NO801936L - Diagnosereagens for parasitoser og allergier, fremgangsmaate for fremstilling av reagenset, samt anvendelse derav - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et nytt diagnosereagens

for parasitoser og allergier, en fremgangsmåte for fremstilling av dette nye reagens og en fremgangsmåte for diagnostisering av parasitoser og av allergier, særlig parasitoser for ormer som forårsaker en økning av de sirkulerende spesifikke immunoglobuliner, såsom IgE,IgG^IgM, ved hjelp av dette reagens.

Å beskytte mennesker og dyr mot parasitiske sykdommer representerer et av de største problemer i verden når det gjelder folkehelsen. Dersom utviklingslandene har løst et visst antall av deres parasitologiske problemer, men uten å ha fullstendig eliminert dem, så utgjør parasitoser hovedhindringen for økonomisk utvikling i mange land, og spesielt land i den varme del av kloden, som er slike land som må regne med den største mennesketetthet.

For å være i stand til å foreta en effektiv kamp mot den plage som skyldes parasitoser, er det viktig at man er i stand til å utføre positive, pålitelige og tidlige diagnoser av parasitoser.

Dersom, kliniske undersøkelser, røntgenstråle-undersøkelser

og informasjoner fra tidligere kjente tilfeller skal være til stor hjelp for å stille en diagnose, er det vesentlig, på grunn av biologiske fremgangsmåter og spesielt immunoparasitologiske fremgangsmåter, at granskingsteknikken er blitt utviklet dypt-gående. Det skyldes vesentlig undersøkelser av hemogrammet og sero-immunologiske undersøkelser at det nå er tilgjengelig, på

det parasitologiske området, "orienterings-argumenter" og "sikkerhets-argumenter" (GENTILINI ogPINON, Vie Medicale, 7. febr. 1973).

Det refereres nå ofte til en parasitisk etiologi, en . feber-manifestasjon som knapt kan bedømmes som "hepatisk", "urinarisk" eller "allergisk".

Det er således blitt foreslått tallrike serologiske teknikker: kutan-tester ved intradermoreaksjon, agglutinasjons-tester av latekspartikler og av sensitiserte røde blodlegemer, hemoagglutinerings-tester, utfelling, gelose-reaksjoner, immunoelektroforetiske analyser, tester med immunofluorescens, komplement-fikserings-reaksjoner etc..., og disse inntil nå konvensjonelle diagnosemetoder har det vært mulig å utvikle i det siste, siden fullstendig kjente og individualiserte antigen- fraksjoner har vært tilgjengelige, og siden også konserveringen og stabiliseringen av disse antigener har vært mestret, og likeledes deres standardisering. Alle disse fremgangsmåter har sine fordeler og sine mangler. Ingen er ufeilbare.

A. CAPRON og medarbeidere (path.Biol. 1970, vol, 18, s. 357-365) sammenligner resultatene oppnådd for immunologisk diagnose av menneske-echinococcosis ved de fire følgende metoder:

1) immunoelektroforese (I.E.),

2) hemagglutinering (H.M.G.),

3) agglutineringsreaksjon på lateks (A.L.) og

4) komplement-fikserings-reaksjonen (C.F.R.).

De samlede resultater av den immunologiske diagnose av hydatidose oppnådd av disse forfattere, er oppsummert i tabell I nedenfor.

Denne tabell fastslår den prosentvise positivitet, og

også de nedre og øvre grenser som ble oppnådd ved de forskjellige metoder som ble anvendt. Det ses at immunoelektroforese har muliggjort at 91,7% av tilfellene blir påvist. I alle tilfeller hvor forekomsten av en hydatidose er blitt positivt bestemt, er dette blitt bekreftet ved operasjonsmetoder, og det er aldri blitt påvist en unødvendig immunologisk diagnose, på den annen side har A.CAPRONog medarbeidere anmerket at et visst antall pasienter hvor den immunologiske respons var negativ, virkelig var hydantidose-bærere, og de manglende prosenter var 15,4 forI.E., 29% forR.F.C., 21,4% for H.M.G, og 24% for A.L.

En annen immunodiagnose-metode som er foreslått, vedrører radioallergosorpsjons-testen eller RAST. Denne test er basert

. på det faktum at de pasienter som plages av parasitose, har

unormalt store mengder med høy-spesifikk immunoglobulin E (igE). Denne metode er beskrevet i detalj av CESKA og medarbeidere (J. AllergyClin.Immunol. 1972, 49, 1). Denne RAST-teknikk har D. VERVLOET og medarbeidere [Rev. franc. Allergol. 1976, 16 (nr. 2), s. 73-78] anvendt på 60 pasienter med kirurgisk bekreftet hydatidose, og har vært i stand til å fastslå 54 ganger, nemlig 90%av tilfellene, nærvær av IgE'er spesifikt med hensyn til løselige antigener av den hydatiske blære. De har også påvist en god korrelasjon mellom mengdene av spesifikk IgE målt ved RAST og den totale mengde av IgE. på den annen side har de imidlertid ikke funnet noen korrelasjon mellom mengdene av IgE antilegemene og mengden av antilegemer målt ved konvensjonelle immunoelektroforese-teknikker med komplement-fiksering, immunofluorescens og hemagglutinering. Disse forfattere, såsom også f.eks.Niklaus WEISS og medarbeidere ("The Lancet", 2. desember 1978), som har anvendt RAST på pasienter infisert med schistosoma heamatobium og S. mansoni, eller DESSAINT og medarbeidere (Immunol. 1975, 2j3,8l3) som har målt de spesifikke IgE'er hos personer plaget av hydatidose og av bilharziose, konkluderer med at RAST kan tilsettes til det "konvensjonelle batteri" av immunologiske tester, uten å for-trenge dem, på grunn av den utilstrekkelige pålitelighet og på grunn av at det ikke er en kvantitativ test men bare en kvalita-tiv. Histamin-bestemmelsestester som er mer pålitelige enn RAST, bør også nevnes.

på et annet område, som er det allergologiske område, har oppfinnerne, basert på arbeidet av SHELLEY[spesielt i NATURE, 1962, 195, s. 1181-1183} BLOOD, 1962, 19, s. 208-216; Trans. Stud. Coll. PhysnsPhilad., 1964, 3_2, s. 15-19], deretter tatt opp av HIRSCH og ZASTROW (J. Allergy Clin. Immunol. 1972, 50 , s. 338-347) og SOIFER og HIRSCH [J. Allergy Clin. Immunol., 1975, 5_6_, s. 127-132], anvendt degranulerings-testen av basofile granulocytter fra mennesker med en diagnosenøyaktighet av størrelsesorden 94%, ved anvendelse av en leukocytt-suspensjon anriket 10 til 20 ganger i basofile granulocytter (med hensyn til det sirkulerende blod), hvis celler er fiksert på et objekt-glass og farvet med toluidin-blått [cf. F. LEYNADIER, H. LUCE og J. DRY, Rev. Franc. d'Allergol., 1977, 1_7, (nr. 4), s. 215-218].

Ved å gå ut fra kjennskapen til at dannelse av betrakte-lige mengder av sirkulerende spesifikke IgE'er er en av karak-teristikkene av immun-responsen til de fleste orm-parasitoser, har oppfinnerne søkt å tilpasse fremgangsmåten ved måling av IgE'er ved spesifikke antigener ved anvendelse av suspensjoner anriket på IgE-bærende basofile granulocytter, anbragt på objekt-glass, hvilke de på forhånd hadde utviklet på det allergologiske området, til diagnose av forskjellige orm-parasitoser.

Det er følgelig et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et nytt diagnosereagens for parasitoser og allergier, og spesielt for orm-parasitoser, hvilke forårsaker en økning av de sirkulerende spesifikke immunoglobuliner fiksert på basofilene, såsom spesielt IgE'ene, hvilket reagens mulig-gjør at det kan oppnås ytterst pålitelige diagnoser, og er relativt enkelt å anvende, mens de teknikker som muliggjør at det kan oppnås, gir sikkerhet for tilstrekkelige konsentrasjoner av basofiler i reagenset for at de oppnådde resultater i nærvær av antigen, ved forløpet av diagnosen, skal være statistisk forståelig med full sikkerhet.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig et diagnosereagens for parasitoser og allergier, og spesielt for orm-parasitoser, hvilke forårsaker en økning av de sirkulerende spesifikke immunoglobuliner, og spesielt av IgE'er,karakterisert vedat det omfatter en suspensjon av spesifikke IgE-bærende basofile granulocytter fra en blodprøve tatt på et menneske eller dyr som blir undersøkt med hensyn til parasitose eller allergi, hvilken suspensjon inneholder fra 300 til 1000 basofiler pr. mm 3 , ved sentrifugering for å o oppsamle et sjikt inneholdende vesentlig leukocytter, som blir blandet med en buffer som er ikke-destruktiv i forhold til basofile celler, såsom f.eks.Hepes buffer ellerPipes buffer, idet nevnte homogeniserte blanding så blir avsatt på en væske med densitet på 1,079-1,085 hvis osmolaritet ligger mellom 280 og 320 milliosmoler, for å fremkalle, etter sentrifugering i en passende tidsperiode og med passende hastighet, en ring som ut-gjøres av en suspensjon anriket på basofiler og som ligger over densitetsvæsken, hvilken ring tas bort, vaskes, fortrinnsvis ved hjelp av den samme buffer som ovenfor, for å avsettes i forskjellige fordypninger i et (en) diagnoseavlesnings-objekt-glass eller -skål.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig også en fremgangsmåte for fremstilling av nevnte diagnosereagens, hvilken består i å utsette en blodprøve, tatt fra et menneske eller dyr som ble antatt for å være plaget av en parasitose eller en allergi, for sentrifugering i en passende periode og ved en passende hastighet for å oppsamle et leukocytt-sjikt og en overflytende plasma rikt på blod-lameller, kaste nevnte plasma og blande leukocytt-sjiktet med en passende mengde med buffer som er ikke-destruktiv med hensyn til basofile celler, såsom f.eks. Hepes CM buffer eller Pipes buffer, under nevnte blanding injisere en væske med densitet på 1,079-1,085 hvis osmolaritet ligger mellom 280 og 320milliosmoler, fordelaktig bestående av en blanding av natriummetrizoat og Ficoll eller av<p>ercol, sentrifugere i en passende periode og ved passende hastighet for å oppnå en ring inneholdende basofilene og lymfocyttene, ta bort nevnte ring og vaske den forsiktig med den samme buffer som ovenfor som kastes slik at bare den cellulære sentrifugerest beholdes, hvilken, etter resuspendering,

er klar til å avsettes i fordypningene i et (en) diagnose-avlesnings-objektglass eller -skål.

I henhold til en fordelaktig utførelse av fremgangsmåten for fremstilling av diagnosereagenset i henhold til foreliggende oppfinnelse, harHepes buffer, som er ikke-destruktiv med hensyn til de basofile celler, ved hjelp av hvilken det ved sentrifugering separerte leukocytt-sjikt tas opp igjen, den følgende sammensetning:

I henhold til en fordelaktig utførelse av fremgangsmåten for fremstilling av diagnosereagenset i henhold til oppfinnelsen, harHepes buffer som er ikke-destruktiv med hensyn til basofile celler, ved hjelp av hvilken det leukocyttiske sjikt separert ved sentrifugering tas opp igjen, et betraktelig redusert innhold avHepes buffer, og et innhold av Nacl som er øket med hensyn til innholdene av den ovennevnte buffer i disse substanser.

I henhold til et fordelaktig trekk ved denne utførelse, er fortrinnsvis den kvantitative sammensetning av nevnte Hepes buffer den følgende:

I henhold til enda en annen utførelse av fremgangsmåten for fremstilling av diagnosereagenset i henhold til foreliggende oppfinnelse, blir prøvetakinger av en blodprøve fra et menneske eller dyr som man antar er plaget av en parasitose eller en allergi, utført med etylendiamin-tetraeddiksyre, i form av et av dens salter, og fortrinnsvis i form av dens kaliumsalt (K-jEDTA) , hvoretter den totale blodmengde som således er tatt ut, hvilken kan oppbevares i denne form i 24 timer, blandes med et likt volum av enHepes buffer av egnet sammensetning, inneholdende heparin i en mengde av 5 til 20 enheter/ml, og så kan det enten under denne blanding injiseres en væske med densitet på 1,079-1,085 hvis osmolaritet ligger mellom 280 og 320milliosmoler, bestående av en blanding av natriummetrizoat og "Ficoll" (varemerke registrert av SIGMA) eller av "<p>ercol"

(varemerke registrert avPHARMACIA), eller blandingen av det hepariniserte blod ogHepes buffer kan overføres til rør på forhånd fylt med ovennevnte væske med densitet på 1,079-

1,085, for å separere basofilene, hvoretter den sentrifugeres i en passende tidsperiode ved en passende hastighet for å oppnå en ring inneholdende basofilene og lymfocyttene, hvilken tas bort og vaskes forsiktig med ovennevnte hepariniserteHepes buffer, som kastes etter sentrifugering slik at bare den cellulære sentrifugerest beholdes, hvilken etter resuspendering er klar til å avsettes i fordypningene i et (en) diagnose-avlesnings-objektglass eller -skål.

på grunn av denne modifikasjon av fremgangsmåten i henhold

til oppfinnelsen, er det mulig å behandle blod tatt dagen før, med ganske tilfredsstillende resultater. Dessuten er den første sentrifugering, som ved den fremgangsmåte for fremstilling av diagnosereagenset som ble definert først, som følger umiddelbart etter at blodprøven er tatt, unødvendig, og dette muliggjør en reduksjon av tiden for diagnose-testen med minst 1 time.

I henhold til foreliggende oppfinnelse har den hepariniserteHepes buffer som anvendes ved denne modifikasjon av fremgangsmåten for fremstilling av diagnosereagenset, fortrinnsvis følgende sammensetning: eller den følgende sammensetning:

og blir i det siste tilfelle, med kalsiumet og magnesiumet i form av deres passende salter, anbragt i passende mengder på diagnose-avlesnings-objektglass eller -skåler.

Det er også et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en diagnose-fremgangsmåte for parasitoser og allergier, og spesielt for parasitoser for ormer, som forårsaker en økning i de sirkulerende spesifikke IgE'er,karakterisert vedat: - diagnosereagenset i henhold til foreliggende oppfinnelse anbringes i kontakt i ca. 15 min. ved 3 7°C med det spesifikke antigen for den parasitose eller den allergi som det er ønsket å diagnostisere, inneholdt med forskjellige konsentrasjoner i et visst antall fordypninger i et (en) diagnose-avlesnings-objektglass eller -skål, mens de resterende fordypninger i nevnte objektglass eller skål inneholder diagnosereagenset alene, for å tjene som sammenligninger, - det følger en rask tørking av det således behandlede objekt-glass, - dette følges av samtidig rask fiksering og farving av objektglasset eller skålen som er behandlet således, ved hjelp av en samtidig rask hydroalkbholisk fikserende og farvende løsning av passende sammensetning som inneholder et metakromisk farvestoff som selektivt farver de cytoplasmiske granuler av basofilene, med hvilket objektglasset eller skålen bringes i kontakt i en kort tid, f.eks. av størrelsesorden 5 til 15 min., - de basofile granulocytter blir opptelt med et optisk mikroskop med en passende forstørrelse (f.eks. 250 til 400), henholdsvis i sammenlignings-fordypningene og i de forskjellige fordypninger inneholdende reagenset og forskjellige antigen-konsentrasjoner, - og ved sammenligning av reduksjonen av antall basofile granulocytter (BG) i de fordypninger som inneholder antigenene med forskjellige konsentrasjoner, med antall avBGsom inneholdes i sammenlignings-fordypningene, etableres degranuleringsindeksen

eller prosent av basofiler som tilsynelatende har forsvunnet i nærvær av antigenet, som, dersom den er større enn 35%, mulig-gjør påvisning av nærværet av den parasitose eller allergi som søkes.

I henhold til en fordelaktig utførelse av fremgangsmåten ved diagnose i henhold til foreliggende oppfinnelse, er den samtidig raskt hydroalkoholisk fikserende og farvende løsning for objektglassene en løsning med en sur pH, lavere enn 2,5, som inneholder toluidin-blått som det metakromatiske farvestoff, sammen med aluminiumsulfat, et cetylpyridinium-halogenid, glutaraldehyd og formaldehyd, i løsning i en blanding av absolutt etanol og metanol og vann.

■ I henhold til en fordelaktig utførelse av det samtidig raskt fikserende og f arvende reagens, som anvendes ved diagnose-fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, utgjøres nevnte reagens av en hydroalkoholisk løsning med sur pH, lavere enn 2,5, som har den følgende sammensetning:

I henhold til en annen fordelaktig utførelse av de samtidig raskt fikserende og farvende reagensløsninger i henhold til foreliggende oppfinnelse, har disse løsninger følgende kvantitative sammensetning:

I henhold til enda en annen utførelse av disse samtidig raskt fikserende og farvende løsninger, har disse følgende kvalitative og kvantitative sammensetning:

I henhold til en annen utførelse av disse samtidig fikserende og farvende løsninger, har disse følgende kvalitative og kvantitative sammensetning:

I henhold til en annen utførelse av de samtidig raskt fikserende og farvende løsninger, så er disse særmerket ved at de er fri for formaldehyd, for glutaraldehyd og for etanol, og ved at de som fikseringsmiddel inneholder propylenglykol.

I henhold til et fordelaktig trekk ved denne utførelse, er den kvalitative og kvantitative sammensetning av disse løsninger følgende:

I henhold til foreliggende oppfinnelse er det benyttede cetylpyridinium-halogenid cetylpyridiniumklorid eller -bromid.

Ved et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse så tilveiebringer den et klar-for-anvendelse-sett eller -utstyr,

som fortrinnsvis inneholdes i et enkelt futteral eller boks, for å utføre diagnosetester for parasitoser og allergier i henhold til foreliggende oppfinnelse, hvilket utstyr erkarakterisert vedat det omfatter i kombinasjon: - en flerhet av objektglass, skåler eller lignende som hver har et visst antall av fordypninger; med lik diameter som totalt, bortsett fra de fordypninger som skal utgjøre sammenligninger, inneholder en forhåndsbestemt mengde av et spesifikt antigen for én parasitose eller en allergi som skal diagnostiseres, hvilket antigen inn-føres i tørr tilstand, fortrinnsvis lyofilisert, i hver av fordypningene, idet nevnte forhåndsbestemte mengder varierer fra en kolonne med fordypninger til den følgende; - en flerhet av rør som inneholder forhåndsmålte mengder av en passende buffer såsomHepes CM eller<p>ipes buffer; - en flerhet av til-

passede beholdere såsom ampuller, rør, sprøyter eller lignende, hver inneholdende en væske med densitet på 1,079-1,085; -

minst én beholder inneholdende en samtidig raskt hydroalkoholisk fikserende og farvende løsning for ovennevnte objekt-glass, skåler eller lignende, fremstilt i samsvar med oppfinnelsen, hvis pH er lavere enn 2,5 og som inneholder et metakromatisk farvestoff såsom fortrinnsvis toluidin-blått, aluminiumsulfat, cetylpyridinium-halogenid, glutaraldehyd og formaldehyd, i løsning i en blanding av absolutt metanol og etanol og vann.

I henhold til en fordelaktig utførelse av klar-for-anvendelse-utstyret i henhold til foreliggende oppfinnelse: - inneholder hver av fordypningene som inneholder et spesifikt antigen til den parasitose eller den allergi som skal diagnostiseres, 10 til 20^ul av nevnte antigen i lyofilisert tilstand;

- hvert rør som inneholder en forhåndsmålt mengde med buffer, inneholder 5 ml av nevnte buffer; - hver ampulle, rør, sprøyte eller lignende som inneholder densitetsvæsken, inneholder 5 ml av nevnte væske med densitet på 1,079-1,085; - beholderen eller hver beholder som inneholder det samtidig raskt hydroalko-

holisk fikserende og farvende reagens for de preparerte objekt-glass, skåler eller lignende, innbefatter en løsning med pH lavere enn 2,5, som har følgende sammensetning:

I henhold til oppfinnelsen er de anvendte objektglass, skåler eller lignende for diagnose-avlesning fortrinnsvis valgt blant: - objektglass som har en flerhet av fordypninger med lik diameter, bestående av paraffin-ringer; - objektglass hvorpå det er limt et klebebånd som på forhånd er gjennomhullet med en flerhet av hull med lik diameter som utgjør fordyp ningene; - gjennomsiktige plastskåler hvor det i bunnen er fastlimt et klebebånd som er gjennomhullet med en flerhet av huller som angitt ovenfor.

I henhold til en fordelaktig utførelse av utstyret eller settet klar-for-anvendelse for utførelse av diagnosetesten i henhold til foreliggende oppfinnelse, inneholder denHepes buffer som inneholdes i forhåndsmålte mengder i ampuller eller egnede rør, fra 4 til 25 ml av en molar løsning avHepes buffer, 0,932 ml med 10% KCl, 0,550 ml med 10%Cacl2, 0,510 ml med 10%MgCl2, fra 850til 900ml med 9% Nacl, i løsning i en tilstrekkelig mengde med vann til å bringe løsningens volum på 1000 ml, og/eller den samtidig raskt fikserende og farvende løsning for antigenpreparatene (eller sammenligningene) båret på diagnose-avlesnings-objektglassene, som inneholdes i den tilsvarende beholder, har følgende sammensetning:

eller den følgende sammensetning: I henhold til en fordelaktig utførelse av klar-for-anvendelse-utstyret i henhold til foreliggende oppfinnelse, for ut-førelse av diagnosetesten, så omfatter dette et futteral som omfatter: en flerhet av tilpassede beholdere såsom ampuller eller rør som inneholder forhåndsmålte mengder av en egnetHepes buffer, og spesieltHepes buffer så som definert ovenfor, en flerhet av ampuller, rør eller sprøyter som hver inneholder forhåndsmålte mengder av en væske med densitet på 1,079-1,085, en flerhet med diagnose-avlesnings-objektglass eller - skåler som hver har et visst antall med fordypninger hvorav de fleste, med unntak av sammenlignings-fordypningene, er beregnet på å motta variable forhåndsbestemte mengder av et antigen som er spesifikt til en allergi eller parasitose som skal diagnostiseres, og en flerhet av ampuller eller rør som inneholder forhåndsmålte mengder av samtidig raskt fikserende og farvende løsning, av den ovenfor definerte type av løsninger. I henhold til en annen fordelaktig utførelse av klar-for-anvendelse-utstyret i henhold til foreliggende oppfinnelse, så er dette sammensatt av to separate futteral hvor det ene, som er bestemt for separeringen av de basofile celler, omfatter: en flerhet av tilpassede beholdere, såsom rør eller ampuller som 'inneholder forhåndsmålte mengder av en egnet buffer, spesielt Hepes buffer så som definert ovenfor, og en flerhet av ampuller eller rør som hvert inneholder en forhåndsbestemt mengde av en væske med densitet 1,079-1,085> og hvor det annet futteral omfatter: en flerhet av diagnose-avlesnings-objekt-glass eller -skåler som hver har et visst antall fordypninger hvorav de fleste, med unntak av sammenlignings-fordypningene, er bestemt for å motta variable mengder av et antigen som er spesifikt for en allergi eller en parasitose som skal diagnostiseres, og en flerhet av ampuller eller rør som inneholder forhåndsmålte mengder av en samtidig raskt fikserende og farvende løsning, av den løsnings-type som er definert ovenfor, for riktig utførelse av diagnosetesten.

I henhold til enda en annen fordelaktig utførelse av klar-for-anvendelse-utstyret i ett eller to futteraler, i henhold til foreliggende oppfinnelse, harHepes buffer som inneholdes i forhåndsmålte mengder i en flerhet av tilpassede beholdere, såsom rør eller ampuller, følgende sammensetning:

I henhold til en annen fordelaktig utførelse av klar-for-anvendelse-utstyret i ett eller to futteraler i henhold til foreliggende oppfinnelse, harHepes buffer som inneholdes i forhåndsbestemte mengder i en flerhet av tilpassede beholdere såsom rør eller ampuller, følgende sammensetning:

i hvilket tilfelle diagnose-avlesnings-objektglassene eller

-skålene inkluderer, i hver av deres fordypninger bestemt for å motta antigen, en forhåndsbestemt mengde av kalsium eller

magnesium i form av deres salter, og spesielt deres klorider.

I henhold til et fordelaktig trekk ved denne utførelse,

er kalsiumet tilstede i en mengde på ca. 1 mmol/liter og magnesiumet tilstede i et forhold på 1 mmol/liter.

Ved siden av de foregående trekk omfatter oppfinnelsen også andre trekk, som vil fremgå av den følgende beskrivelse.

Oppfinnelsen er rettet mer spesielt på nye diagnosereagenser, for parasitoser og allergier, og også på deres fremstilling, i henhold til de foregående trekk, og på diagnosefremgangsmåter hvor nevnte reagens benyttes, og også på de midler som anvendes for å utføre nevnte diagnosefremgangsmåter.

Beskrivelse av foretrukne utførelser

Oppfinnelsen vil lettere forstås ved hjelp av den ytterligere beskrivelse som følger, idet det vises til eksemplene på fremstilling av diagnosereagensene i henhold til foreliggende oppfinnelse, til eksempler på buffere som er nyttige for fremstilling av disse reagenser, til eksempler på de samtidig raskt fikserende og farvende løsninger som er nyttige ved diagnose-fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, og også til en diagnosetest ved hjelp av nevnte reagens, og resultatene av denne test blir illustrert ved grafisk fremstilling og med tegninger av diagnose-avlesnings-objektglass i de medfølgende figurer.

Det skal imidlertid forstås at disse eksempler og tegninger bare er gitt for å illustrere oppfinnelsen, og utgjør ikke på noen måte noen begrensning av denne.

I - Eksempler på fremstilling av et diagnosereagens for parasitose eller for allergi i henhold til oppfinnelsen

Eksempel 1

a) Det tas en blodprøve på o totalt 5 til 10 cm 3 på o en pasient som antas å være plaget av en parasitose eller allergi

som det er ønsket å påvise, og prøvetagningen blir fortrinnsvis utført slik at den er knyttet til en nøye beregnet mengde av heparin (lo til 15 enheter pr. ml).

b) Dersom blodet ikke blir behandlet umiddelbart, kan det anbringes i et kjøleskap ved en temperatur som ikke overskrider

4°C i en periode som ikke overskrider 3-4 timer.

Den totale mengde blod som er tatt, blir sentrifugert ved 130 g til 150g i 15 minutter for å separere plasmaet som inneholder blod-lamellene fra et leukocyttsjikt som også inneholder røde blodlegemer. c) Den overflytende plasma som inneholder blodlamellene tas så opp og kastes, opptil ca. 2 til 4 mm av leukocytt-sjiktet, og denne operasjon blir fordelaktig utført ved hjelp av en sprøyte som er forsynt med en lang nål, med et kateter eller med en pasteur-pipette. på den annen side blir leukocyttsjiktet og ca. 1 cm^ med under-tilstøtende røde blodlegemer utvunnet. d) I et rør, på f.eks. 100 x 20, blir det anbragt 5 ml med Hepes buffer CM som har den følgende sammensetning:

hvilken blir justert med ca. lo dråper av 1 N NaOH ved pH mellom 7,4 og 7,6, og for denne blir det kontrollert at osmolariteten er mellom 290 og 300 mOsM, og i 25 mmol med buffer blir det ut-vunne leukocyttsjikt og cm 3 med røde blodlegemer innført og blir blandet med bufferen. e) ved hjelp av en sprøyte som fortrinnsvis er forsynt med en lang nål av typen lumbar-punkteringsnål eller en pasteur-pipette, blir det i bunnen av røret fra trinn d) med forsiktig-het innført 5 ml av en væske med densitet på 1,080som har den følgende sammensetning:

densiteten er tilpasset nøyaktig til 1,080?

' dersom det anvendes metrizoat-ampuller på 30 ml med 32,8%,

er den nødvendige mengde medFicoll for én ampulle 8,441 g med 108,85 mlH20 q.s.p.

Denne injeksjon løfter det under-tilstøtende fortynnede blod.

f) Det tas forholdsregler for at det ikke blir noen røring, for at de to medier ikke skal bli blandet, og så følger en

sentrifugering i 30 minutter ved 400g ved grenseflaten (f.eks. i en jOUAN-sentrifuge med 1800 opm med B stjerne).

g) ved slutten av sentrifugeringen blir det fra bunn til topp iakttatt ca. 1 cm med røde blodlegemer, så væsken med

densitet på 1,080, som er separert fra bufferen som er i den øvre del, med en ring som inneholder basofilene og andre hvite celler.

Ved hjelp av en sprøyte som er forsynt med et kateter, med en lang nål eller med en pasteur-pipette tas ringen forsiktig opp, og det er nemlig ca. 1 til 2 ml med væske.

Denne ring vaskes én gang i 3 til 5 volumer med Hepes CM buffer, overflytende væske kastes og man beholder bare ca.

0,5 cm 3 av det fortynnede cellulære sediment i bufferen.

Cellene tilbakeføres så under omrøring i suspensjon i bufferen og suspensjonen kan holdes ved 4°C inntil den anvendes i de følgende to eller tre timer.

Den oppnådde cellesuspensjon inneholder fra 5 til 10%med basofiler i suspensjon i 5 ml buffer, d.v.s. at selv om antall basofiler som inneholdes i 1^ul med sirkulerende blod ikke overskrider 30eller 40, så er det i cellesuspensjonen oppnådd i henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, oppnådd en anrikning av basofil-innholdet slik at suspensjonen inneholder fra 300 til 1000 basofiler pr. ^ul.

h) på de dannede diagnose-avlesnings-objektglass (sammen-lign med fig. 1 hvor disse objektglass er gitt henvisnings-tallet 1), det vil si hvorpå det er fastlimt et klebebånd som på forhånd er gjennomhullet med hull av identisk diameter, hvilke utgjør fordypningene 2, 3, 4 og 5 (se fig. 1), er det inne i hver av fordypningene 3, 4 og 5 anbragt 20^ul av den ovennevnte cellesuspensjon, og cellene i suspensjon er fordelt regelmessig i hver fordypning. I et visst antall av fordypningene, f.eks. fjerdedelen av dem, vist ved henvisningstall 2, er det til cellesuspensjonen satt 10^ul av ovennevnte Hepes CM buffer, og i de andre fordypninger, 3, 4 og 5, er det til celle-suspens jonen satt 10^ul av antigen som er spesifikt for den parasitose eller allergi som det er ønsket å diagnostisere, fortynnet i enHepes CM buffer.

Det skal bemerkes at det antigen som er spesifikt for den parasitose eller den allergi som det er ønsket å diagnostisere, med fordel kan komme fra en prøvetagning som er utført på en pasient som lider av den samme parasitose eller allergi, av en tumoral væske eller allergen væske som oppbevares inntil anvendelse ved å fryse den ved en optimal temperatur på -80°C.

I den utførelse som her er beskrevet stammer det spesifikke antigen for en parasitose som skal diagnostiseres, fra prøver av væskeinnholdet fra en hydatisk blære i leveren, som er tatt ut under en kirurgisk operasjon og konservert ved -80°C.

For å anvende nevnte hydatiske væske som antigen, blir den opptint, hvoretter den muligens, men ikke nødvendigvis, sentrifugeres ved 1000 g i 15 minutter.

Den overflytende væske på den ene side og sentrifugeresten på den annen side, kan begge anvendes som antigen, enten i deres rene tilstand, eller fortynnet med enHepes CM buffer.

i) Det på denne måte tilberedte objektglass anbringes i

en plastboks hvis fuktighetsinnhold er nær mettethet.

Denne boks anbringes i en tørkeovn ved 3 7°C i 15 minutter, den tid som er nødvendig og tilstrekkelig for at reaksjonen mellom cellesuspensjonen og antigenet skal kunne foregå.

j) Objektglasset tas så ut av tørkeovnen, og det tørkes så svært raskt ved blåsing med varm luft.

Objektglasset fikseres og tørkes så samtidig ved hjelp av den følgende løsning:

i hvilken objektglasset dyppes i 15 minutter, og ved slutten av denne periode skylles det i 30sekunder i vann, 30sekunder i absolutt etanol og om nødvendig i xylen.

I det tilfelle hvor det benyttes små gjennomsiktige plastskåler for avlesning av diagnosen, helles en passende mengde av ovennevnte fikserende og farvende løsning direkte inn i nevnte skåler for å bevirke den samtidig raske fiksering og farvning.

Objektglasset festes så ved hjelp av en passende feste-væske (f^eks. "EUKITT" som fås fraBIOLYON) og en dekk-strimmel (cf. strimmel b i fig. 1).

k) Avlesningen utføres ved å telle i mikroskopet (med en forstørrelse på 2 50, 400 eller 1000 i henhold til hvor mange celler det er i suspensjonen) antallet med basofiler som finnes i det samme antall med mikroskopiske felt som er fordelt tilfeldig i sammenlignings-fordypningene og i fordypningene som inneholder antigenet.

Den samtidige fiksering og farving muliggjør rask og fullstendig identifisering av de intakte basofiler hvis antall (200 til lOOO/^ul) og utseende muliggjør en tellenøyaktighet på minst 30 til 50 basofiler pr. sammenlignings-område, hvilket er forlikelig med statistisk analyse.

Degranuleringen av de basofiler som har reagert med det spesifikke antigen, følges av en tilsynelatende forsvinning av disse celler, hvilke så bare kan identifiseres ved deres metakromatiske effekt i et optisk mikroskop.

Reduksjonen av antall basofiler i fordypningene som inneholder antigenet i forhold til i sammenlignings-fordypningene, uttrykkes ved degranuleringsindeksen:

I nærvær av en parasitose eller av en allergi, frembringes det en tydelig DI, i det minste større enn 35%, og ofte nær 100%.

Eksempel 2

Ved en modifikasjon blir det anvendt objektglass som alle-rede er forsynt med et tørt antigen inne i fordypningene, og et slikt antigen er oppnådd ved fryse-tørking av den overflytende væske oppnådd etter sentrifugering av en tumoral væske,

som beskrevet i eksempel 1, h).

En slik preparering av objektglassene forenkler behand-lingen betraktelig, siden det er tilstrekkelig å anbringe 20^1 av cellesuspensjonen i alle fordypningene (hvorav en del, ca. fjerdeparten, ikke inneholder antigen og tjener som sammenligninger ) .

Eksempel 3

Antigenet som er tilstede i fordypningene i objektglasset, innføres med forskjellige konsentrasjoner: f.eks. når det dreier seg om et objektglass med 8 fordypninger hvorav 2 fordypninger (fordypningene 2) ikke inneholder antigen og følgelig er sammenlignings-fordypninger, innføres antigenet i fordypningene 3 med en fortynning pa o 10 —4, i fordypningene 4 med en fortynning på o lo —6 og i fordypningene 5 med en fortynning på o 10 —8, med Hepes CM buffer som omtalt i eksempel 1.

Eksempel 4

Den optiske opptelling beskrevet under k) i eksempel 1 kan erstattes med automatisk opptelling ved hjelp av en kommer-sielt kjent maskin, f.eks. den som er markedsført under navnet

"OPTOMAX".

Det er mulig som en variasjon å anvende samtidig raskt fikserende og farvende løsninger for de preparerte objektglass, eller andre sammensetninger enn de som er angitt i eksempel 1, j) ovenfor, for ytterligere å forbedre farvingen av nevnte objektglass.

II - Eksempler på samtidig raskt fikserende og farvende løsninger

Eksempel 5

Eksempel 6 Eksempel 7 Eksempel 8

Eksempel 9

Eksempel lo Eksempel 11 Eksempel 12 Eksempel 13

Hepes buffer som er ikke-destruktiv med hensyn til de basofile celler, som anvendes til å ta opp de leukocyttsjikt som separeres ved sentrifugering, kan ha andre sammensetninger enn den som er beskrevet i eksempel 1, d) ovenfor. III - Eksempler på sammensetninger av Hepes buffere Eksempel 14

Osmolariteten til bufferen reguleres slik at den blir i alt vesentlig nær (minst innen 20%) den til plasmaet.

Eksempel 15

Osmolariteten til bufferen reguleres slik at den blir i alt vesentlig nær (innen ca. 20%) den til plasmaet.

Eksempel 16

Osmolariteten til pufferen reguleres slik at den blir i alt vesentlig nær (minst innen ca. 20%) den til plasmaet.

Eksempel 17

Osmolariteten til bufferen reguleres slik at den blir i alt vesentlig nær (minst innen ca. 20%) den til plasmaet.

IV - Andre eksempler på fremstilling av et diagnosereagens

for parasitoser og for allergier i henhold til foreliggende oppfinnelse

Eksempel 18

1) EtHepes buffer-medium slik som beskrevet i eksempel

15 ovenfor, blir rekonstituert, d.v.s. at 2 ml av 10ganger konsentrert buffer-medium tas inn i en ampulle, hvortil det blir satt 18 ml destillert vann. på denne måte oppnås det 20 ml av såkalt rekonstituert buffer hvorav 15 ml tas opp som blir innført i et sentrifugerbart rør på 20 ml. Til de 5 ml med rekonstituertHepes buffer blir det satt 50 til 250 inter-nasjonale enheter av kalsium-,litium- eller natrium-heparinat. Det således fremstilte rør er rør (1). 2) innholdet i en ampulle av basofil-separasjonsmedium (BSM) som er klart for anvendelse, hvilket er væsken med densitet på 1,079-1,085 omtalt ved foreliggende oppfinnelse, blir tømt inn i et rør på 20 ml som har rund bunn og er sentrifugerbart. Det således dannede rør er rør (2). 3) Under fasting blir det tatt opp 5 ml med vene-blod på K-jEDTA ["vacutainer" (registrert varemerke), "venoject" (registrert varemerke) eller ved hjelp av en nål med en trakt for-bundet med et rør inneholdende en slik mengde av K^EDTA at den endelige konsentrasjon av K^EDTA i blodet vil være 1,5 mg/ml blod]. 4) Dette blod overføres til røret (1) som inneholder den hepariniserteHepes buffer (se (1) ovenfor) og blir svakt homogenisert. 5)Blandingen av blod og homogenisertHepes buffer ved overflaten avBSMblir forsiktig "anbragt i røret (2) ( se 2 ovenfor) ved hjelp av en pasteur-pipette. 6) Dette rør sentrifugeres i 30 minutter ved 400 g ved grenseflaten. på grensen mellomBSMog buffer-mediet oppnås en hvitaktig ring som tas bort fullstendig (1 til 3 ml) ved hjelp av en pasteur-pipette anbragt på en sprøyte eller pære. 7) Det således oppnådde cellulære medium anbringes i et sentrifugerør inneholdende resten av det hepariniserteHepes medium og vaskes ved en sentrifugering i lo minutter ved 150g. Den overflytende væske tas opp inntil helningsavbøyning i

røret (gjenværende volum -0,5 ml).

8) Etter forsiktig homogenisering i en periode på 30-50 sekunder ved røring for hånd eller med hvirvelen, er den cellulære sentrifugerest klar for anvendelse i det følgende trinn for avsetning på diagnose-avlesnings-objektglass.

Det skal bemerkes at alle de ovennevnte operasjoner, og spesielt sentrifugeringen, utføres ved omgivelsestemperatur ca. 20°C.

9) pegranuleringsreaksjon.

I hver av fordypningene i et diagnose-avlesnings-objekt-glass anbringes 20^ul av cellesuspensjonen (resuspendert sentrifugerest) .

Objektglasset anbringes så i en bedekket skål (av typenPetri-skål) inneholdende et stykke våt bomull. Alt sammen anbringes i tørkeovnen ved 3 7°C i 20 minutter.

Så fjernes bedekningen på skålen og bomullen. Objektglasset er fremdeles i ovnen, og tørkes så i ca. 15 minutter. Objektglasset kan også tørkes med en hår-tørker.

Fikseringen/farvingen oppnås ved å dekke hver av fordypningene med en samtidig raskt farvende og fikserende løsning i samsvar med ett av eksemplene 5 til 13 ovenfor. Objektglasset får være på bæreren i 15 minutter, og skylles så under en dusj med vann fra en springvannskran (30 sek.), dehydratiseres i et bad av absolutt etanol (30sek.) og dyppes 1 sek. i et xylen-bad, for å lette festingen.

En dråpe av feste-mediet anbringes på et dekk-glass. Det sistnevnte påføres så på objektglasset. Det er nødvendig med 10 til 15 minutter for å tørke alt sammen (tørkingen kan på- skyndes ved å anbringe objektglasset i tørkeovnen eller under en hår-tørker).

IO) Avlesning av testen

Den utføres med et vanlig optisk mikroskop. Det har fortrinnsvis "bredfelt"-objektiver og høye stykker og er av tilstrekkelig kvalitet til at det kan oppnås perfekt fokusering over hele feltet.

Den forstørrelse som anvendes er variabel i samsvar med antall basofiler. vanligvis 400, dette kan bringes opp til 1000 (dypping) når det er stor forekomst av basofiler, eller derimot til 250 dersom iakttageren er øvet.

Basofilene kan kjennes ved hjelp av at de har en dyp farve i forhold til de andré celler (vesentlig lymfocytter og mono-cytter), og spesielt ved den fiolette farve, noen ganger rød, til forskjell fra den blåfarve (lys eller dyp) på de andre celler.

Basofilene opptelles på hver av fordypningene. i de fleste tilfeller er det tilstrekkelig med 20mikroskopiske felt (10felt tilfeldig ved en vertikal diameter og 10felt tilfeldig ved en horisontal diameter). Det viktige er selvsagt at det samme antall felt undersøkes på hver av fordypningene.

Ved addering av antall basofiler som finnes i identiske

fordypninger A og B, oppnås:

T = antall basofiler uten antigen

Ag (1, 2, 3 eller 4 = antall basofiler med antigen.Degranuleringsindeksen (D.I.) bestemmes for hver antigen-fortynning ved følgende forhold:

D.I. % T ~ Ag x 10<0>

30 V - Eksempel på anvendelse av diagnosemetoden i henhold til oppfinnelsen

Det anvendte antigen ble oppnådd fra væskeinnholdet i en hydatisk blære fra leveren, som ble tatt ut ved en kirurgisk operasjon og konservert ved -80°C.

Etter opptining ble den hydatiske væske sentrifugert ved 1000 g i 15 minutter. Den overflytende væske på den ene side, og sentrifugeresten på den annen side, ble anvendt som rene antigener eller fortynnet med enHepes CM buffer.

Resultatene ble uttrykt som prosent basofiler som tilsynelatende var forsvunnet i nærvær av antigenet i forhold til antall basofiler opptelt i nærvær av bufferen uten antigen.

Observasjonen ble foretatt på en mann som var 38 år gammel, som hadde en hydatisk blære på 15 cm i diameter, utviklet på bekostning av den høyre flik av leveren. Dens innhold var gjennomsiktig og det var tallrike datterblærer.Blæren og det hydatiske ytre ble utsatt for en fullstendig bortskjærelse.Immunodiagnose (elektroforese og hemagglutinasjon) var negativ før operasjonen. Den fjerde dagen etter operasjonen var hem-agglutineringen positiv ved 1/12800og den intradermale injeksjon av avtagende fortynninger av væske sterilisert ved filtrering, viste en positiv reaksjon ved 1/100 (15-35), ved det 20. minutt.

Testen i henhold til oppfinnelsen ble utført på pasienten den andre og den fjerde dagen etter operasjonen og hver gang med to sammenligninger. De fire sammenligninger var fri for enhver parasitisk plage. En av sammenligningene hadde en hemolymphangioma på 3420gram i den høyre flik av leveren som var operativt fjernet.

Resultater

Figurene 2 og 3 viser den prosentvise degranulering for pasienten og for de to sammenligningsprøver den andre og fjerde dag etter operasjonen. Disse prosenter ble fastslått på mer enn 200 basofiler (virkelig opptelt antall, og ikke ekstra-polert fra noen celler opptelt påMallasez-objektglasset) for hvert subjekt (fra 202 til 1270) i fravær av antigenet.

Disse resultater viser, for denne pasient plaget av en hydatisk blære i leveren, en degranulering av basofilene i nærvær av hydatisk væske, som er meget betydelig.

Det ble ikke iakttatt noen forskjell på resultatene enten det anvendte antigen var hydatisk væske eller sentrifugerest.

Det fremgår av den foregående beskrivelse at det i henhold til oppfinnelsen oppnås midler for realisering av en diagnosetest for parasitoser og for allergier som involverer førhøyelse av spesifikke IgE'er, som er meget pålitelig og gir et prosent-vis 'samsvar med histamin-testene som ligger nær 100%.

Dessuten er avlesningen av diagnose-objektglassene gjort betraktelig lettere, og påskyndet ved at det kan opptelles et øket antall basofiler, og det er således muliggjort at det oppnås statistisk gyldige degranuleringsindekser.

Diagnosereagenset og diagnosetesten i henhold til foreliggende oppfinnelse kan brukes for diagnose av hvilke som helst parasitoser og allergier som blir en økning i spesifikke IgE'er, og spesielt helminthiases så som bilharziosis, tenia, ascariosis, filariosis, oxyurosis, etc.

Som det fremgår av det foregående, så er oppfinnelsen på ingen måte begrenset til de praktiserings-fremgangsmåter, utførelser og anvendelser som nå er blitt eksplisitt beskrevet. Den omfatter derimot alle modifikasjoner som en fagmann i industrien kan komme på uten å avvike fra omfanget eller ånden ved foreliggende oppfinnelse.

Claims (26)

1. Reagens for diagnose av parasitoser og allergier, og spesielt parasitoser for ormer og allergier som forårsaker en økning av sirkulerende spesifikke immunoglobuliner og særlig av IgE'er, hvor nevnte reagens omfatter en suspensjon av basofile granulocytter som bærer spesifikke IgE'er, oppnådd fra en blodprøve tatt fra et menneske eller dyr som blir undersøkt for en parasitose eller en allergi, hvilken suspensjon inneholder fra 300 til 1000 basofiler pr. mm 3, ved sentrifugering for å oppsamle et sjikt inneholdende vesentlig leukocytter, hvilket blir blandet med en buffer som er ikke-destruktiv med hensyn til basofile celler, så som særligH epes CM buffer ellerP ipes buffer, idet nevnte homogeniserte blanding så blir anbragt i en væske med densitet på 1,0 79-1,085 hvis osmolaritet er mellom 280 og 320 milliosmoler, for etter sentrifugering i en passende periode og med passende hastighet, å frembringe en ring som består av en suspensjon som er anriket på basofiler og som overdekker densitetsvæsken, hvor nevnte ring tas opp og så vaskes, fortrinnsvis ved anvendelse av samme buffer som ovenfor, for å avsettes i de forskjellige fordypninger i et (en) diagnose-avlesnings-objektglass eller -skål.

2.F remgangsmåte for fremstilling av et diagnosereagens i henhold til krav 1, hvilken består av: å utsette en blodprøve tatt fra et menneske eller dyr som antas å være plaget av en parasitose eller en allergi, for en sentrifugering i en passende periode og med en passende hastighet for å oppsamle et leukocytt-sjikt og en overflytende plasma som er rik på blodlameller; kassere nevnte plasma og blande leukocyttsjiktet med en passende mengde av en buffer som er ikke-destruktiv i forhold til de basofile celler, såsom særligH epes CM eller <p> ipes buffer; injisere, under nevnte blanding, en væske med densitet på 1,0 79-1,0 88 hvis osmolaritet er mellom 280 og 320 milliosmoler, fordelaktig bestående av en blanding av natrium-metrizoat ogF icoll eller <p> ercoll; sentrifugere i en passende periode og med passende hastighet for å oppnå en ring som inneholder basofilene og lymfocyttene; ta ut nevnte ring og vaske den omhyggelig méd den samme buffer som ovenfor, som kastes slik at bare den cellulære sentrifugerest beholdes, hvilken, etter resuspendering, er klar til å anbringes i fordypningen i et (en) diagnose-avlesnings-objektglass eller-skål

3. Ikke-destruktiv buffer for basofile celler som er nød-vendig for utførelse av fremgangsmåten i henhold til krav 2, hvilken er enH epes buffer med følgende sammensetning:

4. Ikke-destruktiv buffer for basofile celler som er nød-vendig for utførelse av fremgangsmåten i henhold til krav 2, hvilken er enH epes buffer med følgende sammensetning:

5.F remgangsmåte for fremstilling av et diagnosereagens i henhold til krav 1, hvorved utførelse av blodprøven på et menneske eller dyr som antas å være plaget av en parasitose eller en allergi, fordelaktig foretas på etylendiamin-tetraeddiksyre i form av ett av dens salter, fortrinnsvis i form av dens kaliumsalt (EDT A ), hvoretter det totale blod som således er prøvetatt, hvilket kan konserveres i denne form i 24 timer, blandes med likt volum av enH epes buffer av passende sammensetning, inneholdende heparin i forholdet 5 til 20 enheter/ml, så enten injiseres, under denne blanding, en væske med densitet på 1,079-1,085 hvis osmolaritet er mellom 280 og 320 milliosmoler, fordelaktig bestående av en blanding av natrium-metrizoat og "Ficoll" (varemerke fra SIGMA) eller "percoll" (varemerke fra PHARMACIA), eller overføres den blod/- hepariniserteH epes buffer-blanding til et rør på forhånd fylt med væske av ovennevnte densitet på 1,079-1,085, for å separere basofilene, og så sentrifugeres det i en passende periode og med passende hastighet for å oppnå en ring som inneholder basofilene og lymfocyttene, hvilken opptas og vaskes omhyggelig med den ovennevnte hepariniserteH epes buffer, hvilken kastes etter sentrifugering slik at bare den cellulære sentrifugerest beholdes, hvilken etter tilbakeføring i suspensjon er klar til å anbringes i fordypningen i et (en) diagnose-avlesnings-ob jektglass eller -skål.

6.H epes buffer som er ikke-destruktiv med hensyn til basofile celler, hvilken er nødvendig for utføringen av diagnose-fremgangsmåten i henhold til krav 5, med følgende sammensetning:

7.F remgangsmåte for fremstilling av et diagnosereagens i henhold til krav 1, karakterisert ved at prøvetagningen av en blodprøve på et menneske eller dyr som antas å være plaget av en parasitose eller av en allergi, ut-føres på etylendiamin-tetraeddiksyre, fordelaktig i form av ett av dens salter og foretrukket i form av dens kaliumsalt (EDTA ), så blandes den totale mengde med blod som således er prøvetatt, hvilken kan konserveres i denne form i 24 timer, med et likt volum av enH epes buffer av egnet sammensetning som er fri for kalsium-, magnesium- og heparinsalter, og det injiseres, under denne blanding, en væske med densitet på 1,079-1,085 hvis osmolaritet er mellom 280 og 320 milliosmoler, fordelaktig bestående av en blanding av natrium-metrizoat og av "F icoll" eller av "percoll", eller blod-Hepes buffer-blandingen overføres til et rør på forhånd fylt med væske av den ovennevnte densitet på 1,079-1,085, det sentrifugeres i en passende periode og med passende hastighet for å oppnå en ring inneholdende basofilene og lymfocyttene, nevnte ring tas opp og vaskes med den sammeH epes buffer som ovenfor som kastes slik at bare den cellulære sentrifugerest beholdes, hvilken, etter resuspendering, er klar til å anbringes i fordypningen i et (en) diagnose-avlesnings-objektglass eller -skål som inneholder kalsiumet og magnesiumet i form av ett av deres egnede salter, hvilke er avsatt i forhåndsbestemte mengder.

8.H epes buffer som er ikke-destruktiv med hensyn til basofile celler, hvilken er nødvendig for utførelse av diagnose-fremgangsmåten i henhold til krav 7, med følgende sammensetning:

i hvilket tilfelle kalsiumet og magnesiumet i form av deres egnede salter er avsatt i forhåndsbestemte mengder på diagnose-avlesningsglass eller -skåler.

9. Diagnose-fremgangsmåte for parasitoser og allergier, og spesielt parasitoser for ormer og allergier som forårsaker en økning av sirkulerende spesifikke immunoglobuliner, og særlig IgE'er, idet fremgangsmåten omfatter: anbringelse i ca. 15 minutter ved 3 7°C av diagnosereagenset i henhold til krav 1 i kontakt med det spesifikke antigen for den parasitose eller den allergi som det er ønsket å påvise, inneholdt i forskjellige konsentrasjoner i et visst antall fordypninger i et (en) diagnose-avlesnings-objektglass eller -skål, mens de resterende fordypninger i samme objektglass eller skål inneholder diagnosereagenset alene, for å tjene som en sammenligning; fortsettelse med rask tørking av det således preparerte objektglass; fulgt av en rask fiksering og farving samtidig på det på denne måte preparerte objektglass ved hjelp av en samtidig fikserende og farvende vandig alkohol-løsning av passende sammensetning, hvilken inneholder et metakromatisk farvestoff som selektivt farver de cytoplasmiske granuler til baso.f ilene, med hvilke ob jektglasset eller skålen bringes i kontakt i en kort tid, særlig av størrelsesorden 5-15 minutter; opptelling av de basofile granulocytter (B G) med et optisk mikroskop med en egnet forstørrelse, henholdsvis i sammenlig-ningsfordypningene og i de forskjellige fordypninger som inneholder reagenset og forskjellige antigen-konsentrasjoner; og fastsettelse, ved sammenligning av reduksjonen av antallet med basofile granulocytter i de fordypninger som inneholder antigenet i forskjellige konsentrasjoner i forhold til antallet avBG inneholdt i sammenlignings fordypningene, av degranuleringsindeksen:

eller den prosent med basofiler som tilsynelatende har forsvunnet i nærvær av antigenet, hvilken, dersom den er større enn 35%, muliggjør diagnosen på nærvær av den parasitose eller den allergi som søkes.

10. Diagnose-fremgangsmåte i henhold til krav 9, karakterisert ved at den samtidig raskt fikserende og farvende hydroalkoholiske løsning for objektglassene eller skålene er en løsning med sur pH, under 2,5, som inneholder toluidin-blått som metakromatisk farvestoff, sammen med aluminiumsulfat, cetylpyridinium-halogenid, glutaraldehyd og formaldehyd, i løsning i en blanding av absolutt etanol og metanol og vann.

11. Samtidig raskt fikserende og farvende reagens, som er nødvendig for utførelsen av diagnose-fremgangsmåten i henhold til krav 9, hvilket er en hydroalkoholisk løsning med sur pH under 2,5 med følgende sammensetning:

12. Samtidig raskt fikserende og farvende reagens for utførelse av diagnosefremgangsmåten i henhold til krav 9, med følgende sammensetning:

13. Samtidig raskt fikserende og farvende reagens for ut-førelse av diagnose-fremgangsmåten i henhold til krav 9, som er fritt for glutaraldehyd og inneholder metanol muligens sammen med formaldehyd og/eller etanol som et fikseringsmiddel.

14.R eagens i henhold til krav 13 som har følgende sammensetning :

15.R eagens i henhold til krav 13 med følgende sammensetning:

16. • Samtidig raskt fikserende og farvende reagens for ut-førelse av diagnose-fremgangsmåten i henhold til krav 9, hvor nevnte reagens er fritt for glutaraldehyd, formaldehyd og etanol og inneholder som fikseringsmiddel propylenglykol sammen med metanol.

17.R eagens i henhold til krav 16, som har følgende sammensetning :

18.R eagens i henhold til krav 11, hvor cetylpyridinium-halogenidet som anvendes er kloridet eller bromidet.

19. Klar-for-anvendelse-sett eller -utstyr, fortrinnsvis inneholdt i et enkelt futteral, for utførelse av diagnosetester på parasitoser og allergier i henhold til krav 9, hvilket omfatter en kombinasjon av: en flerhet av objektglass eller skåler som hver har et visst antall fordypninger med lik diameter, hvorav de fleste, bortsett fra fordypninger som skal utgjøre sammenligninger, inneholder en forhåndsbestemt mengde av et spesifikt antigen for en parasitose eller en allergi som skal påvises, hvilket antigen er innført i tørr tilstand, fortrinnsvis fryse-tørket, i hver av fordypningene, idet nevnte forhåndsbestemte mengde varierer fra en kolonne av fordypninger til den neste; en flerhet av rør inneholdende forhåndsmålte mengder av en egnet buffer såsomH epes CM eller <p> ipes buffer; en flerhet av tilpassede beholdere såsom ampuller, rør eller sprøyter som hver inneholder væske med densitet på 1,079-1,085; og hvor minst én beholder inneholder en samtidig raskt fikserende og farvende hydroalkoholisk løsning i henhold til hvilket som helst av kravene 11 til 18.

20. Klar-for-anvendelse-enhet eller -utstyr i henhold til krav 9, hvor: hver av fordypningene som inneholder et spesifikt antigen for den parasitose eller allergi som skal påvises, inneholder 10 til 20 ml av nevnte antigen i lyofilisert tilstand; hvert rør som inneholder en forhåndsmålt mengde med buffer, inneholder 5 ml av nevnte buffer; hver beholder som er tilpasset til slike rør, ampuller eller sprøyter, inneholder 5 ml av nevnte densitetsvæske på 1,079-1,085; og en eller flere beholdere som inneholder den samtidig raskt hydroalkoholisk fikserende og farvende løsning for objektglassene eller preparerte bokser, innbefatter en løsning med pH under 2,5 som har følgende sammensetning:

21. Utstyr eller klar-for-anvendelse-sett for utførelse av en diagnosetest på parasitoser og allergier i henhold til krav 9, hvorved denH epes buffer som inneholdes i forhåndsmålte mengder i ampuller eller egnede rør, omfatter 4 til 25 ml av en molar-løsning av Hepes buffer, 0,932 ml med 10 %-ig KCl, 0,550 ml med 10 %-ig Cacl2 , 0,510 ml med 10 %-ig MgCl2 og 850 til 900 ml med 9 %-ig Nacl, i løsning i en tilstrekkelig mengde med vann til at løsningen utgjør 1000 ml og/eller hvor den samtidig raskt fikserende og farvende løsning for antigen (eller sammenlignings) prepareringene utført ved diagnose-avlesnings-ob jektglassene , inneholdt i forhåndsmålte mengder i ampuller eller egnede enhetsrør, har en sammensetning i henhold til hvilket som helst av kravene 11 til 18.

22. utstyr eller klar-for-anvendelse-sett i henhold til krav 21, sammensatt av et futteral som omfatter: en flerhet av tilpassede beholdere såsom ampuller eller rør som inneholder forhåndsmålte mengder av en egnetH epes buffer, særlig Hepes buffer i henhold til krav 4, en flerhet av ampuller, rør eller sprøyter som inneholder forhåndsmålte mengder av en væske med densitet på 1,079-1,085, en flerhet av diagnose-avlesnings-objektglass eller -skåler som hver har et visst antall fordypninger hvorav de fleste, med unntak av sammenlignings-fordypningene, er beregnet på å motta variable forhåndsbestemte mengder av et spesifikt antigen for en allergi eller en parasitose som skal påvises, og en flerhet av ampuller eller rør som innelukker forhåndsbestemte mengder av en samtidig raskt fikserende og farvende løsning, i henhold til hvilket som helst av kravene 11 til 18.

23. Utstyr eller klar-for-anvendelse-sett i henhold til krav 21, sammensatt av to separate futteraler hvor den ene, som er bestemt for separeringen av basofile celler, omfatter: en flerhet av tilpassede beholdere, såsom ampuller eller rør som inneholder forhåndsmålte mengder av en egnet buffer, og særligH epes buffer i henhold til krav 4, en flerhet av ampuller eller rør som hver inneholder forhåndsmålte mengder av væske med densitet på 1,0 79-1,0 85; og hvor det andre futteral omfatter: en flerhet av diagnose-avlesnings-objektglass eller -skåler som hver har et visst antall fordypninger hvorav de fleste, med unntak av sammenlignings fordypningene, er beregnet på å motta variable forhåndsbestemte mengder av et spesifikt antigen for en allergi eller en parasitose som skal påvises, og en flerhet av ampuller eller rør som inneholder forhåndsmålte mengder av en samtidig raskt fikserende og farvende løsning, av løsningstypen i henhold til hvilket som helst av kravene 11 til 18, for riktig utførelse av diagnosetesten.

24. Utstyr eller klar-for-anvendelse-enhet i henhold til krav 21, i ett eller to futteraler, hvorH epes buffer inneholdt i forhåndsmålte mengder i en flerhet av tilpassede beholdere, såsom rør eller ampuller, har sammensetningen i henhold til krav 6.

25. utstyr eller klar-for-anvendelse-sett i henhold til krav 21, i ett eller to futteraler, hvorH epes buffer inneholdt i forhåndsmålte mengder i en flerhet av tilpassede beholdere, såsom rør eller ampuller, har sammensetningen i henhold til krav 8, og hvor diagnose-avlesnings-objektglassene eller -skålene innbefatter, i hver av deres fordypninger beregnet på å motta antigenet, en forhåndsbestemt mengde av kalsium og av magnesium i form av deres salter, og særlig deres klorider.

26. Utstyr eller klar-for-anvendelse-sett i henhold til krav 25, hvor kalsiumet er til stede på diagnose-avlesnings-objektglassene eller -skålene i et forhold på 1 mmol/liter, og magnesiumet er til stede i et forhold på ca. 1 mmol/liter.