FR2460481A1 - Nouveau reactif de diagnostic des parasitoses, procede de preparation de ce nouveau reactif et procede de diagnostic des parasitoses a l'aide dudit reactif - Google Patents

Abstract

REACTIF DE DIAGNOSTIC DES PARASITOSES. IL EST CONSTITUE PAR UNE SUSPENSION DE POLYNUCLEAIRES BASOPHILES PORTEURS D'IGE SPECIFIQUES, CONTENANT DE 300 A 1000BASOPHILES PAR MM. CETTE SUSPENSION EST OBTENUE A PARTIR D'UN ECHANTILLON DE SANG PRELEVE CHEZ UN PATIENT HUMAIN, A L'AIDE D'UN LIQUIDE DE DENSITE 1,079-1,085 ET EST DEPOSEE DANS LES DIFFERENTS PUITS D'UNE LAME OU ANALOGUE DE LECTURE DE DIAGNOSTIC, EN VUE DE LA REALISATION D'UN DIAGNOSTIC DES PARASITOSES. APPLICATION AU DIAGNOSTIC DES PARASITOSES, NOTAMMENT DES PARASITOSES A VERS QUI PROVOQUENT UNE AUGMENTATION DES IGE SPECIFIQUES CIRCULANTES.

Description

La présente invention est relative a un nouveau réactif de diagnostic des parasitoses, à un procédé de préparation de ce nouveau réactif et à un procédé de diagnostic des parasitoses, notamment des parasitoses à vers qui provoquent une augmentation des immunoglobulines spécifiques circulantes telles qu'IgE, IgG4,
IgM, à l'aide de ce réactif.

La protection de l'homme et des animaux domestiques contre les affections parasitaires représente l'un des grands problèmes mondiaux en matière de santé publique. Si les pays développés ont résolu un certain nombre de leurs problèmes parasitologiques sans les avoir cependant tous supprimés, les parasitoses constituent l'obstacle majeur au développement économique de beaucoup de pays, et en particulier des pays des régions chaudes du globe, qui sont celles qui comptent la plus grande prolifération humaine.

Il est essentiel pour pouvoir entreprendre une lutte efficace contre le fléau que représentent les parasitoses, de pouvoir réaliser un diagnostic sûr, fiable et précoce des parasitoses.

Si les examens cliniques, les examens radiologiques et les renseignements tirés de l'anamnèse sont d'un grand secours pour l'établissement du diagnostic, c'est essentiellement grâce aux méthodes biologiques et notamment immunoparasitologiques que les techniques d'investigation ont profondément évolué. C'est grace,essentiellement, & l'étude de l'hémogramme et des examens séro-immunologiques que l'on dispose actuellement,dans le domaine de la parasitologie,des "arguments d'orientation" et des "arguments de certitude" (GENTILINI et PINON, Vie Médicale,7 Février 1973).

Il est fréquent actuellement de rapporter à une étiologie parasitaire une manifestation fébrile jadis jugée "hépati que", "urinaire", ou "allergique".

De nombreuses techniques sérologiques ont été ainsi proposées : des tests cutanés par intradermoréaction, des tests d'agglutination des particules de latex et des hématies sensibilisées, des tests d'hémagglutination, des réactions de précipitation en gélose, des analyses immunoélectrophorétiques, des tests par immunofluorescence, des réactions de fixation du complément, etc... Ces méthodes désormais classiques de diagnostic ont pu se développer ces derniers temps, depuis que l'on dispose de fractions antigéniques parfaitement connues et indi vidualisées et depuis, également, que l'on a maîtrisé la conservation et la stabilisation de ces antigènes ainsi que leur standardisation. Toutes ces méthodes ont leurs avantages et leurs inconvénients, aucune n'est infaillible. C'est ainsi que A. CAPRON et Collab. (Path.Biol. 1970, Vol. 18, pages 357365) comparent les résultats obtenus pour le diagnostic immunologique de l'échinococcose humaine par les quatre méthodes suivantes : 1) l'immunoélectrophorèse (I.E.), 2) l'hémagglutination (H.M.G.), 3) la réaction d'agglutination au latex (AL), et 4) la réaction de fixation du complément (RFC).

Les résultats globaux du diagnostic immunologique de l'hydatidose obtenus par ces Auteurs,sont résumés dans le
Tableau I ci-après.

TABLEAU I

<tb> <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> de <SEP> de <SEP> Pot:centa- <SEP> iniim= <SEP>
<tb> Méthode <SEP> étudiés <SEP> positifs <SEP> sitivité <SEP> tif <SEP> obser- <SEP> Maximum <SEP> Moyenne <SEP>
<tb> <SEP> vé
<tb> I.E. <SEP> 350 <SEP> 321 <SEP> 91,7 <SEP> % <SEP> 1 <SEP> 18 <SEP> 4,8
<tb> RFC <SEP> 318 <SEP> 227 <SEP> 71,4 <SEP> % <SEP> 1/2 <SEP> 1/256 <SEP> 1/20
<tb> H.M.G <SEP> 330 <SEP> 260 <SEP> 78,8 <SEP> % <SEP> 1/512 <SEP> 1/512000 <SEP> 1/30000
<tb> A.L. <SEP> 279 <SEP> 220 <SEP> 78,8 <SEP> % <SEP> 1/2 <SEP> 1/512 <SEP> 1/50 <SEP>
<tb>
Ce Tableau met en évidence les pourcentages de positivité, ainsi que les limites inférieures et supérieures obtenues par les diverses méthodes utilisées.On remarque que l'immunoélectrophorèse a permis de déceler 91,7 % des cas. Dans tous les cas où il a été conclu positivement à l'existence d'une hydatidose, celle-ci a été confirmée par la voie opératoire, et il n'a jamais été posé de diagnostic immunologique par excès.

Par contre, A. CAPRON et Collab. ont noté qu'un certain nombre de malades pour lesquels la réponse immunologique a été négative étaient bien porteurs d'une hydatidose. Le pourcentage d'échec était de 15,4 % pour I.E., 29 % pour RFC, 21,4 % pour HMG et 24 % pour A.L.

Une autre méthode d'immunodiagnostic proposée a trait à la technique de radioallergosorption ("radioallergosorbent- test" des anglo-saxons ou RAST). Ce test est basé sur le fait que les sujets atteints de parasitose ont des taux d'immunoglobulines E (IgE) spécifiques anormalement élevés. La méthode a été décrite en détail pas CESKA et Collab. (J. Allergy Clin.

Immunol. 1972, 49, 1). C'est ainsi que D. VERVLOET et Collab.

ZRev. franç. Allergol. 1976, 16 (nO 2), pages 73-78/ ont utilisé cette technique du RAST chez 60 sujets présentant une hydatidose confirmée chirurgicalement et ont pu mettre en évidence 54 fois, soit dans 90 % des cas, la présence d'IgE spécifiques à l'égard des antigènes solubles du kyste hydatique. Ils ont également mis en évidence une bonne corrélation entre le taux d'IgE spécifiques mesuré par le RAST et le taux d'IgE totales. Mais, par contre, ils n'ont pas trouvé de corrélation entre le taux des anticorps IgE et le taux des anticorps mesurés par les techniques classiques d'immuno-électrophorèse, de fixation du complément, d'immunofluorescence et d'hémagglutination.Ces Auteurs, comme également par exemple Niklaus WEISS et Collab. ("The Lancet", 9 Décembre 1978) qui ont utilisé le RAST chez des sujets infestés par Schistosoma haematobium et S. mansoni,ou DESSAINT et
Collab. (Immunol. 1975, 29, 813) qui ont dosé les IgE spécifiques chez des sujets atteints dthydatidose et de bilharziose, concluent que le RAST peut s'ajouter à la "batterie classique" des tests immunologiques, sans les supplanter, en raison de sa fiabilité insuffisante et du fait qu'il ne s'agit pas d'un test quantitatif, mais d'un test uniquement gualitatif. I1 y a lieu également de citer les tests de dosage de l'histamine plus fiables que le RAST.

Dans un autre domaine, qui est celui de l'allergologie, les Inventeurs, en se basant sur les travaux de SHELLEY Lnotamment dans NATURE,1962, 195, p. 1181-1183 ; BLOOD, 1962, 19, p. 208-216 ; Trans. Stud. Coll. Physns Philad., 1964, 32, p. 15-197,repris ultérieurement par HIRSCH et ZASTROW (J. Allergy
Clin. Immunol. 1972, 50, p. 338-347) et SOIFER et HIRSCH ZJ. Allergy Clin. Immunol., 1975, 56, p. 127-132?, ont appliqué le test de dégranulation des polynucléaires basophiles humains avec une précision du diagnostic de l'ordre de 94 %, en utilisant une suspension leucocytaire enrichie 10 à 20 fois en polynucléaires basophiles (par rapport au sang circulant), dont les cellules sont fixées sur lame et colorées au bleu de toluidine Zcf. F. LEYNADIER, H. LUCE et J. DRY, Rev.Franç. d'Allergol.

1977, 17 (NO 4) p. 215-2187.

En partant de la connaissance du fait que la production de quantités importantes d'IgE spécifiques circulantes est l'une des caractéristiques de la réponse immune à la plupart des parasitoses à vers, les Inventeurs ont cherché à adapter la méthode de mesure des IgE par des antigènes spécifiques en utilisant des suspensions enrichies en polynucléaires basophiles porteurs d'IgE, mises sur lames, qu'ils avaient précédemment mise au point dans le domaine de l'allergologie, au diagnostic de diverses parasitoses à vers.

La présente invention a en conséquence pour but de pourvoir à un nouveau reactif de diagnostic des parasitoses, et notamment des parasitoses à vers qui provoquent une augmentation des immunoglobulines spécifiques circulantes fixées sur les basophiles, telles que les IgE en particulier, lequel réactif permet d'obtenir des diagnostics extrêmement fiables et est d'un emploi relativement simple, tandis que les techniques qui permettent de l'obtenir, assurent des concentrations en basophiles suffisantes dans le réactif pour que les résultats obtenus en présence d'antigène, au cours du diagnostic, soient statistiquement interprétables en toute sécurité.

La présente invention a pour objet un réactif de diagnostic des parasitoses, et notamment des parasitoses à vers qui provoquent une augmentation des immunoglobulines spécifiques circulantes, et notamment des IgE, caractérisé en ce qu'il est constitué par une suspension de polynucléaires basophiles porteurs d'IgE spécifiques,obtenue à partir d'un échantillon de sang prélevé chez un patient humain chez lequel on recherche une parasitose, laquelle suspension contient de 300 à 1 000 basophiles par mm , par centrifugation pour recueillir une couche contenant essentiellement des leucocytes, qui est mélangée avec un tampon non destructeur vis-à-vis des cellules basophiles, tel que le tampon
Hépès ou le tampon Pipès par exemple, ledit mélange homogénéisé étant ensuite déposé sur un liquide de densité 1,079-1,085 dont l'osmolarité est comprise entre 280 et 320 milliosmoles, pour donner lieu après centrifugation pendant une durée et à une vitesse appropriées, à un anneau qui est constitué par une suspension enrichie en basophiles et qui surmonte le liquide de densité, lequel anneau est prélevé puis lavé, de préférence à l'aide du même tampon que ci-dessus, pour être déposé dans les différents puits d'une lame ou d'une boite de lecture de diagnostic.

La présente invention a également pour objet un procédé de préparation dudit réactif de diagnostic, qui consiste : - à soumettre un échantillon de sang prélevé chez un patient humain supposé atteint d'une parasitose, à une centrifugation pendant une durée et à une vitesse appropriées pour recueillir une couche leucocytaire et un plasma surnageant riche en plaquettes - à rejeter ledit plasma et à mélanger la couche leucocytaire avec une quantité appropriée de tampon non destructeur à l'égard des cellules basophiles tel que le tampon Hépès CM ou Pipès par exemple ; - à injecter sous ledit mélange un liquide de densité 1,079-1,085, dont l'osmolarité est comprise entre 280 et 320 milliosmoles, avantageusement constitué par un mélange de métrizoate de sodium et de Ficoll ou de Percol ; - à centrifuger pendant une durée et à une vitesse appropriées, pour obtenir un anneau contenant les basophiles et les lymphocytes ;-à prélever ledit anneau et à le laver soigneusement avec le même tampon que ci-dessus que l'on rejette pour ne conserver que le culot cellulaire qui, après remise en suspension, est prêt à être déposé dans les puits d'une lame ou d'une boîte de lecture de diagnostic.

La présente invention a en outre pour objet un procédé de diagnostic des parasitoses, et notamment des parasitoses à vers qui provoquent une augmentation des IgE spécifiques circulantes, caractérisé en ce que :-l'on met en contact pendant environ 15 minutes à 370C, le réactif de diagnostic conforme à l'invention, avec de l'antigène spécifique de la parasitose que l'on cherche à diagnostiquer, contenu à différentes concentrations dans un certain nombre de puits d'une lame ou d'une boîte de lecture de diagnostic, tandis que les puits restants de ladite lame ou boîte contiennent le réactif de diagnostic seul, pour servir de témoins ; - l'on procède à un séchage rapide de la lame ainsi préparée ; - l'on procède à la fixation et à la coloration rapides, simultanées de la lame ou de la boSte---prepa- rée de la sorte, à l'aide d'une solution hydro-alcoolique de fixation et de coloration rapides, simultanée, de;composition appropriée, qui contient un colorant métachromatique qui colore sélectivement les granules cytoplasmiques des basophiles, avec laquelle la lame ou la boîte est mise en contact pendant un temps bref, de l'ordre de 5 à 15 minutes, par exemple ; - l'on compte les polynucléaires basophiles au microscope optique, avec un grossissement approprié (250 à 400 par exemple), respectivement dans les puits témoins et dans les différents puits contenant le réactif et différentes concentrations d'antigène ; - et l'on établit, par comparaison de la diminution du nombre de polynucléaires basophiles (PB) dans les puits contenant l'antigène à diverses concentrations, par rapport au nombre de PB contenus dans les puits témoins, l'index de dégranulation
ID = PB témoins - PB antigène x 100, ou pourcentage de basophi
PB témoins les qui ont apparemment disparu en présence de l'antigène, qui, s'il est supérieur à 35 %, permet de diagnostiquer la présence de la parasitose recherchée.

Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de diagnostic conforme à la présente invention, la solution hydroalcoolique de fixation et de coloration rapides, simultanées, des lames est une solution à pH acide, inférieur à 2,5, qui contient comme colorant métachromatique, du bleu de toluidine, associé à du sulfate d'aluminium, du chlorure de cétylpyridinium, du glutaraldéhyde et du formaldéhyde, en solution dans un mélange d'éthanol et de méthanol absolus et d'eau
La présente invention a de plus pour objet, un ensemble prêt à l'emploi, de préférence contenu dans un coffret unique, pour la réalisation du test de diagnostic des parasitoses, conforme à la présente invention, lequel ensemble est caractérisé en ce qu'il comprend, en combinaison-:: - une pluralité de lames, boites ou analogues présentant chacune un certain nombre de puits de diamètre égal dont la totalité, sauf les puits devant constituer les témoins, contiennent une quantité prédéterminée d'un antigène spécifique d'une parasitose à diagnostiquer, lequel antigène est introduit à l'état sec, de préférence lyophilisé, dans chacun des puits, lesdites quantités prédéterminées variant d'une colonne de puits à la suivante ; - une pluralité de tubes contenant des quantités prédosées d'un tampon approprié tel que tampon Hépès CM ou Pipès ; - une pluralité de seringues ou analogues de 5 cm3 contenant chacune un liquide de densité 1,079-1,085, associées à des aiguilles ou analogues d'injection dudit liquide de densité ; - un récipient contenant une solution hydroalcoolique de fixation et de coloration rapides, simultanées,des lames, boites ou analogues susdites préparées conformément à 1 'inven- tion, dont le pH est inférieur à 2,5 et qui contient un colorant métachromatique tel que le bleu de toluidine de préférence, du sulfate d'aluminium, du chlorure de cétylpyridinium, du glutaraldéhyde et du formaldéhyde, en solution dans un mélange de méthanol et d'éthanol absolus et d'eau.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'ensemble prêt à l'emploi conforme à la présente invention : - chacun des puits contenant un antigène spécifique de la parasitose à diagnostiquer contient 10 ijl dudit antigène à l'état lyophilisé - chaque tube contenant une quantité prédosée de tampon contient 5 ml dudit tampon ; - chaque seringue contenant du liquide de densité contient 5 ml dudit liquide de densité 1,079-1,085 ; - le récipient contenant la solution hydroalcoolique de fixation et de coloration rapides, simultanées1 des lames, boîtes ou analogues préparées, renferme une solution à pH inférieur à 2,5, présentant la composition suivante bleu de toluidine ou colorant métachromatique analogue : 2,2 g/litre environ, sulfate d'aluminium : 7,5 g/litre environ, chlorure de cétylpyridinium : 0,75 g/litre environ, glutaraldéhyde : 20 g/litre environ, formaldéhyde : 35 g/litre environ, méthanol absolu:300 ml/litre environ, éthanol absolu :300 ml/litre environ, eau distillée qsp 1 000 ml.

Conformément à l'invention, les lames, botes ou analogues de lecture de diagnostic mises en oeuvre sont choisies notamment parmi : - les lames présentant une pluralité de puits de diamètre égal, constitués par des cercles de paraffine - les lames sur lesquelles est collé un ruban adhésif préalablement percé d'une pluralité de trous de diamètre égal qui constituent les puits ; - des boites de plastique transparent au fond desquelles est collé un ruban adhésif percé d'une pluralité de trous comme indiqué ci-dessus.

Outre les-dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre.

L'invention vise plus particulièrement les nouveaux réactifs de diagnostic des parasitoses, ainsi que leur procédé de préparation, conformes aux dispositions qui précèdent, et les procédes de diagnostic mettant en oeuvre lesdits réactifs,et les moyens mis en oeuvre pour réaliser lesdits procédés de diagnostic.

L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère en premier lieu à des exemples de préparation des réactifs de diagnostic conformes à la présente invention, puis à un test de diagnostic à l'aide dudit réactif, les resultats de ce test étant illustrés par des graphiques et par la représentation de lames de lecture de diagnostic, dans les dessins annexés.

Il doit être bien entendu toutefois, que ces exemples et dessins sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLES DE PREPARATION D'UN REACTIF DE DIAGNOSTIC DE PARASITOSE,
CONFORME A L'INVENTION
EXEMPLE 1 3
a) On prélève 5 à 10 cm d'un échantillon de sang total chez un patient supposé atteint de la parasitose que l'on vise à diagnostiquer, le prélèvement étant effectué de préférence à jeûn sur une quantité strictement calculée d'héparine (10 à 15 unités par ml).

b) Si le sang zest pas traité immédiatement, il peut être placé au réfrigérateur à une température ne dépassant pas 40C et pendant une durée ne dépassant pas 3 à 4 heures.

Le sang total prélevé est centrifugé à 130 g à 150 g durant 15 minutes, afin de séparer le plasma contenant les plaquettes, d'une couche leucocytaire, qui contient également les hématies.

c) On prélève et on jette le plasma surnageant contenant les plaquettes, jusqu' à environ 2 à 4 mm de la couche leucocytaire, cette opération pouvant avantageusement être effectuée à l'aide d'une seringue munie d'une aiguille longue, d'un cathéter ou d'une pipette Pasteur.

On récupère d'autre part la couche leucocytaire et environ 1 cm3 d'hématies.sous-jacentes.

d) Dans un tube, de 100 x 20 par exemple, dans lequel on a déposé 5 ml de tampon Hépès CM qui présente la composition suivante - Tampon Hépès, solution molaire 25 ml - KC1 10 %, 0,932 ml - CaCl2 10 %, 0,550 ml - MgC12 10 %, 0,510 ml - NaCl 9 %O (7,6 g), 844,11 ml - H2O distillée qsp 1 000 ml
On ajuste avec une dizaine de gouttes de NaOH N à pH entre 7,4 et 7,6
on vérifie que l'osmolarité est entre 290 et 300 mOsM; pour 25 mmoles de tampon, on introduit la couche leucocytaire et le om3 d'hématies récupérées, que l'on melange avec le tampon.

e) A l'aide d'une seringue de préférence munie d'une longue aiguille, du type des aiguilles à ponction lombaire,ou d'une pipette Pasteur, on injecte avec précaution au fond du tube de l'étape d), 5 ml du liquide de densité 1,080 qui présente la composition suivante - Métrizoate de sodium 15 g (une ampoule de 20 ml à 75 %
Produit par NYEGAARD, OSLO) - Ficoll (Sigma) 12,867 g - H20 qsp 165,8 ml on adapte la densité de façon précise à 1,080 ; si on utilise des ampoules de métrizoate de 30 ml à 32,8 *, la quantité de Ficoil nécessaire pour une ampoule est de 8,441 g avec H2O qsp 108,85 ml.

Cette injection soulbve le sang dilué sus-jacent.

f) On prend la précaution de ne pas agiter pour que les deux milieux ne se mélangent pas, puis l'on procède à une centrifugation de 30 minutes à 400 g à l'interface (par exemple, dans une centrifugeuse JOUAN à 1800 tours/minute, avec étoile B).

g) Au terme de la centrifuqation, on observe de bas en haut, environ 1 cm d'hématies, puis le liquide de densité 1,080, qui est séparé du tampon, qui se trouve à la partie supérieure, par un anneau qui contient les basophiles et d'autres cellules blanches.

A l'aide d'une seringue munie d'un cathéter, d'une longue aiguille ou à l'aide d'une pipette Pasteur, on prélève avec précaution l'anneau, soit environ 1 à 2 ml de liquide.

On lave cet anneau une fois dans 3 à 5 volumes de tampon H4pes CM t on jette le surnageant pour ne garder qu'environ 0,5 cm3 du sédiment cellulaire dilué dans le tampon.

On remet, sous agitation, les cellules en suspension
dans le tampon et on peut ensuite garder la suspension à 40C
jusqu'à son utilisation dans les deux ou trois heures qui sui
vent.

La suspension cellulaire obtenue contient de 5 à 10 %
de basophiles en suspension dans 0,5 ml de tampon, c'est-à-dire
que,alors que le nombre de basophiles contenus dans 1 pl de sang
circulant ne dépasse pas 30 ou 40, dans la suspension cellulaire
obtenue conformément au procédé objet de l'invention, on obtient
un enrichissement de la teneur en basophiles tel que la suspen
sion contient de 300 à 1 000 basophiles par p1.

h) Sur des lames de lecture de diagnostic préparées
(cf. figure 1 annexée dans laquelle ces lames sont désignées par
la référence 1), c'est-à-dire sur lesquelles est collé un ruban
adhésif préalablement percé de trous de diamètre identique, qui
constituent des puits 2,3,4,5, (cf. figure 1), on dépose à l'intérieur
de chacun des puits 3,4,5, 20 pl de la suspension cellulaire susdite,
les cellules en suspension étant réparties de façon régulière
dans chaque puit.Dans un certain nombre de puits, le quart d'entre eux par exemple,désignés en référence 2,l'on ajoute à la suspension cellulaire, 10 p1 du tampon Hépès a ci-dessus ; dans les autres puits 3,4,5, on
ajoute à la suspension cellulaire, 10 pl de l'antigène spécifique
de la parasitose que l'on cherche à diagnostiquer, dilués dans
du tampon Hépès CM.

A noter que l'antigène spécifique de la parasitose
que l'on cherche à diagnostiquer peut avantageusement provenir
d'un prélèvement effectué, chez un patient atteint de la même
parasitose, de liquide tumoral qui est conservé, jusqu'à utili
sation, par congélation à une température optimale de -800C.

Dans l'exemple de réalisation présentement décrit,
l'antigène provient de prélèvements du contenu liquide d'un
kyste hydatique du foie, lui-même prélevé pendant une interven
tion chirurgicale, et conservé à -800C.

Pour utiliser ledit liquide hydatique en tant qu'anti-
gène, on le décongèle, après quoi on peut éventuellement mais
non obligatoirement le centrifuger à 1000 g pendant 15 minutes.

Le surnageant d'une part, le culot de centrifugation
d'autre part, peuvent être tous deux utilisés en tant qu'anti-
gène, soit à l'état pur, soit dilués avec un tampon Hépès CM.

i) La lame préparée de la sorte est placée dans une
boite de plastique dont la teneur en humidité est voisine de la
saturation.

On met cette botte à l'étuve à 370C durant 15 minutes,
temps nécessaire et suffisant pour que la réaction entre la sus
pension cellulaire et l'antigène puisse avoir lieu.

j) On sort ensuite la botte de l'étuve, puis on sèche
très rapidement la lame par soufflage d'air chaud.

La lame est alors sizeltanément fixée et coloree
l'aide de la solution suivante
bleu de toluidine 2,2 g/litre
sulfate d'aluminium 7,5 litre
chlorure de cétylpyridinium 0,75 g/litre
glutaraldéhyde 20 g/litre
formaldéhyde 35 g/litre
méthanol absolu 300 ml/litre
éthanol absolu 300 ml/litre
eau distillée qsp 1 00Q ml
pH mesuré 2,3
dans laquelle la lame est trempée pendant 15 minutes, au bout
desquelles elle est rincée 30 secondes dans l'eau distillée,
30 secondes dans l'éthanol absolu et si besoin dans le xylène.

Dans le cas où on utilise des petites boîtes de plastique transparent pour la lecture du diagnostic ,on verse directement une quantité appropriée de la solution de colorant fixateur cidessus, dans lesdites boites pour réaliser la fixation et la coloration rapides, simultanées.

La lame est ensuite monte à l'aide d'un liquide de montage approprié (tel qu"'Eukitt" disponible chez BIOLYON) et d'une lamelle (cf. lame b dans la figure l).

k) La lecture s'effectue en comptant au microscope
(avec un grossissement de 250, 400 ou 1000 en fonction de la
richesse en cellules de la suspension) le nombre de basophiles
trouvés dans le même nombre de champs microscopiques répartis
au hasard dans les puits témoins et dans les puits contenant de 1 'antigène.

La fixation-et la coloration simultanées permettent une identification rapide et parfaite des basophiles intacts dont le nombre
(200 à 1000/1) et l'aspect permettent un comptevoisin d'au
moins 30 à 50 basophiles par plage-timoin, ce qui est compatible
avec une analyse statistique.

La dégranulation des basophiles qui ont réagi avec l'antigène spécifique, s'accompagne d'une disparition apparente de ces cellules qui ne peuvent alors être identifiées que par leur métachromasie, au microscope optique.

La diminution du nombre des basophiles dans les puits contenant l'antigène par rapport aux puits témoins, est exprimée par l'index de dégranulation
ID = PB témoins - PB antigène x 100
PB témoins
En présence d'une parasitose, on obtient un ID significatif, au moins supérieur à 35 % et fréquemment voisin de 100 8.

EXEMPLE 2
Suivant une variante, on utilise des lames déjà préparées avec de l'antigène sec à l'intérieur des puits, un tel antigène ayant été obtenu par lyophilisation du surnageant obtenu après centrifugation de liquide tumoral, comme décrit à l'Exemple 1, h).

Une telle préparation des lames simplifie considérablement la manipulation, puisqu'il suffit de déposer 20 p1 de suspension cellulaire dans tous les puits (dont certains, environ le quart, ne contiennent pas d'antigène et serviront de témoins).

EXEMPLE 3
L'antigène présent dans les puits de la lame est introduit à diverses concentrations : par exemple, dans le cas d'une lame à 8 puits dont 2 puits (les puits 2) ne contiennent pas l'antigène et sont donc des puits témoins, on introduit l'antigène, dans les puits 3 à une dilution de 10 4, dans les puits 4 à une dilution de 10 6, et dans les puits 5 à une dilution de 10 8, avec le tampon Hépès CM mentionné dans l'Exemple 1.

EXEMPLE 4
Le comptage oculaire decrit au k) peut être remplacé par un comptage automatique à l'aide d'une machine connue du commerce, telle que celle qui est connue sous la dénomination commerciale d' "OPTOMAX".

EXEMPLE D'APPLICATION DU PROCEDE DE DIAGNOSTIC CONFORME A
L'INVENTION
L'antigène utilisé a été obtenu à partir du contenu liquide d'un kyste hydatique du foie, prélevé pendant l'intervention chirurgicale et conservé à -800C.

Après décongélation, le liquide hydatique a été centrifugé à 1 000 g pendant 15 minutes. Le surnageant d'une part, le culot de centrifugation d'autre part, ont été employés comme antigènes purs ou dilués avec un tampon Hépès CM.

Les résultats ont été exprimés en pourcentage de basophiles ayant apparemment disparu en présence d'antigène par rapport au nombre de basophiles comptés en présence du tampon sans antigène.

L'observation concerne un homme âgé de 38 ans, qui avait un kyste hydatique de 15 cm de diamètre, développé aux dépens du lobe droit du foie. Son contenu était translucide avec d'innombrables vésicules filles. Le kyste et l'adventice hydatique ont fait l'objet d'une exérèse complète.L'immunodiagnostic (électrophorèse et hémagglutination) était, avant l'intervention, négatif ; le quatrième jour post-opératoire, l'hémagglutination était positive à 1/12800 et l'injection intradermique de dilutions décroissantes du liquide stérilisé par filtration, a montré une réaction positive à 1/100 (15-35), à la 20ème minute.

Le test conforme à l'invention a été fait, chez le malade, le deuxième et le quatrième jours post-opératoires et chaque fois chez deux témoins. Les quatre témoins étaient indemnes de toute infestation parasitaire. L'un des témoins avait un hémolymphangiome de 3420 grammes du lobe droit du foie qui a été réséqué.

RESULTATS
Les figures 2 et 3 montrent les pourcentages de dégranulation du malade et des deux témoins au deuxième jour et au quatrième jour post-opératoires. Ces pourcentages ont été établis sur plus de 200 basophiles (nombre réellement-compté et non extrapolé à partir de guelques cellules dénombrées sur lame de Mallasez) pour chaque sujet (de 202 à 1270) en l'absence d'antigène.

Ces résultats montrent, chez ce malade atteint d'un kyste hydatique du foie, une dégranulation des basophiles en présence de liquide hydatique, très hautement significative.

Il n'a pas été observé de différences dans les résultats selon que l'antigène utilisé était le liquide hydatique ou le culot de centrifugation.

Il résulte de la description qui précède que l'on obtient, conformément à l'invention, des moyens pour la réalisation d'un test de diagnostic de parasitoses comportant une élé vation des IgE spécifiques, qui est extremement fiable et donne un pourcentage de concordance par rapport aux tests de l'histamine, qui est voisin de 100 %.

De plus, la lecture des lames de diagnostic est considérablement facilitée et accélérée par l'augmentation du nombre des basophiles à compter, permettant ainsi d'obtenir des index de dégranulation statistiquement valables.

Le réactif de diagnostic et le test de diagnostic conformes à la présente invention sont applicables au diagnostic de toutes les parasitoses qui déterminent une augmentation des IgE spécifiques, et notamment aux helminthiases telles que bilharziose, ténia, ascariose, filariose, oxyurose, etc...

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'entre décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée , de la présente invention.

Claims (2)

REVENDICATIONS est prélevé, puis lavé, de préférence à l'aide du meme tampon que ci-dessus, pour etre déposé dans les différents puits d'une lame ou botte de lecture de diagnostic. basophiles et qui surmonte le liquide de densité, lequel anneau centrifugation pendant une durée et à une vitesse appropriées, à un anneau qui est constitué par une suspension enrichie en sur un liquide de densité 79-1,085 dont l'osmolarité est comprise entre 280 et 320 milliosmoles, pour donner lieu, après Pipés notamment, ledit mélange homogénéisé étant ensuite déposé cellules basophiles,tel que le tampon HépésCM ou le tampon qui est mélangée avec un tampon non destructeur vis- -vis des recueillir une couche contenant essentiellement des leucocytes, de 300 à 1 OOO basophiles par mm , par centrifugation pour lequel on recherche une parasitose, laquelle suspension contient 3 caractérisé en ce qu'il est constitué par une suspension de polynucléaires basophiles porteurs d'IgE spécifiques, obtenue à partir d'un échantillon de sang prélevé chez un patient humain chez immunoglobulines spécifiques circulantes, et notamment des IgE,

1 - Réactif de diagnostic des parasitoses, et notamment des parasitoses à vers gui provoquent une augmentation des

ledit anneau et à le laver soigneusement avec le meme tampon que ci-dessus, que l'on rejette pour ne conserver que le culot cellulaire qui, après remise en suspension, est pret à etre dépo 8é dans les puits d'une lame ou d'une botte de lecture de diag nostic.

1,079-1,085, dont l'osmolarité est comprise entre 280 et 320 milliosmoles, avantageusement constitué par un mélange dc métrizoate de sodium et de Ficoîl ou de Percol ; - à centrifuger pendant une durée et à une vitesse appropriées, pour obtenir un anneau contenant les basophiles et les lymphocytes : - à prélever

une quantité appropriée de tampon non destructeur à 11 égard des cellules basophiles-,tel que le tampon Hépès CM ou Pipés notamment t - à injecter sous ledit mélange un liquide de densité

leucocytaire et un plasma surnageant riche en plaquettes , - à rejeter ledit plasma et à mélanger la couche leucocytaire avec

une durée et à une vitesse appropriées pour recueillir une couche

selon la Revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste : - à soumettre un échantillon de sang prélevé chez un patient humain supposé atteint d'une parasitose, à une centrifugation pendant

2 - Procédé de préparation du réactif de diagnostic

PB témoins ou pourcentage de basophiles qui ont apparemment disparu en présence de l'antigène, qui, s'il est supérieur à 35 %, permet de diagnostiquer la présence de la parasitose recherchée.

ID = PH témoins - PB antigène x 100

30- Procédé de diagnostic des parasitoses, et notamment des parasitoses à vers qui provoquent une augmentation des immunoglobulines spécifiques circulantes ,et notamment des IgE, caractérisé en ce que : - l'on met en contact pendant environ 15 minutes à 370C, le réactif de diagnostic selon la Revendication 1, avec de l'antigène spécifique de la parasitose que l'on cherche à diagnostiquer, contenu à différentes concentrations dans un certain nombre de puits d'une lame ou d'une botte de lecture de diagnostic, tandis que les puits restants de ladite lame ou botte contiennent le réactif de diagnostic seul, pour servir de témoins ;; - l'on procède à un séchage rapide de la lame ainsi préparée t - l'on procède à la fixation et à la coloration rapides, simultanées, de la lame préparée de la sorte, à l'aide d'une solution hydroalcoolique de fixation et de coloration rapides, simultanées,de composition appropriée, qui contient un colorant métachromatique qui colore sélectivement les granules cytoplasmiques des basophiles, avec laquelle la lame ou la botte est mise en contact pendant un temps bref, de l'ordre de 5 à 15 minutes. notamment ; - l'on compte les polynucléaires basophiles (PB) au microscope optique, avec un grossissement appropriésrespectivement dans les puits témoins et dans les différents puits contenant le réactif et différentes concentrations d'antigènes ;; - et l'on établit, par comparaison de la diminution du nombre de polynucléaires basophiles dans les puits contenant l'antigène à diverses concentrations, par rapport au nombre de PB contenus dans les puits témoins, l'index de dégranulation

4 - Procédé de diagnostic selon la Revendication 3, caractérisé en ce que la solution hydroalcoolique de fixation et de coloration rapides, simultanEes,des lames est une solution à pH acide, inférieur à 2,5, qui contient comme colorant mdta- chromatique, du bleu de toluidine, associé à du sulfate d'aluminium, du chlorure de cétylpyridinium, du glutaraldéhyde et du formaldéhyde, en solution dans un mélange d'éthanol et de méthanol absolus et d'eau.

Pipés ; - une pluralité de seringues de 5 cm contenant chacune le liquide de densité 1,079-1,085, associées à des aiguilles ou analogues d'injection dudit liquide de densité ; - un récipient contenant une solution hydroalcoolique de fixation et de coloration rapides, simultanées,des lames, bottes ou analogues susdites, dont le pH est inférieur à 2,5 et qui contient un colorant mdtachromatique tel que le bleu de toluidine de préférence, du sulfate d'aluminium, du chlorure de cétylpyridinium, du glutaraldéhyde et du formaldéhyde, en solution dans un mélange de méthanol et d'éthanol absolus et d'eau.

5C Ensemble pret à l'emploi, de préférence contenu dans un coffret unique, pour la réalisation du test de diagnostic des parasitoses,selon l'une quelconque des Revendications 3 ou 4, caractérisé en ce qutil comprend, en combinaison : - une pluralité de lames ou botes présentant chacune un certain nombre de puits de diamètre égal dont la totalité, sauf les puits devant constituer les témoins, contiennenr une quantité prédéterminée d'un antigène spécifique d'une parasitose à diagnostiquer, lequel antigène est introduit à l'état sec, de préférence lyophilisé, dans chacun des puits, lesdites quantités prédéterminées variant d'une colonne de puits à la suivante ; - une pluralité de tubes contenant des quantités préposées d'un tampon approprié tel que tampon Hépès CM ou 3

6 - Ensemble pret à l'emploi selon la Revendication 5, caractérisé en ce que s - chacun des puits contenant un antigène spécifique de la parasitose à diagnostiquer contient 10 iil dudit antigène à l'état lyophilisé ; - chaque tube contenant une quantité préposée de tampon contient 5 ml dudit tampon - chaque seringue contenant du liquide de densité contient 5 ml dudit liquide de densité 1,079-1,085 ; - le récipient contenant la solution hydroalcoolique de fixation et de coloration rapides simultanées, des lames ou bottes p ré p a ré es , r e n f e r m e une solution à pH inférieur à 2,5, présentant la composition suivante : bleu de toluidine ou colorant métachromatique analogue : 2,2 g/litre environ, sulfate d'aluminium : 7,5 g/litre environ, chlorure de cétylpyridinium : 0,75 g/litre environ, glutaraldéhyde t 20 g/litre environ, formaldéhyde : 35 g/litre environ, méthanol absolu : 300 ml/litre environ, éthanol absolu s 300 ml/litre environ, eau distillée qsp 1 000 ml.