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BEZEICHNUNG: Körper und Verfahren zur fluorimetrischen
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Bestimmung einer biologisch abgeleiteten Probe.
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren und einen Körper zum Einsatz
in der fluorimetrischen Bestimmung einer biologisch abgeleiteten Probe.
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Es gibt eine Vielzahl von für die quantitative Bestimmung einer unbekannten
Menge einer aus einem biologischen Medium (wie beispielsweise Serum oder Urin) entnommenen
Probe eingesetzten Verfahren. Verfahren, die auf mit radioaktiven Anhängerstoffen
markierten Substanzen beruhen, schließen indirekte radio-immunologische Proben (gleichzeitig
ablaufende Bindung, Sättigung oder Verscjiebung) und direkte Verfahren (Sandwich-
und immunoradiometrische Verfahren) ein, Andere bekannte Verfahren beruhen auf Markierungen
mit Fluorochrom und Enzymen als Anhängerstoffe. Nach der Ausführung der obigen Reaktionen
müssen die gebundenen, mit Anhängerstoffen versehenen Substanzen von der nicht an
der Reaktion beteiligten mit Anhängerstoff markierten Substanz getrennt werden,
die freie und nichtspezifisch gebundene Substanz einschließt0 Dieser in der flüssigen
Phase auszuführende Trennschritt kann aber unwirksam, unzuverlässig und ungeeignet
sein0 Zur Lösung dieses Problems sind eine Anzahl von Verfahren vorgeschlagen worden
, durch die Verwendung von Diagnose-Reagentien auf festen Oberflächen, die mit der
mit Anhänger
stoff versehenen Substanz in Verbindung treten. In
jeder dieser Anordnungen wird das die gebundene Substanz mit dem Anhängerstoff enthaltende
feste Substrat von der flüssigen Phase getrennt, die die freie, mit Anhängerstoff
versehene Substanz enthält, und daraufhin ausgewaschen, um die restliche freie,
nicht spezifisch gebundene Substanz mit dem Anhängerstoff zu entfernen, Nach einem
Verfahren zur Antigen-Bestimmung werden Reagens tien auf Reagensgläser oder Einsätze
aus Kunststoff durch die physikalische Adsorption von für die zu testende Probensubstanz
typischen Antikörpern aufgeschichtet. Derartige Verfahren sind in der US-PS 3 646
346 und 3 826 619 offenbart. Eine solche physikalische Adsorption ist wegen der
ungleichförmigen Beschaffenheit der Kunststoffoberflächen, ebenso wie der Ungenauigkeiten
in dem Beschichtungsverfahren schwierig zu steuern. Dazu wird auf die Arbeit mit
der Bezeichnung H Radio Immunoassay Methoden Europäischer wlWorkshop 15-17 September
1970, Edinburgh (Autoren Kirkham u.a.) verwiesen. Auf der Seite 441 stellen die
Autoren fest, daß der Bindungsanteil zwischen 20 und 70% liegt, wenn man verschiedene
beschichtete Polystyrol röhren in einem besonderen System benutzt, was zur Aufgabe
dieses Verfahrens führte. Weiterhin tritt in nachfolgenden immunochemischen Reaktionen
ein bedeutender Anteil an nicht spezifischen" Bindungen der mit Anhängerstoff versehenen
Substanz an die feste Oberfläche ein. Diese Bindung,
von hydrophober
oder von ionischer Art, ist schwächer als die immunochemische Bindung. Daher zerstört
heftiges und wiederholtes Waschen, das zur Entfernung von Lösungsrückständen und
nicht spezifisch gebundener Substanz mit Anhängerstoff erforderlich ist, häufig
die schwächere Bindung in der physikalischen Beschichtung, woraus sich der Verlust
physikalisch gebundener Diagnose-Reagentien ergibt.
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Die Resultate aus Proben, die solche beschichteten Flächen zum Einsatz
bringen, sind daher verhältnismäßig ungenau und wegen dieser Arten von Fehlklassifizierungsfehlern
nicht reproduzierbar. (Envall u.a. in Biochim. BioPhN.
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Acta 251 (1971) 427-434, Seite 450). Ein anderer Nachteil der physikalischen
Bindung, wie beispielsweise mit Antikörpern, liegt darin, daß Antikörper in dieser
Form verhältnismäßig reaktionsträge oder unempfindlich gegenüber großen antigenen
sind. Es wird vermutet, daß diese auf räumlichen Behinderungseffekten beruht.
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Bei dem Verfahren nach Bennich u.a. (US-PS 3 720 760) werden immunologische
Substanzen noch fester aufgebracht durch Befestigung an porösen, mikrovernetzten,
schwellfähigen Polymeren der unter der Handelsbezeichnung Sephadex vertriebenen
Art. Ein solches Material ist vorzugsweise in der Form von Makroteilchen angezeigt.
Solche mikrovernetzte Materialien haben den ihnen innewohnenden Nachteil, daß es
bei ihnen schwierig ist, die Zwischen-Hohl räume von nicht spezifischer gebundener
und freier mitgeführter,
mit Anhängerstoff versehener Substanz
freizuwaschen. Dies ergibt unerwünscht hohe Hintergrund oder Störanteil-Ablesewerte.
Es ist ebenfalls schwierig, die Hohlräume zwischen den Makroteilchen hinreichend
frei von Rückständen an freier mit Anhängerstoff markierten Substanz zu waschen,
was im allgemeinen mehrere Verlagerungswaschungen erfordert. Jeder Waschschritt
verlangt eine sorgfältige und zentrifugal ausgeführte Trennung durch eine Dekantierung
zur Vermeidung einer Falschklassifizierung und zur Herabsetzung einer versehentlichen
Verschüttung von Teilchen beim Waschvorgang.
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Dieses Verfahren ist bei fluorimetrischen und kolorimetrischen Oberflächensystemen
ungeeignet, weil die Teilchen nicht genau betrachtet werden können. Dies liegt daran,
daß lose mikrovernetzte Perlen, wie sie in radioaktiven Proben verwendet werden,
eine schlecht bestimmte und schwierig einzuhaltende Oberfläche für eine gleichförmige
Ausleuchtung und Betrachtung ergeben.
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Ein anderes vorgeschlagenes Verfahren ist in einem Artikel beschrieben,
mit dem Titel: "Solid Phase Disc Radioimmunoassay of Human Growth Hormone von Catt
u.a., J. Lab & Clin Med (1966), 100, 31c. Kleine Scheiben eines substituierten
Verpflanzung-Copolymers, das unter der Handelsbezeichnung "Protapol. DI/1" vertrieben
wird, werden mit einem Antikörper beschichtet. Wie in dem obigen Artikel von Kirkham
u.a. auf den Seiten 294 und 295
ausgeführt, liefert dieses Verfahren
eine schwache Reproduzierung, d.h. es gibt eine sehr breite Streuung zwischen wiederkehrenden
Abbildungen an jedem gegebenen Punkt, und manchmal sind die Unterschiede sehr groß.
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Die Scheiben erfordern eine wiederholte Handhabung, und, jedesmal,
wenn sie durch einen festen Gegenstand berührt werden, wird die Gefahr des Verlustes
an gebundener, mit einem Anhängerstoff versehener Substanz, oder die Verunreinigung
durch freie, mit Anhängerstoff versehene Substanz oder andere zur Störung beitragende
Verunreinigungen beträchtlich. Wie bei dem obigen Verfahren mit Makroteilchen würde
die Scheibe in fluorimetrischen oder kolorimetrischen Meßanordnungen nicht genau
betrachtet und schwierig in die richtige Betrachtungsstellung bei einer optischen
Einrichtung bringbar sein.
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Im Hinblick auf die obigen Ausführungen besteht offensichtlich Bedarf
für ein Analyseverfahren in der Feststoff phase, bei welchem die Oberfläche leicht
zu waschen und Trennungen von Substanzen leicht ausführbar sind, das damit wirkungsvoll
und reproduzierbar ist und das ohne Schwierigkeiten für die genaue Betrachtung in
Anwendung gebracht werden kann0 Daher ist es Aufgabe der Erfindung, einen Körper
und ein Verfahren zu seinem Einsatz bei der quantitativen Bestimmung einer biologisch
abgeleiteten Probe mit Anhängerstoffen zu schaffen, bei welchem die oben erwähnten
Probleme
bei der Waschung, Trennung und Handhabung nach den vorbekannten
Verfahren der Bestimmung in der Feststoffphase beseitigt werden, dabei soll ein
Körper mit einer Handhabe oder einem Handgriff geschaffen werden, der eine berührungsfreie
Handhabung der festen Oberfläche erleichtert und die Notwendigkeit des Zentrifugierens
und Dekantierens aufhebt, dabei soll der Körper nach der Erfindung besonders für
die reproduzierbare, genaue Probenbestimmung mit gerigern Hintergrund- oder Störanteil
und einem minimalen Fehler durch Falschklassifizierung eingesetzt werden, ganz besonders
sollen sich Körper und Verfahren für die genaue und reproduzierbare Betrachtung
in einem optischen System, wie einem Fluorimeter oder Kolorimeter eignen.
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Der zur Lösung der gestellten Aufgabe vorgeschlagene Körper ist dadurch
gekennzeichnet, daß er eine Handhabe oder einen Handgriff aufweist, der mit zumindest
einer, nicht aus Makroteilen bestehenden, nicht schwellfähigen, undurchlässigen,
durchgehenden, flachen Oberflächenzone verbunden ist, die eine Fläche von zumindest
einem Quadratmillimeter bildet, daß ein Diagnose-Reagens an zumindest eine, mit
einem Fluorochrom als Anhängerstoff versehene, biologisch abgeleitete Probe gebunden
ist, und daß das genannte Diagnose-Reagens kovalent an die genannte Oberflächenzone
gebunden ist.
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Das zur Lösung der gestellten Aufgabe vorgeschlagene, erfindungsgemäße
Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß
es die folgenden Schritte
umfaßt: (a) die kovalente Bindung eines Diagnose-Reagens an zumindest eine nicht
aus Makroteilchen bestehende, nicht schwellfähige, undurchlässige und durchgehende,
flache Oberflächenzone eines Körpers, (b) die Herstellung des Kontaktes zwischen
der mit dem Diagnose-Reagens gebundenen flachen Oberfläche nach (a) mit einer Probensubstanz,
die mit dem genannten Diagnose-Reagens in Lösung reaktionsfähig ist, und mit einer
mit einem Fluorochrom als Anhängerstoff versehenen Substanz, für eine hinreichende
Zeit, um ein mit Fluorochrom als Anhängerstoff versehenes Reaktionsprodukt zu erzeugen,
das erfaßt werden kann, (c) die Trennung der Oberfläche nach der Reaktion und der
Lösung, die nicht gebundene, mit Fluorochrom als Anhängerstoff versehene Substanz
enthält, nach der Vollendung des Schrittes (b), (d) die Waschung der Oberfläche
nach Schritt (c), nach der Reaktion, und (e) den Transport des Körpers zur Meßstelle
eines Fluoroszenzmessers zur quantitativen Messung des Betrages der von der gewaschenen,
einer Reaktion unterzogenen Oberfläche nach Schritt (d) ausgesendeten Fluoreszenz.
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Nach der vorliegenden Erfindung wird also ein Körper geschaffen, der
zum Einsatz in der quantitativen Bestimmung einer biologisch abgeleiteten Probe
mit Anhängerstoffen geeignet ist. Der Körper schließt eine Handhabe ein, die zumindest
an einer, nicht aus Makroteilchen gebildeten, nicht schwellfähigen, undurchlässigen
und durchgehenden Oberflächenzone befestigt ist, die kovalent an ein Diagnose-Reagens
gebunden ist, das mit der biologisch abgeleiteten Probe reaktionsfähig ist. Die
Oberfläche mit dem gebundenen Reagens (beispielsweise ein Antikörper) tritt mit
der Probensubstanz (beispielsweise ein Antigen) in Reaktion.
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Bei einem Verfahren mit gleichzeitig ablaufenden Reaktionen wird die
mit einem Anhängerstoff versehene Substanz (beispielsweise ein mit Fluorochrom als
Anhängerstoff versehenes Antigen) gleichzeitig mit der Probensubstanz zur Reaktion
gebracht. Bei dem sogenannten Sandwicb-Verfahren wird die mit dem Anhängerstoff
versehene Substanz (beispielsweise ein mit einem Fluorochrom als Anhängerstoff versehener
Antikörper) nacheinander zur Reaktion gebracht. Bei einem anderen Typ eines gleichzeitig
ablaufenden Verfahrens sind gebundenes Reagens und Probensubstanz ein- und dieselbe,
und sie werden beide gleichzeitig zur Reaktion mit der Substanz mit dem Anhängerstoff
(beispielsweise einem mit Fluorochrom als Anhängerstoff versehenen Antikörper) zur
Reaktion gebracht. Bei jedem dieser Verfahren wird die Reaktion zwischen Oberfläche
und Probe durch Rühren mittels der Handhabe beschleunigt. Dann wird die Oberfläche
auf
geeignete Weise von der Probe getrennt und mittels der Handhabe
des Körpers zu einer Meßstelle transportiert, zur Messung des Betrages der von einer
mit Anhängerstoff versehenen Substanz ausgehenden Fluoreszenz, ohne die Notwendigkeit,
die Oberfläche berühren zu müssen, Nach einer Ausführungsform der Erfindung umfaßt
der Körper zumindest zwei an ihm angebrachte Zonen mit einem Diagnose-Reagens, von
denen eine eine Standardzone mit einer vorbestimmten Menge der mit dem Anhängerstoff
versehenen Substanz enthält. Nach einer anderen Ausführungsform ist der Körper vielflächig
und weist auf jeder aus der Vielzahl seiner Flächen ein unterschiedliches Diagnose-Reagens
auf.
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Es kann ebenfalls eine Vielzahl von Diagnose-Reagentien in einer eibazigen
Zone in einer nach Zufallsgesetzen verteilten Dispersion eingebracht und mit zumindest
zwei verschiedenen Probensubstanzen und mit mit Anhängerstoffen versehenen , die
verschiedene Aussendungen haben, zur Reaktion gebracht werden0 Weitere Vorteile
und Merkmale der Erfindung folgen aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung
von Ausführungsbeispielen und anhand der beigefügten Zeichnungen.
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Es zeigen: Fig. 1: eine schematische Ansicht einer Ausführungsform
des Körpers nach der Erfindung bei der Betrachtung durch eine Einrichtung zur Fluoreszenzmessung,
und
Fig. 2 und 3: verschiedene Ausführungsformen des erfindungsgemäßen
Körpers.
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Die Erfindung bezieht sich auf einen zum Einsatz bei der quantitativen
Bestimmung einer biologisch abgeleiteten Probensubstanz mittels Anhängerstoffen
geeigneten Körper.
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Wie hier definiert, ist die "Probensubstanz eine in einem biologischen
Medium enthaltene Substanz. Probensubstanzen schließen Antigene, Antikörper, Hormone,
Enzyme, Drogen, Infektionserreger und andere Substanzen ein. Die Probensubstanz
wird mit einem Diagnose-Reagens, das kovalent an eine durchgehende feste Oberfläche
gebunden ist, zur Reaktion gebracht. Wie hier definiert, ist ein Diagnose-Reagens"
ein an einer Oberfläche gebundenes Reagens, das spezifisch, entweder direkt oder
indirekt, mit der Probensubstanz reagiert. Zur quantitativen Messung wird das Diagnose-Reagens
ferner mit einer mit einem Anhängerstoff versehenen Substanz zur Reaktion gebracht.
Der Begriff damit einem Anhänger stoff versehene Substanz8 (labelled substance)
ist als eine solche Substanz definiert, die einen durch ein Detektionssystem feststellbaren
Stoff einschließt und spezifisch reaktionsfreudig gegenüber der Probensubstanz oder
dem Diagnose-Reagens ist. Die Probensubstanz kann mitunter selbst Fluoreszenz erzeugend
sein (beispielsweise Tetrazyklin oder enzymatisch, wie z.B0 Trypsin) oder sie kann
in diesen Zustand am Untersuchungsort (in situ) gebracht werden. Anhängerstoffe
schließen Fluorochrome, Radionuklide und Enzyme ein,
Die mit Anhängerstoffen
versehenen Substanzen können mit der Probensubstanz vor oder nach der Trennung reagiert
haben, oder sie können mit homologen, mit Anhängerstoffen versehenen Stoffen an
der festen Oberfläche gebunden werden (beispielsweise Antigene oder Antikörper,
von denen einer mit Anhängerstoff versehen ist).
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Zur Vereinfachung der Beschreibung wird zunächst ein typisches fluorimetrisches
System vom sogenannten *'Bandwicht yp beschrieben. Das Verfahren kann als aus den
folgenden Schritten bestehend zusammengefaßt werden: (1) Das Diagnose-Reagens wird
kovalent an einer Oberflächenzone eines festen Körpers gebunden (beispielsweise
ein Antikörper).
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(2) Das gebundene Diagnose-Reagens wird mit der Probensubstanz (beispielsweise
ein Antigen) zur Reaktion gebracht und an der Oberflächenzone gebunden0 (3) Die
Oberflächenzone wird gewaschen, um die nicht gebundene Probe und das Lösungsmittel
zu entfernen.
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(4) Die Oberflächenzone wird mit einer mit einem AnhEngerstoff versehenen
Substanz (z.B. ein Antikörper mit Fluorochrom als Anhängerstoff) zur Reaktion gebracht.
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(5) Die Oberflächenzone wird erneut gewaschen und
(6)
der Körper wird zu einer Meßstelle zur Messung der Menge der mit einem Anhängerstoff
versehenen Substanz transportiert.
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Es wird nun auf den Schritt (1) bezug genommen, demnach wird das Diagnose-Reagens
kovalent an einer nicht aus Makroteilchen bestehenden , nicht schwellfähigen, undurchlässigen
und durchgehenden Oberflächenzone des Körpers gebunden. Eine solche kovalente Bindung
kann direkt zwischen dem Diagnose-Reagens und einer mit dieser reaktionsfähigen
Oberfläche durchgeführt werden. Beispiele solcher Oberflächen schließen Polymere,
wie Polymethylmethacrylat, Polystyrol, Polyamid (Nylon) und Polysaccharide ein,
Diagnose-Reagentien mit Karboxylsäure und Aminogruppen sind mit solchen Oberflächen
reaktionsfähig.
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Bei einem indirekten Kopplungsverfahren können mit den obigen Gruppen
reaktionsfähige und als Brücken zwischen den polymeren Oberflächen und dem Diagnose-Reagens
dienende Gruppen entweder in dem polymeren Grundstoff vorhanden oder durch bekannte
chemische Reaktionen an diesen gebunden sein. Derartige Reagentien zur Kopplung
schließen Aminogruppen, Hydroxylgruppen, Amidogruppen und Karboxylgruppen ein. Geeignete
Verfahren zur Kopplung zwischen dem Polymer und dem Diagnose Reagens sind in der
US-PS 3 720 760 dargelegt.
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Andere kovalente Bindungen können indirekt mit keramischen Substraten
durch den Einsatz von zwischengeschalteten
Kopplungsförderern,
wie sie in der US-PS 3 652 761 (Weetall) beschrieben sind, ausgeführt werden0 Wenn
auch diese Patentschrift die Kopplung an mikrovernetzte Oberflächen beschreibt,
so sind diese Verfahren auch auf die durchgehende, undurchlässige, nicht aus Makroteilchen
bestehende Oberfläche nach der Erfindung anwendbar.
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Das sogenannte direkte oder "Sandwich"-Verfahren wird wie folgt durchgeführt:
Ein Reagens zur Kopplung wird zuerst an einem Substrat gebunden. Bei einem speziellen
Verfahren zur Kopplung wird eine polymere Oberfläche, beispielsweise eine Akryl-Oberfläche,
mit einem Kopplungsförderer oder Abstandshaltungsmittel zu einer Reaktion, mit Karbodiimid
als Katalysator, vom Typ einer nukleophilen Substitution gebracht. Daraufhin wird
das Diagnose-Reagens, beispielsweise ein Antikörper, in ähnlicher weise kovalent
an den Kopplungsförderer gebunden0 Beim folgenden Schritt wird die Oberfläche des
Körpers mit dem kovalent gebundenen Antikörper mit einem Medium in Kontakt gebracht,
bei dem der Verdacht besteht, daß es die die mit dem Antikörper reaktionsfähige
Probensubstanz, wie beispielsweise Antigen, enthält, in Kontakt gebracht.
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Sofern vorhanden, reagiert das Antigen mit dem Antikörper und verbindet
sich mit diesem auf der Oberfläche während eines Inkubationszeitraumes. Es ist höchst
vorteilhaft, die reaktionsfähige Oberfläche während der Inkubation zu bewegen oder
rührend zu schwneken. Dies ergibt eine bedeutend
schnellere Reaktionszeit.
Es ist außerdem festgestellt worden, daß dies die Reproduzierbarkeit der Versuchsergebnisse
erhöht. Zu diesem Zweck wird, wie im folgenden ausgeführt, der Körper mit einer
Handhabe oder einem Handgriff versehen, die darauf verwendet werden kann, die reaktionsfähige
Oberflächenzone entweder mechanisch oder manuell aufzurühren.
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Beim nächsten Schritt, nach der Inkubation mit der das Antigen enthaltenden
Serumprobe, wird die Oberfläche einfach von der Lösung getrennt und mit einem geeigneten
Lösungsmittel gewaschen, wie einer wässerigen Phosphatpufferlösung oder destilliertem
Wasser.
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Beim nachfolgenden Schritt wird die Oberfläche mit einer mit Anhängerstoff
versehenen Substanz in Kontakt gebracht, Antikörperlösung wird, beispielsweise mit
einem Fluorochrom als verseflen. Anhängerstoff 'Bur vollständigen Reaktion zwischen
dem mit einem Anhängerstoff versehenen Antikörper und dem Antigen wird die Lösung
für eine hinreichend lange Zeit zur Inkubation gebracht. Wie bei der Inkubation
der Probe ist es vorteilhaft, die Lösung während dieser Inkubation aufzurühren,
um die Reaktionszeit zu vermindern und um die Reproduzier barkeit der Bestimmung
zu verbessern.
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Beim nächsten Schritt wird die den mit Anhängerstoff versehenen, nicht
gebundenen Antikörper enthaltende Lösung von der festen Oberfläche getrennt, die
gebundene Antikörper
mit Anhängerstoff enthält.
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Darauffolgend wird die der Reaktion unterzogene feste Oberfläche gründlich
gewaschen, um Rückstände an freien und nicht spezifisch gebundenen Antikörpern zu
entfernen, die noch auf der Oberfläche verblieben sein können. Die Wirksamkeit dieses
Waschnungsschrittes ist äußerst wichtig zur Erzielung genauer Ergebnisse. Daher
wird die Oberfläche gründlich mit einer geeigneten Spülungslösung, wie wässeriger
Phosphatpufferlösung oder destilliertem Wasser, gewaschen.
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Dieser Waschungsschritt begründet die Wichtigkeit der anfänglichen
kovalenten Bindung des Diagnose-Reagens mit der Oberfläche beim ersten Schritt.
Wenn beispielsweise ein solches Reagens nur aufgeschichtet wird, wie beispielsweise
durch Adsorption auf der festen Oberfläche, so kann bei diesem heftigen Waschvorgang
ein Teil davon zusammen mit der begleitenden, mit Anhängerstoff versehenen Substanz
ausgewaschen werden.
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Nach der Waschung wird der die mit dem Anhängerstoff versehene Substanz
enthaltende Körper zu einer Meßstelle zur Messung der Menge dieser Substanz transportiert.
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Zur Eräuterung wird ausgeführt, daß ein gebräuchliches Verfahren zur
Bindung von Probensubstanzen von dem Pachmann der Immunologie als "Sandwich"-VerfahrBn
bezeichnet wird.
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Im herkömmlichen Fall wird ein Antikörper der speziellen
Krankheit,
deren Vorhandensein zu bestimmen ist, in einer Schicht auf die Oberfläche aufgebracht.
Ein typischer Anwendungsfall bringt den Test auf Australisches Antigen" im Blut
zum Einsatz, dies wird als eindeutiger und unmittelbarer Nachweis für eine Hepatitis-Infektion
angesehen. Der Antikörper gegen das "Australische Antigen wird in einem Film auf
das Substrat aus Kunststoff aufgeschichtet.
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Das Serum des Subjekts, bei dem der Verdacht auf Trägerschaft des
Antigens besteht, wird mit dem Antikörper zur Reaktion gebracht. Beim Vorhandensein
des Antigens erfolgt seine immunologische Bindung an den Antikörper. Nach der Spülung
mit Wasser zur Entfernung des nicht gebundenen Stoffes werden weitere, mit einem
fluoreszierenden Anhängerstoff versehene Antikörper zugesetzt. Diese werden an das
Antigen gebunden, sofern dieses vorhanden ist. Dann werden bei einer abschließenden
Spülung alle nicht gebundenen, mit Anhängerstoff versehenen Antikörper entfernt.
Ein solches Verfahren wird in der US-PS 3 826 618 (Drafu) im Hinblick auf die radio-immunologische
Probenahme beschrieben. Nach der vorliegenden Erfindung wird der Antikörper zuerst
kovalent an der Oberfläche gebunden. In einer Fluoreszenz-Meßeinrichtung wird die
Fluoreszenz, wenn vorhanden, durch einen Fluoreszenzmesser festgestellt0 Bei einem
anderen Typ eines direkten Verfahrens wird das Diagnose-Reagens, d.h. der Antikörper,
zuerst kovalent, wie oben beschrieben, an dem Substrat gebunden. Daruafhin wird
die das Antigen enthaltende Probe, die zuvor beispielsweise
mit
einem fluoreszenzerzeugenden Anhängerstoff versehen worden ist, mit der Oberfläche
zu einer immunologischen Reaktion zwischen dem Antigen und dem Antikörper in Kontakt
gebracht. Dieses system ist oben in dem ersten Beispiel erlautert worden.
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Bei einem BeisDiel eines "Sandwich"-Verfahrens wird kovalent ein Antigen
- beispielsweise eine Aufbereitung mit treponema pallidum" - an dem Körper gebunden,
wenn gewünscht wird, ie Antikörper gegen Syphilis im Subjekt zu bestimmen. Das Serum
des Subjekts wird mit dem Körper zur Inkubation gebracht, dann wird eine Spülung
vorgenommen. Dann werden antihumane Antikörper (aus der Ziege oder dem Kaninchen
gewonnen) hinzugefügt, einer Inkubation unterzogen, und eine Spülung vorgenommen.
War ein humaner Antikörper zu treponemae im Serum vorhanden, so wird er an dem Körper
durch eine immunologische Reaktion zur Haftung gebracht und hält seinerseits die
mit Anhängerstoff versehenen Antikörper der Ziege fest, und damit kann eine quantitative
Ablesung des Titers für Syphilis erhalten werden. Dies stellt eine Abwandlung des
allgemein gebräuchlichen FTA-ABS-Tests dar (fluoreszierende "treponema"-Antikörperadsorption),
womit der Körper nach der Erfindung eine genaue Mengenbestimmung ermöglicht.
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Jede Antikörper erzeugende Infektionskrankheit ist nach dem Verfahren
mit Proben erfaßbar, und dies schließt solche Krankheiten mit einem öffentlichen
Gesundheitsinteresse ein,
wie Syphilis, Gonorhoe, Streptokokken-Racheninfektionen,
Dyssenterie, Salmonelleninfektionen, Typhus, Tollwut, Serum-Hepatitis, Grippentypen
usw. Die Erfindung eignet sich auch zur Qualitätsprüfung in der Nahrungs und Heilmittelindustrie.
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Ebenso, bei einem anderen Anwendungsbereich der beschriebenen Verfahrensweise
ist es oft von Wert, nicht das Vorhandensein der Krankheit (Antigene), sondern die
schützende Immunisierung des Körpers gegen eine Krankheit (Antikörper-Titer) als
Ergebnis einer absichtlichen Impfung zu bestimmen.
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So verabfolgt beispielsweise ein Arzt einem Kind eine Impfung mit
DPT-Impfstoff zur Schaffung einer Immunität gegen Diphterie, Keuchhusten und Tetanus.
Dann vermutet er, daß alle drei Impfungsanteile angegangen sind. Ein Test des Serums
auf Antikörper zu jeder dieser Krankheiten würde tatsächlich belegen, ob alle drei
Antigene wirksam sind zur Erzeugung der immunisierenden Antikörper. Der gegenwärtige
Stand der Technik gestattet nicht ein solches einfaches Nachprüfungsverfahren.
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Setzt man das Verfahren nach der Erfindung bei dem sogenannten "gleichzeitig
ablauf enden" Verfahren (competitive procedure) ein, so werden die obigen Abläufe
allgemein wie folgt abgewandelt: Anstelle der Kopplung Diagnose-Reagens (Antikörper)
mit der
Probe (Antigen) mit der mit einem Anhängerstoff versehenen
Substanz (Antikörper) werden die letztgenannte Substanz und eine Probe von demselben
Typ (beispielsweise ein Antigen) gleichzeitig zugeführt, um zur gleichen Zeit auf
das Diagnose-Reagens (beispielsweise einen Antikörper) einzuwirkenf das kovalent
an die feste Oberfläche gebunden Nach dieser Inkubation oder Kontaktherstellungsseit
wird die feste Qberfläche mit denselben Vorteilen wie bei dem sogenannten tlSandwich-Verfahren
gewaschen.
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Ausführungsbeispiele zur Veranschaulichung des erfindungsgemäßen Systems,
wo Antigene oder Antikörper im strikten Sinne nicht einbezogen, jedoch proteinbindende
Verfahren noch angewendet werden, schließen solche Kombinationen ein, wie Thyroxin
bindendes Globulin (TBG) und Thyroxin mit Eigenfaktor, Vitamin B12, sowie beispielsweise
Lactoglobulin des Rindes und Folsäure.
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In allen Fällen wird ein Bestandteil des Paares (ein erster Typ eines
Proteins) kovalent an eine feste Oberfläche gebunden und kann auch an Blutserum
gebunden oder von diesem entfernt sein, dabei tritt der andere Bestandteil des Paares
(eine zweite Art einer mit dem Protein vom ersten Typ bindungsfähigen Substanz)
in #ettstreitw bei der Bindung mit den Molekülen seiner eigenen Art, die mit einem
Fluorochrom als Anhängerstoff versehen sind. Diese Ånwendungsbeispiele und die allgemeine
Anwendung stehen in strkter Analogie zu
den Antikörper/Serum-Antigen/Antigen
+ Anhängerstoff-Systemen, die in der obigen immunologischen Reaktion beschrieben
worden sind.
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Qach der Erfindung umfaßt das Diagnose-Reagens einen Bestandteil einen
Bestandteil des obigen Stoffpaares, und die biologisch abgeleitete Substanz umfaßt
die beiden anderen. Das Reaktionsprodukt des Stoffpaares ist "aneinandergebunden".
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Bei einem anderen Typ eines gleichzeitig ablaufenden Verfahrens wird
eine vorbekannte Menge eines Antigens kovalent an die Oberfläche gebunden und gleichzeitig
mit einer Lösung des; selben Antigentyps in unbekannter Menge mit einem spezifischen,
mit einem Anhängerstoff versehenen Antikörper in Kontakt gebracht. Ein Verfahren
zur radio-immunologischen Probenahme, das die obige Vorgehensweise bei einer nicht
kovalent gebundenen Oberfläche in Einsatz bringt, wobei ein mit radioaktivem Anhängerstoff
versehener Antikörper in einer Lösung gemessen wird, wird in einem Artikel von J.S.
Woodhead u.a. mit dem Titel "The Immunoradiometric Assay and Related DechniquesN
Br. Med. Bull. 30:44 (1974) beschrieben. Bei dem vorliegenden System wird allerdings
das Antigen kovalent an der Oberfläche gebunden, der mit Anhängerstoff versehene
Antikörper an der Oberfläche gemessen, und es wird einem fluoreszierenden Anhängerstoff
der Vorzug gegeben.
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Abwandlungen können den Einsatz verschiedener fluoreszierender Anhängerstoffe
wie Lissamin-Rhodamin B, D.A.N.S. (1Die
methylamino-Naphtalin-5-Sulfonsäure),
Ortho-Phthalaldehyd und Fluorescamin einschließen, die häufig in der Fluoreszenz-Mikroskopie
eingesetzt werden. Die ersten beiden Anhänger stoffe besitzen ein orangefarbenes
oder rotes Ausendungsspektrum anstelle des gelbgrünen oder Pluoreszin-Spektrums,
und die beiden letztgenannten Anhängerstoffe besitzen ein blaues bzwO grünes Aussendungsspektrum.
Die einzige Änderung am Fluoreszenzmesser besteht im Austausch des verwendeten Anregung
und Emissionsfilters, ebenso wie der Auswechslung des fluoreszierenden Anhängerstoffes
bei den Antikörpern des Reagensvorrates.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist ebenfalls auf den Einsatz von Systemen
mit Enzymen als Anhängerstoffe anwendbar. Ein derartiges system wird in einem Artikel
von Perce u.a. mit dem Xitel Weise of Enzyme-Linked Antibodies to Measure Serum
AntiDNAAntibody in Systemic Lupus Erthyematosus« Clin. Chem.
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20/3, 353-359 (1974) beschrieben. Das beschriebene System unterscheidet
sich insofern von dem hier erläuterten, als das DiagnoseReagens, DNA, von einem
Reagensglasträgerma terial adsorbiert wird. Daraufhin wird ein DNA-Antikörper enthaltendes
Serum mit dem Reagensglas mit seiner Beschichtung zur Reaktion gebracht, der eine
Reaktion mit einem Antihuman-Gamma-Globulinp eroxidas e -Enaym folgt, das zur Beschichtung
des Glases konjugiert ist. Durch die Einwirkung der Peroxidase auf das Substrat
wird ein gefärbtes Reaktionsprodukt entwickelt, das nach herkömmlichen Verfahren
kolorimetrisch gemessen wird.
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Die folgende Beschreibung geht besonders auf den bei den obigen Verfahren
verwendeten Körper ein. Dieser schließt zwei wichtige Merkmale ein: eine Handhabe
oder einen Handgriff und zumindet eine, nicht aus Makroteilchen bestehende, nicht
schwellfähige, undurchlässige, durchgenende Oberflächenzone, die zur kovalenten
Bindung an einDiagnosReagens in der Lage ist. Der Handgriff kann die Seite eines
Reagens glases oder eih Teil eines festen Gegenstandes sein. Eine besonders bevorzugte
Ausführungsform der Handhabe ist ein Handgriff, der speziell zur Erieichterung der
mechanischen oder manuellen Handhabung des Körpers zum Aufrühren oder dergl.
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ausgebildet ist.
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Es wird nun insbesondere auf Fig. 1 bezug genommen, dort ist ein
Körper in Verbindung mit einer Fluoreszenz-Meßeinrichtung dargeste-llt. Der Körper
bei 10 ist an eine übliche fluoreszierende Substanz 11 gebunden; d.h. von derselben
fluores--zierenden Substanz, wie sie sie verwendet wurde, um die den Antikörper
enthaltende Oberfläche 12 im unteren Teil eines Zylinders 10 mit Anhängerstoff zu
versehen, und besitzt einen vorbekannten, mit der Meßeinrichtung gemessenen Titer,
der in der Reagensröhre oder der Probe Verwendung findet. In diesem Beispiel handelt
es sich also um einen Fluoreszenzmesser. In geeigneter Weise wird ein freier Zwischenraum
13 um die Oberfläche des ylinders 10 herum freigelassen und trennt die obere und
die untere Schicht 11 bzw. 12 voneinander.
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Die untere Schicht 12 kann einen, nach einer der obigen Methoden
vorbereiteten Streptokokken-Antikörper mit einem
fluoreszierenden
Anhängerstoff enthalten. Die untere Schicht ist in die Flüssigkeit des Körpers eingetaucht,
um festzustellen, ob eines der vermuteten Antigene in dem zu testenden Serum vorhanden
ist.
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Ein Faserotikkabel 14 oder Lichtleiter leitet ultraviolettes Licht
von einer Lichtquelle 16. Dann durchläuft das Licht ein geeignetes Gelatinefilter
19, das sicherstellt, daß nur das Licht der angeregten Wellenlänge den Körper erreicht
und auf seine Oberfläche auftrifft, woraufhin die Fluoreszenz der mit Fluorochrom
als Anhängerstoff versehenen Substanz angeregt wird. Es sind zwei Faseroptikkabel
19 und 20, mit entsprechenden Filtern 19a und 20a vorgesehen. Das eine Glasfaserkabel
19 leitet fluoreszierendes Licht von der fluoreszierenden Standardbeschichtung zu
einer Fotovervielfacherröhre 21, und das andere Glasfaserkabel 20 leitet die von
der unteren fluoreszierenden Schicht 12 ausgehende Fluoreszenz zur Fotovervielfacherröhre
21. Ein durch einen Motor 23 angetriebenes Unterbrecherrad 22 läuft um und bewirkt
einen wechselnden Lichtfluß von jeder der Schichten 11 und 12 zur Fotovervielfacherröhre
21. Auf diese Weise wird ein direkter Vergleich zwischen dem Standard- und dem Test-Teil
erhalten.
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Nach der Ausführungsform gemäß Fig. 2 schließt ein paddelförmiger
Körper 26 eine Handhabe 27, einen Schaft 28 und einen breiten flachen Kopf 29 am
anderen Ende ein, wobei der Kopf 29 eine Schicht 30 der Probe trägt. In dieser Ausführungsform
ist ein Fluoreszenzmesser veranschaulicht, bei
dem zwei Faseroptikkabel
31 (Licht zur Anregung) und 32 (für das ausgesendete fluoreszierende Licht) parallel
zueinander verlaufen.
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Bei der Ausführungsform nach Fig0 3 wird ein Vielfachtestkörper gezeigt.
Der Körper schließt einen Würfel 33 am Ende eines Handgriffs 34 ein. Der iurfel
33 kann vier Seiten zeigen, davon sind die Seiten 36 und 37 hier sichtbar. Jede
Seite weist einen unterschiedlichen Probenauftrag auf. Dieser Körper ist besonders
für die Fluoreszenzmessung ausgelegt.
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Somit können vier verschiedene fluoreszierende Anhängerstoffe vorgesehen
sein, und der Fluoreszenzmesser kann ein Filterrad mit vier Filterungszonen von
ausgewählter Wellenlänge aufweisen, um die zur Fotovervielfacherröhre 21 gehende
Lichtenergie zu filtern. Wenn die Bedienperson den Würfel 33 (oder einen anderen
vielflächigen Körper) dreht, kann jeder Test aufeinanderfolgend abgelesen werden.
In ähnlicher Weise kann ein Handgriff an einem Zylinder, einer Kugel oder einem
anderen Träger oder Substrat befestigt sein. Es können auch andere Mittel zur Bewegung
des Substrats, auf dem verschiedene biologisch abgeleitete Substanzen in Schichten
aufgetragen sind, verwendet werden, um die dem Fluoreszenzmesser ausgesetzte Oberfläche
zu verändern, Allgemein ausgedrückt, bilden der mit Streifen versehene Zylinder
nach Fig. 1 und der Würfel nach Fig. 3 zwei Ausführungsformen für den Einsatz von
vielen Zonen, die auf ein
Substrat als Schicht aufgetragen und
auf eine vielfache quantitative Bestimmung, insbesondere von der Art der Fluoreszenzmessung,
abgestimmt sind. Jede Form eines Substrats kann verwendet werden, solange es eine
erste eines beispielsweise mit einem Fluorochrom als Anhängerstoff versehene Zone
eines Substrats und zumindest eine andere Zone einer solchen Substanz mit Anhängerstoff
umfaßt. Solche verschiedenen Zonen kennen eine Standardzone einer vorbestimmten
Menge derselben Art einer Substanz wie die mit Fluorochrom als Anhängerstoff versehene
eisnchließen. In dieser Weise werden zwei verschiedene Zonen, wie beispielsweise
die Streifen 11 und 12 nach Fig. 1, betrachtet, um einen direkten Vergleich des
Standard-und des Test-Teils zu schaffen.
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Nach einer anderen kusführungsform kann eine einzige Oberflächenzone
eine Vielzahl von mit Anhängerstoffen versehenen Substanzen in einer Dispersion
nach Zufallsgesetzen verteilt sein, die chemisch an das Substrat gebunden ist. Zumindest
zwei der Anhängerstoffe sind Fluorochrome, die, auf verschiedene Lichtwellenlängen
ansprechend, Fluoreszenz aussenden.
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Diese können in solchen Fällen verwendet werden, wo es wünschenswert
ist, die Gegenwart von mehr als einer Probensubstanz festzustellen.
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Zur Feststellung der obigen Substanzen mit Anhängerstoffen für verschiedene
Wellenlängen in nach Zufallsgesetzen erfolgter Dispersion kann ein Fluoreszenzmesser
mit einem Filterrad derart ausgestattet werden, daß mehrere verschiedene
Wellenlängen
für mehrere bestimmte fluoreszierende Anhängerstoffe ausgefiltert werden können,
beispielsweise: (1) Fluoreszin-Isothiocyanat (gelbgrün), (2) Lissamin-Rhodamin B-200
(tieforange), (3) D.A.N.S. (l-Dimethylamino-Naphtalin-5-Sulfonsäure (rot), (4) Ortho-Phtalaldehyd
(blaugrün), und (5) Fluorescamin (blaugrün), und wenn jeder Anhängerstoff beispielsweise
ftr drei Mikroorganismen, die für Infektionen der Harnwege von Interesse sind (beispielsweise
N. coli, Pseudomonas,Staphylokokken) an einen unterschiedlichen Antikörper gebunden
sind, dann können zwei,drei oder alle gleichzeitig identifiziert und bestimmt werden0
Fluoreszierende Anhängerstoffe schließen Natriumfluorescin-Isothiocyanat oder andere
geeignete Substanzen ein. Dieses spezielle Fluorochrom, das eine Erregungswellenlänge
bei 460 nm und eine Aussendungswellenlänge bei 520 nm aufweist, ist von Vorteil.
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Die Oberflächenzone des Körpers ist durch bestimmte physikalische
und chemische Eigenschaften gekennzeichnet. Die chemische Haupteigenschaft liegt,
wie oben ausgeführt, in der Fähigkeit, mit dem jeweiligen Diagnose-Reagens eine
kovalente Bindung einzugehen. Hinsichtlich der physikalischen Eigenschaften besteht
eine solche Oberfläche nicht aus Makroteilchen, ist nicht schwellfähig, undurchlässig
und durchgehend.
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Das Nichtvorhandensein von Makroteilchen an der Oberflächenzone des
Körpers unterscheidet diese von Mikroperlen und dergl. Sie soll eine hinreichende
Oberflächengröße haben, um dem Detektor gegenüber eine mikroskopisch einzige Oberfläche
zu bieten, um eine Integration des fluoreszierenden Lichtes oder der Radioaktivität
von großen Ansammlungen von Substanzen mit Anhängerstoffen zu gestatten, und dadurch
den Erfassungsfehler von Probe zu Probe zu vermindern0 Vorzugsweise ist eine solche
Fläche ein Quadrat von mindestens 1 mm2.
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Die Verwendung von losen Teilchen, die oft bei radioaktiven Proben
eingesetzt werden, ergibt eine schlecht abgegrenzte und schwer zur gleichförmigen
Anregung und genauen Betrachtung der Fluoreszenz einzuhaltende Oberfläche.
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Ein anderes Merkmal der Oberfläche besteht darin, daß sie für Flüssigkeit
undurchlässig ist. Dies zeichnet sie gegenüber gelartigen, mikrovernetzten Perlen
aus. Wenn solche Perlen, wie eingangs ausgeführt, zu diesem Zweck verwendet werden,
ist es äußerst schwierig, aus ihren Zwischenräumen nichtspezifisch gebundene und
festgehaltene Anhänger-Rea gentien auszuwaschen. Durch die Verwendung der undurchlässigen
Oberfläche wird das Waschverfahren schneller und wirksamer gemacht Ein anderes Merkmal
der Oberflächenzone besteht darin, daß sie durchgehend ist. Durch die Ausbildung
einer durchgehenden, nicht porösen Oberfläche werden die oben genannten Schwierig
keiten beim Waschen vermieden. Es ist selbstverständlich,
daß eine
zur Unterstützung der Kopplung mit Säure oder einem anderen Reagens behandelte Oberfläche
in den Rahmen der Erfindung fällt, selbst wenn die Oberfläche aufgerauht ist. Jegliche
Porösität, Durchlässigkeit oder Unstetigkeit einer solchen aufgerauhten Oberfläche
ist vernachlässigbar im Vergleich zu den mikrovernetzten Makroteilchen nach dem
vorbekannten Stande der Technik.
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Ein anderes Merkmal der Oberflächenzone liegt darin, daß sie nicht
schwellfähig ist. Dies steht im Gegensatz zu dreidimensionalen Gelen, wie das genannte
'8Sephadex", bei denen nicht gebundene Reagentien schwierig auszuwaschen sind, und
die in ihren Dimensionen schwierig einzuhalten sind.
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Ausführungsbeispiel 1 Dieses Ausführungsbeispiel veranschaulicht eine
Fluoreszenzmessung einer Antikörper/Antigen-Reaktion, bei welcher ein in Lösung
befindliches Antigen mit einem fluoreszierenden Anhängerstoff versehen und mit einem
auf einer Oberfläche immobilisierten Antikörper zur Reaktion gebracht worden ist.
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Bei diesem sogenannten "direkten" Verfahren ist die Fluoreszenz der
Oberfläche proportional der Antigenkonzentration in der Lösung.
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Mit Säure getränkte Polyamidstreifen werden mit Anti-Strepttolysin-0
durch 30-minütiges Eintauchen in eine im Verhältnis 1«8 in Salzlösung verdünnte
Lösung von Anti-Streptolysin-O bei langsamem Verrühren beschichtet, während ein
Kopplungsförderer
zu 1% (Glutaraldehyd) langsam zugeführt wird.
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ach einer Waschung mit Wasser und Srocknung werden die kovalent gebundenen
Streifen verschiedenen Konzentrationen von Streptolysin-O Toxin in destilliertem
Wasser ausgesetzt.
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Zwei ml jeder Konzentration werden zuerst mit 0,2 ml einer Fluorescaminlösung
(40 mg in 100 ml Azeton) zur Reaktion gebracht, um das Antigen mit dem Anhängerstoff
zu versehen.
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Dann werden die Streifen unter Verrühren 30 Minuten lang beigegeben,
entfernt, mit Wasser gespült und getrocknet.
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Sie werden dann in die Meßeinrichtung eigelegt, mit einer Wellenlänge
von 375 nm angeregt, und die Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von 475 nm gemessen.
Es werden die folgenden Ergebnisse erhalten: Streptolysin-O-oxin Fluoreszenzsignal
Lösung 1:5 280 1 : 10 155 1:20 105 1 : 40 45 leer 0 Ausführungsbeispiel 2 Dieses
Ausführungsbeispiel veranschaulicht eine Fluoreszenzmessung bei Bakterien, wobei
in einer Suspension befindliche Bakterien an einer Oberfläche gebunden sind und
nach einem sogenannten "Sandwich"-Verfahren mit einem mit einem Anhängerstoff versehenen
Antikörper zur Reaktion gebracht werden.
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Die Fluoreszenz der Oberfläche ist der Bakterienkonzentra tion in
der Probe proportional.
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Streptococcus beta-hemolyticus, Typ A, wurde in einer Typsinbrühe
in Reinkultur gezüchtet, im Autoklaven gekocht, zentrifugiert und mit Phosphatpuffersalzlösung
(PBS) gewaschen. Dann werden die Zellen in PBS wieder zur Suspension gebracht, in
Konzentrationen von 107, 105 und 103 Organismen pro ml.
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DEAS-Zellulosestreifen werden durch 15-minütiges Eintauchen in eine
im Verhältnis 1:16 in einem Phosphatpuffer verdünnte Anti-Serumlösung unter Umrühren
mit Streptokokken-A-Antiserum beschichtet, dabei werden 0,5 ml eines zu 50» verdünnten
Kopplungsförderers (Glutaraldehyd) langsam beigegeben.
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Nach dem Waschen werden die kovalent gebundenen Streifen 5 Minuten
lang in 5 ml jeder der erwähnten Konzentrationen einer Inkubation unterzogen, der
eine Waschung mit Phosphatpufferlösung (PBS) folgt.
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Als nächstes werden die Streifen 5 Minuten lang in einer Lösung von
mit dem Anhängerstoff Fluorescin-Isothiocyanat versehenen Streptokokken-Antikörpern,
Typ A, einer Inkubation unterzogen, die in einer Phosphatpufferlösung im Verhältnis
1:4 verdünnt worden sind. Dann werden die Streifen mit Pufferlösung abgespült und
luftgetrocknet. Die Streifen werden dann in die Meßeinrichtung eingelegt, und man
erhält die folgenden Ablesewerte:
Streptokokken-Konz entration
Bluoreszenzsignal (Organismen pro ml) ml) 107 340 105 305 10 122 Wenn auch bei diesem
Ausführungsbeispiel die Bindung durch Querbindungen der Antiserumproteine in einer
stark haftenden Schicht erhalten wurde, so ist auch eine kovalente Bindung direkt
mit Zellulosederivaten, wie beispielsweise Amino-Zellulose in ähnlicher Weise möglich,
Ausführungsbeispiel 3 Dieses Ausführungsbeispiel beschreibt die Fluoreszenzmessung
vielfacher Oberflächen, die einer gemeinsamen Lösung ausgesetzt worden sind, die
mehrere Substanzen enthält, für die eine Messung gewünscht wird.
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Drei Flächenquadrate aus Zellulose werden jeweils mit einem anderen
Immunoglobulin-Antikörper (Ziege, antihumanes IgA, IgG, IgM) unter Einsatz von Glutaraldehyd
als Kopplungsförderer zur Reaktion gebracht. Die auf einem Eunststoffstreifen angebrachten
Zellulosequadrate werden in eine geeignete, mit einer Pufferlösung verdünnte Serumprobe
gelegt.
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Nach einer Inkubation von 10 Minuten wird der Streifen entnommen,
und die drei beschichteten Quadrate mit Pufferlösung abgespült. Sie werden dann
mit einer Lösung zur Reaktion gebracht, die in gleich aktiver Konzentration mit
Fluoreszin
Isothiocyanat als Anhängerstoff versehenes antihumanes
IgA, IgG, IgM (Ziege) gelöst in einer geeigneten Pufferlösung enthält, und wobei
weitere 10 Minuten lang die Inkubation erfolgt. Dann werden die Streifen wieder
gewaschen, und jede Fläche wird getrennt in der Meßeinrichtung gemessen.
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In dieser Weise werden die relativen Konzentrationswerte der verschiedenen
Immunoglobuline bestimmt.
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Ausfuhrungsbeispiel 4 Dieses Ausführungsbeispiel beschreibt die Fluoreszenz~
messung einer gemeinsamen Oberfläche, die einer Lösung ausgesetzt wird, die mehrere
Substanzen enthält, für die einzelne Messungen gewünscht werden0 Eine kreisförmige
Scheibe aus Polymethylmathacrylsäure, die eine zufällige Mischung derselben drei
Immunoglobulin-Anti körper wie oben enthält, wird einer in einer geeigneten Pufferlösung
aufgelösten Serumprobe ausgesetzt0 Nach 10-minütiger Inkubation wird der Streifen
entfernt und mit Pufferlösung abgespült. Dann wird er einer Inkubation in einer
eine Mischung aus Ziegen-Antikörpern enthaltenden Lösung unterzogen, wobei jeder
Antikörper mit einem anderen Fluorchrom als Anhängerstoff versehen ist, d.h, Anti-IgA
(Ziege), mit Fluorescamin, Anti-IgG (Ziege) mit Fluorescin-Isothiocyanat und AntiIgM
(ziege) mit Rhodamin, die in einer geeigneten Pufferlösung gelöst und 20 Minuten
lang einer Inkubation unterzogen worden sind. Der Streifen wird entnommen
und
mit einer Pufferlösung gewaschen. Dann erfolgt die aufeinanderfolgende Ablesung
an der Meßeinrichtung, wobei zunächst die Anregung bei 390 nm und die Ablesung der
Aussendung bei 485 nm, dann die Anregung bei 390 nm mit Ablesung bei 485 nm (Aussendung)
und dann eine Anregung bei 480 nm mit Ablesung bei 520 nm, und schließlich eine
Anregung bei 520 nm mit Ablesung der Aussendung bei 595 nm erfolgt.
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So werden also die Konzentrationswerte für IgA, IgG und IgM bestimmt0
Es ist selbstverständlich, daß die obige spezielle Beschreibung und die speziellen
Zeichnungen nur zum Zweck der Veranschaulichung gegeben worden sind, und aaß daran
Änderungen und Abwandlungen vorgenommen werden können, ohne vom Wesen und vom Rahmen
der beigefügten Patentansprüche abzugeben0 Dem Fachmann des Gebietes, auf das sich
diese Erfindung bezieht, erscheinen viele Änderungen im Aufbau und stark unterschiedliche
Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung denkbar, ohne von dem Wesen und
Rahmen der Erfindung abzugehen. Die Offenbarungen und die hier gegebene Beschreibung
sind rein anschaulicher Art, und es ist nicht beabsichtigt, daß sie in irgendeinem
Sinne einsehränkend sein sollen.