JPH09507910A

JPH09507910A - 同時でのサンプル抽出及び免疫原性反応を含む抗体又は抗原の検査のための迅速イムノアッセイ

Info

Publication number: JPH09507910A
Application number: JP7516069A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．スチュワート，サンディ
Original assignee: チバ−ガイギーアクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1993-12-10
Filing date: 1994-11-29
Publication date: 1997-08-12
Anticipated expiration: 2018-10-14
Also published as: EP0733208B1; CA2177288A1; EP0733208A1; AU8114394A; WO1995016205A1; ATE164683T1; CA2177288C; DK0733208T3; ES2114727T3; US6503702B1; US5695928A; AU703343B2; JP3457324B2; DE69409401D1; HK1008442A1; GR3026730T3; DE69409401T2

Abstract

(57)【要約】本発明は検査サンプル中に存在しうる様々な検査物質の迅速検査できるイムノアッセイに関する。本発明の一の特徴は第１抗原−検査物質複合体の形成と同時に検査物質の抽出又は単離を行うことにある。この第１抗原−検査物質複合体を、迅速且つ効率的な検査を促進する多数の隙間空間を有する固相フォーマットの中で捕促させる。本発明のイムノアッセイの広範囲にわたる環境条件で有効であり、そして実験室設備抜きで利用するに足りるほど簡単である。

Description

【発明の詳細な説明】同時でのサンプル抽出及び免疫原性反応を含む抗体又は抗原の検査のための迅速イムノアッセイ本発明は検査物質の検査のための迅速イムノアッセイに関する。検査サンプル中の検査物質を検査するために１又は複数種の抗体を使用するイムノアッセイは幅広く知られる。イムノアッセイ法の進歩は感度及び使い易さの向上を招来する。この進歩にもかかわらず、感度又は結果の信頼性を損うことなく、より迅速に、且つ時間及び資源を節約して抗原性物質を検査及び測定することを達成せしめることの要望が残っている。この要望の追求のため、いくつかのイムノアッセイの方式が開発されている。複数の抗体であってその一つが固相材料に結合していることのある抗体を頼りとするいくつかのイムノアッセイが開発されている。この結合はニトロセルロース、ポリスチレンビーズ、プラスチック布、ポリカーボネートフィルター等を用いて成し遂げられている。例えば米国特許第4,803,154号には「サンドイッチ」型イムノアッセイが記載されており、それにおいては反応性アルデヒド基を介して抗体を結合させるのに利用できる規定された、且つ仕切られた親水性領域を作り出すように疎水性シートを処理している。この検査物質を含む検査サンプルを、免疫反応を介して検査物質を捕獲する結合抗体を有する処理領域と接触させる。次いで、検出手段がコンジュゲートされた別の抗体をこの処理領域に加え、そして第一工程におけるシート上に固定化した検査物質と結合させる。検出手段の実効を図ると、検査サンプル中の検査物質の存在を測定することが可能となる。この方法は「迅速」方法と述べられているが、しかし事前のアッセイサンプル調製時間を含まずに、60分から48時間完了するのにかかっている。「ディップスティック」の如くの慣用のフォーマットも開発されている。一例において、ポリビニルクロリドシートに融着させたポリカーボネート検査膜を有する「ディップスティック」フォーマットが、現場の条件で使用可能なイムノアッセイ法を担うのに利用されている。C．L．Pennyら、Journal of Immunology M ethods 123：185-192(1989)。この方法においては、検査物質は、そのディップスティックを検査サンプルの中に浸すことにより検査膜に結合させており、この検査サンプルは流体でなくてはならない。第二の工程において、このディップスティックを、検査手段がコンジュゲートされている抗体を含む溶液の中に浸し、その抗体は結合した抗原性物質との免疫反応により固定される。最終工程において、検出手段の実効を図る。これはディップスティックを適当な検査試薬を含む溶液に浸すことを含む。このアッセイは完了するのに、事前アッセイサンプル準備を含めずに１時間より長くかかると述べられている。「サンドイッチ」型イムノアッセイの別の例においては、第１抗体をマルチウェルの表層に結合させている。S．Kodamaら、Journal of Immunological Method s 127：103-108(1990)。予め調製しておいた検査サンプルを検出手段のコンジュゲートされている第２抗体を含む適当なバッファーと混合し、次いでその組合せた溶液をプレートのウェルに入れる。最終工程において、この検出手段の実効を図る。それはウェルに適当な検出試薬を加えることにより成し遂げられる。次いで抗体−検査物質の存在を決定する。記載のアッセイは完了まで50分かかる。サンプルの準備時間は含めていない。迅速、且つ、経済的であると主張されているその他のイムノアッセイも知られているが（例えば、米国特許第4,962,023号、米国特許第5,169,757 号）、しかしながら全て、検査サンプルを準備する時間を含めずに、アッセイが完了するのに少なくとも１時間かかるという制約を有する。より短い時間で足りるイムノアッセイ、例えばヒト絨毛ゴナドトロピン(hCG) の検査を基礎とする妊娠についての一般的に入手できるラテックス凝集検査も知られている。かかる検査の一例はMonoclonal Antibodiesにより製造され、そしてBaxter Scientific Products(McGaw，IL)により供給されているB．Clone（商標）hCGアッセイである。かかる検査は簡単であり、そしてhCGの検査のために数分又は30分以内で足りる。これらの検査は検査サンプルとして尿を利用するようにデザインされており、これは検査物質の検査前の任意の準備を必要としない。検査物質を含む検査サンプルがより複雑な場合、例えば全血、排せつ物及び植物又は動物組織の場合、検査サンプルの準備は独立した時間のかかる工程であり得、これは信頼性のある、且つ正確な結果を得るのに必要な時間及び労力を多大にしうる。このような状況下では、似たような時間で完了でき、且つ、抽出工程を検査物質の検査工程と一緒にできるイムノアッセイが、時間及び労力の双方において長所を供するであろう。いくつかのイムノアッセイは単独のインキュベーション工程のみを必要とするように開発されてもいる。かかるイムノアッセイは「同時」イムノアッセイとして知られる。かかるアッセイの一例は米国特許第4,376,110号に記載されている。かかるアッセイにおいて、固相支持体に結合した抗体を、検出手段のコンジュゲートされた別の抗体と同時に検査サンプルとインキュベートする。米国特許第 4,376,110号に記載の別のタイプのイムノアッセイは「リバース」イムノアッセイであり、これはまず検出手段のコンジュゲートされている抗体、次いで固相支持体に結合した抗体の添加が続く、液体検査サンプルへの段階的添加を含む。かかるイムノアッセイは操作のし易さを供するが、しかし未調製の検査サンプル中の妨害物質の潜在的な存在に基づいて悩まされる。更に、かかるイムノアッセイにおいては液相の中で抗体−抗原反応が起こるため、液体検査サンプルが必要とされる。かかる「同時」又は「リバース」イムノアッセイは、液体検査サンプルから捕促された抗体−検査物質複合体を除去する追加の分離及び洗浄工程をも必要とする。「同時」又は「リバース」イムノアッセイの更なる例は米国特許第5,011,771号に見い出され、ここでイムノアッセイの前に検査サンプルを準備する必要性、及び液体検査サンプルから捕促された抗体− 検査物質複合体を分離する必要性は、追加の沈降及び遠心工程を必要とする。それ故、実験設備を必要としうる追加の工程の必要性は非実験室条件下でイムノアッセイを実施するためのかかる方法の有用性を制約しうる。細菌及びウィルスについてのその他のイムノアッセイが米国特許第5,169,789 号に記載されており、これは短時間で実施でき、そして同時での検査サンプルの溶解及び抗体反応を含む。このイムノアッセイはサブマイクロメーターの孔径を有するニトロセルロース膜を利用し、そこでは、サンプリング手段から捕促膜に至る検査物質含有液の流れは、任意的な下層吸収層により助長される拡散に制約されている。かかるイムノアッセイは単独アッセイにおける多重検査物質についての検査結果の同時目視決定を可能とするように物理的に配置できず、その理由は膜材料の制約された流速及び不透明な性質による。米国特許第4,366,241号及び米国特許第5,006,464号に開示の如くのサブマイクロメーターサイズの孔を有するニトロセルロースに基づくその他のイムノアッセイは類似の欠点を有する。本発明は高感度、高信頼性、及び経済的であり、そして完了するのに、検査サンプルの準備時間及び１又は複数種の検査物質の検査手段の実効を図る時間を含めて60秒ほどの短さで足りるイムノアッセイを提供する。本発明は検査サンプルの中に存在しうる様々な検査物質の迅速な検査が可能なイムノアッセイに関する。本発明の一の特徴は、検査物質の抽出又は単離を第１抗原−検査物質複合体の形成と同時に行うことにある。この第１抗原−検査物質複合体を、迅速、且つ有効な検査を助長する多数の隙間空間を有する大容積を形成できるよう三次元において有意義な寸法を有する固相フォーマットの中に捕促させる。更に、単一の検査サンプルの中の複数の検査物質の同時検査を可能にする多層アレンジメントの固相フォーマットを有するイムノアッセイを提供する。この多層アレンジメントは検査サンプルの中に存在する検査物質の量の半定量的な決定のためにも利用される。本発明のイムノアッセイは多種多様な環境条件で有効であり、そして実験室設備がなくても利用できるに足りるほどに簡単である。本発明はタンパク質、病原性、特異的な抗原、特異的な抗体、ハプテン、環境の中の化学物質、又は抗体の得られうる任意のその他の物質の検査のために利用できうる。本発明により包括される固有の方法は資源又は時間に付随する費用を伴うことなく、一層改善された検査方法の感度を保持している。このイムノアッセイを実施するためのキットも述べる。本発明は植物材料の如く所望の検査サンプル中の検査物質を迅速に検査するのに利用できる免疫収着アッセイに関する。検査物質は多種多様な分子又は化合物であってよく、それには抗体、抗原、ハプテン、有機化学、タンパク質、酵素、ホルモン、炭水化物、脂質、巨大分子、ポリマー；植物、昆虫、哺乳動物もしくは任意のその成分の細胞；ウィルス、ウィルスサブユニット、毒素、医薬品、アレルゲン、微生物、例えば細菌、菌類、酵母、マイクロプラズマもしくはその任意の成分、又は免疫反応性であるもしくはそのようにすることのできうる任意の検査物質が含まれる。成分は任意の単細胞又は多細胞生物から調製又は誘導した任意の細胞性又はサブ細胞画分である。例えば、細胞膜の粗又は精製調製品はサブ細胞画分であってよく、又は免疫反応性であるものもしくはそのようにすることのできるものであってよい。同様に、細胞の調製品を単離組織から調製してよく、そしてそれは免疫反応性であるか、又はそのようにすることできる細胞性画分であってよい。成分は単離組織から、中間的な細胞分画工程の必要性抜きで誘導されたサブ細胞性画分であってもよい。更に、成分は精製又は粗製のいづれかである細胞又は組織の化学的又は生化学的画分であってよく、又は免疫反応性にすることのできるものであってよい。このアッセイにおける免疫吸着力は、検査物質を認識し、中心成分として前記検査物質を有している「サンドイッチ」又は複合体を作り出す複数の抗体又は抗原により提供される。抗体はイムノグロブリンと呼ばれるタンパク質のファミリーの構成員であり、これは免疫原と特異的に結合できる。イムノグロブリンは種々のタンパク質群であり、そしてIgG，IgM，IgA，IgD及びIgEと呼ばれるクラスのアイソタイプとして哺乳動物において見い出されている。抗体は一般に、抗原の結合する可変領域、並びにアイソタイプ及び種特異性である定常領域を有する。抗原は抗体の可変領域により免疫学的に認識され、その結果としてそれに結合する物質又は物質の必須部分と定義される。検査サンプル中の検査物質の検査のためのイムノアッセイは下記の工程を含んで成る：（ａ）検査サンプルの抽出物を、この抽出物の中の前記検査物質を免疫学的に認識する第１抗体の存在下で調製し、これにより第１抗体−検査物質を形成する、ここで前記第１抗体は検出手段にコンジュゲートされている；（ｂ）前記検査物質により免疫学的に認識される所望の抗原、又は前記検査物質もしくは工程（ｃ）の第３抗体のいづれかを免疫学的に認識できる第２抗体を結合させることによって、多数の隙間空間を有する大容量を形成するように三次元方向において有意義な寸法を有する固相フォーマットを調製する；（ｃ）任意的に前記第２抗体に第３抗体を免疫学的に結合させる、ここでこの第３抗体は前記検査物質も認識する；（ｄ）工程（ａ）の前記抽出物を、前記工程（ｂ）又は工程（ｃ）で調製したフォーマットと組合せ、これにより前記抽出物を前記第１抗体−検査物質複合体を捕促する前記調製した固相フォーマットの隙間空間に流す；（ｅ）前記捕促された第一抗体−検査物質複合体の存在により前記検査物質を検査する；工程を含んで成る。本発明のイムノアッセイにおける第一工程はExLISAバッファー系を用いる、第１抗体−検査物質複合体の同時形成の伴う、検査サンプルからの検査物質の抽出を含む。この第１抗体は前記検査物質に免疫学的に結合させるべき第１リガンドである。この第１抗体はそれにコンジュゲートした検出手段を有する。様々な検出手段が当業界において公知であり、そして以降に説明する。本発明のイムノアッセイにおける第２工程は、固相フォーマットに結合した適当なアフィニティーリガンドによる第１抗体−検査物質複合体の物理的捕促を含む。適当なアフィニティーリガンドは検査物質の種類に依存し、そして一般に検査物質に免疫学的に結合することができるものである。検査物質の種類に依存して、適当なアフィニティーリガンドは第２抗体（相補性抗原又はその他の相補性抗体の捕促のため）又は抗原（その相補性抗体の捕促のため）のいづれでもよい。本発明においては、この固相フォーマットは孔質であり、そして多数の隙間空間を保有する大容量を形成するよう三次元において有意義な寸法を有する。この適当なアフィニティーリガンドを固相フォーマットに結合させておく。「固相フォーマット」とは、イムノアッセイの捕促媒体を構成するマトリックスの物理的な構造又はアレンジメントを意味するために用いている。任意的に、イムノアッセイにおいて検出すべき検査物質が抗原であるとき、第３抗体を加えてよい。この第３抗体はこの固相フォーマットに結合した第２抗体により免疫学的に認識されるであろう。この第３抗体は検査物質をも免疫学的に認識するであろう。このようにして調製した固相捕促フォーマットは高められた感度を有し、その結果、第３抗体抜きで調製した固相捕促フォーマットよりも優れた検出レベルを有する。本発明のイムノアッセイにおける第３工程は、固相フォーマットに付加された適当なアフィニティーリガンドにより捕促される第１抗体−検査物質の検査を含む。このことは、物理的捕促により形成されるアフィニティーリガンド−検査物質−第１抗体複合体に結合したままである第１抗体にコンジュゲートされている検出手段により供される。本発明により供される迅速検出は、１）所望の検査サンプルからの検査物質の抽出、及び２）この第１抗体への前記検査物質の結合を双方同時に実施することによりある程度達成される。検査サンプルからの検査物質の抽出及び第１抗体−検査物質複合体の形成の双方を同時に行わせることの組合された有用性を達成せしめるため、抽出方法の必要とされる強度と、抗体−抗原結合の繊維さとのバランスをとらせるバッファー系を作り上げることが必要である。「ExLISA」なる語は、検査サンプルからの検査物質の抽出にとって必要な成分を、ELISAで見い出されるものと似たようなイムノアッセイを実施するのに必要な成分と組合せる固有のバッファー系を意味することに利用されている。ExLISAバッファー系の開発は、抗体−抗原結合にとって阻害性である典型的な抽出バッファーに存在する障害、例えばジチオスレイトール(DTT)の如くのスルフヒドリル還元剤の組込みを解決する。更に、ExLISAバッファー系は、それらが満足たる検査サンプル抽出に影響を及ぼさない点で、典型的なイムノアッセイバッファーに存在する追加の問題を解決する。従って、このイムノアッセイ手順は、第１抗体−検査物質結合反応を慣用の方法よりもはるかに短い時間で可能にするExLISAバッファー系により強化される。ほとんどのケースにおいて、検査サンプルの抽出を含む完全なイムノアッセイは約１分間で完了しうる。検査サンプルからの検査物質の抽出と第１抗体−検査物質複合体の形成とを同時に行うため、得られるExLISAバッファー系は一般のイムノアッセイバッファー系よりも短い反応時間を有し、そしてそれは採用した抗体の能力によってのみ制約される。本発明のExLISAバッファー系は検査サンプルから検出すべき検査物質の最適抽出及び最適第１抗体−抗原結合の双方を単一工程で行うことが可能である。ExLI SAバッファー系はpHをコントロールするためのバッファー、界面活性剤、塩、キレート剤、安定化剤、フェノール系化合物インヒビター、プロテアーゼインヒビター、及びこのアッセイにおいて用いたどの抗体によっても認識されないタンパク質を含んで成る。 ExLISAバッファー系のために選定されたバッファーは検査サンプルからの検査物質の抽出及び第１抗体−検査物質複合体の最適形成の両者にとって適切でなくてはならない。好適なバッファーはpHを約6.5〜約9.0、好ましくは約7.5〜約8.5に維持する無機型のものである。最適第１抗体−検査物質複合体形成はこの範囲内で起こり、そしてほとんどの検査物質の溶解性がこの範囲内で最適ともなる。バッファーの好適な濃度域は約10mM〜約200mM、より好ましくは約2 5〜約100mMであり、そして高すぎて第１抗体−検査物質複合体の形成を阻害することなく適切な緩衝能を供するに足りるものであるべきである。一の好適な態様において、このバッファーは50mMの炭酸ナトリウムpH8.5とする。抽出工程の際の細胞性材料の溶解を助長するために適当な界面活性剤をExLISA バッファー系に加える。この濃度は細胞性材料の溶解度が界面活性剤の変性作用とつり合うように慎重に選定すべきであり、そして好ましくは約0.01〜約0.2％（ｗ／ｖ）、より好ましくは約0.01％〜約0.1％（ｗ／ｖ）とする。更に、好適な界面活性剤は第１抗体−検査物質複合体の形成を阻害しないよう非イオン性タイプである。適当な界面活性剤はTRITON（商標）Ｘ−100非イオン界面活性剤、T WEEN（商標）20非イオン性界面活性剤、NP−40又はMEGA−８から選ばれうる。本発明の一の態様において、この界面活性剤は0.05％（ｗ／ｖ）のTRITON（商標）Ｘ−100とする。 ExLISAバッファー系に含ませるための塩の適切な濃度は、第一抗体−検査物質複合体の最適な形成を供するように選ぶ。生理食塩水溶液は約25mM〜約175mM、より好ましくは約100mM〜約175mMに範囲する濃度で使用することが好ましい。好適な塩は塩化ナトリウム、塩化カリウム等から選ばれうる。本発明の一の態様において、この塩は140mMの濃度の塩化ナトリウムとする。検査サンプルからの検査物質の抽出により遊離される２価以上の正電荷を有する多価イオンを除去するため、ExLISAバッファー系にキレート剤も利用すべきである。生物又は環境検査サンプルの中に存在しうるこのキレート剤により除去される多価イオンはCa²⁺，Mg²⁺，Zn²⁺，Al³⁺等でありうる。多価イオンの除去は溶液中でのタンパク質の沈殿を防ぐ。このキレート剤は約0.5mM〜約1 0mM、より好ましくは約１mM〜約５mMの範囲の濃度で存在していることが好ましい。適当なキレート剤はEDTA（エチレンジアミン四酢酸）、EGTA（エチレングリコール−ビス（β−アミノ−エチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′−四酢酸）、等から選ばれうる。本発明の一の態様において、このキレート剤は５mMのEDTAとする。第１抗体−検査物質複合体及び第１抗体にコンジュゲートされた検出手段の安定性及び活性を維持するために安定化剤をExLISAバッファー系に加える。安定化剤の濃度は、第１抗体−検査物質複合体の形成をスローダウンさせないよう重要である。好適な安定化剤はアガー、アガロース、ポリエチレングリコール、グリセロール、エチレングリコール等である。安定化剤の好適な濃度は約0.01％〜約 20％（ｗ／ｖ）、より好ましくは約１％〜約10％（ｗ／ｖ）とする。本発明の一の態様において、この安定化剤は１％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール（３キロダルトン）とする。検査サンプルからの検査物質の抽出により溶液の中に遊離するフェノール系化合物を除去するため、フェノール系化合物インヒビターをExLISAバッファー系に加える。フェノール系化合物はタンパク質を沈殿させ、検査物質の溶解及び第１抗体−検査物質複合体の形成を妨害する。好適なフェノール系化合物には、ポリビニルポリピロリドン（PVPP）として知られる不溶性高分子量架橋形態のポリビニルピロリドン、ホウ酸ナトリウム又はポリエチルイミンが含まれる。フェノール系化合物インヒビターの好適な濃度は約0.01％〜約１％（ｗ／ｖ）、より好ましくは約0.05％〜約0.5％（ｗ／ｖである。本発明の一の態様において、PVPPは0.15％（ｗ／ｖ）の濃度で使用する。検査サンプルからの検査物質の抽出により遊離されるプロテアーゼによるタンパク質の消化を防ぐため、ExLISAバッファー系にプロテアーゼインヒビターを加える。かかるプロテアーゼは第１抗体及びタンパク質性検査物質を破壊できる。セリンー、システイン−又はアスパラギン酸型プロテアーゼのいづれかを阻害するプロテアーゼインヒビターがExLISAバッファー系に含ませるのに適当である。適当なプロテアーゼインヒビターはPEFABLOC（商標）、PMSF（フェニルメチルスルホニルフルオリド）、TLCK（Ｎ−トシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン）、 TPCK（Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン）、α−カプロン酸、ロイペプチン、ベンズアミド、アンチパイン又はペプスタチンである。プロテアーゼインヒビターの好適な濃度は約0.01mM〜約１mM、より好ましくは約0.1m M〜約0.5mMである。本発明の一の態様において、PEFABLOC（商標）プロテアーゼインヒビター(Boehringer Mannhein)を0.5mMの濃度で使用する。このアッセイにおいて用いられるどの抗体によっても認識されないタンパク質もこのExLISAバッファー系の中に存在させてよい。認識されないタンパク質は検査サンプルの抽出により遊離される分子又は化合物による非特異的な結合の免疫学的ブロッキングを可能にする。この認識されないタンパク質は、検査サンプルの抽出により遊離されるその他のタンパク質よりも高い濃度で外的に供給せしめることにより、プロテアーゼ攻撃に対するタンパク質の更なる保護をも供する。適当な認識されないタンパク質は牛血清アルブミン(BSA)、オバルブミン、カゼイン又は胎児牛血清である。認識されないタンパク質の好適な濃度は約0.05％〜約５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは約0. 1％〜約２％（ｗ／ｖ）である。本発明の一の態様において、BSAを0.5％（ｗ／ｖ）で加える。最大の便宜、使用抗体の経済性及び一連の用途にとって、検査サンプルをExLI SAバッファー系により最少限の容量で抽出することが所望される。即ち、この抽出は小さな試験管、遠沈管又は任意の類似の小型容器の中で実施してよい。検査サンプルからの検査物質の抽出はガラス棒、乳棒、ボルテキシング、音波処理、ホモジネーション又は検査サンプルの一体化の破壊を助長する任意のその他の物理的力により促進されうる。更に、ガラスビーズ、カルボランダム、シリカ又は任意のその他の粗い材料を、検査サンプルの一体化の破壊を更に助長するように加えてよい。一の例において、プラスチックマイクロ遠沈管及び対合乳鉢組合せであって組織の混合及び抽出にとって幅広く利用されているものが本発明における利用にとって適当であることが見い出された。本発明のその他の固有の特徴は、ExLISAバッファーを用いての検査サンプルからの検査物質の抽出の際に形成される第１抗体−検査物質を捕促するために用いる固相フォーマットである。当業界で一般的に用いられている「固相」は、マイクロタイタープレート又はチューブ壁の非孔質表層及びニトロセルロースのへりの孔質表層を意味する。それ故、当業界におけるイムノアッセイの固相は、本質的には二次元特性を有する捕促媒体を述べている。本明細書で用いる「固相フォーマット」は、本発明のイムノアッセイの捕促媒体を構成するマトリックスの物理的組織又はアレンジメントを意味する。従って、「固相フォーマット」なる語は本明細書では、本発明を、当業界に存在している「固相」を利用するものと区別するために使用している。検査サンプルは最少量のExLISAバッファーで抽出することが好ましいが、固相フォーマットは、それが第１抗体−検査物質複合体の効率的な捕促のために適当であることを必要とする。使用する固相フォーマットは、大容量を形成し、それ故検査サンプルの抽出物がくぐり抜けることのできる多数の隙間空間内に大きな有効表面積が供される三次元の有意義な寸法を有さなくてはならない。更に、第１抗体−検査物質複合体にとっての捕促媒体として利用される固相フォーマットは液体が全体にわたって活発、且つ迅速に流れるに足りるほど多孔性であるべきである。このことは、固相フォーマットが、サブミクロン域ではなく、マイクロメーター域又はそれより大きい孔径を有することを要する。この高多孔性三次元「フォーマット」は本発明の迅速イムノアッセイにおける第１抗体−検査物質複合体の極めて有効な捕促を可能にする。この固相フォーマットの孔質及び物理学的配置の更なる長所は、特にチップ配置において（図１参照）、粒子の除去を行う濾過又は遠心工程の利用を必要としないこと等にある。この粒子は組織の抽出において形成することがあり、慣用の固相のサブマイクロメーターサイズの孔を閉塞してしまいうる。本発明に従って仕上げることができ、且つ適当な固相フォーマットとして使用できうる数多くの材料が入手できる。これらの材料の一部はセルロースアセテート、ポリエステルコート化ポリスチレン、セルロース、ニトロセルロース及びナイロンである。一の好適な態様において、セルロースアセテートファイバーより成り、そしてHydros，Inc.，Falmouth，MAより入手できるACT−10（商標）シリンダーフィルターを固相フォーマットとして利用する。このACT−10（商標）は約４mmの直径及び約６mmの高さを有し、約20〜30マイクロメーターの孔サイズを有するシリンダー形態である。いくつかの例を以下に示し、それにおいてはACT−10（商標）を固相フォーマットとして使用している。別の好適な態様において、ポリスチレンでコーティングされたポリエステルより成り、且つAmerican Filtrona，Richmond，VAより入手できるシリンダー状フィルターを固相フォーマットとして使用する。このフィルターも、直径約４mm及び高さ約６mmを有し、且つ約20〜30マイクロメーターの孔サイズを有するシリンダー形態である。この固相フォーマットは一定のイムノアッセイにとってのセルロースアセテートより優れていることがあり、なぜならポリスチレンコーティングは共有結合にとって使用される官能基の量を増大させることを担うからである。ポリスチレンでコーティングされたポリエステルははるかに強められた物理的保全力も有する。セルロースアセテートより成る固相フォーマットに比べての更なる利点において、ポリエステルの利用は抗体を共有結合させ、冷凍保護剤で乾燥し、次いで使用時まで保存することを可能にする。水分の吸収力に基づき膨張及び収縮するセルロースアセテートはドライ条件下で15ヶ月間保存できる。ポリスチレン固相フォーマットでコーティングされたポリエステルを本明細書に記載のアレンジメント及びアッセイの全てにおいて使用しており、セルロースアセテートにより得られるものと同等又は優れたアッセイ結果をもたらしている。選定の固相フォーマットはそれに適当なアフィニティーリガンドを組合させることによって本発明のイムノアッセイに利用するための準備をしなくてはならない。第１抗体−検査物質複合体を捕促する能力を供するのは固相フォーマットへのアフィニティーリガンドの結合である。本発明の一の態様において、適当なアフィニティーリガンドを固相フォーマットに、まず固相フォーマット上のアルキル化を介してアミノ結合基を作り上げることによって結合させる。適当なアルキル化剤はアルデヒド及びＮ−マレイミドである。固相フォーマットを調製したら、次に第２抗体を化学反応性アミノ基を介して固相フォーマットに共有結合させる。アルデヒドの場合、可逆性シッフ塩基をアルデヒド基と第２抗体上のアミノ基との間で形成させる。次にこの結合を低濃度のナトリウムシアノボロハイドライドによる還元アルキル化を介して安定化させる。このようにして調製した固相フォーマットを第１抗体−検査物質複合体の捕促のために利用できうる。他方、第１抗体−検査物質複合体の捕促の前に、第３抗体を第２抗体に免疫学的に結合させてよい。この第３抗体は検査物質を免疫学的に認識し、それに免疫学的に結合し、そしてそれ故第１抗体−検査物質複合体を捕促するようなものとして選ぶ。本発明の別の態様において、この固相フォーマットはまず反応性アルデヒド基を作り上げるように上記の通りに調製する。調製できたら、ストレプトアビジンを反応性基に共有結合させ、次いで低濃度のナトリウムシアノボロハイドライドで還元させる。このようにして調製した固相フォーマットを、第１抗体−検査物質複合体に結合しているビオチンラベル化第２又は第３抗体の捕促のために利用する。本発明の更なる態様において、固相フォーマットを上記の通りにして調製する。調製できたら、適当な抗原を選定の抗原の化学的性質に適する手段を介して固相フォーマットに共有結合させる。この固相フォーマットを、結合抗原を認識する抽出物中の抗体の捕促のために使用してよい。アフィニティーリガンドを固相フォーマットに共有的な状態で結合させることは本発明の必要要件ではない。抗体、その他のタンパク質及び多くの抗原は静電力又はその他の分子間力を通じて固相フォーマット収着させることができる。このようにして調製した固相フォーマットは、検査サンプル中に存在している検査物質を捕促するうえで同等に有効である。しかしながら、アフィニティーリガンドと固相フォーマットとの間の結合の長期安定性は危険な場合があり、その理由はかかる結合は共有結合よりも弱いからである。このようにして調製した固相フォーマット−アフィニティーリガンド複合体を、ExLISAバッファー系による検査サンプルの抽出を介して得られる第１抗体−検査物質複合体を捕促するのに用いる。本発明は現存の方法と比べたときに固有の捕促方法を提供する。第１抗体−検査物質複合体の捕促は、本発明のイムノアッセイに用いる適当なアフィニティーリガンドが結合している固相フォーマットの隙間空間を通じて適当な容量の抽出物を流すことにより行う。孔質固相フォーマットにより供される大きな有効表面積を介する適当な容量の抽出物を流すことは、第１抗体−検査物質複合体の極めて有効な捕促を提供する。本発明の一の態様において、固相フォーマットをプラスチックピペットチップの中に、その固相フォーマットが図１に示しているようにチップの内周全体に対して密着するように押し付けて収納する。これは、本質的に低容量「クロマトグラフィー」カラムをもたらす。ExLISAバッファーを用いて検査サンプルから調製した抽出物を標準のピペッターを用いてピペットチップに流し入れると、その抽出物は固相フォーマット全体に流れる。このアレンジメントは適当なアフィニティーリガンドの結合した非常に大きな表面積を供し、ExLISAバッファー系を利用する検査サンプルからの検査物質の抽出の際に形成される第１抗体−検査物質複合体の迅速、且つ動的な捕促を可能にする。このことは、20μｌ未満の比較的少容量の抽出調製物の利用を可能とし、同時に約10μｇ以上の検査物質の結合能を供する。低容量及び高結合能の固有の組合せは第１抗体−検査物質複合体の高濃度回収を可能にする。この固相フォーマットはアイ・ドロッパー・バレル及びシリンジバレルの双方においても、同等の結果をもって採用されうる。更に、アイ・ドロッパー及びシリンジアレンジメントの双方は、接続バルブ又はプランジャーによる吸引及び排出を更なる機械装置を必要とすることなく、可能にする。双方のアレンジメントは第１抗体−検査物質複合体の捕促のための大きな固相フォーマットの利用も可能とし、これは増大した濃度の抗体の共有結合、その結果としての増大した量の検査物質の捕促を可能にする。採用できるその他のアレンジメントは、小さなろう斗型において開放端を有するウェルをもつ96穴マイクロプレート鋳型、例えばPolyfiltronics，Inc.，Rock land，MAより入手でき、且つ商品名FILTAPLATE（商標）で市販されているものでありうる。このマルチウェルプレートは、マイクロプレートの上からろう斗を介し、マイクロプレートの下方のリザーバーに至るまで真空を導くことも可能にする小型の真空ユニットに収納してよい。上記のポリスチレンコート化ポリエステル固相フォーマットであってその強固な物理的保全性を理由にこのアレンジメントに極めて適合するものをマルチウェルプレートの各ウェルの中に、固相フォーマットがウェルの内壁の周囲に密着するようにして置く。96の検査サンプルまで単独アッセイで操作できうる。このアレンジメントは検査物質の定量的、且つ定性的な測定の双方を、使用した検査手段により可溶性又は不溶性反応生成物のいづれが生成されるかを選択することに依存して、可能にする。本発明に係るこのような迅速イムノアッセイの定量バージョンは固相フォーマットに共有結合した第２又は第３抗体を採用し、それはマルチウェルプレートのウェルの中に入れる。次いで検査サンプルを適当な第１抗体−酵素コンジュゲートを含むExLISAバッファー中で抽出し、そしてウェルに加える。次いでポリエステルフィルター要素を含むウェルにわたって真空を適用する。このウェルを真空により洗浄し、そして不溶性反応生成物を生成する基質を加え、そして真空により除去する前に捕促された検査物質複合体に結合した酵素と反応させる。その結果としての比色検査は検査物質の存在の定性的な目視検査を可能にする。このアレンジメントを基礎とする迅速イムノアッセイの定量バージョンは２つの例外を除き、上記の定性バージョンと同一である。第１に、マイクロプレートを収納する真空装置の第2 96穴マイクロプレートの真下での且つ第１プレートとインラインでの追加を許容するように改良し、これにより第１マイクロプレートの各ウェルが第２マイクロプレートの対応のウェルの真上にくるようにする。この第２プレートはELISA式アッセイのために利用される任意の慣用の96穴プレートであってよい。ウェル中での固相フォーマットによる検査物質の捕促及びその後の洗浄の後、第２プレートを改良真空装置に設置する。可溶性反応生成物を生成する酵素基質をウェルに加え、次いで反応生成物を含む溶液を第２マイクロプレートに流し入れる前に検査物質複合体と反応させる。次いでこの第２マイクロプレートを除去し、そして得られる溶液の定量分析のための任意のマイクロプレートリーダーの中に設置する。類似の調製固相フォーマットを含むその他のウェルにおける一般的な標準曲線対比を行うことにより、非常に特異的、且つ高感度な定量分析を迅速、且つ信頼性をもって実施できる。このアレンジメントは後にビオチンでラベルされた第１抗体に複合させるストレプトアビジンにコンジュゲートされた蛍光マーカー及び第１抗体にコンジュゲートされたアルカリ性ホスファターゼ用のケミルミネッセンス基質の双方の利用を可能にする。得られる感度は、ピペットチップアレンジメントにおいてセルロースアセテート固相フォーマットを利用することにより可能な感度よりも、少なくとも1000倍優れている。適当なアフィニティーリガンドの結合により固相フォーマットが調製できたら、それは多層アレンジメントにおいてその他の類似の調製した固相フォーマットと組合せてもよい。この多層アレンジメントは一回の抽出で複数種の第１抗体− 検査物質複合体の検出を可能にする。このアレンジメントは一回のアッセイ工程において陽性及び陰性コントロール結果を決定を可能にする陽性又は陰性コントロール層の一体化を可能にもする。一回のアッセイで１より多くの種類の検査物質を検出するのに利用するとき、このExLISAバッファー系は検査サンプル中で検出される一連の検査物質に特異的である様々なコンジュゲート化第１抗体を含むように改良されるであろう。多重固相フォーマットを利用することができ、このフォーマットは、例えば、低、中及び高レベルの検査物質に対応するであろう複数の固相フォーマットのそれぞれに第２及び／又は第３抗体をレベルを増やして結合させることにより、半定量的なイムノアッセイを提供できる。検査サンプル中に存在する検査物質のレベルに依存して、第１（低）の、第２（中）の又は第３（高）の調製した固相フォーマットは、利用した検出手段に従って陽性の反応を示すであろう。捕促した第１抗体−検査物質複合体の検出、それ故検査サンプル中の検査物質の有無の決定は当業界に公知である多種多様な方法を通じて成し遂げられうる。イムノアッセイの検出の一般的及び特殊な原理を説明する有用な文献はE．Harlo w and D．Lane，Antibodies，A Laboratory Mannal，Cold Spring Harbor Labor atory，New Y ork，1988又はE．T．Maggio編、Enzyme−Immunoassay，CRC Press，Florida，19 80に見い出せる。両文献とも引用することで本明細書に組入れる。検出技術は直接及び間接法は分けることができる。直接法においては、第１抗体は検出手段をそれにコンジュゲートさせることによりラベルする；次いで第１抗体を検査物質に直接結合させるのに利用する。直接法において有用なかかる検出手段の例は放射性ヨウ素、発色原基質を利用する様々な酵素、ビオチン、蛍光団、金属、例えばコロイド状金、又は放射性アミノ酸前駆体の存在下での第１抗体の生合成である。間接法においては、第１抗体はいづれの検出手段にもコンジュゲートさせない。その代わり、検査物質に対するその結合能を第二試薬により、例えばラベル化抗イムノグロブリン抗体又はラベル化プロテインＡを用いて検出する。検出手段の選定は、アッセイ条件、使い易さ、試薬の入手性、試薬の安定性及び必須のアッセイ感度に依存する。本発明において好適なのは検出手段としての直接法の利用である。有用な直接法に対する広い一般論として、検出手段としての酵素ラベルは簡単な目視結果の利点を供し、そして優れた感度はそれらを定量アッセイにとって有用なものとするが、しかし定量アッセイにおいて使用するのは一層困難であり、その理由は反応速度を精度をもって測定する必要性にある。第１抗体の放射性ヨウ素ラベリングは著しく正確な定量結果をイムノアッセイ手順において供するが、しかし厳格な安全な手順がその利用にとって必要とされる。蛍光団は、たとえそれらがイムノサイトケミストリーの如くの用途において高解像度を供するにしても、紫外光励起手段及びフルオリメトリー又は蛍光顕微鏡による検出も必要とする。金属ラベル、例えば金コロイドは数多くの有用な方式において一層幅広く有用となりつつある。金は生物学的に不活性であり、そして良好な電荷密度を有し、それが第１抗体上の帯電基に容易に結合するようにする。本発明の好適な一の態様において、酵素は検出手段として第１抗体にコンジュゲートさせる。抗体は酵素への共有結合によって容易にラベルできる。例えば、 S．Avrameas，Enzyme Markers：Theirlinkage with proteins and use in immun o-histochemistry ，Histochem．J．４：321-330，1972を参照のこと。酵素反応は検出シグナルを本質的に増幅させるため、かかるコンジュゲートは極めて高感度でありうる。検出レベルはピコモルの域ほどに低いことがある。多種多様な酵素が抗体とラベルするのに使用されている。最も一般的に使用されているのは西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びβ−ガラクトシダーゼである。ウレアーゼ及びグルコースオキシダーゼも限定されて利用されている。検出手段としての利用にとって理想的な酵素は安価であり、非常に安定であり、そしてコンジュゲートし易いものであるべきである。理想的な酵素は高触媒活性を有し、且つ可溶性の生成物及び不溶性の生成物の双方を供する一連の基質と反応もすべきである。本発明の好適な態様において、牛小腸アルカリホスファターゼを検出手段として利用する。しかしながら、数多くの検出方法が存在し、そして任意のいくつかの検出方法が利用できることが本発明の範囲に包括されることと解されるべきである。検出手段のコンジュゲーションは当業界に公知である。酵素はいくつかの一般的な方法のいづれかによって第１抗体にコンジュゲートさせることができうる。グルタルアルデヒド法においては、グルタルアルデヒドは酵素及び第１抗体に、各タンパク質上に有用な反応性アミノ基を介して結合する。例えば、S．Avramea s, Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehyde ，Immunochemistry６：43-52，19 69を参照のこと。過ヨウ素酸塩法においては、炭水化物の過ヨウ素酸処理は環構造を開き、そしてこれらの成分がタンパク質上に存在している遊離なアミノ基に結合することを可能にする。例えば、P．K．NakaneとA．KawaoiのPeroxidase la beled antibody：A new method of conjugation, J．Histochem．Cytochem.22： 1084-1091，1974を参照のこと。酵素上のアミノ基のコンジュゲーションはSPDP （Ｎ−スクシニミジル−３−〔２−ピリジルジチオ〕プロピオネート）との反応、還元及びピリジルジスルフィド架橋の形成を介して抗体上に導入したチオール基に共有結合させてもよい。A．J．Cumberら、Preparation of antibody-toxin conjugates ，Methods Enzymol．112：207（1985）。本発明におけるアルカリホスファターゼのコンジュゲーションの好適な方法はグルタルアルデヒド法である。他方、第１抗体にコンジュゲートさせた検出手段はいく種かの蛍光団のいづれかであってよい。４種の蛍光団、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレット及びフィコエリセリンが一般的に利用されている。蛍光団はDMSO（ジメチルスルホキシド）の中での塩化アンモニウムとの反応により第１抗体にコンジュゲートさせる。例えば、J．W．Goding．Conjugatim of antibodies with fluorochrome s, J．Immunol．Methods 13：215-226，1976を参照のこと。本発明の一の好適な態様において、フルオレセイン（FITC）又はローダミン(TRITC)のイソシアネート誘導体を使用する。酵素検出手段にとっての基質は可溶性又は不溶性反応生成物のいづれかを生成しうる。不溶性酵素反応生成物は、反応後に固相フォーマット内に残る利点を有する。このことはイムノアッセイの結果の目視観察を可能にする。不溶性反応生成物の利用は本態様における個別に調製したフォーマットの積層を可能にする利点も有する（図１参照のこと）。反応生成物の不溶性はある層から隣りの層への漏出を阻止し、多重第１抗体−検査物質複合体又は半定量分析についての同時アッセイを可能にする。他方、使用する基質が可溶性酵素反応生成物を生成するなら、その生成物は第１抗体 −検査複合体を捕促している固相フォーマットから漏出することがあり、そしてその存在は例えば光度計により検出でき、これによって第１抗体−検査物質複合体の量は定量的に決定されうる。本発明のイムノアッセイは、植物、哺乳動物、昆虫、微生物、土壌、空気、水、又は環境に一般に存在又は由来する多種多様な検査物質を検出するのに利用できうる。この検査物質は多種多様な分子又は化合物であってよく、それには限定することなく、抗体、抗原、ハプテン、有機化学物質、例えば除草剤、タンパク質、酵素、ホルモン、炭水化物、脂質、巨大分子、ポリマー、植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞又はその一部、ウィルス、ウィルスのサブユニット、毒素、医薬品、アレルゲン、微生物、例えば細菌、菌類、酵母、マイクロプラズマ又はその任意の一部、又は免疫学的に活性であるもしくはそうなりうる任意の検査物質が含まれる。本発明を利用する一般的なイムノアッセイ手順は、検査物質の有無についてアッセイすべき検査サンプルの獲得により始まる。検査サンプルを、適当な量及び組成を有する組合せた第１抗体及びExLISAバッファー系の存在下で適当な容器の中に入れる。検査サンプルは検査サンプルの種類に適する任意の手段によって得られうる。例えば、植物組織は切断、断片化、引裂、打ち抜き又はクリッピングにより獲得できうる。他方、血液サンプルは簡単な液体転写工程により獲得できうる。哺乳動物組織サンプルは多種多様な有用な生検手順のいづれかにより獲得できうる。本発明の要件は、第１抗体を、使用前にExLISAバッファー系と合わせることにある。対比のために多くの検査サンプルを同時に調製するとき、検査サンプルの量はサンプル間で合理的に一致していることが所望される。このことは、使用するExLISAバッファー系の容量と抗体の量の双方が、検査物質の最大の感度レベル及び抽出を獲得するのに適する比に維持されていなければならないことにおいて重要である。更に、検査サンプル間で最も正確な対比ができるよう、大雑把に等量のサンプルを各アッセイのために獲得すべきである。検査サンプルをExLISAバッファー系及び第１抗体と合わせたら、検査サンプルの一体性を崩壊及び検査物質の抽出を助長するある程度の物理的力を供することが必要でありうる。検査サンプルからの検査物質の抽出を助長する手段のいくつかの例は、ガラス棒、乳棒、ボルテキシング、音波処理又はホモジネーションの利用による。更に、ガラスビーズ、カルボランダム、シリカ又は任意のその他の粗い材料を検査サンプルの一体性の破壊率を更に高めるために任意的に加えてよい。本発明の一の利点は、ExLISAバッファー系が、第１抗体と検査物質との最適な反応を抽出工程の際の検査サンプルからのその遊離の直後に可能にすることにある。検査サンプル、ExLISAバッファー系及び第１抗体を本発明のガイドラインに沿って決定したら、抽出物中の検査物質は、約５〜約60秒以内、より好ましくは約５〜約30秒以内、最も好ましくは約10〜約15秒以内での捕促のために調製されうる。上記の工程において形成される第１抗体−検査物質複合体の捕促は、上記の方法に従って予め調製した固相フォーマットの隙間空間にわたって抽出物を流すことにより行う。孔質な固相フォーマットにより供される大きな有効表面積にわたる適当な容量の抽出物の流れは、非常に有効な第１抗体−検査物質複合体の捕促を供する。この抽出物を固相フォーマットの隙間空間内に約５〜約60秒、より好ましくは約５〜約30秒、最も好ましくは約10〜約15秒保持する。この抽出物は適当な時間を経て固相フォーマットから放出される。捕促された第１抗体−検査物質複合体を捕促した固相フォーマットを次に適当な洗浄バッファーで洗う。このことは固相フォーマットからの残留化学品及び捕促されなかった物質の除去の効果を有する。固相フォーマットの洗浄は、洗浄バッファーをそれに流し、次いでそれを放出させる又は洗浄バッファーを追い出す力をそれにかけることによって達成される。捕促された第１抗体−検査物質複合体を含む固相フォーマットを洗浄した後、検出手段にとって必要な任意の試薬を加える。本発明のイムノアッセイは上記の及び当業界に公知の多種多様な検出手段を利用してよい。本発明の好適な態様において、検出手段として酵素を第１抗体にコンジュゲートし、次いで適当な基質を固相フォーマットに流し込む。次いで基質をコンジュゲート酵素と反応させ、検出可能な生成物を生成させる。この手段による検出は一般に５分以内に達成される。一の好適な態様において、本発明は以下の工程に従って植物組織の中の検査物質の有無を決定するために有用である：１．鋭利なキャップ付きマイクロ遠沈管を、少量の植物組織のサンプルを得るため、サンプリングする植物器官の上にキャップをかぶせ、植物器官の一部が植物体から切り離され、そして管の中に収容されるようにすることにより、利用する。２．アルカリホスファターゼがコンジュゲートされている適当な第一抗体と予め組合された250μｌのExLISAバッファー系をサンプリング管に加える。この組織を約５〜10秒間混合する。３．この抽出物を、上記の通りにして適当なアフィニティーリガンドで調製したACT−10（商標）固相フォーマット（Hydros，Inc．，Falmouth，MA）の中に流し込む。この混合物を約５〜15秒間保持して第１抗体−検査物質複合体の捕促を促進し、次いで放出させる。４．チップを１μｌの洗浄バッファー（10mMのトリス−TRIZMZ pH8.0，0.05％ｗ／ｖのTWEEN（商標）20非イオン性界面活性剤、0.02％ｗ／ｖのアジ化ナトリウム）により、そのバッファーをチップの下へと押し出すことにより洗浄する。５．このチップに約50μｌの酵素基質、ニトロブルーテトラゾリウム及びブロモクロロインドールホスフェートを流し込む。６．完全な発色のために５〜10分待ち、そして結果を記録する。他方、検査サンプル中の抗体を検査することが所望されるなら、適当な抗原を固相フォーマットに共有結合させ、そして効率的な抗原の捕促及びその検出をもって、単独工程の検査及び抗原反応と同じ原理を利用する。例えば、一定の血清内の抗体集団を決定するためのIgG又はIgMの如くのイムノグロブリンの分類は、固相フォーマットの多重積載した連続層であって各層が異なるイムノグロブリンアイソタイプを捕促できる層を利用し、本発明により迅速に成し遂げることができる。各イムノグロブリンクラスへと調製された抗体を適当な固相フォーマットに結合させることができる。個々の固相フォーマットを各イムノグロブリンクラスのために調製でき、次いでそれぞれを多層アレンジメント中のピペットチップ内に入れる（図１参照）。適当なExLISAバッファー系を利用する同時での血清の抽出及び第１抗体−イムノグロブリン複合体の形成の後、調製した固相フォーマットの各層の隙間空間内で種々の第１抗体−イムノグロブリン複合体を捕促するため、検査サンプルを各層に流す。上記の任意の如くの標準検出法を、検査サンプル中の種々のイムノグロブリンの存在を示すために用いる。血清中の抗体を検出するための本発明の利用の別の例は、ヒト免疫不全ウィルス(HIV)に対する抗体の検査である。ホルマリン固定化HIV又はコートタンパク質を適当なフォーマットに結合させる。血清を抽出し、そして第１抗体−検査物質複合体の形成を、第１抗体として例えば抗ヒト抗体を含む適当なExLISAバッファー系を用いて第１抗体−検査物質複合体の形成を成し遂げる。抽出物を、非生存性ウィルス又はコートタンパク質の結合している孔質固相フォーマットに流し、第１抗体−HIV特異抗体複合体を捕促する。その後の検査は任意のいくつかの述べられた手段により行う。同時での抽出及び第１抗体−検査物質複合体形成、前記複合体の捕促、並びに前記複合体の形成の要素を組合せた本発明は、２分以内で広範囲な環境条件下で実施できるイムノアッセイを提供する。それは実験室施設なしで、現場、オフィス、グリーンハウス、農場又は家庭で利用するのに十分なほど簡単である。本発明は発現したタンパク質、病原体、特定の抗原、特定の抗体、環境中の化学物質、又は任意の物質であってそれに対するモノクローナルもしくはポリクローナルのいづれかである抗体が得られうるものの検査のために利用できうる。本発明に含まれる固有の方法は資源又は時間における付随の費用を伴うことなく、一層向上した方法の検出感度を保持する。本発明のイムノアッセイは簡単な仕様書に従って誰にでも実施でき、家庭、オフィス、現場又は任意のその他の場所での利用を可能にする。本発明の有用性を最大限とするため、キットの形態で組立てられたイムノアッセイであって、（ａ）前述の検査物質に対して結合できる第１抗体の存在下におけるこの検査物質の抽出手段、ここでこの第１抗体は検出手段にコンジュゲートされている；（ｂ）前記第１抗体及び前記検査物質により形成される複合体を捕促できる多数の隙間空間を有する大きな容量を形成するよう三次元において有意義な寸法を有する固相フォーマット；（ｃ）請求項29記載のExLISAバッファー系を含む容器；（ｄ）検出可能な反応生成物を生成するための前記検出手段と反応性の試薬；（ｅ）前記試薬の分注手段；を密閉区画で収容するように仕切られたキャリヤーを含んで成るものを得ることが所望される。かかるキットは使用するのが簡単であり、なぜならそれは結果を得るのに必要な全ての試薬を含むからである。本発明の一態様において、イムノアッセイのためのキットは各検査サンプルのためのマイクロ遠沈管、各検査サンプルのためのピペットチップであって、第１抗体−検査物質複合体の捕促のための適当なアフィニティーリガンドにより調製された固相フォーマットが、陽性コントロールとして調製した固相フォーマット及び陰性コントロールとして調製した固相フォーマットと一緒多層アレンジメントで収納されているチップ、マイクロ遠沈管の中の検査サンプルを粉砕するのに適する乳棒、中に予め希釈されている検出手段にコンジュゲートされた第１抗体を任意的に有する又は有さないExLISAバッファー系の分注用ボトル、洗浄バッファーの分注用ボトル、洗浄バッファーのために用いる各検査サンプルのための１mlのディスポーザブル分注ピペット、及び第１抗体にコンジュゲートされた検出手段と共に用いる適当な試薬の分注用ボトルを含んで成る。20までの検査サンプルのために十分なパーツを含むキットが現場条件での利用に好都合である。本発明の別の態様において、大スケール用途のためのキットを、成分がバルク状で調製され、そして20倍以上の量で入れられるように作ってよい。大容量の試薬を供給するか、又は２倍〜10倍の濃度において供給し、そして追加のディスポーザブルピペット及び乳棒をキットに追加する。以下の実施例は本発明の実施において利用した材料と方法及びその結果を更に説明する。これらは例示で提供し、そしてその説明は本発明を限定するものと解すべきでない。図面の簡単な説明図１（チップアレンジメント中の多層固相フォーマット）は本発明の一態様の模式図を示し、それでは個別に調製した固相フォーマットは、第１抗体−検査物質複合体の捕促及び検出、それと同時に陽性及び陰性コントロール検査の双方を実施するための多層アレンジメントに置かれている。固相フォーマットは慣用のプラスチックピペットチップの内側に、それらがチップの内周全体に密着するように収納されている。実施例Ａ．ExLISAバッファー ExLISAバッファー系の一の好適な例は、50mMのNaCO₃ pH8.5，140mMのNaCl，５ mMのEDTA，0.05％のTRITON（商標）Ｘ−100非イオン性界面活性剤、0.15％のPVP P（ｗ／ｖ），１％のPEG（３キロダルトン）、0.5mMのPEFABLOC（商標）プロテアーゼインヒビター、0.5％のBSAより成る。本例は、植物組織又は細胞の抽出にとって幅広く有用であることが見い出され、第１抗体−検査物質複合体の抽出及び形成を一の同時の工程において有効に組合せる。これらの試薬は一般に表示の化学品供給会社より入手できる。 50mM NaCO3 pH8.5 （Sigma Chem.） 140mM NaCl （Sigma Chem.） 5mM EDTA （Sigma Chem.） 0.05％ TRITON（商標）Ｘ−100 （Sigma Chem.） 0.15％ PVPP （Sigma Chem.） 1.0％ PEG(３kd) （Sigma Chem.） 0.5％ BSA （Sigma Chem.） 0.5mM PEFABLOC（商標）（Boehringer Mannheim）使用前に、本発明におけるExLISAバッファーを、検出手段の一例としてアルカリホスファターゼにコンジュゲートされている第１抗体と組合せる。この第１抗体は、検査物質を免疫学的に認識するように選定し、そして任意の起源、例えばヤギ、ウサギ、ラット又はマウスから調製できうる。イムノアフィニティー精製を精製第１抗体を得るために利用してよく、そして仔牛小腸アルカリホスファターゼをAvrameas前掲の改良グルタルアルデヒド法を利用してそれにコンジュゲートしてよい。コンジュゲートした第１抗体を、本発明に係るアッセイにおける使用のために有効な希釈率を決定するために力価検定する。適当な希釈率は作製した第１抗体のバッチ毎に決定しなくてはならないが、しかし一般にはExLISAバッファーの中で１：100〜１：1000の範囲である。ExLISAバッファー中の第１抗体コンジュゲートは、その存在下で植物組織又は細胞を混合したときに検査物質にすぐに結合する。Ｂ．葉組織の中で発現したバチルス・スリジエンシス・カースタキ（Bacillus t hurigiensis kurstaki）（Btk）エンドトキシンの検査固相フォーマットは上記した通りであり、その一例はHydros，Inc．（Falmout h，MA）より購入でき、そしてACT−10（商標）として商業的に知られ、それはタンパク質上に存在する第１アミン基に結合できる。この固相フォーマットに共有結合した第２抗体をヤギ抗−ウサギ抗体（多数の販売会社から市販）から100μｇ／mlの濃度において硼酸食塩水(100mMの硼酸、25mM の硼酸ナトリウム、75mMの塩化ナトリウム、pH8.5)バッファーで４℃で一夜かけて免疫精製した。次いで未結合のヤギ抗−ウサギ抗体を固相フォーマットから除き、そして結合したヤギ抗−ウサギ抗体を20mMのナトリウムシアノボロハイドライドによるシッフ塩基の還元により２〜４時間かけてそのフォーマットに共有結合させた。固相フォーマット上の任意の残留活性部位をブロッキングバッファー (３％ｗ／ｖの牛血清アルブミン、0.02％ｗ／ｖのアジ化ナトリウム、10mM のリン酸ナトリウム、140mMの塩化ナトリウム、pH7.5)で少なくとも１時間４℃ でブロッキングした。ブロッキングバッファーを除き、次いでイムノアフィニティー精製したウサギ抗−Btk第３抗体を希釈バッファー（１％ｗ／ｖの牛血清アルブミン−0.02％のアジ化ナトリウム、0.05％のTWEEN（商標）20非イオン性界面活性剤、10mMのリン酸ナトリウム、140mMの塩化ナトリウム、pH7.5)の中に1 5μｇ／mlで加え、そして４℃で一斉インキュベートした。この第３抗体は通常の抗体−抗原反応で第２抗体に結合する。 Btkエンドトキシンタンパク質アッセイのために３層の固相フォーマットをピペットチップの中に収納した（図１に示す通り）。底の固相フォーマット層はアッセイ陽性コントロールであり、それは固相フォーマットに共有結合した仔牛小腸アルカリホスファターゼより成る。陽性コントロール層の上の固相フォーマットは陰性コントロールであり、それは収着した牛血清アルブミンより成る。この上部の固相フォーマット層は、上記の通り、抽出物から第１抗体−検査物質複合体を捕促するために用いる層である。ピペットチップの中に収納されたこの３層の固相フォーマットは、検査サンプル抽出物を準備するまでチップ保存バッファー（25mMのトリス、140mMのNaCl，pH7.8，2％ｗ／ｖのBSA，0.05％ｗ／ｖのTWEEN（商標）20非イオン性界面活性剤、0.02％ｗ／ｖのNaN₃）の中に保存しておく（６ヶ月まで保存できる）。この保存バッファーは使用直前に調製固相フォーマットから吸引除去する。検査植物の葉組織は、葉の上に1.5mlのマイクロ遠沈管の蓄を食いつかせることにより獲得し、これは小さな円形の葉領域を取り出させる。この検査サンプルはアッセイを１時以内で実施できないとき、又は周囲温度が90°Ｆより高いとき、低温に保っておく。次いでこの組織を上記の実施例Ａに記載の250μｌのExLIS Aバッファーの存在下で、混合用のKontes（商標）(Vineland，N．J.)プラスチック乳棒を用い、約５秒間の強い回転運動により混合する。抽出の際、第１ヤギ抗 −Btk抗体又はマイクロ遠沈管の中での乳棒による混合により組織から遊離するB tkエンドトキシンに結合する。次いでこの抽出物を調製固相フォーマットの隙間空間に流し、第１抗体−Btk複合体を固相フォーマットに結合した第２抗体−第３抗体複合体に捕促させる。この抽出物を固相フォーマットに少なくとも15秒間保持し、次いで廃棄槽に放出させる。この抽出物は放出するまで室温で１時間までは固相フォーマットの中に残留しておいてよいが、しかし２〜３分を超えると、感度はわずかにしか上がらない。捕促後、この固相フォーマットを１mlの洗浄バッファー（10mMのトリス−TRIZMA，pH8.0，0.05％ｗ／ｖのTWEEN（商標）20 非イオン性界面活性剤、0.02％ｗ／ｖのアジ化ナトリウム）で洗う。次いでこの固相フォーマットをニトロブルーテトラゾリウム及びブロモクロロインドールホスフェート（これは化学品供給業者Kirkegaard & Perryより入手できるアルカリホスファターゼ用の単一成分基質である）で飽和にする。存在しているBtkエンドトキシンタンパク質の量に依存して、反応はほぼ直ちに始まりうる。しかしながら、一般に反応は、結果を記録する前、少なくとも５分間進行させておく。完全サンドイッチ複合体のみがアルカリホスファターゼに特異的な基質により同定されるであろう。酵素基質をUV光から隔離しておく注意を払わねばならず、なぜなら基質は光感度性であるからである。特定の検査サンプルについての結果を、３枚の層のそれぞれに存在している色調を記録することにより決定する。陽性コントロールとしての底の固相フォーマット層はアッセイを行うときに常に濃青色に変化すべきである。陽性コントロールの上方の固相フォーマットは陰性コントロールであり、それはアッセイのときに常に白色から薄灰色のままであり続けるべきである。最上固相フォーマット層は捕促及びその後の第１抗体−Btkタンパク質複合体の存在の検出のためにあり、そしてその存在下でのみ変色するであろう。従って、濃青色の未知の固相フォーマットはBTの存在について陽性の植物を示し、そして変色なし（陰性コントロールにより表示される白色、又は薄い灰色）はBT陰性の植物を示す。もし陽性コントロール（底部固相フォーマット層）が濃青色に変化しないか又は陰性コントロール（中央の固相フォーマット層）が白色又は薄灰色のままでないなら、このアッセイは反復しなくてはならず、なぜならこのことは偽せの測定値を示しているからである。 500以上の植物を、現場条件下での本発明の迅速イムノアッセイ及び慣用の実験室ベースELISAの双方によりBtkエンドトキシンの存在について検査した。この２通りのアッセイ間で完璧な相関が観察され、この迅速イムノアッセイは、一層時間及び資源のかかるELISAと同程度の感度及び信頼性があることを示唆する。Ｃ．葉組織におけるキュウリ（cucumber）キチナーゼの検査このイムノアッセイは、使用した抗体を除き、上記と同じ手順を踏む。葉組織内の発現したキュウリキチナーゼタンパク質の存在についてアッセイするため、ヤギ抗−マウス第２抗体をアルデヒド基によるシッフ塩基形成、シアノボロハイドライドによる還元及び牛血清アルブミンによる未反応部位のブロッキングにより所望の固相フォーマットに共有結合させた。キュウリキチナーゼに対する３種類の免疫精製したモノクローナルマウス第３抗体の混合物を通常の抗体−抗原反応を介してヤギ抗−マウス第２抗体に結合させた。この調製した固相フォーマットを次に第１抗体−検査物質複合体の捕促のために用いた。調製した固相フォーマットをピペットチップの中に、上記の通り陽性コントロールのための固相フォーマット層及び陰性コントロールのための別の固相フォーマット層と共に収納した。このExLISAバッファー系は上記の実施例Ａに記載のものと同じであるが、ただしイムノアフィニティー精製したウサギ抗−キュウリキチナーゼ第１抗体をそれに加えた。この第１抗体を上記の通りにしてアルカリホスファターゼにコンジュゲートした。ExLISAバッファー系の存在下で組織を混合することにより調製した抽出物を、調製した固相フォーマットの隙間空間の中に流し込んだ。酵素基質による処理により、上部の固相フォーマットは第１抗体−キチナーゼタンパク質複合体が存在しているときに濃青色に変色した。以下の実施例Ｄに記載の原理を利用し、キチナーゼの発現を、第２抗体のレベルを増やしながら調製した固相フォーマットの多層アレンジメントを用い、半定量的な状況でも検査した。病原体感染に応答してキチナーゼと一緒に植物の中で往々にして内因的に発現されるPr−１塩基性タンパク質を、適当な第２抗体により調製した固相フォーマットをチップアレンジメントにおいて組合せたときに、上述の通りにしてキチナーゼと一緒に検査された。Ｄ．ムギ（wheat）の菌類病原体の検査このイムノアッセイは、病原体の検査のために用いた抗体を除き、先に記載と同じ手順を踏んだ。イムノアフィニティー精製したヤギ抗ヒツジ第２抗体を適当な固相フォーマットに反応性アルデヒド基を介して結合させ、そして未反応部位を牛血清アルブミンの添加によりブロッキングした。セプトリア・トリチシ（Se ptoria tritici）に対する精製ヒツジ第３抗体を通常の抗体−抗原反応を介してヤギ抗−ヒツジ第２抗体に結合させた。ExLISAバッファー系は実施例Ａに記載の通りとしたが、ただしアルカリホスファターゼにコンジュゲートしたイムノアフィニティー精製したヒツジ抗−セプトリア・トリチシをそれに加えた。ExLISAバッファー系の存在下で組織を混合することにより調製した抽出物を、調製した固相フォーマットの隙間空間に流し込んだ。酵素基質による処理を経て、上部の固相フォーマット層は第１抗体−セプトリア・トリチシ抗原複合体が存在しているときに青色に変色した。ムギ植物のセプトリア・トリチシ又はセプトリア・ノドルム（S.nodorum）感染レベルの半定量検出も、固相フォーマットに共有結合した第２及び／又は第３抗体のレベルを調節することにより本イムノアッセイを利用して成し遂げた。３種類の固相フォーマットをそれぞれ、検査すべき病原体の種に応じて、セプトリア・トリチシ又はセプトリア・ノドルムのいづれかに特異的な第２抗体のレベルを下げながら調製した。低、中又は高度感染レベルに対応する第２抗体の量を、本迅速イムノアッセイを較正するために同じ抗体を利用するサンドイッチELISA により予備決定しておいた。３種類の調製した固相フォーマットを、陽性及び陰性コントロールとして調製した固相フォーマットと共に、慣用のプラスチックピペットチップの中に入れて、図１に示すような多重積層した連続層を形成した。葉抽出物を第１抗体−酵素コンジュゲートを含むExLISAバッファー系において調製し、ここでこの第１抗体はここでも検査すべき病原体の種に応じてセプトリア・トリチシ又はセプトリア・ノドルムのいづれかに特異的である。検査物質を含む抽出物を上記の通りにして調製した５つの積層連続固相フォーマットに流した。抽出物を放出させ、チップを洗い、そして酵素基質を目視評価を行うためにチップの中に流し込んだ。種々のレベルのセプトリアは、調製した固相フォーマットの１つ、２つ又は３つが比色的に陽性となることをもたらした。換言すれば、低レベルのセプトリア感染は一つの調製した固相フォーマットが陽性となることをもたらし、中レベルの感染は２つのフォーマットが陽性となることをもたらし、そして高レベルは３つのフォーマットが陽性となることをもたらした。セプトリア・トリチシ及びセプトリア・ノドルムは共に同じ検査サンプルから同じアッセイで同時に検出されもした。２つの調製した固相フォーマットを利用することにより（一方には一病原体を検出するための第２抗体が有結合しており、そして他方にはその他の病原体を検出するための第２抗体が共有結合している）、病原体の一方又は双方が存在していることを区別することが可能であった。双方の調製した固相フォーマットを単数のピペットチップの中に、図１に示しているのと似たようにして、陽性及び陰性コントロールとして調製した固相フォーマットと一緒に入れた。葉サンプルをExLISAバッファー系、及び２種のセプトリア種のうちの一方をそれぞれが認識する２種類の第１抗体−酵素コンジュゲートの存在下でホモジナイズにかけた。この検査サンプル抽出物をチップに流し、放出させ、チップを洗い、次いで比色識別のために酵素基質をチップの中に流し述べた。セプトリアの双方の種が査サンプルの中に存在しているとき、第２抗体で調製した双方の固相フォーマットが陽性的に反応した。セプトリアの一方の種のみが査サンプルの中に存在しているときでは、その種を認識する第２抗体により調製した固相フォーマットのみが陽性的に反応した。シュードセルコスポレラ・ハーポトリコイデス(Pseudocercosporella herpotr ichoides)の検査及び半定量（ムギの眼点病）も迅速イムノアッセイを利用して成し遂げることができる。このイムノアッセイは、検出手段として酵素がコンジュゲートされている第１抗体及び固相フォーマットに共有結合した第２抗体として、Ｐ．ハーポトリコイデスに特異的なポリクローナル抗体を使用する。ムギ組織を抗体−酵素コンジュゲートを含むExLISAバッファーの中でホモジナイズし、そして上記した通りにして調製した固相フォーマットに流した。眼点病感染レベルはセプトリアについて上記した単独アッセイにおいて半定量でき、又はＰ．ハーポトリコイデス、Ｓ．トリチシ及びＳ．ノドルムの存在は全て単独迅速イムノアッセイで検出できる。Ｅ．バナナの菌類病原体（シガトカ〔Sigatoka〕）の検査このイムノアッセイは、適当な抗体を除き、実施例Ｄに記載とまさに同じである。モノクローナル及びポリクローナルの双方を、固相フォーマット調製、第１抗体−査物質複合体の捕促、及び検出手段としてのアルカリホスファターゼによる検出して、第１、第２及び第３抗体のために用いた。Ｆ．昆虫腸レセプターの検査本イムノアッセイの目的は、昆虫プルテラ（Plutella）の個別の個体の腸膜において見い出せる特異的な毒素結合性レセプターの有無の決定にある。このイムノアッセイは、バチルス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）から単離した精製特異的エンドトキシンをアルデヒド基との相互作用を通じて適当な固相フォーマットに結合させ、シッフ塩基をナトリウムシアノボロハイドライドにより還元し、そして未反応の部位を牛血清アルブミンの添加によりブロッキングすることを除き、上記の手順を踏む。ExLISAバッファー系は、プルテラのブラッシュボーダー膜小胞を免疫学的に認識するイムノアフィニティー精製したウサギ第１抗体により調製した。この第１抗体をアルカリホスファターゼにコンジュゲートした。一匹の昆虫をマイクロ遠沈管の中に入れ、そして第１抗体を含むExLISAバッファー系の中で乳棒ですりつぶした。得られる抽出物を、調製した固相フォーマットの隙間空間の中に吸引により流し、そして固相フォーマットに共有結合させたバチルス・スリンジエンシスエンドトキシンにより捕促した。種々のパチルス・スリンジエンシスエンドトキシンを個々の固相フォーマットに共有結合させ、そして各別の固相フォーマットをピペットチップの中で層状に収納した。ウサギ抗−ブラッシュボーダー膜第１抗体は抽出物中に存在する全ての昆虫腸レセプターに非特異的に結合するであろうが、特定のフォーマット層の中に存在している特異的なエンドトキシンに結合するもののみがその層により捕促されるであろう。従って、特定のフォーマット層において結合したエンドトキシンに特異的な第１抗体−腸レセプター複合体のみがその層により捕促され、そしてその層において濃青色の発色を示すものとしてのアルカリホスファターゼによる検出の陽性結果を生み出すであろう。種々のバチルス・スリンジエンシスエンドトキシンに対する腸レセプター結合のバリエーションは、どの固相フォーマット層が陽性反応を、そしてどれが陰性反応を示すかを観察することにより迅速に決定できうる。Ｇ．牛血清中のブルセラ・アボルタス（Brucella abortus）に対する抗体の検査ブルセラ・アボルタスは蓄牛の主要の病原細菌であり、そして著しい経済的な結果の伴う獣医学的病気である牛ブルセラ症を引き起こす。この病気は非常に伝染性であり、そして公的隔離に委ねられている。病気の存在を決定する迅速手段は、牛血清中のブルセラ病原体に対する抗体の存在の決定によることができ、そして病気の伝染をモニター及びコントロールするのに有利であろう。これは病原体の力価が安定でないとき、病原体よりも抗体を検査する利点を有する。ブルセラ・アボルタス又はブルセラ・アボルタスの粗抽出物から部分精製リポ多糖を調製し、そして適当な固相フォーマットに収着させた。固相フォーマットへのリポ多糖結合はレクチンの利用により高めることが可能でありうる。固相フォーマット上の任意の残留結合部位は牛血清アルブミン以外のタンパク質、例えばオブアルブミン又はカゼインによりブロッキングしなくてはならない。このようにして調製した固相フォーマットを多層アレンジメントにおいてピペットチップの中に、陰性コントロール（オブアルブミンの結合した中央層）及び陽性コントロール（アルカリホスファターゼの結合した底部層）のための独立の固相フォーマットと一緒に収納する。適量の牛血清を、アルカノホスファターゼのコンジュゲートしたヤギ抗−牛イムノグロブリン第１抗体の加えておいたExLISAバッファーの中に希釈する。このようにして調製した検査サンプルの抽出物を多層固相フォーマットの隙間空間の中に流し込む。この抽出物を約15秒間保持した後、それを放出させる。次いでピペットチップを洗浄バッファーで洗う。次にこの固相フォーマットを、ニトロブルーテトラゾリウムとブロモクロロインドールホスフェート（アルカリホスファターゼにとっての基質である）とで飽和にする。血清サンプル中に存在するブルセラ・アボルタスに対する抗体の量に依存して、反応は１分以内で始まりうる。しかしながら、一緒に反応を、結果を記録する前に少なくとも10分間進行させておく。Ｈ．土壌及び水サンプル中の除草剤の検査このイムノアッセイは、使用した抗体を除き、上記と同じ手順を踏む。土壌又は水中のメタロクロール又はスルホニルウレアの如くの除草剤の存在をアッセイするため、メタロクロールを免疫学的に認識するヨーロッパ特許出願第EP-446,1 73-Aに記載のモノクローナル抗体、及びスルホニルウレアとして知られている除草剤のクラスの構成員を免疫学的に認識するヨーロッパ特許第EP-549,525-Aに記載のモノクローナル抗体を第１及び第２抗体として使用した。第２抗体を、アルデヒド基によるシッフ塩基の形成、シアノボロハイドライドによる還元及び牛血清アルブミンによる未反応部位のブロッキングにより、所望の固相フォーマットに共有結合させる。このように調製した固相フォーマットを第１抗体−除草剤複合体を捕促するために用いる。この調製した固相フォーマットをピペットチップの中に、上記の通り、陽性コントロールのための固相フォーマット層及び陰性コントロールのための独立の固相フォーマット層と共に収納した。ExLISAバッファー系は上記の実施例Ａに記載と同じとしたが、ただし検査すべき除草剤を免疫学的に認識するイムノアフィニティー精製して第１抗体をそれに加える。この第１抗体は上記の通りにしてアルカリホスファターゼにコンジュゲートさせる。土壌サンプルの場合、除草剤をまず当業界公知の方法で抽出しなくてはならず、このようにして作った抽出物をExLISAバッファーと混合する。水サンプルは準備することなく使用してよく、又はExLISAバッファーと混合する前に公知の方法により濃縮してよい。得られる組合せ混合物を調製した固相フォーマットの隙間空間に流し込む。酵素基質による処理を経て、上部固相フォーマット層は第１抗体−除草剤複合体が存在しているときに濃青色に変色するであろう。上記の実施例Ｄに記載の方法を利用し、除草剤の存在は第２抗体のレベルを増やしながら調製した固相フォーマットの多層アレンジメントを利用して半定量的状況でも検査できうる。更に、検査サンプル中の１種より多くの除草剤の存在は、適当な第２抗体により調製した固相フォーマットをチップアレンジメントの中で組合せたとき、上記のように同時に決定されうる。 ExLISAバッファー系を利用する抽出工程は、現在利用されている様々なその他の抽出法と同程度に有用であることが実証された。これは標準の方法と、本発明により包括される方法との直接対比により示される。バチルス・スリンジエンシス・カースタキ・エンドトキシン、バチルス・スリンジエンシス・テネブリオンス・エンドトキシン、PRlaタンパク質、キュウリキチナーゼ及びホスホフィノトリシン・アセチルトランフェラーゼについてのイムノアッセイは、標準の抽出技術の利用から獲得したものと比べ、抽出物をExLISAバッファー系を用いて調製したときに似たような定量値をもたらした。それ故、ExLISAバッファー系を利用する抽出法は、標準の方法と比べたときに同じ結果をもたらす。本明細書の中で挙げた公開物及び特許出願は全て本発明の属する当業者の技術水準の指標である。公開物及び特許出願は全て引用することで本明細書に組入れる。上記の発明は例示の目的で説明してきたが、本発明の範囲を逸脱することない一定の改変を施すことができることが自明であろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年１１月２０日【補正内容】明細書ている抗体、次いで固相支持体に結合した抗体の添加が続く、液体検査サンプルへの段階的添加を含む。かかるイムノアッセイは操作のし易さを供するが、しかし未調製の検査サンプル中の妨害物質の潜在的な存在に基づいて悩まされる。更に、かかるイムノアッセイにおいては液相の中で抗体−抗原反応が起こるため、液体検査サンプルが必要とされる。かかる「同時」又は「リバース」イムノアッセイは、液体検査サンプルから捕促された抗体−検査物質複合体を除去する追加の分離及び洗浄工程をも必要とする。「同時」又は「リバース」イムノアッセイの更なる例は米国特許第5,011,771号に見い出され、ここでイムノアッセイの前に検査サンプルを準備する必要性、及び液体検査サンプルから捕促された抗体− 検査物質複合体を分離する必要性は、追加の沈降及び遠心工程を必要とする。それ故、実験設備を必要としうる追加の工程の必要性は非実験室条件下でイムノアッセイを実施するためのかかる方法の有用性を制約しうる。細菌及びウィルスについてのその他のイムノアッセイが米国特許第5,169,789 号に記載されており、これは短時間で実施でき、そして同時での検査サンプルの溶解及び抗体反応を含む。このイムノアッセイはサブマイクロメーターの孔径を有するニトロセルロース膜を利用し、そこでは、サンプリング手段から捕促膜に至る検査物質含有液の流れは、任意的な下層吸収層により助長される拡散に制約されている。かかるイムノアッセイは単独アッセイにおける多重検査物質についての検査結果の同時目視決定を可能とするように物理的に配置できず、その理由は膜材料の制約された流速及び不透明な性質による。米国特許第4,366,241号及び米国特許第5,006,464号に開示の如くのサブマイクロメーターサイズの孔を有するニトロセルロースに基づくその他のイムノアッセイは類似の欠点を有する。検査サンプルは最少量のExLISAバッファーで抽出することが好ましいが、固相フォーマットは、それが第１抗体−検査物質複合体の効率的な捕促のために適当であることを必要とする。使用する固相フォーマットは、大容量を形成し、それ故検査サンプルの抽出物がくぐり抜けることのできる多数の隙間空間内に大きな有効表面積が供される三次元の有意義な寸法を有さなくてはならない。更に、第１抗体−検査物質複合体にとっての捕促媒体として利用される固相フォーマットは液体が全体にわたって活発、且つ迅速に流れるに足りるほど多孔性であるべきである。このことは、固相フォーマットが、サブミクロン域ではなく、マイクロメーター域又はそれより大きい孔径を有することを要する。この高多孔性三次元「フォーマット」は本発明の迅速イムノアッセイにおける第１抗体−検査物質複合体の極めて有効な捕促を可能にする。この固相フォーマットの孔質及び物理学的配置の更なる長所は、特にチップ配置において（図１参照）、粒子の除去を行う濾過又は遠心工程の利用を必要としないこと等にある。この粒子は組織の抽出において形成することがあり、慣用の固相のサブマイクロメーターサイズの孔を閉塞してしまいうる。本発明に従って仕上げることができ、且つ適当な固相フォーマットとして使用できうる数多くの材料が入手できる。これらの材料の一部はセルロースアセテート、ポリエステルコート化ポリスチレン、セルロース、ニトロセルロース及びナイロンである。一の好適な態様において、セルロースアセテートファイバーより成り、そしてHydros，Inc.，Falmouth，MAより入手できるACT−10（商標）シリンダーフィルターを固相フォーマットとして利用する。このACT−10（商標）は約４mmの直径及び約６mmの高さを有し、約20〜30マイクロメーターの孔サイズを有するシリンダー形態である。いくつか適当なアルキル化剤はアルデヒド及びＮ−マレイミドである。固相フォーマットを調製したら、次に第２抗体を化学反応性アミノ基を介して固相フォーマットに共有結合させる。アルデヒドの場合、可逆性シッフ塩基をアルデヒド基と第２抗体上のアミノ基との間で形成させる。次にこの結合を低濃度のナトリウムシアノボロハイドライドによる還元アルキル化を介して安定化させる。このようにして調製した固相フォーマットを第１抗体−検査物質複合体の捕促のために利用できうる。他方、第１抗体−検査物質複合体の捕促の前に、第３抗体を第２抗体に免疫学的に結合させてよい。この第３抗体は検査物質を免疫学的に認識し、それに免疫学的に結合し、そしてそれ故第１抗体−検査物質複合体を捕促するようなものとして選ぶ。本発明の別の態様において、この固相フォーマットはまず反応性アルデヒド基を作り上げるように上記の通りに調製する。調製できたら、ストレプトアビジンを反応性基に共有結合させ、次いで低濃度のナトリウムシアノボロハイドライドで還元させる。このようにして調製した固相フォーマットを、第１抗体−検査物質複合体に結合しているビオチンラベル化第２又は第３抗体の捕促のために利用する。本発明の更なる態様において、固相フォーマットを上記の通りにして調製する。調製できたら、適当な抗原を選定の抗原の化学的性質に適する手段を介して固相フォーマットに共有結合させる。この固相フォーマットを、結合抗原を認識する抽出物中の抗体の捕促のために使用してよい。アフィニティーリガンドを固相フォーマットに共有的な状態で結合させることは本発明の必要要件ではない。抗体、その他のタンパク質及び多くの抗原は静電力又はその他の分子間力を通じて固相フを可能にする。得られる感度は、ピペットチップアレンジメントにおいてセルロースアセテート固相フォーマットを利用することにより可能な感度よりも、少なくとも1000倍優れている。適当なアフィニティーリガンドの結合により固相フォーマットが調製できたら、それは多層アレンジメントにおいてその他の類似の調製した固相フォーマットと組合せてもよい。この多層アレンジメントは一回の抽出で複数種の第１抗体− 検査物質複合体の検出を可能にする。このアレンジメントは一回のアッセイ工程において陽性及び陰性コントロール結果を決定を可能にする陽性又は陰性コントロール層の一体化を可能にもする。一回のアッセイで１より多くの種類の検査物質を検出するのに利用するとき、このExLISAバッファー系は検査サンプル中で検出される一連の検査物質に特異的である様々なコンジュゲート化第１抗体を含むように改良されるであろう。多重固相フォーマットを利用することができ、このフォーマットは、例えば、低、中及び高レベルの検査物質に対応するであろう複数の固相フォーマットのそれぞれに第２及び／又は第３抗体をレベルを増やして結合させることにより、半定量的なイムノアッセイを提供できる。検査サンプル中に存在する検査物質のレベルに依存して、第１（低）の、第２（中）の又は第３（高）の調製した固相フォーマットは、利用した検出手段に従って陽性の反応を示すであろう。捕促した第１抗体−検査物質複合体の検出、それ故検査サンプル中の検査物質の有無の決定は当業界に公知である多種多様な方法を通じて成し遂げられうる。イムノアッセイの検出の一般的及び特殊な原理を説明する有用な文献はE．Harlo w and D．Lane，Antibodies，A Laboratory Mannal，Cold Spring Harbor Labor atory，New Y of enzymes to proteins with glutaraldehyde ，Immunochemistry６：43-52，19 69を参照のこと。過ヨウ素酸塩法においては、炭水化物の過ヨウ素酸処理は環構造を開き、そしてこれらの成分がタンパク質上に存在している遊離なアミノ基に結合することを可能にする。例えば、P．K．NakaneとA．Kawaoi のPeroxidase l abeled antibody：A new method of conjugation, J．Histochem．Cytochem．22 ：1084-1091，1974を参照のこと。酵素上のアミノ基のコンジュゲーションはSPD P（Ｎ−スクシニミジル−３−〔２−ピリジルジチオ〕プロピオネート）との反応、還元及びピリジルジスルフィド架橋の形成を介して抗体上に導入したチオール基に共有結合させてもよい。A．J．Cumberら、Preparation of antibody-toxi n conjugates ，Methods Enzymol．112：207（1985）。本発明におけるアルカリホスファターゼのコンジュゲーションの好適な方法はグルタルアルデヒド法である。他方、第１抗体にコンジュゲートさせた検出手段はいく種かの蛍光団のいづれかであってよい。４種の蛍光団、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレット及びフィコエリセリンが一般的に利用されている。蛍光団はDMSO（ジメチルスルホキシド）の中での塩化アンモニウムとの反応により第１抗体にコンジュゲートさせる。例えば、J．W．Goding．Conjugation of antibodies with fluorochrom es, J．Immunol．Methods 13：215-226，1976を参照のこと。本発明の一の好適な態様において、フルオレセイン（FITC）又はローダミン(TRITC)のイソシアネート誘導体を使用する。酵素検出手段にとっての基質は可溶性又は不溶性反応生成物のいづれかを生成しうる。不溶性酵素反応生成物は、反応後に固相フォーマット内に残る利点を有する。このことはイムノアッセイの結果の目視観察を可能にする。不溶性反応生成物の利用は本態様におけ３．この抽出物を、上記の通りにして適当なアフィニティーリガンドで調製したACT-10（商標）固相フォーマット（Hydros，Inc．，Falmouth，MA）の中に流し込む。この混合物を約５〜15秒間保持して第１抗体−検査物質複合体の捕促を促進し、次いで放出させる。４．チップを１μｌの洗浄バッファー（10mMのトリス−TRIZMZA（商標）pH8.0 ，0.05％ｗ／ｖのTWEEN（商標）20非イオン性界面活性剤、0.02％ｗ／ｖのアジ化ナトリウム）により、そのバッファーをチップの下へと押し出すことにより洗浄する。５．このチップに約50μｌの酵素基質、ニトロブルーテトラゾリウム及びブロモクロロインドールホスフェートを流し込む。６．完全な発色のために５〜10分待ち、そして結果を記録する。他方、検査サンプル中の抗体を検査することが所望されるなら、適当な抗原を固相フォーマットに共有結合させ、そして効率的な抗原の捕促及びその検出をもって、単独工程の検査及び抗原反応と同じ原理を利用する。例えば、一定の血清内の抗体集団を決定するためのIgG又はIgMの如くのイムノグロブリンの分類は、固相フォーマットの多重積載した連続層であって各層が異なるイムノグロブリンアイソタイプを捕促できる層を利用し、本発明により迅速に成し遂げることができる。各イムノグロブリンクラスへと調製された抗体を適当な固相フォーマットに結合させることができる。個々の固相フォーマットを各イムノグロブリンクラスのために調製でき、次いでそれぞれを多層アレンジメント中のピペットチップ内に入れる（図１参照）。適当なExLISAバッファー系を利用する同時での血清の抽出及び第１抗体−イムノグロブリン複合体の形成の後、調製した固相フォーマットの各層の隙間空間内で種々の第１抗体−イムノグロブリン複合体（ａ）前述の検査物質に対して結合できる第１抗体の存在下におけるこの検査物質の抽出手段、ここでこの第１抗体は検出手段にコンジュゲートされている；（ｂ）前記第１抗体及び前記検査物質により形成される複合体を捕促できる多数の隙間空間を有する大きな容量を形成するよう三次元において有意義な寸法を有する固相フォーマット；（ｃ）請求項１記載のExLISAバッファー系を含む容器；（ｄ）検出可能な反応生成物を生成するための前記検出手段と反応性の試薬；（ｅ）前記試薬の分注手段；を密閉区画で収容するように仕切られたキャリヤーを含んで成るものを得ることが所望される。かかるキットは使用するのが簡単であり、なぜならそれは結果を得るのに必要な全ての試薬を含むからである。本発明の一態様において、イムノアッセイのためのキットは各検査サンプルのためのマイクロ遠沈管、各検査サンプルのためのピペットチップであって、第１抗体−検査物質複合体の捕促のための適当なアフィニティーリガンドにより調製された固相フォーマットが、陽性コントロールとして調製した固相フォーマット及び陰性コントロールとして調製した固相フォーマットと一緒多層アレンジメントで収納されているチップ、マイクロ遠沈管の中の検査サンプルを粉砕するのに適する乳棒、中に予め希釈されている検出手段にコンジュゲートされた第１抗体を任意的に有する又は有さないExLISAバッファー系の分注用ボトル、洗浄バッファーの分注用ボトル、洗浄バッファーのために用いる各検査サンプルのための１mlのディスポーザブル分注ピペット、及び第１抗体にコンジュゲートされた検出手段と共に用いる適当な試薬の分注用ボトルを含んで成る。20までの検査サンプルのための中に収納されたこの３層の固相フォーマットは、検査サンプル抽出物を準備するまでチップ保存バッファー（25mMのトリス、140mMのNaCl，pH7.8，2％ｗ／ｖのBSA，0.05％ｗ／ｖのTWEEN（商標）20非イオン性界面活性剤、0.02％ｗ／ｖのNaN₃）の中に保存しておく（６ヶ月まで保存できる）。この保存バッファーは使用直前に調製固相フォーマットから吸引除去する。検査植物の葉組織は、葉の上に1.5ml のマイクロ遠沈管の蓄を食いつかせることにより獲得し、これは小さな円形の葉領域を取り出させる。この検査サンプルはアッセイを１時以内で実施できないとき、又は周囲温度が90°Ｆより高いとき、低温に保っておく。次いでこの組織を上記の実施例Ａに記載の250μｌのExLIS Aバッファーの存在下で、混合用のKontes（商標）(Vineland，N．J.)プラスチック乳棒を用い、約５秒間の強い回転運動により混合する。抽出の際、第１ヤギ抗 −Btk 抗体又はマイクロ遠沈管の中での乳棒による混合により組織から遊離する btkエンドトキシンに結合する。次いでこの抽出物を調製固相フォーマットの隙間空間に流し、第１抗体−Btk複合体を固相フォーマットに結合した第２抗体− 第３抗体複合体に捕促させる。この抽出物を固相フォーマットに少なくとも15秒間保持し、次いで廃棄槽に放出させる。この抽出物は放出するまで室温で１時間までは固相フォーマットの中に残留しておいてよいが、しかし２〜３分を超えると、感度はわずかにしか上がらない。捕促後、この固相フォーマットを１mlの洗浄バッファー（10mMのトリス−TRIZMA（商標），pH8.0，0.05％ｗ／ｖのTWEEN （商標）20非イオン性界面活性剤、0.02％ｗ／ｖのアジ化ナトリウム）で洗う。次いでこの固相フォーマットをニトロブルーテトラゾリウム及びブロモクロロインドールホスフェート（これは化学品供給業者Kirkegaard & Perryより入手できるアルカリホスファターゼ用の単一成分基質請求の範囲１．検査サンプル中に存在する検査物質のサンプル抽出及び抗原−抗体反応を同時に支持することのできるExLISAバッファー系であって、有効な量の（ａ）バッファー；（ｂ）界面活性剤；（ｃ）塩；（ｄ）キレート剤；（ｅ）安定化剤；（ｆ）フェノール系化合物インヒビター；（ｇ）プロテアーゼインヒビター；及び（ｈ）このアッセイに利用するどの抗体によっても認識されないタンパク質；を含んで成るExLISAバッファー系。２．前記バッファーが炭酸ナトリウム、硼酸ナトリウム又はトリス−食塩水より選ばれる、請求項１記載のExLISAバッファー系。３．前記界面活性剤が非イオン性である、請求項１記載のExLISAバッファー系。４．前記界面活性剤がTRITON（商標）Ｘ−100，Tween（商標）20 NP−40又は MEGA−８より選ばれる、請求項３記載のExLISAバッファー系。５．前記塩が塩化ナトリウム又は塩化カリウムから選ばれる、請求項１記載の ExLISAバッファー系。６．前記キレート剤がEDTA又はEGTAより選ばれる、請求項１記載のExLISAバッファー系。７．前記安定化剤がアガー、アガロース、ポリエチレングリコール、グリセロール又はエチレングリコールから選ばれる、請求項１記載のExLISA バッファー系。８．前記フェノール系インヒビターがポリビニルピロリドン、硼酸ナトリウム又はポリエチルイミンより選ばれる、請求項１記載のExLISAバッファー系。９．前記プロテアーゼインヒビターがPEFABLOC（商標），PMSF，TLCK，TPCK， α−カプロン酸、ロイペプチン、ベンズアミジン、アンチパイン又はペプスタチンより選ばれる、請求項１記載のExLISAバッファー系。 10．前記タンパク質がBSA、オブアルブミン、カゼイン又は胎児牛血清より選ばれる、請求項１記載のExLISAバッファー系。 11．前記検査物質に結合できる第１抗体を更に含んで成り、ここで前記第１抗体は検出手段にコンジュゲートされている、請求項１記載のExLISAバッファー系。 12．前記検出手段が酵素である、請求項11記載のExLISAバッファー系。 13．前記酵素がアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼから選ばれる、請求項12記載のExLISAバッファー系。 14．前記酵素が不溶性反応生成物を生成する、請求項12記載のExLISAバッファー系。 15．前記酵素が可溶性反応生成物を生成する、請求項12記載のExLISAバッファー系。 16．前記検出手段が蛍光団である、請求項11記載のExLISAバッファー系。 17．前記蛍光団がFITC，TRITC、テキサスレッド又はフィコエリスリンより選ばれる請求項16記載のExLISAバッファー系。 18．検査サンプル中の検査物質の検査のためのイムノアッセイであって、下記の工程：（ａ）検査サンプルの抽出物を、この抽出物中の前記検査物質を免疫学的に認識する第１抗体の存在下で調製し、これにより第１抗体−検査物質を形成する、ここで前記第１抗体は検出手段にコンジュゲートされている；（ｂ）前記検査物質又は工程（ｃ）の第３抗体を免疫学的に認識できる所望の第２抗体を結合させることにより、多数の隙間空間を有する大容量を形成するように三次元方向において有意義な寸法を有する固相フォーマットを調製する；（ｃ）任意的に前記第２抗体に第３抗体を免疫学的に結合させる、ここで前記第３抗体は前記検査物質を免疫学的に認識する；（ｄ）工程（ａ）の前記抽出物を、前記工程（ｂ）又は工程（ｃ）で調製したフォーマットと組合せ、これにより前記抽出物を前記第１抗体−検査物質複合体を捕促する前記調製した固相フォーマットの隙間空間に流す；（ｅ）前記捕促された第１抗体−検査物質複合体の存在により前記検査物質を検査する；ことを含んで成るイムノアッセイ。 19．前記検査物質が細菌、昆虫、菌類、ウィルス、植物細胞、タンパク質、炭水化物、ホルモン、医薬品、脂質、除草剤、又は任意のそれらの組合せから選ばれる、請求項18記載のイムノアッセイ。 20．前記細菌がブルセラ・アボルタスである、請求項19記載のイムノアッセイ 21．前記昆虫がプルテラである、請求項19記載のイムノアッセイ。 22．前記菌類がセプトリア・トリチシ又はシガトカより選ばれる、請求項19記載のイムノアッセイ。 23．前記ウィルスがヒト免疫不全ウィルスである、請求項19記載のイムノアッセイ。 24．前記タンパク質がイムノグロブリン、キュウリキチナーゼ又はバチルス・スリンジエンシス・エンドキシンから選ばれる、請求項19記載のイムノアッセイ。 25．前記固相フォーマットがセルロースアセテート、ポリエステルコート化ポリスチレン、セルロース、ニトロセルロース又はナイロンより選ばれる、請求項 18記載のイムノアッセイ。 26．前記固相フォーマットが多重積載連続層より成り、ここで各層は異なり合う検査物質を捕促できる、請求項25記載のイムノアッセイ。 27．前記各層が異なる量の前記検査物質を捕促できる、請求項26記載のイムノアッセイ。 28．前記検出手段が酵素である、請求項18記載のイムノアッセイ。 29．前記酵素がアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼから選ばれる、請求項28記載のイムノアッセイ。 30．前記酵素が不溶性反応生成物を生成する、請求項28記載のイムノアッセイ。 31．前記酵素が可溶性反応生成物を生成する、請求項28記載のイムノアッセイ。 32．前記検出手段が蛍光団である、請求項18記載のイムノアッセイ。 33．前記蛍光団がFITC，TRITC、テキサスレッド又はフィコエリスリンより選ばれる請求項32記載のイムノアッセイ。 34．植物材料中の検査物質の検査のためのイムノアッセイであって、下記の工程：（ａ）植物材料の抽出物を、この抽出物中の前記検査物質を免疫学的に認識する第１抗体の存在下で調製し、これにより第１抗体−検査物質を形成する、ここで前記第１抗体は検出手段にコンジュゲートされている；（ｂ）前記検査物質又は工程（ｃ）の第３抗体を免疫学的に認識できる所望の第２抗体を結合させることにより、多数の隙間空間を有する大容量を形成するように三次元方向において有意義な寸法を有する固相フォーマットを調製する；（ｃ）任意的に前記第２抗体に第３抗体を免疫学的に結合させる、ここで前記第３抗体は前記検査物質を免疫学的に認識する；（ｄ）工程（ａ）の前記抽出物を、前記工程（ｂ）又は工程（ｃ）で調製したフォーマットと組合せ、これにより前記抽出物を前記第１抗体−検査物質複合体を捕促する前記調製した固相フォーマットの隙間空間に流す；（ｅ）前記捕促された第１抗体−検査物質複合体の存在により前記検査物質を検査する；ことを含んで成るイムノアッセイ。 35．前記検査物質が細菌、昆虫、菌類、ウィルス、植物細胞、タンパク質、炭水化物、ホルモン、医薬品、脂質、除草剤、又は任意のそれらの組合せから選ばれる、請求項34記載のイムノアッセイ。 36．前記昆虫がプルテラである、請求項35記載のイムノアッセイ。 37．前記菌類がセプトリア・トリチシ又はシガトカより選ばれる、請求項35記載のイムノアッセイ。 38．前記タンパク質がイムノグロブリン、キュウリキチナーゼ又はバチルス・スリンジエンシス・エンドキシンから選ばれる、請求項35記載のイムノアッセイ。 39．前記固相フォーマットがセルロースアセテート、ポリエステルコート化ポリスチレン、セルロース、ニトロセルロース又はナイロンより選ばれる、請求項 34記載のイムノアッセイ。 40．前記固相フォーマットが多重積載連続層より成り、ここで各層は異なり合う検査物質を捕促できる、請求項39記載のイムノアッセイ。 41．前記各層が異なる量の前記検査物質を捕促できる、請求項40記載のイムノアッセイ。 42．前記検出手段が酵素である、請求項34記載のイムノアッセイ。 43．前記酵素がアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼから選ばれる、請求項42記載のイムノアッセイ。 44．前記酵素が不溶性反応生成物を生成する、請求項42記載のイムノアッセイ。 45．前記酵素が可溶性反応生成物を生成する、請求項42記載のイムノアッセイ。 46．前記検出手段が蛍光団である、請求項34記載のイムノアッセイ。 47．前記蛍光団がFITC，TRITC、テキサスレッド又はフィコエリスリンより選ばれる請求項46記載のイムノアッセイ。 48．検査サンプル中の検査物質の検査のためのイムノアッセイであって、下記の工程：（ａ）検査サンプルの抽出物を、この抽出物中の前記検査物質を免疫学的に認識する第１抗体の存在下で調製し、これにより第１抗体−検査物質を形成する、ここで前記第１抗体は検出手段にコンジュゲートされている；（ｂ）前記検査物質により免疫学的に認識される所望の第２抗体を結合させることにより、多数の隙間空間を有する大容量を形成するように三次元方向において有意義な寸法を有する固相フォーマットを調製する；（ｃ）工程（ａ）の前記抽出物を、前記工程（ｂ）で調製したフォーマットと組合せ、これにより前記抽出物を前記第１抗体−検査物質複合体を捕促する前記調製した固相フォーマットの隙間空間に流す；（ｄ）前記捕促された第１抗体−検査物質複合体の存在により前記検査物質を検査する；ことを含んで成るイムノアッセイ。 49．前記検査物質が抗体である、請求項48記載のイムノアッセイ。 50．前記固相フォーマットがセルロースアセテート、ポリエステルコート化ポリスチレン、セルロース、ニトロセルロース又はナイロンより選ばれる、請求項 48記載のイムノアッセイ。 51．前記固相フォーマットが多重積載連続層より成り、ここで各層は異なり合う検査物質を捕促できる、請求項50記載のイムノアッセイ。 52．前記各層が異なる量の前記検査物質を捕促できる、請求項51記載のイムノアッセイ。 53．前記検出手段が酵素である、請求項48記載のイムノアッセイ。 54．前記酵素がアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼから選ばれる、請求項53記載のイムノアッセイ。 55．前記酵素が不溶性反応生成物を生成する、請求項53記載のイムノアッセイ。 56．前記酵素が可溶性反応生成物を生成する、請求項53記載のイムノアッセイ。 57．前記検出手段が蛍光団である、請求項48記載のイムノアッセイ。 58．前記蛍光団がFITC，TRITC、テキサスレッド又はフィコエリスリンより選ばれる請求項57記載のイムノアッセイ。 59．検査サンプル中の検査物質のイムノアッセイによる検査用キットであって、（ａ）前述の検査物質に対して結合できる第１抗体の存在下におけるこの検査物質の抽出手段、ここでこの第１抗体は検出手段にコンジュゲートされている；（ｂ）前記第１抗体及び前記検査物質により形成される複合体を捕促できる多数の隙間空間を有する大きな容量を形成するよう三次元において有意義な寸法を有する固相フォーマット；（ｃ）ExLISAバッファーを含む容器；（ｄ）検出可能な反応生成物を生成するための前記検出手段と反応性の試薬；（ｅ）前記試薬の分注手段；を密閉区画で収容するように仕切られたキャリヤーを含んで成るキット。 60．前記検査物質が細菌、昆虫、菌類、ウィルス、植物細胞、タンパク質、炭水化物、ホルモン、医薬品、脂質、除草剤、又は任意のそれらの組合せから選ばれる、請求項59記載のキット。 61．前記細菌がブルセラ・アボルタスである、請求項60記載のキット。 62．前記昆虫がプルテラである、請求項60記載のキット。 63．前記菌類がセプトリア・トリチシ又はシガトカより選ばれる、請求項60記載のキット。 64．前記ウィルスがヒト免疫不全ウィルスである、請求項60記載のキット。 65．前記タンパク質がイムノグロブリン、キュウリキチナーゼ又はバチルス・スリンジエンシス・エンドキシンから選ばれる、請求項60記載のキット。 66．前記固相フォーマットがセルロースアセテート、ポリエステルコート化ポリスチレン、セルロース、ニトロセルロース又はナイロンより選ばれる、請求項 59記載のキット。 67．前記固相フォーマットが多重積載連続層より成り、ここで各層は異なり合う検査物質を捕促できる、請求項66記載のキット。 68．前記各層が異なる量の前記検査物質を捕促できる、請求項67記載のキット。 69．前記検出手段が酵素である、請求項59記載のキット。 70．前記酵素がアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼから選ばれる、請求項69記載のキット。 71．前記酵素が不溶性反応生成物を生成する、請求項69記載のキツト。 72．前記酵素が可溶性反応生成物を生成する、請求項69記載のキット。 73．前記検出手段が蛍光団である、請求項59記載のキット。 74．前記蛍光団がFITC，TRITC、テキサスレッド又はフィコエリスリンより選ばれる請求項73記載のキット。 75．請求項59記載のキットを製造するための方法であって、（ａ）前述の検査物質に対して結合できる第１抗体の存在下におけるこの検査物質の抽出手段、ここでこの第１抗体は検出手段にコンジュゲートされている；（ｂ）前記第１抗体及び前記検査物質により形成される複合体を捕促できる多数の隙間空間を有する大きな容量を形成するよう三次元において有意義な寸法を有する固相フォーマット；（ｃ）請求項29記載のExLISAバッファー系を含む容器；（ｄ）検出可能な反応生成物を生成するための前記検出手段と反応性の試薬；（ｅ）前記試薬の分注手段；を密閉区画で含んで成る仕切られたキャリヤーを組立てる方法。 76．検査サンプル中の検査物質の同時サンプル抽出及び抗原−抗体反応のための請求項31記載のExLISAバッファー系の利用。 77．検査サンプル中の検査物質のイムノアッセイにより検査するための請求項 59記載のキットの利用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．検査サンプル中の検査物質の検査のためのイムノアッセイであって、下記の工程：（ａ）検査サンプルの抽出物を、この抽出物中の前記検査物質を免疫学的に認識する第１抗体の存在下で調製し、これにより第１抗体−検査物質を形成する、ここで前記第１抗体は検出手段にコンジュゲートされている；（ｂ）前記検査物質又は工程（ｃ）の第３抗体を免疫学的に認識できる所望の第２抗体を結合させることにより、多数の隙間空間を有する大容量を形成するように三次元方向において有意義な寸法を有する固相フォーマットを調製する；（ｃ）任意的に前記第２抗体に第３抗体を免疫学的に結合させる、ここで前記第３抗体は前記検査物質を免疫学的に認識する；（ｄ）工程（ａ）の前記抽出物を、前記工程（ｂ）又は工程（ｃ）で調製したフォーマットと組合せ、これにより前記抽出物を前記第１抗体−検査物質複合体を捕促する前記調製した固相フォーマットの隙間空間に流す；（ｅ）前記捕促された第１抗体−検査物質複合体の存在により前記検査物質を検査する；ことを含んで成るイムノアッセイ。２．前記検査物質が細菌、昆虫、菌類、ウィルス、植物細胞、タンパク質、炭水化物、ホルモン、医薬品、脂質、除草剤、又は任意のそれらの組合せから選ばれる、請求項１記載のイムノアッセイ。３．前記細菌がブルセラ・アボルタスである、請求項２記載のイムノアッセイ。４．前記昆虫がプルテラである、請求項２記載のイムノアッセイ。５．前記菌類がセプトリア・トリチシ又はシガトカより選ばれる、請求項２記載のイムノアッセイ。６．前記ウィルスがヒト免疫不全ウィルスである、請求項２記載のイムノアッセイ。７．前記タンパク質がイムノグロブリン、キュウリキチナーゼ又はバチルス・スリンジエンシス・エンドキシンから選ばれる、請求項２記載のイムノアッセイ。８．前記固相フォーマットがセルロースアセテート、ポリエステルコート化ポリスチレン、セルロース、ニトロセルロース又はナイロンより選ばれる、請求項１記載のイムノアッセイ。９．前記固相フォーマットが多重積載連続層より成り、ここで各層は異なり合う検査物質を捕促できる、請求項８記載のイムノアッセイ。 10．前記各層が異なる量の前記検査物質を捕促できる、請求項９記載のイムノアッセイ。 11．前記検出手段が酵素である、請求項１記載のイムノアッセイ。 12．前記酵素がアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼから選ばれる、請求項11記載のイムノアッセイ。 13．前記酵素が不溶性反応生成物を生成する、請求項11記載のイムノアッセイ。 14．前記酵素が可溶性反応生成物を生成する、請求項11記載のイムノアッセイ。 15．前記検出手段が蛍光団である、請求項１記載のイムノアッセイ。 16．前記蛍光団がFITC，TRITC、テキサスレッド又はフィコエリスリンより選ばれる請求項15記載のイムノアッセイ。 17．植物材料中の検査物質の検査のためのイムノアッセイであって、下記の工程：（ａ）植物材料の抽出物を、この抽出物中の前記検査物質を免疫学的に認識する第１抗体の存在下で調製し、これにより第１抗体−検査物質を形成する、ここで前記第１抗体は検出手段にコンジュゲートされている；（ｂ）前記検査物質又は工程（ｃ）の第３抗体を免疫学的に認識できる所望の第２抗体を結合させることにより、多数の隙間空間を有する大容量を形成するように三次元方向において有意義な寸法を有する固相フォーマットを調製する；（ｃ）任意的に前記第２抗体に第３抗体を免疫学的に結合させる、ここで前記第３抗体は前記検査物質を免疫学的に認識する；（ｄ）工程（ａ）の前記抽出物を、前記工程（ｂ）又は工程（ｃ）で調製したフォーマットと組合せ、これにより前記抽出物を前記第１抗体−検査物質複合体を捕促する前記調製した固相フォーマットの隙間空間に流す；（ｅ）前記捕促された第１抗体−検査物質複合体の存在により前記検査物質を検査する；ことを含んで成るイムノアッセイ。 18．前記検査物質が細菌、昆虫、菌類、ウィルス、植物細胞、タンパク質、炭水化物、ホルモン、医薬品、脂質、除草剤、又は任意のそれらの組合せから選ばれる、請求項17記載のイムノアッセイ。 19．前記昆虫がプルテラである、請求項18記載のイムノアッセイ。 20．前記菌類がセプトリア・トリチシ又はシガトカより選ばれる、請求項18記載のイムノアッセイ。 21．前記タンパク質がイムノグロブリン、キュウリキチナーゼ又はバチルス・スリンジエンシス・エンドキシンから選ばれる、請求項18記載のイムノアッセイ。 22．前記固相フォーマットがセルロースアセテート、ポリエステルコート化ポリスチレン、セルロース、ニトロセルロース又はナイロンより選ばれる、請求項 17記載のイムノアッセイ。 23．前記固相フォーマットが多重積載連続層より成り、ここで各層は異なり合う検査物質を捕促できる、請求項22記載のイムノアッセイ。 24．前記各層が異なる量の前記検査物質を捕促できる、請求項23記載のイムノアッセイ。 25．前記検出手段が酵素である、請求項17記載のイムノアッセイ。 26．前記酵素がアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼから選ばれる、請求項25記載のイムノアッセイ。 27．前記酵素が不溶性反応生成物を生成する、請求項25記載のイムノアッセイ。 28．前記酵素が可溶性反応生成物を生成する、請求項25記載のイムノアッセイ。 29．前記検出手段が蛍光団である、請求項17記載のイムノアッセイ。 30．前記蛍光団がFITC，TRITC、テキサスレッド又はフィコエリスリンより選ばれる請求項29記載のイムノアッセイ。 31．サンプル抽出及び抗原−抗体反応を同時に支持することのできるExLISAバッファー系であって、有効な量の（ａ）バッファー；（ｂ）界面活性剤；（ｃ）塩；（ｄ）キレート剤；（ｅ）安定化剤；（ｆ）フェノール系化合物インヒビター；（ｇ）プロテアーゼインヒビター；及び（ｈ）このアッセイに利用するどの抗体によっても認識されないタンパク質；を含んで成るExLISAバッファー系。 32．前記バッファーが炭酸ナトリウム、硼酸ナトリウム又はトリスー食塩水より選ばれる、請求項31記載のExLISAバッファー系。 33．前記界面活性剤が非イオン性である、請求項31記載のExLISAバッファー系。 34．前記界面活性剤がTRITON（商標）Ｘ−100，Tween（商標）20NP−40又はME GA−８より選ばれる、請求項33記載のExLISAバッファー系。 35．前記塩が塩化ナトリウム又は塩化カリウムから選ばれる、請求項31記載の ExLISAバッファー系。 36．前記キレート剤がEDTA又はEGTAより選ばれる、請求項31記載のExLISAバッファー系。 37．前記安定化剤がアガー、アガロース、ポリエチレングリコール、グリセロール又はエチレングリコールから選ばれる、請求項31記載のExLISAバッファー系。 38．前記フェノール系インヒビターがポリビニルピロリドン、硼酸ナトリウム又はポリエチルイミンより選ばれる、請求項31記載のExLISAバッファー系。 39．前記プロテアーゼインヒビターがPEFABLOC（商標），PMSF，TLCK，TPCK， α−カプロン酸、ロイペプチン、ベンズアミジン、アンチパイン又はペプスタチンより選ばれる、請求項31記載のExLISAバッファー系。 40．前記タンパク質がBSA、オブアルブミン、カゼイン又は胎児牛血清より選ばれる、請求項31記載のExLISAバッファー系。 41．前記検査物質に結合できる第１抗体を更に含んで成り、ここで前記第１抗体は検出手段にコンジュゲートされている、請求項31記載のExLISAバッファー系。 42．前記検出手段が酵素である、請求項41記載のExLISAバッファー系。 43．前記酵素がアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼから選ばれる、請求項42記載のExLISAバッファー系。 44．前記酵素が不溶性反応生成物を生成する、請求項42記載のExLISAバッファー系。 45．前記酵素が可溶性反応生成物を生成する、請求項42記載のExLISAバッファー系。 46．前記検出手段が蛍光団である、請求項41記載のExLISAバッファー系。 47．前記蛍光団がFITC，TRITC、テキサスレッド又はフィコエリスリンより選ばれる請求項46記載のExLISAバッファー系。 48．検査サンプル中の検査物質の検査のためのイムノアッセイであって、下記の工程：（ａ）検査サンプルの抽出物を、この抽出物中の前記検査物質を免疫学的に認識する第１抗体の存在下で調製し、これにより第１抗体−検査物質を形成する、ここで前記第１抗体は検出手段にコンジュゲートされている；（ｂ）前記検査物質により免疫学的に認識される所望の第２抗体を結合させることにより、多数の隙間空間を有する大容量を形成するように三次元方向において有意義な寸法を有する固相フォーマットを調製する；（ｃ）工程（ａ）の前記抽出物を、前記工程（ｂ）で調製したフォーマットと組合せ、これにより前記抽出物を前記第１抗体−検査物質複合体を捕促する前記調製した固相フォーマットの隙間空間に流す；（ｄ）前記捕促された第１抗体−検査物質複合体の存在により前記検査物質を検査する；ことを含んで成るイムノアッセイ。 49．前記検査物質が抗体である、請求項48記載のイムノアッセイ。 50．前記固相フォーマットがセルロースアセテート、ポリエステルエート化ポリスチレン、セルロース、ニトロセルロース又はナイロンより選ばれる、請求項 48記載のイムノアッセイ。 51．前記固相フォーマットが多重積載連続層より成り、ここで各層は異なり合う検査物質を捕促できる、請求項50記載のイムノアッセイ。 52．前記各層が異なる量の前記検査物質を捕促できる、請求項51記載のイムノアッセイ。 53．前記検出手段が酵素である、請求項48記載のイムノアッセイ。 54．前記酵素がアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼから選ばれる、請求項53記載のイムノアッセイ。 55．前記酵素が不溶性反応生成物を生成する、請求項53記載のイムノアッセイ。 56．前記酵素が可溶性反応生成物を生成する、請求項53記載のイムノアッセイ。 57．前記検出手段が蛍光団である、請求項48記載のイムノアッセイ。 58．前記蛍光団がFITC，TRITC、テキサスレッド又はフィコエリスリンより選ばれる請求項57記載のイムノアッセイ。 59．検査サンプル中の検査物質のイムノアッセイによる検査用キットであって、（ａ）前述の検査物質に対して結合できる第１抗体の存在下におけるこの検査物質の抽出手段、ここでこの第１抗体は検出手段にコンジュゲートされている；（ｂ）前記第１抗体及び前記検査物質により形成される複合体を捕促できる多数の隙間空間を有する大きな容量を形成するよう三次元において有意義な寸法を有する固相フォーマット；（ｃ）ExLISAバッファー系を含む容器；（ｄ）検出可能な反応生成物を生成するための前記検出手段と反応性の試薬；（ｅ）前記試薬の分注手段；を密閉区画で収容するように仕切られたキャリヤーを含んで成るキット。 60．前記検査物質が細菌、昆虫、菌類、ウィルス、植物細胞、タンパク質、炭水化物、ホルモン、医薬品、脂質、除草剤、又は任意のそれらの組合せから選ばれる、請求項59記載のキット。 61．前記細菌がブルセラ・アボルタスである、請求項60記載のキット。 62．前記昆虫がプルテラである、請求項60記載のキット。 63．前記菌類がセプトリア・トリチシ又はシガトカより選ばれる、請求項60記載のキット。 64．前記ウィルスがヒト免疫不全ウィルスである、請求項60記載のキット。 65．前記タンパク質がイムノグロブリン、キュウリキチナーゼ又はバチルス・スリンジエンシス・エンドキシンから選ばれる、請求項60記載のキット。 66．前記固相フォーマットがセルロースアセテート、ポリエステルコート化ポリスチレン、セルロース、ニトロセルロース又はナイロンより選ばれる、請求項 59記載のキット。 67．前記固相フォーマットが多重積載連続層より成り、ここで各層は異なり合う検査物質を捕促できる、請求項66記載のキット。 68．前記各層が異なる量の前記検査物質を捕促できる、請求項67記載のキット。 69．前記検出手段が酵素である、請求項59記載のキット。 70．前記酵素がアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼから選ばれる、請求項69記載のキット。 71．前記酵素が不溶性反応生成物を生成する、請求項69記載のキット。 72．前記酵素が可溶性反応生成物を生成する、請求項69記載のキット。 73．前記検出手段が蛍光団である、請求項59記載のキット。 74．前記蛍光団がFITC，TRITC、テキサスレッド又はフィコエリスリンより選ばれる請求項73記載のキット。 75．請求項59記載のキットを製造するための方法であって、（ａ）前述の検査物質に対して結合できる第１抗体の存在下におけるこの検査物質の抽出手段、ここでこの第１抗体は検出手段にコンジュゲートされている；（ｂ）前記第１抗体及び前記検査物質により形成される複合体を捕促できる多数の隙間空間を有する大きな容量を形成するよう三次元において有意義な寸法を有する固相フォーマット；（ｃ）請求項29記載のExLISAバッファー系を含む容器；（ｄ）検出可能な反応生成物を生成するための前記検出手段と反応性の試薬；（ｅ）前記試薬の分注手段；を密閉区画で含んで成る仕切られたキャリヤーを組立てる方法。 76．検査サンプル中の検査物質の同時サンプル抽出及び抗原−抗体反応のための請求項31記載のExLISAバッファー系の利用。 77．検査サンプル中の検査物質のイムノアッセイにより検査するための請求項 59記載のキットの利用。