ES2322931T3 - Preparacion de esferas para pruebas de diagnostico. - Google Patents

Abstract

Una esfera de reactivo rígida, liofilizada, la esfera comprende un reactivo útil para detectar un analito en una muestra dada, en donde el reactivo se distribuye a través de una red de carbohidrato que consiste de trehalosa, y la esfera de reactivo está libre de tensoactivo.

Description

Preparación de esferas para pruebas de diagnóstico.

Campo técnico de la invención

Esta invención se relaciona con la producción de esferas o glóbulos estabilizados que están libres de tensoactivos o detergentes y que contienen componentes diagnósticamente y terapéuticamente útiles tal como anticuerpos, antígenos, y otros agentes fisiológicos útiles para una variedad de propósitos terapéuticos y diagnósticos. Esta también se relaciona con productos producidos por los procesos novedosos.

Antecedente de la invención

Al preparar reactivos para prueba eficiente y conveniente de muestras biológicas clínicas, es frecuentemente importante obtener mezclas químicas secas en cantidades discretas uniformes. Así, los reactivos miden normalmente y precisamente cantidades pequeñas de químicos frecuentemente con excipientes inertes. Se ha conocido que esto se hace convenientemente al suministrar soluciones de químicos. Desafortunadamente, las soluciones líquidas de muchos materiales, y en particular, materiales biológicamente activos tal como anticuerpos, enzimas, ciertas proteínas, y materiales hidrolizables no son generalmente estables en la solución. Por lo tanto se proporcionan frecuentemente en forma seca para mejorar la estabilidad.

La tecnología actual para producir mezclas químicas secas involucra procedimientos tal como mezcla seca, secado por rociado, secado de lecho fluido y la formación de esferas rígidas. Todos estos procedimientos, sin embargo, tienen limitaciones que los hacen costosos, ineficientes o difíciles de implementar. En la tecnología de mezclado seco, es difícil obtener mezclas homogéneas de químicos que tienen diferentes densidades. Más aún, la homogeneidad es particularmente difícil de lograr cuando cantidades muy pequeñas de ingredientes se mezclan con grandes cantidades de otros. Una vez hecho homogéneo, es extremadamente difícil suministrar de manera reproducible (dentro de 1%) cantidades pequeñas (menos de aproximadamente 10 mg) de los químicos mezclados.

La tecnología de secado por rociado produce mezclas más homogéneas de químicos debido a que los reactivos se disuelven primero en líquido. Al utilizar secado por rociado, sin embargo, es difícil y costoso obtener cantidades de tamaño preciso de químicos mezclados. Como se practica generalmente, este proceso produce partículas con distribuciones de tamaño que tienen coeficientes de variación en peso de más de 20%. Las partículas resultantes se han procesado para obtener tamaños de partícula uniformes. Después de aglomeración, las partículas son generalmente menos solubles que las partículas de secado por rociado originales. Más aún, estos procedimientos típicamente utilizan soluciones criogénicas de halocarbonos que son peligrosas para el medio ambiente y no se pueden emplear con algunos reactivos tal como anticuerpos ya que ellos pueden inactivarlos.

La tecnología de lecho fluido se basa en rociar una mezcla de reactivo líquida sobre una partícula y secar el líquido para obtener una partícula cubierta con los reactivos mezclados. Utilizando este procedimiento, es difícil obtener partículas de tamaño uniforme y producir un producto uniforme.

Una alternativa utilizada comúnmente para la producción de los productos deseados es el tubo recubierto con una solución de los materiales deseados seguido por secado por calor, aire o congelamiento. Desafortunadamente, muchos materiales que son tubos recubiertos se unen fuertemente a la superficie del tubo y no se redisolverán rápidamente cuando se agrega líquido al tubo. Esto puede complicar ensayos debido al lapso de tiempo requerido para alcanzar la disolución completa. En algunos casos, la redisolución lenta y posiblemente incompleta evitará el desarrollo de un ensayo útil.

Ahora se ha descubierto que el uso de esferas uniformes preformadas, elimina el problema de disolución lenta y ofrece grandes ventajas sobre las técnicas de secado del tubo.

La preparación de esferas sustancialmente uniformes secas rígidas es una alternativa atractiva para producir mezclas secas ya que las esferas son relativamente fáciles para preparar con cantidades definidas de ingredientes, activos e inertes. Adicionalmente, ellos son fáciles de manejar y se disuelven fácilmente en los fluidos corporales tal como orina, sangre, suero y plasma.

Hasta ahora tales esferas o glóbulos se han preparado de soluciones acuosas que contienen detergentes o tensoactivos al gotear cantidades medidas de las soluciones en un líquido criogénico tal como nitrógeno, recolectar los glóbulos congelados que se forman y después de esto, liofilizar los glóbulos para remover la humedad. Los glóbulos así formados son útiles para algunos propósitos pero no se pueden emplear en pruebas biológicas que se afectan adversamente por la presencia de tensoactivos residuales que se distribuyen a través de los glóbulos después de liofilización.

Por ejemplo, los glóbulos no son útiles en pruebas que requieren sangre completa o tiene lugar en la presencia de glóbulos rojos intactos o glóbulos blancos intactos ya que los tensoactivos originan lisis celular sanguínea e interfieren con la prueba. Este problema es especialmente agudo si la prueba es una que requiere visualización o detección del producto en la ausencia de apagado por hemoglobina, o los glóbulos blancos intactos tal como se utilizan en varios ensayos quimioluminiscentes como se describe adelante.

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La técnica ha invertido mucho tiempo y esfuerzo buscando producir reactivos estables, secos que contienen cantidades exactas de componentes seleccionados útiles para analizar muestras biológicas tal como sangre, plasma, suero, orina y otros fluidos corporales. Ver, por ejemplo las siguientes Patentes de los Estados Unidos: 3,721,725; 4,820,627; 3,932,943; 4,115,537; 4,848,094; 4,755,461; 4,655,047; 4,678,812; y 4,762,857, que se relacionan generalmente con secado por rociado de mezcla seca y secado de lecho fluido.

Una patente más recientemente publicada, Patente de los Estados Unidos 5,413,732 describe y reivindica un método para proporcionar esferas de reactivos liofilizadas adecuadas para análisis de muestras biológicas, en particular análisis de muestras de sangre en un analizador centrífugo.

Una ventaja particular del proceso descrito es que las esferas se preparan a partir de una solución acuosa. Por lo tanto no es difícil asegurar que en los productos finales los componentes secos se distribuyen uniformemente y en las proporciones apropiadas.

Los glóbulos o esferas de reactivo preferidas por el proceso de la patente se definen cuando comprenden los reactivos necesarios para las pruebas propuestas junto con rellenos y tensoactivos. Ver por ejemplo el primer párrafo de la columna 1, columna 6, líneas 41 a 60 y todos los ejemplos.

Existen, como se indicó anteriormente, pruebas biológicas que no se pueden conducir en la presencia de tensoactivos. Una tal prueba es una prueba para septicemia e infecciones descritas en J. of Immunol. Methods 212 (1996) 169-165; Patente U.S. 5,804,370. Las invenciones descritas en estas publicaciones son aplicables para reconocer infecciones y septicemia, que incluyen sus varias etapas. El punto más importante de las invenciones es la formación de un complejo anticuerpo/antígeno que se une a los receptores específicos en neutrófilos, linfocitos o monocitos en la presencia del complemento para provocar una absorción rápida oxidativa que se puede detectar como emisión liviana utilizando, por ejemplo, un agente quimioluminiscente tal como luminol o lucigenina. El nivel de la absorción rápida oxidativa se relaciona con el nivel del antígeno.

Las pruebas son aplicables para el reconocimiento de una variedad de antígenos relacionados con infección y septicemia que incluyen, por ejemplo, microorganismos y sus componentes, que incluyen constituyentes de pared celular gram positivos y endotoxinas gram negativas, lipopolisacáridos, ácido lipoteicoico, y los mediadores inflamatorios que aparecen en la circulación como un resultado de la presencia de estos componentes que incluyen factor de necrosis de tumor (TNF), interleuquina-1 (IL-1) y otras interleuquinas y citoquinas. Otros antígenos a los que las pruebas son aplicables incluyen aquellos relacionados con abuso de drogas, hormonas, toxinas, fármacos terapéuticos, marcadores de daño del músculo cardiaco, ovulación, embarazo y otras pruebas similares.

De acuerdo con el procedimiento preferido para conducir las pruebas, el anticuerpo complementario para el antígeno o analito de interés se distribuye en una o más esferas o glóbulos tal como aquellos que son la materia objeto de esta invención.

Se ha observado que si las esferas contienen tensoactivos, ellas no se pueden utilizar para conducir las pruebas descritas ya que los tensoactivos interfieren con las varias reacciones necesarias para la producción de una emisión de luz medible y detectable.

Existen todavía otras pruebas que no son posibles en la presencia de tensoactivos. Estas pruebas también se basan en las reacciones de anticuerpo/antígeno que producen una señal detectable. Mientras las pruebas son aplicables para detectar una variedad de antígenos, ellas son particularmente adecuadas para la detección de analitos cardiacos tal como mioglobina, troponina I, troponina T y CK-MB que se liberan en la sangre del tejido cardiaco deteriorado como un resultado del evento de daño de tejido tal como angina o infarto del miocardio.

Brevemente, las pruebas involucran poner en contacto muestra presunta de sangre completa, plasma o suero con un anticuerpo detector que se marca con un marcador detectable. El oro es el marcador preferido ya que esta produce un color púrpura que es visible a simple vista. Si existe un analito cardiaco complementario al anticuerpo detector presente en la muestra, el analito y el anticuerpo reaccionarán para formar un complejo de anticuerpo/analito marcado con oro que luego reacciona con un anticuerpo de captura para concentrar el complejo e incrementar la visibilidad del color púrpura.

Se prefiere utilizar sangre completa para conducir las pruebas diferentes de suero o plasma. Sin embargo, los glóbulos rojos en sangre completa interfieren con la detección visual del color producido por el marcador seleccionado.

La técnica anterior identificada anteriormente utiliza un dispositivo para la rápida detección de analitos cardiacos utilizando sangre completa. En resumen, el dispositivo es un dispositivo de portátil en el que una membrana porosa se mantiene entre los soportes rígidos inferiores y superiores. La membrana es típicamente nitrocelulosa. Los soportes son plásticos tal como un polímero acrílico. Los soportes, pueden ser transparentes para permitir al usuario ver el color formado como un resultado de las reacciones que tienen lugar. Alternativamente, ellos pueden ser opacos con una abertura a través de la cual se puede observar la señal detectable.

El dispositivo se forma con una ruta para el movimiento de una muestra de prueba del puerto de entrada para la captura del anticuerpo. La ruta incluye canales formados en las membranas de soporte que están en contacto cooperativo con otros canales formados en la membrana porosa.

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En una modalidad de las invenciones descritas, la sangre completa entra a la ruta y pasa alrededor de un glóbulo que contiene un anticuerpo detector marcado, que disuelve el glóbulo y sus componentes y luego fluye en la membrana porosa. La sangre completa se mueve a través de la membrana por acción capilar. Cuando esta pasa a través de la membrana los glóbulos rojos se separan cromatográficamente del plasma. El plasma luego entra a un canal en la membrana en donde se ubica el anticuerpo capturado.

En una prueba positiva utilizando un marcador dorado, el glóbulo que contiene el anticuerpo se disuelve en la sangre completa y se forma el complejo de anticuerpo/analito marcado. Los glóbulos rojos se separan como se describe y el plasma que contiene el complejo, pero libre de glóbulos rojos, entra al canal de captura en donde el complejo reacciona con el anticuerpo de captura.

El dispositivo se puede diseñar con uno o más canales de captura para detectar uno o varios analitos. Si solo se utiliza un canal de captura, este puede contener uno o más anticuerpos de captura espaciados. Alternativamente, puede haber un anticuerpo de captura en cada uno de los dos o más canales de captura. Así, el dispositivo se puede emplear para detectar cada uno de los analitos mencionados anteriormente o cualquier combinación de estos. Esto por supuesto, no se limita a los analitos mencionados pero puede con los anticuerpos complementarios apropiados, monoclonal o policlonal, ser utilizados para detectar cualquiera de un gran número de analitos conocidos para ser liberados por el tejido cardiaco dañado. Se identifican muchos tales analitos en la Patente US. 5,749,274 presentada en Mayo 5,
1998.

Con las pruebas de septicemia e infección mencionadas anteriormente, la presencia de tensoactivos en el anticuerpo que contiene el glóbulo interfiere con las pruebas para analizar sangre completa para analitos cardiacos. En este caso, surge la interferencia debido a que los tensoactivos originan hemólisis de los glóbulos rojos que liberan todos sus componentes incluyendo hemoglobina rica en color. La hemoglobina no se puede separar por la membrana y, como un resultado, entra al canal de captura y oscurece la señal.

La US-A-5,763,157 describe una esfera de reactivo que comprende por lo menos un reactivo biológico y un material de relleno que forma cristal en una concentración suficiente para facilitar la formación de una composición porosa, vidriosa, en donde la semi-esfera de reactivo es soluble en agua y tiene un T_{g} suficiente para estabilidad a temperatura ambiente. Se combinan por lo menos dos carbohidratos para crear la esfera de reactivo. El primer carbohidrato es un polímero sintético de alto peso molecular. El segundo carbohidrato es diferente del primer carbohidrato. Se proporciona un método para elaborar la esfera de reactivo.

Resumen de la invención

Esta invención proporciona esferas de reactivos libres de tensoactivos, rígidas, liofilizadas de la reivindicación 1. Las esferas son útiles para analizar fluidos corporales para la presencia de analitos, que incluyen aquellos que sirven como marcadores diagnósticamente útiles de una afección médica. Las esferas de la presente invención son especialmente útiles en el desempeño de bioensayos con muestras que contienen células que están intactas, y deben permanecer para evitar la contaminación del ensayo y/o retener la integridad del analito. En modalidades específicas de la invención, el reactivo es un anticuerpo reactivo con un marcador diagnóstico de una afección médica dada.

De acuerdo con lo anterior, en un aspecto de la presente invención, se proporciona una esfera de reactivo libre de tensoactivos, rígida, liofilizada que contiene por lo menos un reactivo en una red de carbohidrato que consiste de trehalosa. En modalidades de la invención, los glóbulos son generalmente uniformes en tamaño, por virtud de que han sido formados de gotitas generalmente de volumen uniforme.

En modalidades preferidas de la presente invención, las esferas contienen un reactivo que es un patrón de unión para el analito de interés, y más preferiblemente es un anticuerpo. Los reactivos particularmente preferidos son anticuerpos reactivos con un marcador que es diagnóstico de una afección médica dada.

En otro aspecto de la presente invención, las esferas se proporcionan específicamente para uso en desarrollar un bioensayo en una muestra que contiene células intactas. Tales muestras incluyen, por ejemplo, sangre completa y sus fracciones que contienen células. Así, la presente invención proporciona adicionalmente un método para desarrollar un bioensayo en una muestra que contiene células intactas, el método comprende la etapa de obtener una o más esferas libres de tensoactivo de la presente invención que contienen un reactivo útil en la detección de un analito presente en la muestra, incubar las esferas con la muestra que contiene células intactas, y luego determinar la presencia del analito reactivo con el reactivo.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un proceso para preparar las esferas de la presente invención de acuerdo con la reivindicación 20.

Pesar las gotas de los líquidos es un método establecido para asegurar la producción de gotas de tamaño uniforme. El tamaño uniforme resulta de la producción de gotas que tienen tensión superficial uniforme que resulta del uso de tensoactivos. En la ausencia de tensoactivos, puede haber una variación en la tensión superficial de las gotas y esto resulta en la producción de gotas que carecen de uniformidad debido a las impurezas, tal como polvos o químicos en la fase líquida.

En claridad de las enseñanzas de la técnica anterior, es sorprendente encontrar que las esferas útiles se pueden producir a partir de soluciones que no contienen tensoactivos. Estos hallazgos sorprendentes no reducen solamente los costos de producción sino que también extienden la utilidad de las esferas a pruebas y ensayos en las que la presencia de tensoactivos es perjudicial. Los términos tensoactivo y detergente se utilizan intercambiablemente aquí.

Las esferas de esta invención retienen todas las ventajas reconocidas en la técnica de los productos anteriores que contienen tensoactivos. Ellos disueltos rápidamente, son fáciles de manejar y son suficientemente rígidos de tal manera que ellos no son fácilmente comprimidos o dañados de otra forma por tratamiento duro. Adicionalmente, debido a que ellos se preparan de soluciones, sus componentes, aún aquellos presentes en cantidades pequeñas, se distribuyen uniformemente.

Descripción detallada de la invención

Las esferas de la presente invención se caracterizan como esferas de reactivo, rígidas, liofilizadas que son libres de tensoactivos. Las esferas que son libres de tensoactivos tienen el beneficio que ellas no interfieren con bioensayos basados en células al originar o promover la lisis celular. De acuerdo con lo anterior, las esferas que son libres de tensoactivos son esferas que, cuando se mezclan con una muestra que lleva células, no originan o promueven ninguna lisis celular indeseada en la muestra.

Las esferas de la presente invención contienen trehalosa como un carbohidrato soluble en agua, inerte que sirve para formar una estructura de red que da las esferas, en su forma liofilizada, una rigidez que, de otra parte, confiere estabilidad durante manejo y, por otro parte, les permite disolverse rápidamente en un medio de reacción acuoso. La trehalosa permite la preparación de productos excelentes debido a sus propiedades estabilizantes conocidas.

En adición al carbohidrato, las esferas de la presente invención contienen un reactivo útil para ensayar un analito dado. Una amplia variedad de tales reactivos son útiles en, y contemplado por, la presente invención. Debido a que las esferas de la presente invención se adaptan bien para uso en ensayos basados en células, ellos son bien adecuados para incorporar uno o más reactivos de un tipo útil en bioensayos. Tales reactivos incluyen antígenos, anticuerpos, y varios otros marcadores de afecciones médicas, trastornos y enfermedades que pueden ser proteínas, ácidos nucleicos y carbohidratos. En ciertas modalidades, las esferas contienen uno o más reactivos para desarrollar un ensayo particular para un analito particular, que puede incluir, por ejemplo, un sustrato sobre el cual puede actuar el analito, una enzima que actúa en el analito o en el producto de una reacción enzimática previa, un cofactor para una enzima, un reactivo cromogénico para formar un producto detectable visiblemente, un reactivo fluorogénico para formar un producto fluorescente, un reactivo quimioluminiscente para formar un producto detectable por luminiscencia, o un ácido nucleico probado tal como un "beacon" molecular. Las esferas de reactivo pueden contener una combinación particular de reactivos para determinar un analito, o una pluralidad de tales combinaciones de reactivo para determinar más de un analito en una muestra. Esferas de reactivo pueden contener un calibrador, reactivo de control positivo o estándar para un ensayo particular. Estos ejemplos son únicamente de ejemplo y no limitantes para los varios usos por lo que las esferas de reactivo de la invención se pueden emplear para proporcionar reactivos determinantes de uno o más analitos, particularmente en sistemas sensibles en la presencia de detergentes o tensoactivos.

En una modalidad preferida de la invención, el reactivo es un anticuerpo reactivo con un analito de interés diagnóstico o con objetivo de interés terapéutico. Tales anticuerpos pueden ser reactivos con tales analitos como marcadores de enfermedad o afecciones médicas. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo reactivo IgM con lipopolisacáridos (LPS) que es un marcador de septicemia. En otras modalidades, el anticuerpo es reactivo con marcadores de progresión de la enfermedad. Por ejemplo, las proteínas provocadas en forma de cascada se pueden detectar cuando el anticuerpo es reactivo con estas proteínas. En el caso de septicemia, los anticuerpos pueden ser reactivos con TNF, IL-6 y otras interleuquinas y citoquinas producidas en respuesta a un mediador inicial de la cascada de septicemia. Alternativamente, el anticuerpo puede ser un reactivo con marcadores de daño cardiaco, por ejemplo, con troponina I, creatina quinasa MB, mioglobina y similares, por ejemplo para diagnóstico de infarto del miocardio. No se pretende limitar el tipo de anticuerpo o el de las especies de anticuerpo incorporadas dentro de las esferas. También se aprecia que una esfera dada puede incorporar un número de anticuerpos reactivos con diferentes antígenos.

Para preparar los productos de esta invención, la primera etapa es disolver los componentes en agua para formar una solución acuosa que comprende agua, trehalosa y anticuerpo en la concentración apropiada.

La solución es preferiblemente, aunque no necesariamente, desgasificada y luego agregada en forma de gotas al nitrógeno líquido en un contenedor tal como una botella aislante. Las gotas se pueden formar por rociado a través de una aguja con un orificio seleccionado. Preferiblemente, sin embargo las gotas se suministran a través de la bomba calibrada de tal manera que las gotas cada una son de un volumen uniforme. La distancia a través de la caída de las gotas es suficiente de tal manera que ellas forman esferas uniformes. Cuando las esferas alcanzan el vapor de nitrógeno líquido frío ellas empiezan a congelar mientras se suspenden en una capa de vapor. Cuando se completa el congelamiento (aproximadamente 10-20 seg.), las esferas se sumergen al fondo del nitrógeno líquido mientras se retiene su forma esférica.

Es importante que el intervalo de tiempo entre la liberación de las gotas de la bomba u orificio de la aguja es tal que ellos no chocan una con la otra antes que ellas se congelan. De otra forma los productos formados no son de tamaño, forma y volumen uniforme.

El nitrógeno líquido es el refrigerante de elección para la práctica de esta invención debido a que es fácilmente disponible y fácil para manejar. Adicionalmente, este es inerte para los componentes de los glóbulos, especialmente se pueden desactivar los anticuerpos con otros refrigerantes tal como halohidrocarburos.

Una vez se forman las esferas, ellas están listas para liofilización. Esta etapa se debe desarrollar sin permitir a las esferas descongelar. Si ellas se descongelan, ellas simplemente correrán juntas y reformarán la solución acuosa. De acuerdo con lo anterior, los glóbulos deseablemente no se recolectan del nitrógeno pero en cambio se retienen bajo el nitrógeno.

Un procedimiento de seguridad para la liofilización acompañante es transferir el nitrógeno líquido y los glóbulos a una bandeja u otro contenedor artificial amplio por ejemplo uno de acero inoxidable. Algo del nitrógeno se le puede permitir evaporar. Sin embargo, suficiente nitrógeno debe permanecer en la bandeja de tal manera que las esferas están bajo nitrógeno y se congelan.

En el tiempo apropiado, la bandeja se transfiere a un liofilizador que ha sido preenfriado de aproximadamente -20ºC a -30ºC y se inicia el ciclo de secado por congelamiento.

La velocidad de liofilización se puede aumentar incrementalmente para hacer al proceso más eficiente y para incrementar la velocidad en el que se obtienen las esferas secas.

Amplias variaciones en los ciclos de secado por congelamiento son posibles con efecto adverso. Un ciclo típico es: 12 a 18 horas a -20ºC a -15ºC; 1 a 4 horas a -10ºC a 10ºC; 1 a 4 horas a 20ºC a 25ºC.

El ciclo óptimo dependerá, por supuesto, de varios factores que incluyen la cantidad de esferas producidas, la velocidad de producción deseada, el tamaño y área de superficie de los glóbulos y la capacidad del anticuerpo para soportar los rigores del proceso de liofilización.

Una vez se completa el ciclo de secado por congelamiento, las esferas se recolectan y se utilizan inmediatamente o se colocan en un contenedor o disecador en donde ellos se protegen de la humedad. Se ha encontrado que los glóbulos preparados de esta forma mantienen su estabilidad y capacidad del anticuerpo o anticuerpos contenido para unir con su antígeno complementario durante dos meses a temperatura ambiente.

Los producidos elaborados por el proceso de esta invención son esferas uniformes que comprenden una red de carbohidrato que consiste de trehalosa en la que en una modalidad, se distribuye una cantidad preseleccionada de uno o más anticuerpos. La cantidad de un anticuerpo particular en la esfera se selecciona de tal manera que cuando la esfera se disuelve en la muestra corporal a ser analizada la concentración del anticuerpo estará en un nivel apropiado para reaccionar con el antígeno. Esto dependerá de varios factores bien conocidos por el técnico experto o fácilmente comprobables mediante procedimientos conocidos. Estos factores incluyen, por ejemplo, la prueba a ser desarrollada, la concentración esperada del antígeno y la afinidad del anticuerpo para el antígeno.

El proceso de esta invención es aplicable a la producción de esferas en las que la cantidad de anticuerpo presente está en sustancialmente cualquier valor práctico para el desarrollo de ensayos conocidos.

El proceso se puede utilizar para preparar esferas de cualquier tamaño o volumen práctico deseable útil para conducir ensayos biológicos.

Las enseñanzas de las patentes y solicitudes referidas en esta descripción, para tal referencia, se incluyen aquí en su totalidad.

Los siguientes ejemplos se dan solo por vía de ilustración y no se consideran como limitantes de esta invención ya que son posibles muchas variaciones evidentes sin variar de su espíritu y alcance.

Ejemplo 1 1. Glóbulos de Anticuerpo IgM

Para esta tanda de glóbulos de anticuerpo, se producen 1200 glóbulos en una concentración de glóbulos de 0.5 microgramos/20 microlitros.

Un frasco del anticuerpo IgM, en una concentración de 1.18 mg/ml, se remueve del congelador a -20ºC, se descongela y se centrifuga. La matriz utilizada para diluir el anticuerpo es 0.3 M trehalosa, preparada en agua libre de endotoxina estéril y se filtra en 0.2 micrometros.

El volumen total requerido es: 1200 glóbulos x 20 microlitros/glóbulo = 24000 microlitros = 24 ml. La cantidad de IgM requerido es: 1200 glóbulos x 0.5 microgramos/glóbulo = 600 microgramo = 0.6 mg. El volumen del anticuerpo IgM requerido es: 0.6 mg/1.18 mg/ml = 0.508 ml = 508 microlitros. El volumen de 0.3 M trehalosa requerido es: 24 ml-0.508 ml = 23.492 ml.

El IgM y la trehalosa se mezclan en un tubo cónico estéril de 50 ml y se centrifugan. Luego la solución se pone en hielo para mantener la solución fría.

El módulo de bomba dual dedicada IgM se limpia utilizando blanqueador e hidróxido de sodio, y luego se enjuaga con agua de horno. El módulo de bomba A se calibra en 20.1 microlitros y el módulo de bomba B se calibra en 20.0 microlitros utilizando agua de horno. Una vez el módulo de bomba dual se calibra, ambas líneas de salida en el módulo de bomba se colocan en el tubo cónico de 50 ml que contiene la solución IgM y la solución se ceba a través de las líneas de la bomba listas para suministro.

Los pesos de las gotas IgM se miden al suministrar una única gota en 5 tubos de centrifuga pesados previamente, y los tubos se vuelven a pesar. Esto se hace para cada módulo de bomba para asegurar que los módulos de bomba se calibren correctamente. El peso de calibración correcto para la gota de anticuerpo IgM está entre 20.3 a 20.8 mg.

1

El módulo de bomba A se calibra correctamente pero el módulo de bomba B se ha amontonado durante el cebado de las líneas; por lo tanto, este se vuelve a calibrar en 20.5 mg.

2

El nitrógeno líquido se vierte en dos botellas aislantes y se coloca directamente adelante de la punta de suministro. La punta está aproximadamente 5 cm antes del borde de la botella aislante para evitar congelamiento. El cronómetro automático se inicia y cada 6 segundos se suministran dos gotas, una en cada botella aislante. Cuando el volumen total de la solución IgM se ha suministrado, ambos botellas aislantes se vacían (nitrógeno líquido y glóbulos) en una bandeja de cocción en acero inoxidable.

La bandeja se coloca en un liofilizador precongelado (-20ºC) para secado por congelamiento, El ciclo de secado por congelamiento es: 12 horas a -20ºC; 1 hora a 0ºC; 1 hora a 25ºC. Después que ha finalizado el ciclo de secado por congelamiento, los glóbulos se remueven del liofilizador y se vierten en un tubo cónico estéril de 50 ml y se marca. Luego los glóbulos se prueban y muestran buena actividad y precisión.

2. Glóbulos LPS (Lipopolisacáridos)

Para esta tanda de glóbulos LPS, 6000 glóbulos se producen en una concentración de 2 ng/20 microlitros por glóbulo.

Un frasco de almacenamiento LPS en una concentración de 1 mg/ml, se remueve del congelador a -20ºC, se descongela y se centrifuga a fondo. La matriz utilizada para diluir el anticuerpo es 0.3 M trehalosa, preparada en agua libre de endotoxina estéril y se filtra en 0.2 micrometros. Una dilución de 1/1000 del LPS se prepara para producir una concentración de 1 microgramo/ml. 20 microlitros de materia prima LPS se mezcla con 20 ml de 0.3 M trehalosa en una botella de vidrio para cocción 20 ml con tapa de polipropileno para horno y se centrifuga a fondo.

El volumen total requerido es: 6000 glóbulos x 20 microlitros/glóbulo = 120000 microlitros = 120 ml. La cantidad de LPS requerido es: 6000 glóbulos x 2 ng/glóbulo = 12000 ng = 12 microgramos. El volumen de LPS requerido es: 12 microgramos/1 microgramo/ml = 12 ml. El volumen de 0.3 M trehalosa requerido es: 120 ml-12 ml = 108 ml.

Se desgasifica primero 108 ml de 0.3 M, luego se mezcla con el LPS en un beaker de cocción de 300 ml y se agita (la barra de agitación se coloca en el horno). Luego la solución se divide en alícuotas, en volúmenes de 24 ml, en botellas de vidrio de cocción de 6-30 ml y se congela a -20ºC. Esto se hace debido a que el LPS en la solución diluida no es estable a 4ºC durante largos periodos de tiempo.

El módulo de bomba dedicado LPS se limpia utilizando blanqueador e hidróxido de sodio, y luego se enjuaga con agua de horno. El módulo de bomba se calibra en 20.0 microlitros utilizando agua de horno. Una vez el módulo de bomba se calibra, la primera botella de la solución LPS se remueve del congelador, se descongela, se centrifuga, se desgasifica y luego se coloca en hielo para mantener la solución fría. La línea de salida para el módulo de bomba que se coloca en la botella contiene la solución LPS y la solución se ceba a través de las líneas de la bomba listas para suministrar. Cada dos horas (o cuando se necesite) una botella se remueve del congelador se descongela, se centrifuga a fondo y se desgasifica antes que sea pipeteada en la botella de suministro.

Los pesos de las gotas LPS se miden al suministrar una única gota en 5 tubos de centrifuga pesados antes, y los tubos se vuelven a pesar. Esto se hace para asegurar que el módulo de bomba se calibre correctamente. El peso de calibración correcto para la gota LPS está entre 20.3 a 20.8 mg.

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El nitrógeno líquido se vierte en una botella aislante y se coloca directamente delante de la tapa de suministro. La tapa está aproximadamente 5 cm antes del borde de la botella aislante para evitar congelamiento. El cronómetro automático se inicia y cada 6 segundos una gota se dispensa en la botella aislante. Cuando el volumen total de la solución LPS se ha suministrado, la botella aislante se vacía (nitrógeno líquido y glóbulos) en una bandeja de cocción en acero inoxidable.

La bandeja se coloca en un liofilizador precongelado (-20ºC) para secado por congelamiento. El ciclo de secado por congelamiento es: 12 horas a -20ºC; 1 hora a 0ºC; 1 hora a 25ºC. Después que ha finalizado el ciclo de secado por congelamiento, los glóbulos se remueven del liofilizador y se vierten en tubos cónicos estériles de 4-50ml y se marcan. Luego los glóbulos se prueban y muestran buena actividad y precisión.

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3. Glóbulos Zymosan

El Zymosan es una suspensión particulada que ha sido mantenida agitando las partículas en suspensión. Si la solución se deja reposar el zymosan se depositará en el fondo del tubo. Para esta tanda de glóbulos zymosan, 450 glóbulos se producen en 20 microlitros por glóbulo.

Cuando el zymosan se prepara éste se elabora en una concentración final de 3 mg/ml solución salina estéril y se almacena congelado en tubos cónicos estériles de 50 ml. Por lo tanto el zymosan necesita ser lavado con agua de horno para remover la solución salina. Primero se necesita calcular el volumen de zymosan requerido.

El volumen de zymosan requerido es 450 glóbulos x 20 microlitros/glóbulo = 9000 microlitros = 9 ml.

Nueve mls de zymosan se descongelan, se centrifugan y luego se centrifugan a 1500 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se aspira y la píldora se resuspende en el volumen original con agua de horno y se centrifuga. El zymosan de nuevo se hila, el sobrenadante se aspira y la píldora se resuspende con agua de horno.

El zymosan se centrifuga una última vez a 1500 rpm durante 10 minutos. El sobrendante se aspira pero en este tiempo la píldora se resuspende en su volumen original de 9 mls con 0.3 M trehalosa, preparado en agua libre de endotoxina estéril y se filtra en 0.2 micrometros.

El módulo de bomba se limpia utilizando blanqueador e hidróxido de sodio, y luego se enjuaga con agua de horno. El módulo de bomba se calibra en 20.0 microlitros utilizando agua de horno.

Una vez el módulo de bomba se calibra, la línea de salida para el módulo de bomba se coloca en el tubo que contiene la solución de zymosan y la solución se ceba a través de las líneas de la bomba listas para suministrar.

El nitrógeno líquido se vierte en una botella aislante y se coloca directamente encima de la tapa de suministro. La tapa está aproximadamente 5 cm antes del borde de la botella aislante para evitar congelamiento. El cronómetro automático se inicia y cada 6 segundos una gota se dispensa en la botella aislante. Cuando el volumen de suspensión del zymosan total se ha suministrado, la botella aislante se vacía (nitrógeno líquido y glóbulos) en una bandeja de cocción en acero inoxidable.

La bandeja se coloca en un liofilizador precongelado (-20ºC) para secado por congelamiento. El ciclo de secado por congelamiento es: 12 horas a -20ºC; 1 hora a 0ºC; 1 hora a 25ºC. Después que ha finalizado el ciclo de secado por congelamiento, los glóbulos se remueven del liofilizador y se vierten en un tubo cónico estéril de 50 mls y se marca.

Estos glóbulos se utilizan para prueba de septicemia de acuerdo con los procedimientos descritos en la patente y solicitudes de patente identificadas anteriormente.

Ejemplo 2

Se utilizan los mismos procedimientos pata preparar esferas que contienen anticuerpos para troponina I, CK-MB, mioglobina y otros analitos cardiacos que incluyen combinaciones de analitos, anticuerpos que reaccionan con bacterias gram positivas y gram negativas, ácido lipoteicoico, factor de necrosis de tumor, interleuquinas y otros productos.

Ejemplo 3

Los glóbulos de anticuerpo anti-LPS IgM descritos anteriormente y los glóbulos LPS se utilizan para medir la cantidad de endotoxina (LPS) en una muestra de sangre completa utilizando un ensayo de tres tubos como se describe en la solicitud copendiente S.N. 09/353,189. Este ensayo tiene la ventaja de glóbulos blancos presentes en la muestra de sangre completa para producir oxidantes en un nivel proporcional al nivel de inmunocomplejos formados en la muestra entre el anticuerpo anti-LPS agregado y cualquier LPS presente en la muestra. El Zymosan mejora la salida del oxidante. El Luminol convierte los oxidantes en salidas de luz visibles, medido en un luminómetro. El ensayo se desarrolla en la ausencia de detergentes o tensoactivos, como los glóbulos blancos en la muestra permanecen intactos para la generación de oxidantes en proporción al nivel de inmunocomplejos; los glóbulos rojos permanecen intactos para evitar interferencia en la medición de los oxidantes. Se preparan las siguientes alícuotas de reacción:

A = Sangre completa + zymosan

B = Sangre completa + zymosan + anticuerpo anti-LPS

C = Sangre completa + zymosan + anticuerpo anti-LPS + LPS exógeno

Las muestras de sangre utilizadas para el ensayo se extraen mediante punción de la vena o a través de catéter en las líneas arteriales en tubos Vacutainer de anti-coagulación 3 ml de EDTA estéril (Becton Dickenson, Franklin Lakes, New Jersey) que prueban antes el contenido de LPS (menos de 0.005 EU/ml).

El amortiguador para la medición de sangre completa o los estudios de quimioluminiscencia de glóbulos blancos es HBSS (libre de pirógeno, endotoxina menor de 0.005 EU/ml) que contiene 1.5 mM de sal de calcio y 0.9 mM de sal de magnesio (Gibco BRL, Grand Island, New York). Este amortiguador (500 ml) se mezcla vigorosamente durante la noche a 25ºC con luminol para proporcionar una solución saturada (150 \muM, HBSS-luminol) y luego se complementa con 4 U/ml de heparina de litio y zymosan.

Todos los experimentos de quimioluminiscencia se ensayan en triplicado y los resultados expresados como los conteos de luminómetro medio por minuto \pm 1 DE. También se pueden preparar los ensayos utilizando duplicado o tubos únicos para los tubos de reacción A, B y C.

Se sigue el siguiente protocolo de ensayo. Dos alícuotas de sangre (500 \mul) se suministran en tubos de vidrio despirogenados en un bloque de aluminio en termostato precalentados a 37ºC. Un tubo contiene una dosis máxima de LPS (2.3 ng, en un glóbulo de 20 \mul); el otro tubo se vacía. Estos tubos se incuban durante 10 min. a 37ºC. Durante los últimos 5 minutos estos tubos de ensayo de poliestireno y vidrio de incubación se cargan en el bloque de calentamiento. Se utilizan tres tubos por ensayo. El tubo A contiene el reactivo de control para la estabilización del anticuerpo o ningún reactivo; los tubos B y C contienen el anticuerpo (dos glóbulos por tubo, 0.75 \mug IgM por glóbulo). A cada tubo se agrega una mezcla de amortiguador Luminol con zymosan no opsonizado (500 \mul por tubo). Esta mezcla equilibra la temperatura durante por lo menos 5 min. Después que la sangre se incuba para un total de 10 min. a 37ºC, 40 \mul se transfieren en cada uno de los tubos A y B del tubo de sangre sin LPS y 20 \mul se transfieren del tubo de la sangre que contiene LPS en el tubo de ensayo C. Todos los tubos se centrifugan y se colocan en el quimioluminómetro para lectura. El luminómetro se termoconfigura a 37ºC y el ensayo está listo para un total de 20 min.

Se utilizan las integrales livianas de 20 minutos de los tubos A, B y C para calcular la cantidad de LPS en la muestra como sigue. La cantidad de LPS presente en la muestra se denomina como "actividad de endotoxina" (EA), y se calcula de las integrales livianas como sigue:

EA = 100 x \frac{\text{Tubo B integral liviano - Tubo A integral liviano}}{\text{Tubo C integral liviano - Tubo A integral liviano}}

De esta forma se calcula EA y la decisión de si un paciente es o no endotoxémico o se puede basar en un valor límite del corte, es decir > 40 unidades EA, un indicador de la endotoxemia clínicamente significativa. La infección Gram negativa se puede eliminar de las muestras con resultados menores de o iguales a 0.4 EA unidades.

Los parámetros adicionales están disponibles del ensayo de tres tubos que resulta ya que pertenece a la etapa de septicemia. Se calcula el grado de respuesta (R) de los glóbulos blancos de los pacientes, una medición de la capacidad máxima del glóbulo blanco para unir y responder a inmunocomplejos opsonizados como se definió anteriormente, como sigue:

R = 1 - \frac{\text{Tubo A integral liviano}}{\text{Tubo C integral liviano}}

Adicionalmente, una medición del nivel de activación de los glóbulos blancos y el número de células (CLmax) se puede medir como el índice de conteo en luminómetro pico del tubo A durante el curso del ensayo. La producción máxima de oxidante de neutrófilos, como se mide por CLmax, es una medición de la capacidad del glóbulo blanco para responder a la inoculación opsónica programada.

Aunque las esferas de reactivo libres de tensoactivo de esta invención son especialmente útiles para conducir pruebas y análisis de fluidos corporales en los que los tensoactivos tienen un efecto dañino, el técnico experto reconocerá que ellos también se pueden emplear en pruebas convencionales con base en antígeno/anticuerpo u otros tipos de reacciones, que incluyen reacciones enzimáticas, cromogénicas, fluorogénicas, o reacciones que emplean combinaciones de los anteriores. Las pruebas y ensayos típicos en los que las esferas de esta invención se pueden utilizar incluyen glucosa, lactato deshidrogenasa, suero glutámico- transaminasa oxaloacética (SGOT), transminasa pirúvica de suero glutámico (SGPT), nitrógeno ureico en sangre (BUN), proteína total, alcalinidad, fosfatasa alcalina, bilirrubina de proteína creatina, calcio, cloro, sodio, potasio, magnesio y similares. Esta lista no es exhaustiva y está destinado únicamente como ejemplo de los ensayos que se pueden desarrollar con las esferas de tensoactivo de la presente invención.

Claims (25)

1. Una esfera de reactivo rígida, liofilizada, la esfera comprende un reactivo útil para detectar un analito en una muestra dada, en donde el reactivo se distribuye a través de una red de carbohidrato que consiste de trehalosa, y la esfera de reactivo está libre de tensoactivo.

2. Una esfera de reactivo rígida, liofilizada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho reactivo es un anticuerpo útil para detectar un antígeno presente en la muestra dada.

3. Una esfera de reactivo libre de tensoactivo rígida, liofilizada en donde la esfera es útil para determinar la presencia de uno o más antígenos en un fluido corporal, que comprende por lo menos un anticuerpo reactivo con el antígeno, distribuido a través de una red de carbohidrato que consiste de trehalosa.

4. Una esfera de reactivo de la reivindicación 2 en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

5. Una esfera de reactivo de la reivindicación 2 en donde el anticuerpo reacciona con un analito cardiaco.

6. Una esfera de reactivo de la reivindicación 2 en donde el anticuerpo reacciona con un antígeno indicador de una infección.

7. Una esfera de reactivo de la reivindicación 2 en donde el anticuerpo reacciona con un antígeno indicador de septicemia.

8. Una esfera de reactivo de la reivindicación 5 en donde el anticuerpo reacciona con troponina 1.

9. Una esfera de reactivo de la reivindicación 5 en donde el anticuerpo reacciona con CK-MB.

10. Una esfera de reactivo de la reivindicación 5 en donde el anticuerpo reacciona con mioglobina.

11. Una esfera de reactivo de la reivindicación 1 en donde la esfera contiene por lo menos tres anticuerpos uno de los cuales reacciona con troponina I, otro con CK-MB y otro con mioglobina.

12. Una esfera de reactivo de la reivindicación 6 en donde el anticuerpo reacciona con un organismo infeccioso o un antígeno en un fluido corporal debido a la presencia del microorganismo.

13. Una esfera de reactivo de la reivindicación 12 en donde el organismo infeccioso es una bacteria gram positiva o gram negativa.

14. Una esfera de reactivo de la reivindicación 12 en donde el anticuerpo reacciona con ácido lipoteicoico, ácido teicoico o un peptidoglicano.

15. Una esfera de reactivo de la reivindicación 12 en donde el anticuerpo reacciona con un lipopolisacárido.

16. Una esfera de reactivo de la reivindicación 12 en donde el anticuerpo reacciona con una citoquina.

17. Una esfera de reactivo de la reivindicación 16 en donde la citoquina es una interleuquina o factor de necrosis de tumor.

18. Una esfera de reactivo de la reivindicación 2 en donde el anticuerpo reacciona con una droga de abuso o su derivado metabólico.

19. Una esfera de reactivo de la reivindicación 2 en donde el anticuerpo reacciona con un agente terapéutico.

20. Un proceso para preparar esferas de reactivo definidas en una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, que comprende las etapas de:

(a) formar una solución acuosa que consiste de agua, un reactivo y trehalosa, dicha solución acuosa es libre de tensoactivo capaz de lisar células intactas durante el desarrollo de un bioensayo;

(b) suministrar dicha solución acuosa como gotas discretas de volumen sustancialmente uniforme en una solución criogénica;

(c) mantener las gotas en la solución criogénica para originar su congelamiento; y

(d) liofilizar las gotas congeladas para formar esferas de reactivo libres de tensoactivo, secas.

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21. Un método para desarrollar un bioensayo que requiere la detección de un soporte analítico en una muestra que contiene células intactas, el método comprende las etapas de obtener una esfera de reactivo rígida, liofilizada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, incubar la esfera de reactivo con la muestra, y determinar la presencia del analito.

22. Una esfera de reactivo preparada por el método de la reivindicación 20.

23. Una esfera de reactivo rígida, liofilizada obtenible al suministrar una gota de solución acuosa en el nitrógeno líquido, en donde la esfera consiste de trehalosa y por lo menos un reactivo que reacciona con un analito de interés, y en donde adicionalmente la esfera está libre de tensoactivo.

24. Uso de una esfera de reactivo rígida, liofilizada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-19 y 22-23 para detectar un analito presente en una muestra que comprende células viables.

25. Uso de una esfera de reactivo rígida, liofilizada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-19 y 22-23 para desarrollar un bioensayo con una muestra que contiene células que deben permanecer intactas para retener la integridad del analito.