JPH0471519B2 - - Google Patents

Info

Publication number
JPH0471519B2
JPH0471519B2 JP61047478A JP4747886A JPH0471519B2 JP H0471519 B2 JPH0471519 B2 JP H0471519B2 JP 61047478 A JP61047478 A JP 61047478A JP 4747886 A JP4747886 A JP 4747886A JP H0471519 B2 JPH0471519 B2 JP H0471519B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
fsh
cross
monoclonal antibody
less
tsh
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP61047478A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS61218600A (ja
Inventor
Hyuupunaa Paraitsu Kurisuta
Shetaasu Harutomuuto
Rentsu Herumuuto
Eruraa Kurausu
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Boehringer Mannheim GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=6264313&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JPH0471519(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Boehringer Mannheim GmbH filed Critical Boehringer Mannheim GmbH
Publication of JPS61218600A publication Critical patent/JPS61218600A/ja
Publication of JPH0471519B2 publication Critical patent/JPH0471519B2/ja
Granted legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/948—Microorganisms using viruses or cell lines
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
    • Y10S436/808—Automated or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野 本発明は卵胞刺激ホルモンの測定法、測定試
薬、これに好適なモノクロナール抗体、その取得
法に関する。 従来の技術 体液、例えば尿、血清及び同様に血漿中の卵胞
刺激ホルモン（FSH）の測定は、主として、視
床下部、下垂体及び性腺の内分泌状態を評価する
ために使用される。この試験は、特に性腺機能低
下、不育症等の鑑別診断に役立つ。更に、この
FSH−測定は、妊婦の誘導の際の排卵時点の測
定のために使用される。 これらのすべての場合に、血清値は生理学的範
囲内に存在する。更に、血清中のFSHの濃度も、
このホルモンの生物学的作用に関する情報を得る
ための目的だけにも測定される。従つて、実質的
に、自然のホルモンの血清濃度の認識は、診断上
重要である。 血清中のヒトFSHの生理学的濃度は次の範囲
内にある： 男性 15mlU／ml 閉経期前の婦人（周期） 10mlU／ml 排卵ピーク時の婦人 20〜30mlU／ml 閉経期後の婦人 30〜80mlU／ml FSHの測定のためには、特に抗原としてのこ
のホルモンがこれを認識する抗体１種以上を用い
て測定される免疫学的試験法が好適である。この
ポリペプチド−ホルモンを用いる抗体取得は、す
べてのポリペプチド−ホルモンは免疫性が悪いの
で、困難と結びついている。FSHと他の糖蛋白
質ホルモン例えば黄体形成ホルモン（LH）、甲
状腺刺激ホルモン（TSH）又はヒト絨毛性ゴナ
ドトロピン（hCG）との間のホルモン学に基づ
き、これらホルモンの１種に対する特異抗体を得
ることは非常に困難である。これら糖蛋白質−ホ
ルモンを認識する抗体は、通例、多かれ少なかれ
他の糖蛋白質−ホルモンとの交叉反応を有する。 特異的にFSHを認識し、他の糖蛋白質−ホル
モンとの交叉反応をしないモノクロナール抗体
は、従来は知られていない。従つて、現在までの
ところでは、他の糖蛋白質ホルモンを多かれ少な
かれ共に検出することなしにFSHを免疫学的に
測定することは可能ではない。 発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は、それを用いて、他の糖蛋白質
−ホルモンの存在でもFSHを特異的に測定する
ことのできる新規の免疫学的方法及び試薬を得る
ことであつた。 問題点を解決するための手段 この課題は、本発明による免疫学的方法及び試
薬で解決される。 従つて、本発明の目的は、特異的にFSHを認
識し、他の糖蛋白質−ホルモン即ちLH，TSH又
はhCGとは３％より少なく交叉反応するモノクロ
ナール抗体少なくとも１種を用いる卵胞刺激ホル
モンの免疫学的測定法並びにこれに好適な試薬で
ある。 免疫学的測定法としては、原則的には、すべて
の慣用のイムノアツセイ例えばラジオイムノアツ
セイ、酵素−イムノアツセイ、螢光−イムノアツ
セイ等が好適である。更に、全体的な変法例えば
競争的イムノアツセイ、サンドイツチ−法等も使
用可能である。標識付けのためには、それぞれの
測定法に慣用の手段が好適である。従つて、ラジ
オ−イムノアツセイの場合には、ラジオアイソト
ープ例えば125Jが標識付けのために使用される。
酵素−イムノアツセイのためには、このために通
例使用されるすべての酵素、例えばペルオキシダ
ーゼ又はβ−ガラクトシダーゼが好適である。螢
光−イムノアツセイのためには、慣用の発光団が
マーカーとして使用可能である。これら種々の試
験法及び変法の詳細は当業者にとつて公知であ
る。FSHの種々の抗原決定因を認識し、そのう
ちの少なくとも１種が他の糖蛋白質−ホルモンと
は３％より少なく交叉反応する、少なくとも２種
の本発明によるモノクロナール抗体を使用する試
験変法が有利である。 FSHの測定のためには、測定すべき抗原を担
体結合され、標識付けされた抗体と接触させるサ
ンドイツチ−法が特に好適であると立証された。
このような測定法のために、例えば本発明による
特異的なモノクロナール抗体を固定相に結合させ
ることができる。これを、第１のインキユベーシ
ヨン工程で、測定すべきFSH及び一般に他の糖
蛋白質ホルモンを含有する試料と共にインキユベ
ートする。この際、特異的抗体により選択的に
FSHが結合される。慣用の洗浄工程の後に、こ
の標識された抗体と共にインキユベートする。こ
れは、必ずしも特異的にFSHを認識する必要は
なく、他の糖蛋白質ホルモンと交叉反応してもよ
い。 この方法は、非特異的に担体結合する抗体を用
いても実施できる。しかしながら、標識された抗
体として、本発明による特異的にFSHを認識す
る抗体を使用することが必要である。 このサンドイツチ法の変法は、同様に、FSH
の測定のために好適である。例えば、差当り、標
識されていない可溶性抗体で、かつ標識された抗
体で、可溶性サンドイツチ−複合体を形成するこ
とができる。これを、引続き、標識されていない
可溶性抗体のEcγ−部を認識する担体結合抗体を
用いて不溶性にする。この変法では、少なくとも
標識されていない可溶性抗体が本発明の抗体であ
るべきである。この際、標識された抗体を過剰に
使用するのが有利である。 本発明の重要性は、この免疫学的方法のため
に、特異的にFSHを認識し、従つてFSHの特異
的測定を可能とするモノクロナール抗体を提供す
ることが意想外に達成されたことにある。 従つて、本発明のもう１つの目的は、他の糖蛋
白質−ホルモンとの交叉反応性が３％より小さい
FSHを認識するモノクロナール抗体である。 本発明によるモノクロナール抗体を得るため
に、実験動物例えばマウスをFSHで免疫化する。
免疫化のために、この免疫原を例えばアジユバン
スと組合せて常法で付与する。アジユバンスとし
ては、水酸化アルミニウムを百日咳菌
（Bordetella pertussis）又はフロインドの
（Freundschem）アジユバンスと共に使用するの
が有利である。免疫化は、有利に、数ケ月にわた
り、４〜６週間隔での少なくとも４回の免疫化に
より行なう。（腹膜内注射）。 このように免疫化した動物から、Ｂ−リンパ球
を得、これを永久骨髄腫細胞系と融合させる。こ
の融合は、ケーラー（Ko¨hler）及びミルスタイ
ン（Milstein）の公知方法〔ネイチユア
（Nature）、256，1975，495〜497頁〕で行なう。
この際生じたハイブリツド細胞の１次培養物を常
法で、例えば、市販の細胞ソルター
（Zellsorter）の使用下に、又は限定稀釈により
クローン化する。それぞれ、適当な試験法で例え
ば酵素−イムノアツセイ（ELISA−法）で、LH
に対して陽性にかつ他の糖蛋白質−ホルモンとは
陰性にもしくは僅かにのみ反応する培養物を更に
加工する。こうして、本発明によるモノクロナー
ル抗体を産生する多数のハイブリツドーマー細胞
系が得られる。公知方法で、この細胞系を培養
し、これにより産生されたモノクロナール抗体を
単離することができる。 この方法で得られる細胞系の例は次のとおりで
ある： クローン293（NCACC 84122002） クローン163（NCACC 84122006）及び クローン381（NCACC 85022205）。 これらの細胞系は、それぞれの番号で寄託機関
NCACC（Natinal Collection of Animal Cell
Cultures）に寄託されている。 このように得られたモノクロナール抗体は、
FSHに対して非常に高い親和性（109〜1011／
モルの親和性定数）を有し、他の糖蛋白質ホルモ
ンとは３％より少なく交叉反応することで優れて
いる。特に有利なモノクロナール抗体は、他の糖
蛋白質−ホルモン例えばhCG，LH及びTSHに対
する１％より少ない特に有利に0.1％より少ない
交叉反応性を有する。この親和性及び他のホルモ
ンとの交叉反応性の測定のために、当業者に公知
の慣用法が提供される。 本発明によるモノクロナール抗体は、試料例え
ば血清又は血漿中でこのホルモンFSHを他の糖
蛋白質−ホルモンの存在で特異的に測定するため
に極めて好適である。この測定法のために、モノ
クロナール抗体そのもの又はそれからの相応する
免疫学的特性を有するフラグメント例えばFab−
フラグメントを使用することができる。従つて、
「モノクロナール抗体」の概念で、完全抗体もフ
ラグメントも理解される。 実施例 次の実施例につき、本発明を詳説する： 例 １ FSHに対するモノクロナール抗体の取得 生後８〜12週のBalb／ｃ−マウスを、水酸化
アルミニウム及び百日咳菌に吸着されたhFSH
〔イムネツクス社（Firma lmmunex）〕100μｇで
腹膜内で免疫化させる。６週後に４週間間隔で更
に３回免疫化させる。この際、各々、水酸化アル
ミニウム及び百日咳菌に吸着されたFSH50μｇを
腹膜内に施与する。 最後の免疫化の後約４ケ月に融合させる。この
融合の３日及び４日前に、それぞれ１回、
FSH100μｇ／PBS（燐酸塩緩衝溶液）により腹膜
内もしくは静脈内で免疫化する。 融合のために、エンツイモロジイ（Enzy−
mology）73（1981）３頁中のガルフレ法
（Galfr′e，Methods）により、免疫化されたマウ
スの脾臓細胞108を骨髄腫（P3×63Ag8−653，
ATCC−CRL8375）２×107と混合し、引続き10
分間遠心分離する（300ｇ，４℃）。細胞をもう一
度BSS（＝平衡塩類溶液：balanced salt
solution）で洗浄し、400ｇで遠心する。上澄み
を除去する。細胞沈殿物に50％PEG−溶液（分
子量4000，Merck）１mlを加える。その後、室
温で、牛胎児血清（FKS）不含のPRMI1640−媒
体（RPMI＝Rosewell Parker Memory
Institute）５mlを引続きもう１度10％FKS含有
RPMI1640−媒体５mlを徐々に滴加し、媒体で50
mlまで充たし、400ｇで10分間遠心分離する。沈
殿した細胞を10％FKS含有RPMI1640−媒体中に
入れる。脾臓細胞各 ２×105を24−穴（well）−
細胞培養プレート（ヌンク社：Firma Nunc）上
に播種する。各培養液に、脾臓細胞１×105又は
腹膜滲出液細胞５×104を栄養細胞として添加す
る。次の日に、ヒポキサンチン−アザセリン−選
択媒体（ヒポキサンチン100mM、アザセリン1μ
ｇ／ml）を添加する。 約７〜10日後に、既に多くのクローンが認めら
れる。１次培養液の上澄みを例２に記載の
ELISA法で試験する。抗原特異性抗体を含有す
る１次培養液を螢光活性化細胞ソルターを用いて
96−穴−細胞培養プレート（ヌンク社）上で更に
クローン化する。栄養細胞として、腹膜−滲出液
−細胞１×104又は脾臓細胞２×104を培養液96−
穴−細胞培養プレート当りに使用する。 こうして、双方のハイブリドーマー細胞系クロ
ーン293、クローン163及びクローン381を単離す
ることができ、これらは寄託機関NCACC
（National Collection of Animal Cell
Cultures）に次の寄託番号で寄託されている： NCACC 84122001（＝クローン269） NCACC 8422006 （＝クローン163）及び NCACC 8502205 （＝クローン381）。 腹水を得るために、ハイブリツド細胞５×106
を予めプリスタン（Pristan）0.5mlで１〜２回前
処理されたマウスの腹膜内に注射する。その１〜
３週間後に、このマウスから腹水液を得ることが
できる。これから常法で抗体を単離することがで
きる。このモノクロナール抗体は特異的にFSH
を認識し、他の糖蛋白質−ホルモンとは交叉反応
しないかもしくは僅かに反応するだけである。こ
れらを以後、MAK293（クローン293）、MAK163
（クローン163）のもしくはMAK381（クローン
381の）と称する。 これらのモノクロナール抗体は、サブ群
lgG1／Ｋに属する。これらの親和性は108／
molである。親和性の測定のために、同族抗原と
の競争曲線をスカツチヤード法（Scatchard：
Ann.N.Y.Acad.Sci.51，1949，660頁参照）で測
定し、評価する。このために必要な測定は例２と
同様に実施する。 例 ２ FSHに対する抗体のスクリーニング試験 免疫化されたマウスの血清又はハイブリツド細
胞の培養液上澄み又は腹水中のFSHに対する抗
体の存在及び特異性を知るために、試験原理とし
てELISA−法を用い、マイクロ滴定プレートに
FSH1μｇ／被覆緩衝液ml（0.2M炭酸ナトリウ
ム／重炭酸ナトリウム、PH9.3〜9.5）を37℃で１
夜重層する。0.9％塩化ナトリウム溶液及び１％
アルブミン溶液で10分間後処理する。引続き、
0.9％塩化ナトリウム溶液で洗浄する。引続き37
℃で１時間、試料100μと共にインキユベート
し、改めて0.9％塩化ナトリウム溶液で洗浄する。
更に、シヤフ（Schaf）−抗−マウス−lgG−ペル
オキシダーゼ−コンジユゲート100〜150mU／ml
と共にインキユベートする（37℃，１時間）。0.9
％塩化ナトリウムでの新たな洗浄工程の後に、ペ
ルオキシダーゼ活性を常法で測定する（例えば
ABTSを用い、室温で30分、405nmでの吸光度差
ΔmEを読む）。 このELISA−試験は次のようにしても実施で
きる： マイクロ滴定プレートにまずシヤフ−抗−マウ
ス−lgGを重層する（20〜30μｇ／被覆緩衝液ml，
37℃で１時間〜１夜）。その後、前記のように更
に処理し、試料溶液を添加し、改めて洗浄する。
引続き、FSH−ペルオキシダーゼ−コンジユゲ
ート250mU／mlと共にインキユベートする（１
時間、37℃）。これを改めて洗浄し、ペルオキシ
ダーゼ−活性を例えばABTSにより測定する。 例 ３ 他の糖蛋白質との交叉反応の測定 例２の記載と同様に操作する。差当り、FSH
の反応性を測定する。次いで、それぞれのモノク
ロナール抗体に、それぞれ、交叉反応を試験する
抗原（hCG，TSH，FSH）を上昇性濃度で添加
する。引続き、この交叉反応を次式で計算する： Ｃ（LH）／Ｃ（交叉反応抗原）×100＝交叉反応率（
％） Ｃ＝最大信号の50％に達するために必要である
抗原の濃度 次に第１表にMAK293，MAK163及び
MAK381に関する測定値をまとめる。
【表】 例 ４ エピトープ特異性（Epitopspezifita¨t）の測定 マイクロ滴定プレートを、0.2M炭酸塩緩衝液
（PH9.6）中のマウス−抗体のFcγ−領域に対する
シヤフ（Schaf）−抗体10μｇ／mlを、37℃で２時
間又は４℃で１夜重層する。その後、PBS／ツ
イーン（Tween）20（0.1％）（PH7.35）で洗浄す
る。引続き、インキユベーシヨン緩衝液（PBS、
牛血清アルブミン（RSA）0.1％、ツイーン20
0.1％）中のモノクロナール抗体（MAK1、濃度
10μｇ／ml）100μを加え、37℃で２時間インキ
ユベートする。 FSH−ペルオキシダーゼ−コンジユゲート
（100mU／ml）を溶液中の第２のモノクロナール
抗体（MAK2）10μｇ／mlと共に４℃で１夜予備
インキユベートする。 MAK1を有するプレートのこのインキユベー
シヨンの後に、過剰のMAK1をPBS−ツイーン
20で除去する。このプレートに、更にPBS−
RSA中の１％マウス−正常血清を30分間室温で
後重層する。予備インキユベートされた
MAK2／FSH−ペルオキシダーゼ−複合体100μ
をプレート上に加え、37℃で２時間インキユベ
ートする。結合したペルオキシダーゼ−活性を基
質としてのABTSで可視にする。測定した色強
度は、MAK1に結合したMAK2／FSH−ペルオ
キシダーゼ−コンジユゲートに正比例する。 種々のモノクロナール抗体で得られた測定結果
を次にまとめる。結合した活性を非競争的に結合
したFSH−ペルオキシダーゼ−活性を百分率で
示す。
【表】 得られた結果は、モノクロナール抗体
MAK381が、双方の抗体MAK293及びMAK163
とは異なる抗原FSHのエピトープに対すするモ
ノクロナール抗体であることを示している。 例 ５ FSHの測定 Ａ 試薬溶液の製造 １ 基質緩衝液： 燐酸ナトリウム緩衝液（PH7.4） 15mM 塩化ナトリウム 15mM EDTA 5mM 牛血清アルブミン（PH7.4） 0.2％ ｏ−ニトロフエニルガラクトシド 5mM ２ 処方１−溶液 処方１として、本発明によるモノクロナールマ
ウス−抗−FSH−抗体を使用する。この抗体を
含有する腹水液に硫酸アンモニウムを1.8Mまで
加える。沈殿を15mM燐酸ナトリウム（PH7.0）
及び50mM塩化ナトリウムの緩衝液中に入れる。
こうして得た溶液をDEAE−セルロース上から通
過させる。 ３ 処方３−溶液 処方３として、同様であるが、処方１とは異な
る抗原決定因を確認する本発明のモノクロナール
マウス−抗−FSH−抗体を使用する。この抗体
を含有する腹水液を２）の記載と同様に精製す
る。完全抗体を公知方法で切断してFab−フラグ
メントを得る。得られたFab−フラグメントとβ
−ガラクトシダーゼとを、R.R.ポルター
（Porter）によるビオケミカル・ジヤーナル
（Biochem.J.）73，（1959）119頁の方法で結合さ
せる。 ４ 活性化された処方２−溶液 シヤフ−抗−マウス−Ecr−抗血清に硫酸アン
モニウムを1.8Mまで加える。沈殿を15mM硫酸
ナトリウム（PH7.0）及び50mM塩化ナトリウム
からの緩衝液中に入れる。こうして得た溶液を
DEAE−セルロース上に通過させる。 Ｂ 試薬担持材の製造 １ 試薬担持材１ １ml当り 燐酸ナトリウム（PH7.3，37℃） 100μモル 塩化マグネシウム 2μモル 塩化ナトリウム 0.9％ 牛血清アルブミン 0.5％ マウスからの抗−FSH−モノクロナール抗
体（処方１−溶液） 5μｇ／ml 抗−FSH−抗体−（マウス）−Fab−フラグメ
ント−β−ガラクトシダーゼ−コンジユゲー
ト（処方３−溶液） 100mU を含有する溶液40μを、市販のポリエステル紙
よりなるフリース上に滴加する。引続き、室温で
乾燥させる。このフリースをその使用まで４℃及
び相対湿度20％に保持する。 ２ 試薬担持材２ セルロースフリース上に公知のブロムシアン活
性化法（西ドイツ特許出願公開第1768512号明細
書）で、マウス−抗体のEcγ−部に対するシヤフ
−抗体（活性化された処方２−溶液）を固定さ
せ、この際、繊維材料１ｇ当り抗体10μｇを固定
のために提供する。洗浄により、結合しなかつた
抗体を除き、フリースを室温で温和に乾燥させ
る。こうして得たフリースの貯蔵は試薬担持材１
と同様に行なう。 この双方の試薬担持材１及び２を用いる測定
は、西ドイツ特許出願第3425008・５号明細書に
記載の分析測定実施用装置を用いて行なう。これ
は、それぞれ特定の１試薬で含浸された吸収性担
持物質を有する多数の試薬領域と連結していて、
挿入素子をローター上に固定する際に、一緒にな
つて内部半径から外部半径方向に通じる試料液体
搬送路を形成する少なくとも１個の混合弁室と混
合室を有する試料装入室及び更に少なくとももう
１つの液体収容室及びこの室から測定室に通じ、
試料液体搬送路と少なくとも部分的に同じ搬送路
を有する成形体よりなる自動遠心分離分析装置用
ローター挿入素子を明らかにしている。ここで、
試料液体搬送路は、試料装入室（Ｐ）から吸着性
材料の充填された緩衝液含有室(a)、室(c)及び室(a)
と(c)の間に配置された第１弁室（VK1）を経て、
第２弁室（VK2）に至り、かつここから室(d)及
び収集室（AK）を経て測定室（Ｋ）に至る。も
う１つの液体を収容するために、ポンプ室として
構成された基質室（pK）を備えており、これは、
配量室（DK）及び毛細管（Kap）よりなる配量
装置及び溢流室（u¨K）を経て第２弁室と連結し
ている。第１図はこの使用ローター挿入素子を図
示している。ここで、試薬担持材１をこの使い捨
て部品の区分ｃに配置し、試薬担持材２を区分ｄ
に配置する。この際、試料40μを、上縁の開口
部から直接、区分ａにピペツト装入する。この試
料は稀釈されていない。基質溶液270μを室pK
中にピペツト装入する。高回転数が静止状態と交
換する適当なプログラムにより、試料及び基質溶
液は分離マトリツクス及びキユベツトの方向に送
られる。 この際、プログラムの経過で処方１及び３は試
料液により区分ｃから溶離され、引続きこの均質
混合物が反応される。生じた複合体が区分ｄで処
方２と結合される。区分ｃからｄへの試料の移動
は非常に抑時間内に行なわれる。 基質溶液は、配量室DKを通つて少部分に分け
られ、その最初のものは、過剰の非複合コンジユ
ゲートの洗浄のために使用される。 複合体形成を介してｄで結合したβ−ガラクト
シダーゼ活性は、試料中に含有されるFSH量に
比例する。この活性は、基質が５分間の反応で着
色生成物に変換されるのに充分な、更なる基質量
で測定される。生じる色はキユベツト中、410nm
で測定される。 既知FSH含量を有する検量血清で、第２図の
検量曲線が得られ、これは、FSH0〜4ng／mlの
範囲（FSH68／40に関する第１ IPR−規準で標
準化）を把握し、血清又は血漿中の充分に敏感な
FSH測定を可能にする。この検量曲線を用いて、
体液例えば血清又は血漿中の未知FSH含量を測
定することができる。 例 ６ サンドイツチ−原理によるFSHの測定 被覆緩衝液（0.2M炭酸ナトリウム／重炭酸ナ
トリウムPH9.4）中に本発明によるFSHに対する
モノクロナール抗体を50μｇ／mlの濃度で含有す
る溶液100μをマイクロ滴定プレートの各々の
凹所に入れ、室温で１時間インキユベートする。
引続き、インキユベーシヨン緩衝液（牛血清アル
ブミン１％，Nac0.9％）を後重層し、室温で
30分間インキユベートする。洗浄緩衝液（Nac
0.9％、ツイーン20 0.1％）で洗浄後に、各凹所
に測定すべきFSHを含有する試料100μを入れ、
室温で30分間インキユベートする。洗浄緩衝液で
の再度洗浄の後に、ペルオキシダーゼ（活性
100mU／ml）とFSHとは異なるエピトープを認
識する本発明によるもう１つのモノクロナール抗
体とからのコンジユゲート100μを重層し、室
温で１時間インキユベートする。 このコンジユゲートの製造のために、オランダ
ガラシ（Meerrettich）−ペルオキシダーゼ（E.
C.1.11.1.7）を使用する。このコンジユゲートは
過沃素酸塩での酸化及び引続く水素化ホウ素を用
いる還元により、P.K.ナカネ（Nakane）による
処方〔M.B.ウイルソン（Wilson）及びP.K.ナカ
ネのW.クナツプ（Knapp）発行、イムノフルオ
レツセンス・アンド・リレイテツド・ステイニン
グ・テクニクス（Immunofluorescense and
Related Staining Technics）、1978、エルスヴ
イア／ノース・ホーランド・ビオメデイカル・プ
レス（Elsevier／North Holland，Biochemical
Press）215〜224頁〕に応じて製造する。 洗浄緩衝液を用いる洗浄の後に、ABTS−標
準溶液100μを重層し、１時間の呈色反応後に、
405nmでの吸光度をELISA−リーダー（ダイナ
テツク：Dynatec）で測定する。 検量曲線を得るために、前記の方法で、試料の
代りに、FSHを種々の限定された濃度で含有す
る溶液を用いる。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明の方法を実施する自動遠心分離
分析装置用ローター挿入素子の略示図であり、第
２図は既知のFSH−含分の血清の検量曲線であ
る。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 卵胞刺激ホルモンFSHを認識し、黄体形性
    ホルモン（LH）、甲状腺刺激ホルモン（TSH）
    又はヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）とは３％
    より少なく交叉反応するモノクロナール抗体少な
    くとも１種を使用することを特徴とする、卵胞刺
    激ホルモンの免疫学的測定法。 ２ FSHを認識し、LH，TSH又はhCGとは１
    ％より少なく交叉反応するモノクロナール抗体少
    なくとも１種を使用する、特許請求の範囲第１項
    記載の方法。 ３ そのうちの少なくとも１種はLH，TSH又は
    hCGと３％より少なく交叉反応する、FSHを認
    識するモノクロナール抗体少なくとも２種を使用
    する、特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方
    法。 ４ FSHを認識し、LH，TSH又はhCGとは３
    ％より少なく交叉反応するモノクロナール抗体少
    なくとも１種を含有することを特徴とする、卵胞
    刺激ホルモン測定用試薬。 ５ FSHを認識し、LH，TSH及びhCGとは１
    ％より少なく交叉反応するモノクロナール抗体少
    なくとも１種を含有する、特許請求の範囲第４項
    記載の試薬。 ６ そのうちの少なくとも１種がLH，TSH及び
    hCGと３％より少なく交叉反応する、FSHを認
    識するモノクロナール抗体少なくとも２種を含有
    する、特許請求の範囲第４項又は第５項記載の試
    薬。 ７ LH，TSH及びhCGとは３％より少なく交叉
    反応することを特徴とする、卵胞刺激ホルモンを
    認識するモノクロナール抗体。 ８ １％より低いLH，TSH，hCGとの交叉反応
    性を有する、特許請求の範囲第７項記載のモノク
    ロナール抗体。 ９ LH，TSH及びhCGとは３％より少なく交叉
    反応する卵胞刺激ホルモンを認識するモノクロナ
    ール抗体を得るために、マウスをFSHで免疫化
    し、この免疫化された動物の脾臓からＢ−リンパ
    球を得、これを骨髄腫細胞と融合させ、生じたハ
    イブリドーマ細胞をクローン化し、特異的に
    FSHを認識する抗体を産生するクローンを選択
    し、これにより形成された抗体を取得することを
    特徴とする、モノクロナール抗体の取得法。
JP61047478A 1985-03-06 1986-03-06 卵胞刺激ホルモンの測定法、測定試薬、これに好適なモノクロナール抗体及びその取得法 Granted JPS61218600A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3507849.9 1985-03-06
DE19853507849 DE3507849A1 (de) 1985-03-06 1985-03-06 Verfahren und reagenz zur bestimmung des follikel stimulierenden hormons sowie hierzu geeignete monoklonale antikoerper

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS61218600A JPS61218600A (ja) 1986-09-29
JPH0471519B2 true JPH0471519B2 (ja) 1992-11-13

Family

ID=6264313

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP61047478A Granted JPS61218600A (ja) 1985-03-06 1986-03-06 卵胞刺激ホルモンの測定法、測定試薬、これに好適なモノクロナール抗体及びその取得法

Country Status (11)

Country Link
US (1) US4762783A (ja)
EP (1) EP0193880B1 (ja)
JP (1) JPS61218600A (ja)
KR (1) KR860007373A (ja)
AT (1) ATE143146T1 (ja)
AU (1) AU556178B1 (ja)
CA (1) CA1273305A (ja)
DE (2) DE3507849A1 (ja)
ES (2) ES8707862A1 (ja)
FI (1) FI91976C (ja)
ZA (1) ZA861551B (ja)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1273506B (it) † 1995-04-06 1997-07-08 Scient Marketing Service S R L Test diagnostico per il rilevamento rapido e sicuro di un marcatore clinico per la diagnosi di menopausa nella donna
EP1143250A3 (en) * 2000-04-03 2004-11-17 Inverness Medical Switzerland GmbH Test methods and devices for analyte isoforms
JP2001349892A (ja) * 2000-04-03 2001-12-21 Unilever Nv 検査方法及びデバイス
EP1143249B1 (en) * 2000-04-03 2014-01-15 Alere Switzerland GmbH Test methods and devices for analyte isoforms
US20070281883A1 (en) * 2006-06-05 2007-12-06 Hanna Rosenfeld Development of follicle stimulating hormone agonists and antagonists in fish

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2111201A (en) * 1981-12-10 1983-06-29 Celltech Ltd Immunoassay of human luteinising hormone

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3114362C2 (de) * 1980-04-11 1983-08-18 Toshiyuki Prof. Nara Hamaoka Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers bzw. Antiserums, Verwendung dieses Verfahrens zur Gewinnung von Säugetierzellen, welche fähig sind, einen solchen Antikörper zu erzeugen und Verwendung des so hergestellten Antikörpers bzw. Antiserums zur Immunoprüfung

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2111201A (en) * 1981-12-10 1983-06-29 Celltech Ltd Immunoassay of human luteinising hormone

Also Published As

Publication number Publication date
ES8802090A1 (es) 1988-04-01
FI860937A (fi) 1986-09-07
JPS61218600A (ja) 1986-09-29
ES8707862A1 (es) 1987-09-16
DE3650570D1 (de) 1996-10-24
ES552705A0 (es) 1988-04-01
EP0193880A3 (de) 1988-11-17
EP0193880B1 (de) 1996-09-18
AU556178B1 (en) 1986-10-23
FI91976C (fi) 1994-09-12
DE3507849A1 (de) 1986-09-11
KR860007373A (ko) 1986-10-10
FI860937A0 (fi) 1986-03-05
FI91976B (fi) 1994-05-31
US4762783A (en) 1988-08-09
CA1273305A (en) 1990-08-28
EP0193880A2 (de) 1986-09-10
ZA861551B (en) 1986-11-26
ATE143146T1 (de) 1996-10-15
ES552703A0 (es) 1987-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4804626A (en) Immunometric assay for the detection of human chorionic gonadotropin
CA1338899C (en) Pregnancy induced hypertension and eclampsia immunoassay and reagents
US4565687A (en) Monoclonal antibodies specific for the unbound β subunit of human chorionic gonadotropin
US5248593A (en) Process and reagent for the determination of the luteinizing hormone and monoclonal antibodies suitable thereof
US5223440A (en) Ex vivo product of conception test to determine abortion
GB2098730A (en) Immunolocalisation
JPH082919B2 (ja) 悪性疾病を検出する方法
JP7013051B2 (ja) 牛妊娠関連グリコタンパク質１に特異的に結合する抗体及びその用途
US5185270A (en) Fetal fibronectin pregnancy test
US5236846A (en) Ectopic pregnancy test
EP0163141A2 (en) Monoclonal anti-human IgG antibody and process for preparing the same
JPH0471519B2 (ja)
Comitti et al. A monoclonal-based, two-site enzyme immunoassay of human insulin
KR100375564B1 (ko) N-펩티드의샌드위치면역학적측정법
JPH0471518B2 (ja)
Engvall et al. Monoclonal antibodies in analysis of oncoplacental protein SP1 in vivo and in vitro
JP3018111B2 (ja) モノクローナル抗体及びアシアログリコプロテインレセプターの測定法
CA2254151A1 (en) Method for immunological assay
Gani et al. Epitope masking and immunodominance—complications in the selection of monoclonal antibodies against HCG
JPH1175839A (ja) モノクローナル抗体、細胞株及びｎ１，ｎ１２−ジアセチルスペルミンの測定法
JPH04108397A (ja) モノクローナル抗体及びそれを用いたｔｓｈ測定法
Epelbaum et al. Competitive ELISA for detection of native ras gene‐related products in sera of cancer patients
KR20230110263A (ko) 심근 트로포닌 i 검출 방법 및 키트
JP3152429B2 (ja) 抗ｈＣＧ―βコアモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ、該モノクローナル抗体およびその用途
JPH0712811A (ja) ビタミンｂ１２を決定するためのイムノアッセイ、ならびにそのための試薬およびキット