FR2543300A1 - Reactif serologique - Google Patents

Abstract

CE REACTIF, DESTINE A DETERMINER LES ANTIGENES ET LES ANTICORPS AVEC UNE SENSIBILITE ET UNE SPECIFICITE PLUS ELEVEES QUE DANS LES TECHNIQUES ANTERIEURES CONNUES, EST BASE SUR L'ACTION INTERDEPENDANTE DE DEUX COMPOSES ACTIFS MIS EN OEUVRE EN UNE SEULE UNITE DE DIAGNOSTIC ET QUI PERMETTENT D'UNE PART D'INHIBER LES FACTEURS "DU TYPE LECTINE" OU "D'ANTICORPS SPECIFIQUES" ET DE DETECTER LES ANTIGENES OU ANTICORPS SPECIFIQUES. POUR OBTENIR UN TEL RESULTAT, ON AJOUTE AUX ANTIGENES OU ANTICORPS DE CELLULES ANIMALES OU VEGETALES UNE SOLUTION DILUEE D'UNE OU PLUSIEURS SUBSTANCES DES TYPES: SUCRES, SUCRES AMINES, GLYCEROPHOSPHATES SPHINGOMYELINES, ESTERS DE CHOLINE, SELS DE CHOLINE OU AUTRES DERIVES D'AMMONIUM QUATERNAIRE.

Description

La présente invention concerne un nouveau réactif sérologique

pour la détermination des antigènes et anticorps.

Problème posé et état de la technique antérieure Le diagnostic d'un grand nombre de maladies contagieuses est basé sur l'évaluation de la réponse immunologique générée par les hôtes

parasites à l'égard des agents infectieux envahisseurs.

Les méthodologies pour ce type d'études ne manquent pas mais elles sont presque toutes basées sur lemême principe qui consiste à

quantifier ou semi-quantifier les anticorps produits contre les micro-

organismes qui provoquent la maladie Ce type d'investigation appartient à la spécialité connue sous le nom de sérologie et il s'agit d'une voie indirecte permettant de déduire l'existence d'une maladie En fait, on admet que si une personne possède des anticorps contre un certain agent infectieux, cela est du au fait que cet agent ou des composants de celuici (antigènes) provoque une stimulation immunologique de l'hôte et que, de ce fait, la génération des anticorps permet de formuler

l'hypothèse de la présence de l'agent infectieux.

Bien évidemment, l'efficacité du système dépendra de la fia-

bilité susceptible d'être attribuée, pour chaque détection d'anticorps,

à sa correspondance véritable avec un antigène ou microorganisme déter-

miné Cette efficacité sera ainsi fonction des niveaux de détection

qui peuvent être atteints pour les anticorps.

Ces deux aspects sont généralement connus comme représentant la spécificité et la sensibilité des tests sérologiques De ces deux notions, la sensibilité est la plus facile à obtenir pour ce qui est des instruments, du fait de l'évolution et des améliorations des méthodes de mesure des molécules biologiques, notamment par radioisotopes, enzymes etc qui permettent de détecter des quantités infinitésimales de toute

protéine immunologiquement intéressante.

La spécificité pose un problème plus difficile et implique des questions relatives au stimulus des antigènes et à l'origine des

réponses qui peuvent être naturelles ou déclenchées par l'hôte stimulé.

On trouve un grand nombre d'antigènes distribués dans la

nature et repris par les créatures vivantes Il est tout à fait classi-

que, dans ces conditions, que la réponse à l'un deux soit capable de

constituer une réaction simultanée à plusieurs porteurs de cet antigène.

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Au cours des trente ou quarante années passées, les scienti-

fiques ont entrepris beaucoup de recherches dans le domaine de l'immu-

nochimie et se sont attachés tout spécialement à la recherche d'antigè-

nes ayant une unique identité, pour la préparation de réactifs sérolq-

giques Dans quelques cas, ces efforts ont rencontré quelques succès. Toutefois ils ne sont pas faciles à accomplir et se traduisent très souvent par une réduction substantielle de la sensibilité inhérente au système. On sait que la recherche de composants spécifiques d'un agent microbien doit être accompagnée d'une sélection dans laquelle

quelques composants sont écartés et d'autres favorisés Les hôtes para-

sites ne réagissent pas toujours avec la même efficacité ou sélectivité à l'égard de tous les antigènes comprenant un agent infectieux et, de ce fait, la sélection de quelques-uns d'entre eux au détriment d'autres rend l'analyse plus spécifique mais au prix d'une sensibilité réduite, attendu que, indépendamment de la sophistication des instruments, il n'est pas possible de détecter des éléments non existants dans notre composition. Au cours de la recherche sérologique de quelques maladies, des tentatives ont été faites pour résoudre des problèmes de ce type

par "neutralisation" ou "absorption" des réponses immunologiques simi-

laires mais non spécifiques à l'agent infectieux en cause Ces neutra-

lisations ou absorptions ont été entreprises sur des microorganismes similaires mais non identiques à ceux recherchés Des progrès ont ainsi été notés dans le diagnostic sérologique de la Syphilis au moyen de l'immuno-fluorescence indirecte et, dans le cas de la maladie de Chagas,

pour la réactivité croisée avec les Leishmanioses Toutefois, cette mé-

thode n'a pas été étendue à d'autres pathologies, que ce soit du au manque de succès dans les résultats ou à une chute marquée dans les titres sérologiqueset également des réponses spécifiques, après les absorptions.

Selon une alternative différente pour améliorer la spécifi-

cité, on a travaillé sur les mécanismes de la réponse naturelle ou

provoquée des hôtes On a découvert il y a plusieurs années que les im-

munoglobulines de type Ig M présentent un comportement moins spécifique que celles de type Ig G Les immoglobulines M sont des protéines de haut 3 25433 e O poids moléculaire agissant des ancêtres immunologiques: elles sont les premières à apparaître dans un foetus et dans une infection; en outre, elles incluent la meilleure part des "anticorps naturels" Elles sont actives sous forme de polymère et, si elles sont détruites, l'Ig M perd pratiquement toutes ses fonctions Les molécules Ig G sont des protéines de faible poids moléculaire et représentent la réponse la plus parfaite

et la plus lente à l'hôte parasite Elles sont actives à l'état de mono-

mère, ce qui permet une différenciation aisée de l'Ig M En utilisant une méthode de réduction modérée qui romptles ponts disulfure en laissant intact l'état de polymère de l'Ig M, cette molécule peut être désactivée

sans affecter l'Ig G Un tel mécanisme a provoqué d'importantes améliora-

tions dans la spécificité de différents tests sérologiques, notamment

en ce qui concerne les essais d'agglutination de cellules ou de micro-

organismes Tel est le cas de l'agglutination directe de Chagas et de la toxoplasmose o le Demandeur et, plus tard, d'autres auteurs, ont pu

prouver que l'emploi systématique de mercapto-2 éthanol (un agent réduc-

teur doux) permet de différencier, avec une efficacité acceptable, des

personnes présumées normales et d'autres personnes qui ont été infectées.

Description de l'invention

Par une exploration en profondeur de cette ligne de recher-

ches, il a maintenant été trouvé qu'il existe, dans les sérums de person-

nes en bonne santé, un nombre important de réactifs non spécifiques qui résistent à l'action du mercapto-2 éthanol Cela signifie que de tels sérums continuent à avoir une capacité d'agglutination non spécifique après mise en contact avec le mercapto-2 éthanol En fait, il n'a pas

été possible d'associer cette activité à des molécules de type immunoglo-

bulinique et l'on a donc commencé à mettre de côté la fonction anticorps

de ces dernières Il s'agit là d'une très importante découverte en séro-

logie car, dans le passé, on admettait que la réactivité des sérums, à l'égard de différents types d'antigènes, était basée rigoureusement sur les principes immunologiques de la réaction antigène-anticorps La preuve directe ou indirecte d'autres facteurs fournit la possibilité d'améliorer les mécanismes de spécificité en éliminant cette activité indésirable La présence de réactifs non spécifiques, même à des taux faibles (c'est-adire pour des concentrations élevées en sérum ou à de faibles dilutions sérologiques, par exemple: 1/2; 1/4 ou 1/8), est

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une source de sérieux problèmes en ce qui concerne la différenciation sérologique, notamment quand les taux (ou titres) spécifiques sont faibles ou lorsque le but est d'augmenter la sensibilité de tout le système Dans de tels cas, la détection de ce qu'on appelle les "bruits de fond", provoqués par la présence de réactifs non spécifiques, est également augmentée Afin d'améliorer la qualité de toute technique sérologique, il est indispensable de faire une discrimination, autant

que possible, entre les résultats correspondant à la population stimu-

lée et ceux correspondant à la population non stimulée A cet égard, l'élimination des réactifs non spécifiques d'une variété quelconque

représente une réelle avance en sérologie.

Afin d'être sûr que les réactifs non spécifiques susmention-

nés possédaient, entre autres choses, une forte capacité d'aggrégation

ou d'agglutination à l'égard de cellules animales ou végétales ou en-

/des fractions core/de ces cellules, le Demandeur a assimilé au départ ce comportement à celui de lectines et a poursuivi ses travaux en se référant à des

substances analogues à la lectine.

On sait que l'on peut extraire des fruits des plantes légu-

mineuses, ou d'autres graines, des substances connues sous le nom de

lectines qui ont la capacité de se combiner spontanément avec des carbo-

hydrates de structure plus complexe, présents dans des microorganismes et dans des cellules animales ou végétales, partout dans le nature Du fait qu'actuellement la signification précise de ces substances n'a pas été clarifiée, il est probable que -parmi d'autres fonctions elles agissent comme colles ou ciments entre les cellules mais leur isolement et leur emploi en biologie sont maintenant de plus en plus fréquents

pour la sélection de différents microorganismes, de cellules-ou d'anti-

gènes.

En fait, la plupart des cellules possèdent dans leurs mem-

branes interne et externe une composition riche en glucides sous la

forme de polysaccharides, glycoprotéines, glycérophosphatides ou phos-

pholipides complexes Lorsque des cellules microbiennes, ou des frac-

tions de celles-ci, ou encore des cellules animales telles que des globules rouges sanguins, porteurs d'antigènes fixés à leur surface,

sont utilisées comme matériau antigène, par exemple lors d'une aggluti-

nation, la présence de facteurs d'agglutination non spécifiques qui

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réagissent avec des sucres ou des phospholipides est clairement établie.

L'hypothèse de la présence de substances de type lectine dans les hu-

mains n'est pas rapportée En réalité, on a fourni, il y a quelque temps,

la preuve qu'une glycoprotéine dénommée "laminine" et agissant apparem-

ment comme colle cellulaire dans les membranes fondamentales de l'endothélium, possède une puissante action non spécifique sur les globules rouges sanguins des béliers fixés par des aldéhydes Il faut souligner que ce type de globule rouge constitue un support universellement connu

pour les antigènes d'hémagglutination et que l'on peut déceler pratique-

ment à coup sûr de la laminine dans la circulation, hors le fait que

cette dernière se trouve présente en grandes proportions dans les tissus.

La réactivité avec des membranes par l'intermédiaire de

composants glycérophosphatidiques est bien connue pour un facteur réac-

tif différent non immunologique tel que la protéine C réactive L'étude de la capacité d'accouplement de cette protéine avec des substances

contenant de la choline distale a abouti à la conclusion que cette capa-

cité peut être inhibée par ce type particulier de motécule, en particu-

lier la phosphatidyl-choline La nouveauté essentielle de la découverte à la base de la présente invention réside dans la constatation que les réactivités sérologiques non spécifiques capables de donner des résultats faux ou réactifs notamment dans les tests d'agglutination de cellules ou des fonctions de celles-ci, peuvent lêtre éliminées dans une large

mesure en introduisant dans les réactions des substances qui, par inhi-

bition, compétition, absorption, neutralisation ou blocage, empêchent l'effet d'aggrégation des réactifs non spécifiques du type "genre lectine' ou protéine C réactive Parmi ces substances on doit signaler des sucres, notamment des sucres aminés, des glycérophosphatides ou phospholipides, des esters de choline, des sels de choline et des sphingomyélines Elles

agissent sur les mécanismes de couplage non spécifique avec les compo-

sants des membranes, au cours du processus de vérification sérologique des anticorps spécifiques face aux antigènes qui forment une partie des

cellules ou qui sont fixés sur ces dernières.

Les facteurs non spécifiques auxquels on se réfère ici sont en général non résistant au mercapto-2 éthanol, à l'exception de la protéine C réactive, mais aussi thermiquement résistant à la température d'inactivation des fractions agglutinantes complémentaires, soit à 560 C pendant 30 minutes Il est ainsi possible de constater que l'effet de

suppression du pouvoir agglutinant non spécifique continue, à l'éviden-

ce, après exposition des sérums au test de chauffage susvisé.

En pratique, la présence de facteurs non spécifiques du type ci-dessus est mise en évidence et neutralisée par la méthodologie dite d'inhibition Cette dernière consiste à utiliser des réactifs formés par deux composants à action indépendante qui, l'un après l'autre ou

simultanément, sont mis en contact avec le sérum ou l'humeur à étudier.

Dans un tel procédé, par suite des phénomènes de séquence,

diffusion ou taux de combinaison, le premier composant à venir en con-

tact avec le sérum est le sucre ou le mélange de sucres et d'autres substances simples qui, bien que n'ayant pas d'activité antigénique,

jouent le rôle d'agents neutralisants pour les substances de type lec-

tine et/ou les agglutinants non spécifiques Le sérum neutralisé réagit avec l'antigène en cause, que celui-ci forme une partie des cellules,

des fonctions de cellules ou qu'il soit fixé sur ces dernières La neu-

tralisation des substances de type lectine et/ou des agglutinants non

spécifiques est assurée par la quantification de "l'inhibition" c'est-à-

dire la quantité de titres obtenus avec des sérums de personnes nor-

males lorsque le neutraliseur est présent dans la réaction Simultané-

ment, cet effet ne doit pas être constaté ou doit être minimal dans le

sérum de personnes contenant des anticorps spécifiques opposés à l'anti-

gène en cause, en particulier si le sérum est désactivé à 560 C pendant

minutes.

On a introduit, il y a quelques années, un mode différent de

recherche sérologique pour la détection des antigènes de circulation.

Selon cette méthode, pour détecter une infection, on recherche la pré-

sence, dans l'hôte, de fractions ou composants du microorganisme Lorsque

cela est confirmé, les probabilités d'obtention d'un diagnostic spécifi-

que correct sont bien meilleures que lorsqu'un anticorps se trouve pré-

sent La détection des antigènes est également entreprise dans des sé-

rums ou des humeurs L'instrument de diagnostic est constitué, dans ce

cas, contrairement à celui décrit au début de la présente description,

par un anticorps spécifique Malgré cela, les substances du genre lectine continuent à interférer avec le diagnostic du fait de leur aptitude à réagir avec l'anticorps spécifique ou avec son support, comme dans le cas de toute autre molécule de type antigène Il ne faut pas oublier que

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les anticorps contiennent aussi des sucres et que, couramment, les sup-

ports cellulaires préférés pour les anticorps sont des bactéries telles que le staphylocoque, riche en protéine A ou les globules rouges sanguins

fixés par des aldéhydes.

Description des réactifs et exemples de réalisation

On décrira maintenant ci-dessous en détail différents réac-

tifs utilisables, à titre non limitatif, selon l'invention.

Exemple I

Cet exemple a trait à la suppression des réactivités non spécifiques dans la détection des anticorps pour le Trypanosoma Cruzi dans des sérums de personnes normales, ceci en utilisant un additif

antigène pour la phosphorylcholine et la solution de galactose.

Préparation du réactif On a collecté 3 g d'épimastigots provenant d'une culture de croissance de quatre jours de T Cruzi Les parasites ont été lavés plusieurs fois par une solution saline tamponnée à p H 7,8 Après cinq lavages, on a mis en suspension les protozoaires au taux de I pour mille dans de l'eau distillée puis abandonné cette suspension pendant

une heure Après avoir ainsi produit une lyse cellulaire, on a centri-

fugé la préparation à 10 000 tours/minute pendant 10 minutes puis on a

rendu isotonique la fraction surnageante par une solution saline tampon-

née, concentrée cinq fois, a p H 6,4 On obtient ainsi la solution anti-

gène qui sera finalement fixée aux corpuscules (ou globules) formolés.

Globules fixés On a lavé plusieurs fois, avec une solution saline tamponnée à p H 7,8, une suspension de globules rouges sanguins de bélier jusqu'a ce que toutes les traces d'hémolyse aient disparues On a ensuite remis en suspension, dans la même solution à 10 %, la masse de globules rouges

en la mélangeant avec un volume égal de solution saline à 10 % de formol.

On a laissé incuber le mélange pendant une heure à 37 C. Les cellules fixées par cette méthode ont été lavées puis remises en suspension dans la solution saline tamponnée, à pi 7,8, avec

% de formol.

Après nouvelle incubation durant une heure à 37 C, les cel-

lules ont été lavées plusieurs fois jusqu'à ce que toutes les traces de formol aient été éliminées Dans de telles conditions, les globules ont été incubés: à concentration de 10 % avec une concentration convenable

d'acide tannique d'environ 1/10000 (variable selon chaque lot de globu-

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les) puis on a laissé le mélange à 370 C pendant trente minutes Après ce traitement, on a lavé trois fois les globules rouges sanguins avec un tampon de phosphates à p H 7,8 Finalement, es cellules ainsi remises en suspension dans un tampon phosphate à p H 6,4, ont été mélangées avec un volume égal d'antigène, préparé comme expliqué ci-dessus Le mélan- ge a été maintenu en incubation durant une heure L'antigène non encore fixé a été lavé trois fois avec une solution tamponnée à 7,8 On a ainsi obtenu la suspension cellulaire sensibilisée qui sera utilisée ultérieurement dans les tests après un processus de polymérisation

avec de l'aldéhyde glutarique à 2 % pendant une demi-heure.

On a ajouté à ce réactif une préparation contenant 2 % de galactose et 3 % de phosphorylcholine Selon une variante, on peut mettre en oeuvre les mêmes inhibiteurs dans des solutions diluées de

sérum, sans modifier sensiblement les résultats.

On va maintenant décrire les résultats obtenus dans des

sérums de personnes en bonne santé et de personnes comportant l'infec-

tion On a éliminé les réactivités non spécifiques dans la détection des anticorps par le T Cruzi dans des sérums de personnes normales On

a utilisé un antigène d'hémagglutination auquel on a ajouté du galacto-

se et de la phosphorylcholine.

Comme on peut le voir dans le tableau I annexé, les sérums

négatifs présentent des réactivités à différentes intensités en rela-

tion avec les antigènes d'hémagglutination En fait, de telles réacti-

vités, mises en évidence comme-un pouvoir d'agglutination non spécifi-

que, n'existent pas dans les sérums de personnes sans Chagas; leur présence est une indication d'anticorps non spécifiques de substances

du genre lectine Lorsqu'on reproduit les essais avec des sérums neutra-

lisés par du galactose et de la phosphoryl-choline, cette réactivité non spécifique disparaît en grande partie Quand on entreprend le même

type d'étude sur des personnes réellement infectées, les taux d'agglu-

tination ne sont pas modifiés, précisément parce qu'ils constituent le

produit de l'action de véritables anticorps.

Exemple 2

On a utilisé une méthode d'approche similaire pour la dé-

tection des anticorps dans l'hépatite B. Préparation du réactif On a préparé une suspension de globules rouges selon la

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même méthode qu'à l'exemple I puis on a fait adhérer les anticorps puri-

fiés à la surface antigène de l'hépatite B (HBM).

Les anticorps purs ont été obtenus par chromatographie d'af-

finité A cet effet, on a préparé une colonne de cefarose activée dans laquelle la protéine correspondant à l'antigène K Bs était fixée en covalence.

On a fait couler dans le colonne un sérum de cheval hyper-

immunisé par le même virus Puis on a lavé plusieurs fois la colonne

avec des phosphates tamponnés à p H 7,8 pour éliminer toute trace de pro-

téines n'ayant pas été fixées Ensuite, on a fait couler dans la colonne une solution tampon à p H 3 d'acide chlorhydrique et de glycine On a pu ainsi briser la liaison antigène-anticorps et recueillir de l'anticorps

pur, rapidement stabilisé à p H alcalin.

On a préparé un mélange ayant une concentration de 2 mg/ml

d'anticorps et de globules rouges, prélablement traité par de la glutu-

raldéhyde à 2,5 %, puis on a laissé incuber au réfrigérateur (à 40 cç

pendant 24 heures L'excès non fixé a été lavé plusieurs fois, le reli-

quat étant constitué par la suspension de cellules qui sera utilisée comme réactifen l'additionnant à des substances de type lectine jouant le rôle d'inhibiteurs Dans ce cas, les inhibiteurs étaient constitués

par de la lécithine à I % et de la glycosamine à 4 % et, comme précédem-

ment on peut les trouver par substitution dans la solution de dilution

de l'échantillon.

Les tests ont été effectués avec ces réactifs et les ré-

sultats sont résumés dans le tableau Il ci-après Comme on peut le constater, les sérums des personnes en bonne santé avaient des taux

d'activité agglutinante non spécifique de valeur similaire à quelques-

unes des réactivités spécifiques inhérentes aux supports L'utilisation de réactifs pour neutraliser les substances de type lectine clarifie la situation en inhibant la réactivité des personnes en bonne santé sans

affecter pour autant celle des supports.

Exemple 3

De façon analogue, l'invention est mise en oeuvre pour l'é-

limination des réactivités non spécifiques chez les personnes en bonne santé et dans des charges ou supports de Toxoplasma, ceci en utilisant

la réaction d'agglutination des anticorps à l'égard des fractions des-

dits parasites.

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Préparation de l'antigène d'agglutination rapide pour toxoplasmose Des trofozoits de Toxoplasma-gondii ont été extraits du péritoine de souris trois jours après inoculation dans une tumeur de type ascite Ehrlich On a laissé se fixer les parasites puis on a lave * 5 plusieurs fois avec un tampon phosphate à p H 7,8 pour obtenir finalement une masse humide qui a été remise en suspension dans de l'eau distillée au taux de 2 g par 100 ml d'eau ajoutée Ce mélange a été conservé en

réfrigérateur pendant 48 heures puis on a centrifugé à 3000 tours/minu-

tes On a ensuite éliminé les dépôts et l'on a mélangé la fraction sur-

nageante avec 2 % de microsphères de nitrate de cellulose ayant un diamètre d'environ 20 microns On a laissé incuber toute la masse durant

12 heures à 40 C puis lavé plusieurs fois à l'eau avec un tampon phos-

phate à pl 7,8 La suspension de particules sensibilisés;telle qu'obte-

nue,était précisément l'antigène d'agglutination rapide de toxophasma.

Elle a été utilisée dans des tests d'agglutination par sédimentation et l'on a pu lire les résultats en dix minutes Pour l'usage, l'antigène a

été complété par addition de I % de N-acétyl-galactosamine et I % d'al-

phaphosphatidyl-choline; en variante, on peut trouver les mêmes inhi-

biteurs dans -la solution de dilution échantillon.

Les résultats des taux ou titres sérologiques obtenus à

partir des personnes en bonne santé ainsi que des supports de toxoplas-

mose, avec ou sans l'aide d'inhibiteurs, sont résumés dans le tableau

III annexé à la présente description.

On peut voir dans ce cas, comme pour les exemples précédents, que l'effet des substances jouant le rôle de simples inhibiteurs est

bien mis en évidence du fait de l'élimination des réactivités non spéci-

fiques indésirables.

Exemple 4,

La présente invention a été décrite dans le but d'obtenir des

réactifs sérologiques ayant une spécificité et sensibilité élevées, ba-

sées sur les phénomènes de neutralisation, absorption, blocage ou inhi-

bition de facteurs d'agglutination non spécifiques avec des substances

simples non antigéniques Selon un facteur caractéristique, quelques-

unes de ces substances simples sont capables de réagir plus facilement avec les facteurs d'agglutination non spécifique que les antigènes ou

anticorps eux-mêmes, du fait de leur affinité ou d'une vitesse de dif-

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fusion plus élevée.

On notera que la liste des substances énumérées dans les exemples cidessus n'est pas limitative et peut être étendue à d'autres facteurs agglutinants non spécifiques et à des éléments simples capables de les débloquer. Toutefois, indépendamment des considérations qui précèdent,

quelques structures moléculaires, du fait de leur similarité de configu-

ration avec les substances susmentionnées, possèdent, par simple déduc-

tion, la possibilité théorique d'une activité inhibitrice identique à celle de ces substances En fait, tel est le cas des sels de choline et d'autres sels d'ammonium quaternaire, dans lesquels la substitution d'un

radical n'affecte pas nécessairement la fonction des facteurs d'aggluti-

nation non spécifique du type protéine C-réactive, ou tout autre agglu-

tinant similaire capable d'interaction avec des molécules de choline.

Avec les produits susvisés on a entrepris des essais similai-

res à ceux des exemples précédents en utilisant des sels d'ammonium tels que par exemple: le bromure de diéthylméthylpropylammonium, le

chlorure de glycidyltriméthylammonium, le chlorure d'hexadécyltriméthy-

lammonium et quelques-uns des détergents cationiques basés sur des sels

d'ammonium quaternaire.

On a utilisé un antigène d'hémagglutination pour Chagas, formé par une suspension de globules rouges sanguins de béliers fixés par des aldéhydes et sensibilisés par des extraits de d'épimastigots de T Cruzi auxquels on avait ajouté 1 Z glucosamine et 3 Z de chlorure

de glycidyltriméthylammonium.

On a testé des sérums normaux avec ou sans inhibiteurs et

l'on a entrepris la même étude avec des sérums chroniques.

* Les résultats obtenus sont illustrés dans le tableau IV

annexé Comme cela ressort de ce tableau, par mise en-oeuvre de subs-

tances simples telles que ci-dessus, on obtient également un effet in-

hibiteur sur les facteurs agglutinants non spécifiques présents dans les sérums normaux, sans toutefois affecter les facteurs provoqués par l'agglutination spécifique dans les sérums des patients qui souffrent

d'une infection chronique Ces essais indiquent que l'effet d'inhibi- tion des sels de choline est supérieur à celui des autres sels d'ammo-

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nium quaternaire qui ont été testés Ceci est probablement du au fait

que ces derniers ne peuvent pas utilisés à des concentrations similai-

res à celles des sels de choline car ils se montent plus aptes que la choline à provoquer le phénomène d'auto-agglutination-des globules rouges sanguins.

TABLEAUX DES RESULTATS D'ESSAIS

Légende: A signifie sérums de personnes en bonne santé B signifie sérums porteurs de l'infection S.In signifie sans inhibiteur A.In signifie avec inhibiteur

TABLEAU I

TITRES

2 4 8 16 32

54 128 256 512

S.In 24 42 50 48 39 26 19 15 12

A 269

A.In 183 82 4 S.In 3 14 8 23 7 3

B 58

B 58 A In 3 14 10 22 6 3

TABLEAU II

Nbre TITRES Sérums 2 4 8 16 32 64 128 256 512 A 182 A In 138 41 3 S.In 16 20 45 48 39 14 B 47 A In 16 18 13 S.In 16 18 13

TABLEAU III

TITRES

Nbre Sérums 2 4 8 16 32 64 I 20 256 512 1024 2048 4096 S In 17 30 32 28 53 ' 26 12 8 2

A 214

A.In 82 68 53 10 I S In 8 27 28 37 6 4 4

B 114

A.In 8 28 32 32 6 4 4

TABLEAU IV

TITRES

Sérums 2 4 8 16 32 64 128 256 512 S.In 24 42 50 48 39 26 19 15 12 Normal A.Inf 80 64 60 42 21 2 S.In 3 14 8 23 7 3 Chronique 3 1 1 22 6 A.1 ronique À In 3 14 10 22 6 3 6,_ 4

2543300-

r Nbre Sérums I O

Claims (2)

R E V E N D I C A T I 0 N S

1 Réactif sérologique pour détermination des antigènes et anticorps avec une sensibilité et une spécificité accrues, caractérisé en ce qu'il est basé par l'action interdépendante, en une seule unité de diagnostic, de deux composants -qui, agissant simultanément ou l'un après l'autre, provoquent l'effet combiné d'inhibition de facteurs

"type lectine" ou "d'anticorps non spécifiques" et de détection d'anti-

corps ou antigènes spécifiques; le premier effet étant obtenu grâce à un premier composant constitué de substances simples sans activité antigénique alors que le second effet est acquis grâce à un deuxième

composant formé de l'antigène ou anticorps spécifique qui est recherché.

2 Réactif sérologique selon la revendication I caractérisé en ce que les substances dudit premier composant,utilisées sous forme de solutions diluées sont choisies dans le groupe constitué par: des hydrates de carbone, des sucres, des sucres aminés, des lipides, des

glycérophosphates, des esters et éthers de choline, des sphingomyéli-

nes, des sels de choline et autres dérivés d'ammoniums quaternaire; et en ce que les antigènes ou anticorps forment une partie de cellules ou fractions de cellules animales ou végétales ou sont fixés sur ces

dernières.