JP2822389B2 - 抗ｆｒ−９００５０６物質抗体、および高感度酵素免疫測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は、新規な抗体、高感度酵素免疫測定法およ
びその測定法を実施するための試験キットに関する。

さらに詳細には、この発明はFR−900506物質中に存在
する抗原決定基を認識する抗体、固定化抗体を利用する
FR−900506物質の高感度酵素免疫測定法（直接法）、被
検物質を認識する第一抗体、および該第一抗体を認識す
る固定化された第二抗体とからなる、低分子物質の高感
度酵素免疫測定法（間接法）、および直接法もしくは間
接法によりFR−900506物質を検出するための試験キット
に関する。

従来の技術及び発明が解決しようとする問題点 FR−900506物質は、ストレプトミセス（Streptomyce
s）属、特にストレプトミセス・ツクバエンシス（Strep
tomyces tsukubaensis）No.9993（微工研条寄第927号）
が産生する免疫抑制活性、抗菌活性等の薬理活性を有す
る化合物で、下記の構造式を有することが知られている
（特開昭61−148181号）。

FR−900506物質は微量で非常に強力な免疫抑制活性を
有するため、例えば臓器移植等の移植の際発現する拒絶
反応を有効且つ持続的に抑制するには、該化合物の生体
投与後の薬物の血中濃度を容易に、かつ高感度にモニタ
リングする技術が必要であり、その為には、微量濃度を
正確に測定する技術の確立が、きわめて重要と考えられ
る。

しかしながら、FR−900506物質の微量濃度を高感度で
且つ簡便に測定する技術は未だ開発されておらず、また
FR−900506物質の検出において重要な意味をもつ該物質
を認識する抗体も未開発の状況にあった。

従来、生体試料等に含まれる微量低分子物質の測定法
としては、ガスクロマトグラフィ、高速液体クロマトグ
ラフィ、ラジオイムノアッセイ法や酵素免疫測定法など
が用いられている。

しかしながら、これらの方法は、（１）微量濃度の薬
理活性物質を測定するには感度が不充分である、（２）
操作が煩雑である、（３）大型装置を必要とする、
（４）危険なラジオアイソトープを使用しなければなら
ない、等の問題点があった。

問題点を解決するための手段 本発明の発明者等は、鋭意研究の結果、FR−900506物
質を認識する抗体を得ることに成功し、次いでこの抗体
を固定化し、これにFR−900506物質を含む検体および酵
素で標識されたFR−900506物質を競合的に反応させるこ
とにより、微量のFR−900506物質を高感度で且つ簡便に
検出できることを見い出した。

更に発明者等は鋭意研究を重ねた結果、被検物質を認
識する第一抗体と、該第一抗体を認識する固定化された
第二抗体を用い、これに被検物質を含む検体および酵素
で標識された被検物質を競合的に反応させることによ
り、極めて微量の被検物質をより高感度で且つ簡便に検
出する測定法を見い出した。また、前記測定を実施する
際に便利な試験キットを作成し、この発明を完成した。

本発明を概説すれば次の４つの発明に分けられる。

（Ｉ）FR−900506物質中の抗原決定基を認識する抗体。

（II）FR−900506物質中に存在する抗原決定基を認識す
る抗体を固定化し、該固定化抗体にFR−900506物質を含
む検体および酵素で標識されたFR−900506物質とを競合
的に反応させ、固定化抗体に結合した酵素で標識された
FR−900506物質を検出することを特徴とするFR−900506
物質の高感度酵素免疫測定法（直接法）。

（III）被検物質を認識する第一抗体および該第一抗体
を認識する固定化された第二抗体とからなり、抗体に含
まれる被検物質と、酵素で標識された被検物質とを該第
一抗体に競合的に反応させ、得られる第二抗体に結合し
た第一抗体に結合している酵素で標識された被検物質を
検出することを特徴とする高感度酵素免疫測定法（間接
法）。

（IV）構成成分として、FR−900506物質中の抗原決定基
を認識する抗体、および酵素で標識されたFR−900506物
質を含むことを特徴とするFR−900506物質を検出するた
めの試験キット。

以下本発明について詳細に説明する。

（Ｉ）FR−900506物質中の抗原決定基を認識する抗体 上記抗体はポリクローナル抗体とモノクローナル抗体
を含む。

ポリクローナル抗体は、そのＨ鎖（heavy chain）の
違いによって、IgG、IgA、IgM、IgDまたはIgEのような
クラスがあり、さらにこれらの各クラスにはいくつかの
サブクラスが存在するが、本発明の抗体はFR−900506物
質中の抗原決定基を認識するものであれば、いずれのタ
イプのものでも使用でき、特に好ましいクラスはIgGで
ある。

ポリクローナル抗体は動物に免疫原となる物質（例え
ば、FR−900506物質）を投与して免疫し、得られる抗血
清から単離・精製される。

免疫操作は常法により行なわれる。

免疫感作される動物は特に限定されないが、通常ウサ
ギ、モルモット、ラット、マウス、ヤギ等が使用され、
特に好ましいものはウサギである。

免疫原となる物質（例えばFR−900506物質）は通常免
疫原性を高めるため、例えば牛血清アルブミン（以下BS
Aと表記）、ゼラチン、ヘモシアニン等の担体と結合さ
せて使用する。免疫間となる物質がFR−900506物質であ
る場合、BSAとの結合体（BSA−FR−900506物質結合体）
は、例えばFR−900506物質をこはく酸等のジカルボン酸
のハーフエステルに変換し、次いでジシクロヘキシルカ
ルボジイミド等の縮合剤の存在下Ｎ−ヒドロキシサクシ
ンイミド等を作用させて、該ハーフエステルの活性エス
テルに導き、さらにBSAと反応させることにより得られ
る。

ポリクローナル抗体は、得られた抗血清から硫安等の
塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィーなど
の常法の操作に付して単離・精製される。

モノクローナル抗体もそのＨ鎖の違いによってポリク
ローナル抗体と同様のクラスやサブクラスを有するが、
本発明のモノクローナル抗体はFR−900506物質中の抗原
決定基を認識するものであれば、いずれのタイプのもの
も使用でき、特に好ましいグラスはIgGである。

モノクローナル抗体は通常細胞融合法により製造され
るが、遺伝子操作の技術によっても製造できる。

細胞融合において使用される抗体産生細胞（例えば、
抗FR−900506物質抗体産生細胞）は、免疫原性を高めら
れた物質（例えば、BSA−FR−900506物質結合体）で免
疫された動物（例えば、マウス、ラット、ラビット、ヤ
ギ等）の脾細胞、リンパ節細胞もしくは末梢リンパ球等
である。また、あらかじめ取り出された前述の細胞ある
いはリンパ球等に培養液中で免疫原を作用させてできる
抗体産生細胞も使用できる。尚、後者の操作を用いる場
合にはヒト由来の抗体産生細胞も調製できる。抗体酸産
生細胞と骨髄腫細胞は融合可能であれば、互いに異なる
動物種に由来するものであってもよいが、同種の動物由
来のものを使用するのが好ましい。

細胞融合法によるモノクローナル抗体の製造は、例え
ばケーラーとミルスタイン（Ｋhler and Milstein）
の基本方法［ネイチャー第256巻、第495頁（1975）］に
従って常法により行なわれる。

特に好ましくは、BSA−FR−900506物質結合体で免疫
したマウスから得られた脾細胞と、マウス骨髄腫細胞と
を細胞融合してハイブリドーマを製造し、その中からFR
−900506物質に特異的なモノクローナル抗体を産生して
いるハイブリドーマを選別する。該ハイブリドーマをマ
ウス腹腔で増殖させ、その腹水からIgG画分の抗FR−900
506物質モノクローナル抗体を取得する。

（II）FR−900506物質の酵素免疫測定法（直接法） 直接法による酵素免疫測定はFR−900506物質中に存在
する抗原決定基を認識する抗体を固定化し、該固定化抗
体にFR−900506物質を含む検体および酵素で標識された
FR−900506物質とを競合的に反応させ、固定化抗体に結
合した酵素で標識されたFR−900506物質を検出すること
により行なわれる。FR−900506物質中に存在する抗原決
定基を認識する抗体とは、発明（Ｉ）記載の抗体を意味
し、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体の
どちらでも使用できるが、より選択性が高く、各製造ロ
ット間でその特性に差がない等の理由からモノクローナ
ル抗体が好ましい。固定化する場合の固相としては、例
えばプレート（イムノプレート等）、粒子（イムノビー
ズ等）、ポリスチレンボールや試験管等が使用される
が、簡便な操作性の点でイムノプレートが好ましい。FR
−900506物質を標識する酵素としては、酵素免疫測定法
に通常使用される酵素が挙げられる。例えば、ペルオキ
シダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエ
ステラーゼ、グルコース−６−りん酸脱水素酵素、りん
ご酸脱水素酵素もしくはウレアーゼ等が使用できるが、
好ましい酵素は、ペルオキシダーゼ（以下PODと表記）
である。

酵素で標識されたFR−900506物質は常法に従い調製さ
れる。例えば架橋剤を用いる場合は前記発明（Ｉ）記載
のFR−900506物質とこはく酸等のジカルボン酸から作ら
れるハーフエステルにＮ−ヒドロキシサクシンイミド等
を作用させ、生成する該ハーフエステルの活性エステル
に、POD等の標識に使用できる酵素を反応させることに
より得られる。

固定化抗体に結合した酵素標識物質の検出は、標識に
使用されている酵素の活性を常法により測定することに
より行なわれる。例えば標識に用いられた酵素がPODの
場合には、Ｏ−フエニレンジアミンと過酸化水素水とを
含む酵素基質溶液を使用し、固定化抗体に結合したPOD
−FR−900506物質標識体の量に応じて酸化された基質の
発色の程度を吸光度測定することによりFR−900506物質
の定量が行なわれる。

本直接法により、FR−900506物質の微量濃度（10^-1〜
10³ng/ml）を高感度かつ簡便に定量的および定性的に測
定することができる。

（III）酵素免疫測定法（間接法） 間接法による酵素免疫測定は、被検物質を認識する第
一抗体および該第一抗体を認識する固定化された第二抗
体を使用し、該第一抗体に検体に含まれる被検物質と酵
素で標識された被検物質とを競合的に反応させ、得られ
る第二抗体に結合した第一抗体に結合している酵素で標
識された被検物質を検出することにより行なわれる。

該間接法はペプタイド、ステロイド、プロスタグラン
ジン、多糖類もしくは大環状化合物等をはじめ種々の物
質を被検物質として測定できるが、大環状化合物、より
具体的にはFR−900506物質の濃度測定に使用できる。

第一抗体は被検物質を認識できる抗体であればポリク
ローナル抗体、モノクローナル抗体のどちらでも使用で
きるが、より選択性が高く、各製造ロット間でその特性
に差がない等の理由からモノクローナル抗体が好まし
い。該第一抗体は発明（Ｉ）の記載と同様に調製され、
被検物質がFR−900506物質の場合には、第一抗体は発明
（Ｉ）により記載されている抗体が使用される。

該第一抗体を認識する第二抗体としては、第一抗体も
しくは第一抗体と同一種の抗体を抗原として用い常法に
より調製された抗体でも、市販されている抗体でも使用
できるが、第一抗体と被検物質との抗原抗体反応を妨げ
ず、第一抗体を認識するものであればポリクローナル抗
体、モノクローナル抗体にかかわらず使用できる。好ま
しくはラビットから得られたIgGクラスの抗体を第一抗
体として使用する場合は、第二抗体としてヤギ抗ラビッ
トIgGを用い、またマウスから得られたIgGクラスの抗体
を第一抗体として使用する場合は、第二抗体としてラビ
ット抗マウスIgGを使用する。

固定化する固相、被検物質を標識する酵素およびその
酵素の検出方法は発明（II）に記載のものと同様の物お
よび方法が使用される。

本間接法は、固定化された第二抗体が認識する第一抗
体の量を調節することにより、被検物質の検出限界値を
変えることができる。すなわち、本発明の具体例として
記載のFR−900506物質の定量の場合は、10^-2ng/ml程度
の極めて微量な濃度まで高感度に且つ簡便に定量的およ
び定性的に測定できることが示された。

（IV）試験キット この試験キットは、FR−900506物質中に存在する抗原
決定基を認識する抗体と、酵素で標識されたFR−900506
物質を含むことを特徴とする。

「FR−900506物質中に存在する抗原決定基を認識する
抗体」とは前述の（Ｉ）に記載されたポリクローナル抗
体もしくはモノクローナル抗体が示すが、好ましくはモ
ノクローナル抗体である。なお該抗体は固定状態でも、
溶液状態でも供給することができる。

酵素で標識されたFR−900506物質とは、前述の（II）
で記載されたものを示すが、好ましくは、ペルオキシダ
ーゼで標識されたFR−900506物質である。

なお該化合物も、固体状態または溶液状態のいずれで
も供給することができる。

この試験キットは、さらに本願中の高感度酵素免疫測
定法を実施する際に使用される物を含んでいてもよい。
たとえば、FR−900506物質を定量的に測定する際に必要
な既知の量のFR−900506物質を、標準試料として含んで
いてもよい。また別の例としては、本願発明（III）に
おいて示されたような“FR−900506物質中に存在する抗
原決定基を認識する抗体”を認識する抗体があげられ
る。

そして、さらに別の例としては、FR−900506物質の標
識として用いられた酵素の基質があげられる。

実施例1.抗FR−900506物質ポリクローナル抗体の調製 FR−900506物質（248mg）をピリジン（7ml）に溶解
し、これにこはく酸無水物（145mg）と４−ジメチルア
ミノピリジン（7ml）を加え、室温で18時間撹拌する。
反応液を減圧下で濃縮乾固し、残渣をシリカゲルカラム
クロマトグラフィにかけ、酢酸エチルで展開してこはく
酸−FR−900506物質ハーフエステル（90mg）を得る。こ
のハーフエステル（90mg）を酢酸エチル（10ml）に溶解
した溶液に、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（12.6mg）
を溶解し、これに氷冷撹拌下ジシクロヘキシルカルボジ
イミド（22mg）を添加し、室温下一晩撹拌する。沈澱物
を濾去し、濾液を減圧留去する。残渣をシリカゲル薄層
クロマトグラフィに付し、酢酸エチルで展開することに
より精製し、上記化合物の活性エステル（74.1mg）を得
る。

IRν（ニート）:1813,1784,1835,1640,1200cm^-1 ２）BSA−FR−900506物質結合体の調製 上記で得られたこはく酸−FR−900506物質ハーフエス
テルの活性エステル（37mg）をジオキサン（4ml）に溶
解した溶液に、BSA（アルモア製薬社製）（30.1mg）を
0.05Mりん酸緩衝液（pH7.3）（10ml）に溶解した溶液を
加え、４℃で３日間撹拌し、反応混合物を0.05Mりん酸
緩衝液（pH7.3）に対して24時間透析することによりBSA
−FR−900506物質結合体を調製する。

３）POD−FR−900506物質標識体の調製 １）で得られたこはく酸−FR−900506物質ハーフエス
エルの活性エステル（0.48mg）のジオキサン溶液（10μ
）に、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（hors
eradish Peroxidase,Type VI,シグマ社製）（10mg）の
シオキサン−0.5％炭酸水素ナトリウム（1:1v/v）混合
溶液（0.36ml）を加え、４℃で2.5時間撹拌する。これ
に0.1％w/vゼラチン−0.05Mりん酸緩衝液（pH7.0）（1.
77ml）を加えた後、0.05Mりん酸緩衝液（pH7.0）に対し
て透析し、POD−FR−900506物質標識体溶液を得る。

４）抗FR−900506物質ポリクローナル抗体の調製 ２）で得たBSA−FR−900506物質結合体（BSA量として
1.6mg）のりん酸緩衝生理食塩水（以下PBS溶液と表記）
（2.5ml）を等量のフロインド（Freund）の完全アジュ
バントに乳化し、ニュージーランドホワイト種ラビット
（雌）７匹のフットパッド（foot pad）と皮下にそれぞ
れ5mlずつ注射して免疫を行なう。２週後と３週後に、
前記と同量のBSA−FR−900506物質結合体のPBS溶液を等
量のフロインド（Freund）の不完全アジュバントで乳化
したものを5mlずつフットパッドと皮下に注射して追加
免疫を行なう。

更に追加免疫から３週後、同様にして最終免疫を行な
う。最終免疫９日後に全採血を行ない、得られる抗血清
（340ml）に等量のPBS溶液及び等量の100％飽和硫安を
加え塩析する。得られる析出物を遠心分離（10,000rpm
×10分）して集め、20mMりん酸緩衝液（pH8.0）（200m
l）に溶解し、同緩衝液（pH8.0）に対し、充分透析後、
同緩衝液で平衡化したDEAEセルロース（DE52、ワットマ
ン・ケミカル・セパレーション社製）にて精製し、抗FR
−900506物質ポリクローナル抗体（5.6g）を含む素通り
画分（IgG画分）を得た（抗体の量は波長280nmにおける
吸光度の値から計算した）。

なお、本実施例にて用いられるPBS溶液とは、水1.0
中に下記組成を含む溶液を意味し、以下の実施例におい
ても同様である。

NaCl 8.0g Na₂HPO₄ 1.15g KCl 0.2g KH₂PO₄ 0.2g 実施例2.抗FR−900506物質モノクローナル抗体の調製 １）抗FR900506物質モノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマの調製 実施例１の２）で得られたBSA−FR−900506物質結合
対（BSA量として50μｇ）のPBS溶液（0.2ml）を等量の
フロインド（Freund）の完全アジュバントに乳化し、BA
LB/cマウス（雌）に腹腔内注射する。その後同量のBSA
−FR−900506物質結合体のPBS溶液を等量のフロインド
（Freund）の不完全アジュバントで乳化したものを、２
週間隔で２回腹腔内注射し、２次、３次の免疫を行な
う。さらにその後、４次免疫として、10倍量のBSA−FR
−900506物質結合体（BSA量として500μｇ）のPBS溶液
（0.2ml）をフロインド（Freund）の不完全アジュバン
トに乳化し、皮下注射した後、最終免疫としてBSA−FR
−900506物質結合体（BSA量として200μｇ）のPBS溶液
（0.2ml）を尾静脈より静注し、３日後に脾臓を取り出
す。

この脾臓をピンセットでほぐし、得られる脾細胞とマ
ウスミエローマ細胞P3×63Ag8U・１とを下記方法に従っ
て融合する。

すなわち、脾細胞をダルベッコ氏改変イーグルズ・ミ
ニマム・エッセンシャルメディウム（最小必須培地、以
下Ｄ−MEMという）に浮遊させ、浮遊液中の赤血球を0.8
3％塩化アンモニウム溶液（９容量）と0.17Mトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（pH7.65,1
容量）との混液で４℃で５分間処理して破壊し遠心分離
により除去する。10％ウシ胎仔血清加Ｄ−MEM中で培養
したマウスミエローマ細胞と脾細胞をＤ−MEMで数回洗
浄する マウスミエローマ細胞（４×10⁷個）の浮遊液に脾細
胞（２×10⁸個）の浮遊液を加え、混液を50mlのプラス
チック管（コーニング・グラス・ワークス社製50mlコー
ニング遠心管）中でよく混合する。培地を遠心分離によ
り除去し、細胞を水浴中で37℃に加温する。この細胞
に、振り混ぜながら45％ポリエチレングリコール（メル
ク社製、平均分子量4,000）溶液（1ml）を１分間かけて
徐々に加え、混合物を室温で５分間放置する。反応混合
物に５分間かけてＤ−MEM（15ml）を滴加して細胞融合
反応を停止させ、大量のＤ−MEMを加えた後、混合物を
遠心分離して上清を除去する。残渣に15％ウシ胎仔血清
（センタウラス社製、ロット757）、グルタミン2mM,2−
メルカプトエタノール２×10^-5、硫酸ストレプトマイシ
ン100μg/ml、ペニシリンG100U/ml、硫酸ゲンタマイシ
ン80μg/mlおよびファンギゾン（アンホテリシンＢ、ギ
ブコラボラトリー製）を補ったＤ−MEMよりなる完全培
地（以下CMという）を加える。混合物を少し混ぜた後、
生じた融合細胞浮遊液を24ウエルのプレート（ヌンク社
製）10枚に脾細胞が１ウエル当り１×10⁶個になるよう
１ウエル1mlずつ分注し、５％炭酸ガス気中37℃で１日
培養した後、アミノプテリン（４×10^-7M）、チミジン
（1.6×10^-5M）およびヒポキサンチン（１×10^-4M）を
含有するCM（HAT培地）1mlを各ウエルに添加する。１日
後、各ウエルから半量の培地を吸引除去しHAT培地を添
加する。その後２日または３日毎に培地交換を続ける。

ハイブリドーマの生育した161ウエル中固相BSA−FR−
900506物質結合体に反応性を示し、且つFR−900506物質
に対し特異的に反応性を示す14ウエルを選択する。さら
にその14ウエルの中から抗体価（titer）の高い８ウエ
ルをBALB/cマウスの胸腺細胞をフィーダー層（５×10⁶
細胞/ml）として用いた96ウエル平底マイクロプレート
（ヌンク社製）を用いて、限界希釈法によりクローニン
グ操作を行ない、FR−900506物質に特異性を示すモノク
ローナル抗体を産生する３種類のハイブリドーマを得
る。

なお、前記各ウエル中の抗体アッセイは、下記に示す
ような固相BSA−FR−900506物質結合体に反応し、かつ
その反応が過剰量のFR−900506物質により拮抗するクロ
ーンを選出する方法で行なう。

すなわちBSA−FR−900506物質結合体に対する反応性
の確認は、該結合体を固相コーティング（固相コーティ
ング条件は20μg/ml PBS溶液を100μ／ウエル添加し
て37℃で２時間静置）した各ウエルに培養液（100μ
）を添加して37℃で２時間静置する。吸引除去、洗浄
後POD標識抗マウスIgG（マイルス社製、コード61−204
・１）の１％BSAを含むPBS溶液（以下１％BSA−PBS溶液
と表記）による2000倍希釈液（100μ）を添加し、37
℃で１時間放置する。吸引除去、洗浄後常法の発色法に
てPOD活性を測定する。また、FR−900506物質に特異的
に反応する抗体であるかどうかの確認は、BSA−FR−900
506物質結合体を固相コーティングした各ウエルに、100
μg/ml濃度に調製したFR−900506物質の１％BSA−PBS溶
液（50μ）を添加した上で、培養液（100μ）を添
加して反応後、POD標識抗マウスIgGにより同様の反応、
発色操作を行ない、過剰のFR−900506物質を加えること
によってその発色が抑えられることにより確認する。

２）モノクローナル抗体の単離・精製 2,6,10,14−テトラメチルペンタデカンを投与して免
疫抑制状態にしたBALB/cマウス（雌）の腹腔内に、実施
例２の１）で得た３種類のハイブリドーマを、各々１マ
ウス当り１×10⁷個移植し、10〜14日後に腹水を採取す
る。50％の飽和硫安により分画した後、10mMりん酸緩衝
液（pH8.0）にて透析する。10mMりん酸緩衝液（pH8.0）
で平衡化したDEAEセルロースカラムクロマトグラフィに
付し、10mMりん酸緩衝液（pH8.0）中,0〜150mMの塩化ナ
トリウム連続濃度勾配法で溶出させ、各ハイブリドーマ
の産生するIgGの分画を得た。各IgGのサブクラスはオク
タロニーの二重免疫拡散法により決定した（表１）。

実施例3.FR−900506物質の酵素免疫測定法（直接法） １）抗体の固相への吸着操作 モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体の溶
液（20μg/ml、PBS溶液）200μずつをエリザ用プレー
トＳ（MS−3496F、住友ベークライト社製）の各ウエル
に分注し、４℃で１晩静置する。抗体溶液を回収後、プ
レートをPBS溶液で３回洗浄する。

２）非特異的吸着防止操作 上記の各プレートに、１％BSA−PBS溶液を満たし、37
℃で30分放置後、PBS溶液を吸引除去する。

３）抗原抗体反応 （１）10％正常血漿を含む１％BSA−PBS溶液で希釈し
た標準FR−900506物質溶液100μずつを上記各ウエル
に分注する。

（２）実施例１の３）で調製したPOD−FR−900506物
質標識体溶液を１％BSA−PBS溶液で２×10⁵倍希釈した
液100μずつを上記の各ウエルに分注する。

（３）上記各ウエルをプレートミキサーで10秒間撹拌
し、４℃で一晩放置する。

４）酵素反応 0.05％ツイーン（Tween）20を含むPBS溶液で上記各ウ
エルを２回、さらにPBS溶液で２回洗浄後、下記のよう
に調製した酵素基質溶液（200μ）を上記各ウエルに
分注し、30分間室温で反応させる。酵素基質溶液は使用
直前に調製する。

酵素基質溶液： Ｏ−フェニレンジアミン（100mg）と30％過酸化水素
水（50μ）をpH5.4のマクバイン（Mcllvaine）緩衝液
（0.1Mりん酸水素二ナトリウム溶液に0.1Mくえん酸を加
えpH5.4に調製したもの）（100ml）に溶解したもの。

５）反応停止操作 4N硫酸溶液（50μ）を上記各ウエルに分注し、反応
を停止させる。

６）測定 基質溶液を対照とし、マルチスキャン（商品名、タイ
ターテック社製）により波長492nmで、反応液の吸光度
を測定する。

以上の測定方法に従い、実施例１で得た抗FR−900506
物質ポリクローナル抗体及び実施例２で得た抗FR−9005
06物質モノクローナル抗体（３種類）を用い、それぞれ
正常血漿として正常ビーグル犬（雄）の血漿を用いた場
合の結果を表２に示す。

実施例4.FR−900506物質の酵素免疫測定法（間接法） １）抗体の固相への吸着操作 第二抗体溶液（３μg/ml、PBS溶液200μずつをエリ
ザ用プレートＨ（MS−3596F、住友ベークライト社製）
の各ウエルに分注し、４℃で１晩静置する。抗体溶液を
回収後、該プレートをPBS溶液で３回洗浄する。

２）非特異的吸着防止操作 上記各プレートに１％BSA−PBS溶液を300μ満た
し、37℃で30分放置後、PBS溶液を吸引除去する。

３）抗原抗体反応 （１）１％BSA−PBS溶液で希釈（第一抗体がポリクロ
ーナル抗体の場合は５×10⁴倍希釈、第一抗体がモノク
ローナル抗体の場合は、２×10⁵倍希釈）したPOD−FR−
900506物質標識体溶液100μずつを上記各ウエルに分
注する。

（２）10％正常血漿を含む１％BSA−PBS溶液で希釈し
た標準FR−900506物質溶液100μずつを上記各ウエル
に分注する （３）１％BSA−PBS溶液で調製した第一抗体溶液（第
一抗体がポリクローナル抗体の場合は、400ng/ml、第一
抗体がモノクローナル抗体の場合は、10ng/ml）50μ
ずつを上記各ウエルに添加する。

（４）上記各ウエルをプレートミキサーで10秒間撹拌
し、４℃で一晩放置する。

４）酵素反応 実施例３の４）と同様。

５）反応停止 実施例３の５）と同様。

６）測定 実施例３の６）と同様。

以上の測定方法に従い、実施例１で得た抗FR−900506
物質ポリクローナル抗体及び実施例２で得たモノクロー
ナル抗体FR−900506−１−60−46をそれぞれ第一抗体と
して用い、正常血漿として正常ビーグル犬（雄）の血漿
を用いた場合の結果を表3,4にそれぞれ示す。

尚、第二抗体は第一抗体が抗FR−900506物質ポリクロ
ーナル抗体の場合は、ヤギ抗ラビットIgG（マイルス社
の抗血清（コード64−331−１）の硫安塩析後、DEAEセ
ルロースにて精製したもの）を、また第一抗体がモノク
ローナル抗体FR−900506−１−60−46の場合はラビット
抗マウスIgG（イーワイ−ラボラトリー社製・カタログN
o.AF−011）をそれぞれ使用している。

実施例5.間接法による血漿中濃度測定試験 下記組成のFR−900506物質を含む固体分散製剤をビー
グル犬（雄）３匹に経口にて単回投与（1mg/kg）し、実
施例４に記載の測定法（第一抗体としてモノクローナル
抗体FR−900506−１−60−46を使用した糸）に従って、
10％正常血漿を含む１％BSA−PBS溶液で希釈した標準FR
−900506物質溶液のかわりに、１％BSA−PBS溶液で10倍
希釈した検体（血漿）を用い、血漿中濃度をモニタリン
グした。結果（３匹の平均値）を表５に示す。尚、表中
の時間は、FR−900506物質を含む固体分散製剤を投与後
の経過時間を示す。

固体分散製剤の組成（1.0gあたり） FR 0.2g ヒドロキシプロピルメチルセルロース 2910（TC−5R） 0.2g クロスカルメロースナトリウム （AC−Di−Sol） 0.2g 乳糖 0.4g 実施例6.間接法実施のための試験キット（Ｉ） ＜構成成分（1000検体用）＞ （１）第一抗体（抗FR−900506物質モノクローナル抗
体）溶液（500μ）¹⁾: １％BSA−PBSにて１μg/mlに調製したもの （２）POD−FR−900506物質溶液（500μ）²⁾: 実施例１の３）で得られた溶液を１％BSA−PBSにて10
00倍希釈したもの （３）FR−900506物質標準溶液（1ml）³⁾: メタノールにて1mg/mlに調製したもの （４）第二抗体（ラビット抗マウスIgG）溶液（600μ
）⁴⁾: PBSにて1mg/mlに調製したもの １）……１％BSA−PBSで100倍希釈して使用する。

２）……１％BSA−PBSで200倍希釈して使用する。

３）……１％BSA−PBSで必要濃度まで希釈して使用す
る。

４）……PBSで333倍希釈して使用する。

該試験キット（Ｉ）は、間接法を実施するに際し、実
施例４の操作手順に従って用いられる。

実施例7.間接法実施のための試験キット（II） ＜構成成分（1000検体用）＞ （１）第一抗体（抗FR−900506物質モノクローナル抗
体）溶液（1ml）¹⁾: １％BAS−PBSで１μg/mlに調製したもの。

（２）POD−FR−900506物質溶液（700μ）²⁾: 実施例１の３）で得られた溶液を１％BAS−PBSにて10
00倍希釈したもの。

（３）FR−900506物質標準溶液（各々1ml）： メタノールにて、各々、100、50、20、10、５、２、
１、0.5、0.2あるいは0ng/mlに調製したもの （４）第二抗体（ラビット抗マウスIgG）溶液（1m
l）³⁾: PBSにて1mg/mlに調製したもの １）……１％BSAおよび0.05％ツイーン20を含むPBS（以
降、１％BSA−0.05％ツイーン20−PBSと略記）で50倍希
釈して使用する。

２）……１％BSA−0.05％ツイーン20−PBSで300倍希釈
して使用する。

３）……PBSで200倍希釈して使用する 該試験キット（II）は間接法を実施するに際し、次に
記載するようなカラムルートもしくは抽出ルートに従っ
て用いられる。

［カラムルート］ 1.測定サンプル（血漿もしくは血清）（100μ）に0.1
N塩酸（1ml）およびメタノール（10μ）を加え、２〜
３分間撹拌する。

１′.FR−900506物質の標準溶液の調製 正常血漿もしくは正常血清（100μ）に、0.1N塩酸
（1ml）およびFR−900506物質標準溶液（10μ）を加
え、２〜３分間撹拌する。

2.カラム処理 ｉ）セップ−パックカラム（商品名:C₁₈カートリッジ
カラム、フオーターズ アソシエイツ製（米国））をメ
タノール（5ml）で活性化し、次いで４％酢酸溶液（20m
l）で洗浄する。

ii）該セップ−パックカラムに前記１もしくは１′の
測定サンプルもしくは標準溶液をかける。

iii）該セップ−パックカラムを４％酢酸溶液（20m
l）で洗浄する。

iv）FR−900506物質をメタノール（3ml）で溶出さ
せ、遠心沈殿管で集める。

3.窒素ガス気流にて乾固する。

4.POD−FR−900506物質の１％BSA−0.05％ツィーン20−
PBS溶液（200μ）にて、その残渣を溶解する。

5.第二抗体溶液（200μ）を96−ウェル平底マイクロ
タイタープレートの各ウェルに加え、４℃で一晩撹拌反
応させる。

6.第二抗体溶液を各ウェルから吸引除去する。

7.PBSで３回洗浄する。

8.3回目の洗浄の後、ただちに、プレートの各ウェル
に、１％BSA−0.05％ツィーン20−PBS（非特異的吸着防
止溶液）（300μ）ずつを加える。

9.室温下、１時間放置する。

10.非特異的吸着防止溶液をウェルから吸引除去し、た
だちに４で得られた測定サンプルもしくは標準溶液（18
0μ）をそのウェルに加える。

この操作は、各ウェルごとに行なう。

11.第一抗体（50μ）を各ウェルに加える。

12.プレートを４℃で一晩撹拌反応させる。

13.溶液を吸引除去後、プレートを0.05％ツィーン20−P
BSで２回洗浄し、そしてさらにPBSで２回洗浄する。

14.ただちに、実施例３の４）に記載の基質溶液（200μ
）を各ウェルに加え室温にて15分間撹拌反応させる。

15.4N硫酸溶液を各ウェルに加えて、酵素基質反応を停
止する。

16.基質溶液をブランクとし、波長492nmにおける各ウェ
ルの吸光度を測定する。

［抽出ルート］ 1.測定サンプル（血漿もしくは血清）（100μ）に、
メタノール（10μ）、0.2Mリン酸緩衝液（pH7.0）（1
ml）およびジクロロメタン（6.0ml）を加える。

１′．正常血漿もしくは正常血清（100μ）に、FR−9
00506物質標準溶液（10μ）、0.2Mリン酸緩衝液（pH
7.0）（1.0ml）およびジクロロメタン（6.0ml）を加え
る。

2.各々の混合物を10分間撹拌した後、3000rpmで10分間
遠心分離する。

3.下層のジクロロメタン（5.0ml）を取得し、窒素ガス
気流にて乾固する。

上記3.で得られる乾燥残渣は、前記記載のカラムルー
トの４〜16と同様の方法に従って処理され、間接法が実
施される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (56)参考文献 特開 昭61−148181（ＪＰ，Ａ) Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ 73［６］（1980）ｐ．804−808 Ｊ．Ｉｍｍｕｈｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ 60［１／２］（1983）ｐ．257−268 「役にたつ免疫実験法」西岡久壽彌５ 編講談社、1984 ｐ．７−15 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (15)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】FR−900506物質中に存在する抗原決定基を
   認識する抗体。
2. 【請求項２】ポリクローナル抗体である第（１）項記載
   の抗体。
3. 【請求項３】ポリクローナル抗体のクラスがIgGである
   第（２）項記載の抗体。
4. 【請求項４】モノクローナル抗体である第（１）項記載
   の抗体。
5. 【請求項５】動物の抗FR−900506物質抗体産生細胞と骨
   髄腫細胞との細胞融合により形成されたハイブリドーマ
   から産生される抗FR−900506物質モノクローナル抗体で
   ある第（４）項記載の抗体。
6. 【請求項６】抗FR−900506物質抗体産生細胞が、マウス
   の脾臓細胞であり、産生されるモノクローナル抗体のク
   ラスがIgGである第（５）項記載の抗体。
7. 【請求項７】FR−900506物質中に存在する抗原決定基を
   認識する第（１）項記載の抗体を固定化し、該固定化抗
   体にFR−900506物質を含む検体および酵素で標識された
   FR−900506物質とを競合的に反応させ、固定化抗体に結
   合した酵素で標識されたFR−900506物質を検出すること
   を特徴とするFR−900506物質の高感度酵素免疫測定法。
8. 【請求項８】抗体がポリクローナル抗体である第（７）
   項記載の高感度酵素免疫測定法。
9. 【請求項９】抗体がモノクローナル抗体である第（７）
   項記載の高感度酵素免疫測定法。
10. 【請求項１０】FR−900506物質中に存在する抗原決定基
    を認識する第（１）項記載の第一抗体および該第一抗体
    を認識する固定化された第二抗体とからなり、検体に含
    まれるFR−900506物質と酵素で標識されたFR−900506物
    質とを該第一抗体に競合的に反応させ、得られる第二抗
    体に結合した第一抗体に結合している酵素で標識された
    FR−900506物質を検出することを特徴とするFR−900506
    物質の高感度酵素免疫測定法。
11. 【請求項１１】第一抗体がモノクローナル抗体である第
    （10）項記載の高感度酵素免疫測定法。
12. 【請求項１２】FR−900506物質を標識している酵素がペ
    ルオキシダーゼであり、第二抗体が、プレートに固定化
    されている第（10）項または第（11）項記載の高感度酵
    素免疫測定法。
13. 【請求項１３】FR−900506物質中のシクロヘキサン環
    に、担体を結合した結合体を用いて得られた第（１）項
    記載の抗体。
14. 【請求項１４】担体を結合させる位置がシクロヘキサン
    環の水酸基である結合体を用いた第（13）項記載の抗
    体。
15. 【請求項１５】シクロヘキサン環の水酸基と担体とをジ
    カルボン酸で結合させた結合体を用いた第（14）項記載
    の抗体。