DE2901391A1

DE2901391A1 - Verfahren zur bestimmung von kreatinkinase-isoenzymen und reagenz zur durchfuehrung des verfahrens

Info

Publication number: DE2901391A1
Application number: DE19792901391
Authority: DE
Inventors: Larry H Coleman; Bonnie Lemat David
Original assignee: SmithKline Instrument Inc
Current assignee: SmithKline Instrument Inc
Priority date: 1978-01-16
Filing date: 1979-01-15
Publication date: 1979-07-19
Also published as: SE7900335L; DK10579A; BE873465A; FR2414729A1; JPS54119291A

Description

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Die Erfindung "betrifft ein immunologisches Festphasenver— fahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Kreatinkinase-Isoenzymen.

Kreatinkinase kommt in drei Isoenzym-Kombinationen vor, die mit MM, BB und MB bezeichnet werden. MM ist die vorherrschende Form im Muskel, BB die vorherrschende Form im Gehirn und MB die vorherrschende Form im Myokard. Erhöhtes MB im Serum ist ein spezifischer Indikator für Myokardverletzungen. Daher ist dessen Nachweis wichtig für die Diagnose von Myokardinfarkten.

Die herkömmlichen Verfahren zur Messung von Kreatinkinase-Isoenzymen lassen in bezug auf Empfindlichkeit zu wünschen übrig, haben eine begrenzte Spezifität und beruhen auf dem Nachweis der enzymatischen Kreatinkinaseaktivität.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein empfindliches und spezifisches immunologisches, in fester Phase ablaufendes Bestimmungsverfahren zur Verfügung zu stellen, das unabhängig von der enzymatischen Kreatinkinaseaktivität ist.

Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert.

Erfindungsgemäss wird ein Kreatinkinase-Isoenzym verwendet, das durch kovalente Bindung oder durch Adsorption an einen wasserunlöslichen Träger, wie Kügelchen oder Teilchen aus Polystyrol, Nylon, Glas, Latex, Agarose oder Polypropylen, immobilisiert ist. Das immobilisierte Isoenzym wird mit einer bekannten Menge eines für die Isoenzym-untereinheit spezifischen Antikörpers, der an ein Indikator enzym, wie

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Meerettichperoxidase,gekoppelt ist, und mit einer flüssigen Probe, die das zu bestimmende Isoenzym enthält, inkubiert. Die Menge des mit Peroxidase markierten Antikörpers, der an das immobilisierte Isoenzym gebunden wird, ist umgekehrt proportional zur Menge der in der Probe vorhandenen freien Isoenzym-Untereinheit. Der unlösliche Träger wird gewaschen und mit einem entsprechenden Peroxidase-Substrat versetzt. Die Färb entwicklung wird visuell oder spektrophotometrisch abgelesen. Umgekehrt kann auch Antikörper an den Träger ge-'O bunden werden.

Nachstehend wird das erfindungsgemässe Verfahren näher anhand der Verwendung des Isoenzyms BB erläutert. BB und der B-Anteil von MB sind immunologisch das gleiche. Gereinigtes '5 BB wird an Kügelchen immobilisiert. Die Kügelchen werden sodann in einem Puffer inkubiert, der mit Meerettichperoxidase markiertes Kaninchen-, Ziegen- oder Schaf-anti-BB und freies BB enthält. Der mit Peroxidase markierte Antikörper geht eine Bindung mit dem vorhandenen BB ein. Die Menge des Anti-

^O körpers, der an den mit BB überzogenen Kügelchen gebunden wird, ist umgekehrt proportional zur Menge des vorhandenen freien BB. Die Kügelchen werden sodann mit Puffer oder Wasser gespült und mit einem Peroxidase-Substrat versetzt. Nach 5- bis 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur

^5 wird die Färb entwicklung spektrophotometrisch gemessen.

Die Reaktionsgeschwindigkeit und/oder die Absorption ist proportional zur Menge des an die Kügelchen gebundenen Antikörpers und umgekehrt proportional zur Menge des freien BB in der Probe. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die

JO Aktivität des mit Antikörper gekoppelten Enzyms, das frei in der Lösung verbleibt, zu messen.

Vorzugsweise werden Polystyrolkügelchen mit einer Oberfläche von 1,29 cm (0,2 sq. in.) verwendet. Diese Kugelchen werden mit einer Lösung von 0,05 "bis 0,12 mg BB/ml 0,05 m Tris-Puffer vom pH-Wert 9 von 1 Stunde bei Raumtem-

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peratur bis 3 Tage bei 4-⁰C inkubiert und dadurch überzogen..

Die f-Globulinfraktionen von anti-BB-Serum werden mit Hilfe von Glutaraldehyd an Meerettichperoxidase gekoppelt» Die Peroxidase-Aktivität xfird unter Verwendung eines der nachstehend genannten Substrate gemessen:

a) 4-Ajainoantipyrin/Phenol/Wasser stoffperoxid,

b) 2,2'-Azino-di-(3-äthylhenzthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS)/Wasserstoffperoxid oder

c) 2,5,3\5'-Tetramethyrbenzidin (TMB). 10

Folgende Inkubationspuffer können verwendet werden:

a) 0,1 m Carbonatpuffer mit 0,15 m Natriumchlorid und

1 bis 30 Prozent normales Kaninchenserum vom pH-Wert 9»

b) 0,1 m Phosphatpuffer mit 1 bis 30 Prozent normalem. ^5 Kaninchen- oder Kälber serum vom pH-Wert 7*5 oder

c) Vollserum.

Zum Waschen der Kügelchen wird entweder (a) der gleiche Inkubationspuffer, wie vorstehend erwähnt, aber ohne Zusatz von Normalserum oder (b) Wasser verwendet.

Das Bestimmungsverfahren läuft folgendermassen ab: 1. 500 ^uI Inkubationspuffer werden in ein Reagenzglas gegeben.
2. Ein überzogenes Kügelchen wird zugesetzt.

3. Freies BB oder MB (zu untersuchende Probe) wird zugesetzt.

4-, 25/Ul mit Peroxidase markierter Antikörper werden zugesetzt.
5. Es wird gründlich durchmischt.

6. Es wird 2 Stundenbei 45°C inkubiert.

7. Der Überstand wird abgesaugt.

8. Es wird 1- bis 3 mal mit Puffer.gewaschen.

9. Das Kügelchen wird in 2 ml Enzymsubstrat lösung gebracht. 10. Es. wird 5 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und sodann die optische Dichte des Substrats bei einer entsprechenden Wellenlänge abgelesen.

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Nachstehend sind spezielle Versuchsergebnisse, die gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren erhalten worden sind, widergegeben.

Kreatinkinase-Isoenzym (Modellsystem Rind) Materialien:

Pester Träger Antikörper

Peroxidasesubstrat Inkubationspuffer

Waschpuffer Freies Isoenzym ■

Verfahren:

Mit BB überzogene 6,35 mm (1/4- in)-Polystyrolkügelchen

Mit Peroxidase markiertes Kam' nch.enanti-BB

4—Aminoantipyrin

Phosphatpuffer, 0,1 m, pH-Wert 7,5, mit 1% normalem Kaninchenserum Phosphatpuffer 0,1 m, pH-Wert 7,5 Einder-BB oder -MM

1. Das BB-Kügelchen wird im Reagenzglas zu 0,5 ml Inkubationspuffer gegeben.

2. Freies Isoenzym wird zugesetzt.

3. 0,025 ml mit Peroxidase markierter Antikörper werden zugesetzt.

4·. Es wird gründlich vermischt und 2 Stunden bei 4-5°C inkubiert.

5- Der Puffer wird abgesaugt und das Kügelchen 3 mal gewaschen.

6. Das Eügelchen wird in 2 ml Substratlösung gebracht und 10 Minuten inkubiert.

7. Nach dem Entfernen des Kügelchens wird die optische Dichte bei 500 nm abgelesen.

Ergebnisse:	Isoenzym	Absorption bei	5OO nm
	0	BB	MM
	0,01	0,64-3	0,64-3
	0,05	0,567	0,637
	0,5	0,477	0,632
	1	0,314-	0,586
	5	0,280	0,604-
	10	0,160	0,569
		0,119	0,54-7

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Nachstehend wird als weiteres Beispiel für das erfindungsgemässe Verfahren die Verwendung von Latexteilchen als fester Träger für ein Humansystem "beschrieben. Gereinigtes BB aus menschlichem Hirn wird an Latexteilchen immobilisiert. Die Teilchen werden in einem Reagenzglas, das mit Peroxidase markiertes anti-Human-BB und freies Human-BB in Serum oder Puffer enthält, inkubiert. Nach einer entsprechenden Inkubationszeit, beispielsweise 1 Stunde bei 4-5⁰C, werden die Teilchen durch Zentrifugation abgetrennt und mit Puffer gewaschen. Nach Zusatz eines Peroxidase-Substrats und nach 15- bis 30-minütiger Inkubation wird die larbentwicklung des Substrats spektrophotometrisch bestimmt. Die Absorption ist proportional zur Menge des an die Teilchen gebundenen Antikörpers und umgekehrt proportional zur Menge des freien Isoenzyms in der Probe. Die vorstehend genannten Latexteilchen weisen einen Durchmesser von 0,8 um auf und werden durch eine Inkubation von 1 Stunde bei Raumtemperatur bis über Facht bei 4°C mit einer Lösung von 0,06 mg BB/ml 0,05 m Tris-Puffer vom pH-Wert 9*0 überzogen. Die Latexteilchen werden in Form einer Suspension mit einem Gehalt an 2 mg Teilchen pro 1 ml Tris-Puffer verwendet.

Es können verschiedenartige feste Träger verwendet werden, beispielsweise auf der Basis von Agarose, Acrylaten oder anderen Trägern mit funktionellen Gruppen für die kovalente Bindung von Proteinen.

nachstehend sind spezielle Ergebnisse, die nach der vorstehend beschriebenen Ausführungsform erhalten worden sind, zusammengestellt:

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Kreatinkinase-Isoenzym (Humansystem). Materialien:

Fester Träger Antikörper Peroxidase-Substrat Inkubationspuffer Waschpuffer Freies Isoenzym

Verfahren:

Latexteilchen mit BB überzogen Mit Peroxidase markiertes Schaf-anti-BB 4~Aminoant ipyrin

Humanserum

Phosphatpuffer, 0,05 m, pH-Wert 7,5 Human BB

1. Ein Reagenzglas wird mit 0,5 nil Serum mit einem Gehalt an BB versetzt.

2. 0,02 ml mit BB überzogene Latexteilchen werden zugesetzt. 3- 0,03 ml mit Peroxidase markiertes anti-BB werden zugesetzt. 4-, Die Bestandteile werden vermischt und 1 Stunde bei 4-5⁰C

inkubiert.

5. Es wird 15 Minuten bei 2500 U/min zentrifugiert.

6. Der Überstand wird abgesaugt und 1 mal mit 1 ml 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 gewaschen.

7. Die Zentrifugation wird wiederholt und der Überstand entfernt. Die Teilchen werden mit 2 ml Peroxidase-Substrat versetzt.

Es wird gründlich vermischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Es wird zentrifugiert. Der Überstand wird in ein sauberes Reagenzglas oder eine Küvette dekantiert. Die optische Dichte bei 500 mn wird ermittelt.

Ergebnisse;

;ug BB-Isoenzym	Absorption bei 500 nm
0	0,354
0,1	0,335
0,5	0,183
1,0	0,142
5,0	0,036
10,0	0,0

Bei einer Kontrolle unter Verwendung von 10 ug MM-Isoenzym

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- 9-ergibt sich keine Verschiebung«

In der Praxis wird eine Serumprobe mit einem unbekannten Gehalt an Isoenzym nach dem vorstehend erläuterten Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse können entweder qualitativ oder quantitativ widergegeben werden, d.h. unter Bezugnahme auf eine Reihe von Standards mit bekannten Isoenzymmengen oder unter Bezugnahme auf normale und abnormale Kontrollseren.

Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird vorzugsweise eine Testpackung verwendet, die folgende Reagent i en enthält:

(a) Pester, mit Kreatinkinase-Isoenzym BB überzogener Träger,

(b) mit Peroxidase markiertes anti-BB,

(c) Substrat zur Messung der Peroxidaseaktivität und (d) Kontroll- oder Eichlösungen.,

Die Isoenzyme MM und BB unterscheiden sich iimmunologisch. BB wird im allgemeinen im Serum nicht gefunden. Somit wird bei Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens auf Serum oder Plasma als flüssige Probe und bei Verwendung eines immobilisierten BB-Isoenzyms eine Messung der Menge an in der Probe vorhandenem MB vorgenommen. In diesem Fall geht der mit Peroxidase markierte Antikörper eine Bindung an die B-Untereinheit des MB-Isoenzyms ein.

Verfahren zum Nachweis von Kreatinkinase-Isoenzymen lassen sich im allgemeinen in 6 Gruppen einteilen: Elektrophorese, Ionenaustausch, kinetische Differenzierung, selektive Aktivierung, Radioimmuntests und immunologische Tests (Clin. Chem. Bd. 23 (1977), 2 Pt. 1, S. 205 bis 210). Folgende Literaturstellen betreffen immunologische Verfaliren: Clin. Chim. Acta, Bd. 58 (1975), S. 223 bis 232; Clin. Chim. Acta, Bd. 73 (3) (1976), S. 445 bis 451; Klin. Wochenschrift, Bd. 53 (1975), S. 329 bis 333; Z. Anal. Chem., Bd. 279 (2) (1976), S. 174 bis 175; Klin. Wochenschrift, Bd. 54- (8) (1976), S. 357 bis 360; und Z.Anal· Chem., Bd. 279 (2) (1976), S. 173.

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-ΙΟΙ Diese Verfahren basieren auf der enzymatischen Bestimmung der gesamten Kreatinkinase-Aktivität der Immunopräzipitation des selektierten Isoenzyms land der Bestimmung der Restaktivität.
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Verfahren zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern, die in enzymmarkierten Komponenten verwendet werden, sind in den trS-PSen 3 654- 090 und 4-016 04-3 beschrieben. Gemäss dem erstgenannten Verfahren wird ein immobilisiertes Hormon "Ό verwendet, während beim letztgenannten Verfahren die Sandwichtechnik angewendet wird.

Die DT-OS 2 548 963 (Derwent Patent Abstract 32973Y) betrifft die Bestimmung der Aktivität des Kreatinkinase-MB-Isoenzyms durch Vorinkubieren der Probe mit Antikörpern gegen die Kreatinkinase-M-Untereinheit, d.h. die Verwendung eines hemmenden Antikörpers. Gemäss der US-PS 3 932 221 wird ein präzipitierender Antikörper für einen ähnlichen Zweck verwendet. Bei beiden Verfahren wird die restliche Kreatinkinase-Aktiyität

nach Behandeln mit einem Antikörper ermittelt.

Aus dem Stand der Technik ergibt sich kein Hinweis auf ein in- fester Phase ablaufendes immunologisches Verfahren zur Bestimmung der Kreatinkinase-Isoenzyme, bei dem immobilisiertes Isoenzym mit einer Testprobe und einem für die Isoenzym-IIntereinheit spezifischen Antikörper, der an ein Enzym gebunden ist, inkubiert wird. Das erfindungsgemässe Verfahren beruht nicht auf der enzymatischen Aktivität der Kreatinkinase und liefert für die Untereinheit genauere Ergebnisse, da es von der immunologischen Empfindlichkeit abhängt.

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Claims

VOSSIUS · VOSSIUS · HILTL · TAUChINER ■ HEUNEMANN PATE NTAhJ WÄ'.TE SIE BERTSTRASS E A- · 8000 MÖNCHEN 86 . PHONE: (O89) 47 4O75 CABLE: BEN ZOUPATENT MÖNCHEN -TELEX 5-29 4-53 VOPAT D u.Z.: M 977 Case: 14000 SMITH KLINE INSTRUMENTS, INC. Sunnyvale, CaI., V.St.A. "Verfahren zur Bestimmung von Kreatinkinase-Isoenzymen und Reagenz zur Durchführung des Verfahrensn Priorität: 16. Januar 1978, V.St.A., Nr. 869 753 Pat entansp rüc he

1.'Verfahren zur Bestimmung von Kreatinkinase-Isoenzymen in ■ flüssigen Proben, dadurch gekennzeichnet, dass man

(a) ein an einem wasserunlöslichen Träger immobilisiertes Kreatinkinase-Isoenzym mit einem für die Isoenzym-r-Untereinheit spezifischen, an ein Enzym kovalent gekoppelten Antikörper und der flüssigen Probe, die das zu bestimmen-

^O de Isoenzym enthält, inkubiert,

(b) den unlöslichen Träger abtrennt und

(c) die Aktivität des an den Antikörper gekoppelten, an den unlöslichen Träger gebundenen Enzyms bestimmt, die ein Mass für die Menge der in der Probe vorhandenen Iso-

zc enzym-Untereinheit darstellt.

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2. Verfahren zur Bestimmung von Kreatinkinase-Isoenzymen in flüssigen Proben, dadurch gekennzeichnet, dass man

(a) an Kügelchen immobilisiertes Kreatinkinase-Isoenzym BB mit anti-BB, das mit Peroxidase markiert ist, und der flüssigen Probe, die das zu bestimmende Isoenzym enthält, inkubiert,

(b) die Kügelchen abtrennt und

(c) die an die Kügelchen gebundene Peroxidaseaktivität

mit einem Peroxidase substrat als Mass für die Menge der in der Probe vorhandenen, freien Isoenzym-Ühtereinheit bestimmt.

3. Reagenz zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch

oder 2, bestehend aus

(a) einem wasserunlöslichen Träger, der mit Kreatinkinase-Isoenzym BB überzogen ist,

(b) mit anti-BB markierter Peroxidase,

(c) Substrat zur Messung der Peroxidaseaktivität und

(d) einer Reihe von Standards mit bekannten Isoenzym-

mengen oder normalen und abnormalen Kontrollseren.

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