FI91976B - Menetelmä ja reagenssi follikkelia stimuloivan hormonin määrittämiseksi sekä tähän tarkoitukseen sopivat monoklonaaliset vasta-aineet - Google Patents

Description

1 91976

Menetelmä ja reagenssi follikkelia stimuloivan hormonin määrittämiseksi sekä tähän tarkoitukseen sopivat monoklonaaliset vasta-aineet

Follikkelia stimuloivan hormonin (FSH) määrittämistä ruumiin nesteistä, esimerkiksi virtsasta, seerumista ja mahdollisesti myös plasmasta, käytetään pääasiallisesti alanäkökukkulan (hypothalamus), aivolisäkkeen (hypophyse) ja sukupuolirauhas-ten (gonadi) endokrinologisen tilan arviointiin. Näitä tutkimuksia käytetään ennen kaikkea sukupuolirauhasten vaajaatoi-tninnan, hedelmättömyyden ja muiden vastaavien tilojen erotus-diagnoosissa. Tämän ohella FSH-määritystä käytetään ovulaation ajankohdan selvittämiseksi raskauden indusoinnin yhteydessä.

Kaikissa näissä tapauksissa seerumiarvot ovat fysiologisella alueella. Tämän lisäksi FSH-pitoisuus seerumissa mitataan myös pelkästään siitä syystä, että tämän hormonin biologisesta vaikutuksesta saataisiin jonkinlainen käsitys. Diagnostisesta merkityksellistä on näin ollen se, että luonnollisen hormonin taso seerumissa tunnetaan.

Ihmisissä FS-hormonin fysiologinen pitoisuus seerumissa on seu-raavilla alueilla: ' miehet <,15 mIU/ml naiset ennen vaihdevuosia, sykliä 10 mIU/ml naiset, ovulaation huippu 20-30 mIU/ml naiset, vaihdevuosien jälkeen 30-80 mIU/ml FSH:n määrittämiseksi voidaan käyttää ennen kaikkea immunologisia koemenetelmiä, joissa antigeeninä toimiva hormoni määritetään yhdellä tai useammalla sitä vastaan vaikuttavalla vasta-aineella. Näiden Dolypeotidisten hormonien avulla tapahtuvaan vasta—aineiden tuottamiseen liittyy vaikeuksia, koska kaikki polypepticiset hormonit ovat huonosti immunogeenisiä. FSH on homologinen muiden glykoDroteiinihormonien kanssa, kuten esi- 2 91 976 merkiksi luteinisoivan hormonin (LH), tyreotropiinia stimuloivan hormonin (TSH) ja ihmisen koriongonadotropiinin (hCG) kanssa, joten jotakin tällaista hormonia vastaan vaikuttavien, spesifisten vasta-aineiden tuottaminen on erittäin vaikeata. Vasta-aineella, jonka vaikutus kohdistuu jotakin tällaista glyko-proteiinihormonia vastaan, on tavallisesti heikompaa tai voimakkaampaa ristireaktiivisuutta myös muiden glykoproteiinihor-monien kanssa.

Monoklonaalinen vasta-aine, jonka vaikutus kohdistuu spesifisesti FS-hormoniin, ja jolla ei ole ristireaktiivisuutta muiden glykoproteiinihormonien kanssa, on toistaiseksi tuntematon.

Näin ollen tällä hetkellä ei ole mahdollista määrittää FS-hormonia immunologisesti siten, etteivät muut glykoproteiini-hormonit vaikuttaisi enemmän tai vähemmän saatuihin tuloksiin.

Tämän keksinnön tehtävänä oli saada aikaan uusi immunologinen menetelmä ja reagenssit, joiden avulla FSH voidaan määrittää spesifisesti myös muiden glykoproteiinihormonien läsnäollessa. Tämä tehtävä ratkaistiin keksinnön mukaisella immunologisella menetelmällä ja reagensseilla. Näin ollen tämä keksintö kohdistuu immunologiseen menetelmään follikkelia stimuloivan hormonin määrittämiseksi, jossa menetelmässä käytetään vähintään yhtä monoklonaalista vasta-ainetta, jonka vaikutus kohdistuu spesifisesti FS-hormoniin, ja josta korkeintaan 3% ristirea-goi muiden glykoproteiinihormonien kanssa, sekä tähän menetelmään soveltuvaan reagenssiin.

Immunologisena määritysmenetelmänä voidaan periaatteessa käyttää kaikkia tavanomaisia immunokokeita, kuten radioimmunokoetta, entsymaattista immunokoetta, fluresenssiin perustuvaa immuno-koetta, jne. Käyttökelpoisia ovat edelleen näiden menetelmien kaikki muunnokset, kuten kilpaileva immunokoe, "sandwich"-menetelmä, jne. Merkitsemiseen voidaan käyttää kullekin määritysmenetelmälle tavallisia keinoja tai aineita. Täten, esimerkiksi radioimmunokokeessa käytetään merkitsemiseen radioisotooppe- 125 ja, esimerkiksi isotooppia I. Entsymaattiseen immunokokeeseen

II

3 91976 soveltuvat kaikki tässä menetelmässä tavallisesti käytetyt entsyymit, kuten peroksidaasi, tai β-galaktosidaasi. Fluoresenssiin perustuvassa immunokokeessa merkkiaineena voidaan käyttää tavallisia fluoresoivia ryhmiä. Näiden eri koemenetelmien ja menetelmämuunnosten yksityiskohdat ovat tuttuja alan asiantuntijalle. Edullisia ovat menetelmien ne muunnokset, joissa käytetään vähintään kahta tämän keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta, joiden vaikutus kohdistuu erilaisiin antigeeni-syyden determinantteihin FS-hormonissa, ja joista vähintään yksi ristireagoi korkeintaan 3-prosenttisesti muiden glykopro-teiinihormonien kanssa.

FS-hormonia määritettäessä tarkoituksenmukaiseksi menetelmäksi on osoittautunut kerrostamismenetelmä ("sandwich"), jossa määritettävä antigeeni saatetaan kosketuksiin kantajaan sidotun, ja merkkiaineella merkityn vasta-aineen kanssa. Tällaista määritysmenetelmää varten kiinteään faasiin voidaan sitoa esimerkiksi tämän keksinnön mukainen, spesifinen monoklonaalinen vasta-aine. Tätä inkuboidaan ensimmäisessä inkubointivaiheessa näytteen kanssa, joka näyte sisältää määritettävän FS-hormonin sekä yleisesti ottaen muut glykoproteiinihormonit. Tällöin tämä spesifinen vasta-aine sitoo selektiivisesti FS-hormonin. Tavanomaisen pesuvaiheen jälkeen seuraa inkubointi merkityn vasta-aineen kanssa. Tämän merkityn vasta-aineen vaikutuksen ei välttämättä täydy kohdistua spesifisesti FS-hormoniin, vaan se voi ristireagoida myös muiden glykoproteiinihormonien kanssa.

Menetelmä voidaan totetuttaa myös epäspesifisellä, kantajaan sidotulla vasta-aineella. Tällöin on kuitenkin välttämätöntä, että merkkiaineella merkittynä vasta-aineena käytetään tämän keksinnön mukaista vasta-ainetta, jonka vaikutus kohdistuu spesifisesti FS-hormonia vastaan.

Kerrostamismenetelmän muunnokset soveltuvat samoin FS-hormonin määrittämiseen. Täten, esimerkiksi ensin voidaan muodostaa liukoinen kerrostettu kompleksi merkkiaineella merkitsemättömästä, liukoisesta vasta-aineesta ja merkitystä vasta-aineesta. Tämä kompleksi tehdään tämän jälkeen liukenemattomaksi sellai- 4 91976 sella kantajaan sidotulla vasta-aineella, jonka vaikutus kohdistuu Fcy-osaan merkitsemättömässä, liukoisessa vasta-aineessa. Tässä menetelmän muunnoksessa vähintään merkitsemättömän, liukoisen vasta-aineen on oltava tämän keksinnön mukainen vasta-aine. Tässä muunnoksessa merkittyä vasta-ainetta käytetään mieluiten ylimäärin.

Olennaisena tässä keksinnössä on pidettävä sitä, että yllättävästi oli mahdollista saada aikaan näihin immunologisiin menetelmiin soveltuvia monoklonaalisia vasta-aineita, joiden vaikutus kohdistuu spesifisesti FS-hormoniin ja jotka näin ollen tekevät FS-hormonin spesifisen määrittämisen mahdolliseksi.

Näin ollen tämä keksintö kohdistuu edelleen FS-hormonia vastaan vaikuttaviin monoklonaalisiin vasta-aineisiin, joiden ristireak-tiivisuus muiden glykoproteiinihormonien kanssa on alle 3 %.

Tämän keksinnön mukaisten monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi koe-eläimiä, esimerkiksi hiiriä, immunoidaan FS-hormonil-la. Eläinten immunoimiseksi tätä immunogeenia annetaan tavalliseen tapaan, esimerkiksi yhdessä jonkin apuaineen kanssa. Apuaineena käytetään mieluiten alumiinihydroksidia yhdessä Bordatella pertus-sis-apuaineen tai Freund'in apuaineen kanssa. Immunointi toteutetaan mieluiten usean kuukauden aikana vähintään neljällä immunoin-nilla 4-6 viikon välein (vatsaontelon sisäinen injektio).

Täten immunoiduista eläimistä otetaan talteen B-lymfosyytit, jotka fuusioidaan myeloomasolujen pysyvän sukupolven kanssa. Tämä fuusioiminen toteutetaan tutkijoiden Köhler ja Milstein esittämällä tunnetulla menetelmällä (Nature 256, 1975, sivut 495-497). Täten muodostettujen hybridisolujen primääriviljelmät kloonataan tavalliseen tapaan, esimerkiksi käyttämällä jotakin tavanomaista kaupallista solulajittelijaa tai käyttämällä rajoittavaa laimentamista ("limiting dilution"). Jatkokäsittelyyn valittiin kulloinkin ne viljelmät, jotka reagoivat positiivisesti FS-hormonia vastaan, ja negatiivisesti, tai ainoastaan vähäisessä määrin, muita glykopro-. teiinihormoneja vastaan jossakin sopivassa koemenetelmässä, esimerkiksi entsymaattisessa immunokokeessa (ELISA-menetelmä). Näin

II

5 91976 saadaan useita hybridoomasolujen sukupolvia, jotka tuottavat tämän keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta. Näitä solusuku-polvia voidaan viljellä, ja niiden tuottamat monoklonaaliset vasta-aineet voidaan eristää tunnettuja menetelmiä käyttäen.

Esimerkkeinä täten valmistetuista solusukupolvista mainittakoon: Klooni 293 (NCACC 84122002),

Klooni 163 (NCACC 84122006) ja

Klooni 381 (NCACC 85022205).

Nämä solusukupolvet on talletettu NCACC (National Collection of

Animal Cell Cultures), ja niille on annettu edellä mainitut tunnusnumerot .

Täten saatujen monoklonaalisten vasta-aineiden tunnusomaisena piirteenä on se, että niiden affiniteetti FS-hormonia vastaan on erittäin korkea (affiniteettivakio suuruusluokkaa >10* 1/mol), ja että ne ristireagoivat muiden glykoproteiinihormonien kanssa alle 3-prosenttisesti. Erityisen edullisten monoklonaalisten vasta-aineiden ristireaktiivisuus, joka kohdistuu muihin glykoproteiini-hormoneihin, kuten hormoneihin hCG, LH ja TSH, on alle 1 %, erityisen mielellään niiden ristireaktiivisuus on alle 0,1 %. Affiniteetin ja muihin hormoneihin kohdistuvan ristireaktiivisuuden määrittämiseksi voidaan käyttää tavanomaisia, alan asiantuntijalle tuttuja menetelmiä.

Tämän keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää erinomaisesti FS-hormonin spesifiseksi määrittämiseksi näytteestä, esimerkiksi seerumista tai plasmasta, muiden glykoproteiinihormonien läsnäollessa. Näissä määritysmenetelmissä näitä monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää sellaisenaan tai niistä voidaan käyttää kappaleita, esimerkiksi Fab-kappaleita, joilla on vastaavat immunologiset ominaisuudet. Näin ollen käsitteellä "monoklonaalinen vasta-aine" tarkoitetaan sekä täydellistä vasta-ainetta että sen kappaleita.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

6 91976 Tätä keksintöä havainnollistetaan edelleen seuraavilla esimerkeillä :

Esimerkki 1 FS-hormonia vastaan vaikuttavien monoklonaalisten vasta-aineiden muodostaminen________ 8-12 viikon ikäiset Balb/c-hiiret immunoidaan antamalla niille vatsaontelon sisäiset! 100^u9 hFS-hormonia (yhtiö Immunex), joka on adsorboitu alumiinihydroksidiin ja Bordatella pertus-sis-toksiiniin. 6 viikon kuluttua eläimet immunoidaan edelleen kolmasti, kulloinkin 4 viikon välein. Tällöin niille annetaan vatsaontelon sisäisesti kulloinkin 50^ug FS-hormonia, joka on adsorboitu alumiinihydroksidiin ja Bordatella pertussis-toksii-niin.

Yhteensulauttaminen toteutetaan suurin piirtein neljän kuukauden kuluttua viimeisestä immunoinnista. Eläimet immunoidaan vielä kerran antamalla niille vatsaontelon sisäisesti tai suonen sisäisesti neljä vuorokautta ja kolme vuorokautta ennen yhteensulauttamista kulloinkin 100^,ug FS-hormonia PBS-liuok-sessa (fosfaatilla puskuroitu suolaliuos).

Yhteensulauttaminen toteutetaan menetelmällä, joka on esitetty julkaisussa Galfre, Methods in Enzymology, T.3 (1981), sivu 3,

G

ja jossa menetelmässä 10 immunoidusta hiirestä saatua perna- 7 solua sekoitetaan 2 x 10 myeloomasoluun (P3x63Ag8-653, ATCC-CRL 8375), jonka jälkeen tätä seosta sentrifugoidaan 10 minuuttia (300 g, 4°C). Nämä solut pestään vielä kertaalleen BSS-liuoksella (tasapainoitettu suolaliuos), ja sentrifugoidaan nopeudella 400 g. Erottunut neste poistetaan. Saatuun solu-kasaumaan lisätään 1 ml 50-prosenttista PEG-liuosta (MG 4000, Merck). Tämän jälkeen tähän seokseen lisätään hitaasti pisa-roittain huoneen lämpötilassa 5 ml RPMI 1640-väliainetta (RPMI = Roswell Parker Memory Institute), joka ei sisällä si-kiöasteisen vasikan seerumia (FKS), tämän jälkeen vielä kerran 5 ml RPMI 1640-väliainetta, jossa on 10% FKS-seerumia, täytetään väliaineella 50 millilitraksi, ja sentrifugoidaan 10 minuuttia nopeudella 400 g. Solukasauma siirretään 10% FKS- li 7 91976 seerumia sisältävään RPMI 1640-väliaineeseen. 24 koloa käsit täville soluviljelylevyille (yhtiö Nunc) siirretään kulloinkin 2 x 105 pernasolua. Kuhunkin viljelmään lisätään ravinnesoluik-5 4 si 1 x 10 pernasolua tai 5 x 10 vatsakalvon läpi tihkunutta eksudaattisolua. Seuraavana päivänä viljelmiin lisätään hypo-ksantiinista ja atsaseriinistä muodostuvaa valikoinnin väliainetta (100 mM hypoksantiinia, l^ug/ml atsaseriiniä) .

Noin 7-10 vuorokauden kuluttua nähdään jo useita klooneja. Primääriviljelmien supernatantti testataan esimerkissä 2 kuvatulla ELISA-menetelmällä. Antigeenille spesifisiä vasta-aineita sisältävät primääriviljelmät kloonataan edelleen 96 koloa käsittävillä soluviljelylevyillä (yhtiö Nunc) fluoresenssiaktivoivan 4 solulajittelijän avulla. Ravinnesoluina käytetään 1 x 10 4 vatsakalvon läpi tihkunutta eksudaattisolua, tai 2 x 10 perna-solua viljelmän 96 koloa kohden.

Tällä tavalla voitiin eristää esimerkiksi hybridomisolujen sukupolvien klooni 293, klooni 163 ja klooni 381, jotka on tallennettu kokoelmaan NCACC (=National Collection of Animal Cell Cultures), ja niillä on seuraavat tunnusnumerot: NCACC 84122002 (= klooni 293), NCACC 84122006 (= klooni 163) ja NCACC 85022205 (= klooni 381).

Vesivatsan (ascites) aikaansaamiseksi hiiriin injektoidaan vatsaontelon sisäisesti 5 x 10^ hybridisolua sen jälkeen, kun ne on ensin käsitelty 1-2 kertaa 0,5 millilitralla pristan-liuos-ta. Tästä injektoinnista yhden - kolmen viikon kuluttua hiirten vesivatsan nestettä voidaan ottaa talteen. Vasta-aineet voidaan eristää tästä nesteestä tavalliseen tapaan. Näiden monoklonaalisten vasta-aineiden vaikutus kohdistuu spesifisesti FS-hormoniin, ja niillä on ainoastaan vähäistä, mikäli lainkaan, ristireaktiivisuutta muiden glykoproteiinihormonien kanssa. Niistä käytetään seuraavassa tunnusta MAK 293 (kloonista 293) MAK 163 ('kloonista 163) ja MAK 381 (kloonista 381).

β 91976 Nämä monoklonaaliset vasta-aineet kuuluvat alaluokkaan IqGl/K.

Q

Niiden affiniteetti on yli 10 1/mol. Affiniteetin määrittämiseksi niiden kilpailukäyrät muodostetaan homologisen antigeenin kanssa Scatchard'in menetelmällä (Ann. N.Y. Acad. Sei.

51, (1949), sivu 660), ja nämä käyrät analysoidaan. Tätä varten tarvittavat mittaukset toteutetaan analogisesti esimerkissä 2 esitetyllä tavalla.

Esimerkki 2

F5-hormonia vastaan vaikuttavan vasta-aineen seulontakoe Jotta FS-hormonia vastaan vaikuttavien vasta-aineiden spesifisyys ja läsnäolo immunoitujen hiirien seerumissa tai hybridi-soluviljelmän supernatantissa tai vesivatsassa saataisiin todetuksi, niin ELISA-menetelmää käytetään testausperiaatteena: mikrotiitterilevyt päällystetään 37°C:n lämpötilassa yön yli liuoksella, joka sisältää l^ug FS-hormonia 1 millilitrassa pääl-lystämispuskuria (0,2 M natriumkarbonaatti/-bikarbonaatti, pH

9,3 - 9,5). Tämän jälkeen niitä käsitellään 10 minuutin ajan 0,9-orosenttisella natriumkloridiliuoksella ja 1-prosenttisella albumiiniliuoksella. Sitten ne pestään 0,9-prosenttisella nat-riumkloridiliuoksella. Tämän jälkeen niitä inkuboidaan 37°C:n lämpötilassa tunnin ajan 100^,ul suuruisen näytteen kanssa, ja pestään sitten uudestaan 0,9-prosenttisella natriumkloridiliuoksella. Tämän jälkeen niitä inkuboidaan (tunnin ajan 37°C:n lämpötilassa) lammas-antihiiri-IgG-peroksidaasi-konjugaatin kanssa, jota konjugaattia käytetään määränä 100-150 mU/ml.

Levyt pestään jälleen 0,9-prosenttisella natriumkloridilla, ja peroksidaasin aktiivisuus määritetään tavanomaiseen tapaan (esimerkiksi ABTS-menetelmällä, 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, ekstinktioero ÄmE määritetään aallonpituudella 405 nm).

ELISA-koe voidaan toteuttaa myös seuraavasti:

Mikrotiitterilevyt päällystetään ensin lammas-antihiiri-IgG-kompleksilla (20-30^ug/ml päällystämispuskuria, yksi tunti -yön yli, 37°C:n lämpötilassa). Tämän jälkeen levyjä jatko-käsitellään edellä kuvatulla tavalla, näyteliuos lisätään ja levyt pestään uudestaan. Lopuksi levyjä inkuboidaan 250 mU/ml suuruisen määrän kanssa FSH-peroksidaasikonjugaattia (1 tunti, 37°C). Levyt pestään ja peroksidaasin aktiivisuus määritetään esimerkiksi ABTS-menetelmällä.

tl 9 91976

Esimerkki 3

Muihin glykoproteiinihormoneihin kohdistuvan ristireaktiivi- suuden määrittäminen_ Tässä määrityksessä menetellään esimerkissä 2 kuvatulla tavalla. Ensin määritetään FS-hormonin reaktiivisuus. Tämän jälkeen kyseiseen monoklonaaliseen vasta-aineeseen lisätään ristireaktii-visuuden suhteen tarkasteltavaa antigeeniä (hCG, TSH, LH) kasvavina pitoisuuksina.

Tämän jälkeen ristireaktiivisuudet lasketaan sexiraavalla kaavalla : C(FSH) - x 100 * ristireaktiivisuus prosentteina C(ristireagoiva antigeeni) missä C tarkoittaa antigeenin sitä pitoisuutta, joka tarvitaan siihen, että suurin mahdollinen signaali saavutetaan 50-prosent-tisesti.

Seuraavassa taulukossa 1 esitetään vasta-aineiden MAK 293, MAK 163 ja MAK 381 tapauksessa mitatut arvot.

Taulukko 1 FS-hormonia vastaan vaikuttavien monoklonaalisten vasta-aineiden MAK 293, MAK 163 ja MAK 381 ristireaktiivisuus hormonien hCG, LH ja TSH kanssa

Glyko- suurin pitoi- pitoisuusalue Prosenttinen ristireaktiivisuus hormoni suus seerumissa ristireaktiivi- -1-- suuskokeessa MAK 293 MAK 163 MAK 381

hCG

(UCB, 200 IU/ml 0-250 IU/ml < 0,1 < 0,1 < 0,1

Belgia)

LH

400 IU/ml 0-12 IU/ml < 0,1 < 0,1 < 0,1

Belgia)

TSH

(Boehringer 1000,uIU/ml 0-9000-uIU/ml <0,1 <0,1 <0,1

Mannheim) ' 10 91 976

Esimerkki 4

Epitooppispesifisyyden määrittäminen

Mikrotiitterilevyä päällystetään 2 tuntia 37°C:n lämpötilassa, tai yön yli 4°C:n lämpötilassa liuoksella, joka käsittää pitoisuutena 10yug/ml lampaan vasta-ainetta, jonka vaikutus kohdistuu erään hiiri-vasta-aineen Fcy-alueeseen, 0,2 M karbonaattipus-kurissa, pH 9,6. Levy pestään tämän jälkeen PBS/Tween 20 (0,1%)-seoksella, pH 7,35. Tämän jälkeen levylle lisätään inkubointipuskurissa (PBS, 0,1% naudan seerumin albumiinia (BSA), 0,1% Tween 20) lOO^ul monoklonaalista vasta-ainetta (MAK 1, pitoisuus 10^ug/ml), ja levyä inkuboidaan 2 tuntia 37°C:n lämpötilassa.

FSH-peroksidaasi-konjugaattia (100mU/ml) inkuboidaan edeltä käsin yön yli 4°C:n lämpötilassa, liuoksessa, erään toisen mono-klonaalisen vasta-aineen (MAK 2) kanssa, pitoisuus 10^ug/ml.

Sen jälkeen, kun levyä on inkuboitu vasta-aineen MAK 1 kanssa, ylimääräinen MAK 1 poistetaan pesemällä levy PBS-Tween-20-seoksella. Tämän jälkeen levy päällystetään 1-prosenttisella hiiren normaaliseerumilla PBS-BSA-liuoksessa 30 minuutin ajan, huoneen lämpötilassa. Levylle lisätään 100^,ul edeltä käsin inkuboitua MAK 2/FSH-peroksidaasi-kompleksia, ja levyä inkuboidaan 2 tuntia 37°C:n lämpötilassa. Sitoutunut peroksidaasi-aktiivisuus tehdään näkyväksi käyttämällä substraattina ABTS-liuosta. Värin mitattu intensiteetti on suoraan verrannollinen vasta-aineeseen MAK 1 sitoutuneeseen MAK 2/FSH-peroksidaasi-konjugaattiin.

Seuraavassa esitetään yhteenvedon tavoin eri monoklonaalisilla vasta-aineilla saadut koetulokset. Sitoutunut aktiivisuus ilmoitetaan Drosentteina kilpailematta sitoutuneesta FHS-perok-sidaasi-aktiivisuudesta: MAK 1 293 163 381 293 00 20 MAK 2 163 00 20 381 20 20 0

II

11 91976

Saadut tulokset osoittavat, että monoklonaalisen vasta-aineen MAK 318 vaikutus kohdistuu FSH-antigeenin ahonkin muuhun epi-tooppiin kuin molempien vasta-aineiden MAK 293 ja MAK 163 vaikutukset .

Esimerkki 5 FS-hormonin määrittäminen A) Reagenssiliuosten valmistaminen 1) Substraattipuskuri:

15 mM natriumfosfaattipuskuri, pH 7,4 15 mM natriumkloridi 5 mM EDTA

0,2% naudan seerumin albumiinia, pH 7,4 5 mM o-nitrofenyyligalaktosidi.

2) Reseptori-l-liuos

Reseptorina 1 käytetään tämän keksinnön mukaista monoklonaalista hiiren anti-FSH-vasta-ainetta. Tätä vasta-ainetta sisältävä vesivatsan neste tehdään ammoniumsulfaatin suhteen korkeintaan 1,8 molaariseksi. Sakka sekoitetaan puskuriin, joka käsittää 15 mM natriumfosfaattia, pH 7,0, sekä 50 mM natriumkloridia.

Näin saatu liuos johdetaan kertaalleen DEAE-selluloosan läpi.

3) Reseptori-3-liuos

Reseptorina 3 käytetään samoin tämän keksinnön mukaista monoklonaalista hiiren anti-FSH-vasta-ainetta, joka kuitenkin tunnistaa toisen antigeenisyyden determinantin kuin reseptori 1.

Tätä vasta-ainetta sisältävä vesivatsan neste puhdistetaan kohdassa 2) esitetyllä tavalla. Täydellinen vasta-aine pilkotaan tunnetulla tavalla Fab-kappaleeksi. Saadut Fab-kappaleet kytketään β-galaktosidaasiin menetelmällä, joka kuvataan julkaisussa R.R. Porter, Biochem. J. ^73, (1959) s. 119.

4) Aktivoitu reseptori-2-liuos

Lampaan antihiiri-Fcy-antiseerumiin lisätään ammoniumsulfaattia korkeintaan pitoisuudeksi 1,8 M. Sakka sekoitetaan puskuriin, joka käsittää 15 mM natriumfosfaattia, pH 7,0 ja 50 mM natriumkloridia. Näin saatu liuos johdetaan kertaalleen DEAE-selluloosan läDi.

12 91 976 B) Reagenssikantajien valmistaminen 1) Reagenssikantaja 1 40^ul liuosta, joka millilitraa kohden käsittää 100 yUmol natriumfosfaattia, pH 7,3 (37°C), 2yUmol magnesiumkloridia 0,9¾ natriumkloridia 0,5% naudan seerumin albumiinia 5 fxq monoklonaalista anti-FSH-vasta-ainetta hiirestä (reseptori-1-liuos) 100 mU anti-FSH-vasta-aine-(hiiri)-Fab-kappale-fS-galaktosidaasi-konjugaattia (reseptori-3-liuos) siirretään pisaroittain kuitumatolle, joka on valmistettu kaupallisesta polyesteripaperista. Tämän jälkeen se kuivataan huoneen lämpötilassa. Näitä kuitumattoja säilytetään käyttöhetkeen saakka 4°C:n lämpötilassa olosuhteissa, joissa ilman kosteus on 20%.

2) Reagenssikantaja 2

Selluloosasta valmistetulle kuitumatolle kiinnitetään tunnetulla, bromisyaanilla toteutettavalla aktivointimenetelmällä (DE-OS 1 768 512) lampaan vasta-ainetta, jonka vaikutus kohdistuu hiiristä saadun vasta-aineen Fcy-osaan (aktivoitu reseptori-2-liuos) siten, että kuitumateriaalin yhtä grammaa kohden pyritään kiinnittämään 10^.ug vasta-ainetta. Kytkeytymättä jäänyt vasta-aine Doistetaan pesemällä, ja kuitumatto kuivataan varovaisesti huoneen lämpötilassa. Näin saadut kuitumatot säilytetään reagenssikanta jän 1 kohdalla esitetysti.

Näiden kahden reagenssikantajän 1 ja 2 avulla tapahtuva määrittäminen toteutetaan DE-patenttihakemuksessa 3 425 008.5 kuvatulla laitteella analyyttisten määritysten suorittamiseksi.

Tämä laite käsittää roottorin lisäelementin sentrifugaalivoi-maan perustuvia analyysiautomaatteja varten, tämän roottorin lisäelementin käsittäessä muotokappaleen, jossa on näytteen vastaanottokammio, joka näytteen vastaanottokammio on yhteydessä usean reagenssialueen kanssa, ja kukin näistä reagenssialueista sisältää’imukykyistä, tietyllä reagenssilla kyllästettyä kanta jamateriaalia , ja jossa muotokappaleessa on lisäksi vähin-

II

13 91 976 tään yksi sekoitusventtiilikammio sekä mittauskammio, jotka muodostavat yhdessä näytenesteen kuljetusreitin, joka kuljetusreitti kulkee säteit-täisesti sisäänpäin ja edelleen säteittäisesti ulospäin, kun lisäelementti on kiinnitetty roottoriin, tämän muotokappaleen käsittäessä edelleen vähintään yhden kammion nesteen vastaanottamiseksi, sekä yhden kuljetusreitin, joka kulkee tästä kammiosta mittauskammioon, ja joka on vähintään osittain identtinen näytenesteen kuljetusreitin kanssa. Tällöin näytenesteen kuljetusreitti kulkee näytteen vastaanottokammiosta (P) imu-kykyisellä materiaalilla täytetyn, puskuria sisältävän kammion (a), kammion (c) ja kammioiden (a) ja (c) välissä sijaitsevan ensimmäisen venttiilikammion (VK1) kautta toiseen venttiili-kammioon (VK2), ja tästä venttiilikammiosta kammion (d) kautta ja kokoomakammion (AK) kautta mittauskammioon XK). Laitteessa on muun nesteen vastaanottamista varten pumppauskammiona esitetty substraattikammio (PK), joka on yhteydessä toisen venttiilikammion (VK2) kanssa annostelukammiosta (DK) ja kapillaarista (Kap) muodostuvan annostelulaitteen ja ylijuoksukammion (ÖK) välityksellä. Kuvassa 1 esitetään kaavamaisesti käytetty roottorin lisäelementti. Reagenssikantajaa 1 laitetaan laitteen kenttään c, ja reagenssikantajaa 2 kenttään d. 40^ul näytettä pipetoidaan suoraan kenttään a yläreunassa sijaitsevan aukon kautta. Näytettä ei ole laimennettu. 270^ul substraattiliuos-ta pipetoidaan kammioon PK. Tämän jälkeen näyte ja substraatti-liuos saadaan liikkumaan erotusmatriisin ja kyvetin suuntaan sopivan ohjelman avulla, jossa ohjelmassa esiintyy vuorotellen suuria pyörimisnopeuksia ja roottorin liikkumattomuutta. Ohjelman edetessä näyteneste eluoi reseptorit 1 ja 3 kentästä c, jonka jälkeen tämän homogeenisen seoksen annetaan reagoida. Muodostuneet kompleksit sidotaan reseptoriin 2 kentässä d.

Näytteen siirtyminen kentästä c kenttään d tapahtuu erittäin lyhyessä ajassa.

Annostelukammio (DK) jakaa substraattiliuoksen osiin, joista ensimmäisiä käytetään ylimääräisen, komplekseja muodostamat-toman konjugaatin uloshuuhtomiseen.

14 91976

Kentässä d komplekseja muodostamalla sitoutuneen β-galaktosi-daasin aktiivisuus on verrannollinen näytteen sisältämään FSH-määrään. Tämä aktiivisuus määritetään uudella substraattiannok-sella, jolloin substraatti muutetaan 5 minuutin pituisella reaktiolla värillisiksi tuotteiksi. Muodostunut väri mitataan kyvetissä aallonpituudella 410 nm.

Kalibrointikäyrä saadaan kalibrointiseerumeilla, joiden FSH-pitoisuus tunnetaan, ja tämä kalibrointikäyrä katLaa alueen 0—4 ng FSH/ml (standardisoitu FSH 68/40-hormonin ensimmäisen IRP-standardin mukaan) ja se mahdollistaa FS-hormonin riittävän herkän mittaamisen seerumista tai plasmasta. FS-hormonin tuntematon pitoisuus ruumiin nesteissä, esimerkiksi seerumissa tai plasmassa, saadaan tämän kalibrointikäyrän avulla.

Esimerkki 6 FS-hormonin määrittäminen kerrostamisperiaatteella ("sandwich") Mikrotiitterilevyn kuhunkin koloon laitetaan lOO^ul liuosta, joka sisältää FS-hormonia vastaan vaikuttavaa, tämän keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta päällystämispuskurissa (0,2 M natriumkarbonaatti/-bikarbonaatti, pH 9,4) pitoisuutena 50 ^ug/ml, ja levyä inkuboidaan tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen levyn kolot päällystetään uudestaan inkubointi-puskurilla (1% naudan seerumin albumiinia, 0,9% NaCl) ja inku-boidan 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Pesupuskurilla (0,9% NaCl, 0,1% Tween 20) pesun jälkeen jokaiseen koloon laitetaan lOO^ul näytettä, joka sisältää määritettävää FS-hormonia, ja levyä inkuboidaan 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen, kun levy on jälleen pesty pesupuskurilla, koloihin lisätään lOO^ul konjugaattia, joka muodostuu peroksidaasista (aktiivisuus 100 mU/ml) sekä toisesta tämän keksinnön mukaisesta monoklonaalisesta vasta-aineesta, jonka vaikutus kohdistuu kuitenkin FS-hormonin toiseen epitooppiin, ja levyä inkuboidaan tunnin ajan huoneen lämpötilassa.

Konjugaatin valmistamiseen käytetään piparjuuren peroksidaasia EC 1.11.1.7. Konjugaatti valmistetaan perjodaatilla hapettamalla, ja tämän jälkeen boorihydridillä pelkistämällä käyttäen 15 91 976

Nakane'n menetelmään, joka esitetään julkaisussa M.B. Wilson ja P.K. Nakane, teoksessa W. Knapp toim. "Immunofluorescense and Related Staining Techniques", 1978, Elsevier/North Holland, Biomedical Press, sivut 215-224.

Pesupuskurilla pesun jälkeen koloihin laitetaan lOO^ul ABTS-substraattiliuosta, ja tunnin pituisen värinmuodostusreaktion jälkeen ekstinktio mitataan aallonpituudella 405 nm ELISA-mitta-laitteella (Dynatec).

Kalibrointikäyrän valmistamiseksi edellä kuvatussa menetelmässä näytteen asemesta käytetään liuoksia, jotka sisältävät FS-hor-monia inkubointipuskurissa erilaisina, tarkoin määrättyinä pitoisuuksina (kuva 2).

Claims (10)

91976

1. Immunologiskt förfarande för bestämning av ett follikel stimulerande hormon (FSH), käzmetecknat av att i förfarandet används minst en mot FSH riktad monoklonal antikropp, vars korsreaktivitet med andra glykoproteinhormoner, LH, TSH och h-CG, är under 3 %, och som är erhällbar frän de deponerade hybridomacellinjerna NCACC 84122002, NCACC 84122006 eller NCACC 85022205.

1. Immunologinen menetelmä follikkelia stimuloivan hormonin (FSH) määrittämiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä käytetään vähintään yhtä monoklonaalista vasta-ainetta, jonka vaikutus kohdistuu FSH:ta vastaan ja jonka ristireaktiivisuus muiden glykoproteiinihormonien h-CG, LH ja TSH kanssa on alle 3 %, ja joka on saatavissa talletetuilla hybridomasolulin- jOilia NCACC 84122002, NCACC 84122006 tai NCACC 85022205.

2. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att i förfarandet används minst en mot FSH riktad monoklonal anti- . kropp, vars korsreaktivitet med andra glykoproteinhormon, LH, TSH och h-CG, är under 1 %. 91976

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmässä käytetään vähintään yhtä monoklonaalista vasta-ainetta, jonka vaikutus kohdistuu FSH:ta vastaan, ja jonka ristireaktiivisuus muiden glykoproteiinihormonien h-CG, LH ja TSH kanssa on alle 1 %.

3. Förfarande enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknat av att i förfarandet används minst tvä monoklonala antikroppar riktade mot FSH, av vilka minst den enas korsreaktivitet med andra glykoproteinhormoner, LH, TSH och h-CG, är under 3 %.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmässä käytetään vähintään kahta, FSH:ta vastaan vaikuttavaa monoklonaalista vasta-ainetta, joista vähintään toisen ristireaktiivisuus muiden glykoproteiinihormonien h-CG, LH ja TSH kanssa on alle 3 %.

4. Reagens för bestämning av ett follikel stimulerande hermon, k&zmetecknad av att den innehäller minst en mot FSH rik-tad monoklonal antikropp, vars korsreaktivitet med andra glykoproteinhormoner, LH, TSH och h-CG, är under 3 %, och som är erhällbar frän hybridomacellinjerna NCACC 84122002, NCACC 84122006 eller NCACC 85022205.

4. Reagenssi follikkelia stimuloivan hormonin määrittämiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää vähintään yhtä monoklonaalista vasta-ainetta, jonka vaikutus kohdistuu FSH:ta vastaan, ja jonka ristireaktiivisuus muiden glykoproteiinihormonien h-CG, LH ja TSH kanssa on alle 3 %, ja joka on saatavissa hybridomasolulinjoilla NCACC 84122002, NCACC 84122006 tai NCACC 85022205.

5. Reagens enligt patentkrav 4, kännetecknad av att den innehäller minst en mot FSH ridtad monoklonal antikropp, vars korsreaktivitet med andra glykoproteinhormoner, LH, TSH och h-CG, är under 1 %.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää vähintään yhtä monoklonaalista vasta-ainetta, jonka vaikutus kohdistuu FSH:ta vastaan ja jonka ristireaktiivisuus muiden glykoproteiinihormonien h-CG, LH ja TSH kanssa on alle 1 %.

6. Reagens enligt patentkrav 4 eller 5, kännetecknad av att den innehäller minst tvä monoklonala antikroppar riktade mot FSH, av vilka minst den enas korsreaktivitet med andra glykoproteinhormoner, LH, TSH och h-CG, är under 3 %.

6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen reagenssi, tunnettu , siitä, että se sisältää vähintään kahta FSH:ta vastaan vai- t kuttavaa monoklonaalista vasta-ainetta, joista vähintään toi- 91976 sen ristireaktiivisuus muiden glykoproteiinihormonien h-CG, LH ja TSH kanssa on alle 3 %.

7. Monoklonal antikropp mot ett follikel stimulerande hor-mon, kännetecknad av att korsreaktivitet av denna antikropp med andra glykoproteinhormoner, LH, TSH och h-CG, är under 3 %, och den är erhällbar frän hybridomacellinjerna NCACC 84122002, NCACC 84122006 eller NCACC 85022205.

7. Monoklonaalinen vasta-aine follikkelia stimuloivaa hormonia vastaan, tunnettu siitä, että tämän vasta-aineen risti-reaktiivisuus muiden glykoproteiinihormonien h-CG, LH ja TSH kanssa on alle 3 % ja että se on saatavissa hybridoomasolu-linjoilla NCACC 84122002, NCACC 84122006 tai NCACC 85022205.

8. Monoklonal antikropp enligt patentkrav 7, kännetecknad av att dess korsreaktivitet med andra glykoproteinhormoner, LH, TSH och h-CG, är under 1 %.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että sen ristireaktiivisuus hormonien LH, TSH ja h-CG kanssa on alle 1 %.

9. Förfarande för producering av en monoklonal antikropp enligt patentkraven 7 eller 8, kännetecknat av att lämpliga djur immuniseras med ett luteiniserande hormon FSH, frän mjältar av dessa djur utvinns B-lymfocyter, som fusioneras med myelomaceller, de bildade hybridomacellerna klonas, de kloner som producerar specifikt mot FSH riktade monoklonala II 91976 antikroppar selekteras, och antikroppar producerade av dessa kloner utvinns.

9. Menetelmä patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukaisen mono-klonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi, tunnettu siitä, että immunisoidaan sopivia koe-eläimiä FSH:lla, otetaan immunisoitujen eläinten pernasta talteen B-lymfosyyttejä, jotka fuusioidaan myeloomasolujen kanssa, kloonataan muodostuneet hybri-doomasolut, selektoidaan kloonit, jotka tuottavat spesifistä, FSH:ta vastaan suunnattua monoklonaalista vasta-ainetta, ja otetaan talteen niiden muodostamat vasta-aineet.

10. Hybridomasolulinja, joka on talletettu numerolla NCACC 84122002, NCACC 84122006 ja NCACC 85022205.

10. Hybridomacellinje, som deponerats med deponeringsnumren NCACC 84122002, NCACC 84122006 och NCACC 85022205. *