JP3457324B2 - 同時でのサンプル抽出及び免疫原性反応を含む抗体又は抗原の検査のための迅速イムノアッセイ - Google Patents

同時でのサンプル抽出及び免疫原性反応を含む抗体又は抗原の検査のための迅速イムノアッセイ

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は検査物質の検査のための迅速イムノアッセイ
に関する。
検査サンプル中の検査物質を検査するために１又は複
数種の抗体を使用するイムノアッセイは幅広く知られ
る。イムノアッセイ法の進歩は感度及び使い易さの向上
を招来する。この進歩にもかかわらず、感度又は結果の
信頼性を損うことなく、より迅速に、且つ時間及び資源
を節約して抗原性物質を検査及び測定することを達成せ
しめることの要望が残っている。
この要望の追求のため、いくつかのイムノアッセイの
方式が開発されている。複数の抗体であってその一つが
固相材料に結合していることのある抗体を頼りとするい
くつかのイムノアッセイが開発されている。この結合は
ニトロセルロース、ポリスチレンビーズ、プラスチック
布、ポリカーボネートフィルター等を用いて成し遂げら
れている。例えば米国特許第4,803,154号には「サンド
イッチ」型イムノアッセイが記載されており、それにお
いては反応性アルデヒド基を介して抗体を結合させるの
に利用できる規定された、且つ仕切られた親水性領域を
作り出すように疎水性シートを処理している。この検査
物質を含む検査サンプルを、免疫反応を介して検査物質
を捕獲する結合抗体を有する処理領域と接触させる。次
いで、検出手段がコンジュゲートされた別の抗体をこの
処理領域に加え、そして第一工程におけるシート上に固
定化した検査物質と結合させる。検出手段の実効を図る
と、検査サンプル中の検査物質の存在を測定することが
可能となる。この方法は「迅速」方法と述べられている
が、しかし事前のアッセイサンプル調製時間を含まず
に、60分から48時間完了するのにかかっている。
「ディップスティック」の如くの慣用のフォーマット
も開発されている。一例において、ポリビニルクロリド
シートに融着させたポリカーボネート検査膜を有する
「ディップスティック」フォーマットが、現場の条件で
使用可能なイムノアッセイ法を担うのに利用されてい
る。C.L.Pennyら、Journal of Immunology Methods 12
3:185−192（1989）。この方法においては、検査物質
は、そのディップスティックを検査サンプルの中に浸す
ことにより検査膜に結合させており、この検査サンプル
は流体でなくてはならない。第二の工程において、この
ディップスティックを、検査手段がコンジュゲートされ
ている抗体を含む溶液の中に浸し、その抗体は結合した
抗原性物質との免疫反応により固定される。最終工程に
おいて、検出手段の実効を図る。これはディップスティ
ックを適当な検査試薬を含む溶液に浸すことを含む。こ
のアッセイは完了するのに、事前アッセイサンプル準備
を含めずに１時間より長くかかると述べられている。
「サンドイッチ」型イムノアッセイの別の例において
は、第１抗体をマルチウェルの表層に結合させている。
S.Kodamaら、Journal of Immunological Methods 127:1
03−108（1990）。予め調製しておいた検査サンプルを
検出手段のコンジュゲートされている第２抗体を含む適
当なバッファーと混合し、次いでその組合せた溶液をプ
レートウェルに入れる。最終工程において、この検出手
段の実効を図る。それはウェルに適当な検出試薬を加え
ることにより成し遂げられる。次いで抗体−検査物質の
存在を決定する。記載のアッセイは完了まで50分かか
る。サンプルの準備時間は含めていない。
迅速、且つ、経済的であると主張されているその他の
イムノアッセイも知られているが（例えば、米国特許第
4,962,023号、米国特許第5,169,757号）、しなしながら
全て、検査サンプルを準備する時間を含めずに、アッセ
イが完了するのに少なくとも１時間かかるという制約を
有する。
より短い時間で足りるイムノアッセイ、例えばヒト絨
毛ゴナドトロピン（hCG）の検査を基礎とする妊娠につ
いての一般的に入手できるラテックス凝集検査も知られ
ている。かかる検査の一例はMonoclonal Antibodiesに
より製造され、そしてBaxter Scientific Products（Mc
Gaw,IL）により供給されているB.Clone（商標）hCGアッ
セイである。かかる検査は簡単であり、そしてhCGの検
査のために数分又は30分以内で足りる。これらの検査は
検査サンプルとして尿を利用するようにデザインされて
おり、これは検査物質の検査前の任意の準備を必要とし
ない。検査物質を含む検査サンプルがより複雑な場合、
例えば全血、排せつ物及び植物又は動物組織の場合、検
査サンプルの準備は独立した時間のかかる工程であり
得、これは信頼性のある、且つ正確な結果を得るのに必
要な時間及び労力を多大にしうる。このような状況下で
は、似たような時間で完了でき、且つ、抽出工程を検査
物質の検査工程と一緒にできるイムノアッセイが、時間
及び労力の双方において長所を供するであろう。
いくつかのイムノアッセイは単独のインキュベーショ
ン工程のみを必要とするように開発されてもいる。かか
るイムノアッセイは「同時」イムノアッセイとして知ら
れる。かかるアッセイの一例は米国特許第4,376,110号
に記載されている。かかるアッセイにおいて、固相支持
体に結合した抗体を、検出手段のコンジュゲートされた
別の抗体と同時に検査サンプルとインキュベートする。
米国特許第4,376,110号に記載の別のタイプのイムノア
ッセイは「リバース」イムノアッセイであり、これはま
ず検出手段のコンジュゲートされている抗体、次いで固
相支持体に結合した抗体の添加が続く、液体検査サンプ
ルへの段階的添加を含む。かかるイムノアッセイは操作
のし易さを供するが、しかし未調製の検査サンプル中の
妨害物質の潜在的な存在に基づいて悩まされる。更に、
かかるイムノアッセイにおいては液相の中で抗体−抗原
反応が起こるため、液体検査サンプルが必要とされる。
かかる「同時」又は「リバース」イムノアッセイは、液
体検査サンプルから捕促された抗体−検査物質複合体を
除去する追加の分離及び洗浄工程をも必要とする。「同
時」又は「リバース」イムノアッセイの更なる例は米国
特許第5,011,771号に見い出され、ここでイムノアッセ
イの前に検査サンプルを準備する必要性、及び液体検査
サンプルから捕促された抗体−検査物質複合体を分離す
る必要性は、追加の沈降及び遠心工程を必要とする。そ
れ故、実験設備を必要としうる追加の工程の必要性は非
実験室条件下でイムノアッセイを実施するためのかかる
方法の有用性を制約しうる。
細菌及びウィルスについてのその他のイムノアッセイ
が米国特許第5,169,789号に記載されており、これは短
時間で実施でき、そして同時での検査サンプルの溶解及
び抗体反応を含む。このイムノアッセイはサブマイクロ
メーターの孔径を有するニトロセルロース膜を利用し、
そこでは、サンプリング手段から捕促膜に至る検査物質
含有液の流れは、任意的な下層吸収層により助長される
拡散に制約されている。かかるイムノアッセイは単独ア
ッセイにおける多重検査物質についての検査結果の同時
目視決定を可能とするように物理的に配置できず、その
理由は膜材料の制約された流速及び不透明な性質によ
る。米国特許第4,366,241号及び米国特許第5,006,464号
に開示の如くのサブマイクロメーターサイズの孔を有す
るニトロセルロースに基づくその他のイムノアッセイは
類似の欠点を有する。
本発明は高感度、高信頼性、及び経済的であり、そし
て完了するのに、検査サンプルの準備時間及び１又は複
数種の検査物質の検査手段の実効を図る時間を含めて60
秒ほどの短さで足りるイムノアッセイを提供する。本発
明は検査サンプルの中に存在しうる様々な検査物質の迅
速な検査が可能なイムノアッセイに関する。本発明の一
の特徴は、検査物質の抽出又は単離を第１抗原−検査物
質複合体の形成と同時に行うことにある。この第１抗原
−検査物質複合体を、迅速、且つ有効な検査を助長する
多数の隙間空間を有する大容積を形成できるよう三次元
において有意義な寸法を有する固相フォーマットの中に
捕促させる。更に、単一の検査サンプルの中の複数の検
査物質の同時検査を可能にする多層アレンジメントの固
相フォーマットを有するイムノアッセイを提供する。こ
の多層アレンジメントは検査サンプルの中に存在する検
査物質の量の半定量的な決定のためにも利用される。本
発明のイムノアッセイは多種多様な環境条件で有効であ
り、そして実験室設備がなくても利用できるに足りるほ
どに簡単である。本発明はタンパク質、病原性、特異的
な抗原、特異的な抗体、ハプテン、環境の中の化学物
質、又は抗体の得られうる任意のその他の物質の検査の
ために利用できうる。本発明により包括される固有の方
法は資源又は時間に付随する費用を伴うことなく、一層
改善された検査方法の感度を保持している。このイムノ
アッセイを実施するためのキットも述べる。
本発明は植物材料の如く所望の検査サンプル中の検査
物質を迅速に検査するのに利用できる免疫収着アッセイ
に関する。検査物質は多種多様な分子又は化合物であっ
てよく、それには抗体、抗原、ハプテン、有機化学、タ
ンパク質、酵素、ホルモン、炭水化物、脂質、巨大分
子、ポリマー；植物、昆虫、哺乳動物もしくは任意のそ
の成分の細胞；ウィルス、ウィルスサブユニット、毒
素、医薬品、アレルゲン、微生物、例えば細菌、菌類、
酵母、マイクロプラズマもしくはその任意の成分、又は
免疫反応性であるもしくはそのようにすることのできう
る任意の検査物質が含まれる。
成分は任意の単細胞又は多細胞生物から調製又は誘導
した任意の細胞性又はサブ細胞画分である。例えば、細
胞膜の粗又は精製調製品はサブ細胞画分であってよく、
又は免疫反応性であるものもしくはそのようにすること
のできるものであってよい。同様に、細胞の調製品を単
離組織から調製してよく、そしてそれは免疫反応性であ
るか、又はそのようにすることできる細胞性画分であっ
てよい。成分は単離組織から、中間的な細胞分画工程の
必要性抜きで誘導されたサブ細胞性画分であってもよ
い。更に、成分は精製又は粗製のいづれかである細胞又
は組織の化学的又は生化学的画分であってよく、又は免
疫反応性にすることのできるものであってよい。
このアッセイにおける免疫吸着力は、検査物質を認識
し、中心成分として前記検査物質を有している「サンド
イッチ」又は複合体を作り出す複数の抗体又は抗原によ
り提供される。抗体はイムノグロブリンと呼ばれるタン
パク質のファミリーの構成員であり、これは免疫原と特
異的に結合できる。イムノグロブリンは種々のタンパク
質群であり、そしてIgG,IgM,IgA,IgD及びIgEと呼ばれる
クラスのアイソタイプとして哺乳動物において見い出さ
れている。抗体は一般に、抗原の結合する可変領域、並
びにアイソタイプ及び種特異性である定常領域を有す
る。抗原は抗体の可変領域により免疫学的に認識され、
その結果としてそれに結合する物質又は物質の必須部分
と定義される。
検査サンプル中の検査物質の検査のためのイムノアッ
セイは下記の工程を含んで成る： （ａ）検査サンプルの抽出物を、この抽出物の中の前記
検査物質を免疫学的に認識する第１抗体の存在下で調製
し、これにより第１抗体−検査物質を形成する、ここで
前記第１抗体は検出手段にコンジュゲートされている； （ｂ）前記検査物質により免疫学的に認識される所望の
抗原、又は前記検査物質もしくは工程（ｃ）の第３抗体
のいづれかを免疫学的に認識できる第２抗体を結合させ
ることによって、多数の隙間空間を有する大容量を形成
するように三次元方向において有意義な寸法を有する固
相フォーマットを調製する； （ｃ）任意的に前記第２抗体に第３抗体を免疫学的に結
合させる、ここでこの第３抗体は前記検査物質も認識す
る； （ｄ）工程（ａ）の前記抽出物を、前記工程（ｂ）又は
工程（ｃ）で調製したフォーマットと組合せ、これによ
り前記抽出物を前記第１抗体−検査物質複合体を捕促す
る前記調製した固相フォーマットの隙間空間に流す； （ｅ）前記捕促された第一抗体−検査物質複合体の存在
により前記検査物質を検査する； 工程を含んで成る。
本発明のイムノアッセイにおける第一工程はExLISAバ
ッファー系を用いる、第１抗体−検査物質複合体の同時
形成の伴う、検査サンプルからの検査物質の抽出を含
む。この第１抗体は前記検査物質に免疫学的に結合させ
るべき第１リガンドである。この第１抗体はそれにコン
ジュゲートした検出手段を有する。様々な検出手段が当
業界において公知であり、そして以降に説明する。
本発明のイムノアッセイにおける第２工程は、固相フ
ォーマットに結合した適当なアフィニティーリガンドに
よる第１抗体−検査物質複合体の物理的捕促を含む。適
当なアフィニティーリガンドは検査物質の種類に依存
し、そして一般に検査物質に免疫学的に結合することが
できるものである。検査物質の種類に依存して、適当な
アフィニティーリガンドは第２抗体（相補性抗原又はそ
の他の相補性抗体の捕促のため）又は抗原（その相補性
抗体の捕促のため）のいづれでもよい。本発明において
は、この固相フォーマットは孔質であり、そして多数の
隙間空間を保有する大容量を形成するよう三次元におい
て有意義な寸法を有する。この適当なアフィニティーリ
ガンドを固相フォーマットに結合させておく。「固相フ
ォーマット」とは、イムノアッセイの捕促媒体を構成す
るマトリックスの物理的な構造又はアレンジメントを意
味するために用いている。任意的に、イムノアッセイに
おいて検出すべき検査物質が抗原であるとき、第３抗体
を加えてよい。この第３抗体はこの固相フォーマットに
結合した第２抗体により免疫学的に認識されるであろ
う。この第３抗体は検査物質をも免疫学的に認識するで
あろう。このようにして調製した固相捕促フォーマット
は高められた感度を有し、その結果、第３抗体抜きで調
製した固相捕促フォーマットよりも優れた検出レベルを
有する。
本発明のイムノアッセイにおける第３工程は、固相フ
ォーマットに付加された適当なアフィニティーリガンド
により捕促される第１抗体−検査物質の検査を含む。こ
のことは、物理的捕促により形成されるアフィニティー
リガンド−検査物質−第１抗体複合体に結合したままで
ある第１抗体にコンジュゲートされている検出手段によ
り供される。
本発明により供される迅速検出は、１）所望の検査サ
ンプルからの検査物質の抽出、及び２）この第１抗体へ
の前記検査物質の結合を双方同時に実施することにより
ある程度達成される。
検査サンプルからの検査物質の抽出及び第１抗体−検
査物質複合体の形成の双方を同時に行わせることの組合
された有用性を達成せしめるため、抽出方法の必要とさ
れる強度と、抗体−抗原結合の繊維さとのバランスをと
らせるバッファー系を作り上げることが必要である。
「ExLISA」なる語は、検査サンプルからの検査物質の抽
出にとって必要な成分を、ELISAで見い出されるものと
似たようなイムノアッセイを実施するのに必要な成分と
組合せる固有のバッファー系を意味することに利用され
ている。ExLISAバッファー系の開発は、抗体−抗原結合
にとって阻害性である典型的な抽出バッファーに存在す
る障害、例えばジチオスレイトール（DTT）の如くのス
ルフヒドリル還元剤の組込みを解決する。更に、ExLISA
バッファー系は、それらが満足たる検査サンプル抽出に
影響を及ぼさない点で、典型的なイムノアッセイバッフ
ァーに存在する追加の問題を解決する。従って、このイ
ムノアッセイ手順は、第１抗体−検査物質結合反応を慣
用の方法よりもはるかに短い時間で可能にするExLISAバ
ッファー系により強化される。ほとんどのケースにおい
て、検査サンプルの抽出を含む完全なイムノアッセイは
約１分間で完了しうる。検査サンプルからの検査物質の
抽出と第１抗体−検査物質複合体の形成とを同時に行う
ため、得られるExLISAバッファー系は一般のイムノアッ
セイバッファー系よりも短い反応時間を有し、そしてそ
れは採用した抗体の能力によってのみ制約される。
本発明のExLISAバッファー系は検査サンプルから検出
すべき検査物質の最適抽出及び最適第１抗体−抗原結合
の双方を単一工程で行うことが可能である。ExLISAバッ
ファー系はpHをコントロールするためのバッファー、界
面活性剤、塩、キレート剤、安定化剤、フェノール系化
合物インヒビター、プロテアーゼインヒビター、及びこ
のアッセイにおいて用いたどの抗体によっても認識され
ないタンパク質を含んで成る。
ExLISAバッファー系のために選定されたバッファーは
検査サンプルからの検査物質の抽出及び第１抗体−検査
物質複合体の最適形成の両者にとって適切でなくてはな
らない。好適なバッファーはpHを約6.5〜約9.0、好まし
くは約7.5〜約8.5に維持する無機型のものである。最適
第１抗体−検査物質複合体形成はこの範囲内で起こり、
そしてほとんどの検査物質の溶解性がこの範囲内で最適
ともなる。バッファーの好適な濃度域は約10mM〜約200m
M、より好ましくは約25〜約100mMであり、そして高すぎ
て第１抗体−検査物質複合体の形成を阻害することなく
適切な緩衝能を供するに足りるものであるべきである。
一の好適な態様において、このバッファーは50mMの炭酸
ナトリウムpH8.5とする。
抽出工程の際の細胞性材料の溶解を助長するために適
当な界面活性剤をExLISAバッファー系に加える。この濃
度は細胞性材料の溶解度が界面活性剤の変性作用とつり
合うように慎重に選定すべきであり、そして好ましくは
約0.01〜約0.2％（w/v）、より好ましくは約0.01％〜約
0.1％（w/v）とする。更に、好適な界面活性剤は第１抗
体−検査物質複合体の形成を阻害しないよう非イオン性
タイプである。適当な界面活性剤はTRITON（商標）Ｘ−
100非イオン界面活性剤、TWEEN（商標）20非イオン性界
面活性剤、NP−40又はMEGA−８から選ばれうる。本発明
の一の態様において、この界面活性剤は0.05％（w/v）
のTRITON（商標）Ｘ−100とする。
ExLISAバッファー系に含ませるための塩の適切な濃度
は、第一抗体−検査物質複合体の最適な形成を供するよ
うに選ぶ。生理食塩水溶液は約25mM〜約175mM、より好
ましくは約100mM〜約175mMに範囲する濃度で使用するこ
とが好ましい。好適な塩は塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム等から選ばれうる。本発明の一の態様において、この
塩は140mMの濃度の塩化ナトリウムとする。
検査サンプルからの検査物質の抽出により遊離される
２価以上の正電荷を有する多価イオンを除去するため、
ExLISAバッファー系にキレート剤も利用すべきである。
生物又は環境検査サンプルの中に存在しうるこのキレー
ト剤により除去される多価イオンはCa2+,Mg2+,Zn2+,Al
3+等でありうる。多価イオンの除去は溶液中でのタンパ
ク質の沈殿を防ぐ。このキレート剤は約0.5mM〜約10m
M、より好ましくは約1mM〜約5mMの範囲の濃度で存在し
ていることが好ましい。適当なキレート剤はEDTA（エチ
レンジアミン四酢酸）、EGTA（エチレングリコール−ビ
ス（β−アミノ−エチルエーテル）N,N,N′−四酢
酸）、等から選ばれうる。本発明の一の態様において、
このキレート剤は5mMのEDTAとする。
第１抗体−検査物質複合体及び第１抗体にコンジュゲ
ートされた検出手段の安定性及び活性を維持するために
安定化剤をExLISAバッファー系に加える。安定化剤の濃
度は、第１抗体−検査物質複合体の形成をスローダウン
させないよう重要である。好適な安定化剤はアガー、ア
ガロース、ポリエチレングリコール、グリセロール、エ
チレングリコール等である。安定化剤の好適な濃度は約
0.01％〜約20％（w/v）、より好ましくは約１％〜約10
％（w/v）とする。本発明の一の態様において、この安
定化剤は１％（w/v）のポリエチレングリコール（３キ
ロダルトン）とする。
検査サンプルからの検査物質の抽出により溶液の中に
遊離するフェノール系化合物を除去するため、フェノー
ル系化合物インヒビターをExLISAバッファー系に加え
る。フェノール系化合物はタンパク質を沈殿させ、検査
物質の溶解及び第１抗体−検査物質複合体の形成を妨害
する。好適なフェノール系化合物インヒビターには、ポ
リビニルポリピロリドン（PVPP）として知られる不溶性
高分子量架橋形態のポリビニルピロリドン、ホウ酸ナト
リウム又はポリエチルイミンが含まれる。フェノール系
化合物インヒビターの好適な濃度は約0.01％〜約１％
（w/v）、より好ましくは約0.05％〜約0.5％（w/vであ
る。本発明の一の態様において、PVPPは0.15％（w/v）
の濃度で使用する。
検査サンプルからの検査物質の抽出により遊離される
プロテアーゼによるタンパク質の消化を防ぐため、ExLI
SAバッファー系にプロテアーゼインヒビターを加える。
かかるプロテアーゼは第１抗体及びタンパク質性検査物
質を破壊できる。セリン−、システイン−又はアスパラ
ギン酸型プロテアーゼのいづれかを阻害するプロテアー
ゼインヒビターがExLISAバッファー系に含ませるのに適
当である。適当なプロテアーゼインヒビターはPEFABLOC
（商標）、PMSF（フェニルメチルスルホニルフルオリ
ド）、TLCK（Ｎ−トシル−Ｌ−リジンクロロメチルケト
ン）、TPCK（Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロ
メチルケトン）、α−カプロン酸、ロイペプチン、ベン
ズアミド、アンチパイン又はペプスタチンである。プロ
テアーゼインヒビターの好適な濃度は約0.01mM〜約1m
M、より好ましくは約0.1mM〜約0.5mMである。本発明の
一の態様において、PEFABLOC（商標）プロテアーゼイン
ヒビター（Boehringer Mannhein）を0.5mMの濃度で使用
する。
このアッセイにおいて用いられるどの抗体によっても
認識されないタンパク質もこのExLISAバッファー系の中
に存在させてよい。認識されないタンパク質は検査サン
プルの抽出により遊離される分子又は化合物による非特
異的な結合の免疫学的ブロッキングを可能にする。この
認識されないタンパク質は、検査サンプルの抽出により
遊離されるその他のタンパク質よりも高い濃度で外的に
供給せしめることにより、プロテアーゼ攻撃に対するタ
ンパク質の更なる保護をも供する。適当な認識されない
タンパク質は牛血清アルブミン（BSA）、オバルブミ
ン、カゼイン又は胎児牛血清である。認識されないタン
パク質の好適な濃度は約0.05％〜約５％（w/v）、より
好ましくは約0.1％〜約２％（w/v）である。本発明の一
の態様において、BSAを0.5％（w/v）で加える。
最大の便宜、使用抗体の経済性及び一連の用途にとっ
て、検査サンプルをExLISAバッファー系により最少限の
容量で抽出することが所望される。即ち、この抽出は小
さな試験管、遠沈管又は任意の類似の小型容器の中で実
施してよい。検査サンプルからの検査物質の抽出はガラ
ス棒、乳棒、ボルテキシング、音波処理、ホモジネーシ
ョン又は検査サンプルの一体化の破壊を助長する任意の
その他の物理的力により促進されうる。更に、ガラスビ
ーズ、カルボランダム、シリカ又は任意のその他の粗い
材料を、検査サンプルの一体化の破壊を更に助長するよ
うに加えてよい。一の例において、プラスチックマイク
ロ遠沈管及び対合乳鉢組合せであって組織の混合及び抽
出にとって幅広く利用されているものが本発明における
利用にとって適当であることが見い出された。
本発明のその他の固有の特徴は、ExLISAバッファーを
用いての検査サンプルからの検査物質の抽出の際に形成
される第１抗体−検査物質を捕促するために用いる固相
フォーマットである。当業界で一般的に用いられている
「固相」は、マイクロタイタープレート又はチューブ壁
の非孔質表層及びニトロセルロースのへりの孔質表層を
意味する。それ故、当業界におけるイムノアッセイの固
相は、本質的には二次元特性を有する捕促媒体を述べて
いる。本明細書で用いる「固相フォーマット」は、本発
明のイムノアッセイの捕促媒体を構成するマトリックス
の物理的組織又はアレンジメントを意味する。従って、
「固相フォーマット」なる語は本明細書では、本発明
を、当業界に存在している「固相」を利用するものと区
別するために使用している。
検査サンプルは最少量のExLISAバッファーで抽出する
ことが好ましいが、固相フォーマットは、それが第１抗
体−検査物質複合体の効率的な捕促のために適当である
ことを必要とする。使用する固相フォーマットは、大容
量を形成し、それ故検査サンプルの抽出物がくぐり抜け
ることのできる多数の隙間空間内に大きな有効表面積が
供される三次元の有意義な寸法を有さなくてはならな
い。更に、第１抗体−検査物質複合体にとっての捕促媒
体として利用される固相フォーマットは液体が全体にわ
たって活発、且つ迅速に流れるに足りるほど多孔性であ
るべきである。このことは、固相フォーマットが、サブ
ミクロン域ではなく、マイクロメーター域又はそれより
大きい孔径を有することを要する。この高多孔性三次元
「フォーマット」は本発明の迅速イムノアッセイにおけ
る第１抗体−検査物質複合体の極めて有効な捕促を可能
にする。この固相フォーマットの孔質及び物理学的配置
の更なる長所は、特にチップ配置において（図１参
照）、粒子の除去を行う濾過又は遠心工程の利用を必要
としないこと等にある。この粒子は組織の抽出において
形成することがあり、慣用の固相のサブマイクロメータ
ーサイズの孔を閉塞してしまいうる。
本発明に従って仕上げることができ、且つ適当な固相
フォーマットとして使用できうる数多くの材料が入手で
きる。これらの材料の一部はセルロースアセテート、ポ
リエステルコート化ポリスチレン、セルロース、ニトロ
セルロース及びナイロンである。一の好適な態様におい
て、セルロースアセテートファイバーより成り、そして
Hydros,Inc.,Falmouth,MAより入手できるACT−10（商
標）シリンダーフィルターを固相フォーマットとして利
用する。このACT−10（商標）は約4mmの直径及び約6mm
の高さを有し、約20〜30マイクロメーターの孔サイズを
有するシリンダー形態である。いくつかの例を以下に示
し、それにおいてはACT−10（商標）を固相フォーマッ
トとして使用している。
別の好適な態様において、ポリスチレンでコーティン
グされたポリエステルより成り、且つAmerican Filtron
a,Richmond,VAより入手できるシリンダー状フィルター
を固相フォーマットとして使用する。このフィルター
も、直径約4mm及び高さ約6mmを有し、且つ約20〜30マイ
クロメーターの孔サイズを有するシリンダー形態であ
る。この固相フォーマットは一定のイムノアッセイにと
ってのセルロースアセテートより優れていることがあ
り、なぜならポリスチレンコーティングは共有結合にと
って使用される官能基の量を増大させることを担うから
である。ポリスチレンでコーティングされたポリエステ
ルははるかに強められた物理的保全力も有する。セルロ
ースアセテートより成る固相フォーマットに比べての更
なる利点において、ポリエステルの利用は抗体を共有結
合させ、冷凍保護剤で乾燥し、次いで使用時まで保存す
ることを可能にする。水分の吸収力に基づき膨張及び収
縮するセルロースアセテートはドライ条件下で15ヶ月間
保存できる。ポリスチレン固相フォーマットでコーティ
ングされたポリエステルを本明細書に記載のアレンジメ
ント及びアッセイの全てにおいて使用しており、セルロ
ースアセテートにより得られるものと同等又は優れたア
ッセイ結果をもたらしている。
選定の固相フォーマットはそれに適当なアフィニティ
ーリガンドを組合させることによって本発明のイムノア
ッセイに利用するための準備をしなくてはならない。第
１抗体−検査物質複合体を捕促する能力を供するのは固
相フォーマットへのアフィニティーリガンドの結合であ
る。本発明の一の態様において、適当なアフィニティー
リガンドを固相フォーマットに、まず固相フォーマット
上のアルキル化を介してアミノ結合基を作り上げること
によって結合させる。適当なアルキル化剤はアルデヒド
及びＮ−マレイミドである。固相フォーマットを調製し
たら、次に第２抗体を化学反応性アミノ基を介して固相
フオーマツトに共有結合させる。アルデヒドの場合、可
逆性シッフ塩基をアルデヒド基と第２抗体上のアミノ基
との間で形成させる。次にこの結合を低濃度のナトリウ
ムシアノボロハイドライドによる還元アルキル化を介し
て安定化させる。このようにして調製した固相フォーマ
ットを第１抗体−検査物質複合体の捕促のために利用で
きうる。
他方、第１抗体−検査物質複合体の捕促の前に、第３
抗体を第２抗体に免疫学的に結合させてよい。この第３
抗体は検査物質を免疫学的に認識し、それに免疫学的に
結合し、そしてそれ故第１抗体−検査物質複合体を捕促
するようなものとして選ぶ。
本発明の別の態様において、この固相フォーマットは
まず反応性アルデヒド基を作り上げるように上記の通り
に調製する。調製できたら、ストレプトアビジンを反応
性基に共有結合させ、次いで低濃度のナトリウムシアノ
ボロハイドライドで還元させる。このようにして調製し
た固相フォーマットを、第１抗体−検査物質複合体に結
合しているビオチンラベル化第２又は第３抗体の捕促の
ために利用する。
本発明の更なる態様において、固相フォーマットを上
記の通りにして調製する。調製できたら、適当な抗原を
選定の抗原の化学的性質に適する手段を介して固相フォ
ーマットに共有結合させる。この固相フォーマットを、
結合抗原を認識する抽出物中の抗体の捕促のために使用
してよい。
アフィニティーリガンドを固相フォーマットに共有的
な状態で結合させることは本発明の必要要件ではない。
抗体、その他のタンパク質及び多くの抗原は静電力又は
その他の分子間力を通じて固相フォーマット収着させる
ことができる。このようにして調製した固相フォーマッ
トは、検査サンプル中に存在している検査物質を捕促す
るうえで同等に有効である。しかしながら、アフィニテ
ィーリガンドと固相フォーマットとの間の結合の長期安
定性は危険な場合があり、その理由はかかる結合は共有
結合よりも弱いからである。
このようにして調製した固相フォーマット−アフィニ
ティーリガンド複合体を、ExLISAバッファー系による検
査サンプルの抽出を介して得られる第１抗体−検査物質
複合体を捕促するのに用いる。本発明は現存の方法と比
べたときに固有の捕促方法を提供する。第１抗体−検査
物質複合体の捕促は、本発明のイムノアッセイに用いる
適当なアフィニティーリガンドが結合している固相フォ
ーマットの隙間空間を通じて適当な容量の抽出物を流す
ことにより行う。孔質固相フォーマットにより供される
大きな有効表面積を介する適当な容量の抽出物を流すこ
とは、第１抗体−検査物質複合体の極めて有効な捕促を
提供する。
本発明の一の態様において、固相フォーマットをプラ
スチックピペットチップの中に、その固相フォーマット
が図１に示しているようにチップの内周全体に対して密
着するように押し付けて収納する。これは、本質的に低
容量「クロマトグラフィー」カラムをもたらす。ExLISA
バッファーを用いて検査サンプルから調製した抽出物を
標準のピペッターを用いてピペットチップに流し入れる
と、その抽出物は固相フォーマット全体に流れる。この
アレンジメントは適当なアフィニティーリガンドの結合
した非常に大きな表面積を供し、ExLISAバッファー系を
利用する検査サンプルからの検査物質の抽出の際に形成
される第１抗体−検査物質複合体の迅速、且つ動的な捕
促を可能にする。このことは、20μｌ未満の比較的少容
量の抽出調製物の利用を可能とし、同時に約10μｇ以上
の検査物質の結合能を供する。低容量及び高結合能の固
有の組合せは第１抗体−検査物質複合体の高濃度回収を
可能にする。
この固相フォーマットはアイ・ドロッパー・バレル及
びシリンジバレルの双方においても、同等の結果をもっ
て採用されうる。更に、アイ・ドロッパー及びシリンジ
アレンジメントの双方は、接続バルブ又はプランジャー
による吸引及び排出を更なる機械装置を必要とすること
なく、可能にする。双方のアレンジメントは第１抗体−
検査物質複合体の捕促のための大きな固相フォーマット
の利用も可能とし、これは増大した濃度の抗体の共有結
合、その結果としての増大した量の検査物質の捕促を可
能にする。
採用できるその他のアレンジメントは、小さなろう斗
型において開放端を有するウェルをもつ96穴マイクロプ
レート鋳型、例えばPolyfiltronics,Inc.,Rockland,MA
より入手でき、且つ商品名FILTAPLATE（商標）で市販さ
れているものでありうる。このマルチウェルプレート
は、マイクロプレートの上からろう斗を介し、マイクロ
プレートの下方のリザーバーに至るまで真空を導くこと
も可能にする小型の真空ユニットに収納してよい。上記
のポリスチレンコート化ポリエステル固相フォーマット
であってその強固な物理的保全性を理由にこのアレンジ
メントに極めて適合するものをマルチウェルプレートの
各ウェルの中に、固相フォーマットがウェルの内壁の周
囲に密着するようにして置く。96の検査サンプルまで単
独アッセイで操作できうる。このアレンジメントは検査
物質の定量的、且つ定性的な測定の双方を、使用した検
査手段により可溶性又は不溶性反応生成物のいづれが生
成されるかを選択することに依存して、可能にする。本
発明に係るこのような迅速イムノアッセイの定量バージ
ョンは固相フォーマットに共有結合した第２又は第３抗
体を採用し、それはマルチウェルプレートのウェルの中
に入れる。次いで検査サンプルを適当な第１抗体−酵素
コンジュゲートを含むExLISAバッファー中で抽出し、そ
してウェルに加える。次いでポリエステルフィルター要
素を含むウェルにわたって真空を適用する。このウェル
を真空により洗浄し、そして不溶性反応生成物を生成す
る基質を加え、そして真空により除去する前に捕促され
た検査物質複合体に結合した酵素と反応させる。その結
果としての比色検査は検査物質の存在の定性的な目視検
査を可能にする。
このアレンジメントを基礎とする迅速イムノアッセイ
の定量バージョンは２つの例外を除き、上記の定性バー
ジョンと同一である。第１に、マイクロプレートを収納
する真空装置の第2 96穴マイクロプレートの真下での且
つ第１プレートとインラインでの追加を許容するように
改良し、これにより第１マイクロプレートの各ウェルが
第２マイクロプレートの対応のウェルの真上にくるよう
にする。この第２プレートはELISA式アッセイのために
利用される任意の慣用の96穴プレートであってよい。ウ
ェル中での固相フォーマットによる検査物質の捕促及び
その後の洗浄の後、第２プレートを改良真空装置に設置
する。可溶性反応生成物を生成する酵素基質をウェルに
加え、次いで反応生成物を含む溶液を第２マイクロプレ
ートに流し入れる前に検査物質複合体と反応させる。次
いでこの第２マイクロプレートを除去し、そして得られ
る溶液の定量分析のための任意のマイクロプレートリー
ダーの中に設置する。類似の調製固相フォーマットを含
むその他のウェルにおける一般的に標準曲線対比を行う
ことにより、非常に特異的、且つ高感度な定量分析を迅
速、且つ信頼性をもって実施できる。このアレンジメン
トは後にビオチンでラベルされた第１抗体に複合させる
ストレプトアビジンにコンジュゲートされた蛍光マーカ
ー及び第１抗体にコンジュゲートされたアルカリ性ホス
ファターゼ用のケミルミネッセンス基質の双方の利用を
可能にする。得られる感度は、ピペットチップアレンジ
メントにおいてセルロースアセテート固相フォーマット
を利用することにより可能な感度よりも、少なくとも10
00倍優れている。
適当なアフィニティーリガンドの結合により固相フォ
ーマットが調製できたら、それは多層アレンジメントに
おいてその他の類似の調製した固相フォーマットと組合
せてもよい。この多層アレンジメントは一回の抽出で複
数種の第１抗体−検査物質複合体の検出を可能にする。
このアレンジメントは一回のアッセイ工程において陽性
及び陰性コントロール結果を決定を可能にする陽性又は
陰性コントロール層の一体化を可能にもする。一回のア
ッセイで１より多くの種類の検査物質を検出するのに利
用するとき、このExLISAバッファー系は検査サンプル中
で検出される一連の検査物質に特異的である様々なコン
ジュゲート化第１抗体を含むように改良されるであろ
う。
多重固相フォーマットを利用することができ、このフ
ォーマットは、例えば、低、中及び高レベルの検査物質
に対応するであろう複数の固相フォーマットのそれぞれ
に第２及び／又は第３抗体をレベルを増やして結合させ
ることにより、半定量的なイムノアッセイを提供でき
る。検査サンプル中に存在する検査物質のレベルに依存
して、第１（低）の、第２（中）の又は第３（高）の調
製した固相フォーマットは、利用した検出手段に従って
陽性の反応を示すであろう。
捕促した第１抗体−検査物質複合体の検出、それ故検
査サンプル中の検査物質の有無の決定は当業界に公知で
ある多種多様な方法を通じて成し遂げられうる。イムノ
アッセイの検出の一般的及び特殊な原理を説明する有用
な文献はE.Harlow and D.Lane,Antibodies,A Laborator
y Mannal,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,19
88又はE.T.Maggio編、Enzyme−Immunoassay,CRC Press,
Florida,1980に見い出せる．両文献とも引用することで
本明細書に組入れる。
検出技術は直接及び間接法は分けることができる。直
接法においては、第１抗体は検出手段をそれにコンジュ
ゲートさせることによりラベルする；次いで第１抗体を
検査物質に直接結合させるのに利用する。直接法におい
て有用なかかる検出手段の例は放射性ヨウ素、発色原基
質を利用する様々な酵素、ビオチン、蛍光団、金属、例
えばコロイド状金、又は放射性アミノ酸前駆体の存在下
での第１抗体の生合成である。間接法においては、第１
抗体はいづれの検出手段にもコンジュゲートさせない。
その代わり、検査物質に対するその結合能を第二試薬に
より、例えばラベル化抗イムノグロブリン抗体又はラベ
ル化プロテインＡを用いて検出する。
検出手段の選定は、アッセイ条件、使い易さ、試薬の
入手性、試薬の安定性及び必須のアッセイ感度に依存す
る。本発明において好適なのは検出手段としての直接法
の利用である。有用な直接法に対する広い一般論とし
て、検出手段としての酵素ラベルは簡単な目視結果の利
点を供し、そして優れた感度はそれらを定量アッセイに
とって有用なものとするが、しかし定量アッセイにおい
て使用するのは一層困難であり、その理由は反応速度を
精度をもって測定する必要性にある。第１抗体の放射性
ヨウ素ラベリングは著しく正確な定量結果をイムノアッ
セイ手順において供するが、しかし厳格な安全な手順が
その利用によって必要とされる。蛍光団は、たとえそれ
らがイムノサイトケミストリーの如くの用途において高
解像度を供するにしても、紫外光励起手段及びフルオリ
メトリー又は蛍光顕微鏡による検出も必要とする。金属
ラベル、例えば金コロイドは数多くの有用な方式におい
て一層幅広く有用となりつつある。金は生物学的に不活
性であり、そして良好な電荷密度を有し、それが第１抗
体上の帯電基に容易に結合するようにする。
本発明の好適な一の態様において、酵素は検出手段と
して第１抗体にコンジュゲートさせる。抗体は酵素への
共有結合によって容易にラベルできる。例えば、S.Avra
meas,Enzyme Markers:Their linkage with proteins an
d use in immuno−histochemistry,Histochem.J.4:321
−330,1972を参照のこと。酵素反応は検出シグナルを本
質的に増幅させるため、かかるコンジュゲートは極めて
高感度でありうる。検出レベルはピコモルの域ほどに低
いことがある。
多種多様な酵素が抗体とラベルするのに使用されてい
る。最も一般的に使用されているのは西洋ワサビペルオ
キシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びβ−ガラクト
シダーゼである。ウレアーゼ及びグルコースオキシダー
ゼも限定されて利用されている。検出手段としての利用
にとって理想的な酵素は安価であり、非常に安定であ
り、そしてコンジュゲートし易いものであるべきであ
る。理想的な酵素は高触媒活性を有し、且つ可溶性の生
成物及び不溶性の生成物の双方を供する一連の基質と反
応もすべきである。本発明の好適な態様において、牛小
腸アルカリホスファターゼを検出手段として利用する。
しかしながら、数多くの検出方法が存在し、そして任意
のいくつかの検出方法が利用できることが本発明の範囲
に包括されることと解されるべきである。
検出手段のコンジュゲーションは当業界に公知であ
る。酵素はいくつかの一般的な方法のいづれかによって
第１抗体にコンジュゲートさせることができうる。グル
タルアルデヒド法においては、グルタルアルデヒドは酵
素及び第１抗体に、各タンパク質上に有用な反応性アミ
ノ基を介して結合する。例えば、S.Avrameas,Coupling
of enzymes to proteins with glutaraldehyde,Immunoc
hemistry6:43−52,1969を参照のこと。過ヨウ素酸塩法
においては、炭水化物の過ヨウ素酸処理は環構造を開
き、そしてこれらの成分がタンパク質上に存在している
遊離なアミノ基に結合することを可能にする。例えば、
P.K.NakaneとA.KawaoiのPeroxidase labeled antibody:
A new method of conjugation,J.Histochem.Cytochem.2
2:1084−1091,1974を参照のこと。酵素上のアミノ基の
コンジュゲーションはSPDP（Ｎ−スクシニミジル−３−
〔２−ピリジルジチオ〕プロピオネート）との反応、還
元及びピリジルジスルフィド架橋の形成を介して抗体上
に導入したチオール基に共有結合させてもよい。A.J.Cu
mberら、Preparation of antibody−toxin conjugates,
Methods Enzymol.112:207（1985）。本発明におけるア
ルカリホスファターゼのコンジュゲーションの好適な方
法はグルタルアルデヒド法である。
他方、第１抗体にコンジュゲートさせた検出手段はい
く種かの蛍光団のいづれかであってよい。４種の蛍光
団、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレット及び
フィコエリセリンが一般的に利用されている。蛍光団は
DMSO（ジメチルスルホキシド）の中での塩化アンモニウ
ムとの反応により第１抗体にコンジュゲートさせる。例
えば、J.W.Goding.Conjugation of antibodies with fl
uorochromes,J.Immunol.Methods 13:215−226,1976を参
照のこと。本発明の一の好適な態様において、フルオレ
セイン（FITC）又はローダミン（TRITC）のイソシアネ
ート誘導体を使用する。
酵素検出手段にとっての基質は可溶性又は不溶性反応
生成物のいづれかを生成しうる。不溶性酵素反応生成物
は、反応後に固相フォーマット内に残る利点を有する。
このことはイムノアッセイの結果の目視観察を可能にす
る。不溶性反応生成物の利用は本態様における個別に調
製したフォーマットの積層を可能にする利点も有する
（図１参照のこと）。反応生成物の不溶性はある層から
隣りの層への漏出を阻止し、多重第１抗体−検査物質複
合体又は半定量分析についての同時アッセイを可能にす
る。他方、使用する基質が可溶性酵素反応生成物を生成
するなら、その生成物は第１抗体−検査複合体を捕促し
ている固相フォーマットから漏出することがあり、そし
てその存在は例えば光度計により検出でき、これによっ
て第１抗体−検査物質複合体の量は定量的に決定されう
る。
本発明のイムノアッセイは、植物、哺乳動物、昆虫、
微生物、土壌、空気、水、又は環境に一般に存在又は由
来する多種多様な検査物質を検出するのに利用できう
る。この検査物質は多種多様な分子又は化合物であって
よく、それには限定することなく、抗体、抗原、ハプテ
ン、有機化学物質、例えば除草剤、タンパク質、酵素、
ホルモン、炭水化物、脂質、巨大分子、ポリマー、植物
細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞又はその一部、ウィル
ス、ウィルスのサブユニット、毒素、医薬品、アレルゲ
ン、微生物、例えば細菌、菌類、酵母、マイクロプラズ
マ又はその任意の一部、又は免疫学的に活性であるもし
くはそうなりうる任意の検査物質が含まれる。
本発明を利用する一般的なイムノアッセイ手順は、検
査物質の有無についてアッセイすべき検査サンプルの獲
得により始まる。検査サンプルを、適当な量及び組成を
有する組合せた第１抗体及びExLISAバッファー系の存在
下で適当な容器の中に入れる。検査サンプルは検査サン
プルの種類に適する任意の手段によって得られうる。例
えば、植物組織は切断、断片化、引裂、打ち抜き又はク
リッピングにより獲得できうる。他方、血液サンプルは
簡単な液体転写工程により獲得できうる。哺乳動物組織
サンプルは多種多様な有用な生検手順のいづれかにより
獲得できうる。
本発明の要件は、第１抗体を、使用前にExLISAバッフ
ァー系と合わせることにある。対比のために多くの検査
サンプルを同時に調製するとき、検査サンプルの量はサ
ンプル間で合理的に一致していることが所望される。こ
のことは、使用するExLISAバッファー系の容量と抗体の
量の双方が、検査物質の最大の感度レベル及び抽出を獲
得するのに適する比に維持されていなければならないこ
とにおいて重要である。更に、検査サンプル間で最も正
確な対比ができるよう、大雑把に等量のサンプルを各ア
ッセイのために獲得すべきである。
検査サンプルをExLISAバッファー系及び第１抗体と合
わせたら、検査サンプルの一体性を崩壊及び検査物質の
抽出を助長するある程度の物理的力を供することが必要
でありうる。検査サンプルからの検査物質の抽出を助長
する手段のいくつかの例は、ガラス棒、乳棒、ボルテキ
シング、音波処理又はホモジネーションの利用による。
更に、ガラスビーズ、カルボランダム、シリカ又は任意
のその他の粗い材料を検査サンプルの一体性の破壊率を
更に高めるために任意的に加えてよい。本発明の一の利
点は、ExLISAバッファー系が、第１抗体と検査物質との
最適な反応を抽出工程の際の検査サンプルからのその遊
離の直後に可能にすることにある。検査サンプル、ExLI
SAバッファー系及び第１抗体を本発明のガイドラインに
沿って決定したら、抽出物中の検査物質は、約５〜約60
秒以内、より好ましくは約５〜約30秒以内、最も好まし
くは約10〜約15秒以内での捕促のために調製されうる。
上記の工程において形成される第１抗体−検査物質複
合体の捕促は、上記の方法に従って予め調製した固相フ
ォーマットの隙間空間にわたって抽出物を流すことによ
り行う。孔質な固相フォーマットにより供される大きな
有効表面積にわたる適当な容量の抽出物の流れは、非常
に有効な第１抗体−検査物質複合体の捕促を供する。こ
の抽出物を固相フォーマットの隙間空間内に約５〜約60
秒、より好ましくは約５〜約30秒、最も好ましくは約10
〜約15秒保持する。この抽出物は適当な時間を経て固相
フォーマットから放出される。
捕促された第１抗体−検査物質複合体を捕促した固相
フォーマットを次に適当な洗浄バッファーで洗う。この
ことは固相フォーマットからの残留化学品及び捕促され
なかった物質の除去の効果を有する。固相フォーマット
の洗浄は、洗浄バッファーをそれに流し、次いでそれを
放出させる又は洗浄バッファーを追い出す力をそれにか
けることによって達成される。
捕促された第１抗体−検査物質複合体を含む固相フォ
ーマットを洗浄した後、検出手段にとって必要な任意の
試薬を加える。本発明のイムノアッセイは上記の及び当
業界に公知の多種多様な検出手段を利用してよい。本発
明の好適な態様において、検出手段として酵素を第１抗
体にコンジュゲートし、次いで適当な基質を固相フォー
マットに流し込む。次いで基質をコンジュゲート酵素と
反応させ、検出可能な生成物を生成させる。この手段に
よる検出は一般に５分以内に達成される。
一の好適な態様において、本発明は以下の工程に従っ
て植物組織の中の検査物質の有無を決定するために有用
である： 1.鋭利なキャップ付きマイクロ遠沈管を、少量の植物組
織のサンプルを得るため、サンプリングする植物器官の
上にキャップをかぶせ、植物器官の一部が植物体から切
り離され、そして管の中に収容されるようにすることに
より、利用する。
2.アルカリホスファターゼがコンジュゲートされている
適当な第一抗体と予め組合された250μｌのExLISAバッ
ファー系をサンプリング管に加える。この組織を約５〜
10秒間混合する。
3.この抽出物を、上記の通りにして適当なアフィニティ
ーリガンドで調製したACT−10（商標）固相フォーマッ
ト（Hydros,Inc.,Falmouth,MA）の中に流し込む。この
混合物を約５〜15秒間保持して第１抗体−検査物質複合
体の捕促を促進し、次いで放出させる。
4.チップを１μｌの洗浄バッファー（10mMのトリス−TR
IZMZA（商標）pH8.0,0.05％ w/vのTWEEN（商標）20非
イオン性界面活性剤、0.02％ w/vのアジ化ナトリウ
ム）により、そのバッファーをチップの下へと押し出す
ことにより洗浄する。
5.このチップに約50μｌの酵素基質、ニトロブルーテト
ラゾリウム及びブロモクロロインドールホスフェートを
流し込む。
6.完全な発色のために５〜10分待ち、そして結果を記録
する。
他方、検査サンプル中の抗体を検査することが所望さ
れるなら、適当な抗原を固相フォーマットに共有結合さ
せ、そして効率的な抗原の捕促及びその検出をもって、
単独工程の検査及び抗原反応と同じ原理を利用する。
例えば、一定の血清内の抗体集団を決定するためのIg
G又はIgMの如くのイムノグロブリンの分類は、固相フォ
ーマットの多重積載した連続層であって各層が異なるイ
ムノグロブリンアイソタイプを捕促できる層を利用し、
本発明により迅速に成し遂げることができる。各イムノ
グロブリンクラスへと調製された抗体を適当な固相フォ
ーマットに結合させることができる。個々の固相フォー
マットを各イムノグロブリンクラスのために調製でき、
次いでそれぞれを多層アレンジメント中のピペットチッ
プ内に入れる（図１参照）。適当なExLISAバッファー系
を利用する同時での血清の抽出及び第１抗体−イムノグ
ロブリン複合体の形成の後、調製した固相フォーマット
の各層の隙間空間内で種々の第１抗体−イムノグロブリ
ン複合体を捕促するため、検査サンプルを各層に流す。
上記の任意の如くの標準検出法を、検査サンプル中の種
々のイムノグロブリンの存在を示すために用いる。
血清中の抗体を検出するための本発明の利用の別の例
は、ヒト免疫不全ウィルス（HIV）に対する抗体の検査
である。ホルマリン固定化HIV又はコートタンパク質を
適当なフォーマットに結合させる。血清を抽出し、そし
て第１抗体−検査物質複合体の形成を、第１抗体として
例えば抗ヒト抗体を含む適当なExLISAバッファー系を用
いて第１抗体−検査物質複合体の形成を成し遂げる。抽
出物を、非生存性ウィルス又はコートタンパク質の結合
している孔質固相フォーマットに流し、第１抗体−HIV
特異抗体複合体を捕促する。その後の検査は任意のいく
つかの述べられた手段により行う。
同時での抽出及び第１抗体−検査物質複合体形成、前
記複合体の捕促、並びに前記複合体の形成の要素を組合
せた本発明は、２分以内で広範囲な環境条件下で実施で
きるイムノアッセイを提供する。それは実験室施設なし
で、現場、オフィス、グリーンハウス、農場又は家庭で
利用するのに十分なほど簡単である。本発明は発現した
タンパク質、病原体、特定の抗原、特定の抗体、環境中
の化学物質、又は任意の物質であってそれに対するモノ
クローナルもしくはポリクローナルのいづれかである抗
体が得られうるものの検査のために利用できうる。本発
明に含まれる固有の方法は資源又は時間における付随の
費用を伴うことなく、一層向上した方法の検出感度を保
持する。本発明のイムノアッセイは簡単な仕様書に従っ
て誰にでも実施でき、家庭、オフィス、現場又は任意の
その他の場所での利用を可能にする。
本発明の有用性を最大限とするため、キットの形態で
組立てられたイムノアッセイであって、 （ａ）前述の検査物質に対して結合できる第１抗体の存
在下におけるこの検査物質の抽出手段、ここでこの第１
抗体は検出手段にコンジュゲートされている； （ｂ）前記第１抗体及び前記検査物質により形成される
複合体を捕促できる多数の隙間空間を有する大きな容量
を形成するよう三次元において有意義な寸法を有する固
相フォーマット； （ｃ）請求項１記載のExLISAバッファー系を含む容器； （ｄ）検出可能な反応生成物を生成するための前記検出
手段と反応性の試薬； （ｅ）前記試薬の分注手段； を密閉区画で収容するように仕切られたキャリヤーを含
んで成るものを得ることが所望される。
かかるキットは使用するのが簡単であり、なぜならそ
れは結果を得るのに必要な全ての試薬を含むからであ
る。本発明の一態様において、イムノアッセイのための
キットは各検査サンプルのためのマイクロ遠沈管、各検
査サンプルのためのピペットチップであって、第１抗体
−検査物質複合体の捕促のための適当なアフィニティー
リガンドにより調製された固相フォーマットが、陽性コ
ントロールとして調製した固相フォーマット及び陰性コ
ントロールとして調製した固相フォーマットと一緒多層
アレンジメントで収納されているチップ、マイクロ遠沈
管の中の検査サンプルを粉砕するのに適する乳棒、中に
予め希釈されている検出手段にコンジュゲートされた第
１抗体を任意的に有する又は有さないExLISAバッファー
系の分注用ボトル、洗浄バッファーの分注用ボトル、洗
浄バッファーのために用いる各検査サンプルのための1m
lのディスポーザブル分注ピペット、及び第１抗体にコ
ンジュゲートされた検出手段と共に用いる適当な試薬の
分注用ボトルを含んで成る。20までの検査サンプルのた
めに十分なパーツを含むキットが現場条件での利用に好
都合である。
本発明の別の態様において、大スケール用途のための
キットを、成分がバルク状で調製され、そして20倍以上
の量で入れられるように作ってよい。大容量の試薬を供
給するか、又は２倍〜10倍の濃度において供給し、そし
て追加のディスポーザブルピペット及び乳棒をキットに
追加する。
以下の実施例は本発明の実施において利用した材料と
方法及びその結果を更に説明する。これらは例示で提供
し、そしてその説明は本発明を限定するものと解すべき
でない。
図面の簡単な説明 図１（チップアレンジメント中の多層固相フォーマッ
ト）は本発明の一態様の模式図を示し、それでは個別に
調製した固相フォーマットは、第１抗体−検査物質複合
体の捕促及び検出、それと同時に陽性及び陰性コントロ
ール検査の双方を実施するための多層アレンジメントに
置かれている。固相フォーマットは慣用のプラスチック
ピペットチップの内側に、それらがチップの内周全体に
密着するように収納されている。
実施例 A.ExLISAバッファー ExLISAバッファー系の一の好適な例は、50mMのNaCO3p
H8.5,140mMのNaCl,5mMのEDTA,0.05％のTRITON（商標）
Ｘ−100非イオン性界面活性剤、0.15％のPVPP（w/v）,1
％のPEG（３キロダルトン）、0.5mMのPEFABLOC（商標）
プロテアーゼインヒビター、0.5％のBSAより成る。本例
は、植物組織又は細胞の抽出にとって幅広く有用である
ことが見い出され、第１抗体−検査物質複合体の抽出及
び形成を一の同時の工程において有効に組合せる。これ
らの試薬は一般に表示の化学品供給会社より入手でき
る。
使用前に、本発明におけるExLISAバッファーを、検出
手段の一例としてアルカリホスファターゼにコンジュゲ
ートされている第１抗体と組合せる。この第１抗体は、
検査物質を免疫学的に認識するように選定し、そして任
意の起源、例えばヤギ、ウサギ、ラット又はマウスから
調製できうる。イムノアフィニティー精製を精製第１抗
体を得るために利用してよく、そして仔牛小腸アルカリ
ホスファターゼをAvrameas前掲の改良グルタルアルデヒ
ド法を利用してそれにコンジュゲートしてよい。コンジ
ュゲートした第１抗体を、本発明に係るアッセイにおけ
る使用のために有効な希釈率を決定するために力価検定
する。適当な希釈率は作製した第１抗体のバッチ毎に決
定しなくてはならないが、しかし一般にはExLISAバッフ
ァーの中で1:100〜1:1000の範囲である。ExLISAバッフ
ァー中の第１抗体コンジュゲートは、その存在下で植物
組織又は細胞を混合したときに検査物質にすぐに結合す
る。
B.葉組織の中で発現したバチルス・スリジエンシス・カ
ースタキ（Bacillus thurigiensis kurstaki）（Btk）
エンドトキシンの検査 固相フォーマットは上記した通りであり、その一例は
Hydros,Inc.（Falmouth,MA）より購入でき、そしてACT
−10（商標）として商業的に知られ、それはタンパク質
上に存在する第１アミン基に結合できる。この固相フォ
ーマットに共有結合した第２抗体をヤギ抗−ウサギ抗体
（多数の販売会社から市販）から100μg/mlの濃度にお
いて硼酸食塩水（100mMの硼酸、25mMの硼酸ナトリウ
ム、75mMの塩化ナトリウム、pH8.5）バッファーで４℃
で一夜かけて免疫精製した。次いで未結合のヤギ抗−ウ
サギ抗体を固相フォーマットから除き、そして結合した
ヤギ抗−ウサギ抗体を20mMのナトリウムシアノボロハイ
ドライドによるシッフ塩基の還元により２〜４時間かけ
てそのフォーマットに共有結合させた。固相フォーマッ
ト上の任意の残留活性部位をブロッキングバッファー
（３％ w/vの牛血清アルブミン、0.02％ w/vのアジ化
ナトリウム、10mMのリン酸ナトリウム、140mMの塩化ナ
トリウム、pH7.5）で少なくとも１時間４℃でブロッキ
ングした。ブロッキングバッファーを除き、次いでイム
ノアフィニティー精製したウサギ抗−Btk第３抗体を希
釈バッファー（１％ w/vの牛血清アルブミン−0.02％
のアジ化ナトリウム、0.05％のTWEEN（商標）20非イオ
ン性界面活性剤、10mMのリン酸ナトリウム、140mMの塩
化ナトリウム、pH7.5）の中に15μmg/mlで加え、そして
４℃で一斉インキュベートした。この第３抗体は通常の
抗体−抗原反応で第２抗体に結合する。
Btkエンドトキシンタンパク質アッセイのために３層
の固相フォーマットをピペットチップの中に収納した
（図１に示す通り）。底の固相フォーマット層はアッセ
イ陽性コントロールであり、それは固相フォーマットに
共有結合した仔牛小腸アルカリホスファターゼより成
る。陽性コントロール層の上の固相フォーマットは陰性
コントロールであり、それは収着した牛血清アルブミン
より成る。この上部の固相フォーマット層は、上記の通
り、抽出物から第１抗体−検査物質複合体を捕促するた
めに用いる層である。ピペットチップの中に収納された
この３層の固相フォーマットは、検査サンプル抽出物を
準備するまでチップ保存バッファー（25mMのトリス、14
0mMのNaCl,pH7.8,2％ w/vのBSA,0.05％ w/vのTWEEN
（商標）20非イオン性界面活性剤、0.02％ w/vのNa
N3）の中に保存しておく（６ヶ月まで保存できる）。こ
の保存バッファーは使用直前に調製固相フォーマットか
ら吸引除去する。
検査植物の葉組織は、葉の上に1.5mlのマイクロ遠沈
管の蓄を食いつかせることにより獲得し、これは小さな
円形の葉領域を取り出させる。この検査サンプルはアッ
セイを１時以内で実施できないとき、又は周囲温度が90
゜Fより高いとき、低温に保っておく。次いでこの組織
を上記の実施例Ａに記載の250μｌのExLISAバッファー
の存在下で、混合用のKontes（商標）（Vineland,N.
J.）プラスチック乳棒を用い、約５秒間の強い回転運動
により混合する。抽出の際、第１ヤギ抗−Btk抗体又は
マイクロ遠沈管の中での乳棒による混合により組織から
遊離するBtkエンドトキシンに結合する。次いでこの抽
出物を調製固相フォーマットの隙間空間に流し、第１抗
体−Btk複合体を固相フォーマットに結合した第２抗体
−第３抗体複合体に捕促させる。この抽出物を固相フォ
ーマットに少なくとも15秒間保持し、次いで廃棄槽に放
出させる。この抽出物は放出するまで室温で１時間まで
は固相フォーマットの中に残留しておいてよいが、しか
し２〜３分を超えると、感度はわずかにしか上がらな
い。捕促後、この固相フォーマットを1mlの洗浄バッフ
ァー（10mMのトリス−TRIZMA（商標）,pH8.0,0.05％ w
/vのTWEEN（商標）20非イオン性界面活性剤、0.02％ w
/vのアジ化ナトリウム）で洗う。次いでこの固相フォー
マットをニトロブルーテトラゾリウム及びブロモクロロ
インドールホスフェート（これは化学品供給業者Kirkeg
aard ＆ Perryより入手できるアルカリホスファターゼ
用の単一成分基質である）で飽和にする。存在している
Btkエンドトキシンタンパク質の量に依存して、反応は
ほぼ直ちに始まりうる。しかしながら、一般に反応は、
結果を記録する前、少なくとも５分間進行させておく。
完全サンドイッチ複合体のみがアルカリホスファターゼ
に特異的な基質により同定されるであろう。酵素基質を
UV光から隔離しておく注意を払わねばならず、なぜなら
基質は光感度性であるからである。
特定の検査サンプルについての結果を、３枚の層のそ
れぞれに存在している色調を記録することにより決定す
る。陽性コントロールとしての底の固相フォーマット層
はアッセイを行うときに常に濃青色に変化すべきであ
る。陽性コントロールの上方の固相フォーマットは陰性
コントロールであり、それはアッセイのときに常に白色
から薄灰色のままであり続けるべきである。最上固相フ
ォーマット層は捕促及びその後の第１抗体−Btkタンパ
ク質複合体の存在の検出のためにあり、そしてその存在
下でのみ変色するであろう。従って、濃青色の未知の固
相フォーマットはBTの存在について陽性の植物を示し、
そして変色なし（陰性コントロールにより表示される白
色、又は薄い灰色）はBT陰性の植物を示す。もし陽性コ
ントロール（底部固相フォーマット層）が濃青色に変化
しないか又は陰性コントロール（中央の固相フォーマッ
ト層）が白色又は薄灰色のままでないなら、このアッセ
イは反復しなくてはならず、なぜならこのことは偽せの
測定値を示しているからである。
500以上の植物を、現場条件下での本発明の迅速イム
ノアッセイ及び慣用の実験室ベースELISAの双方によりB
tkエンドトキシンの存在について検査した。この２通り
のアッセイ間で完璧な相関が観察され、この迅速イムノ
アッセイは、一層時間及び資源のかかるELISAと同程度
の感度及び信頼性があることを示唆する。
C.葉組織におけるキュウリ（cucumber）キチナーゼの検
査 このイムノアッセイは、使用した抗体を除き、上記と
同じ手順を踏む。葉組織内の発現したキュウリキチナー
ゼタンパク質の存在についてアッセイするため、ヤギ抗
−マウス第２抗体をアルデヒド基によるシッフ塩基形
成、シアノボロハイドライドによる還元及び牛血清アル
ブミンによる未反応部位のブロッキングにより所望の固
相フォーマットに共有結合させた。キュウリキチナーゼ
に対する３種類の免疫精製したモノクローナルマウス第
３抗体の混合物を通常の抗体−抗原反応を介してヤギ抗
−マウス第２抗体に結合させた。この調製した固相フォ
ーマットを次に第１抗体−検査物質複合体の捕促のため
に用いた。調製した固相フォーマットをピペットチップ
の中に、上記の通り陽性コントロールのための固相フォ
ーマット層及び陰性コントロールのための別の固相フォ
ーマット層と共に収納した。このExLISAバッファー系は
上記の実施例Ａに記載のものと同じであるが、ただしイ
ムノアフィニティー精製したウサギ抗−キュウリキチナ
ーゼ第１抗体をそれに加えた。この第１抗体を上記の通
りにしてアルカリホスファターゼにコンジュゲートし
た。ExLISAバッファー系の存在下で組織を混合すること
により調製した抽出物を、調製した固相フォーマットの
隙間空間の中に流し込んだ。酵素基質による処理によ
り、上部の固相フォーマットは第１抗体−キチナーゼタ
ンパク質複合体が存在しているときに濃青色に変色し
た。
以下の実施例Ｄに記載の原理を利用し、キチナーゼの
発現を、第２抗体のレベルを増やしながら調製した固相
フォーマットの多層アレンジメントを用い、半定量的な
状況でも検査した。病原体感染に応答してキチナーゼと
一緒に植物の中で往々にして内因的に発現されるPr−１
塩基性タンパク質を、適当な第２抗体により調製した固
相フォーマットをチップアレンジメントにおいて組合せ
たときに、上述の通りにしてキチナーゼと一緒に検査さ
れた。
D.ムギ（wheat）の菌類病原体の検査 このイムノアッセイは、病原体の検査のために用いた
抗体を除き、先に記載と同じ手順を踏んだ。イムノアフ
ィニティー精製したヤギ抗ヒツジ第２抗体を適当な固相
フォーマットに反応性アルデヒド基を介して結合させ、
そして未反応部位を牛血清アルブミンの添加によりブロ
ッキングした。セプトリア・トリチシ（Septoria triti
ci）に対する精製ヒツジ第３抗体を通常の抗体−抗原反
応を介してヤギ抗−ヒツジ第２抗体に結合させた。ExLI
SAバッファー系は実施例Ａに記載の通りとしたが、ただ
しアルカリホスファターゼにコンジュゲートしたイムノ
アフィニティー精製したヒツジ抗−セプトリア・トリチ
シをそれに加えた。ExLISAバッファー系の存在下で組織
を混合することにより調製した抽出物を、調製した固相
フォーマットの隙間空間に流し込んだ。酵素基質による
処理を経て、上部の固相フォーマット層は第１抗体−セ
プトリア・トリチシ抗原複合体が存在しているときに青
色に変色した。
ムギ植物のセプトリア・トリチシ又はセプトリア・ノ
ドルム（S.nodorum）感染レベルの半定量検出も、固相
フォーマットに共有結合した第２及び／又は第３抗体の
レベルを調節することにより本イムノアッセイを利用し
て成し遂げた。３種類の固相フォーマットをそれぞれ、
検査すべき病原体の種に応じて、セプトリア・トリチシ
又はセプトリア・ノドルムのいづれかに特異的な第２抗
体のレベルを下げながら調製した。低、中又は高度感染
レベルに対応する第２抗体の量を、本迅速イムノアッセ
イを較正するために同じ抗体を利用するサンドイッチEL
ISAにより予備決定しておいた。３種類の調製した固相
フォーマットを、陽性及び陰性コントロールとして調製
した固相フォーマットと共に、慣用のプラスチックピペ
ットチップの中に入れて、図１に示すような多重積層し
た連続層を形成した。葉抽出物を第１抗体−酵素コンジ
ュゲートを含むExLISAバッファー系において調製し、こ
こでこの第１抗体はここでも検査すべき病原体の種に応
じてセプトリア・トリチシ又はセプトリア・ノドルムの
いづれかに特異的である。検査物質を含む抽出物を上記
の通りにして調製した５つの積層連続固相フォーマット
に流した。抽出物を放出させ、チップを洗い、そして酵
素基質を目視評価を行うためにチップの中に流し込ん
だ。種々のレベルのセプトリアは、調製した固相フォー
マットの１つ、２つ又は３つが比色的に陽性となること
をもたらした。換言すれば、低レベルのセプトリア感染
は一つの調製した固相フォーマットが陽性となることを
もたらし、中レベルの感染は２つのフォーマットが陽性
となることをもたらし、そして高レベルは３つのフォー
マットが陽性となることをもたらした。
セプトリア・トリチシ及びセプトリア・ノドルムは共
に同じ検査サンプルから同じアッセイで同時に検出され
もした。２つの調製した固相フォーマットを利用するこ
とにより（一方には一の病原体を検出するための第２抗
体が共有結合しており、そして他方にはその他の病原体
を検出するための第２抗体が共有結合している）、病原
体の一方又は双方が存在していることを区別することが
可能であった。双方の調製した固相フォーマットを単数
のピペットチップの中に、図１に示しているのと似たよ
うにして、陽性及び陰性コントロールとして調製した固
相フォーマットと一緒に入れた。葉サンプルをExLISAバ
ッファー系、及び２種のセプトリア種のうちの一方をそ
れぞれが認識する２種類の第１抗体−酵素コンジュゲー
トの存在下でホモジナイズにかけた。この検査サンプル
抽出物をチップに流し、放出させ、チップを洗い、次い
で比色識別のために酵素基質をチップの中に流し述べ
た。セプトリアの双方の種が検査サンプルの中に存在し
ているとき、第２抗体で調製した双方の固相フォーマッ
トが陽性的に反応した。セプトリアの一方の種のみが検
査サンプルの中に存在しているときでは、その種を認識
する第２抗体により調製した固相フォーマットのみが陽
性的に反応した。
シュードセルコスポレラ・ハーポトリコイデス（Pseu
docercosporella herpotrichoides）の検査及び半定量
（ムギの眼点病）も迅速イムノアッセイを利用して成し
遂げることができる。このイムノアッセイは、検出手段
として酵素がコンジュゲートされている第１抗体及び固
相フォーマットに共有結合した第２抗体として、P.ハー
ポトリコイデスに特異的なポリクローナル抗体を使用す
る。ムギ組織を抗体−酵素コンジュゲートを含むExLISA
バッファーの中でホモジナイズし、そして上記した通り
にして調製した固相フォーマットに流した。眼点病感染
レベルはセプトリアについて上記した単独アッセイにお
いて半定量でき、又はP.ハーポトリコイデス、S.トリチ
シ及びS.ノドルムの存在は全て単独迅速イムノアッセイ
で検出できる。
E.バナナの菌類病原体（シガトカ〔Sigatoka〕）の検査 このイムノアッセイは、適当な抗体を除き、実施例Ｄ
に記載とまさに同じである。モノクローナル及びポリク
ローナルの双方を、固相フォーマット調製、第１抗体−
検査物質複合体の捕促、及び検出手段としてのアルカリ
ホスファターゼによる検出して、第１、第２及び第３抗
体のために用いた。
F.昆虫腸レセプターの検査 本イムノアッセイの目的は、昆虫プルテラ（Plutell
a）の個別の個体の腸膜において見い出せる特異的な毒
素結合性レセプターの有無の決定にある。このイムノア
ッセイは、バチルス・スリンジエンシス（Bacillus thu
ringiensis）から単離した精製特異的エンドトキシンを
アルデヒド基との相互作用を通じて適当な固相フォーマ
ットに結合させ、シッフ塩基をナトリウムシアノボロハ
イドライドにより還元し、そして未反応の部位を牛血清
アルブミンの添加によりブロッキングすることを除き、
上記の手順を踏む。ExLISAバッファー系は、プルテラの
ブラッシュボーダー膜小胞を免疫学的に認識するイムノ
アフィニティー精製したウサギ第１抗体により調製し
た。この第１抗体をアルカリホスファターゼにコンジュ
ゲートした。一匹の昆虫をマイクロ遠沈管の中に入れ、
そして第１抗体を含むExLISAバッファー系の中で乳棒で
すりつぶした。得られる抽出物を、調製した固相フォー
マットの隙間空間の中に吸引により流し、そして固相フ
ォーマットに共有結合させたバチルス・スリンジエンシ
スエンドトキシンにより捕促した。種々のパチルス・ス
リンジエンシスエンドトキシンを個々の固相フォーマッ
トに共有結合させ、そして各別の固相フォーマットをピ
ペットチップの中で層状に収納した。ウサギ抗−ブラッ
シュボーダー膜第１抗体は抽出物中に存在する全ての昆
虫腸レセプターに非特異的に結合するであろうが、特定
のフォーマット層の中に存在している特異的なエンドト
キシンに結合するもののみがその層により捕促されるで
あろう。従って、特定のフォーマット層において結合し
たエンドトキシンに特異的な第１抗体−腸レセプター複
合体のみがその層により捕促され、そしてその層におい
て濃青色の発色を示すものとしてのアルカリホスファタ
ーゼによる検出の陽性結果を生み出すであろう。種々の
バチルス・スリンジエンシスエンドトキシンに対する腸
レセプター結合のバリエーションは、どの固相フォーマ
ット層が陽性反応を、そしてどれが陰性反応を示すかを
観察することにより迅速に決定できうる。
G.牛血清中のブルセラ・アボルタス（Brucella abortu
s）に対する抗体の検査 ブルセラ・アボルタスは蓄牛の主要の病原細菌であ
り、そして著しい経済的な結果の伴う獣医学的病気であ
る牛ブルセラ症を引き起こす。この病気は非常に伝染性
であり、そして公的隔離に委ねられている。病気の存在
を決定する迅速手段は、牛血清中のブルセラ病原体に対
する抗体の存在の決定によることができ、そして病気の
伝染をモニター及びコントロールするのに有利であろ
う。これは病原体の力価が安定でないとき、病原体より
も抗体を検査する利点を有する。ブルセラ・アボルタス
又はブルセラ・アボルタスの粗抽出物から部分精製リポ
多糖を調製し、そして適当な固相フォーマットに吸着さ
せた。固相フォーマットへのリポ多糖結合はレクチンの
利用により高めることが可能でありうる。固相フォーマ
ット上の任意の残留結合部位は牛血清アルブミン以外の
タンパク質、例えばオブアルブミン又はカゼインにより
ブロッキングしなくてはならない。このようにして調製
した固相フォーマットを多層アレンジメントにおいてピ
ペットチップの中に、陰性コントロール（オブアルブミ
ンの結合した中央層）及び陽性コントロール（アルカリ
ホスファターゼの結合した底部層）のための独立の固相
フォーマットと一緒に収納する。適量の牛血清を、アル
カリホスファターゼのコンジュゲートしたヤギ抗−牛イ
ムノグロブリン第１抗体の加えておいたExLISAバッファ
ーの中に希釈する。このようにして調製した検査サンプ
ルの抽出物を多層固相フォーマットの隙間空間の中に流
し込む。この抽出物を約15秒間保持した後、それを放出
させる。次いでピペットチップを洗浄バッファーで洗
う。次にこの固相フォーマットを、ニトロブルーテトラ
ゾリウムとブロモクロロインドールホスフェート（アル
カリホスファターゼにとっての基質である）とで飽和に
する。血清サンプル中に存在するブルセラ・アボルタス
に対する抗体の量に依存して、反応は１分以内で始まり
うる。しかしながら、一緒に反応を、結果を記録する前
に少なくとも10分間進行させておく。
H.土壌及び水サンプル中の除草剤の検査 このイムノアッセイは、使用した抗体を除き、上記と
同じ手順を踏む。土壌又は水中のメタロクロール又はス
ルホニルウレアの如くの除草剤の存在をアッセイするた
め、メタロクロールを免疫学的に認識するヨーロッパ特
許出願第EP−446,173−Ａに記載のモノクローナル抗
体、及びスルホニルウレアとして知られている除草剤の
クラスの構成員を免疫学的に認識するヨーロッパ特許第
EP−549,525−Ａに記載のモノクローナル抗体を第１及
び第２抗体として使用した。第２抗体を、アルデヒド基
によるシッフ塩基の形成、シアノボロハイドライドによ
る還元及び牛血清アルブミンによる未反応部位のブロッ
キングにより、所望の固相フォーマットに共有結合させ
る。このように調製した固相フォーマットを第１抗体−
除草剤複合体を捕促するために用いる。この調製した固
相フォーマットをピペットチップの中に、上記の通り、
陽性コントロールのための固相フォーマット層及び陰性
コントロールのための独立の固相フォーマット層と共に
収納した。ExLISAバッファー系は上記の実施例Ａに記載
と同じとしたが、ただし検査すべき除草剤を免疫学的に
認識するイムノアフィニティー精製して第１抗体をそれ
に加える。この第１抗体は上記の通りにしてアルカリホ
スファターゼにコンジュゲートさせる。土壌サンプルの
場合、除草剤をまず当業界公知の方法で抽出しなくては
ならず、このようにして作った抽出物をExLISAバッファ
ーと混合する。水サンプルは準備することなく使用して
よく、又はExLISAバッファーと混合する前に公知の方法
により濃縮してよい。得られる組合せ混合物を調製した
固相フォーマットの隙間空間に流し込む。酵素基質によ
る処理を経て、上部固相フォーマット層は第１抗体−除
草剤複合体が存在しているときに濃青色に変化するであ
ろう。
上記の実施例Ｄに記載の方法を利用し、除草剤の存在
は第２抗体のレベルを増やしながら調製した固相フォー
マットの多層アレンジメントを利用して半定量的状況で
も検査できうる。更に、検査サンプル中の１種より多く
の除草剤の存在は、適当な第２抗体により調製した固相
フォーマットをチップアレンジメントの中で組合せたと
き、上記のように同時に決定されうる。
ExLISAバッファー系を利用する抽出工程は、現在利用
されている様々なその他の抽出法と同程度に有用である
ことが実証された。これは標準の方法と、本発明により
包括される方法との直接対比により示される。バチルス
・スリンジエンシス・カースタキ・エンドトキシン、バ
チルス・スリンジエンシス・テネブリオンス・エンドト
キシン、PR1aタンパク質、キュウリキチナーゼ及びホス
ホフィノトリシン・アセチルトランフェラーゼについて
のイムノアッセイは、標準の抽出技術の利用から獲得し
たものと比べ、抽出物をExLISAバッファー系を用いて調
製したときに似たような定量値をもたらした。それ故、
ExLISAバッファー系を利用する抽出法は、標準の方法と
比べたときに同じ結果をもたらす。
文献の一覧 Avrameas,Enzyme Markers:Their linkage with protein
s and use in immunohistochemistry,Histochem.J.4:32
1−330,1972。
Avrameas,Coupling of enzymes to proteins with glut
araldehyde,Immunochemistry 6:43−52,1969。
CumberらPreparation of antibody−toxin conjugates,
Methods Enzymol.112:207（1985）。
Goding,Conjugation of antibodies with fluorochrome
s,J.Immunol.Methods 13:215−226,1976。
HarlowらAntibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring
Harbor Laboratory Press,New York,1988。
KodamaらJournal of Immulogical Methods 127:103−10
8,1990。
Maggio（Ed）:Enzyme−Immunoassay,CRC Press,Florid
a,1980。
NakaneらPeroxidase labeled antibody:A new method o
f conjugation,J.Histochem.Cytochem.22:1084−1091,1
974。
PennyらJournal of Immunological Methods 123:185−1
92,1989。
米国特許第4,366,241号 EP−446 173−Ａ 米国特許第4,376,110号 EP−549 525−Ａ 米国特許第4,803,154号 米国特許第4,962,023号 米国特許第5,006,464号 米国特許第5,011,771号 米国特許第5,169,757号 米国特許第5,169,789号 本明細書の中で挙げた公開物及び特許出願は全て本発
明の属する当業者の技術水準の指標である。公開物及び
特許出願は全て引用することで本明細書に組入れる。
上記の発明は例示の目的で説明してきたが、本発明の
範囲を逸脱することない一定の改変を施すことができる
ことが自明であろう。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ // Ｃ０７Ｋ 16/00 Ｃ０７Ｋ 16/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/543 G01N 33/531 G01N 33/533 G01N 33/569 C07K 16/00 C12P 21/08

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】検査サンプル中に存在する検査物質のサン
    プル抽出及び抗原−抗体反応を同時に支持することので
    きるバッファー系であって、有効な量の （ａ）バッファー； （ｂ）界面活性剤； （ｃ）塩； （ｄ）多価イオンを除去するためのキレート剤； （ｅ）前記抗原−抗体反応における抗体の安定性及び活
    性を維持し、且つ約0.01〜約20（w/v）％量の濃度で存
    在する安定化剤； （ｆ）フェノール系化合物インヒビター； （ｇ）プロテアーゼインヒビター；及び （ｈ）このアッセイに利用するどの抗体によっても認識
    されないタンパク質； を含んで成るバッファー系。
  2. 【請求項２】前記バッファーが炭酸ナトリウム、硼酸ナ
    トリウム又はトリス−食塩水より選ばれる、請求項１記
    載のバッファー系。
  3. 【請求項３】前記界面活性剤が非イオン性である、請求
    項１記載のバッファー系。
  4. 【請求項４】前記界面活性剤がTRITON（商標）Ｘ−100,
    Tween（商標）20 NP−40又はMEGA−８より選ばれる、
    請求項３記載のバッファー系。
  5. 【請求項５】前記塩が塩化ナトリウム又は塩化カリウム
    から選ばれる、請求項１記載の記載のバッファー系。
  6. 【請求項６】前記キレート剤がEDTA又はEGTAより選ばれ
    る、請求項１記載のバッファー系。
  7. 【請求項７】前記安定剤がアガー、アガロース、ポリエ
    チレングリコール、グリセロール又はエチレングリコー
    ルから選ばれる、請求項１記載のバッファー系。
  8. 【請求項８】前記フェノール系インヒビターがポリビニ
    ルピロリドン、硼酸ナトリウム又はポリエチルイミンよ
    り選ばれる、請求項１記載のバッファー系。
  9. 【請求項９】前記プロテアーゼインヒビターがPEFABLOC
    （商標）,PMSF,TLCK,TPCK,α−カプロン酸、ロイペプチ
    ン、ベンズアミジン、アンチパイン又はペプスタチンよ
    り選ばれる、請求項１記載のバッファー系。
  10. 【請求項１０】前記タンパク質がBSA、オブアルブミ
    ン、カゼイン又は胎児牛血清より選ばれる、請求項１記
    載のバッファー系。
  11. 【請求項１１】前記検査物質に結合できる第１抗体を更
    に含んで成り、ここで前記第１抗体は検出手段にコンジ
    ュゲートされている、請求項１記載のバッファー系。
  12. 【請求項１２】前記検出手段が酵素である、請求項11記
    載のバッファー系。
  13. 【請求項１３】前記酵素がアルカリホスファターゼ、ペ
    ルオキシダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼから選ばれ
    る、請求項12記載のバッファー系。
  14. 【請求項１４】前記酵素が不溶性反応生成物を生成す
    る、請求項12記載のバッファー系。
  15. 【請求項１５】前記酵素が可溶性反応生成物を生成す
    る、請求項12記載のバッファー系。
  16. 【請求項１６】前記検出手段が蛍光団である、請求項11
    記載のバッファー系。
  17. 【請求項１７】前記蛍光団がFITC,TRITC、テキサスレッ
    ド又はフィコエリスリンより選ばれる請求項16記載のバ
    ッファー系。
  18. 【請求項１８】検査サンプル中の検査物質の同時サンプ
    ル抽出及び抗原−抗体反応のために請求項１記載のバッ
    ファー系を使用する方法。
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Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU6360994A (en) * 1993-03-08 1994-09-26 Steven H Boyd Aligned fiber diagnostic chromatography
US5695928A (en) 1993-12-10 1997-12-09 Novartis Corporation Rapid immunoassay for detection of antibodies or antigens incorporating simultaneous sample extraction and immunogenic reaction
EP0786089B1 (en) * 1994-10-11 2001-12-12 Abbott Laboratories Deposit assessment methodology of bacillus thuringiensis delta-endotoxin
US6989240B2 (en) * 1995-04-13 2006-01-24 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Method for detecting hemolysis
CN1207569C (zh) * 1997-08-04 2005-06-22 株式会社先端生命科学研究所 用于测定含病毒样品的方法、病毒测定方法和诊断试剂盒
GB2342992A (en) * 1998-10-22 2000-04-26 Horticulture Res Int Dipstick detection system
US6344337B1 (en) 1999-02-19 2002-02-05 Board Of Trustees Of Michigan State University Antigen test to detect equine protozoal myeloencephalitis in horse serum and cerebrospinal fluid
WO2000060353A1 (en) * 1999-04-06 2000-10-12 Genzyme Corporation Composition for patient sample preparation
WO2000076538A1 (en) 1999-06-10 2000-12-21 Michigan State University Feline calicivirus isolated from cat urine and vaccines thereof
US6537762B1 (en) 1999-07-30 2003-03-25 Board Of Trustees Of Michigan State University Peptide mimotope to mycotoxin deoxynivalenol and uses thereof
AU7108700A (en) 1999-09-02 2001-03-26 Michigan State University Vaccine to control equine protozoal myeloencephalitis in horses
US7419668B1 (en) 1999-09-02 2008-09-02 Board Of Trustees Of Michigan State University Vaccine to control equine protozoal myeloencephalitis in horses
US20040191260A1 (en) 2003-03-26 2004-09-30 Technion Research & Development Foundation Ltd. Compositions capable of specifically binding particular human antigen presenting molecule/pathogen-derived antigen complexes and uses thereof
US6734420B2 (en) * 2000-04-06 2004-05-11 Quantum Dot Corporation Differentiable spectral bar code methods and systems
DE10051266A1 (de) * 2000-10-16 2002-04-25 Basf Ag Verfahren zur Filtration einer Flüssigkeit, mit einem Filterhilfsmittel und Verfahren zu deren Herstellung
US6603403B2 (en) * 2000-12-12 2003-08-05 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Remote, wetness signaling system
US6583722B2 (en) 2000-12-12 2003-06-24 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Wetness signaling device
US7691645B2 (en) * 2001-01-09 2010-04-06 Agilent Technologies, Inc. Immunosubtraction method
CA2474458A1 (en) * 2002-01-31 2003-08-07 Mitchell C. Sanders Method for detecting microorganisms
US6992176B2 (en) * 2002-02-13 2006-01-31 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antibody having a T-cell receptor-like specificity, yet higher affinity, and the use of same in the detection and treatment of cancer, viral infection and autoimmune disease
US20030153094A1 (en) * 2002-02-13 2003-08-14 Board Of Trustees Of Michigan State University Conductimetric biosensor device, method and system
EP1485075A4 (en) * 2002-02-20 2006-04-26 Dyax Corp MHC-PEPTIDE COMPLEX BINDING LIGANDS
DE10215147A1 (de) * 2002-04-05 2003-10-16 Basf Ag Verwendung von Polymerisation, enthaltend thermoplastische Polymere als Filterhilfs- und/oder Stabilisierungsmittel
GB0210460D0 (en) * 2002-05-08 2002-06-12 York Nutritional Lab Ltd Sample collection device
US20040018556A1 (en) * 2002-07-29 2004-01-29 Cantor Thomas L. Reagent and method for determination of a substance using an immunoaggregator
DK1567661T3 (da) * 2002-11-26 2011-01-03 Eci Biotech Inc Fremgangsmåder, biosensorer og sæt til detektion og identificering af svampe
JP2006520190A (ja) * 2003-01-21 2006-09-07 マイクロニクス， インコーポレイテッド 流体の微小流体的な操作、増幅、および分析（例えば、細菌アッセイおよびアンチグロブリン試験）のための方法およびシステム
WO2005050216A1 (en) * 2003-07-25 2005-06-02 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Identification of toxin-binding protein involved in resistance to cry1 toxins, and related screening methods
US20050170445A1 (en) * 2004-01-07 2005-08-04 Duke University Methods of establishing profiles for use in evaluating wound healing and biocompatibility of implant materials and microarrays useful therefor
WO2005079345A2 (en) * 2004-02-12 2005-09-01 Rush University Medical Center Fluid composition used to simulate human synovial fluid
DK1718969T3 (da) 2004-02-26 2010-11-29 Candor Bioscience Gmbh Vandig opløsning til anvendelse som medium for et bindingspars specifikke reaktion
US20050214882A1 (en) * 2004-03-25 2005-09-29 Ez Bio Inc. Reagents, methods and kits for the universal rapid immuno-detection
RU2418633C2 (ru) 2004-04-08 2011-05-20 Байоматрика, Инк. Объединение процессов хранения образцов и управление образцами в медико-биологических науках
US20060099567A1 (en) * 2004-04-08 2006-05-11 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
CN1303424C (zh) * 2004-04-15 2007-03-07 云南省农业科学院 Cmv云南分离物tas－elisa检测试剂盒及其制备方法
CA2583406A1 (en) * 2004-09-20 2007-01-04 Boston Microfluidics Microfluidic device for detecting soluble molecules
JP2008524600A (ja) * 2004-12-16 2008-07-10 インヴィトロジェン コーポレーション 多重化アッセイの較正及び定量化用の量子ドットコード化ビーズセット、及びその使用方法
US20060275841A1 (en) * 2004-12-20 2006-12-07 Martin Blankfard Assay method and apparatus with reduced sample matrix effects
WO2006098804A2 (en) 2005-03-11 2006-09-21 Chembio Diagnostic Systems, Inc. Dual path immunoassay device
US7189522B2 (en) * 2005-03-11 2007-03-13 Chembio Diagnostic Systems, Inc. Dual path immunoassay device
WO2007012944A2 (en) * 2005-07-28 2007-02-01 Pfizer Products Inc. Methods of vaccine administration, new feline caliciviruses, and treatments for immunizing animals against feline paraovirus and feline herpes virus
WO2007136778A2 (en) * 2006-05-19 2007-11-29 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Fusion proteins, uses thereof and processes for producing same
US9068216B2 (en) 2007-03-22 2015-06-30 Bret T. Barnhizer Methods and devices for rapid detection and identification of live microorganisms by aptamers and/or antibodies immobilized on permeable membranes
US8287810B2 (en) * 2007-06-20 2012-10-16 Board Of Trustees Of Michigan State University Electrically-active ferromagnetic particle conductimetric biosensor test kit
US8747855B2 (en) * 2008-04-09 2014-06-10 Technion Research & Development Foundation Limited Anti human immunodeficiency antibodies and uses thereof
EP2636513B1 (en) * 2008-04-10 2014-08-27 Stratasys Ltd. System and method for three dimensional model printing
US20110117673A1 (en) * 2008-07-16 2011-05-19 Johnson Brandon T Methods and systems to collect and prepare samples, to implement, initiate and perform assays, and to control and manage fluid flow
US8021873B2 (en) 2008-07-16 2011-09-20 Boston Microfluidics Portable, point-of-care, user-initiated fluidic assay methods and systems
US20100022916A1 (en) 2008-07-24 2010-01-28 Javanbakhsh Esfandiari Method and Apparatus for Collecting and Preparing Biological Samples for Testing
JP5143046B2 (ja) * 2009-02-12 2013-02-13 富士フイルム株式会社 被験物質の測定方法及び該測定方法を実施するためのキット
WO2011057347A1 (en) 2009-11-12 2011-05-19 Tgr Biosciences Pty Ltd Analyte detection
US20110218117A1 (en) * 2010-03-05 2011-09-08 Aquilino Arnold J Enhanced Immunosorbent Spot Test Device and Method of Using Same
CA2710904A1 (en) * 2010-07-23 2012-01-23 Norgen Biotek Corp. Methods and devices for rapid urine concentration
US9845489B2 (en) 2010-07-26 2017-12-19 Biomatrica, Inc. Compositions for stabilizing DNA, RNA and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
WO2012018638A2 (en) 2010-07-26 2012-02-09 Biomatrica, Inc. Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
US8603835B2 (en) 2011-02-10 2013-12-10 Chembio Diagnostic Systems, Inc. Reduced step dual path immunoassay device and method
US8859297B2 (en) 2011-05-23 2014-10-14 Board Of Trustees Of Michigan State University Detection of conductive polymer-labeled analytes
US10739337B2 (en) 2011-08-30 2020-08-11 Board Of Trustees Of Michigan State University Extraction and detection of pathogens using carbohydrate-functionalized biosensors
BR112014017336A8 (pt) * 2012-01-13 2017-07-04 Nanologix Inc método para rápida detecção e identificação de um ou mais microorganismos alvo vivos em uma amostra; dispositivo para rápida detecção e identificação de um ou mais microorganismos alvo vivos em uma amostra; e teste de kit para rápida detecção e identificação de um ou mais microorganismos alvo vivos em uma amostra para uso no método
EP2934572A4 (en) 2012-12-20 2016-11-23 Biomatrica Inc FORMULATIONS AND METHODS FOR STABILIZING PCR REAGENTS
WO2015143277A1 (en) 2014-03-20 2015-09-24 Wellstat Diagnostics, Llc Antibodies and methods for the detection of cell death
EP3126486B1 (en) 2014-04-02 2019-07-03 Chembio Diagnostic Systems, Inc. Immunoassay utilizing trapping conjugate
EP3154338B1 (en) 2014-06-10 2020-01-29 Biomatrica, INC. Stabilization of thrombocytes at ambient temperatures
US20160116466A1 (en) 2014-10-27 2016-04-28 Chembio Diagnostic Systems, Inc. Rapid Screening Assay for Qualitative Detection of Multiple Febrile Illnesses
CN105116078A (zh) * 2015-08-10 2015-12-02 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 用于质谱鉴定的革兰氏细菌蛋白质处理方法及其缓冲溶液
EP4242628A3 (en) 2015-12-08 2023-11-08 Biomatrica, INC. Reduction of erythrocyte sedimentation rate
EP3684921A1 (en) 2017-09-18 2020-07-29 Bayer Healthcare LLC Methods of inactivation of viruses using n-methylglucamide and its derivatives
EP3732461A1 (en) * 2017-12-29 2020-11-04 F. Hoffmann-La Roche AG Tissue sample preparation system
CN109946140B (zh) * 2019-04-13 2021-05-11 三门县人民医院 真菌染色液和真菌染色方法
WO2021182558A1 (ja) * 2020-03-12 2021-09-16 日立化成ダイアグノスティックス・システムズ株式会社 試料中の対象物質を免疫測定するための方法及びキット
CN116699126A (zh) * 2023-06-13 2023-09-05 深圳市博卡生物技术有限公司 一种抗体偶联的微球复合物的封闭剂

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4108976A (en) * 1977-03-04 1978-08-22 Becton, Dickinson And Company Automated direct serum radioimmunoassay
US4376110A (en) * 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4366241A (en) * 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
JPS59137417A (ja) * 1983-01-28 1984-08-07 Morinaga Milk Ind Co Ltd 人尿由来コロニ−形成刺激因子及びカリクレインの製造法
FR2549230B1 (fr) * 1983-06-14 1986-04-11 Bio Merieux Procede de detection d'un oligomere dans un milieu liquide contenant des monomeres correspondants, dispositif pour la mise en oeuvre de ce procede et application notamment a la recherche d'allergenes
IL73938A (en) * 1984-01-02 1989-09-28 Boehringer Mannheim Gmbh Process and reagent for the determination of polyvalent antigen by incubation with three different receptors
DE3425008A1 (de) * 1984-07-06 1986-02-06 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und vorrichtung zur durchfuehrung analytischer bestimmungen
US5011771A (en) * 1984-04-12 1991-04-30 The General Hospital Corporation Multiepitopic immunometric assay
CA1341423C (en) * 1984-10-31 2003-03-04 Paul A. Luciw Recombinant proteins of viruses associated with lymphadenopathy syndrome and/or acquired immune deficiency syndrome
JPS61247965A (ja) * 1985-04-25 1986-11-05 Susumu Kogyo Kk 酵素免疫測定法
US5073341A (en) * 1985-08-21 1991-12-17 Biotope, Inc. Devices for conducting specific binding assays
US4810648A (en) * 1986-01-08 1989-03-07 Rhone Poulenc Agrochimie Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
US5219761A (en) * 1986-05-20 1993-06-15 Agri-Diagnostics Associates Method and a kit for diagnosing plant diseases
AU8131487A (en) * 1986-11-19 1988-05-26 Bioclones (Pty) Ltd Method of detecting the presence of a plant antigen in a plant
US5169789A (en) * 1986-12-03 1992-12-08 New Horizons Diagnostics Corporation Device and method for self contained solid phase immunodiffusion assay
DE3883808T2 (de) * 1987-02-27 1994-04-28 Eastman Kodak Co Testsatz, Extraktionsvorrichtung und Verfahren zur Bestimmung von Streptococcus-A-Antigen.
US5122452A (en) * 1987-05-20 1992-06-16 Carleton University Enzyme immunoassay with a macroporous hydrophobic synthetic polymer cloth containing an immobilized antibody or antigen
US5169757A (en) * 1987-05-20 1992-12-08 Carleton University Antibodies or antigens bound to a macroporous hydrophobic synthetic polymer cloth for immunological techniques
US4962023A (en) * 1987-06-22 1990-10-09 Louisiana State University, Agricultural And Mechanical College Single incubation immuno sorbent assay method using particle labels to detect test antigen specific antibodies in presence of other antibodies
US5006464A (en) * 1987-10-01 1991-04-09 E-Y Laboratories, Inc. Directed flow diagnostic device and method
US5077198A (en) * 1988-04-14 1991-12-31 Eastman Kodak Company Diagnostic kit and method for rapid detection of antibodies
EP0353895A1 (en) * 1988-07-18 1990-02-07 MITSUI TOATSU CHEMICALS, Inc. Immunoassay method
US5006461A (en) * 1989-11-03 1991-04-09 Transgenic Sciences, Inc. TMB formulation for soluble and precipitable HRP-ELISA
US5159789A (en) * 1990-05-14 1992-11-03 Haapanen Randy M Noise baffle for drain pipes
US5200321A (en) * 1990-09-07 1993-04-06 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Microassay on a card
US5283179A (en) * 1990-09-10 1994-02-01 Promega Corporation Luciferase assay method
JP2583153B2 (ja) * 1990-11-09 1997-02-19 和光純薬工業株式会社 安定なアビジン―ビオチン化タンパク質複合体溶液の製造方法
US5171537A (en) * 1991-05-06 1992-12-15 Richard E. MacDonald Activated immunodiagnostic pipette tips
AU6360994A (en) * 1993-03-08 1994-09-26 Steven H Boyd Aligned fiber diagnostic chromatography
US5695928A (en) 1993-12-10 1997-12-09 Novartis Corporation Rapid immunoassay for detection of antibodies or antigens incorporating simultaneous sample extraction and immunogenic reaction
US7725307B2 (en) * 1999-11-12 2010-05-25 Phoenix Solutions, Inc. Query engine for processing voice based queries including semantic decoding

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