JPH10282098A - 蛍光免疫測定法 - Google Patents

蛍光免疫測定法

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JPH10282098A
JPH10282098A JP9093496A JP9349697A JPH10282098A JP H10282098 A JPH10282098 A JP H10282098A JP 9093496 A JP9093496 A JP 9093496A JP 9349697 A JP9349697 A JP 9349697A JP H10282098 A JPH10282098 A JP H10282098A
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JP
Japan
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antibody
labeled
measured
fluorescent
crp
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JP9093496A
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English (en)
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Hiroshi Nakayama
浩 中山
Kimimasa Miyazaki
仁誠 宮崎
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Panasonic Holdings Corp
Original Assignee
Matsushita Electric Industrial Co Ltd
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 蛍光強度の変化(蛍光消光法、蛍光消光阻害
法)により高分子量の物質、特に蛋白質を容易に測定す
るキットを提供する。 【解決手段】 蛍光物質で標識した抗体を用いて、測定
対象物を測定することにおいて標識抗体と測定対象物が
凝集することにより起こる蛍光強度の減少を測定するこ
とを特徴とする蛍光免疫測定法、蛍光物質で標識した抗
体と蛍光消光物質で標識した測定対象物質を用いて、検
体中に測定対象物が存在することにより標識抗体と標識
測定対象物の凝集を阻害する結果起こる蛍光強度の増加
を測定することを特徴とする蛍光免疫測定法である。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、溶液中の測定対象
物を測定あるいは検出する手段として利用することがで
き、特に環境、食品及び医療の分野に有用である。
【0002】
【従来の技術】従来の蛍光免疫を利用した測定方法にお
いて、蛍光増強法、蛍光消光法、蛍光増強阻害法および
蛍光消光阻害法が知られている。
【0003】これらの方法は、抗体と蛍光色素標識され
た抗原が免疫反応することにより標識蛍光色素の蛍光強
度が変化することを利用したものである。また、これら
の方法は、ハプテン(低分子量物質)を検出する手段と
してよく利用されている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】上記の従来法を利用し
た場合、蛋白質のような高分子量の物質に利用すること
は困難であった。その理由の一つとして、抗原抗体反応
による蛍光強度の変化は、抗体の抗原結合部位に標識蛍
光物質の一部あるいは全部が取り込まれることにより起
ることが知られており、蛋白質の場合には標識すること
により抗原性が変化し、抗原抗体反応が起らない可能性
が高いからである。
【0005】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
の一つの手段として、蛍光物質で標識した抗体を用い
て、測定対象物を測定することにおいて標識抗体と測定
対象物が凝集することにより起こる蛍光強度の減少を測
定することを特徴とする蛍光免疫測定法を利用した。こ
の方法では、凝集隗に取り込まれた蛍光物質は、凝集前
のものと比較して蛍光物質同士が近傍に集まっているた
め自己消光作用を起こす。この方法では抗体を標識する
ため抗原性を変えることなく、つまり抗原抗体反応性を
変化させることなく測定することができる。
【0006】また、もう一つの手段として、蛍光物質で
標識した抗体と蛍光消光物質で標識した測定対象物質を
用いて、検体中の測定対象物を測定することにおいて、
検体中に測定対象物が存在することにより標識抗体と標
識抗原の凝集を阻害する結果起こる蛍光強度の増加を測
定することを特徴とする蛍光免疫測定法あるいは、標識
物質を抗体側と抗原側を入れ替えた方法を利用した。こ
の方法では、検体中に測定対象物がない場合には、蛍光
標識した抗体と蛍光消光物質標識した抗原とが凝集して
蛍光物質と蛍光消光物質が近傍になるため消光作用を起
こす。一方、検体中に測定対象物がある場合には、蛍光
標識した抗体と測定対象物とが凝集し、蛍光標識抗原が
単体で存在し、蛍光物質と蛍光消光物質が近傍にないた
め消光作用を起こさない。この方法では、抗体としてポ
リクローナル抗体あるいは数種類のモノクローナル抗体
を使用した。この方法により抗原性を著しく変えること
なく、つまり抗原抗体反応性を変化させることなく測定
することができる。
【0007】本発明の蛍光免疫測定法を利用することに
より、高分子量を有する物質、特に蛋白質の測定キット
を容易に提供することができる。
【0008】
【発明の実施の形態】本発明では、抗体あるいは抗原の
アミノ基と結合できる官能基を有している蛍光色素を利
用する。タンパク質との結合効率の面から官能基として
は、サクシミドあるいはイソチオシアネート基が望まし
い。
【0009】抗体あるいは抗原1分子に対する蛍光色素
の結合数は、任意に変えることが可能であり、なるべく
多く結合させることができる。しかし、多く結合させる
と抗体あるいは抗原の性能(親和性、溶解性等)を低下
させる恐れがあるため、結合数は1〜20までが望まし
い。色素を抗体あるいは抗原に結合する際、上記官能基
を有する場合には室温で数時間で結合することができ
る。その後、未反応色素をゲル濾過あるいは透析により
容易に取り除くことができる。
【0010】また、蛍光消光物質を標識する場合におい
ても、抗体あるいは抗原のアミノ基と結合できる官能基
を有している蛍光消光物質を利用する。タンパク質との
結合効率の面から官能基としては、サクシミドあるいは
イソチオシアネート基が望ましい。
【0011】抗体あるいは抗原1分子に対する蛍光消光
物質の結合数は、任意に変えることが可能であり、なる
べく多く結合させることができる。しかし、多く結合さ
せると抗体あるいは抗原の性能(親和性、溶解性等)を
低下させる恐れがあるため、結合数は1〜20までが望
ましい。色素を抗体あるいは抗原に結合する際、上記官
能基を有する場合には室温で数時間で結合することがで
きる。その後、未反応色素をゲル濾過あるいは透析によ
り容易に取り除くことができる。
【0012】今回発明した蛍光免疫測定法を導入するこ
とにより多くの測定対象物を測定することができる。特
に、免疫測定項目の大多数を占めているタンパク質を定
量的に測定するには、本発明の蛍光免疫測定法を利用す
ることが最も容易な方法であると考えられる。
【0013】今回発明した蛍光免疫測定法は、蛍光物質
の局所的高濃度による自己消光現象あるいは、蛍光消光
剤を利用した蛍光消光現象を抗原抗体反応による凝集作
用に導入することにより測定対象物測定法を提供する。
【0014】以下に、具体的に上記発明の一例として、
蛍光色素としてフルオレセイン、蛍光消光物質としてニ
ッケル錯体、抗体として抗CRPポリクローナル抗体を
用いて測定対象物としてCRPを測定した方法について
記述する。
【0015】(フルオレセイン標識抗CRP抗体の作
製)FLUORESCEIN-ISOTHIOCYANATE(FITC、Mw=389、吸収
極大:約490nm)1.30mgを100μlのDMFに溶解した(3.3
3*10-6モル、抗体比50倍当量)。
【0016】この液を10mg/ml抗CRP抗体液(6.67*10-8モ
ル)に添加し、室温で一晩撹拌しながら反応した。
【0017】反応後、SephadexG-25カラム(サイズ:40
0*20mm、平衡バッファ:PBS、流速:2ml/分)にか
け、タンパク質分画のみを集めた。
【0018】この分画を紫外線・可視光線スペクル分析
を行った結果、抗体1個あたりに10.5個のFITCが結合し
ていた(抗CRP-FITC)。
【0019】(フルオレセイン標識CRPの作製)FLUO
RESCEIN-ISOTHIOCYANATE(FITC、Mw=389、吸収極大:約
490nm)1.30mgを100μlのDMFに溶解した(3.33*10-6モ
ル、抗体比50倍当量)。
【0020】この液を7.14mg/mlCRP液(6.67*10-8モル)
に添加し、室温で一晩撹拌しながら反応した。
【0021】反応後、SephadexG-25カラム(サイズ:40
0*20mm、平衡バッファ:PBS、流速:2ml/分)にか
け、タンパク質分画のみを集めた。
【0022】この分画を紫外線・可視光線スペクル分析
を行った結果、抗体1個あたりに9.5個のFITCが結合し
ていた(CRP-FITC)。
【0023】(ニッケル錯体標識抗CRP抗体の作製)
BIS(trichlorBenzenedithol)Nickel-ISOTHIOCYANATE
(NiITC、Mw=481)1.60mgを100μlのDMFに溶解した
(3.33*10-6モル、抗体比50倍当量)。
【0024】この液を10mg/ml抗CRP抗体液(6.67*10-8モ
ル)に添加し、室温で一晩撹拌しながら反応した。
【0025】反応後、SephadexG-25カラム(サイズ:40
0*20mm、平衡バッファ:PBS、流速:2ml/分)にか
け、タンパク質分画のみを集めた。
【0026】この分画を紫外線・可視光線スペクル分析
を行った結果、抗体1個あたりに6.2個のNiITCが結合し
ていた(抗CRP- NiITC)。
【0027】(ニッケル錯体標識CRPの作製)BIS(t
richlorBenzenedithol)Nickel-ISOTHIOCYANATE( NiIT
C 、Mw=481)1.60mgを100μlのDMFに溶解した(3.3
3*10-6モル、抗体比50倍当量)。
【0028】この液を7.14mg/mlCRP液(6.67*10-8モル)
に添加し、室温で一晩撹拌しながら反応した。
【0029】反応後、SephadexG-25カラム(サイズ:40
0*20mm、平衡バッファ:PBS、流速:2ml/分)にか
け、タンパク質分画のみを集めた。
【0030】この分画を紫外線・可視光線スペクル分析
を行った結果、抗体1個あたりに7.2個のNiITCが結合し
ていた(CRP- NiITC)。
【0031】(FITC-抗CRPの自己消光によるCRP測定)
上記で作製した抗CRP-FITC溶液700μlの蛍光測定を行っ
た(温度:20度、励起波長:490nm、蛍光波長:520n
m)。測定後、この溶液に各濃度のCRP(最終濃度:0か
ら20mg/dl)10μlを混合し、2分後再度蛍光を測定し
た。その結果、添加したCRP量の増加とともに蛍光強度
が減少した(図1)。
【0032】(FITC-抗CRPとニッケル錯体標識CRPを用
いたCRP測定)上記で作製した抗CRP-FITC溶液500μlと
ニッケル錯体標識CRP溶液500μlを混合し、2分後の蛍光
測定を行った(温度:20度、励起波長:490nm、蛍光波
長:520nm)。次に、抗CRP-FITC溶液500μlに各濃度のC
RP(最終濃度:0から20mg/dl)10μlを混合し、2分後さ
らにニッケル錯体標識CRP溶液500μlを混合し、その2
分後に再度蛍光強度を測定した。その結果、添加したCR
P量の増加とともに蛍光強度が増加した(図2)。
【0033】(ニッケル錯体標識抗CRPとFITC-CRPを用
いたCRP測定)上記で作製したニッケル錯体標識抗CRP溶
液500μlとFITC-CRP溶液500μlを混合し、2分後の蛍光
測定を行った(温度:20度、励起波長:490nm、蛍光波
長:520nm)。次に、ニッケル錯体標識抗CRP溶液500μl
に各濃度のCRP(最終濃度:0から20mg/dl)10μlを混合
し、2分後さらにFITC-CRP溶液500μlを混合し、その2
分後に再度蛍光強度を測定した。その結果、添加したCR
P量の増加とともに蛍光強度が増加した(図2)。
【0034】
【発明の効果】以上のように本発明は、蛋白質を始めと
する高分子量の物質を容易に測定できる方法を得ること
ができた。
【0035】また、本発明の蛍光免疫測定法を利用する
ことにより高性能な環境測定キット、食品管理測定キッ
ト及び医療診断キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】図は本発明の蛍光免疫測定法を用いて、CRP
を測定した結果を示す図
【図2】図は本発明の蛍光免疫測定法を用いて、CRP
を測定した結果を示す図

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】蛍光物質で標識した抗体を用いて、測定対
    象物を測定することにおいて標識抗体と測定対象物が凝
    集することにより起こる蛍光強度の減少を測定すること
    を特徴とする蛍光免疫測定法。
  2. 【請求項2】蛍光物質で標識した抗体と蛍光消光物質で
    標識した測定対象物質を用いて、検体中の測定対象物を
    測定することにおいて、検体中に測定対象物が存在する
    ことにより標識抗体と標識測定対象物の凝集を阻害する
    結果起こる蛍光強度の増加を測定することを特徴とする
    蛍光免疫測定法。
  3. 【請求項3】蛍光消光物質で標識した抗体と蛍光物質で
    標識した測定対象物質を用いて、検体中の測定対象物を
    測定することにおいて、検体中に測定対象物が存在する
    ことにより標識抗体と標識測定対象物の凝集を阻害する
    結果起こる蛍光強度の増加を測定することを特徴とする
    蛍光免疫測定法。
  4. 【請求項4】ポリクローナル抗体あるいはモノクローナ
    ル抗体の混合物であることを特徴とする請求項1、2ま
    たは3に記載の蛍光免疫測定法。
  5. 【請求項5】測定対象物が、多抗原性を有する物質であ
    ることを特徴とする請求項1、2または3記載の蛍光免
    疫測定法。
  6. 【請求項6】多抗原性物質がウイルス、細菌、器官、ペ
    プチド、蛋白質、オリゴ糖、あるいは多糖であることを
    特徴とする請求項5記載の蛍光免疫測定法。
  7. 【請求項7】蛋白質が、HCG、LH,FSH,TSH
    あるいはCRPであることを特徴とする請求項5記載の
    蛍光免疫測定法。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002040024A (ja) * 2000-03-31 2002-02-06 Ortho-Clinical Diagnostics Inc C反応性蛋白についての免疫測定
WO2003060519A1 (fr) * 2001-12-27 2003-07-24 Techno Network Shikoku Co., Ltd. Procede permettant de tester une reaction d'agglutination
WO2011061944A1 (ja) 2009-11-19 2011-05-26 株式会社プロテイン・エクスプレス 蛍光免疫測定方法
WO2013065314A1 (ja) 2011-11-02 2013-05-10 ウシオ電機株式会社 蛍光標識抗体可変領域含有ポリペプチド複合体を用いた蛍光免疫測定方法

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KR20140084266A (ko) 2011-11-02 2014-07-04 우시오덴키 가부시키가이샤 형광 표지 항체 가변 영역 함유 폴리펩티드 복합체를 이용한 형광 면역 측정 방법

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