DE68925387T2 - Verfahren zur Behandlung von Immunotest-Proben, die Schleim enthalten - Google Patents
Verfahren zur Behandlung von Immunotest-Proben, die Schleim enthaltenInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft einen Immunotest auf Antigene in Proben, die Schleim enthalten.
- Immunotests können bei der medizinischen Diagnose verwendet werden, um festzustellen, ob ein spezielles Bakterium vorhanden ist. Bei einer Art von Immunotests wird ein spezielles bakterielles Antigen unter Verwendung eines markierten Antikörpers erkannt. Beispielsweise kann der Antikörper mit einem erkennbaren Enzym, z.B. Meerrettich-Peroxidase markiert werden, um das Vorliegen der Antikörper zu erkennen, indem ein Substrat für das Enzym bereitgestellt und die Umwandlung des Substrats in ein Produkt festgestellt wird.
- Ein Problem bei den Immunotestverfahren besteht in Ungenauigkeiten, die durch Wechselwirkungen zufolge anderer Substanzen in der Probe verursacht werden. Beispielsweise kann ein unzutreffender Positivbefund von einer unspezifischen Bindung zwischen Schleim in der Probe und dem markierten Antikörper herrühren. Zum Beispiel kann Schleim natürlicherweise in Urogenitalproben vorhanden sein, die genommen werden, um mittels Immunotests Geschlechtskrankheiten zu diagnostizieren. Außerdem kann Schleim die Fähigkeit von Immunotests, Probenbestandteile zu erkennen, stören, wenn der interessierende Analyt in der Matrix der Probe verschleiert und dadurch für die Reagenzien des Testsatzes schlecht zugänglich ist. Ein recht bekanntes Verfahren zur Aufbereitung von respiratorischen Sputumproben für diagnostische Tests sieht die Verwendung eines mukolytischen Wirkstoffs wie N-Acethylcystein oder Dithiothreitol vor, um die Viskosität der Proben zu vermindern und sie besser zu homogenisieren. Diese Wirkstoffe, die die Grundbestandteile des Schleims sind, wirken, indem sie die Disulfidbrücken dissoziieren. Diese auf Thiol-vermittelter Dissoziation basierenden Wirkstoffe sind im allgemeinen für Immunotests ungeeignet, die hämhaltige Enzymmarkierungen verwenden wie Merrettich-Peroxidase, und zwar in Folge ihrer inhibitorischen Wirkung auf das Enzym.
- Ein Immunotest zum Erkennen von Neisseria gonorrhoea in klinischen Proben ist in dem US-Patent 4,497,900 beschrieben.
- Die EP-A-103 958 beschreibt die Verwendung von Periodat, das auf einem festen Träger imprägniert ist, um die Störung durch Ascorbat in Tests mit Peroxidase-Färbetestsystemen zu vermindern.
- Wir haben herausgefunden, daß es möglich ist, die Störung durch Schleim in Proben zu vermindern, ohne daß nicht hinnehmbare nachteilige Auswirkungen auf den Immunotest entstehen, indem die Probe oxidierenden Bedingungen ausgesetzt wird. Somit hat die Erfindung ein Verfahren und eine Zusammenstellung für einen Immunotest zum Gegenstand, der einen Antikörper verwendet, der an ein Antigen in einer eine Schleimmatrix enthaltenden Probe binden soll. Zu dem Verfahren gehört ein Schritt, gemäß dem die schleimenthaltende Probe mit einem Oxidationsmittel mit einer Konzentration behandelt wird, die ausreicht, um eine unspezifische Bindung des Antikörpers an die Schleimmatrix zu verhindern. Nach dieser Behandlung wird die Probe mit Standardtesttechniken weiterbearbeitet.
- Bei bevorzugten Ausführungsbeispielen wird die Oxidation durch eine Behandlung mit Wasserstoffperoxid oder einem organischen Peroxid ausgeführt; die Probe ist eine Urogenitalprobe (insbesondere eine Endocervicalprobe); und das zu erkennende Antigen ist Neisseria gonorrhoea, z.B. das H-8 Antigen von Neisseria gonorrhoea. Die Zusammenstellung enthält vorzugsweise Mittel, um die Endocervicalprobe zu nehmen (bspw. einen Abstrichtupfer).
- Diese Erfindung schafft ein Verfahren, mit dem die Anzahl der falschen Positivbefunde bei einem Immunotest vermindert wird, ohne daß nicht akzeptable nachteilige Auswirkungen auf die Bindung von Antigen und Antikörper in dem Test oder auf die Fähigkeit auftreten, das Vorliegen von geringen Mengen des Antigens zu erkennen.
- Die Wahl von Peroxid als Oxidationsmittel ist wegen seiner Neigung besonders vorteilhaft, in Anwesenheit von Katalase- oder Pseudoperoxidase-Aktivität abzubauen, die bei Urogenitalproben natürlicherweise auftritt. Eine derartige enzymatische Aktivität entsteht aufgrund der vorhandenen normalen parasitischen Mikroflora und der Bestandteile von Blut oder Epithelzellen, die in derartigen Proben zwangsläufig vorhanden sind. Dieser probenaktivierte Abbau von Wasserstoffperoxid ist zweckmeäßig, da das Oxidationsmittel wie Wasserstoffperoxid das Enzym schädigen und damit die Markierungsaktivität vermindern kann. Das Wasserstoffperoxidmaß wird durch die oben beschriebene Aktivität während der Inkubation der Proben vermindert, so daß verhältnismäßig hohe Werte von Peroxid verwendet werden können, ohne daß es notwendig wird, vor der Zugabe des Enzymmarkers einen zusätzlichen Neutralisierungsschritt durchzuführen. Stärkere Oxidantien als Peroxid, z.B Periodat oder Perdorat, sind für den Enzym-Immunotest weniger geeignet, weil sie eine zerstörende Wirkung auf den Enzymmarker haben, wenn kein neutralisierender Wirkstoff vorhanden ist.
- Diese Erfindung eignet sich insbesondere zur Erkennung von charakeristischen Antigenen, die von Neisseria gonorrhoea, Chlamydia trachomatis und Herpes Viren stammen.
- Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung des bevorzugten Ausführungsbeispiels und aus den Ansprüchen.
- Die Erfindung betrifft die Vorbehandlung einer Probe für einen Enzym-Immunotest. Hierzu gehört es im allgemeinen, daß die Probe mit einem minimalen Volumen eines oxidativen mukolytischen Wirkstoffes, bspw. Wasserstoffperoxid, bei einer Konzentration zwischen 1 bis 15% (Gew./Gew.) 1 bis 5 Minuten lang gemischt wird, ehe der Standardimmunotest ausgeführt wird.
- Proben von durch Geschlechtsverkehr über Krankenheiten (STD) bei weiblichen Patienten sind für die enzymmarkierten Immunotesttechniken wegen des hohen Anteils von falschen Positivbefunden besonders problematisch. Dennoch sind sie für das erfindungsgemäße Testverfahren besonders geeignet.
- Alle nachfolgenden Maßnahmen werden bei Umgebungstemperatur (etwa 20ºC) ausgeführt.
- 1. Eine Urogenitalabstrichprobe wird 5 Minuten lang mit 100 ml einer 5%igen Lösung von Wasserstoffperoxid in Citratphosphatpuffer bei einem pH-Wert von 5 gehalten (49 mM Citrinsäure und 0,1 M Natriumdihydrogenphosphat).
- 2. Die Abstrichprobe wird sodann in einen 500 µl Testpuffer gebracht, der aus 0,45 M Kaliumphosphat, 0,113 M Natriumchlorid, 0,56% Rinderalbumin-Serum, 0,38% Thriton X-100 und 0,056% Timerosol bei einem pH-Wert von 7,2 besteht. Der Abstrich wird gegen Ende der Extraktion in der Lösung bewegt. Durch dieses Verfahren wird das Gonokokken-Antigen aus dem Organismus und der Probenmatrix in die Lösung extrahiert.
- 3. Nach dem Auspressen der Flüssigkeit aus dem Tupfer wird der Tupfer weggeworfen.
- 4. In das Röhrchen, das die ausgepresste Probenflüssigkeit enthält, werden 50 µl eines Anti-Gonokokken-Antikörpers, der kovalent (durch das Verfahren nach Wilson und Nakane beschrieben in Immunofluorescence and Related Staining Techniques, Napp et al., eds., 1978. Seiten 215 bis 224) gebunden ist, hinzugegeben. Das Röhrchen wurde bewegt, um die Wirkstoffe sorgfältig zu mischen.
- 5. Ein mit einem Anti-Gonokokken-Antikörper beschichtetes Eintauchstäbchen (nach dem Verfahren von Catt und Treager, beschrieben in Science 158:1570 (1967)), wurde sodann 30 Minuten lang in das Röhrchen gesteckt.
- 6. Das Eintauchstäbchen wurde sorgfältig unter einem Leitungswasserstrahl 5 Sekunden gewaschen, dann heftig geschüttelt, um den Wasserüberschuß zu entfernen.
- 7. Das gewaschene Eintauchstäbchen wurde sodann in ein neues Glasröhrchen gebracht, daß 237 µl eines frischen chromogenen Entwicklers enthält, der aus 3 Teilen 5,2 mM 3,3', 5,5-Tetramethylbenzidin in Methanol in 4 Teilen aus 0,03 % Wasserstoffperoxid in 49 mM Citrinsäure, 0,1 M Natriumdihydrogenphosphat, 0,006 % Präpariersalz und 0,005 % Timerosol bei einem pH-Wert von 5 zusammengesetzt ist. Siehe Gerber et al. in dem US Patent 4,503,143.
- 8. Nach einer 10-minütigen Inkubation wurde das Eintauchstäbchen aus dem Entwickler herausgenommen. Die Intensität der blauen Farbe in dem Entwickler ist der Menge von Gonokokken-Antigen, das in der Probe vorhanden ist, proportional. Das Fehlen der blauen Farbe zeigt das Fehlen des Gonokokken-Antigens an.
- Die Ergebnisse des obigen Tests wurden mit denen verglichen, die mit Standardkulturtechniken erhalten wurden. Das Hinzufügen des Behandlungsschritts mit Wasserstoffperoxid erhöht sowohl die Empfindlichkeit als auch die Spezifität des Tests. Die Empfindlichkeit wird definiert als die Anzahl der Positivbefunde, die durch die Immunotesttechniken erkannt wurden, gegenüber der Anzahl von Positivbefunden, die durch die Kulturtechniken festgestellt wurden; die Spezifität ist definiert als das Verhältnis der Anzahl der Negativbefunde, die sich mit den Immunotesttechniken eingestellt haben, verglichen mit der Anzahl, die durch die Kulturtechniken ermittelt wurden.
- Im einzelnen wurden zusammengehörige Probenpaare von individuellen Patienten zusammengetragen. In allen Fällen wurden die einzelnen Abstrichtupfer charakterisiert, indem zunächst ein Standardwachstumsmedium überstrichen wurde, um ein Referenzergebnis für die Gonokokken-Kultur zu erhalten. Ein Partner jedes Paares wurde sodann der oben beschriebenen Peroxidbehandlung unterzogen, während der andere entsprechend einem Standardimmunotestprotokoll bearbeitet wurde.
- Die Peroxidbehandlung verbesserte die Übereinstimmung zwischen dem Enzym-Immunotest und der Kultur, sowhohl hinsichtlich der Proben mit positiven als auch der Proben mit negativem Befund. Die klinische Empfindlichkeit wurde nicht nachteilig beeinträchtigt, und die Spezifität wurde verbessert.
- Bei einem Experiment, das im wesentlichen wie oben beschrieben ausgeführt wurde, wurde die Übereinstimmmung zwischen dem Enzym-Immunotest (EIA) und der Kultur sowohl für Proben mit positivem Befund (Empfindlichkeit) als auch für Proben mit negativem Befund (Spezifität) verbessert. Empfindlichkeit Spezifität Kultur perox
- Ein weiterer Vorteil der Peroxidbehandlung besteht in der Verminderung der Hintergrundenzymaktivität und einer sich daraus ergebenden Verbesserung bei der klinischen Spezifität. Insbesondere wurde der Hintergrundwert der Enzymaktivität bei den Immunotests bei den zusammengehörigen Paaren der Proben mit Kulturen mit Negativbefund gemessen. Jeder Partner des Paares wurde mit verlängerten Inkubationszeiten behandelt, um die Signalwerte zu akzentuieren, und zwar entweder mit Peroxid oder ohne Peroxid, und sodann erfolgte eine visuell Bestimmung und eine Quantisierung durch Spektophotometrie. Die Peroxidbehandlung vermindert wesentlich das Hintergrundsignal bei den Kulturproben mit Negativbefund. Die Ergebnisse sind nachstehend aufgelistet: perox Kultur Mean OD
- Das Ziel-Antigen wird durch die oxidierenden Bedingungen, die von der Peroxidbehandlung hervorgerufen werden, im wesentlichen nicht beinträchtigt. Wenn Standardlaborzubereitungen von Suspensionen mit Gonokokkenorganismen in den Immunotest untersucht wurden, hat die Wirkung der Wasserstoffperoxidbehandlung (100 µl bei 5% 5 Minuten lang) die Signalintensität nicht signifikant beeinträchtigt.
- Andere Ausführungsbeispiele fallen in den Schutzumfang der Ansprüche. Beispielsweise sind andere Peroxide für die Erfindung auch brauchbar, bspw. organische Peroxide einschliesslich Methylhydroperoxid, T-Butylhydroperoxid, Cumenhydroperoxid.
Claims (11)
1. Immunotestverfahren unter Verwendung eines
Antikörpers, der an ein Antigen in einer Probe bindet, die
eine Schleimmatrix enthält, wobei es zu dem Verfahren
gehört:
daß zunächst die den Schleim enthaltende Probe mit
einem Oxidationsmittel behandelt wird, das in einer
Konzentration vorliegt, die ausreicht, die unspezifische
Bindung des Antikörpers an die Schleimmatrix zu reduzieren
und
daß sodann der Antikörper mit der Probe in Berührung
gebracht wird und die Antikörper-Antigenbindung in der
Probe erkannt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die
Schleimprobe mit Wasserstoffperoxid oder einem organischen
Peroxid oxidiert wird.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
bei dem die Probe aus dem Urogenitalbereich stammt.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
bei dem das Antigen ein Neisseria gonorrhoea-Antigen ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem das Antigen ein
H-8-Antigen ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei
dem die Probe eine Mikroflora oder andere Bestandteile
aufweist, die eine Pseudoperoxidaseaktivität zeigt bzw.
zeigen.
7. Zusammenstellung für einen Immunotest unter
Verwendung eines Antikörpers, der an ein Antigen in einer
Probe bindet, die eine Schleimmatrix enthält, wobei die
Zusammenstellung enthält:
ein Oxidationsmittel und
einen mit einer erkennbaren Markierung markierten
Antikörper.
8. Zusammenstellung nach Anspruch 7, bei der das
Oxidationsmittel Wasserstoffperoxid oder ein organisches
Peroxid ist.
9. Zusammenstellung nach Anspruch 7 oder 8, bei dem
die Zusammenstellung Mittel enthält, um eine Probe aus dem
Urogenitalbereich zu nehmen.
10. Zusammenstellung nach einem der Ansprüche 7 bis
9, bei dem der Antikörper ein solcher ist, der speziell an
ein Neisseria gonorrhoea-Antigen bindet.
11. Zusammenstellung nach Anspruch 10, bei der das
Antigen ein H-8-Antigen ist.
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