JP2003506684A - 結合対の両方のメンバーを同時に検出するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 結合対の両方のメンバーＡおよびＢ（例えば、抗原および抗体）を同時に測定するための、方法およびキットが記載される。この方法は、以下の工程を包含する：生物学的サンプルを、固相試薬と接触させて、第１の反応粒子を形成する工程であって、この固相試薬は、メンバーＡに対しての結合親和性を有する捕捉抗体でコーティングされている、工程；この第１の反応粒子を、メンバーＡに対して特異的な結合親和性を有する標識抗体およびメンバーＢに対して特異的な結合親和性を有する標識抗体と接触させて、第２の反応粒子を形成する工程；ならびにこの第２の反応粒子上の標識を、フローサイトメトリーによって測定する工程。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、生物学的サンプルにおける結合対の両方のメンバーを同時に検出す
るための方法に関する。

【０００２】 （発明の背景） 血液成分の輸血および移入のために使用される血液生成物は、以下のような感
染性因子の存在について慣用的にスクリーニングされなければならない：ヒト免
疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、肝炎ウイルス、ヒトＴリンパ球親和性ウイルス、お
よびサイトメガロウイルス。このような因子は、代表的に、酵素イムノアッセイ
分析（ＥＩＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を使用して、ウイルス抗
原の同定またはこのウイルスに対する免疫応答（すなわち、宿主由来の抗ウイル
ス抗体）の検出のいずれかによって、検出される。ウイルスへの感染とイムノア
ッセイ技術による検出との間のウィンドウ期間が、ＨＩＶについては２〜４週間
、そしてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）については約１０週間まで変動するので、
イムノアッセイ技術は、それがウイルス混入物の存在を感染の初期段階において
検出する能力が制限される。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
または分枝鎖ＤＮＡ分析のような技術は、感染と検出との間の期間を短縮し得る
が、個体ドナーに基づく使用のためには費用が手が出ないほどに高く、そしてウ
ィンドウ期間を排除しない。

【０００３】 （発明の要旨） 本発明は、生物学的サンプルから結合対の両方のメンバー（例えば、リガンド
およびレセプター、または抗原および宿主抗体）を同時に検出するための、迅速
かつ感度のよい方法に基づく。本発明の方法は、例えば、初期段階において感染
を検出する能力を増強して、この感染のより早期の処置をもたらし得る。

【０００４】 本発明は、生物学的サンプルにおける結合対の両方のメンバーＡおよびＢを同
時に測定するための方法を特徴とする。この生物学的サンプルは、血液、血漿、
血清、尿、脳脊髄液、痰、涙、羊水、硝子体液、唾液、および組織培養上清から
なる群より選択される。この方法は、以下の工程を包含する：固相試薬を提供す
る工程であって、この固相試薬は、捕捉抗体でコーティングされた粒子を含み、
この捕捉抗体は、結合対のメンバーＡに対して特異的な結合親和性を有する、工
程、およびこのメンバーＡが、存在する場合には、この粒子と結合して第１の反
応粒子を形成する条件下で、生物学的サンプルを固相試薬に接触させる工程。捕
捉抗体は、モノクローナル抗体であり得る。第１の反応粒子は、メンバーＡに対
して特異的な結合親和性を有する第１の抗体と、および結合対のメンバーＢに対
して特異的な結合親和性を有する第２の抗体と接触されて、第２の反応粒子を形
成し、ここで、第１の抗体は第１の標識で標識されており、そして第２の抗体は
第２の標識で標識されている。第１および第２の抗体は、モノクローナル抗体で
あり得る。第１および第２の標識（例えば、蛍光団）は、第２の反応粒子上にお
いて、フローサイトメトリーを使用して測定される。

【０００５】 特定の実施形態においては、捕捉抗体の抗原結合領域が、結合対のメンバーＡ
を結合するために利用可能であるように、実質的に全ての捕捉抗体が粒子上で配
向される。

【０００６】 結合対のメンバーＡは、例えば、抗原であり得、そしてメンバーＢは、宿主抗
体であり得る。この抗原は、Ｃ型肝炎抗原、Ｂ型肝炎抗原、またはヒト免疫不全
ウイルス抗原のようなウイルス抗原、あるいはグルタミン酸デカルボキシラーゼ
のような自己抗原であり得る。結合対のメンバーＡはまた、サイトカインのよう
なリガンドであり得、そしてメンバーＢは、サイトカインレセプターのようなレ
セプターであり得る。さらに、メンバーＡは酵素であり得、そしてメンバーＢは
基質であり得る。例えば、この酵素は、カスパーゼ−３またはカスパーゼ−１で
あり得、そしてこの基質は、それぞれポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼま
たはプロインターロイキン−１であり得る。

【０００７】 本発明はまた、生物学的サンプルにおける結合対の両方のメンバーＡおよびＢ
を同時に測定するための、キットを特徴とする。このキットは、以下を備える：
固相試薬であって、この固相試薬は、結合対のメンバーＡに対して特異的な結合
親和性を有する捕捉抗体でコーティングされた粒子を含む、固相試薬；結合対の
メンバーＡに対して特異的な結合親和性を有する、第１の抗体であって、ここで
、この第１の抗体が、第１の標識で標識されている、第１の抗体；および結合対
のメンバーＢに対して特異的な結合親和性を有する、第２の抗体であって、ここ
で、この第２の抗体が、第２の標識で標識されている、第２の抗体。捕捉抗体の
抗原結合領域が、結合対のメンバーＡを結合するために利用可能であるように、
実質的に全ての捕捉抗体が、粒子上で配向される。このキットは、ラベルまたは
パッケージ挿入物をさらに備え得、このラベルまたはパッケージ挿入物は、固相
試薬、第１の標識抗体、および第２の標識抗体が、フローサイトメトリーによっ
て、生物学的サンプルにおける結合対の両方のメンバーＡおよびＢを同時に測定
するために使用され得ることを示す。

【０００８】 他に定義しない限り、本明細書中において使用される全ての技術的用語および
科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されると同じ意味を
有する。本明細書中に記載されるものと類似であるかまたは等価である方法およ
び材料が、本発明の実施において使用され得るが、適切な方法および材料を、以
下に記載する。本明細書中において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、
および他の参考文献は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。矛盾
する場合には、本明細書が、定義を含めて、支配する。さらに、材料、方法、お
よび実施例は、例示的であるのみであり、そして限定することを意図しない。

【０００９】 本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から
、明らかである。

【００１０】 （詳細な説明） （イムノアッセイ形式） 一般に、本発明は、生物学的サンプル中の結合対の両方のメンバーを同時に検
出するためにサンドイッチイムノアッセイ方法を使用する。結合対としては、核
酸、タンパク質（または低分子およびタンパク質）から構成される対を含めて、
複合体を形成する分子の任意の組み合わせが挙げられる。核酸対は、ＤＮＡ：Ｒ
ＮＡ対またはＤＮＡ：ＤＮＡ対であり得る。例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ結合対（例
えば、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡおよびｍＲＮＡ）は、ＰＣＲ産物検出系として用い
られ得る。ＤＮＡ／ＤＮＡ結合対（例えば、ｓｓＤＮＡおよびウイルスＤＮＡ）
は、増幅したＤＮＡあたりのウイルスの定量のための競合アッセイにおいて用い
られ得る。

【００１１】 タンパク質（または低分子およびタンパク質）の結合対の非限定的な例として
は、ホルモン、サイトカイン、ペプチド、薬物、ウイルスタンパク質、または他
の抗原および同族レセプターもしくは宿主抗体が挙げられる。ウイルスタンパク
質／レセプター結合対は、例えば、ＨＩＶ ｇｐ１２０および可溶性ＣＤ４であ
り得る。薬物および薬物レセプター結合対は、例えば、コカインおよびドーパミ
ンレセプターであり得る。ペプチドおよびペプチドレセプター結合対は、例えば
、アセチルコリンおよびムスカリン性レセプター、またはドーパミンおよびドー
パミンレセプターであり得る。ホルモンおよびホルモンレセプター結合対は、例
えば、インスリンおよびインスリンレセプターであり得る。サイトカインおよび
サイトカインレセプター結合対は、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびＴＮ
ＦのＩ型または２型のレセプター、またはインターロイキン２（ＩＬ−２）およ
びＩＬ−２レセプターであり得る。抗原および抗体対は、例えば、ウイルスタン
パク質および宿主抗ウイルスタンパク質抗体、または自己抗原および宿主抗自己
抗原抗体であり得る。ＨＩＶ ｐ２４／ヒト抗ＨＩＶ抗体、ＨＩＶ ｇｐ１２０
／ヒト抗ＨＩＶ ｇｐ１２０抗体、ＨＢＶ表面抗原／ヒト抗ＨＢＶ表面抗原、お
よびＨＣＶコアタンパク質／ヒト抗ＨＣＶコア抗体は、ウイルスタンパク質およ
び宿主抗体結合対の例である。自己抗原および宿主抗自己抗原抗体結合対は、例
えば、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）および宿主抗ＧＡＤ抗体であ
り得る。

【００１２】 検出され得る他のタンパク質結合対は、酵素および酵素基質結合対である。例
えば、酵素／基質対は、カスパーゼ−３／ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラー
ゼまたはカスパーゼ−１／プロインターロイキン−１であり得る。

【００１３】 メンバーＡ（これは、結合対のいずれかのメンバーであり得る）は、メンバー
Ａについての特異的結合親和性を有する捕捉抗体でコーティングされた粒子であ
る固相試薬で捕捉される。例えば、同時に検出されるべき結合対がＨＩＶ ｇｐ
１２０／宿主抗ＨＩＶ ｇｐ１２０抗体である場合、その粒子は、ＨＩＶ ｇｐ
１２０または抗宿主免疫グロブリン（Ｉｇ）について特異的結合親和性を有する
抗体でコーティングされ得る。

【００１４】 メンバーＡは、生物学的サンプルを、捕捉抗体でコーティングされた粒子と接
触させることによって捕捉される。本明細書中で使用される場合、適切な生物学
的サンプルは、細胞または細胞性物質を含み、そして適切な生物学的サンプルと
しては、例えば、血液、血漿、血清、尿、唾液、痰、涙、羊水、硝子体液および
脳脊髄液が挙げられる。他のサンプルは、インビトロ組織培養培地／上清を含み
得る。生物学的サンプルは、非イオン性界面活性剤（例えば、０．５％ Ｔｒｉ
ｔｏｎ−Ｘ １００またはＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））で処理されて、病原体由来
のコア抗原を曝露し得る。

【００１５】 固相試薬および生物学的サンプルを、メンバーＡ（存在する場合）のこの粒子
に対する結合を促進する条件下で接触させることによって、第１の反応粒子を形
成する。このような条件は、室温でのリン酸緩衝化生理学的食塩水（ＰＢＳ）中
に１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および０．１％アジ化ナトリウムを含む緩衝液の
使用、または生理学的ｐＨ条件下での任意の生物学的流体の使用を含み得る。次
いで、第１の反応粒子を、２セットの標識抗体（すなわち、レポーター抗体）と
接触させて、第２の反応粒子を形成する。第１の抗体は、メンバーＡについての
特異的結合親和性を有し、そして第１の標識で標識される。第１の抗体は、メン
バーＡが捕捉抗体に結合したままでメンバーＡに結合し得る。従って、捕捉抗体
および第１の抗体は、対として作用しなければならない。第２の抗体は、結合対
のメンバーＢについての特異的結合親和性を有し、そして第２の標識で標識され
る。蛍光標識した抗体はこの方法において特に有用である。

【００１６】 図１は、メンバーＡおよび宿主抗メンバーＡ抗体を検出するためのアッセイの
模式図を提供する。この実施形態では、ビオチン化した捕捉抗体は、メンバーＡ
についての特異的結合親和性を有し、そして抗原捕捉ビーズに対してアビジンを
介して結合されている。第１の抗体は、メンバーＡについての特異的結合親和性
を有し、そしてフィコエリトリン（第１の標識）で標識される。第２の抗体は、
シアニンフィコエリトリン（第２の標識）で標識され、そして宿主Ｉｇ（メンバ
ーＢ）についての特異的結合親和性を有する。第１の反応粒子は、メンバーＡ、
宿主抗メンバーＡ抗体、捕捉抗体、および固相試薬（例えば、抗原捕捉ビーズ）
を含み、一方、第２の反応粒子は、第１の反応粒子およびこれらの２つの標識さ
れた抗体を含む。

【００１７】 フローサイトメトリーを用いて、第２の反応粒子に対する標識の量を測定し得
る。本明細書中で使用される場合、用語「測定する」とは、定性的測定および定
量的測定をいう。言い換えると、用語「測定する」は、第２の反応粒子に対する
標識の存在または非存在を報告すること、ならびに存在する標識の量を決定する
ことを含む。フローサイトメーターは、光学フィルターを用いて蛍光発光を分割
し、そして別々の光電子増倍管を用いて個々の発光シグナルを増幅することによ
って、少なくとも３つの別の蛍光発光波長範囲を測定し得る。この粒子に関連し
た蛍光発光強度は、生物学的サンプル中に存在する分析物の濃度に直接比例する
。従って、各色素が異なる抗体に結合されている、異なる発光スペクトルを有す
る異なる色素の使用は、粒子集団あたりの複数の分析物の分析を可能にする。フ
ローサイトメーターはまた、異なる大きさの粒子を区別し得、その結果、例えば
、直径約７μｍの粒子は、直径約１０μｍの粒子から識別され得る。それゆえ、
さらなる成分は、複数の蛍光色素とおよび２または３つの異なる平均直径の粒子
集団との組み合わせを用いることによって検出され得る。

【００１８】 （抗体産生） メンバーＡまたはメンバーＢについての特異的結合親和性を有する抗体は、標
準的な方法によって産生され得る。あるいは、抗体は、例えば、以下から市販さ
れ得る：ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）、Ｃｏｕｌｔ
ｅｒ（Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）、Ｍａｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓ
ｅｒｖｉｃｅ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＭＥ）またはＢｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ，ＭＥ）。本明細書中で使用される場
合、用語「抗体」は、メンバーＡまたはメンバーＢ中のエピトープ決定基に結合
し得る、インタクトな分子ならびにそのフラグメントを含む。用語「エピトープ
」とは、抗体のパラトープが結合する、抗原上の抗原性決定基をいう。エピトー
プ決定基は通常、分子の化学的に活性な表面グループ化（ｇｒｏｕｐｉｎｇ）（
例えば、アミノ酸または糖側鎖）からなり、そして代表的に、特異的三次元構造
特徴ならびに特異的電荷特徴を有する。エピトープは一般的に、少なくとも５連
続したアミノ酸を有する。従って、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノ
クローナル抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖Ｆｖ抗体フラグメント、Ｆ
ａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ）₂フラグメントを包含する。モノクローナル
抗体は特に有用である。

【００１９】 一般に、目的のタンパク質は、組換えによって、化学合成によって、またはネ
イティブタンパク質の精製によって産生され、次いで、動物を免疫するために用
いられる。種々の宿主動物（例えば、ウサギ、ニワトリ、マウス、モルモットお
よびラットを含む）は、目的のタンパク質の注射によって免疫され得る。アジュ
バントを用いて、宿主の種に依存して免疫学的応答を増大させ得、そしてアジュ
バントとしては、Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（完全および不完全）、ミネラルゲ
ル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン）、
プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳
濁物、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびジニトロフェノール
が挙げられる。ポリクローナル抗体は、免疫した動物の血清において含まれる、
特定の抗原について特異的である抗体分子の不均質集団である。モノクローナル
抗体は、抗原内に含まれる特定のエピトープに対する抗体の均質な集団であり、
標準的なハイブリドーマ技術を用いて調製され得る。特に、モノクローナル抗体
は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，１９７５，２５６：４９５
によって記載される培養中の連続細胞株によって抗体分子の産生を提供する任意
の技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ Ｔｏｄａｙ，１９８３，４：７２；Ｃｏｌｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８３，８０：２０２６）およびＥＢＶハイブリドー
マ技術（Ｃｏｌｅら，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ
Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９
８３，７７−９６頁）によって入手され得る。このような抗体は、ＩｇＧ、Ｉｇ
Ｍ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそれらの任意のサブクラスを含む任意の免疫
グロブリンクラスの抗体であり得る。本発明のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養され得る。

【００２０】 キメラ抗体は、異なる部分が、異なる動物種に由来する分子（例えば、マウス
モノクローナル抗体から誘導された可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域
を有する分子）である。キメラ抗体は、標準的な技術によって産生され得る。

【００２１】 メンバーＡまたはメンバーＢについて特異的結合親和性を有する抗体フラグメ
ントは、公知の技術によって生成され得る。例えば、このようなフラグメントと
しては、抗体分子のペプシン消化によって産生され得るＦ（ａｂ’）₂フラグメ
ントおよびＦ（ａｂ’）₂フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによ
って生成され得るＦａｂフラグメントを含むがこれらに限定されない。あるいは
、Ｆａｂ発現ライブラリーは、構築され得る。例えば、Ｈｕｓｅら，１９８９，
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５を参照のこと。単鎖Ｆｖ抗体フラグメントは
、Ｆｖ領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントとをアミノ酸架橋（例えば、
１５〜１８アミノ酸）によって連結することによって形成されて、単鎖ポリペプ
チドを生じる。単鎖Ｆｖ抗体フラグメントは、標準的技術によって産生され得る
。例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと。

【００２２】 一旦産生すると、抗体またはそのフラグメントを、標準的なイムノアッセイ方
法によってメンバーＡまたはメンバーＢの認識について試験する。これらの方法
としては、例えば、ＥＬＩＳＡ技術またはＲＩＡが挙げられる。Ｓｈｏｒｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１１章、Ｇ
ｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍら編、１９９２を参照のこ
と。適切な抗体は、好ましくは、組換えタンパク質およびネイティブタンパク質
に対して等しい結合親和性を有する。

【００２３】 あるいは、抗体を、以下の様式での蛍光サンドイッチアッセイにおいて、結合
対を形成するそれらの能力について評価し得る。ビーズを、ビオチン化抗体（例
えば、抗ウイルスタンパク質抗体）でコーティングし得、次いで、１００μｌ容
量で２ｎｇ／ｍｌの適切なタンパク質（例えば、組換えウイルスタンパク質）と
共に約３０分間インキュベートし得る。これらのビーズを、ＰＢＳ中、１％ Ｆ
ＢＳおよび０．１％ アジ化ナトリウムを含有する２ｍｌの緩衝液で２回洗浄し
た後、これらのビーズを、約０．５μｇのフィコエリトリン標識抗体と共にイン
キュベートする。強い蛍光シグナルを生じる抗体の対は、本発明のアッセイにお
ける使用に適切である。

【００２４】 （固相試薬） 適切な粒子（例えば、ビーズ）は、約２μｍ〜１５μｍの平均直径を有し、そ
して、ポリスチレンであるか、強磁性であるか、または常磁性であり得る。例え
ば、これらの粒子は、約４μｍ〜約１１μｍの平均直径を有し得る。代表的な平
均粒子直径は、約４〜５μｍ、７〜８μｍ、および１０〜１１μｍである。粒子
は、例えば、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｌｉｂｅｒｔｙｖｉｌｌｅ．Ｉ
Ｌから市販されている。粒子は、公知技術によって捕捉抗体でコーティングされ
得る。例えば、アビジンまたはストレプトアビジンでコーティングした常磁性ビ
ーズを、ビオチン化捕捉抗体でコーティングし得る。一般に、アビジンまたはス
トレプトアビジンでコーティングしたビーズを、ビオチン化抗体を飽和状態で混
合した（３．９×１０⁷個の７μｍビーズあたり約４０μｇのタンパク質）生理
食塩水溶液（例えば、ＰＢＳ）に再懸濁させ、そして室温でインキュベートする
。結合が完了した後、ビーズを、例えば、ＰＢＳ中、１％ ＦＢＳおよび０．１
％ アジ化ナトリウムを含有する緩衝液で、洗浄およびブロックする。

【００２５】 核酸結合対を測定する場合、アビジンまたはストレプトアビジンでコーティン
グしたビーズを、ビオチン化核酸に結合させ得る。核酸は、標準的なニックトラ
ンスレーション反応におけるビオチン−１１−ｄＵＴＰの取り込みによって、ビ
オチンで標識され得る。

【００２６】 特定の実施形態において、実質的に全ての捕捉抗体が、粒子上で配向され、そ
の結果、その抗原結合領域は、メンバーＡを結合するために利用可能であり、ア
ッセイの全体の感度を増加する。用語「実質的に全て」とは、少なくとも８０％
、そして好ましくは、少なくとも９０％（例えば、９５％または９９％）の抗体
が、この様式で配向されることを示す。パーセント配向性は、フィコエリトリン
標識ヤギ抗マウス抗体の結合に関連する蛍光を測定し、そして標準化した蛍光粒
子と比較することによって、定量的に推測され得る。抗体の抗原結合領域は、そ
の抗体が、抗原結合領域の直ぐ外側のアミノ酸残基でビオチン化される場合に、
メンバーＡを結合するために利用可能である。従って、抗体のビオチン化におい
て、約５：１〜約１０：１のビオチン：抗体のモル比および他の標準的な反応条
件を使用する。例えば、ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルまた
はビオチンスクシンイミジルエステルを、約８．１のｐＨで使用し得る。あるい
は、ビオチンヒドラジドを、４．５〜５．０のｐＨで使用し得る。

【００２７】 アッセイの感度もまた増加し得る。なぜなら、生物学的サンプルからのメンバ
ーＡの捕捉は、従来のアッセイのように、２００μｌ以下の反応容量に限定され
ないからである。粒子は、磁気的分離または遠心分離のいずれかによって、大量
の生物学的サンプルから容易に収集される。さらに、各々の粒子は、平均して、
１粒子あたり約１８０，０００〜２４０，０００個の抗体結合部位および約３０
０，０００〜３５０，０００個のビオチン化抗原結合部位を含む。従って、各々
の粒子は、抗原の濃度に対して、大きな結合能力および大きな分析効果範囲を有
する。

【００２８】 （検出可能な標識） 各々の標識した抗体は、他の蛍光団と対比する色の光を放出する蛍光団での標
識によって、別々に可視化され得る。例えば、以下の蛍光団の組み合わせを使用
し得る：７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、Ｔｅｘａｓ
Ｒｅｄ^TM（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏ
Ｒ）、５−（および−６−）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、リサミンローダミ
ンＢ、５−（および−６−）−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン−５
−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボ
ン酸、テトラメチルローダミン−５−（および−６−）−イソチオシアネート、
５−（および−６−）−カルボキシテトラメチルローダミン、７−ヒドロキシク
マリン−３−カルボン酸、６−［フルオレセイン５−（および−６−）−カルボ
キサミド］ヘキサン酸、Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボ
ラ−３ａ，４ａジアザ−３−インダセンプロピオン酸、エオシン−５−イソチオ
シアネート、エリトロシン−５−イソチオシアネート、フィコエリトリン（Ｂ−
、Ｒ−またはシアニン−）、アロフィコシアニン、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ^TM およびＣａｓｃａｄｅ^TMブルーアセチルアジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂ
ｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）。

【００２９】 抗体はまた、半導体ナノクリスタルで標識され得る。水溶性ナノクリスタルは
、異なるサイズの、シリカシェル中に封入されたカドミウム−セレン／カドミウ
ム−硫黄コアシェルナノクリスタルまたはメルカプト酢酸に可溶化されたカドミ
ウム−セレン／亜鉛−硫黄ナノクリスタルから作製される。このような水溶性ナ
ノクリスタルは、狭い、整調可能な、対称性の発光スペクトルを有し、そして測
光的に安定である。Ｂｒｕｃｈｅｚ Ｊｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８、２
８１：２０１３−２０１６；およびＣｈａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８、２
８１：２０１６−２０１８を参照のこと。

【００３０】 （複数の抗原および宿主抗体の検出） 標識（例えば、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ^TM（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂ
ｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、フィコエリトリン、およびシアニン−
フィコエリトリン）の組み合わせは、とりわけ、２つの抗原および１つの宿主抗
体を検出するために使用され得る。例えば、ＨＣＶ、ＨＢＶ表面抗原、宿主抗Ｈ
ＣＶ抗体および宿主抗ＨＢＶ表面抗原抗体が、フィコエリトリン標識抗体（ＨＣ
Ｖに対する特異的結合親和性を有する）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ^TM標識抗体
（ＨＢＶ表面抗原に対する特異的結合親和性を有する）、およびシアニン−フィ
コエリトリン標識抗宿主Ｉｇ抗体を使用して、同時に検出され得る。３つの異な
る標識および異なるサイズ（例えば、平均直径７〜８μｍおよび１０〜１１μｍ
）を有する２つの粒子集団を使用して、６つの異なるウイルス抗原および宿主抗
体までが同時に検出されるのを可能にする。異なる平均直径の第３の粒子集団の
使用は、９つの異なるウイルス抗原および宿主抗体までが同時に検出されるのを
可能にする。

【００３１】 一旦個体がセロコンバージョンを生じる（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｔｅｄ）（す
なわち、宿主抗体を発生する）と、ウイルス抗原を、血漿サンプル中で検出する
ことが困難であり得る。なぜなら、そのウイルス粒子上の捕捉抗体またはレポー
ター抗体に対する結合部位が、宿主抗体によってブロックされてしまうからであ
る。本発明は、このアッセイの従来のイムノアッセイ形式を超える改善された感
度に起因して、この困難性を克服する。従って、ウイルス抗原は、従来のイムノ
アッセイ形式が検出し得ない状況下で、本発明の方法を使用して検出され得る。
本明細書中に記載されるように、ウイルス抗原は、このウイルスタンパク質に対
する特異的な結合親和性を有する、モノクローナル抗体でコーティングした粒子
を使用して捕捉され得、そしてそれらの存在は、セロポジティブの個体中のこの
ウイルスタンパク質に対するレポーターモノクローナル抗体で検出され得る。こ
のウイルスタンパク質に対する宿主抗体は、標識ヤギ抗ヒトＩｇによって同時に
検出され得る。宿主抗体を伴わないウイルスタンパク質の検出は、この宿主が、
最近感染され、そしてセロコンバージョンを生じていないことを示し、一方、ウ
イルスタンパク質および宿主抗体の検出は、感染およびセロコンバージョンの存
在を示す。特定のサンプルにおいて、例えば、第１の抗体に対する結合部位が利
用可能でない場合、宿主抗体は検出され得るが、ウイルスタンパク質は検出され
ない。この例において、ウイルスタンパク質は、直接測定されないが、ウイルス
タンパク質は、サンプル中になお存在し、このウイルスタンパク質に対する抗体
をコーティングした捕捉ビーズが、ウイルス抗原および宿主抗体の免疫複合体を
捕捉する。

【００３２】 本発明は、以下の実施例においてさらに記載され、これらの実施例は、特許請
求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。

【００３３】 （実施例） （実施例１−タンパク質のビオチン化）：抗体を、５ｍｇ／ｍｌの濃度で結合
体化させ；ウイルス抗原を、１ｍｇ／ｍｌの濃度で結合体化させた。抗ウイルス
タンパク質抗体およびウイルス抗原をビオチン標識するために、これらのタンパ
ク質を、適切なサイズのＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ａｍｉｃｏｎ）フィルターを使用
して、１００ｍＭ ＫＨ₂ＣＯ₃緩衝液（ｐＨ８．３）中に交換した。

【００３４】 ＤＭＳＯ（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，Ｃａｔ．＃Ｄ８７７９）中のビオチンＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミジルエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ
）を、使用直前に調製し、そして５：１または１０：１のモル比でビオチン化す
るタンパク質に加えた。このタンパク質溶液を軽くボルテックスし、そしてこの
ビオチン／ＤＭＳＯをこのタンパク質溶液に添加し、そして激しく混合すること
によって、反応させた。タンパク質およびビオチンエステルを、暗所中、室温に
て１時間反応させた。結合体化された抗体を、１×ＰＢＳを溶出に使用する、１
０ｍｌ Ｓｅｐｈａｄｅｘ−２５ゲルカラムまたはスピンカラム上での分離によ
って、遊離ビオチンから分離した。個々の１ｍｌ画分を収集し、Ａ２８０ｎｍで
の吸光度を測定した。Ａ２８０の初期ピークを示す画分を、収集およびプールし
、残りの画分（第２のＡ２８０ピークを示す画分を含む）を廃棄した。

【００３５】 スピンカラムを使用する場合、反応混合物を、４つのスピンカラム間で均等に
分配し、そしてＳｅｒｏｆｕｇｅ遠心分離機を使用して高速で２分間スピンした
。カラムを通過する物質を収集し、そしてカラムを、１×ＰＢＳをカラムに充填
しそしてＳｅｒｏｆｕｇｅにおいて高速で２分間スピンして、これを５回繰り返
すことによって、洗浄した。収集した物質を、４つのカラム間で均等に再分配し
、次いで、Ｓｅｒｏｆｕｇｅ遠心分離機を使用して高速で２分間スピンした。カ
ラムを通過する物質を、収集し、プールし、そしてＡ２８０について再分析し、
そして濃度を決定した。結合体化されたタンパク質を、４℃で保存した。

【００３６】 （実施例２−分析物捕捉ビーズの生成）：分析物捕捉ビーズを、十分に混合す
ることによってアビジンコーティングした常磁性ビーズ（７μｍ、Ｓｐｈｅｒｏ
ｔｅｃｈ，ＶＭ−６０−１００）を十分に再懸濁することにより、調製した。ビ
ーズ（代表的に、３．８×１０⁶個のビーズ）を、５０ｍｌの遠心分離チューブ
に置き、そして３０ｍｌの１×ＰＢＳと混合させた。磁石によってチューブの側
面にビーズを保持させた後、全ＰＢＳを除去した。ビーズを、ＰＢＳでさらに２
回洗浄した。

【００３７】 最後のＰＢＳ洗浄後、必要量のビオチン化抗体（代表的に、４０μｇ）および
２ｍｌの１×ＰＢＳを、ビーズに添加した。ビーズを、最小３時間、連続的にボ
ルテックスするか、または１時間ボルテックスし、次いで４℃で一晩保存するこ
とによって、再懸濁させた。一晩保存したビーズを、翌朝さらに２時間ボルテッ
クスした。ＰＢＳ中１％ ＦＢＳおよび０．１％ ＮａＮ₃を含有する約３０ｍ
ｌの緩衝液を使用して、結合体化されたビーズを３回洗浄した。ビーズを、１９
．２５ｍｌの同緩衝液で再懸濁し、そして使用時まで４℃で保存した。

【００３８】 抗体を、フルオレセイン誘導体Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ^TM（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で標識するために、抗体を、５ｍｇ
／ｍｌの濃度で１００ｍＭ ＫＨ₂ＣＯ₃緩衝液（ｐＨ９．０）中に交換した。Ｏ
ｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ^TM（ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中１０ｍｇ／ｍｌ
）を、２５：１のモル比で抗体に添加し、暗所中、室温で１時間インキュベート
した。遊離のＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ^TMをＧ−２５ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム
上で抗体から分離した。Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ，Ｉｎｔｅｒｇｅｎ Ｂｉ
ｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｐｕｒｃｈａｓｅ，ＮＹ）およびシアニンフィコエ
リトリン（Ｃｙ５ＰＥ）の結合体を、２−イミノチオラン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を１６２５：１のモル比で使
用して生成し、その抗体を改変するために、２０：１のモル比で蛍光色素および
スルホＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ）を改変した。改変した蛍光色素および抗体を、
暗所中、室温で１時間、一緒にインキュベートした。遊離の蛍光色素および抗体
を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００−ＨＲカラム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）上で、蛍光色素結合体化抗体から分離
した。アフィニティー精製し、そしてマウス抗体、ウマ抗体、ウシ抗体、ラット
抗体およびウサギ抗体に対して吸収させたヤギＦ（ａｂ’）₂抗ヒトＩｇ抗血清
（重鎖および軽鎖特異的）を、ＰＥまたはＣｙ５−ＰＥで標識した。タンパク質
に対する蛍光色素の比を変更して、特定の抗体またはウイルス抗原についての蛍
光シグナルを最適化し得る。

【００３９】 （実施例３−ウイルス抗原および宿主抗体の検出）：正常個体およびＨＣＶ、
ＨＩＶまたはＨＢＶに対して陽性の個体由来の血漿サンプルを、Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＮＹ）、Ｓｃａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｓａｎｔｅｅ，ＣＡ）、またはＩｎｔｅ
ｒｇｅｎ ＢｉｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｐｕｒｃｈａｓｅ，ＮＹ）から得た
。試験前に、血漿サンプルを、最終濃度０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ界面活性剤
で処理し、ウイルス膜を溶解し、そしてコア粒子を露出させた。Ｅ．ｃｏｌｉ由
来の組換えウイルス抗原（表面抗原およびコア抗原を含む）を、ＢｉｏｓＰａｃ
ｉｆｉｃ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）またはＩｎｔｅｒｇｅｎ ＢｉｏＤｉ
ａｇｎｏｓｔｉｃｓから得た。抗原を、正常な非病的血清サンプルに添加し、参
照標準曲線を作成し、そしてスパイク（ｓｐｉｋｅ）および回復分析に使用した
。

【００４０】 フローサイトメトリー分析を、ビーズ集団をゲートするために、直線の前方
対 側方の光散乱を使用する、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＥＰＩＣＳ Ｐｒｏｆｉｌｅ
ＩＩ、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＸＬまたはＰａｒｔｅｃ ＰＡＳフローサイトメーター
上で行った。蛍光シグナルを、対数的に増幅させた。蛍光放出を、光学フィルタ
ーによって別個の色に分離した。５２５ｎｍのバンドパスフィルターを使用して
、緑色の蛍光（Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎおよびＦＩＴＣ）を収集し、５６５ｎ
ｍのバンドパスフィルターを使用して、オレンジ色の蛍光（ＰＥ）を収集し、そ
して６３０ｎｍのロングパスフィルターを使用して、赤色の蛍光（Ｃｙ５ＰＥ）
を収集した。

【００４１】 サンプルを、ＰＥ標識およびＣｙ５ＰＥ標識Ｆ（ａｂ’）₂ヤギ抗ヒトＩｇ（
重鎖および軽鎖特異的）抗体と共にインキュベートした。各場合において、宿主
抗ウイルス抗体を、捕捉された抗原を有するビーズ上で検出し、そして正常サン
プルまたは異なるウイルス由来のビーズ上で検出されなかった。ＨＢＶ表面抗原
および抗ＨＢＶ抗体、ならびにＨＣＶコア抗原および抗ＨＣＶ抗体を、ＰＥ標識
抗体（ＨＣＶコア抗原に対する特異的結合親和性を有する）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇ
ｒｅｅｎ標識抗体（ＨＢＶ表面抗原に対する特異的結合親和性を有する）、およ
びＣｙ５ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇ抗体を使用して検出した。図２Ａ〜２Ｈに示さ
れるように、ＨＣＶ、ＨＢＶおよび宿主抗体の個々および同時の検出が、可能で
あった。

【００４２】 （他の実施形態） 本発明を、その詳細な説明と共に記載したが、この前述の説明が、例示であっ
て、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲を限定することが意図され
ないことが理解される。他の局面、利点および改変は、上記の特許請求の範囲内
にある。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、メンバーＡおよび宿主抗メンバーＡ抗体（メンバーＢ）を検出するた
めのアッセイの模式図である。

【図２】 図２Ａ〜図２Ｈは、フローサイトメトリーによるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ
）表面抗原、抗ＨＢＶ宿主抗体、ＨＣＶコア抗原および抗ＨＣＶ宿主抗体の同時
検出を示す散布図である。図２Ａは、正常サンプル中のＨＢＶ抗原および抗体で
ある。図２Ｂは、正常サンプル中のＨＣＶ抗原および抗体である。図２Ｃは、Ｈ
ＢＶポジティブサンプル中のＨＢＶ抗原および抗体である。図２Ｄは、ＨＢＶポ
ジティブサンプル中のＨＣＶ抗原および抗体である。図２Ｅは、ＨＣＶポジティ
ブサンプル中のＨＢＶ抗原および抗体である。図２Ｆは、ＨＣＶポジティブサン
プル中のＨＣＶ抗原および抗体である。図２Ｇは、ＨＢＶポジティブ／ＨＣＶポ
ジティブサンプル中のＨＢＶ抗原および抗体である。図２Ｈは、ＨＢＶポジティ
ブ／ＨＣＶポジティブサンプル中のＨＣＶ抗原および抗体である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ Ｈ 33/573 33/573 Ａ 33/576 33/576 Ｂ Ｚ 33/577 33/577 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生物学的サンプルにおける結合対の両方のメンバーＡおよび
   Ｂを同時に測定するための方法であって、該方法は、以下： ａ）固相試薬を提供する工程であって、該固相試薬は、捕捉抗体でコーティン
   グされた粒子を含み、該捕捉抗体は、該結合対の該メンバーＡに対して特異的な
   結合親和性を有する、工程； ｂ）該メンバーＡが、存在する場合には、該粒子と結合して第１の反応粒子を
   形成する条件下で、該生物学的サンプルを該固相試薬に接触させる工程； ｃ）該第１の反応粒子を、該メンバーＡに対して特異的な結合親和性を有する
   第１の抗体と、および該結合対の該メンバーＢに対して特異的な結合親和性を有
   する第２の抗体と接触させて、第２の反応粒子を形成する工程であって、ここで
   、該第１の抗体が第１の標識で標識されており、そして該第２の抗体が第２の標
   識で標識されている、工程；ならびに ｄ）該第２の反応粒子上の該第１および第２の標識を、フローサイトメトリー
   を使用して測定する工程、 を包含する、方法。
2. 【請求項２】 前記捕捉抗体の抗原結合領域が、前記結合対の前記メンバー
   Ａを結合するために利用可能であるように、実質的に全ての該捕捉抗体が前記粒
   子上で配向される、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記メンバーＡが抗原であり、そして前記メンバーＢが宿主
   抗体である、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記抗原がウイルス抗原である、請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記ウイルス抗原がＣ型肝炎抗原である、請求項４に記載の
   方法。
6. 【請求項６】 前記ウイルス抗原がＢ型肝炎抗原である、請求項４に記載の
   方法。
7. 【請求項７】 前記ウイルス抗原がヒト免疫不全ウイルス抗原である、請求
   項４に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記抗原が自己抗原である、請求項１に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記自己抗原がグルタミン酸デカルボキシラーゼである、請
   求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記メンバーＡがリガンドであり、そして前記メンバーＢ
    がレセプターである、請求項１に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記リガンドがサイトカインであり、そして前記レセプタ
    ーがサイトカインレセプターである、請求項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記メンバーＡが酵素であり、そして前記メンバーＢが基
    質である、請求項１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記酵素がカスパーゼ−３であり、そして前記基質がポリ
    （ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼである、請求項１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記酵素がカスパーゼ−１であり、そして前記基質がプロ
    インターロイキン−１である、請求項１２に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記第１および第２の標識が蛍光団である、請求項１に記
    載の方法。
16. 【請求項１６】 前記生物学的サンプルが、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄
    液、痰、涙、羊水、硝子体液、唾液、および組織培養上清からなる群より選択さ
    れる、請求項１に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記捕捉抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記
    載の方法。
18. 【請求項１８】 前記第１の抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に
    記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記第２の抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に
    記載の方法。
20. 【請求項２０】 生物学的サンプルにおける結合対の両方のメンバーＡおよ
    びＢを同時に測定するためのキットであって、該キットは、以下： ａ）固相試薬であって、該固相試薬は、該結合対の該メンバーＡに対して特異
    的な結合親和性を有する捕捉抗体でコーティングされた粒子を含み、ここで、該
    捕捉抗体の抗原結合領域が、該結合対の該メンバーＡを結合するために利用可能
    であるように、実質的に全ての該捕捉抗体が該粒子上で配向される、固相試薬； ｂ）該結合対の該メンバーＡに対して特異的な結合親和性を有する、第１の抗
    体であって、ここで、該第１の抗体が、第１の標識で標識されている、第１の抗
    体；および ｃ）該結合対の該メンバーＢに対して特異的な結合親和性を有する、第２の抗
    体であって、ここで、該第２の抗体が、第２の標識で標識されている、第２の抗
    体、 を備える、キット。
21. 【請求項２１】 前記キットが、ラベルまたはパッケージ挿入物をさらに備
    え、ここで、前記固相試薬、前記第１の抗体、および前記第２の抗体が、フロー
    サイトメトリーによって、生物学的サンプルにおける結合対の両方のメンバーＡ
    およびＢを同時に測定するために使用され得ることを、該ラベルまたはパッケー
    ジ挿入物が示す、請求項２０に記載のキット。