JP2008524600A - 多重化アッセイの較正及び定量化用の量子ドットコード化ビーズセット、及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は2004年12月16日に出願した米国仮特許出願第60/637347号の優先権を主張し、この出願は援用して本明細書の一部をなす。
様々な較正部分を含む対照ビーズのセットを提供する。この対照ビーズは、滴定曲線の形成を可能とするために試料ビーズと組み合わせることができる。滴定曲線の使用によって、多重化アッセイにおける試料ビーズからの分析物濃度の定量性が改善される。
組成物及び方法は、様々な構成要素や工程を「含む」(「特に限定されないが、挙げられる」の意味として解釈される)という表現で記載しているが、これらの組成物及び方法は、該様々な構成要素及び工程「から実質的になる」又は「からなる」こともありえ、かかる語法は実質的にクローズド・メンバー群を定義するものとして解釈されるべきである。
本発明の一実施形態は対照ビーズのセットに関するものである。このセットはコード化部分及び較正部分を含む複数のビーズを含んでおり、該コード化部分は複数のビーズ中に一定濃度で存在し、該較正部分は複数のビーズ中に様々な濃度で存在する。コード化部分はビーズ内部に存在させるか、ビーズ全体に分布させるか、又はビーズの表面若しくはその近傍に配置できる。較正部分はビーズ内部に存在させるか、ビーズ全体に分布させるか、又はビーズの表面若しくはその近傍に配置できる。濃度範囲は低濃度から高濃度までとすることができ、換言すると、ビーズは低絶対数から高絶対数までの範囲の較正部分をビーズ上に有することができる。対照ビーズは1以上、例えば、2、3、4、5、6等のコード化部分を含むことができる。対照ビーズは1以上、例えば、2、3、4、5、6等の較正部分を含むことができる。
本発明のさらなる実施形態は、分析物のアレイと相互作用するように構成された試料ビーズのセット、及び滴定曲線を作成できるように構成された対照ビーズのセットを含む組成物に関する。
本発明のさらなる実施形態は、ビーズ組成物を備えたキットに関する。キットは、滴定曲線を得るためのプロトコル、及びの段落に記載のビーズ混合物の何れかを含むことができる。
本発明のさらなる実施形態は、上記の対照ビーズを用いて滴定曲線を作成する方法に関する。方法は、対照ビーズのセットを準備する工程であって、対照ビーズのセットがコード化部分及び較正部分を含む工程;コード化部分からシグナルを得る工程;較正部分からシグナルを得る工程;並びに較正部分から得られるシグナルから滴定曲線を作成する工程を含むことができる。対照ビーズのセットは様々な濃度の較正部分を有することができる。
上記の対照ビーズ、ビーズ混合物及びキットは多重化分析物アッセイの定量結果を改善するために使用できる。対照ビーズのセットの使用によって、1種以上の分析物の濃度を定量化するためにその後使用できる滴定曲線を作成することが可能になる。本発明者らは、滴定曲線を用いなければ、分析物の濃度とシグナルが直接相関しないことを見出した。従って、本発明の方法は、多重化分析物アッセイの精度を大幅に高めることがわかった。分析物は一般にいかなる分析物とすることもできる。分析物の例として、DNA、RNA、PNA、蛋白質、抗体、リガンド、受容体、脂質、多糖等が挙げられる。分析物は、ビオチン化されているか、又はビオチン化されていないかの何れかとすることができる。
実施例1:量子ドットナノ粒子の調製
量子ドットナノ粒子の調製は、当該技術分野において周知である。量子ドットの調製方法の例は、米国特許第6207299号、同第6322901号、及び同第6576291号、並びに刊行物「Alternative Routes toward High Quality CdSe Nanocrystal,」(Qu et. al.,Nano Lett.,1(6):333−337(2001))に記載されている。量子ドットナノ粒子は、Quantum Dot Corporation(Hayward,CA)より市販されている。量子ドットナノ粒子の調製は、多くの特許及び刊行物の主題になっており、以下にいくつかの例を挙げる。合金又は混合シェルの使用が、米国特許第6815064号に記載されている。プロモーターを用いて量子ドットコアを作製することが、米国特許公開第2003/0097976号(2003年5月29日公開)に記載されている。混合された疎水性/親水性ポリマー転移剤を量子ドットの表面に結合させる表面修飾法が、米国特許第6649139号に示唆されている。
量子ドットナノ粒子含浸ミクロスフェアを作製する方法は、当技術分野において周知である。量子ドットナノ粒子含浸ミクロスフェアの調製は、多くの特許及び刊行物の主題になっており、以下にいくつかの例を挙げる。米国特許第6479146号には、分解可能なコロイドテンプレート上でナノコンポジット多層の静電的自己集合を使用する方法が記載されている。国際公開第00/77281号(2000年12月21日公開)には、多層コーティングを介した結晶の封入が記載されている。国際公開第01/51196号(2001年7月19日公開)には、ポリマー多層を用いる固体粒子のテンプレート法が記載されている。国際公開第99/47252号(1999年9月23日公開)には、層様の高分子電解質の自己集合を使用してナノカプセル及びマイクロカプセルを調製することが記載されている。米国特許第6548171B1号明細書及び同第6680211B2号には、蛍光ナノ結晶が埋設されたミクロスフェア記載されている。最後に、高分子電解質多層膜が、Park他、Langmuir 18:9600−9604(2002)によって成形された。
以下のプロトコルを使用して、ほぼ等量の橙色及び赤色を発する量子ドットナノ粒子を組み込んでいるビーズを調製した。ビーズは、卓上遠心分離器又は磁気分離の何れかによって洗浄工程及び沈着工程の間に懸濁液から簡便に分離できる。球状ポリスチレン基材ビーズ(9μm、常磁性コア、非誘導化)は、Polymer Laboratories(Shropshire,UK)から購入した。基材ビーズ(20mg、4%溶液として500μL)を水洗し、次いでポリエチレンイミン(10mL、4%、約25,000g/モル分子量、Aldrich Chemical(St.Louis,MO))と30分間インキュベートした。このビーズを、水の中で撹拌しその後遠心分離して再懸濁することによって10回洗浄した。
以下の表1及び2の数値を用いて、ビオチン化及び非ビオチン化オリゴヌクレオチドの貯蔵混合物(各々、一級アミン官能基で5’端キャップしたもの)を、MES緩衝液(2−モルホリノエタンスルホン酸、100mM)中で最終総オリゴヌクレオチド濃度が2.5μMになるように調製した。EDC((1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩))貯蔵溶液を、EDC(1g)を25mLのMES緩衝液(100mM)と合わせることによって、MES中4%の濃度で調製した。量子ドットナノ粒子含浸ビーズ(実施例より;1反応につき100万個のビーズ)を水で洗浄し(3回)、次いで100mMのMES緩衝液で洗浄して(1回)、MES(10μL)に再懸濁させた。オリゴヌクレオチド貯蔵溶液(80μL)を、最終EDC濃度が2%になるように、EDC貯蔵溶液(90μL)と共にビーズ懸濁液と合わせた。こうして得られた反応懸濁液を混合し、その後Vortemp振盪培養器を用いて終夜、1500rpm、22℃にて反応させた。反応後、ビーズを洗浄して、500μLのPBS中で4℃にて保存した。
遺伝子パネル選択:適切な試料(例えば、細胞、組織等)から、例えば50の標的遺伝子を分析用に選択した。各標的遺伝子に対して1つの捕捉プローブを設計及び選択した。各捕捉プローブは、独自に光学的検出が可能な量子ドットナノ粒子含浸ビーズの1集団に接合させた。標的遺伝子及びスパイクしたオリゴヌクレオチドを増幅させ、米国特許第5514545号;第5545522号;第5716785号;及び第5891636号に開示のT7増幅法を用いて、ビオチンで標識した。
結合較正ビーズは、ビオチン−オリゴの付着レベルを漸増させて各ウェルに添加される例えば9種の独自にコードされたビーズの1シリーズであって、実施例に記載の通りに調製する。結合検量線を、このシリーズから得られるシグナルから、各ウェルに対して作成する。このデータにより、1ビーズ当たり既知数のビオチンによって生成されるシグナルレベル(RFU)の情報が与えられる。次いでこのデータを使用して、各ウェル内の他の全ビーズからのシグナルを較正する。こうして、「較正RFU」すなわち、各ウェル内の独自にコード化された各ビーズについての、1ビーズ当たりのビオチン数が与えられる。較正RFUを用い、次の実施例に提示するデータ曲線適合アルゴリズムに示すような方法を使用して標的分子の数を定量化する。
使用できるビーズのさらなるセットは、ハイブリダイゼーション対照ビーズである。これらのビーズは、1種以上の異なる定義済みオリゴヌクレオチド配列を表面に有する。ビオチン化逆相補オリゴヌクレオチドを、希釈系列に結合させて、システムのハイブリダイゼーションの有効性を試験できる。オリゴヌクレオチド配列は、独自なものであって、且つ対象の標的配列とはクロスハイブリダイズしないように設計できる。そのアッセイで既知配列の何れともハイブリダイズしないように設計したオリゴヌクレオチド配列を有する、非特異的ハイブリダイゼーション対照ビーズを使用することもできる。
標識対照ビーズを使用し、陽性対照の一形式として作用させることができる。これらの既知配列の合成RNA転写物を、ビーズに接触させる前に試料に添加できる。合成RNA転写物を異なる濃度添加して、標識対照ビーズの応答を試験できる。増幅された転写物配列とハイブリダイズするように設計したオリゴヌクレオチド配列を有する標識対照ビーズを添加できる。合成RNA転写物及びそれらの相補体は、他の分析物配列と交差反応しないように設計する。
機器対照ビーズも各ウェルに添加できる。このビーズは、例えば、655nmピークの発光量子ドット等の、レポーター量子ドットナノ結晶で染色されたビーズを含む。機器対照ビーズは、例えば655nm及び705nmの複数のレポーター色を有することができる。
1ビーズ当たりのビオチンの関数としての測定強度に対する、最適なデータモデル(曲線適合)を求めた。
培養細胞を異なる化合物で、異なる濃度にて処理して、15種の試料を作製した。処理後に、細胞を溶解して、総RNAを抽出した。総RNA(100ng)を次いで、Eberwineプロトコルの変法によりT7で増幅した。試料を、全ウェルに入れた試料ビーズ及び対照ビーズの混合物を用いて個々に分析した。試料をビーズとハイブリダイズさせ、洗浄し、ストレプトアビジンQ655レポーターで染色し、洗浄して、Mosaic機器(Quantum Dot Corporation;Hayward,CA)で走査した。
Claims (53)
- 多重化アッセイにおいて少なくとも1種の分析物の濃度を定量する方法であって、以下の工程を含む方法:
試料ビーズのセット及び対照ビーズのセットを含む混合物を準備する工程であって、試料ビーズの前記セットが第1コード化部分、及び少なくとも1種の分析物に選択的に結合する第1捕捉部分を含んでおり、対照ビーズの前記セットが第2コード化部分及び較正部分を含む工程、
前記少なくとも1種の分析物を含有することが疑われる試料に前記混合物を接触させる工程、
第1コード化部分からシグナルを得る工程、
第2コード化部分からシグナルを得る工程、
前記較正部分からシグナルを得る工程、
前記較正部分から得られるシグナルから滴定曲線を作成する工程、及び
前記滴定曲線及び画像を用いて、前記少なくとも1種の分析物の濃度を定量する工程。 - 第1コード化部分から得られるシグナル、第2コード化部分から得られるシグナル及び前記較正部分から得られるシグナルを同時に得る、請求項1記載の方法。
- 対照ビーズの前記セットが前記較正部分を様々な濃度で有する、請求項1記載の方法。
- 滴定曲線を作成する工程が、前記較正部分から得られるシグナルを、一次多項、二次多項、三次多項、四次多項、又はシグモイド適合を用いて分析することを含む、請求項1記載の方法。
- 第1コード化部分が少なくとも1種の半導体ナノ結晶である、請求項1記載の方法。
- 第2コード化部分が少なくとも1種の半導体ナノ結晶である、請求項1記載の方法。
- 第1コード化部分が少なくとも1種の半導体ナノ結晶であり、第2コード化部分が少なくとも1種の半導体ナノ結晶である、請求項1記載の方法。
- 前記較正部分が直接検出可能な部分である、請求項1記載の方法。
- 前記較正部分が間接的に検出可能な部分である、請求項1記載の方法。
- 前記較正部分がビオチン化化合物である、請求項1記載の方法。
- 前記較正部分がビオチン化オリゴヌクレオチドである、請求項1記載の方法。
- 同時に画像化する工程の前に前記混合物を標識ストレプトアビジンに接触させることを更に含む、請求項1記載の方法。
- 同時に画像化する工程の前に、少なくとも1種の半導体ナノ結晶で標識されたストレプトアビジンに前記混合物を接触させることを更に含む、請求項1記載の方法。
- 試料ビーズの前記セットがポリマービーズである、請求項1記載の方法。
- 試料ビーズの前記セットがポリスチレンビーズである、請求項1記載の方法。
- 対照ビーズの前記セットがポリマービーズである、請求項1記載の方法。
- 対照ビーズの前記セットがポリスチレンビーズである、請求項1記載の方法。
- 前記少なくとも1種の分析物がDNA、RNA、PNA、タンパク質、抗体、リガンド、受容体、脂質又は多糖である、請求項1記載の方法。
- 前記少なくとも1種の分析物がDNAである、請求項1記載の方法。
- 前記少なくとも1種の分析物がビオチン化DNAである、請求項1記載の方法。
- 多重化アッセイにおいて少なくとも1種の分析物の濃度を定量する方法であって、以下の工程を含む方法:
ビーズの第1セット及びビーズの第2セットを含む混合物を準備する工程であって、ビーズの第1セットが第1半導体ナノ結晶、及び少なくとも1種の分析物に選択的に結合するオリゴヌクレオチドを含んでおり、ビーズの第2セットが第2半導体ナノ結晶及びビオチン化オリゴヌクレオチドを含む工程、
前記少なくとも1種の分析物を含有することが疑われる試料に前記混合物を接触させる工程、
第3半導体ナノ結晶で標識されたストレプトアビジンに前記混合物を接触させる工程、
前記混合物を同時に画像化して画像を生成する工程であって、前記画像が第1半導体ナノ結晶から得られるシグナル、第2半導体ナノ結晶から得られるシグナル及び第3半導体ナノ結晶から得られるシグナルを含む工程、
第3半導体ナノ結晶から得られるシグナルから滴定曲線を作成する工程、及び
前記滴定曲線及び前記画像を用いて、前記少なくとも1種の分析物の濃度を定量する工程。 - 滴定曲線を作成する方法であって、以下の工程を含む方法:
対照ビーズのセットを準備する工程であって、前記対照ビーズのセットがコード化部分及び較正部分を含む工程、
前記コード化部分からシグナルを得る工程、
前記較正部分からシグナルを得る工程、及び
前記較正部分から得られたシグナルから滴定曲線を作成する工程。 - 前記コード化部分から得られるシグナル及び前記較正部分から得られるシグナルを同時に得る、請求項22記載の方法。
- 対照ビーズの前記セットが前記較正部分を様々な濃度で有する、請求項22記載の方法。
- 滴定曲線を作成する工程が、前記較正部分から得られるシグナルを、一次多項、二次多項、三次多項、四次多項、又はシグモイド適合を用いて分析することを含む、請求項22記載の方法。
- 前記コード化部分が少なくとも1種の半導体ナノ結晶である、請求項22記載の方法。
- 前記較正部分が直接検出可能な部分である、請求項22記載の方法。
- 前記較正部分が間接的に検出可能な部分である、請求項22記載の方法。
- 前記較正部分がビオチン化化合物である、請求項22記載の方法。
- 前記較正部分がビオチン化オリゴヌクレオチドである、請求項22記載の方法。
- 同時に画像化する工程の前に前記混合物を標識ストレプトアビジンに接触させることを更に含む、請求項22記載の方法。
- 同時に画像化する工程の前に、少なくとも1種の半導体ナノ結晶で標識されたストレプトアビジンに前記混合物を接触させることを更に含む、請求項22記載の方法。
- 対照ビーズのセットがポリマービーズである、請求項22記載の方法。
- 対照ビーズのセットがポリスチレンビーズである、請求項22記載の方法。
- 滴定曲線を作成する方法であって、以下の工程を含む方法:
対照ビーズのセットを準備する工程であって、前記対照ビーズのセットが第1半導体ナノ結晶及びビオチン化オリゴヌクレオチドを含む工程、
第2半導体ナノ結晶で標識されたストレプトアビジンに前記セットを接触させる工程、
前記セットを同時に画像化して画像を生成する工程であって、前記画像が第1半導体ナノ結晶から得られるシグナル及び第2半導体ナノ結晶から得られるシグナルを含む工程、及び
第2半導体ナノ結晶から得られるシグナルから滴定曲線を作成する工程。 - 対照ビーズのセットであって、
コード化部分及び較正部分を含む複数のビーズを含んでおり、
前記コード化部分が前記複数のビーズ中に一定濃度で存在し、
前記較正部分が前記複数のビーズ中に様々な濃度で存在する、セット。 - 前記較正部分が前記ビーズの表面上にある、請求項36記載のセット。
- 前記ビーズが複数種の異なる較正部分を含む、請求項36記載のセット。
- 前記ビーズが球状である、請求項36記載のセット。
- 前記ビーズがポリスチレンビーズである、請求項36記載のセット。
- 前記ビーズの径が約0.1μm〜約100μmである、請求項36記載のセット。
- 前記コード化部分が直接検出可能な部分である、請求項36記載のセット。
- 前記コード化部分が間接的に検出可能な部分である、請求項36記載のセット。
- 前記コード化部分が少なくとも1種の半導体ナノ結晶を含む、請求項36記載のセット。
- 前記較正部分が直接検出可能な部分である、請求項36記載のセット。
- 前記較正部分が間接的に検出可能な部分である、請求項36記載のセット。
- 前記較正部分が少なくとも1種の半導体ナノ結晶を含む、請求項36記載のセット。
- 前記較正部分が少なくとも1種のビオチン化化合物を含む、請求項36記載のセット。
- 前記較正部分が少なくとも1種のビオチン化オリゴヌクレオチドを含む、請求項36記載のセット。
- 前記コード化部分が少なくとも1種の半導体ナノ結晶を含んでおり、
前記較正部分が少なくとも1種のビオチン化化合物を含む、請求項36記載のセット。 - 前記コード化部分が少なくとも1種の半導体ナノ結晶を含んでおり、前記較正部分が少なくとも1種のビオチン化オリゴヌクレオチドを含む、請求項36記載のセット。
- 前記較正部分が最高濃度のビーズから得られるシグナルと前記較正部分が最低濃度のビーズから得られるシグナルの比が1.1より大きい、請求項36記載のセット。
- 対照ビーズのセットであって、
半導体ナノ結晶及びビオチン化オリゴヌクレオチドを含む複数のビーズを含んでおり、
前記半導体ナノ結晶が前記複数のビーズ中に一定濃度で存在し、
前記ビオチン化オリゴヌクレオチドが前記複数のビーズ中に様々な濃度で存在する、セット。
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