ES2963821T3 - Procedimiento y kit de prueba para la determinación cuantitativa de biomarcadores en muestras fecales - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a un método que comprende los siguientes pasos: (a) recolectar una muestra de heces con el analito y transferir una cantidad definida de muestra de heces a un recipiente preparado con un filtro de tamiz y una cantidad predeterminada de solución de extracción; (b) suspender y extraer la muestra de heces en la solución de extracción, de manera que el analito se disuelva; (c) filtrar la solución de extracción a través del filtro de tamiz y transferir una cantidad definida de solución de extracción a una tela no tejida de celulosa con una absorbencia predeterminada; (d) secar rápidamente la solución de extracción sobre la tela no tejida de celulosa a temperatura ambiente mediante la acción capilar de la tela no tejida, en donde la tela no tejida junto con la solución de extracción de muestra representa un modo de almacenamiento y transporte que es estable durante días y semanas, y en el que el analito y las enzimas digestivas se proporcionan de manera físicamente separadas entre sí; (e) recibir y extraer el analito de la tela no tejida en una cantidad predefinida de tampón de análisis; (f) retirar la tela no tejida del tampón de análisis con el analito; y (g) determinar cuantitativa o cualitativamente el analito en el tampón de análisis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Método y kit de prueba para la determinación cuantitativa de biomarcadores en muestras fecales
Campo técnico
La invención se refiere a métodos para la determinación cuantitativa de biomarcadores en muestras fecales, así como a un conjunto de determinación para ello.
Antecedentes de la solicitud
El examen clínico de las secreciones intestinales es impopular. Por una parte, el médico no puede tomar inmediatamente una muestra, sino que, en primer lugar, tiene que esperar a que se produzca una deposición de la persona. Los excrementos, las deposiciones o las heces médicas son antihigiénicos, malolientes y desagradables. Por lo tanto, al paciente se le entrega un dispositivo para que él, por sí mismo, pueda transferir parte de sus heces a un recipiente de examen, una etapa, por lo general, no controlada. Para determinaciones cuantitativas, además, se tiene que pesar la muestra fecal o determinar su volumen. Sin embargo, esto no es homogéneo, sino que la matriz, la consistencia y la composición dependen del alimento y del estado de salud. Las proteínas diana de diagnóstico, además, no son estables. Las bacterias intestinales y las enzimas digestivas son activas en el intestino y permanecen así incluso después de su secreción. No solo atacan a las proteínas diana, sino que también alteran la determinación enzimática o inmunológica.
Por lo tanto, en la mayoría de los casos, las muestras fecales se congelan hasta su examen. La congelación y descongelación de heces están asociadas con tiempos de espera durante los que continúa la degradación y descomposición. También existen tampones estabilizadores para pequeñas cantidades. El inconveniente es que es difícil inhibir los procesos de digestión y que la estabilización en los tampones tiene que ser buena durante al menos de cinco a siete días a temperatura ambiente, puesto que es el tiempo que transcurre entre la toma de muestra y el examen en el laboratorio. Para el preanálisis de muestras de heces, se aplica la regla general de que el analito en el tampón de estabilización tiene que sobrevivir sin refrigerar durante de 5 a 7 días, incluidos fines de semana, días festivos y métodos de transporte más largos, teniéndose que tener en cuenta las estaciones cálidas y las condiciones extremas de transporte.
Finalmente, el analito se tiene que extraer de la matriz de heces y llevarse a solución. Si para la extracción se usa un tampón caotrópico, las sales caotrópicas se deben retirar antes de una determinación inmunológica, de modo que el analito diana proteico se pueda renaturalizar de nuevo. En la mayoría de los casos, la sangre oculta o la hemoglobina se degradan en sistemas tampón convencionales a una velocidad de un 6 a un 7 por ciento al día (Grazziniet al,Influence of seasonal variations in ambient temperatures on performance of immunochemical faecal occult blood test for colorectal cancer screening: observational study from the Florence district, Gut (2010), 59(11): 1511-5; Van Room et al, Are fecal immunochemical test characteristics influenced by sample retum time? A population-based colorectal cancer screening trial. The American J. of Gastroenterology (2012) 107:99-107).
Las muestras de heces secas también se conservan y almacenan en soportes de papel particulares (Whatman FTA® bzw. FTA® Card) (Nechvatal JMet al.in Fecal collection, ambient preservation, and DNA extraction for PCR amplification of bacterial and human markers from human faeces, J Microbiol Methods. (2008) 72(2):124-32; Chu DM, et al., Detection of Cyclospora cayetanensis in animal fecal isolates from Nepal using an FTA filter-base polymerase chain reaction method. Am J Trop Med Hyg. (2004) 71(4):373-9; Subrungniang I, et al., Evaluation of DNA extraction and PCR methods for detection of Enterocytozoon bienuesi in stool specimens J Clin Microbiol. (2004) 42(8):3490-4). El documento WO2016014822 (GE Healthcare) divulga soportes de un material de fibra como celulosa, fibra de vidrio o microfibras. También se usan membranas porosas de poliéster, polietersulfona (PES), poliamida (nailon), polipropileno, politetrafluoroetileno (PTFE), policarbonatos, nitrato de celulosa, acetato de celulosa o alginato. En ocasiones, la muestra fecal también se trata con sustancias caotrópicas y desnaturalizantes durante el secado en el soporte; véase el documento EP1 109899 (Whatman PLC). Sin embargo, el analito en muestras de heces secas, con frecuencia, es un ácido nucleico, que se analiza, por ejemplo, con una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las proteínas rehúyen la determinación cuantitativa, puesto que se desnaturalizan entretanto y se unen al soporte a través de interacciones hidrófobas "indisolubles". Un análisis cuantitativo diferenciador ya no es posible con medios sencillos, si es que lo es.
Los documentos JP2003 014768 A, JP2003 194825 A, JP 6 077763 B2 enseñan tampones y métodos para la estabilización de la hemoglobina en solución para la detección de sangre oculta en las heces. Edwardset al.divulgan, en el artículoImproving fecal blood testing,Gastroenterology/1998), 114(1):227, que la hemoglobina en las heces sería estable sobre el papel después de la deshidratación, pero la determinación cuantitativa es problemática para los usuarios.
Por tanto, existe la necesidad de obtener un método preanalítico con el que se pueda preparar y conservar una muestra fecal para el análisis químico de proteínas. El estado de la técnica representa el problema.
Breve descripción de la invención
Esta solicitud divulga un método de acuerdo con la reivindicación 1 y kits de prueba y conjuntos de reactivos adecuados para el método de acuerdo con la reivindicación 10. Se pueden obtener modos de realización y aspectos preferentes de la invención en las reivindicaciones dependientes de 2 a 9 y 11-12, así como en los ejemplos.
El método para la preparación preanalítica de muestras fecales (heces, excrementos, desechos o deposiciones) comprende las etapas: (a) obtener y transferir una cantidad conocida de matriz de muestra a un recipiente con una cantidad conocida de solución acuosa de extracción de proteínas; (b) extraer el analito proteico de la matriz de la muestra; (c) aplicar un volumen conocido de extracto acuoso a un material soporte con propiedades de fluencia capilares y cromatográficas, de modo que el extracto acuoso con las proteínas diana se propague sobre el material soporte; (d) secar el material soporte, representando el soporte con el extracto seco una forma de conservación y de transporte de la muestra fecal. Para la posterior determinación cuantitativa de analitos proteicos o que contienen aminoácidos en las heces: (e) eluir el analito del material soporte en una cantidad conocida de tampón de examen; (f) separar el material soporte del tampón de examen; y (g) determinar cuantitativamente el analito proteico mediante una reacción enzimática o inmunológica. La solución acuosa de extracción de muestra mencionada anteriormente contiene, en exceso molar con respecto a las proteínas y aminoácidos, preferentemente de 1 a 50 mM/l de un ácido cetocarboxílico de 1 a 12 átomos de carbono, que, al secarse con aminoácidos y proteínas en el extracto, forma sales hidratadas solubles en agua, así como sales tampón para un pH entre 3 y 10, y opcionalmente detergentes, agentes solubilizantes, agentes complejantes, agentes rédox, biocidas, adyuvantes, así como sales para el ajuste de la fuerza iónica.
Los ácidos cetocarboxílicos se pueden seleccionar del grupo con ácidos a-cetomonocarboxílicos, ácidos acetodicarboxílicos, ácidos p-cetocarboxílicos, ácidos p-cetodicarboxílicos, ácido a-cetopropiónico (ácido pirúvico), ácido acetoacético, ácido cetomalónico (ácido mesoxálico), ácido oxaloacético, ácido oxalosuccínico, ácido acetoglutárico, isocitrato, ácido oxohexanoico (ácido cetocaproico), ácido oxoheptanoico (ácido cetoenántico), ácidos Y-cetocarboxílicos, ácido levulínico, ácido fenilpirúvico, cetoderivados y ésteres del ácido tereftálico, así como monoo diésteres de los ácidos cetocarboxílicos mencionados anteriormente con un alcohol lineal o ramificado de 1 a 6 átomos de carbono, ácido glioxílico, éster etílico del ácido glioxílico, éster etílico del ácido pirúvico.
El tampón de extracción puede contener: de un 0,001 a un 5,0 % en peso con respecto al peso total, preferentemente de un 0,005 a un 0,5 % en peso, de azúcar y/o aminoazúcar, preferentemente un mono-, di- o trisacárido conservante, preferentemente sacarosa, lactosa, maltosa o trehalosa. El aminoazúcar puede ser: glucosamina, N-metilglucosamina, galactosamina o ácido neuramínico. No están excluidos los azúcares como sacarosa o dextrosa. Es preferente, en particular, la trehalosa debido a su bajo punto de transición vítrea y sus propiedades como "sustituto del agua" durante la estabilización de proteínas.
El tampón de extracción de muestra puede contener preferentemente uno o más adyuvantes seleccionados de colorante soluble en agua, indicador de pH, indicador rédox, indicador de descomposición, azul de metileno, verde de malaquita, aromas, citronelal, geraniol. El tampón de extracción puede contener, además, un eluyente seleccionado de policarboxilato, éter de policarboxilato, sulfonato de naftaleno, sulfonato de melamina y sulfonato de lignina.
Se aplica una cantidad conocida de extracto de muestra a un soporte, es decir, un tejido con buenas propiedades capilares y de propagación, de modo que el extracto de muestra se seque rápidamente sobre el tejido en condiciones ambientales. Un tejido ventajoso para el secado conservante del extracto de muestra es, en particular, una estructura de fibras que se unen para formar un material no tejido o un soporte en el que se soportan las fibras. Preferentemente, el tejido está unido a una superficie más grande de material absorbente a través de dos o más elementos de unión o bridas. Esto define la cantidad de extracto de muestra absorbido. La cantidad de extracto de muestra seco resulta, entonces, de la superficie de secado del tejido. Esta se encuentra preferentemente entre 0,3 y 3,0 centímetros cuadrados, preferentemente entre 0,5 y 2,0 cm2, más preferentemente aproximadamente de 0,78 cm2 (superficie circular con un diámetro de 1,0 cm).
La muestra fecal se extrae de acuerdo con la invención, dependiendo del analito, con 10 a 5000 partes de tampón de extracción de muestra. Es, en particular, favorable el uso de 50 a 250 partes de tampón de extracción para también estandarizar las propiedades de fluencia sobre el tejido. Dado que la matriz de la muestra fecal puede contener fibras no digeribles y otros componentes sólidos no digeridos, el extracto todavía se puede filtrar antes de la aplicación, por ejemplo, a mediante un filtro de tamiz, o los componentes sólidos también se pueden separar por centrifugación. El filtro de tamiz se puede disponer en la punta del sistema de obtención de muestras.
Otro aspecto de la divulgación se refiere a un kit de prueba que comprende un sistema de obtención de heces para la obtención de una cantidad conocida de muestra fecal en un tampón de extracción de muestra, como se describe anteriormente, así como un tejido con propiedades capilares, como se describe anteriormente, para la obtención, para el secado y para el transporte de extracto de muestra seco. El material de fibra y superficie, así como el tampón de extracción de muestra, están diseñados preferentemente para la determinación de los siguientes parámetros de deposiciones o heces: Albúmina, slgA antigliadina, a1-antitripsina, calprotectina, 13-defensina (HBD-1, -2, -3, - 5, -6), dopamina, slgA anti transglutaminasa tisular humana, EDN (neurotoxina derivada de eosinófilos), ácidos biliares, hemoglobina, complejo hemoglobina/haptoglobina, histamina, antígeno deH. pylori,ferritina, lisozima, lactoferrina, mieloperoxidasa, elastasa pancreática, amilasa pancreática, prealbúmina/transtiretina, serotonina, zonulina.
La invención y sus ventajas se describirán ahora con más detalle con ejemplos y modos de realización con respecto a las figuras. Estos sirven para la representación y descripción. Sin embargo, la divulgación no está limitada a esto, sino que el alcance reivindicado resulta de las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de las figuras
Muestran:
la fig. 1un diagrama de la nube de puntos y el resultado de la comparación entre métodos entre la determinación directa a partir del extracto líquido y la determinación después de disolver una mancha fecal seca (DFS);
la fig. 2una representación gráfica del sistema de obtención de heces para transferir una cantidad definida de heces (15 mg) a un tampón de extracción (1,5 ml) de acuerdo con la invención;
la fig. 3una sección fotográfica del tejido, estando la superficie de secado limitada mediante perforaciones y unida de forma fluida a un material no tejido de fibras más grande a través de bridas; la superficie de secado se puede separar para su análisis.
Descripción detallada de la invención
El preanálisis divulgado aquí para el examen cuantitativo de muestras fecales comprende obtener y transferir una cantidad definida de muestra a un recipiente con agente de extracción, una disolución o extracción del analito que se va a cuantificar de la matriz de muestra, por ejemplo, dispersando la muestra en el tampón de extracción; una separación del extracto con el analito de las partes sólidas de la matriz de examen, por ejemplo, haciendo pasar el extracto a través de un filtro de tamiz, sedimentación o centrifugación; una aplicación de una cantidad conocida de extracto a una superficie predeterminada con propiedades capilares y propiedades cromatográficas, de modo que el extracto de muestra se propague sobre la superficie y se pueda secar en condiciones ambientales habituales. Esto se puede realizar aplicando una cantidad conocida de gotas a la superficie de secado. Secar el extracto de muestra en la superficie en condiciones ambientales, después de lo que el soporte con el extracto de muestra seco representa una forma de almacenamiento y de transporte estable. La superficie de secado está preferentemente perforada en una superficie más grande y unida a ella a través de una o varias bridas o elementos de retención. Así, el exceso de líquido puede fluir hacia la superficie circundante o ser succionado por ella. Entonces, la superficie de secado predeterminada se puede separar del entorno para su análisis. Esto estandariza la cantidad de líquido de muestra aplicado. También resulta de la viscosidad y fluidez del tampón de extracción sobre la superficie de secado. La viscosidad y fluidez del extracto se pueden ajustar a través de la concentración de azúcar en el tampón de extracción. La superficie de secado con el material soporte se adhiere preferentemente a una carta o sobre. Este puede estar preetiquetado o preparado para el etiquetado. Después de aplicar y secar el tampón de extracción sobre la superficie de secado, se completa el preanálisis.
El preanálisis se caracteriza por que el agente de extracción contiene un ácido cetocarboxílico que forma sales coordinadas con aminoácidos y proteínas y puede reemplazar a los enlaces por puente de hidrógeno coordinados. Se descubrió que las proteínas y compuestos similares a aminoácido en presencia de ácidos cetocarboxílicos no se desnaturalizan ni siquiera después del secado sobre un soporte o una superficie de secado o se unen a la superficie a través de interacciones hidrófobas, sino que permanecen cuantitativamente solubles en un extracto de este tipo incluso después del secado.
Después de la preparación preanalítica de muestras fecales (heces, excrementos, desechos o deposiciones), el método divulgado también comprende las etapas para determinar cuantitativamente el analito, a saber, una elución del analito de la superficie de secado en una cantidad conocida de tampón de examen; una separación del material soporte del tampón de examen; y una determinación cuantitativa del analito mediante una reacción enzimática o inmunológica.
La solución acuosa de extracción para la muestra fecal contiene, en exceso molar, con respecto a las proteínas y analitos extraídos, preferentemente de 1 a 50 mM/l de ácido cetocarboxílico de 1 a 12 átomos de carbono, que forman sales hidratadas coordinadas solubles en agua con compuestos que contienen aminoácidos, así como sales tampón para un pH de entre 3 y 10. Opcionalmente están presentes detergentes, agentes solubilizantes, agentes complejantes, agentes rédox, biocidas, adyuvantes, así como sales para el ajuste de la fuerza iónica.
Los ácidos cetocarboxílicos se seleccionan preferentemente del grupo con ácidos a-cetomonocarboxílicos, ácidos acetodicarboxílicos, ácidos p-cetocarboxílicos, ácidos p-cetodicarboxílicos, ácido a-cetopropiónico (ácido pirúvico), ácido acetoacético, ácido cetomalónico (ácido mesoxálico), ácido oxaloacético, ácido oxalosuccínico, ácido acetoglutárico, isocitrato, ácido oxohexanoico (ácido cetocaproico), ácido oxoheptanoico (ácido cetoenántico), ácidos Y-cetocarboxílicos, ácido levulínico, ácido fenilpirúvico, cetoderivados y ésteres del ácido tereftálico, así como monoo diésteres de los ácidos cetocarboxílicos mencionados anteriormente con un alcohol lineal o ramificado de 1 a 6 átomos de carbono, ácido glioxílico, éster etílico del ácido glioxílico, éster etílico del ácido pirúvico.
Además, el tampón de extracción puede contener uno o más azúcares conservantes, que, al secarse el tampón, forman sales similares a hidrato con proteínas, que no cristalizan en el soporte a temperatura ambiente, sino que se vuelven similares a vidrio. El tampón de extracción puede contener mono-, di- o trisacáridos, como sacarosa, lactosa, maltosa o trehalosa y como el trisacárido rafinosa. Son preferentes sacarosa, lactosa, maltosa o, muy en particular, trehalosa. También pueden estar contenidos aminoazúcares, es decir, monosacáridos que poseen un grupo amino primario, secundario o terciario o un grupo amino acilado (-NH-CO-R) en lugar de un grupo hidroxi. Son preferentes glucosamina, N-metilglucosamina, galactosamina y ácido neuramínico. El azúcar/aminoazúcar está presente preferentemente en la preparación para el tampón de extracción en una cantidad tal que, después del secado y la reelución del portador en el volumen previsto de tampón de examen, esté presente en la solución en una concentración de aproximadamente 1 a 200 mg/ml. El azúcar está presente preferentemente en el tampón de examen en una concentración de 30 a 50 mg/ml. Por tanto, el tampón de extracción puede contener de un 0,001 a un 5,0 % en peso con respecto al peso total, preferentemente de un 0,005 a un 0,5 % en peso de azúcar y/o aminoazúcar. Es preferente, en particular, la trehalosa. Aunque la trehalosa es ligeramente higroscópica, posee un punto de gelificación y de transición vítrea comparativamente alto. La transición vítrea describe el intervalo de temperatura en el que una sustancia amorfa pasa de la región sólida similar a vidrio a la región viscoelástica, "similar a goma". Esta región desempeña un papel esencial en la encapsulación de sustancias en matrices que contienen carbohidratos amorfos, como fibras de celulosa. En la naturaleza, la trehalosa protege a las células de los daños provocados por los cristales de hielo durante las heladas y también durante la sequía. De alguna forma, la trehalosa es funcionalmente similar a la sacarosa, pero posee otras propiedades estabilizadoras y de punto vítreo. La trehalosa se encuentra de forma natural en plantas y hongos y en la hemolinfa de muchos insectos. La trehalosa es estable química y térmicamente frente a los ácidos y fácilmente soluble en agua, siendo la trehalosa menos soluble a bajas temperaturas y más soluble a temperaturas más altas que la sacarosa. A diferencia de los disacáridos, la trehalosa no es hidrolizable y no puede participar en una reacción de Maillard con aminoácidos o proteínas. También es favorable que también posea una alta fuerza adhesiva sobre muchos plásticos y celulosa, evitando así que el extracto de muestra seco se desmorone de la superficie de soporte durante el transporte.
El tampón de extracción puede contener uno o más adyuvantes seleccionados de colorante soluble en agua, indicador de pH, indicador rédox, indicador de descomposición, azul de metileno, verde de malaquita, aromas, citronelal, geraniol. El tampón de extracción puede contener, además, un eluyente seleccionado de policarboxilato, éter de policarboxilato, sulfonato de naftaleno, sulfonato de melamina y sulfonato de lignina.
La muestra fecal se extrae, dependiendo del analito, con 10 a 5000 partes de tampón de extracción de muestra. Es, en particular, favorable el uso de 50 a 250 partes de tampón de extracción para también estandarizar las propiedades de fluencia sobre el tejido. Dado que la matriz de la muestra fecal puede contener fibras no digeribles y otros componentes sólidos no digeridos, el extracto todavía se puede filtrar antes de la aplicación, por ejemplo, a mediante un filtro de tamiz, o los componentes sólidos también se pueden separar por centrifugación. El filtro de tamiz se puede disponer en la punta del sistema de obtención de muestras.
El tampón de extracción de muestra se aplica en una cantidad conocida a un soporte, es decir, un tejido con buenas propiedades capilares y de propagación, de modo que se seque rápidamente sobre el tejido en condiciones ambientales. Un tejido ventajoso para el secado conservante del extracto de muestra es, en particular, una estructura de fibras que se unen para formar un material no tejido o un soporte en el que se soportan las fibras. Preferentemente, el tejido está unido a una superficie más grande de material absorbente a través de dos o más elementos de unión o bridas. Esto define la cantidad de extracto de muestra absorbido. La cantidad de extracto de muestra seco resulta, entonces, de la superficie de secado del tejido. Esta se encuentra preferentemente entre 0,3 y 3,0 centímetros cuadrados, preferentemente entre 0,5 y 2,0 cm2, más preferentemente aproximadamente de 0,78 cm2 (superficie circular con un diámetro de 1,0 cm).
Un aspecto de la divulgación se refiere a un kit de prueba para el paciente o el sujeto complementario que comprende un sistema de obtención de heces para la obtención de una cantidad predeterminada de muestra fecal en una cantidad predeterminada de tampón de extracción de muestra, como se describe anteriormente, así como un tejido con propiedades capilares, como se describe anteriormente, para la obtención, para el secado y para el transporte de extracto de muestra seco. El sistema de obtención de heces está diseñado de modo que el sujeto, por sí mismo, pueda secar un número conocido de gotas definidas de extracto de muestra —correspondiente a, por ejemplo, 200 pl— sobre la superficie de secado previamente perforada. Las cantidades (superficie y material de fibra, así como extracto de muestra) están diseñadas preferentemente para la determinación de los siguientes parámetros de deposiciones o heces: albúmina, slgA antigliadina, a1-antitripsina, calprotectina, 13-defensina (HBD-1, -2, -3, -5, -6), dopamina, slgA anti transglutaminasa tisular humana, EDN (neurotoxina derivada de eosinófilos), ácidos biliares, hemoglobina, complejo hemoglobina/haptoglobina, histamina, antígeno deH. pylori,ferritina, lisozima, lactoferrina, mieloperoxidasa, elastasa pancreática, amilasa pancreática, prealbúmina/transtiretina, serotonina, zonulina.
La determinación cuantitativa del analito se realiza preferentemente después de la disolución del material soporte en el tampón de examen a través de una reacción inmunológica. El ensayo de unión se puede realizar, por ejemplo, en un ELISA (enzimoinmunoanálisis de adsorción), RIA (radioinmunoanálisis), FIA (inmunoanálisis por fluorescencia), LIA (inmunoanálisis por luminiscencia) o ILMA (ensayo inmunoluminométrico). Son preferentes, en particular, los sistemas de detección no radioactivo basados en marcadores de fluorescencia y quimioluminiscencia (FIA o LIA).
Para el preanálisis es sustancial la aplicación del extracto de muestra sobre una superficie de secado definida, es decir, un soporte con acción capilar. Además, es esencial que el analito o la proteína diana no se desnaturalice ni se una irreversiblemente a la superficie de secado, puesto que después de la conservación provisional sobre la superficie de secado, el analito tiene que volver cuantitativamente a la solución. Durante la extracción de la matriz de muestra, el analito se lleva a solución por primera vez, el extracto se separa de los componentes sólidos de la matriz mediante sedimentación, flotación, filtración o centrifugación, y, entonces, se aplica una cantidad de extracto a la matriz de la superficie de secado o al soporte, por ejemplo, en forma de un número predeterminado de gotas. Después de la aplicación sobre la superficie de secado con las propiedades capilares, la mezcla de proteínas del extracto se somete a una separación cromatográfica parcial, separándose también el analito de las enzimas digestivas. Las bacterias intestinales presentes en el extracto se inactivan en una capa de azúcar similar a vidrio. El analito, la proteína diana, termina seca y protegida como una sal soluble del ácido beta-cetocarboxílico sobre la superficie y en las cavidades del material soporte.
El método requiere el uso de un tejido con buenas propiedades capilares y de propagación. Este es el caso de un material no tejido, un tejido de fibras que se unen para formar un material no tejido o un soporte en el que se soportan las fibras. Las fibras direccionales o filamentos dispuestos tienen alta
acción capilar y permiten una propagación y secado de la solución de extracción de muestra en condiciones ambientales. Las fibras se pueden seleccionar de fibra de celulosa, fibra de vidrio, fibras de poliéster, polietersulfona (PES), poliamida (nailon), polipropileno, politetrafluoroetileno (PTFE), policarbonato, nitrato de celulosa o acetato de celulosa, así como mezclas de estas fibras. Debido a los diferentes procesos de solidificación, el material no tejido también puede ser similar a papeles, láminas o plásticos reforzados con fibras. Otros tejidos con buenas propiedades capilares y de propagación son las placas cromatográficas de capa fina, es decir, una película o placa con una capa fina de un material de separación estacionario, como tierra de diatomeas, por la que luego pasa la solución acuosa de extracción de muestra.
El tejido está diseñado ventajosamente para absorber y secar de 10 a 1000 pl de extracto de muestra acuoso, preferentemente de 50 a 500 pl. La superficie de secado se puede diseñar de modo que el exceso de solución de extracción se drene en dos o más puntos a través de elementos de unión, bridas o dientes. La superficie de secado puede ser parte de un tejido más grande y estar rodeada de ranuras y perforaciones de modo que se pueda separar de la superficie más grande. Son posibles muchos patrones y estructuras de perforación para limitar la superficie de secado. En un modo de realización, una o más superficies de secado del tamaño de una moneda (euro o dólar) o un sello postal se perforan en una superficie más grande con material no tejido. Varias superficies de secado definidas permiten varias determinaciones cuantitativas de los parámetros en las heces.
Entonces, se separa el soporte con el extracto de muestra seco de la superficie más grande antes del análisis o de la disolución de las proteínas en las heces. Esto puede limitar y estandarizar exactamente la cantidad de aplicación y la cantidad de extracto de muestra seco. El espesor del tejido absorbente está diseñado de modo que se puedan estar contenidos aproximadamente de 200 a 250 pl de extracto de muestra en el soporte del tamaño de una moneda o sello postal. El extracto de muestra seco sobre el soporte o material no tejido o material de fibra representa la forma de almacenamiento y de transporte estable durante varios días y semanas y que se puede enviar por correo al laboratorio clínico examinador sin grandes limitaciones logísticas. Si el soporte de secado está dispuesto en un sobre o en una funda, también se solucionan los problemas de higiene. El olor es, sobre todo, un problema en las condiciones de transporte y de estabilización de líquidos.
A continuación se describirán ejemplos del preanálisis y de la determinación. Sin embargo, la divulgación no está limitada a los ejemplos, sino que el alcance resulta de las reivindicaciones.
Ejemplos
Ejemplo 1: determinación cuantitativa de elastasa pancreática en las heces
Generalidades: La elastasa pancreática tiene un peso molecular de 26 kDa y es una serina proteasa. Se secreta junto con otras enzimas digestivas por las células acinares del páncreas como proenzimas y, entonces, se activa por escisión en el duodeno. Durante el tránsito intestinal se une a las sales biliares y, por tanto, queda protegido de la digestión. La concentración de elastasa pancreática en las heces es una medida de la capacidad secretora del páncreas. La determinación de concentración en las heces permite el diagnóstico de una insuficiencia pancreática exocrina y está indicada para diarreas inespecíficas, estreñimiento, heces grasas, flatulencias, pérdida de peso, dolor abdominal superior, así como intolerancias alimentarias. La determinación en las heces también permite una supervisión de la función pancreática exocrina en fibrosis quística, diabetesmellituso pancreatitis crónica. En todos estos casos se debe tomar una determinación periódica.
Kit de pruebas preanalítico:Para el preanálisis, se suministró a los pacientes un sistema de preparación de heces (Immundiagnostik AG, Bensheim, DE - n.° de artículo K 6998SAS), conteniendo el tubo de heces 1,5 ml de tampón de extracción de heces de acuerdo con la invención (Na2HPO420 mM, KH2PO42,6 mM, KCl 2,7 mM, NaCl 137 mM, pglutarato de sodio 50 mM, trehalosa 20 mM, SDS al 0,1 %, Triclosan® al 1 %, azul de metileno, citronelal). La cantidad de heces obtenible con la lanza de obtención de heces se diseñó para que fuera de 15 miligramos según el tamaño de las muescas y abolladuras; por tanto, el factor de dilución fue de 1:100. Las heces en bruto se transfirieron al tampón de extracción con la lanza. El exceso de heces se elimina inevitablemente del sistema suministrado durante la transferencia. Entonces, el paciente debe dispersar homogéneamente las heces en el tampón de extracción y después de 10 minutos debe obtener 200 microlitros (4 gotas) de un "punto homogéneo" con una minipipeta calibrada (Minivette® de Sarstedt, DE) y disponer en gotas sobre un material no tejido de celulosa redondo (Whatman, EE. UU.) de 1 cm de diámetro. El extracto acuoso de heces se propaga inevitablemente sobre esta superficie de secado y se seca rápidamente a temperatura ambiente o en condiciones ambientales. La superficie de secado se perforó en una superficie más grande de material no tejido de celulosa de modo que se drenara un exceso potencial, o considerado por el paciente, de extracto líquido (la 5.a gota). La superficie de secado representó una forma de transporte y almacenamiento estable de la muestra de examen que se envía de nuevo al laboratorio clínico.
Las series comparativas mostraron que el almacenamiento de la muestra sobre el material no tejido de fibras durante cuatro semanas fue estable, ya que el tiempo de almacenamiento no tuvo una influencia sustancial en el resultado cuantitativo. El material no tejido de fibras se pudo enviar al laboratorio por correo en un sobre. Normalmente, la estabilidad de la elastasa pancreática en las heces en bruto es de casi 3 días cuando se enfría (4-8 °C) o a temperatura ambiente y hasta un año solo a -20 °C (Stein, J.et al.,Immunoreactive elastase I: clinical evaluation ofa new noninvasive test of pancreatic function. Clinical Chemistry, 1996, 42(2):222-6; Nandhakumar, N. & Green, M.R., Interpretations: How to use faecal elastase testing. Archives of disease in childhood. Education and Practice Edition, 2010, 95(4):119-23]. La congelación tiene el inconveniente de que se asocia con un ciclo de congelación/descongelación. El procedimiento de secado tiene la ventaja de que se pueden preparar varias muestras a partir de un material fecal y procesarlas por separado, lo que significa que se pueden examinar distintos parámetros y marcadores al mismo tiempo. Lo único que hay que tener en cuenta es el factor de dilución del parámetro respectivo.
Determinación cuantitativaLa elastasa pancreática sobre el material no tejido de fibras se determinó con un ELISA para elastasa convencional (Immundiagnostik AG, Bensheim, DE - n.° de artículo K 6915). La superficie de secado con el extracto fecal se separó del material no tejido y todas las sales allí se disolvieron en 1,0 ml de tampón de lavado ELISA, de modo que resultó un "segundo extracto". La elastasa pancreática disuelta del material no tejido de fibras se unió mediante anticuerpos antielastasa monoclonales y se fijó en una placa de microvaloración. Las proteínas no unidas del segundo extracto se lavaron de la placa de microvaloración en etapas de lavado y la elastasa pancreática unida se detectó con segundos anticuerpos (anti elastasa pancreática humana de ratón) marcados con peroxidasa, el llamado conjugado de anticuerpo. Después de otras etapas de lavado, se añadió una solución con tetrametilbencidina (TMB) como sustrato de peroxidasa para una reacción de color. El desarrollo del color en la placa de microvaloración es entonces proporcional a la cantidad de analito en la muestra o en el patrón de comparación. Entonces, se puede determinar la concentración en la muestra por medio de comparación a través de una curva patrón paralela. Independientemente de la muestra inicial y del tiempo de secado sobre el material no tejido de fibras, con el tampón de extracción de heces descrito, la elastasa pancreática vuelve a disolverse de forma reproducible y cuantitativa y, por lo tanto, se puede determinar incluso después del transporte sobre el material no tejido de fibras.
Específicamente, se pipetearon por duplicado 100 pl de patrón, control o "segundo extracto" (1 ml de tampón de lavado) sobre una placa de microvaloración recubierta de anticuerpo y se incubó durante 30 minutos con agitación a temperatura ambiente. La placa de microvaloración se lavó 5 veces con tampón de lavado y se pipetearon 100 pl de conjugado de anticuerpo en cada pocillo. A esto le siguieron 30 minutos de incubación con agitación a temperatura ambiente. La placa de microvaloración se lavó varias veces con tampón de lavado y se pipetearon 100 pl de sustrato TMP en cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos con protección frente a la luz. La reacción de color se detuvo mediante la adición de una solución de detención (100 pl de solución de H2SO4) a cada pocillo. Entonces, se realizó la medición en el fotómetro a una longitud de onda de 450 nm.
Ejemplo 2: comparación entre métodos durante la determinación directa y mancha fecal seca (DFS)
Se examinaron muestras en bruto fecales (almacenadas a -20 °C) para determinar la concentración de elastasa pancreática directamente y después de disolver una mancha fecal seca de un material no tejido de fibras. Para la determinación directa, se transfirieron 15 mg de muestra de heces a 1,5 ml de tampón de extracción (dilución 1:100) con el sistema de obtención de heces (SAS) descrito en el ejemplo 1, se dispersaron y se equilibró la suspensión durante 10 minutos a temperatura ambiente; véase la figura 3. El primer extracto (dilución 1:100) se diluyó adicionalmente 1:100 con tampón de lavado ELISA de modo que la dilución final fue de 1:10.000. La determinación inmunológica de elastasa pancreática se realizó con 100 pl de dilución final por pocillo como en el ejemplo 1.
Para la determinación después de la disolución de la mancha fecal seca (DFS, dry fecal spot) del material no tejido de fibras, se añadieron gota a gota 100 pl de tampón de extracción (dilución 1:100) sobre el material no tejido de fibras, se secó a temperatura ambiente y se almacenó en un sobre postal en el estante durante 7 días (una semana) a temperatura ambiente. A continuación, se separaron las superficies de secado del material no tejido y se trataron durante 10 minutos en un tubo Eppendorf de 1,5 ml con 1,0 ml de tampón de lavado (dilución 1:1000) mientras se agitaba con vórtex. El material no tejido de fibras se centrifugó y se diluyeron 100 pl de sobrenadante con 900 pl de tampón de lavado ELISA (dilución 1:10.000). Se usaron 100 pl de esta dilución final en la prueba por cavidad. Los resultados de la comparación entre métodos se pueden obtener de la tabla 1 y se representan gráficamente en la figura 1 como una nube de puntos.
Tabla 1
La correlación entre estos dos métodos de medición fue muy fuerte (R=0,96). El coeficiente de determinación R2=0,929, figura, 1 muestra el análisis de puntos (diagrama de dispersión). La precisión o correlación es aquí una medida de la desviación de un valor de medición del valor "real" debido a un error sistemático. Se demostró aquí, comparándolo con un método validado, la determinación directa en "líquido". Por tanto, los métodos eran absolutamente equivalentes.
Ejemplo 3: comparación de la precisión de los métodos
La siguiente información sobre la precisión (entre ensayos) indica hasta qué punto los valores de análisis se dispersan cuando se analizan repetidamente. También se determinó la imprecisión o reproducibilidad entre ensayos. La tabla 2 muestra los resultados sobre la reproducibilidad o dispersión de los resultados para dos muestras ("11" —valor medio— y "22" —valor alto— ) en 20 repeticiones.
Tabla 2Dispersión (n=20) de los valores de medición durante la determinación a partir de una mancha fecal seca
La desviación estándar (n=20) para la muestra en bruto "11" con una concentración de elastasa pancreática mediaalta (PM=[296,65 |jg/ml]) fue igual a 17,25 |jg/ml. El coeficiente de variación porcentual fue de un 5,81 %. En una muestra en bruto con una concentración de elastasa pancreática alta (PM=526,25 [pg/ml]), la desviación estándar fue de 21,89.
La imprecisión o reproducibilidad entre ensayos de la determinación de la concentración de elastasa pancreática en las heces en distintos días se determinó para determinaciones de la mancha fecal seca (DFS) y la determinación directa del líquido de extracción de heces.
Tabla 3
Los resultados muestran que la precisión y la reproducibilidad no se ven sustancialmente afectadas por el secado del extracto de heces sobre una tela no tejida. Por tanto, el método preanalítico proporciona un gran valor práctico, puesto que elimina los problemas con el transporte y la estabilidad de las muestras de heces.
Ejemplo 4: determinación de calprotectina a partir de manchas de heces secas (DFS)
La calprotectina fecal es un marcador con alto valor predictivo negativo con respecto a enfermedades gastrointestinales. Si el nivel de calprotectina en las heces es bajo, lo más probable es que no esté presente ninguna una enfermedad orgánica del tracto intestinal. Por tanto, es importante distinguir entre pacientes con colon irritable y aquellos con enfermedad inflamatoria intestinal (EII). La detección de las heces por medio de ELISA o extracto líquido de heces turbidimétrico se correlaciona bien con hallazgos histológicos y endoscópicos de la actividad de la enfermedad en la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, así como con la referencia estándar para la actividad de la EII, la medición de la excreción fecal de granulocitos neutrófilos marcados con indio 111. Sin embargo, la prueba de granulocitos requiere precisa tiempo (hospitalización, determinación y eliminación de isótopos) y es estresante. La calprotectina en las heces es un marcador de progresión ideal para la enfermedad de Crohn o después de la extirpación de pólipos. Los primeros experimentos han demostrado que la concentración de calprotectina en las heces también se puede determinar inmunológicamente a partir de manchas fecales secas. Se realizó la determinación de calprotectina de forma análoga al ejemplo 1. La comparación entre métodos (DFS con análisis húmedo) arrojó una alta correlación de los valores de medición (R=0,95); y un coeficiente de determinación ajustado R2=0,918.
Ejemplo 5: determinación de sangre oculta en manchas de heces secas (DFS)
La detección de hemoglobina en las heces puede servir como marcador de hemorragia gastrointestinal para la detección del cáncer colorrectal. La sangre en las heces se puede deber a tumores o pólipos en el intestino. Otras posibles indicaciones son enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, etc. Si se detecta hemoglobina en las heces, se debe realizar una colonoscopia para determinar de dónde proviene la hemorragia o si está presente un tumor o un precursor en el intestino. Se ha demostrado que, en combinación con la colonoscopia, la inmunoprueba fecal de Hb reduce el riesgo de fallecer por cáncer de colon. La toma de muestras y la determinación cuantitativa se pueden realizar de forma análoga al ejemplo 1. Como ventaja particular resulta la alta estabilidad de la muestra a temperatura ambiente. La hemoglobina en las heces se desgrada hasta en un 50 % al día a temperatura ambiente, de modo que las heces en bruto preanalíticas se tienen que congelar. Incluso en un tampón de estabilización, la degradación de la hemoglobina oculta a temperatura ambiente sigue siendo aproximadamente de un 3 a un 7 % al día, a menudo incluso más. Sin embargo, si las heces se conservan como una mancha de heces seca sobre un papel no tejido como en el ejemplo 1, la hemoglobina es cuantitativamente estable durante semanas y la muestra se puede enviar por correo a un laboratorio para su análisis. Dado que regularmente se excretan pequeñas cantidades de sangre en las heces, la determinación de la hemoglobina oculta se debe realizar cuantitativamente, no solo analíticamente. Dado que la muestra de heces es estable con respecto a la sangre oculta en las heces, se puede averiguar un valor umbral para determinar cuándo está indicada una colonoscopia. Al igual que con otras pruebas en esta región, este valor umbral también se debe optimizar para lograr la sensibilidad y especificidad deseadas (véase Gies Aet al.Direct Comparison of Diagnostic Performance of 9 Quantitative Fecal Immunochemical Tests for Colorectal Cancer Screening, Gastroenterology, 2018, 154:93-104)
Claims (12)
1. Método para la preparación preanalítica de una muestra con heces, excrementos o deposiciones para una determinación cuantitativa de un analito proteico, que comprende las etapas:
(a) recoger la muestra y transferir una cantidad conocida a un recipiente preparado con una cantidad conocida de solución acuosa de extracción;
(b) dispersar y extraer el analito proteico de la matriz de muestra;
(c) separar el extracto acuoso de los componentes de matriz sólidos y aplicar un volumen conocido de extracto acuoso a un material soporte seco que posee propiedades capilares y propiedades cromatográficas de modo que el extracto discurra y se propague sobre el material soporte;
(d) Secar el material soporte a temperatura ambiente, representando el soporte con el extracto seco una forma de conservación y de transporte;
(e) eluir el analito proteico del material soporte en una cantidad conocida de tampón de examen;
(f) separar el material soporte del tampón de examen; y
(g) determinar cuantitativamente el analito,
caracterizado por quela solución acuosa de extracción contiene, en exceso, de 1 a 50 mmol/l de ácido cetocarboxílico de 1 a 12 átomos de carbono, que, en condiciones ambientales, forma sales hidratadas solubles en agua con aminoácidos y proteínas, así como sales tampón, detergentes, agentes solubilizantes, agentes complejantes, biocidas, adyuvantes y sales para el ajuste de la fuerza iónica, habituales.
2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los ácidos cetocarboxílicos se seleccionan del grupo que comprende ácidos a-cetomonocarboxílicos, ácidos a-cetodicarboxílicos, ácidos p-cetocarboxílicos, ácidos pcetodicarboxílicos, ácido a-cetopropiónico (ácido pirúvico), ácido acetoacético, ácido cetomalónico (ácido mesoxálico), ácido oxaloacético, ácido oxalosuccínico, ácido a-cetoglutárico, isocitrato, ácido oxohexanoico (ácido cetocaproico), ácido oxoheptanoico (ácido cetoenántico), ácidos Y-cetocarboxílicos, ácido levulínico, ácido fenilpirúvico, cetoderivados y ésteres del ácido tereftálico, así como mono- o diésteres de los ácidos cetocarboxílicos mencionados anteriormente con un alcohol lineal o ramificado de 1 a 6 átomos de carbono, ácido glioxílico, éster etílico del ácido glioxílico, éster etílico del ácido pirúvico.
3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la solución de extracción contiene de un 0,001 a un 10,0 % en peso con respecto al peso total de la composición, preferentemente de un 0,005 a un 0,5 % en peso, de uno o más sacáridos seleccionados de sacárido conservante, trehalosa, sacarosa, maltosa.
4. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la solución de extracción contiene uno o más aditivos seleccionados de colorante soluble en agua, indicador de pH, indicador rédox, indicador de descomposición, azul de metileno, verde de malaquita, aromas, citronelal, geraniol.
5. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el soporte presenta fibras seleccionadas de fibra de celulosa, fibra de vidrio o fibras de poliéster, polietersulfona (PES), poliamida (nailon), polipropileno, politetrafluoroetileno (PTFE), policarbonato, nitrato de celulosa o acetato de celulosa.
6. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la solución de extracción contiene un eluyente seleccionado de policarboxilato, éter de policarboxilato, sulfonato de naftaleno, sulfonato de melamina y sulfonato de lignina.
7. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que una parte de la matriz de muestra se extrae de 50 a 250 partes, preferentemente de 80 a 120 partes, de solución de extracción.
8. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el soporte sólido está diseñado para una absorción definida y para el secado de 100 a 250 pl de solución acuosa de extracción y cualquier posible exceso de solución acuosa de extracción es retirado, de modo que el analito contenido en la misma queda excluido de la determinación cuantitativa.
9. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8 para la determinación cuantitativa del contenido en las heces de calprotectina (S100A8/S100A9; MRP8(MRP14); elastasa pancreática, histamina, lactoferrina, betadefensina (HBD-1, -2, -3, -5, -6), EDN (neurotoxina derivada de eosinófilos), hemoglobina, complejo hemoglobina/haptoglobina.
10. Kit de prueba, que comprende
(a) un sistema de obtención de heces con una cantidad conocida de solución de extracción que contiene, en exceso, con 1 a 50 mmol/l de ácido cetocarboxílico de 1 a 12 átomos de carbono que, en condiciones ambientales, forma sales hidratadas solubles en agua con aminoácidos y proteínas, así como sales tampón, detergentes, agentes solubilizantes, agentes complejantes, biocidas, adyuvantes, así como sales para el ajuste de la fuerza iónica, habituales, así como
(b) un soporte sólido, diseñado para una absorción definida y para el secado de 100 a 250 j l de solución acuosa de extracción, en el que un posible exceso de solución acuosa de extracción es conducido fuera, de modo que el analito contenido en la misma queda excluido de la determinación cuantitativa.
11. Kit de prueba de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el soporte sólido está unido a una cantidad más grande de material de fibra absorbente a través de una o más redes definidas, de modo que el exceso de líquido se drene del soporte.
12. Kit de prueba de acuerdo con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, diseñado para la determinación del contenido en las heces de calprotectina (S100A8/S100A9; MRP8(MRP14); elastasa pancreática, histamina, lactoferrina, beta-defensina (HBD-1, -2, -3, -5, -6), EDN (neurotoxina derivada de eosinófilos), hemoglobina, complejo hemoglobina/haptoglobina.
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