JP2583153B2 - 安定なアビジン―ビオチン化タンパク質複合体溶液の製造方法 - Google Patents
安定なアビジン―ビオチン化タンパク質複合体溶液の製造方法Info
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- JP2583153B2 JP2583153B2 JP2302645A JP30264590A JP2583153B2 JP 2583153 B2 JP2583153 B2 JP 2583153B2 JP 2302645 A JP2302645 A JP 2302645A JP 30264590 A JP30264590 A JP 30264590A JP 2583153 B2 JP2583153 B2 JP 2583153B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、アビジン−ビオチンシステムに於て用いら
れる安定なアビジン−ビオチン化タンパク質複合体溶液
の製造方法に関する。
れる安定なアビジン−ビオチン化タンパク質複合体溶液
の製造方法に関する。
［発明の背景］ 卵白から得られる糖タンパク質のアビジン、或はスト
レプトマイセスによって産生される糖鎖を持たないスト
レプトアビジンはビタミンの一種であるビオチンと特異
的に結合する。ビオチンをタンパク質に結合させると通
常タンパク質１分子あたりに複数個のビオチンがこれに
結合する。また、アビジン１分子あたりにビオチンは複
数個結合できる。従つて、ビオチンが結合したタンパク
質、即ちビオチン化タンパク質とアビジンを反応させる
と複数個のビオチン化タンパク質と複数個のアビジンの
結合した複合体が形成される。この複合体はビオチン化
タンパク質とアビジン或はストレプトアビジンとが３次
元構造を形成しているものと思われるが構造等は不明で
ある。このアビジン−ビオチン化タンパク質複合体を用
いたアビジン−ビオチンシステムは免疫組織化学染色，
ハイブリドーマのスクリーニング,DNAプルーブ染色，固
定相酵素免疫測定，二重標識研究等に於て広く利用され
ている。また、アビジン−ビオチンシステムは蛍光或は
酵素を用いる検出方法の中でも感度の高い方法であるこ
とが一般によく知られている（特開昭59−224564号公報
等）。
レプトマイセスによって産生される糖鎖を持たないスト
レプトアビジンはビタミンの一種であるビオチンと特異
的に結合する。ビオチンをタンパク質に結合させると通
常タンパク質１分子あたりに複数個のビオチンがこれに
結合する。また、アビジン１分子あたりにビオチンは複
数個結合できる。従つて、ビオチンが結合したタンパク
質、即ちビオチン化タンパク質とアビジンを反応させる
と複数個のビオチン化タンパク質と複数個のアビジンの
結合した複合体が形成される。この複合体はビオチン化
タンパク質とアビジン或はストレプトアビジンとが３次
元構造を形成しているものと思われるが構造等は不明で
ある。このアビジン−ビオチン化タンパク質複合体を用
いたアビジン−ビオチンシステムは免疫組織化学染色，
ハイブリドーマのスクリーニング,DNAプルーブ染色，固
定相酵素免疫測定，二重標識研究等に於て広く利用され
ている。また、アビジン−ビオチンシステムは蛍光或は
酵素を用いる検出方法の中でも感度の高い方法であるこ
とが一般によく知られている（特開昭59−224564号公報
等）。
しかしながら、従来の製造方法、即ち、アビジンとビ
オチン化タンパク質を混合し、一定時間熟成反応させる
方法により得られたアビジン−ビオチン化タンパク質複
合体溶液は安定性が極めて悪く、アビジン−ビチオン化
タンパク質複合体としての使用可能な期間は調製後数時
間乃至数日間しかなかつた。そのため該複合体を効率よ
く使用するには、必要量を用時調製しなければならない
という煩わしさがあり、しかも該複合体溶液が使用可能
になるまでにはアビジンとビオチン化タンパク質を混合
した後、30分程度の熟成時間が必要であるため、すぐに
は使用に供せないという不便さもあつた。それ故、長期
間保存可能で、しかも随時使用可能なアビジン−ビオチ
ン化タンパク質複合体溶液の出現が切に望まれていた。
オチン化タンパク質を混合し、一定時間熟成反応させる
方法により得られたアビジン−ビオチン化タンパク質複
合体溶液は安定性が極めて悪く、アビジン−ビチオン化
タンパク質複合体としての使用可能な期間は調製後数時
間乃至数日間しかなかつた。そのため該複合体を効率よ
く使用するには、必要量を用時調製しなければならない
という煩わしさがあり、しかも該複合体溶液が使用可能
になるまでにはアビジンとビオチン化タンパク質を混合
した後、30分程度の熟成時間が必要であるため、すぐに
は使用に供せないという不便さもあつた。それ故、長期
間保存可能で、しかも随時使用可能なアビジン−ビオチ
ン化タンパク質複合体溶液の出現が切に望まれていた。
［発明の目的］ 本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、
長期間安定に保存でき、且つ随時使用可能なアビジン−
ビオチン化タンパク質複合体溶液とその製造方法を提供
することを目的とする。
長期間安定に保存でき、且つ随時使用可能なアビジン−
ビオチン化タンパク質複合体溶液とその製造方法を提供
することを目的とする。
［発明の構成］ 本発明はアビジンとビオチン化タンパク質とを一定時
間反応させた後、反応停止剤を加えて反応を停止させる
ことを特徴とする安定なアビジン−ビオチン化タンパク
質複合体溶液の製造方法及び該方法により得られたアビ
ジン−ビチオン化タンパク質複合体溶液の発明である。
間反応させた後、反応停止剤を加えて反応を停止させる
ことを特徴とする安定なアビジン−ビオチン化タンパク
質複合体溶液の製造方法及び該方法により得られたアビ
ジン−ビチオン化タンパク質複合体溶液の発明である。
即ち、本発明者らは、長時間安定に保存し得るアビジ
ン−ビオチン化タンパク質複合体溶液を求めて鋭意研究
を重ねた結果、アビジンとビオチン化タンパク質とを一
定時間反応させた後、適当な反応停止剤を加えてアビジ
ン−ビオチン化タンパク質複合体の形成反応を停止させ
ることにより該目的を達成し得ることを見出し、本発明
を完成するに至つた。
ン−ビオチン化タンパク質複合体溶液を求めて鋭意研究
を重ねた結果、アビジンとビオチン化タンパク質とを一
定時間反応させた後、適当な反応停止剤を加えてアビジ
ン−ビオチン化タンパク質複合体の形成反応を停止させ
ることにより該目的を達成し得ることを見出し、本発明
を完成するに至つた。
本発明に於て用いられるビオチン化タンパク質として
は、例えばビオチン化ペルオキシダーゼ，ビオチン化ア
ルカリホスファターゼ，ビオチン化β−ガラクトシダー
ゼ等のビオチン化酵素があげられる。
は、例えばビオチン化ペルオキシダーゼ，ビオチン化ア
ルカリホスファターゼ，ビオチン化β−ガラクトシダー
ゼ等のビオチン化酵素があげられる。
本発明に於てアビジンの代わりにストレプトアビジン
を用いることも可能である。
を用いることも可能である。
本発明に於て用いられる反応停止剤としては例えばグ
ルタルアルデヒド、パラホルムハルデヒド或は免疫組織
染色に用いられるZamboni固定液、PLP固定液（何れも主
成分はパラホルムアルデヒド）等のアルデヒド類が好ま
しく挙げられるが、これらに限定されるものではなくア
ビジン−ビオチン化タンパク質複合体の形成反応を停止
する能力を有し、且つ得られた該複合体の使用目的に於
て悪影響を及ぼさないものであれば何れにてもよい。
ルタルアルデヒド、パラホルムハルデヒド或は免疫組織
染色に用いられるZamboni固定液、PLP固定液（何れも主
成分はパラホルムアルデヒド）等のアルデヒド類が好ま
しく挙げられるが、これらに限定されるものではなくア
ビジン−ビオチン化タンパク質複合体の形成反応を停止
する能力を有し、且つ得られた該複合体の使用目的に於
て悪影響を及ぼさないものであれば何れにてもよい。
本発明は、通常安定化剤の存在下に実施される。本発
明に於て用いられる安定化剤としては、タンパク質安定
化剤であれば何れにても使用できるが、通常、ポリオー
ル類が好ましく用いられる。ポリオール類の具体例とし
ては、例えば、グリセロール、エチレングリコール、サ
ッカロース等が挙げられるが、中でもグリセロールがよ
り好ましく用いられる。
明に於て用いられる安定化剤としては、タンパク質安定
化剤であれば何れにても使用できるが、通常、ポリオー
ル類が好ましく用いられる。ポリオール類の具体例とし
ては、例えば、グリセロール、エチレングリコール、サ
ッカロース等が挙げられるが、中でもグリセロールがよ
り好ましく用いられる。
これらの安定化剤はその種類により若干異なるが通
常、反応液中の濃度が１〜60wt/vol％となるように添加
され、グリセロールの場合は通常50wt/vol％前後の濃度
が好ましく用いられる。
常、反応液中の濃度が１〜60wt/vol％となるように添加
され、グリセロールの場合は通常50wt/vol％前後の濃度
が好ましく用いられる。
アビジンとビオチン化タンパク質の反応は通常、室温で
行われ、反応時間は通常数十分乃至数時間、好ましくは
１時間前後である。またアビジンとビオチン化タンパク
質の混合割合はアビジン１モルに対し、通常ビオチン化
タンパク質0.1〜10モル好ましくは１〜２モル、より好
ましくは1.5モル前後が用いられる。
行われ、反応時間は通常数十分乃至数時間、好ましくは
１時間前後である。またアビジンとビオチン化タンパク
質の混合割合はアビジン１モルに対し、通常ビオチン化
タンパク質0.1〜10モル好ましくは１〜２モル、より好
ましくは1.5モル前後が用いられる。
本発明に係るアビジン−ビオチン化タンパク質複合体
溶液は長時間安定に保存可能であり、しかも、使用した
い時にはそのまますぐに使用できる（用時調製の場合の
ように30分間の熟成時間を要さない。）。
溶液は長時間安定に保存可能であり、しかも、使用した
い時にはそのまますぐに使用できる（用時調製の場合の
ように30分間の熟成時間を要さない。）。
本発明に係るアビジン−ビオチン化タンパク質複合体
溶液を免疫組織染色、酵素免疫測定法、ウエスタンブロ
ッティング、ハイブリドーマのスクリーニング等に使用
すると、極めて高感度にこれを実施することができる。
溶液を免疫組織染色、酵素免疫測定法、ウエスタンブロ
ッティング、ハイブリドーマのスクリーニング等に使用
すると、極めて高感度にこれを実施することができる。
即ち、本発明に係るアビジン−ビオチン化タンパク質
複合体を各種アビジン−ビオチンシステムに使用すれば
操作は簡便で、感度も高く、試液の無駄もない。
複合体を各種アビジン−ビオチンシステムに使用すれば
操作は簡便で、感度も高く、試液の無駄もない。
以下に実施例により、本発明を更に詳細に述べるが、
本発明はこれらにより何等限定されるものではない。
本発明はこれらにより何等限定されるものではない。
［実施例］ 実施例1.安定なストレプトアビジン−ビオチン化ペルオ
キシダーゼ複合体溶液の調製 グリセロールを50wt/vol％含有する0.1Mリン酸緩衝液
（pH6.0）95mlにストレプトアビジン1mg及びビオチン化
ペルオキシダーゼ1mgを加えてよく撹拌し、室温下１時
間静置した後、反応停止剤のZamboni固定液5mlを加えよ
く撹拌して、ストレプトアビジン−ビオチン化ペルオキ
シダーゼ複合体溶液を得た。
キシダーゼ複合体溶液の調製 グリセロールを50wt/vol％含有する0.1Mリン酸緩衝液
（pH6.0）95mlにストレプトアビジン1mg及びビオチン化
ペルオキシダーゼ1mgを加えてよく撹拌し、室温下１時
間静置した後、反応停止剤のZamboni固定液5mlを加えよ
く撹拌して、ストレプトアビジン−ビオチン化ペルオキ
シダーゼ複合体溶液を得た。
尚、この時の複合体の分子量はHPLCより約20万と推定
された。
された。
実施例2.実施例１のストレプトアビジン−ビオチン化ペ
ルオキシダーゼ複合体溶液による組織抗原の染色（光学
顕微鏡観察による） （操作手順） １）組織を10％ホルマリンで固定し、常法に従つてパラ
フィン切片とした後、脱パラフィン、水洗、３％過酸化
水素水で15分間インキュベートした。
ルオキシダーゼ複合体溶液による組織抗原の染色（光学
顕微鏡観察による） （操作手順） １）組織を10％ホルマリンで固定し、常法に従つてパラ
フィン切片とした後、脱パラフィン、水洗、３％過酸化
水素水で15分間インキュベートした。
２）0.01Mリン酸緩衝生理食塩水（以下、PBSと略記す
る。）にて５分間ずつ３回洗浄した。
る。）にて５分間ずつ３回洗浄した。
３）次に10％正常ヤギ血清で室温10分間反応させた後、
更に各種抗原に対応する200倍に希釈したウサギ抗体と
室温で１時間反応させた。
更に各種抗原に対応する200倍に希釈したウサギ抗体と
室温で１時間反応させた。
４）５分間ずつ３回PBS洗浄した後、ビオチン化抗ウサ
ギ抗体で室温10分間反応させた。
ギ抗体で室温10分間反応させた。
５）PBSで５分間ずつ３回洗浄した後、実施例１で調製
したストレプトアビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ
複合体溶液と室温15分間反応させた。
したストレプトアビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ
複合体溶液と室温15分間反応させた。
６）PBSで５分間ずつ３回洗浄した後、色素混合液で５
分間反応させ、然る後蒸留水で充分に洗浄した。
分間反応させ、然る後蒸留水で充分に洗浄した。
７）マイヤーヘマトキシリン溶液で３分間後染色し、脱
水、透徹、封入して光顕試料とした。
水、透徹、封入して光顕試料とした。
（結果） 横紋筋の組織切片を試料としたものでは、Desminが
（＋）にでた。
（＋）にでた。
胃癌の組織切片を試料としたものでは、EMAが
（＋）にでた。
（＋）にでた。
大腸癌の組織切片を試料としたものでは、CEAが
（＋）にでた。
（＋）にでた。
リンパ節の組織切片を試料としたものでは、LCAが
（＋）にでた。
（＋）にでた。
尚、上記からのいずれの場合も特異性に優れ従来
の複合体による方法と相関し、且つ染色像も極めて鮮明
であった。
の複合体による方法と相関し、且つ染色像も極めて鮮明
であった。
尚、実施例１に於てZamboni固定液の代わりにPLP固定
液、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドを夫々
反応停止剤として用いて得られたストレプトアビジン−
ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体溶液を、本実施例で
用いた該複合体溶液の代わりに用いた場合も、本実施例
と全く同様の結果が得られた。
液、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドを夫々
反応停止剤として用いて得られたストレプトアビジン−
ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体溶液を、本実施例で
用いた該複合体溶液の代わりに用いた場合も、本実施例
と全く同様の結果が得られた。
比較例1.従来法によるストレプトアビジン−ビオチン化
ペルオキシダーゼ複合体溶液の調製 0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）100mlにストレプトアビジ
ン1mg、ビオチン化ペルオキシダーゼ1mgを混合し室温に
30分間おき、熟成させた。
ペルオキシダーゼ複合体溶液の調製 0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）100mlにストレプトアビジ
ン1mg、ビオチン化ペルオキシダーゼ1mgを混合し室温に
30分間おき、熟成させた。
実施例3.実施例１と比較例１のストレプトアビジン−ビ
オチン化ペルオキシダーゼ複合体溶液の保存安定性の比
較（ELISAによる） （操作手順） １）抗原（ウサギIgG）を20μg/ml,2μg/ml,0.2μg/ml,
0.02μg/ml,0.002μg/mlの各濃度に調製後、96穴マイク
ロプレートに100μ/wellずつ分注し、37℃で１時間イ
ンキュベートした後、0.05％Tween20（花王（株）登録
商標）添加PBS（以下、PBS−Tweenと略記する。）で３
回洗浄した。
オチン化ペルオキシダーゼ複合体溶液の保存安定性の比
較（ELISAによる） （操作手順） １）抗原（ウサギIgG）を20μg/ml,2μg/ml,0.2μg/ml,
0.02μg/ml,0.002μg/mlの各濃度に調製後、96穴マイク
ロプレートに100μ/wellずつ分注し、37℃で１時間イ
ンキュベートした後、0.05％Tween20（花王（株）登録
商標）添加PBS（以下、PBS−Tweenと略記する。）で３
回洗浄した。
２）１％ウシ血清アルブミン含有PBS−Tweenを200μ/
wellずつ分注し、37℃で１時間イキュベートした後、PB
S−Tweenで３回洗浄した。
wellずつ分注し、37℃で１時間イキュベートした後、PB
S−Tweenで３回洗浄した。
３）ビオチン化抗ウサギIgGをPBS−Tweenで50倍希釈し1
00μ/wellずつ分注し、37℃で10分間インキュベート
した後、PBS−Tweenで３回洗浄した。
00μ/wellずつ分注し、37℃で10分間インキュベート
した後、PBS−Tweenで３回洗浄した。
４）実施例１又は比較例１で調製したストレプトアビジ
ン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体溶液を100μ/
wellずつ分注し、37℃で５分間インキュベートした後、
PBS−Tweenで３回洗浄した。
ン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体溶液を100μ/
wellずつ分注し、37℃で５分間インキュベートした後、
PBS−Tweenで３回洗浄した。
５）発色試液（ｏ−フェニレンジアミン、H2O2溶液）を
100μ/wellずつ分注し、室温で３分間反応させた。
100μ/wellずつ分注し、室温で３分間反応させた。
６）6N硫酸を50μ/wellずつ分注し、発色反応を停止
させた。
させた。
７）分光光度計で0D492nm値を測定した。
（結果） 表１より明らかな如く、本発明に係る複合体溶液は４
℃で１年間保存しても、調製直後の複合体溶液とELISA
の感度に差は認められなかつた。これに対し、従来の複
合体溶液は４℃で１週間保存すると調製直後と比べて著
しい感度の低下が認められた。
℃で１年間保存しても、調製直後の複合体溶液とELISA
の感度に差は認められなかつた。これに対し、従来の複
合体溶液は４℃で１週間保存すると調製直後と比べて著
しい感度の低下が認められた。
尚、実施例１に於てZamboni固定液の代わりにPLP固定
液、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドを夫々
反応停止剤として用いて得られたストレプトアビジン−
ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体溶液を、実施例１で
得られた該複合体溶液の代わりに用いた場合も、実施例
１で得られた複合体溶液の場合とほぼ同様の結果が得ら
れた。
液、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドを夫々
反応停止剤として用いて得られたストレプトアビジン−
ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体溶液を、実施例１で
得られた該複合体溶液の代わりに用いた場合も、実施例
１で得られた複合体溶液の場合とほぼ同様の結果が得ら
れた。
［発明の効果］ 以上述べた如く、本発明の方法により得られたアビジ
ン−ビオチン化タンパク質複合体溶液は長期間安定に保
存可能であり、しかも随時使用可能なので、使用の都度
調製せずに済み、操作が簡便となり、経済的且つ効率的
であり、斯業に貢献するところ極めて大なる発明であ
る。
ン−ビオチン化タンパク質複合体溶液は長期間安定に保
存可能であり、しかも随時使用可能なので、使用の都度
調製せずに済み、操作が簡便となり、経済的且つ効率的
であり、斯業に貢献するところ極めて大なる発明であ
る。
Claims (9)
- 【請求項１】アビジンとビチオン化タンパク質とを一定
時間反応させた後、反応停止剤を加えて反応を停止させ
ることを特徴とする安定なアビジン−ビオチン化タンパ
ク質複合体溶液の製造方法。 - 【請求項２】安定化剤の存在下にアビジンとビオチン化
タンパク質とを反応させる請求項（１）に記載の製造方
法。 - 【請求項３】安定化剤がポリオール類である請求項
（２）に記載の製造方法。 - 【請求項４】ポリオール類がグリセロールである請求項
（３）に記載の製造方法。 - 【請求項５】ビオチン化タンパク質がビオチン化酵素で
ある請求項（１）〜（４）の何れかに記載の製造方法。 - 【請求項６】ビオチン化酵素がビオチン化ペルオキシダ
ーゼである請求項（５）に記載の製造方法。 - 【請求項７】アビジンがストレプトアビジンである請求
項（１）〜（６）の何れかに記載の製造方法。 - 【請求項８】反応停止液がグルタルアルデヒド、パラホ
ルムアルデヒド、Zamboni固定液、又はPLP固定液である
請求項（１）〜（７）の何れかに記載の製造方法。 - 【請求項９】請求項（１）に記載の製造方法により得ら
れたアビジン−ビオチン化タンパク質複合体溶液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2302645A JP2583153B2 (ja) | 1990-11-09 | 1990-11-09 | 安定なアビジン―ビオチン化タンパク質複合体溶液の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2302645A JP2583153B2 (ja) | 1990-11-09 | 1990-11-09 | 安定なアビジン―ビオチン化タンパク質複合体溶液の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04178399A JPH04178399A (ja) | 1992-06-25 |
| JP2583153B2 true JP2583153B2 (ja) | 1997-02-19 |
Family
ID=17911480
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2302645A Expired - Lifetime JP2583153B2 (ja) | 1990-11-09 | 1990-11-09 | 安定なアビジン―ビオチン化タンパク質複合体溶液の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2583153B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5695928A (en) * | 1993-12-10 | 1997-12-09 | Novartis Corporation | Rapid immunoassay for detection of antibodies or antigens incorporating simultaneous sample extraction and immunogenic reaction |
| EP2058663A1 (en) * | 2007-11-12 | 2009-05-13 | Euro-Diagnostica B.V. | Method for the immobilization of an analyte on a solid support |
-
1990
- 1990-11-09 JP JP2302645A patent/JP2583153B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04178399A (ja) | 1992-06-25 |
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