JPH03206960A - 不均一系イムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 不均一系イムノアッセイは、非標識結合試薬から標識結
合試薬の分離を可能にする手段を要求する。多くの場合
、特異的結合リガンドまたは受容体が結合する表向が与
えられる。これまで様々な表面が用いられてきた。たと
えば、濾過できるラテックス粒ｆ、通常プラスチックで
アッセイ混合物の容器ともなるチューブまたはウエル、
磁場勾配中′Ｃ分離できる磁性粒子、遠心分離で分離さ
れるかまたはクロ７トグラフィーの静止相として用いら
れる不溶性ボリマー、試薬を濾過できまた毛ｍ管作用で
移送できるセルロースまたは万ラス濾紙のような吸水性
材料である。

米国特許第４．６５９．６７８号には、ハプテンでａ識
された抗体が液体メジウム中の被験物質と複合体を形成
させてイムノアッセイを行う方法が記載されているａ複
合体は、ハプテンに対する抗体が結合する固体支持体に
結合する。結合したサンプルの検出は、放射性ヨード、
蛍光体または酵素のような試薬で標識された被験物質に
対する第二の抗体を用いて行われる。

米国特許第４．２９８．６８５号にシよ、酵素に共有結
合させた抗原、ビオチン化抗原およびアビジンで」一ト
した表面を用いる検定方法が記載されている。診断的検
定に適した競合的イムノアッセイ系であると述べられて
いる。

ヨーロッパ特許出願第０　　２０１　　０７９号には、
ビオチンが結合した第一の抗体、検出可能な標識に結合
した第二の抗体、および固体支持体に付看したどオチン
に対する結合′＃Ｊ質を用いるサンドインチイムノアツ
セイが記載ざれている。

米国特許第４，２２８．２３７号には、酢素標１アビジ
ンとビオチン標識試薬を用いる液体メジウム中のリガン
ドの存在の測定方法が記載されている．，得られたＷ＃
索活性が｝ｔンプル中に存在するリガンドの量に相関す
る。

英国特許出願第２　　０８４　　３１７号には、ハプテ
ンまたはアビジンに対する抗体でコートした固体表面、
抗原−ハグテンまたは抗原〜ビオチン接合体、抗原に対
する可溶性抗体、および抗体に対する酵素標識抗体を用
いる抗原の競合的イムノアッセイが記載されている。

米国特許第４，７８０，４２３号には、制御ざれた細孔
ガラス粒子を用いる不均一系アッセイが記載ざれている
。この制御された細孔ガラスビーズはリガンドに結合で
きる特異的結合パートナーの支持体として蛍光イムノア
ッセイに使用されている。この発明に用いられているよ
うに、ガラス粒子は興味ある複合体を結合し、その検出
は蛍光ブロープを用い（達成される。蛍光の測定はガラ
ス粒子の存在下に行なわれる。

磁性粒子やガラスビーズのような固体粒子が免疫検定法
の支持体として有用なことはよく知られている。このよ
うな検定の例としては、米国特許第４．７７７，１４５
号に記載されている蛍光イムノアツセイにおける固体支
持体としての磁性粒子の使用がある。イムノアフイニテ
ィーク口マトグラフィーにおけるアビジンでコートざれ
たガラスビーズの使用、およびアビジンでコートされた
ビーズの製造方法は、Ｂａｂａｓｈａｋ，　Ｊ．　Ｖ．
　＆　Ｔ．　ＨＰｈｉｌｌｉｐｓ：Ｊ．　Ｃｈｒｏｍａ
ｔｏｇｒ．，　４　４　４　：　２　１　，　１　９８
８に記載されている。

本発明は、高い適用能、迅速な結合と、遠心分離や慣用
の濾過を行うことなく不均一系イムノアツセイの静止相
の便利な洗浄が可能な本発明の改良方法を用いて様々な
不均一系イムノアツセイを行う手段を提供するものであ
る。

隻３』Ｌ４Ｌ イムノアッセイにおける表面結合成分を液体メジウムΦ
に溶解または懸濁した成分から分＠するにあたり、固体
支持体が結合のｔこめの表ｌｔｎを与え、液体メジウム
は反も容器に挿入されたチューブを介して吸引により支
持体から分離される方法を捉供寸る。支持体にはその表
面に多くの特異的結合対（ＳｂＣｌ）のメンバー、通粛
は受容体を付看させ、これが相補性ｓｂｐメンバー、通
常は小分子に結合し、ついでこれが被験物質に結合可能
な試薬と結合する。分離には、標識に接合して液体メジ
ウム中に存在する小分子に対する受容体の、支持体に結
合した同じ受容体接合体からの分離が包含ざれる。

本発明の−態様は、被ｌ！？ｌＩ質のイムノアツセイを
実施するにあたり、■被験物質の含有が疑われるサンプ
ルと、被験物質の検出に有用な複数の試薬、ひとつは支
持体をひとつはＹＡＲを包含する試薬をアツセイメジウ
ムに取り、０メジウムと支持体を分離し、Ｏメジウムま
たは支持体について標識の存在または量を観察すること
からなる方法である。標識の存在または辱はナンブル中
の被験物質の存在または唾に相関する。方法の改良は、
２種の試薬として、第一および第二の接合体を用い、そ
れぞれは特異的結合対（ｓｂ−ｐ）メンバーからなりそ
れらはアッセイメジウム中で互いに他のｓｐｂメンバー
と相補性であって、その各メンバーは小分子に結合し、
この小分子は各接合体で互いに異なる改良方法である。

本発明の他の煕様は、被験物質のイムノアッセイを実施
するにあたり、水性メジウム中に（１）被験物質に対す
る受容体と被験物質の類縁体からなる第一の特異的結合
対（ｓｂｐ）のメンバーに結合した第一の小分子、（２
）第一の小分子に対する第一の受容体に結合した標識、
（３）被験物質の含有が疑われるサンプル、（４）被験
物質または第一のｓｂｐのメンバーに相補性″ｒ−Ｘに
結合した第二のｓｂｐのメンバー（Ｘは第二の小分子（
Ｚ）または第二の小分子に対する第二の受容体（抗一ｌ
）である）、および（５）Ｙに結合した支持体（ＹはＺ
または抗Ｚｔ−あり、Ｙは×とは実質的に異なる〉を混
合する方法である。ついでメジウムと支持体を分離し、
メジウムまたは支持体のいずれかについて、標識の存在
または罎を観察する。標諜の存在または階はナンブルΦ
の被ＩＩ物質の存在または量に相関・Ｆる。

本発明のさらに他の態様は、イムノアツセイを実施する
にあたり、水性メジウム中に、（１）第一の小分子と、
（１）被験物質（ｄ）に相補性の第一の待異的結合対（
ｓｂｐ）メンバーまたは（ｉｉ）被験物質の類縁体との
接合体（　Ｃ　１　）　、ｆ２１被験物質の含有が疑わ
れるナンブル、（３）第二の小分子と、被験物質に相補
性の第二のｓｂｐメンバーまたは被験物質の類縁体との
接合体（Ｃ３）を混合する方法（ただしこの場合、Ｃ１
およびＣ３の少なくとも一方は、被験物質に相浦性のｓ
ｂｐメンバーを含有する）を混合する方法である。この
水性メジウムを、（１）〜（３）の試薬と同時にまたは
試薬の混合物をインキユベーシヨンしたのち、第二の小
分子に対する第二の受容体に結合した支持体（Ｓ）と、
接合体（Ｃ１〉を含む複合体が支持体にサンプル中の被
験物質の存在の関数として結合する条件下に混合する１
，メジウムと支持体をインキュベートし、ついで分離し
、８ｌ識と第一の小分子に対する第一の受容体との接合
体（Ｃ２）が水性メジウム中に存在しない場合にはその
接合体（Ｃ２）の溶液を支持体と混合する。ついで支持
体につ（／Ｍ（、通常は接合体（Ｃ２）の溶液から分離
したのち、標識の存在または頃を観察する。

本発明のさらに他の態様は、サンプル中の被験物質の検
出のためのイムノアツセイを行うにあたり、水性メジウ
ム中に（１）第一の小分と被験物質の類縁体との接合体
（Ｃ’ｌ）、（２）被験物質の含有が疑われるサンプル
、（３）第二の小分子と被験物質のひとつに相補性の抗
体との接合体（Ｃ’　　３）、および（４）標識と小分
子の一方に相補性の抗体との接合体（Ｃ’　　２）を混
合するものである。試薬は、水性メジウムおよび、接合
体（Ｃ’　２）の抗体に相補性ではない他方の小分子に
対する受容体に結合した支持体と同時に、１！識を有す
る複合体がサンプル中に存在する被験物質の量に逆相関
して支持体の表面に結合する条件下に混合する。メジウ
ムと支持体を分離し、メジウムまたは支持体について！
ｊＡ識の存在または頃を観察する。

本発明の他の態様においては、サンプル中にその存在が
疑われる七ノエピトーブ抗原を検出するにあたり、サン
プル中の抗県の量に逆相関する関係で、次の形の複合体
、 （１）ａｍ−Ａｂ　　：　Ｆ−Ａｂ７、，−テン：ハ７
ｙント −Ｘ：Ｙ一支持体または （２）標識−Ａｂ：Ｆ−ハプテン：Ａｂ，、ブテンＥ Ｘ：Ｙ一支持体 （式中、標識一八ｂＦは標識に結合した第一の小分子（
「）に対する抗体であり、Ｆ−ハプテンおよびハプテン
ーＸは抗原の類縁体に結合した小分子（ＦまたはＸ）で
あり、Ａｂ，、アヶアーＸおよびＦ−Ａｂ，、プテアは
抗−ハプテン抗体と第二の小分子（Ｘまたはド）の接合
体であり、Ｙ一支持体は支持体に結合した受容体である
）を形或させる工程からなる７ツセイである〇 本発明のさらに他の態様は、サンプル中の抗体被験物質
（ｄ）の検出のためのアッヒイを行うにあたり、（１）
第一の小分子と抗体被験物質に相補性の抗体または抗体
被験物質に対する抗原との接合体＜Ｃ″１　）　、＋２
）標謙と第一の小分子に対する第一の受容体との接合体
〈Ｃ“２　）　、＋３１抗体被験物質の含有が疑われる
サンプル、（４）抗体被験物質に相補性の第二の抗体ま
たは抗体被験物質に対する抗原と第二の小分子との接合
体（Ｃ″３）を水性メジウム中に混合する方法である。

水性メジウム中の試薬は同時にまたはインキュベーショ
ン後に、第二の小分子に対する第二の受容体に結合した
支持体（Ｓ）と、標識を含む複合体がサンプル中の被験
物質の存在の関数として支持体の表面に結合する条件下
に混合する。試薬の混合後、メジウムを支持体から分離
し、メジウムまたは支持体のいずれかについて、サンプ
ル中の抗体の存在または量に関連する標識の存在または
量を観察する。

本発明のさらに他のＢ様は、式 Ｅ−Ａｂ　　：Ｆ−ハプテン：Ａｂ７、ブテンーＸ：Ｆ Ｙ一支持体 く式中、Ｅ−ＡｂＦは酵素に結合した抗−フルオレセイ
ン抗体であり、「：−ハグテンはフルオレセイン結合ハ
プテンであり、Ａｂ　　　−、−ＸはビハブＴノ オチンに結合した抗一ハプテン抗体であり、Ｙ支持体は
支持体に結合したアビジンである〉で示ざれる組成物に
関する。

本発明の他の態様においては、サンプル中に存在するハ
プテンの検出にあたり、複合体ＷＡ識一Ａｂ　　：Ｆ−
ハプテン：Ａｂ７、ブテンーＦ Ｘ：Ｙ一支持体 （式中、標識一八ｂＦは酵素に結合した抗−フルオレセ
イン抗体であり、Ｆ−ハプテンはフルオレセイン結合ハ
プテンであり、Ａｂ　　　　−−Ｘはハプテノ ビオチンに結合した抗−ハプテン抗体であり、Ｙ−支持
体は支持体に結合したアジビンである）を形或させる工
程からなるアッセイである。

本発明のさらに他の態様は、次の形 ＋ｌ）Ｅ−Ａｂ　　　　：ｒ−Ａｂ：Ａｂ：ＡＱ−Ｘ：
ＹＦ 一支持体 または ｆ２＋　　　１ハプテン−Ａｂ　　　：Ｆ−Ａｇ　：Ａ
ｂ：Ａｂ−Ｘ：Ｆ Ｙ一支持体 （式中、Ｅ−ＡｂＦは酵素に結合した第一の小分子に対
寸る抗体であり、Ｆ−ＡｑおよびＦ−Ａｂはそれぞれ、
サンプル中に存在する抗体に相補性の抗原、および免疫
グロブリンに対する抗体に結合した第一の小分子（Ｆ）
であり、Ａｂはサンブル中に存在する抗体であり、Ａｂ
−ＸおよびＡｇＸはサンプル中の抗体に相補性の抗体お
よび抗原に結合した第二の小分子（Ｘ）であり、Ｙ一支
持体は支持体に結合したアビジンである）を有する組或
物に関する。

本発明のさらに他の態様は、式 Ｅ−Ａｂ　　：Ｆ−Ａｂ，：Ａ：Ａｂ２−ＸＦ （式中、Ｅ−ＡｂＦは酵素に結合した抗一Ｆ！ｉｔ体で
あって、Ｆは第一の小分子であり、Ｆ−Ａｋ）１は第一
の抗体に結合した上記第一の小分子（Ｆ）であり、Ａｂ
２−Ｘは第二の小分子に結合した第二の抗体である）で
示される組戒物に関する。

本発明の他の態様は、被験物質のイムノアツセイを行う
ためのキッドであり、（ａ）第一の小分子と？ｌ１験？
ｌ貢に相補性の第−・のｓｂｐメンバーとの接合体、０
第二の小分子と上記被験物質の類縁体であるかまたはそ
の被＃物質に相補性の第二のｓｂｐメンバーとの接合体
、０上記小分子の一方に対する受容体と酵素の接合体、
０その酵素に対する基質、および（ｅ）他方の小分子に
対する受容体に結合した表面からなる支持体をパッケー
ジした形態のキットに関する。

発明の詳細な記゛ 本発明は、既知のイムノアッセイよりも多目的に使用で
きて便利なイムノアツセイ法を提供する。

本発明はとくに、分離工程を必要とするサンプル中の被
験物質のアツセイに応用できる。

本発明の特定の態様についてさらに説明を進める前に、
多くの用語について定義する。

「被験物質」は、興味ある材料であるサンプル中の測定
すべき化合物または組或物を意味する。

被験物質は特異的結合体（ｓｂｐ）のメンバーであり、
リガンドであってもよく、１ｌＩｉｉまたは多価、通常
抗原性またはハプテン性で、単一の化合物であるかまた
は少なくとも１似の共通のエピトーブまたは杭隙決定部
位を有する複数個の化合物である。被験物質は粒子の成
分であってもよく、またアッセイ時に粒子に結合しても
よい。粒子の戒分である被験物質の例としては、細胞表
面上の抗原、たとえば血液型抗［　（Ａ，１３．ＡＢ．
０．Ｄ等）または口ＬＡ抗原がある。被験物質が粒子に
結合する場合に生じる結合は、特異的または非特異的、
免疫学的または非免疫学的結合であってよい。

多価リガンド被験物質は通常、ポリ（７ミノ酸）すなわ
ちポリベプチドおよび蛋白質、多糖、核酸、ならびにそ
れらの組合せである。このような組合せには、細菌、ウ
イルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞膜
等が包含される。

多くの場合、本発明に用いられる多エビトーブリガンド
被験物質は、少なくとも約５．０００，通常は少なくと
も約ｉｏ．ｏｏｏの分子量を有する。ボリ（アミノ酸）
の範喘では、興味のあるポリ（アミノｍｌ）は一般に、
分子量約５，０００〜５，０００，０００、さらに通常
には約２０．０ＯＯ〜１，０００，０００であり、興味
のあるボルヒンの場合は、分子量は通常約５．０００〜
６ｏ，ｏｏｏの範囲である。

広範囲の蛋白質類、類似の構造的特徴を有づる蛋白質群
、特定の生物学的機能を有する蛋白質群、特定の微生物
とくに病原微生物に関連する蛋白質群等が考慮される。

モノエビトーブリガンド被験物質は、一・般に分ｆａ約
１００〜２，０００、さらに通常では分子量１２５〜１
．０００である。興味ある被験物質には、薬剤、代謝物
、有害生物殺滅剤、汚染物質等が包含される。興味ある
薬剤にはアルカロイドが包含される。アルカロイドとし
ては、モルフイン、］デイン、ヘロイン、デキストロメ
トロファン、それらの誘導体および代謝物を包含するモ
ルフィンアルカロイド、コカインおよびペンゾイルエク
ゴニン、それらの誘導体ならびに代謝物を包含する］カ
インアノレカロイド、リゼノレグ酸ジエチノレアミドを
含むエノレゴットアノレ力ロイド、ステロイドアノレカ
ロイド、イミナゾイノレアノレ力ロイド、キナゾリンア
ノレカｎイド、イソキノリン７ノレカロイド、キニンお
よび午二ジンを含むキノリンアルカロイド、ジテＪレベ
ンアノレ力［１イド、それらの誘導体ならびに代謝物が
ある。

次の薬剤群にはステロイド、たとえばエステロジエン、
アンドロジエン、アンドロコーヂカノレステロイド、胆
汁酸、強心グリコシドおよびアグリコンがあり、ジゴキ
シンおよびジゴキシゲニン、サポニンおよびサポゲニン
、それらの誘導体および代謝物が包含される。また、ジ
エチルスチルベストロールのようなステロイド様作用物
質も含まれる。

次の薬剤群は、５〜６員環を有するラクタム類であり、
バルビツール酸たとえばフエノバルビタールおよびセコ
バルビタール、ジフエニルヒダントイン、ブリミドン、
エトスキシミド、ならびにそれらの誘導体が包含される
。

次の薬剤群は、２〜３１１！！の炭素原子を有するアル
キル基をもつアミノアルキルベンゼン類であり、オキナ
ゼパム、クロルブロマジン、テグレトール、イミブラミ
ン、それらの誘導体および代謝物が含まれ、この場合、
巽項環はアゼビン、ジアゼピンおよびフエノチ７ジン類
である。

次の薬剤群はプリンであり、テオフイリン、カフェイン
、それらの代謝物および誘′ａ体が包含される。

次の薬剤群はマリハナから誘導される化合物であり、カ
ンナビノーノレおよびｔトラヒドロカンナビノールが包
含される。

次の薬剤群はビタミンを包含し、これにはＡ．Ｂたとえ
ばＢ，Ｃ，Ｄ．ＥおよびＫ１葉酸チア１２ ミンが含まれる。

次の薬剤群はプロスタグランジン類であり、これらはヒ
ドロキシル化および不飽和結合の数および位置による多
様な化合物を含んでいる。

次の薬剤群は抗生物質であり、ペニシリン、クロロマイ
セチン、アクチノマイセチン、テトラサイクリン、テラ
７イシン、それらの代謝物および誘導体が包含される。

次の薬剤群はヌクレオシドおよびヌクレオチドであり、
ＡＴＰ．ＮＡＤ、Ｆ　Ｍ　Ｎ、７デノシン、グ７ノシン
、チミジンおよびシチジン、ならびにそれらの適当な糖
およびリン酸置換体が包含される。

次の薬剤群、その他の個々の薬剤であり、たとえばメサ
ドン、メプ口バメート、セロトニン、メペリジン、アミ
トリブチリン、ノルトリブチリン、リドカイン、プロ力
インアミド、アセチルブロ力インアミド、プロブラノロ
ール、グリセオフルビン、バルブロ酸、プチロフエノン
類、抗ヒスタミン剤、アトロビンのような抗コリン剤、
それらの代謝物および誘導体が包含ざれる。

病態に関連した代謝物には、スペルミン、ガラクトース
、ノエニルビルビン酸、およびボルフイリンエ型がある
。

次の薬剤群はアミノグリコシドであり、たとえばゲンタ
マイシン、カナマイシン、トブラマイシン、およびアミ
力シンが包含される。

興味ある有害生物殺滅剤としては、ポリハロゲン化ビフ
ェニル、リン酸エステル、チオリン酸工ステノレ、カノ
レバメート、ボリハ１」ゲン化スノレフエンアミド、そ
れらの代謝物Ｊ３よび誘導体がある。

受容体被験物質については、分子屡は一般に１ｏ．ｏｏ
ｏ〜２×１０８、通常は１０．０００〜１０６の範囲で
ある。免疫グロブリン、Ｉ　ｇＡ．ｆｑＧ，ＩｑＥおよ
びＩｇＭについては、分子量は一般に約１６０，０００
から約１０６の問を変動する。酵素は、通常約ｉｏ，ｏ
ｏｏ〜１．０００，０００の範囲の分子量を有する。天
然の受容体は広範囲に変動し、一般的には少なくとも約
２５．０００の分子遥を有するが１０６またはそれ以上
の場合もある。これらの物質には、たとえば、アビジン
、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ｆイロキシン結合グロプリン、サイ
ロキシン結合プレアルブミン、トランスコルチン等が包
含される。

特異的結合対のメンバー（ｓｂｐメンバー）とは、他の
分子の特定の空間および極性機構に特異的に結合し、そ
れに対して相補性と定義される領域を表面上または空洞
内に有する１種または２種の異なる分子を意味する。特
異的結合対のメンバ一はリガントおよび受容体（抗リガ
ンド）と呼ばれることもある。これらは通常、免疫学的
ベア、たとえば抗原一抗体であるが、他の免疫学的ベア
ではない特異的結合対、たとえばビオチンーアビジン、
ホルモンーホルモン受容体、ＩＱＧ−プロテインＡ等も
本発明に包含される。

「リガンド」は、受容体が天然に存在するかまたは製造
できる任意の有機化合物を意味する。

「受容体」は、分子の特定の空間および極性機構、たと
えばエビトープまたは抗原決定部位を認識できる任意の
化合物または組或物を意味する。

受容体の例には、天然の受容体たとえばサイロキシン結
合グロプリン、抗体、酵素、Ｆａｂフラグメント、レク
チン、プロテインＡ、補体或分ＣＩｑ等がある。

「ハプテン」は分子量１００〜１，０００．０００また
はそれ以上、通常は１００〜２．０００のリガンドであ
り、相補性ｓｂｐメンバー、抗体または他の受容体のい
ずれかに結合でき、この場合リガンドは、被験物質とは
少なくとも小分子への結合の存在に上って異なり、ｓｂ
ｐメンバーへの結合に際し液験物質とＢ合できる被験物
質類縁体である。ハプテンの例としては、ビタミンＢ１
２、葉酸、ジゴキシン、サイロキシノン等の誘導体を挙
げることができる。これらのハプテンに相当寸るｓｂｐ
メンバーの例としては、それぞれ内因ｆ、葉酸結合蛋白
質、抗一ジゴキシン抗体および抗サイロキシン抗体があ
る。ハプテンの語はまた、甲状腺結合グｂブリン、アル
ブミン、免疫グロブリン等のような高分子逢リガンドに
も、とくに相当する被験物質がサンプル中に比較的高濃
度に存在することが期待される場合、リガンドがｓｂｐ
メンバーとの結合で被験物質と競合できることを条件に
、適用されるものである。

「支持体」は任意の多孔性または多孔性でない表面を意
味する。代表的な支持体表面としては、ガラスまたはプ
ラスチックビーズ、ラテックスまたはセルロース粒子、
ガラスまたはセルロース濾紙、ニトロセルロース膜、ボ
リスチレンプレート、磁性粒子、プラスチックチューブ
または容器等を挙げることができる。支持体は、ｓｂｐ
メンバーが非拡散的に結合可能で、リガンドメジウムに
溶解せずまた悪影警を与えない任意の便利な材料で製造
できる。支持体は通常、ボリスチレン、ポリカルボネー
ト、ポリ７クリレート、ポリ塩化ビニル，ポリウレタン
、テフロン等のようなプラスチックであり、またｒｋＳ
Ｓ、ニッケル、銅、金のような金属性材料でもよく、ま
た好ましくは、たとえば石英、ノＪラス等を含めたセラ
ミックである。支持体がビーズのマトリックスである場
合は、ビーズは通常、所定のほぼ均一なサイズ、好まし
くは０．２〜２．　５ａｍ＋のサイズを有し、粗いまた
は平滑な表面、好ましくは平滑な表面をもっている。

ビーズは好ましくは円形または長円形で、通常はほぼ球
形であって、非特異的結合を賎小限にする表面特性を有
する。本発明のイムノアッセイに使用される場合、支持
体には、リガンドたとえばビオチン、または受容体、好
ましくは受容体たとえば抗体、アビジン、アボ酵素、リ
ブレッサー蛋白、内因子等のｓｂｐメンバーが結合ざれ
ている。

「小分子」は、分子蟻１００〜２，０００．好ましく（
よ１５０〜１，○ＯＯ、好ましくは１５０〜１．０００
の有機またはｆｉｔｌｌｌｍ属基を意味し、通常はｓｂ
ｏメンバーまたは支持体に結合していて、それに対する
受容体が存在するかまたは製造できる。本発明に有用な
小分子の例には、ビオチン、リゼルグ酸、ブルシン、フ
ルオレセイン、ビタミンＢ１２およびー・般的には検定
すべきサンプル中に通常は高濃度には存在しない分子の
誘導体が包含ざれる。生物学的サンプルの場合には、毒
性の高い分子および薬剤以外の合成的に誘導される分子
が多くの場合好ましい。

「接合体」は、１つまたは多くの小分子または標１に非
共有または共有、好ましくは共有結合によって結合した
特異的結合対メンバーたとえばリガンドまたは受容体、
通常は抗体を意味する。接合体は、被験物質と相補性の
ハプテンまたは受容体に結合した１または２以上の小分
子であってもよい。

「標識」は、小分子と相補性の受容体に共ｈ結合するシ
グノ−ル生成系のメンバーを意味する。標識は同僚元素
または非同位元素のいずれぐもよいが、通常は非同位元
素で、たとえば酵素のような触媒、蛍光体、染料または
化学発光体のような発色原、金属粒子等である。

「シグナル生戒系」は、１または２以上の戒分を有し、
その少なくとも一或分は標識であるシグナル生戒系を意
味する。シグナル生成系は、サンプル中の被験物質の存
在または量に標識連したシグナルを発生する。シグナル
生或系は、測定可能なシグナルの生戒に必要なすべての
試薬を包含する。

標識は通常、直接または間接的に、小分子に対する受容
体に接合される。シグナル生戒系の成分は、化学発光体
、放躬性物質、補酵素、酵素生或物と反応する物質、酵
素、および触媒、固体粒子、蛍光原、発色原、金粒子等
とすることができる。シグナル生或系は外部装置で、好
ましくは粒子の凝集程度の測定、または電磁照銅線の使
用により、望ましくは肉眼検査によって検出できるシグ
ナルを与える。多くの場合、シグナル生成系は、色原体
基質と酵素（この場合、色原体蓼質は、紫外部または可
視領域の光を吸収する染料にＭ′＃的に変換される〉、
リン光体、蛍光体、化学発光体、故躬性原子、電子活性
基等を含有する。

シグナル生戒糸は少なくとも１種の触媒、通常は酢索、
少なくとも１種の基質を包含することができるし、また
２種またはそれ以上の触媒と複数個の基質を包含しても
よい。１種の酵素の基質が他の酵素の生成物であるよう
な酵素の組合せを包含させることもできる。シグナル生
或系は、サンプル中の被験物質の量に関連する検出可能
シグナルを与える生或物を生或するように操作される。

とくに興味ある醇索には、過酸化水素の産生および染料
前駆体を染料に酸化するための過酸化水素の使用に関与
する酵素である。特定の組合せとしては、糖オキシダー
ゼたとえばグルコース、ガラクトースオキシダ、または
異項環オキシダーぜたとえばウリカーゼ、キサンチンオ
キシダーゼと、過酸化水素をＳ料前駆体の酸化に使用す
る酵素、すなわち、西洋ワサビベルオキシダーゼ、ラク
トベルオキシダーピまたはミク［１ペルオキシダーゼと
の組合せを挙げることがぐきる。本発明においてとくに
興味がある池の酢素には、β−ガラクトシダービ、ウレ
７−ビ、アルカリホスノ７ターぜおよびＱ−ベータレプ
リカーゼがある。

「非特異的結合」の語は、結合する分子の特異的構造と
は比較的独立な、表面への標識または分子の非共有結合
を意味する。このような非特異的結合は、電荷または静
電的相互作用、疎水性相互作用、水素結合、ファンデル
ワールス力等によって生じる。

「補助材料」の語は、本発明によるアツセイに用いられ
る様々な付加的材料を意味する。たとえば、アッセイメ
ジウム中に通常存在するＩｌｉｌ剤、ならびにアツセイ
メジウムおよびアツセイ成分のための安定化剤等である
。これらの添加物に加えて多くの場合、補助的蛋白質た
とえばアルプミン、界面活性剤とくに非イオン界面活性
剤、結合増強剤たとえばボリアルキレングリコール等が
包含される。

ト述のように、本発明の一態様は、支持体に結合した受
容体−ａＪｉ接合体を、液体メジウムに溶解した同じ接
合体から分離する方法に関するらのである。この方法は
、接合体を含有する液体メジウムを、溶液中に存在する
被験物質の徴に閏連して接合体に直接または間接に結合
できるｓｂｐメンバーを結合する支持体と混合するもの
である。

本発明の好ましい実ａｌｌ様においては、固体支持体は
ビーズのマトリックスである。完全な分離を達成するた
めには、接合体を含有する液体メジウムはビーズのマト
リックスを完全に覆うのに必要な容量を著しく越えるも
のではなく、ビーズを覆うのに十分でない容嶺でもよい
。ｓｂｐメンバーの量はすべての接合体を結合するのに
少なくとも十分であればよい。しかしながら、液体の容
量がビーズを覆うのに必要な容量よりも実質的に多い場
合の分離方法ら本発明に包含ざれる。いずれの場合も、
分離を行う方法は同じである。インキュベーション後、
液体メジウムはまずそのマトリックスとインキコベート
され、これは通常、濾過装蓑のような他のものが装備さ
れていない、したがって液体に対して不透過性の容器中
で行われる。

ついで、メジウムを吸引によってビーズから分離する。

吸引は、１個もしくは２個以上の開口部、好ましくは１
個の開口部を有するチューブを用いて行われる。チュー
ブの断面が円形の場合、開口部直径は、それと接触する
最小のビーズの直径よりも小さくなるようにする。チュ
ーブの断面が円形でない場合には、開口部の最短または
最長の断面の径が少なくとも相当するビーズの直径より
も小さくなければならない。その結果、液体はマトノツ
クスから、ビーズの喪失を招くことなく高価的に分離さ
れる。

本発明のイムノアッセイに用いられる試薬は、本発明の
設計にとくに重要である。設計にあたっては、大部分の
被験物質に広く適用できて、イムノアツセイ系における
自動化と試薬の安定性の制御が容易な試薬を用いる方法
が選択される。

本発明の一実施態様として、サンプル中のモノエビトー
ブ抗原、たとえば薬剤の検出のための方法を説明する。

この方法では、第一の小分子に結合したハプテンの接合
体がサンプル中の抗原と、第二の小分子に結合した抗一
ハプテン抗体の接合体への結合で競合するような競合的
アッセイ様式が用いられる。ハプテン接合体と抗−ハプ
テン接合体との複合体の生或醸が被験物質の量に＋１１
達する。生或した複合体は、小分子の一方に対づる受容
体が結合した固体支持体に結合する。支持体への結合の
萌または後に、他の小分子に対する受容体と標識の接合
体を、複合体と混合する。ハプテンの検出に適用された
本発明のこの方法で生或する複合体を構成的にホすと次
の通りである。

Ｅ−Ａｂ　　：Ｆ−ハプテン：Ａｂ７、プテン〜Ｘト Ｙ一支持体 Ｅ一八ｂ　：Ｆ−Ａｂ，、ブテン：ハプテン−ＸＦ Ｙ一支持体 式中、Ｅ−ＡｂＦは標識に結合した小分子（Ｆ）に対す
る受容体、たとえば酵素に結合した抗−フルオレセイン
抗体であり、Ｆ−ハプテンおよびハプテンー×はハプテ
ンに結合したフルオレセインまたはビオチンのような小
分子（ＦまたはＸ）であり、Ａ　ｔ）　，ブ，，−Ｘお
よびＦ−Ａｂ，、ブヶアは第二の小分子（ＸまたはＦ）
たとえばビオチンまたはフルオレセインと抗一ハプテン
抗体の接合体であり、Ｙ一支持体は支持体に結合したＸ
に対する受容体たとえばアビジンである。

本発明の他の応用においては、アツセイ方法はとくに、
少なくとも２つの抗原決定基、すなわち受容体が同時に
結合できる少なくとも２つの部位を有するサンプル中の
被験物質の検定に適するように設計されている。本発明
の好ましい実施態様においては、この検定方法は以下の
試薬、すなわち、小分子に対する受容体に結合した標識
たとえば抗〜フルオレセインに結合した酵素：被験物質
の第一の抗原決定部位に相補性゛Ｃ小分子たとえばフル
オレセインが結合した第一の抗体：被験物質の第二の抗
原決定基に相補性で第二の小分子たとえばビオチンが結
合した第二の抗体二問題の被験物質の含有が疑われるサ
ンプル；および第二の小分子に対する受容体たとえばア
ビジンが結合した支持体を使用する。このアッセイの抗
体はｔノクローナル′Ｃ：らボリクＯ−アルでもよいが
、モノクローナルが好まし。このようなアッヒイ系にお
いては、固体支持体に結合する４ｌ！識の署は、サンプ
ル中に存在する被験物質の量に直接関連づる。とくに、
標識が結合する第一の小分子に対する受容体は、第一の
抗体に結合した第一の小分子に結合する。被験物質の存
在下には、第一の抗体は被験物質とその第一の抗原決定
部位で結合する。第二の小分子が結合する第二の抗体は
、被験物質とその第二の抗涼決定部位で結合づる。一方
、第二の抗体上の第二の小分子は支持体に結合した第二
の小分子に対する受容体に結合し、その結果、問題の複
合体は支持体に結合する。試薬およびサンプルは、同時
に、またはすべてもしくは一部を順次、互いにまた固体
支持体と混合することができるが、受容体に結合した標
識を、支持体がすべての他の試薬と接触したのちに支持
体に別偶に添加される場合を除いて、試薬およびサンプ
ルは固体支持体への導入前に混合することが好ましい。

ｍｓ物質の検出に適用される、本発明のイムノアツセイ
で生成する複合体をａｔ或的に示さば次の通りである。

Ｅ−Ａｂ　　：ドーＡｂ　　：Ａ：Ａｂ２−Ｘ：ＹＦ１ 一支持体 式中、Ｅ−Ａ　ｂＦは椋識たとえば酵素に結合した第一
の小分子に対する受容体たとえば抗−７ルオレセイン抗
体であり、Ｆ−Ａｂ１ｕ被験物質に対する第一の抗体に
結合した第一の小分子たとえばフルオレセインであり、
Ａはサンプル中に存在する問題の被験物質であり、Ａｂ
２−Ｘは被験物質に対する第二の抗体に結合した第二の
小分子たとえばビオチンであり、Ｙ一支持体は、支持体
に結合した第二の小分子に対する受容体たとえばアビジ
ンである。

本発明のアッセイ方法は、微生物学的抗原、とくに感染
疾患において生じる抗原、たとえばクラミジア、ＡＩＤ
Ｓに伴うヒト免疫不全症ウイルス（｝−１１Ｖ−１）等
の検出にとくに適している。

本発明のアツセイ方法はまた、抗体の検出に適当である
。本発明の好ましい実１１Ｍｇ様におけるイムノアッセ
イでは次のような試薬が利用される。

７ｌヘわち、抗＝７ルオレセイン抗体に結合した酵木、
フルオレヒインに結合した抗体ｍｗＡｗ質と相補性の抗
原の類縁体、抗体の含有が疑われるサンプル、ビオチン
に結合した免疫グロブリンに対する抗体、およびアビジ
ンが結合した支持体である。

このイムノアッセイ法を用いると、問題のサンブルが抗
体を含む場合、酵素を含む複合体が支持体に結合する。

非結合酵素を分離したのら、支持体七に存在する酵素活
性はサンプル中の抗体の存在と相関する。このような７
ツセイの一変法では、たとえば、フルオレセイン結合抗
原をフルオレセインに結合した免疫グロブリンに対する
抗体に置換し、ビオチンに結合した免疫グロブリンに対
する抗体をビオチンに結合した抗原に置換する。サンブ
ル中に存在する特定の抗体の検出に適用される本発明の
方法において生或する複合体を構或的に小すと次の通り
である。

ピーＡｂ　　：Ｆ−ＡＱ：Ａｂ：Ａｂ−Ｘ：Ｙ−Ｆ 支持体 ヒーＡｂ　　：ｔ−−−Ａｂ：Ａｂ：Ａｑ−Ｘ：ＹＦ 支持体 式中、Ｅ−ＡｂＦはｅ識に結合した第一の小分了に対す
る抗体であり、Ｆ−ＡｂおよびＦ−Ａｇはそれぞれ、免
疫グロブリンに対する抗体、およびサンプル中に存在す
る抗体に相補性の抗原に、それぞれ結合した第一の小分
子（Ｆ）であり、Ａｂはサンプル中に存在する問題の抗
体であり、ＡＧ×およびＡｂ−Ｘは、サンプル中の抗体
と相補性な抗原、およびサンプル中の抗体に相補性の抗
体にそれぞれ結合した第二の分子（Ｘ）である。

本発明のさらに他の応用においては、イムノアッセイ法
はサンプル中の［ＱＭの存在を検出するために設計され
る。とくに、この方法は、肝炎コア抗原に対する抗体の
検出に適している。このアッセイ系においては、以下の
戒分が使用できる。

すなわち、抗−フルオレセイン抗体に結合した酵素、フ
ルオレセインに結合した抗原、サンプル、ピオチンに結
合した抗一ヒト［ＱＭ、およびアビジンでコートした支
持体である。サンプル中にＩｇＭが存住寸ると、検出再
能な複合体が生或する。酵素活性の程度がサンプル中の
［ｇＭ１度に相関する。このアッセイの変法においては
、フルオレセインが抗原に直接ではなくて、抗一抗ｊ京
抗体に結合される。

アツセイ系の設計によって、包括的な試薬、すなわら問
題の被験物質なく任意のアッセイ系に使用できる試薬の
使用が可能になる。上述の例から明らかなように、各７
ツセイでは小分子に結合した受容体からなる接合体が使
用される。

上述の各方法では、第一の小分子と第一のｓｂｐメンバ
ーの接合体（Ｃ１〉は、第一の小分子に対する受容体と
４１識の接合体｛Ｃ２｝と直接非共有結合で結合し、ま
た、第二の小分子と第二のｓｂｐメンバーの接合体（Ｃ
３〉に非共有結合で結合している。この場合、Ｃ１と０
３の間の結合は、アッセイがただ１個の抗原決定部位を
もつ被験物質について行われる場合は直接であり、他方
、アツヒイが多重抗原決定部位をもつ被験物質について
行われる場合は直接または間接である。

接合体Ｃ３はさらに、表面に第二の小分子に対する受容
体が結合している支持体に直接、ル共有結合で結合する
。アツセイに要求されるすべての結合が起こると、以下
の組成の複合体が生或する。

Ｃ２：Ｃ１：（Ａ）　　　：Ｃ３：Ｓ ｎ 式中、Ａは被験物質の分子であり、Ａに結合するただ１
個のｓｂｐメンバーが使用される場合、すなわち被験物
質が１個の抗原決定部位をもつときはｎはＯであり、被
験物質が多重抗原決定部位をもつ場合はｎは１である。

アツセイの実施に際しては、より便利なある工程順序が
存在し、他方、最高のアッセイ感度を与える順序がある
。使用する特定な順序の選択はしたがって、アツセイを
実施する人の要求に依存する。一般的には、まず、水性
メジウム中に通常添加順序は考慮せずに、サンプル、０
１，Ｃ２およびＣ３を混合するのが好ましい。ただし、
単一の抗原決定基をもつ被験物質についての競合的アツ
セイの場合には、通常、被験物質に相補性のｓｂｐメン
バーを含む接合体とサンプルを同時に、または被ｗＡｍ
ｇの類縁体を含む接合体とサンプルを混合する前に、混
合することが好ましい。ナンプル、Ｃ１，Ｃ２およびＣ
３を含有する水性メジウムをついで、所望により１時間
ま゛Ｃまたはそれ以上インキュベートしたのち、支持体
（Ｓ）と混合し、通常はさらに５秒〜ｂ＠間、通常は１
分〜１時間インキュベートする。支持体に結合した標識
またはメジウム中に残った標識の社をついで直接、しか
し通常は支持体からメジウムを分離したのちに測定する
。

使用できる他のプロトコールとして、サンプルならびに
全試薬ＣＩ．Ｃ２，Ｃ３およびＳをほぼ同時に混合し、
５時間までインキュベートしたのち、メジウムと支持体
の分離前または分離後、通常は分離後に、支持体（Ｓ）
上またはメジウム中の標識を検出する方法がある。これ
は便利さは加わるが、特定の検定感度を達或するために
はインキュベーション時間の延長が必要になる。

使用できる他のプロトコールとして、支持体に、Ｃ３、
サンプル、Ｃ１およびＣ２の溶液を順次添加し、各添加
後にインキｌベーシ４ンを行いまたは行わず、次の溶液
の添加菌に各溶液の支持体からの分離を行いまたは行わ
ずに実施する方法があり、感度を増大させることができ
る。支持体へ０２の溶液を添加したのら、メジウムと支
持体の分離前または分離後、通常は分離後に、支持体上
またはメジウム中で標識を検出する。

とくに好ましいプロトコールにおいては、サンプルを水
性メジウム中、メジウムを支持体と混合する前またはそ
れと同時に０１およびＣ３と混合する。メジウムと支持
体の任意のインキュベーション後に、支持体をメジウム
から分離し、Ｃ２を含む溶液と混合する。Ｃ２を支持体
とインキュベートしたのち、溶液と支持体の分＠前また
は分離後、通常は分離後に、支持体上または水性メジウ
ム中で標識を検出する。

これらのアッセイにおいては、任意の便利な標識が使用
できる。標識には、酵素、たとえばアルカリホスファタ
ーピのようなホスフフ７ターゼ、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）のようなべルオキシダーゼ、ウレアー
ゼ、β−がラクトシダーゼのようなグリコシダーピ、グ
ル］一スオキシダーピのようなオシダーゼ、コリンエス
テラーピのようなエステラーぜ、Ｑ〜ベーターレプリカ
ーぜのようなヌクレオチドポリメラーぜ、ベニシリナー
ゼ、ルシノｌラー己等が包含される。また、ｆＩ系に対
する抗体もしくは機構に基づくインヒビターのような酵
素インヒビター、または酵素補欠分子族のような酵素ア
クティベーター、またはＮＡＤ，ＮＡＤ日、ＮＡＤＰ，
ＡＴＰ，ＦＡＤ，ＦＭＮのような補酵素の誘導体も使用
できる。また、フルオレセイン、ウンベリフエロン、オ
キサジン、アクリジニウム塩、アクリドン、ビレン、ス
クアレート染料、蛍光性希土類キレート、シ７ニド、メ
ロシアニド、フィ〕ピリプロテイン、ごメイン、ナフチ
ルアミン等の誘導体のような蛍光原も使用できる。他の
有用な種類のａ識としては、ジオキシタン、ルミソール
、ホタルルシフエリン、アクリジニウムエステルの誘導
体を含む化学発光標識がある。粒子状の標識も使用でき
る。それらは直径１００ｎｉ未満であることが好ましく
、またそれらが検出可能な分子をもつかそれら自体か容
易に検出可能であればとくに好ましい。有用な粒ｆ状Ｉ
Ｒａには、コロイド状金、コロイド状セレニウム、染色
ガノスビーズ、検出可能分子を結合もしくは吸蔵したり
ボゾーム染料粒子もしくは結晶等が包含される。他の標
識としてはさらに、放射性原子、電子活性Ｉ！識たとえ
ば有機水銀化合物、ヒドロキノン、ベンチジン、フエ口
セン、α−ジケトン，ヒドロキシルアミンおよびヒドラ
ジン、酵素以外の触媒たとえばフェナジンメトサルフェ
ート、およびメルドラブルーがある。

標識は通常、小分子に対する受容体、通常は抗体に共有
結合させる。結合は、標識の水素原子の受容体への結合
への単なる置換であってもよいし、また標識と受容体の
間に任意のサイズの連結基を包含させてもよい。しかし
ながら、連結基のサイズは必要以上に長くないことが好
ましく、標識に結合したｓｂｐメンバーと相補性のｓｂ
ｐメンバーの結合に影響与えるものではなく、またＩｌ
ｓ誠によるシグナル生或を妨害しないものでな（Ｊれば
ならない。一般的には、連結基は、結合または１〜１０
０個の涼了好ましくは１〜１５１１Ｕの原子を含む基で
ある。

ｓｂｐメンバーに結合した小分子を含有する本発明の接
合体は、天然の受容体が存在するかまたはそれが製造で
きる小分子を含有する。小分子は通常、極端に親水性で
も疎水性で６なく、サンプル中に存在する可能性がある
物質と構造的に類似しないものが好ましい。接合体がハ
プテンに結合した小分子である場合には、小分子は好ま
しくは少なくとも１０個の１京子長、多くの場合少なく
とも２０個の原子長の原子鎖を介してハプテンに結合さ
せるが、この原子鎖はもっと短くても長くてもよく、条
件はこの鎖が小分子に対する受容体によるおよび接合体
内のｓｂｐメンバーに相補性のｓｂｐメンバーによる接
合体への同時結合を妨げないことのみである。ハプテン
接合体は通常、１個の小分子に結合した１個のハプテン
を有するが、ハプテンに２個以上の小分子が結合したハ
プテン接合体ら本発明の範囲に包含ざれる。多重抗原決
定部位を有するかまたは受容体であるｓｂｐメンバーと
小分子の接合体は、接合体内に少なくと６１個、多くの
場合２〜２０ｆＡの小分子を有し、これらは通常共有結
合している。結合は、小分子の水桑原イのｓｂｐメンバ
ーへの結合への単なる置換であってもよいし、また小分
子とＳｂＤメンバーの間に任意のサイズの連結基を包含
させてもよい。しかしながら、連結基のサイズは必艮以
上に長くないことが好ましく、小分子に対する受容体お
よび接合体内のｓｂｐメンバーと相補性のｓｂｐメンバ
ー、両者の接合体への結合を妨害しないものではなけれ
ばならない。

本発明の支持体は通常、ビーズ、リボゾーム、セル、ゾ
ル等のような粒子；＠湿性材料たとえば多孔膜、セルＯ
−ス紙、ガラス紙およびニトロセルロース膜；非孔性材
料たとえばガラス、プラスチック、金属、セラミック等
である。受容体は支持体の表面に、その受容体に相補性
な小分子リガンドを含む接合体が容易に結合できるよう
な様式で、共有結合または非共有結合によって結合させ
る。この表面に対する受容体の結合は通常、表面を受容
体とインキュベートすることによって達或されるが、こ
の場合、表面を予め結合を増強させるような試薬、たと
えばポリリジンのようなポリカチオン；カルボジイミド
；シリル化剤：二官能性架橋試薬たとえばカルボニルジ
イミダゾール、過ヨウ素４Ｅおよび類似の活性化試薬で
処理してもよい。別法として、支持体は、受容体に対し
て相補性のｓｂｐメンバーたとえば受容体に対するリガ
ンドまたは受容体に対する抗体がすでに表面に結合して
いる形に製造することもできる。受容体をこのような表
面とインキュベートすれば、受容体は非共有結合で結合
する。受容体に対するリガンドが最初から表面上に存在
するこの結合方法を採用すれば、受容体は通常、リガン
ドに対して少なくとも２個の結合部位をもつことになる
。

本発明の実施に際しては、液体メジウム、通常は水性メ
ジウムが使用される。他の極性溶媒、通常は１個から６
ＩＩ！ｉｌ、さらに通常では１〜４個の炭Ａ原子を有す
る酸化型右機溶媒、たとえばアルコール、エーテル等も
使用できる。通常、これらの補溶［は約４０兎量％未満
、さらに通常では約２０重盪％未満存在させる。一般的
には５〜１０のＤＨ範囲、通常は６〜９の範囲が使用さ
れる。アツセイに際してｐＨに関しさらに注意すべき点
は、ＳｂＤメンバーの結合に必要なレベルの維持、また
一方ではジグナル生成効率を至適にするレベルの維持で
ある。場合によっては、これらを考慮して妥協しなけれ
ばならない。所望のｐＨを遅或し、測定時このｐＨを維
持するためには、様々な１衝剤が使用される。緩衝剤の
例としては、ホウ酸塩、リン１Ｅ炭１Ｅトリス、バルビ
タール等を挙げることができる。本発明に使用される緩
衝剤にはとくに制限はないが、個々の分離または個々の
アツセイについては、ある緩衝剤が他のものよりも好ま
しい場合がある。

分離およびアツセイを実施する場合には通常、穏和な温
度が用いられ、アツセイの実施中は通常一定の温度に維
持される。アツセイ温度はとくにイムノアッセイの場合
、一・般に約Ｏ゜・〜５０℃の範囲で、さらに通常では
約１５゜・〜４０℃である様々な試薬のａ度は、液体メ
ジウム中のｓｂｐメンバーまたは７ツセイ中の破験物質
の′ａ度範囲によって一般的に決定されるが、各試薬の
ａｍ的な濃度は通常、興味ある範囲にわたって、分離ま
たは検定の感度および特異性を至適にするようにＵＳ的
に決定される。

本発明のイムノアッセイにおいては、水性メジウムにシ
グナル生成系の１種または２種以七の成分を含有させる
ことができる。シグナル生成系の各成分の濃度は、興味
ある被験物質の濃度範囲、および用いられる測定または
検定の種類に依存し、変動する。一般的にいえば、シグ
ナル生成系の各成分の濃度は、被験物質の興味ある濃度
範囲西で検定の感度を至適にするように選択される。

便宜上、アッセイを行うための試薬は、被験物質のアッ
セイに使用する既定嶺をパッケージとして組合せたキッ
トとして提供することもできる。

キットは、（ａ）第一の小分子と′ｍ験物質に相浦性の
第一のｓｂｐメンバーとの接合体、および０第二の小分
子と、被験物質の類縁体であるかまたは液Ｓ物質に相補
性の第二のｓｂｐメンバーとの接合体から構成される。

キットにはまた、標識と小分子の一方に対する受容体と
の接合体、および他方の小分了に対する受容体が表面に
結合している支持体も包含させることができる。キット
に虹ざらに、サンプル中の被験物質の量に閏達したシグ
ナルを生或ざせるための他の試薬を包含させてもよい。

補助剤も必要に応じて包含させることができる。

サンプル中の被験物質の存在または口を測定するための
試薬を包含させた好ましいキットは、■第一の小分子と
被験物質に相補性の第一のｓｂｐメンバーとの接合体、
υ第二の小分子と、被験物質の類縁体であるかまたは被
験物質に相補性の第二のｓｂｐメンバーとの接合体、Ｏ
小分子の一方に対する受容体と酵素の接合体、０酵素に
対する基質、および所望により０シグナル生戒系の他の
成分、小分子他方に対する受容体に結合した表面をもつ
支持体、補助剤から構成される。

水明［ＩＪｉ．：記載した発明において、周体支持体が
ビーズのマトリックスである場合には、ビーズは通常、
非孔性で、饅通はガラスまたはラテックスであり、通常
は平均直径０．２〜２，５層である。マトリックスは５
０〜５０，０００涸のビーズから構成するのが適当であ
る。とくに好ましくは、ビーズの平均直径は０．５〜２
ｆｆｉｌである。ビーズは通常ほぼ球状であり、粗いま
たは平滑な表面を有する。

イムノアッセイに有用であるためには、ビーズは特定の
表面特性をもつものでなければならない。

その表面は、標識およびｓｂｐメンバーに対する非特異
的結合性は低く、一方、非結合標識から、被験物質また
はその相補性ｓｂｐメンバーに結合したＩ識の分離の効
率的な手段を与えるものでなければならない。ビーズの
サイズおよび形状は、液体メジウムの容量に対するビー
ズ＆而の比を最大にするように選択され、またビーズマ
トリックスへの吸引ヂューブの挿入を容易にし、マトリ
ツクスからの液体メジウムの分離を効率的にするように
選ばれる。容量に対する表面の比が大きいほど、ビーズ
への標謙のさらに迅速な結合がＩＩＴ能になるが、小さ
なビーズを使用すると分離効率が必然的に悪くなる。通
常は０．２〜２．５ＭＩＩのサイズが最も有用であるこ
とが明らかにされている。

さらに、多くの場合、結合能を最大にするため、ビーズ
上のｓｂｐンバーの表面密度を最大にすることが望まし
い。一般に、表面密度は１０，○ＯＯｎＩ１２あたりｓ
ｂｐメンバー少なくとも１分子でなければならず、好ま
しくは１０００ｎｉ２あたり少なくとも１分ｆ、とくに
好ましくは１００ｎｉ２あたり少なくとも１分子であっ
て、アツセイメジウム中に存在し、ビーズに接触するす
べての相補性ｓｂｐメンバーを結合するのに十分高いこ
とが好ましい。

ビーズの表面積が大きいことから、バックグランドの非
特異的結合が低＜１！持されるように、その表面の性質
には注意を払わなければならない。

ビーズに結合される受容体としてアビジンを使用する場
合には、ビーズにはアビジンを結合ざじたのら、スクロ
ースの存在下にガラス粒子を乾燥させることによって、
非特異的結合を減少させることができる。糖のはかに、
有用なことが明らかにされ（いるコーティングの例には
、ウシ血清７ルブミン（ＢＳＡ）．ポリ（ビニルアルコ
ール）、力ぜインおよび脱脂ミルクがある，， どのような種類の固体支持体を使用しても、受容体がそ
の表面に結合し、その受容体が小分子に特異的に結合す
るように処理しなければならない。

本発明の好ましい実ＩＡｉ態様においては、支持体は嵯
々な異なるアッヒイに使用できるように、それにリガン
ドまたは受容体を結合させる。たとえば、アビジンは０
．５〜１．５層の球状ガラスビーズに共有結合させるこ
とかでぎる。これらのビーズのマトリックスを水性メジ
ウム中、被験物質に対するビオヂン標識抗体、被験物質
を含むサンプル、および溶液中の被験物質の量の関数と
してピオチン標識抗体に結合する標識抗体またはリガン
ドと混合する。ビーズはビオチンに結合し、ビオチンは
どの抗体にも結合できるので同じビーズが大部分の抗体
一抗原対に使用できる。標：Ａ抗体またはりガンドのビ
オチン化抗体への結合および後者のビーズへの結合が起
こるのに十分な時間インキュベートしたのち、溶液を吸
引によってビーズから除去する。同じまたは別のチュー
１を使って、次に洗浄液を加え、液体を再び吸引する。

洗浄サイクルを反復したのち、標識を検出すると、ａｌ
Ｊｉの量はサンプル中の被験物質の量に相関する。

本発明の方法は、任意の被験物質の不均一系結合アッセ
イに応用できる。特定のアツセイとしては、たとえば、
ジゴキシン、トリコードサイロニン（Ｔ３）、甲状腺刺
激ホルモン（ＴＳ口）　甲状腺結合グロプリン（ＴＢＧ
）、ビタミンＢ１２、肝炎抗原〈たとえば口ＢｓＡｌお
よび肝炎抗体、ヒト免疫不全症ウイルス（口ｒＶ）関連
抗原および抗体のアツセイを挙げることができる。各系
において、被験物質に相補性のビオチン化抗体またはビ
オチン化抗原が用いられる。アビジン（ストレバごジン
を包含する〉以外の受容体としては、たとえば抗体、プ
［ＩＴインＡ１内因ｆ、ブ１−ＩＴインＧ．Ｃ１（］、
レクチン、７ボ酵素等をビーズに付着させることができ
、さらに被験物質に相補竹のｓｂｐメンバーまたは被験
物質の類縁体に接合した相浦性小分子が使用ざれる。

本発明の好ましい＠様においては、すべてのアッセイが
同一の２種の一般的試薬、一般的な受容体たとえばアビ
ジンに結合した非孔性ビーズおよび第二の一般的受容体
たとえば抗−フルオレセインに結合した酵素が使用され
る。このようなアッセイにおいては、ビオチンおよびフ
ルオレセイン結合ｓｂｐメンバーは互いにまたは溶液相
中の被験物質と、ビーズマトリックスと混合する前に結
合させる。この場合、結合反応はより迅速に進行し、つ
いで被験物質の結合が表面において、通常、酵素連結イ
ムノソーペントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）の場合のように
起こる。

多重エピトーブ被験物質、たとえば「ＳＨ、特異的ｒＳ
Ｈのアッヒイにおいては、抗体はごオチンに接合され、
ついｒアビジン被覆ガラスビ〜ズによっｉｌｌ捉される
。第二の丁Ｓ　Ｉ−１特異的抗体はフルオレセインに接
合される。酵素接合体番よ、抗フルオレセイン抗体に連
結した少なくとも１個の口ＲＰを有する。全成分の混合
物を短時間インキヱベートしたのら、アビジンで被覆し
たガラスビーズを加え、表面に複合体くビオチンー抗体
：ＴＳ口：抗体−フルオレセイン：抗一ノルオレヒイン
一口ＲＰ）を結合させる。

全抗体−サンプルインキュベーション容壜が完全にビー
ズ間の空間に捕捉されるように十分な量のビーズを含む
マトリックスを加える。これにより表面と容量の比を最
大にし、拡散距離を比較的短くし、振盪しないでもピオ
チン化抗体の定壜的な結合が可能になる。

次に、ビーズの表面を、ビーズマトリックスの底まで吸
引チューブを差し込んで、洗浄液の添加、吸引を繰り返
すことによって洗浄する。ビーズの密度およびサイズに
より、ビーズは洗浄液の噴流によって容易に懸濁され、
ついで速やかに沈降する。ビーズは洗浄ブローベによっ
て吸引されないだけの大きさを有する。次に標識を加え
、酢本生成物の薯を過当なインキユベーシ］ン時間後に
比色的に測定し、既知濃度の被験物質サンプルを用いて
得られた生成物の陽と比較する。

本発明の好ましい態様にお番ナる化学および方法により
、標準的ＥＬ［ＳＡに対して以下の右意な利点が達成さ
れる。すなわち、１）受容体結合支持体はすべての７ツ
セイに広く適用できる、２冫溶液相での被験物質と抗体
の結合により、固体表面に固体化された抗体を用いる場
合に比べてきわめて迅速な反応が起こる、３）高い抗体
結合能をもつ大きな表面積の存在により、捕捉が迅速に
達成される、４）捕捉表面は定量的に添加される必要が
ないさらに、受容体一標識接合体はすべてのアッセイに
広く適用でき、それが至適化および安定化が必要な唯一
の標識試薬である。これは、各アッヒイについて別傭の
標識試薬を必要とする標準的な不均一系イムノアッセイ
のフォーマットと全く異なるものである。小分子たとえ
ばビオチンまたはフルオレセインの抗体またはハプテン
へ結合させる化学的操作は単Ｉ４ｉで能率的′Ｃある（
たとえば、Ｄ．　　Ｈ．　　Ｂｏｏｒｓｓａ　　：　　
Ｉｓｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｓｉｓｔｒｙ，２　　：　
　４　　５５．１９８３参照）。小分Ｔ接合体の安定牲
は、接合体に用いられる抗体と同様に良好である。

轡 以下の例は本発明を例示するものであって、本発明を限
定するものではない。とくに指示がない限り、試薬は市
販のものを入手し、製造業者の指示が適用可能な鴫合は
それに従った。

例中、アッセイブロトコールのもとに記載したインキュ
ベーション後のビーズからの７ツセイメジウムの吸引お
よびその後の洗浄液の吸引は、真空ラインに接続した細
いスチールチューブ（ビーズはチューブ内に入れないよ
うな）を用い、ビーズの間を通して反応試験管の底部に
さし込んで実施した。

例には、以下の略号を用いる。

Ａｂロｉｇ　　’抗ジゴキシン抗体 八Ｆ　：抗フルオレセイン抗体 Ａｂ　：抗〜トリョードサイロニン抗体１３ ＡＮＳ：８−７ニリノナノタレン−１−スルホン酸 ビオチン〜ＬＣ−ＮＨＳ：スクシンイミジル６（ピＡ１
ンアミド）ヘキサノエート Ｂ　ｉ　ｓ−Ｎ口　：２．２’　−オキシビス（エチ２ ルアミン） ＢＳＡ　：ウシ血清７ルブミン ＤＣＣ：Ｎ．Ｎ’　−ジシクロヘキシノレカルボジイミ
ド Ｄｉａ：ジゴキシン Ｄ　＋　ｇ−ＣＭＯ　：ジゴキシンカノレボキシメチノ
レオキシム ｏ　ｒ　ｇ−ＬＣ−Ｆ　：ジゴキシンカーレポキシメチ
ルオキシムーＬ　Ｃ　−　Ｎ　＋−１−カルボキシフル
オレセイン Ｆ：フルオレセイン ＥＤＡＣ　：　１−エチル−３−（３−ジメチル７ミノ
プロピノレ）カノレボジイミド ＥＤｒＡ：エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩 「：ノルオレスヒイン Ｆ−ＣＯＯＦ１：６−カルボキシフルオレセインＦ−Ｌ
Ｃ−ＮＨ　　：カノレボキシフルオレセイン２ −ＬＣ−Ｎ目， ＧＢ：ガラスビーズ ＨＲＰ：西洋ワサビペルオキシダーゼ ＬＣ：３，３’　−ジアミノーＮ−メチルジブ目ピルア
ミン ＮａＰｉ：リンｉ！Ｉｆトリウム！ｌ衝液Ｎ日Ｓ：Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミド０／ｎ　：一夜 ＰＢＳ　：リン酸綴Ｉ食塩溶液 Ｓｕ　Ｉ　ｆｏ−Ｎ｝−１３　：ス）Ｉ．ｔ＊−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミド Ｔ　　：３，３’　　　５’−ｔ−リョードーしーチロ
３ シン 丁ＭＢ：３．３’　，５．５’　−テトラメチノレベン
チジンー二塩酸塩 ＴＮＢＳＡ：２，４．６１−リニト０ベンゼンスルホン
酸 例１　： ジゴしシン検出用の不均 一糸酵素ベース 材料の．ａ製 この試薬は連続した２■程、すなわち１）天然ＨＲＰの
２個の反応性アミノ基を、日ＲＰ−ＣＯＯＨへのスクシ
ニル化によりカルポキシル基に変換した、２）ついで口
ＲＰ−ＣＯＯＩ１を過剰量のオキシビス（エチルアミン
）およびＥＤＡＣと反応させて日ＲＰ−スクシニルービ
スーＮ１］２を生成させた、によって製造した。

口ＲＰのスクシニル化：　０　．　１　Ｍ　　Ｂｏｒａ
ｘ中２０ａｙ／ＩｒＩＨ　Ｒ　Ｐ溶液２−に室温で、Ｄ
ＭＦ中２．５Ｍｉ水コハク！４０μｌを加えた。２０分
間攪拌後、さらに４０μ１の無水コハク酸溶液を加え、
混合物をさらに１時間室温でインキュベートした。

反応混合物を０．００５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（Ｎ
ａＰ　ｉ　＞／ｐＨ＝７．０中で平衡化したＳｃｐｈａ
ｄｅｘ　　Ｇ　−　２　５カラム上によｊいて精製し、
低分’ｒａｍ質を除去した。目Ｒ　Ｐ　−　Ｃ　Ｏ　Ｏ
口を７ミフンＹＭ−１０ｇｌを用いて２０ａｇ／一口Ｒ
Ｐ−Ｃ００口に濃縮した。反応生成物をゲル電気泳動に
付し、反応性７ミノ基をＴＮＢＳＡｍ定した。

スクシニル化口ＲＰへの反応性アミノ基の導入＝０．Ｏ
０５Ｍ　　ＮａＰ　＋／ＤＨ＝７．０中２０ｑ／一　口
ＲＰ−ＣＯＯ口　１ｄに、固体の２．２′ビスオキシ（
エチルアミン〉二塩１１Ｊｍ８．８６岬を加えた。反応
混合物のＤＨを０．２〜ＩＮａ　Ｆ−ｌＰＯ４により７
．０に調整した。この混２ 合物にＥＤＡＧ１４１！Ｆを加え、反応混合物を穏やか
に１！痒しながら４℃で２時問インキュベートした。０
．０５Ｍ　　ＮａＰｉ、０．０５ＭＮａＣ１／ｏＨ＝７
．８で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ一２５カラム
によって、口ＲＰ−スクシニノレーピスーＮ日，かう未
反応低分子糧物質を除去した。

反応性アミン基の数はＴＮＢＳＡにより、ＨＲＰースク
シニルービスーＮＨ２あたり１．５と測定された。口Ｐ
Ｒ−スクシニルービス−Ｎ口２をＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ（Ｃ−５０）−Ｌで精製すると、２種の主生成物、（
１）１個の７ミノ襲を有する口ＲＰスクシニルービス−
Ｎ口２および（２１　Ｈ　Ｒ　Ｐあたり２個の７ミノ基
を有する目ＲＰ−スクシニルー・ビスーＮト１２が分離
された。

２　ジゴキシン−ＮＨＳの調製 ２０■のＤｉ（Ｊ−ＣＭ○、５１１９のＮｌ−ｌＳおよ
び９標識のＦＤＡＣをＤＭＦ０．２ｄ中に含有する溶液
を、室温でｌｌ！Ｉ痒しながら一夜（０／ｎ　）インキ
ュベートした。濾過して不溶性の物質を除去したのち、
溶媒（ＤＭＦ）をロータリーエバボレーターで除去した
。

０．０５Ｍ　　　ＮａＰｉ　、０．０５ＮａＣｊ！／ｐ
Ｈ一７．８中１．３■／ｄのＨＲＰ−スクシニルービス
−Ｎ口，（口ＲＰあたり２つの反応性アミノ基を有する
＞４ｍに、４℃で、ＤＭＦ中１４ｍｏｌｅ／ｄのＤｉＱ
−ＮＨＳ　　１．３ａ＋ｅを加えた（４Ｘ３２４μｌ、
１５分毎に３２５μｌのＤｉＱ−Ｎｌ−１３溶液を添加
した》。反応混合物を次に、４℃で１！痒しながら３時
間インしユベートした。２Ｍグリシン／師−８．０を１
５０μ１加え、さらに１時間室温でインキュベートして
反応を停止させた。最後に反応混合物を遠心分離して不
溶性物質を除去し、０．０５〜Ｉ　　Ｂｏｒａｘ中Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ　　Ｇ　−　２　５上で精製した。ＴＮＢ
ＳＡを用いて残った反応性アミン基を滴定して、ハプテ
ン数は約２と評価された。この接合体は４℃で保存した
。

抗−ジゴキシン抗体を固定プロテインＡで精製して、Ａ
ｂｆａＧ分画を得た。次に、このＡｂ（０．０５Ｍ　　
ＮａＰｉ．０．０５Ｍ　　ＮａＣ１／ｌ）Ｈ＝７．８中
約２〜２．５１１ｇ／ｍ＞とごオチン−ＬＣ−ＮＨＳ　
（まずＤＭＦ中に可溶化し、反応にはその小部分を使用
）と混合し、４℃で３時問インキュベートしてＡｂ　　
　−ビオチンを製造しＯｉｇ た。反応混合物中の反応原料のモル比はＡｂ：ビオチン
ーＬＣ−Ｎ口Ｓ＝１：２５とした。結合しなかったビオ
チンをＳｃｇｈａｄｅｘ　　Ｇ−２　５カラムで除去し
た。最終の接合体は０．０５ＭＮａＰ＋．０．００１％
チメロリ“−ル／ｐＨ＝７．４中に４℃でまたは凍結し
で保存した。

ｃ．ｏｉｇ−１−ｃ−１−の調製 この試薬は、（１）　Ｆ　−　Ｎ　Ｈ　Ｓ　，　＋２１
　Ｆ　−　Ｌ　Ｃ　−Ｎ口，、および（３１ＤｉＱ−Ｌ
Ｃ−Ｆを′Ｉ４製する３連続工程で製造した。

１．Ｆ−ＮＨＳのＩＩ４製 ＤＭＦ中１００１９／−６一カノレボキシフノレオレセ
インおよび３０．６ａｙ／ｍＮ口Ｓの混合物２一に、２
７５ｌ！ｇ／ｄＤｃｃ　　Ｏ．４ｄを加えた。この混合
物を、暗所、室温でＯ／ｎｌｌ！拌した。生成したジシ
クロヘキシル尿素を濾過して除く。１ハプテン−ＮＨＳ
の生成を、Ｃ｝−Ｉ　　Ｃト１２：メタノール二酢２ 酸＝８５：１５：１の溶媒系を使用するシリカ板上簿層
クロマトグラノイーｒＬＣによって調べた。

ＤＭＦをロータリーエバボレーターで除去し、生成物（
Ｆ−Ｎ日Ｓ〉を強力な減圧下でさらに乾燥し、４℃でデ
シケーター中に保存した。

１Ｇ　　１．５Ｍｌに、Ｄ　Ｍ　Ｆ中１２５■／ｄのＦ
−ＮＨＳ　　１．２ｍを加え、暗所、゛窄温ｒ１痒しな
からＯ／ｎインキュベートした．，Ｆ−ＮＨＣ：＋−Ｃ
のモル比は１：４０とした。反応混合物を０，５Ｍ　　
ＮａＰ　ｉ／ｐＨ５．０ｒｌ／２０に希釈し、混合物の
ＯＨをリン量によって５，０に調整した。

全混合物を、０．５Ｍ　　ＮａＰ　ｉ，／ｐｉｆ＝５．
０中に平衡化した（２．５Ｘ１０ａ）８ｉｏＲｅｘ−７
０カラムに負荷した。負荷後、カラムを開始緩衝液です
べての３，３′−ジアミノーＮ−メチルジブ０ピノレア
ミンが除去されるまで（丁ＮＢＳＡ反応でモニタリング
）洗浄した。カラムを０．００１Ｍ　　ＮａＰ　ｉ／ｐ
Ｈ＝６．０で洗浄して６−カルポキシフオレスセイン夾
雑物を除去した。低イオン強度Ｉ！衝液での洗浄により
、６−カルポキシフルオレスセインのみでなく、フルオ
レセイン含有夾雑物も除去される。カラムを脱イオン水
（ＤＨ２０）で洗浄して塩を除去した，，最後にカラム
を０．８Ｍ　　ＮＨ４０Ｈで洗い流した。水酸化アンモ
ニウムを凍結乾燥によっで除宏した，，純度をチＩツク
したのら、生成物を−２０℃のデシケーター中に保存し
た。反応は１１紙電気泳動＜０．０５Ｍ　　ＮａＰ　’
＋／ｏＨ＝５．８．２０分）および「シＣ（Ｃ１８プレ
ート、溶媒とじでＤ一口２０中５０％メタノールを用い
て）によって追跡した（生成物の純度もチェックした）
。

３．Ｄ　ｉ　（７−ＬＣ−Ｆの調製 ＤＭＦ／ＤＭＳＯ　（５　：　１　）溶媒１．５Ｉｌｌ
中に２３．０５ａｙ　（０．０５ｍｍｏｌｅ　　）Ｄ　
　ｉ　　ｏ−ＣＭ０，５　０．　３　５ｔｌ９　（０．
　　１　ｍｍｏｌｅ　）フルオレスセイン−ＬＣ−Ｎ口
２および１　９．　２４Ｆ　（０．　１１１１（ｌｉｅ
　）ＥＤＡＣを含む溶液を、暗所、室温で一夜攪拌した
．，３ｄのＤ一日，Ｏを加えるとＤ　ｉ　ｇ−ＬＣ−Ｆ
ｉＢよびＤｉａ−ＣＭＯＳ沈殿し、これを濾過し、溶媒
を捨てた。濾過された物質をＣＨ２Ｃ１−４２＝メタノ
ール：酢酸−６０　：　４０　：　５からなる溶媒系に
Ｊ！溶解し、同じ溶媒系中シリカゲル力ラム（１．５Ｘ
２０ｃｍ）ｈに負荷した。これらの条件下には、Ｄ＋ｇ
−ＣＭＯはＤ　ｉ　ａ−ＬＣ−Ｆ接合体の前を移動し、
Ｆ−ＬＣ−Ｎト１２はカラムの填部に結合したままであ
った。物質の純度は、上述の溶媒系を用いてｒＬＣシリ
カゲルプレート、およびｐｔ＋＝５．８での濾紙電気泳
動によって調べた。

精製された物質から溶媒を１１−タリーエパボレーター
により減圧下で除点し、生或物を最小容吊のメタノール
／ＤＭＦ　（７０　：３０）に再溶解し、遠心分離して
不溶性物質（シリカゲル）を除ムした。最後の工程は、
Ｎ製時に溶解して生成物と共溶出することのあるシリカ
ゲルの大部分を除去するために実施された。生成物はメ
タノール／ＤＭＦ（７０：３０）溶媒系中−１０℃〜−
２０℃で保存した。生成物の濃度は、既知量の６−カル
ボキシフルオレセインを用いて作威した標準曲線から、
Ａ　　によって求めた。

４９０ ０．抗−７ルオレセインートＩＲＰ　　合体の調製使用
される抗一７ルオレセイン抗体は、標準的モノクローナ
ル抗体製造法（　Ｈｉ　ｌｓｔｅｉｎ，　Ｃ．　＆κｏ
ｈｌｅｒ，　　Ｃ．　　：　Ｎａｔｕｒｅ，　２　５　
６　：　４　９　５　，　１　９　７５）を用いて製造
されたモノクロ−ナル抗−フルオレヒイン抗体であった
。口Ｒ　Ｐに接合さぜる前に、これらの抗体は固定化プ
ロテインＡまたはＡｂｘｖトリックス（Ｓｅｏｈａｃｒ
ｙｌ　Ｓ　−　２　０　０のすイジング力ラムと組合せ
て）により［＜ＪＧｆ＞画に精製した。後者の操作ｐＨ
範囲は５．８〜７．０とした。

１，トＩＲＰ−ＮＨＳの製造 接合体の製造にはスクシニル化口１＜Ｐ（口ＲＰＣＯＯ
口〉を使用した。０．００３Ｍ ＮａＰ　ｌ．／（ｌＨ＝６．９中２　０ｍｇ／ｔｄＨ　
Ｒ　ＰＣ○０口１．２５ｄに、１３１ＧのスノレホーＮ
ＨＳを加えた。混合物のｐＨを０．２ＭＮａ２口ＰＯ４
によって６．９に戻しで調整したのち、２０■のＥＤＡ
Ｃを加えた。反応混合物を室温−Ｃ−　２　０分間イン
キュベートしたのら、ＰＢＳ／ｐＨ＝７．１中Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ　　Ｇ　−　２　５カラム上で精製した。精製
したＨ　Ｒ　Ｐ　−　Ｎ　Ｈ　Ｓは直ちに、ノルオレヒ
イン抗体（Ａｂ１）との接合に使用した。

接合前に、フルオレヒイン抗体を０．０２ＭＮａＰ＋．
０．１４Ｍ　　ＮａＣｆ／ｐｌｌ＝７．２に対しで透析
し、Ｆ　　を最終濃度が結合部位と等５２０ モルになるように添加した（Ｆ　　は抗＝フルオ５２０ レセイン抗体の結合部位を速断するために使用された）
。

２０Ｍ９／一日ＲＰ−Ｎ｝ＩＳ　　Ｏ．９ｒｄにＰＢＳ
中２＃Ｊ／標識Ａｂ，５２ｏの３ｌＩを加え、混合物を
４℃で４．５時間インキュベートした（混合物を最初に
濃縮すると、接合の化学的効率は改善されるが、凝集の
形或を最小限にするように注意が必要である）。ヒドロ
キシルアミンを反応混合物中０．　１Ｍの終濃度（ｐＨ
＝７．０）になるように加えて反応を停止させ、一夜４
℃でインキュベートした。

反応混合物を、アミコン濃縮装置によりＹＭ−１０膜を
用いて、約２Ｍｌに濃縮し、ついでＳｅｐｈａｃｒｙｌ
　Ｓ　−　３　０　０カラム（１．５Ｘ１　１４３）上
で精製した。ＭＷ＝２００Ｋ〜２５０Ｋに相当するピー
ク物質をアッセイに使用した。

Ｅ．アビジンーガラスピーズ（ＧＢ）の製直径約０．７
５ｍ＋のガラスビーズ （Ｇｌｅｎ　Ｈｉｌｌｓ，　Ｉｎｃ．，　Ｈａｙｗｏｏ
ｄ，　ＮＪ　）をまず５％ｔａ酸中で１時間煮沸して清
浄化し、ついで洗液の０１１が中性になるまで脱イオン
水で洗浄した。ビーズを室’６４ｃ−ａ空下に乾燥した
。

酸洗浄ごーズ１均に、酢酸エチル３００ｄ中１一のアミ
ノブ口ピルトリエトキシシランに加えた。

次に混合物をロータリーアスビレーター中に取り、溶媒
を除去すると、ビーズはアミノシラン試薬の薄いフィル
ムによって被覆された。ビーズをついでステンレス鋼反
応器に移し、窒索／アルゴン雰囲気下、オーブン中で１
３０℃に一夜加熱した。

冷ｂ１後ビ・−ズはそのまま次工程に使用した。

アミン化されたビーズ５００ｇを傾斜組織培養フラスコ
に取り、これにＯ．ＩＭホウ酸ナトリウム（１１８９．
０）１　７０ｍを加え１０分間放置した。

無水コハク酸（２ＯｄＤＭＦ中２．０ｇ）の溶液をピペ
ットで添加した。フラスコに栓をして手で振盪した。無
水コハク酸溶液の最終添加後にすべての液体を除去し、
ビーズは脱イオン水２００１Ｉｌ×４Ｔ：洗浄した。

ビーズを１回、０．１Ｍ　　ＹＥＳ　（２−　［Ｎ−モ
ルホリノ］エタンスルホン／Ｉ）ｐＨ５．２の１５０１
７！で洗浄したのち、ビーズを丁度覆う液雛のＭＥＳに
再懸濁した。ＭＥＳ２ｄ中１００ＨｇのＥＤＡＣ　（１
−エチル−３−［３−ジメチルアミノブロピル１カルポ
ジイミド）を一度に加え、手で振盪して５分問混合した
。アスピレーターを用いて液体を除去し、アビジン（２
０■）の２Ｃ）ａｄＭＥＳ溶液およびＢＳＡ　（４０ａ
ｙ）を一度に加えた。

ビーズを手で混合し、さらにＭＥＳ！ｌ衝液をビーズが
丁度覆われるまで加えた。最後に培養フラスコを軌道振
ｗＩ器に置き、内容物を４℃で一夜振盪した。

ついで、ビーズをＩＮ　　ＮａＣ１＜２００ｄｘ４）、
次に脱イオン水（２００ｄＸ４）で洗浄した。各洗浄の
前後に、液体は完全に除去した。ビーズをついで０．１
％８ＳＡおよび２，５％スクロース含有リン酸一食塩！
ｌｌｉｌ（２０ｍ）４リン酸塩、１４０ｍＨ　　ＮａＣ
１、０．０２％ＮａＮ３、ｏＨ７．４）−ｒ′処理した
（１５０ＭｉＸ３＞。Ａ［の液体を除去し、湿ったヒー
スを負空デシケーター中の容器に移した。

鰻後に、米国ａ！準試験用陥ＮＱ１６または２０を通過
させ、保存中に豆いに付ｉ　ｔるのを防ぐため、カビイ
ン末をビ〜ズに故布した。

３目一ビオチンとの結合試験によれば、このようにして
製造されたビーズには１ｇあたり２〜１１μタの活性ア
ビジンが導入されていた。

別個に調製し、凍結保存した。新鮮な操作用基質溶液は
、各回、２種の試薬溶液を希釈し、混合して２ｌ製した
。濃厚保存溶液は次のようにして５Ｉ製した。

ＴＭＢ保存溶液（溶液１〉 ６．８２グクエンＩｌｌ（ｉｖ）Ｗ＝１９２．１）０．
６２ｙｌ−ＭＢ二塩酸塩（ｉｖ）Ｗ＝３１３．３）１０
０ｄのＤ−｝−１，，０に溶解する尿素過酸化水素保存
溶液（溶液２） ５Ｊのクエン酸三ノートリウム二永和物（〜＋Ｗ＝２９
４．’ｌ） ０　．　３　７　２　’Ｊ　ＥＤ　Ｔ　Ａ　（　Ｎ　ａ
　ａ　＞（〜ＩＷ＝３８０．２＞ ０．７５２！Ｊ尿ｉｌｌ２０２　（ｉｖ）Ｗ＝９４．０
７）１００ｍのＯ−Ｈ２０に溶解する 基質操作用溶液の調製 ０．１２５〜Ｉ　　ＮａＨ　　ＰＯ　　　８−２４ １Ｍｌの溶液１ １Ｍｌの溶１２ 混合後、直ちに使用した アッセイブロトコール ジゴキシンアッセイのプロトコールは以下の３部からな
る。すなわち、１）溶液相でのアッセイ成分（ごオチン
−Ａｂ　　　＋Ｄｉｑ−ＬＣ−Ｆ＋Ｄｉｇ ＡｂＦ一口ＲＰ）間の結合反応による複合体くビオチン
−Ａｂ　　　−Ｄｉｏ−ＬＣ−Ｆ−ＡｂＦ−Ｄｉｇ 日ＲＰ）の形成、２）Ｇ　Ｂ−アピジンによる複合体の
結合と非結合アッセイ戒分からの分離、および３》醇素
基璽の添加と発色である。

ジゴキシンアッヒイＧ，Ｌ　１　０　Ｘ　７　５　ｍの
使い捨てガラス１ユーブ中に、１［常ヒト保ｇ血清中標
品または未知サンプル５０μｌ１アッヒイＷｉＩ液（０
．２〜Ｉ　　ＮａＰｉ、０．１４Ｍ　　Ｎａ（１！およ
び０．１％ＢＳＡ，ｐ＋ｌ７、４）中１．７４ｎり／ｔ
ｄＯ　＋　＜Ｊ−ＬＣ−Ｆ５０μｉ！、および８Ｑｎｇ
／ｔｄごオチンー＾ｂ　　と］μｇ／ｄＡｂ，　−｝−
ＩＲＰ０１ｇ 接合体の混合１１１　００μｌを順次加えて行われた。

アッセイ混合物をボルテックスミキサー中でＷ１痒し、
３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベーシ
ョン後、各チューブに０．６５９のＧＢ−アビジンを加
えて、結合シグナル発生体（Ａｂ，−１−ＩＲＰ）を非
結合成分からの分離を行い、ついで３７℃で１０分間イ
ンキュベートし、＠後に洗浄ａｌ衝液（０．０１Ｍ　　
ＮａＰｉ，ｐＨ７．２）４Ｘ１ｍで洗浄した。洗浄後、
各チューブにＨＲＰＩ貿（　Ｔ　ＭＢ　／尿素Ｎ２０２
）Ｏ、３一を加え、３７℃で５分間インキュベートした
。

記載の方法で作成した標準曲轢を用い、３９例の患者サ
ンプルについてジゴキシン濃度を定はした。

一例として第１図に示されているように、得られた結果
は既知のラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ＞で得られた埴
とよく一致した。

この試薬は、＋１１　Ｆ　−　Ｎ　Ｈ　Ｓ　、（２１　
Ｆ　−　Ｌ　Ｃ　−Ｎ口　および＋３１Ｔ３−　ＬＣ−
Ｆを製造する３連統２ 工程で製造された，Ｆ−ＮＨＳおよびＦ　−　Ｌ　Ｃ　
−ＮＨ２の製造は例１に記載したと同様であった。

ＤＭＦ／ＤＭＳＯ　（４　二１　）溶［１ａｅ中に、ト
リョードサイロギ酸３０．４ｍ９（０．０５ｓｔｏｌｅ
　＞　、Ｆ−ＬＣ−ＮＨ２　５０．　３５ａ＋ｙ＜０．
　１ｉｇｓｏｌｅ　）およびＥＤＡＣ１９．２Ｈ！ｌ（
０．　１ｍｌｏｌｅ　）を含む溶液を、暗所、室温で一
夜攪拌した。Ｔ３〜ＬＣ−Ｆおよびトリョードサイロギ
Ｉ！（未反応で残っていれば〉をＤ一口，０５Ｉｄ．を
加えで沈殿させ、濾過し、溶媒を捨てた。

濾過された物質をＣＨ　　Ｃｌ　　：メタノール：酢２
２ １（５０：５０：５）からなる溶媒系に再溶解し、同じ
溶媒系中１．５Ｘ２０ａｗシリカゲル力ラム士に負荷し
た。これらの条件下にＣよ、トリコードナイロギ醒は丁
，−ＬＣ−Ｆ接合体の前を移動し、Ｆ−ＬＣ−Ｎ口，は
カラムの頂部に結合したままであった。この物質の純度
は、上述の溶媒系を用いてＴＬＣシリカゲルプレートで
調べた。精製ざれたｌｆｆ質からロータリーエバボレー
ターで溶媒を除去し、生成物を最小容嬶のメタノール／
ＤＭＦ（７０：３０）に再溶解した。この最終工程は、
精製時に溶解して生成物と共溶出するシリカゲルの大部
分を除去するために実施した。生成物は、メタノール／
ＤＭＦ　（７０　：　３０）溶媒系中に２０℃で保存し
た。保存溶液中のＴ３−ＬＣ−Ｆの濃度は、既知縁の６
−カルボキシーフルオレセインを用いて作或した標準曲
線からＡ４９ｏによって測定した。

抗−１３抗体は、固定化ブ［ｌアインーＡを用いてＩｇ
Ｇ分画に精製した。抗体ＩｇＧはビオチンし（，−ＮＨ
Ｓを用いてビオチン化した（反応混合物中の［ル比（よ
、Ａｂ：ビオチンーＬＣ−Ｎ口Ｓ＝１：２５とした〉。

非結合ヒオチンをＳｅｐｈａｄｅｘ−　Ｇ　２　５カラ
ムで除去し、Ａｂ１３−ビオチンは０．０５Ｍ　　Ｎａ
Ｐ　ｉ／ｏＨ＝７．４中、４℃でまたは凍結して保存し
た。

Ｃアごジンのガラスビーズ（ＧＢ）へのカップリング この試薬は０．５ａｇ〜１．０麿の非孔性ガラスビーズ
を３−７ミノブロビルトリ玉トキシシランで処理して、
ガラスビーズの表面上に反応性アミノ基を生成さぜるこ
とによって製造した。このＧＢ−ＮＨ２をついでＦＤＡ
Ｃを用いてＣＭデキトスランでコートし、最後にスクシ
ニル化してすべでのアミン基をカルボキシル基に変換し
た。アビジンはＥＤＡＣ化学によってＣＫ−デキストラ
ン被ＩＧＢにカップリングさせた，，最後に、アビジン
標識ガラスビーズを２．５％スクロース、０，１％ＢＳ
Ａ含有溶液で被覆した。ビーズを減圧下に乾燥してアッ
ヒイに使用した。

例１にはアビジン被覆ガラスビーズの製造のための別法
が与えられている。

０．０７５Ｍバルヒタールナトリウム、０．ＭＮａＣｊ
！、０．００２％チメロナール、０．１％ＢＳＡ，Ｉ）
Ｈ＝８．６ ２　放出試薬（ＲＲ） ２ １■／ａｉ！Ａ　Ｎ　Ｓ、５１１１４　　ＥＤＴＡ，０
．５■／ｌｍｌ！ＢＧＧ、０．５ＭＩ／ｌヒツジＩａＧ
、４％正常マウス血清を含有するアツセイ緩衝液を血清
蛋白質から結合Ｔ３を放出させるために使用した。

例１に記載したと同様にして濃厚保存溶液を調製した。

アッセイブロトコール アッセイは１０Ｘ７５ａｍの使い捨てガラスチューブ中
に、市販の標準品または未知サンプル５０１１１、放出
試薬中１．５ｎ（＋／ｄのＴ３−ＬＣ−Ｆ５０μＪ！、
８０ｎ！ＩＪ／　ｄビオチンーＡｂ１３と１μＪ／ｍ！
ＡｂＦ一日ＲＰ接合体の混合物１　００ｕ１を順次加え
て実施した，，７ツセイ混合物をボルテックスミキサー
中で攪拌し、３７℃で１５分間イントユベートした，，
インキュベーション後、結合シグナル発生体（Ａｂ１−
口ＲＰ）の非結合成分からの分離を、各チューブへのＧ
Ｂ−アビジン０．６５ｇの添加、３７℃での１０分間の
インキュベーションおよび洗浄緩衝液（０．０１ＭＮａ
Ｐ　ｉ　、０８７．２）４ｘ　１Ｈｔｒの洗浄によッテ
実施した。洗浄後、各チューブあたり０．　３Ｈｌ．の
口ＲＰ基質（ＴＭＢ／尿素口，０２）を加え、３７℃で
５分間インキュベートした。１Ｉｄの１ＮＨ３Ｐｏ４を
加えて反応を停止させ、発色量をＡ４５ｏＴ″測定した
。上述の方法で作成した標準曲線を用い、４１例の患者
血清サンプルについてＴ３濃度を測定した。得られた結
果は、一例として第２図に示されているように、既知の
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で得られた値とよく一
致した。

材料の！ｌ製 抗−ＴＳｔ−１抗体は、固定化プロテインＡによって精
製してＡｂｌＱＧ分画を得るか、純粋な市販品（Ｂｉｏ
ｓ　Ｐａｃｉｆｉｃ，　Ｈｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ，　ＣＡ
；　ＣａｍｂｒｉｄｇｅＭｅｄｉｃａｌ　，　Ｃａｍｂ
ｒｉｄｇｅ，　Ｍ＾）を入手した。八ｂビオチンはＡｂ
（０．ＩＭ　　ＮａＰｉ．０．２ＭＮａＣｊ！／ｐＨ７
．５中１〜３ＲＦＪ／Ｍ１〉とスルホーＮＨＳ−ＬＣ−
−ビオチンを混合して製造した。スルホーＮＨＳ−ＬＣ
−ごオチンは３〜５回に分けて１５分間を要して加え、
反応は室温で１．５時間進行させた。結合しなかったビ
オチン化試薬はＳｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ　−　２　５カ
ラムによって除去した。

Ａｂ：スルホ−Ｎ　Ｈ　Ｓ　−　Ｌ　Ｃ−ビオチンのモ
ル比は１：１０，１：２０および１：４０とした。接合
体は０．００１％チメロサールを含有する反応ａｉｌ液
中に保存した。

３７７．１２岬の６−カルポキシフルオレセインおよび
１１５１１！ＪのＮ｝−１８を含有するＤＭＦ３．４ｄ
に、２０６．３■のＤＣＣを含有するＤＭＦ０．６Ｍｌ
を加えた。混合物を一夜、室温で攪拌した。ジシクロヘ
ギシル尿素を１去した。

Ｆ−ＮＨＳは、ジクロ口メタン：メタノールニ酢酸−９
０：１０：１を用いてシリカプレ〜ト｝＝ＴＬＣｋ：よ
っｒチェックした．，Ｆ−Ｎ｝−ＩｓはＤＭＦ中に−２
０′ｃｒ：保存した。

抗−ＴＳＨをプロテインＡクロマトグラフィーで精製し
、０．１Ｍ　　ＮａＰｉ、０．２ＭＮａＣ１、５ｉ＋Ｈ
　　ＥＤＴＡ１ＤＨ７．３に透析した。

Ａｂ−ＦはＤＭＦ中Ａｂ（１．５〜２．ＯＩ！ｇ／ｄ）
をＦ−ＮＨＳと混合し、室温で１ＦＲ間反応させて製造
した。Ｆ−ＮＨＳ：Ａｂの比は１２．５：１および２５
：１とした。

Ｃ．抗−フルオレセインーＨＲＰ接合体の製造試薬は例
１に記載したと同様にして製造した。

Ｄアッセイブロトコール ＴＳＩ−１アッセイのプロトコールは３部がらなる。

ケなわち、１）溶液相における７ツヒイ成分（ｔ′オチ
ンＡｂ　　　．ＴＳＨ，Ａ　　　−ＦおよびＡｂ，ＴＳ
ｌｌ１　　　　　　　ｒｓＨ２ −ＨＲＰ）間の結合反応、２）凌合体のＪＦ結合成分か
らのＧＢ−７ごジンによる分離、および３）＃ｆ索基質
の添加および発色である。

ＴＳロアッセイは１０Ｘ７５ｍ＋ガラスチューブ中で実
ｍする。様々な酷の「ＳＨを含有するヒト血清またはウ
シ血清１５０μｌに、Ａｂ，−ＨＲＰ２００ｎｏを含有
するｍｓ液（０．０１ＭＮａＰｉ　１　０．１５０Ｍ　
　　ＮａＣＪ、１．Ｏ％ＢＳＡ、０．１％ｒｗｅｅｎ　
−　２　０　）　２　０　ｕ　ｔおよび、１８０ｎｇの
Ａｂ　　　−ビオチンとＡｂ　　　−ＦをＴＳＨＩ　　
　　　　　　　ＴＳＨ２ 含有するＩｌｌ液２０μｌを加える。アッセイチューブ
はボルテツクスミキサー上で攪拌し、３７℃で１２．５
分間インキュベートした。インキュベーション後、０．
６５ｇのＧＢ−アとジンを加え、インキュベーションを
さらに１２．５分間続けた。

ついで、ビーズをｉ．ｏＩｄ！の洗浄緩！ＩＩ（０．０
１Ｍ　　ＮａＰｉ、０．１５Ｍ　　ＮａＣ１、０．１％
ｒｗｅｅｎ　，　ｐＨ７　．　４　）で４回洗浄した。

洗浄後、０．２’ｄのＨ　Ｒ　Ｐ基質（ＴＭ［３／＋４
２０２）を加え、５分間発色させた．０．４−の口．Ｐ
Ｏ４を加えて反応を停止させた。サンプルを全容１．Ｏ
Ｉｌｌに希釈し、Ｏ　Ｄ　４ｓｏにおｔナる光学密度を
測定した。結果は、０．０５μ［．Ｕ「Ｓ口／′一血清
で再現できた。

例４：ｈＣＧの検出のための不均−系醇素ペースイムノ
アッセイ 材料の調製 抗−ｈＣＧ抗体は、固定化プロテインＡによって精製し
て、抗体ＩＱＧ分画を得た。このビオチンーＡｂｈｃＧ
（ｘはＮＨＳ−ＳＣ−ビオチンを用いて製造した。（こ
のＡｂｈｃＧｃｘはｈＣＧのα−サブユニットに特異性
のモノクローナル抗体であり、標準モノクローナル抗体
技術を使用して、実験室で製造した。〉上記Ａｂ　（２
〜４　ｑ／ｄ　）を０．ＩＭ　　ＮａＨＣ０３、ｐＨ８
．２中に透析した。

Ｎ　Ｈ　Ｓ　−　Ｌ　Ｃ−ビオチンは一夜にわたり乾燥
させた。Ａｂに対して５０倍モル過剰のＮＨＳ−ＬＣ−
ビオチンを、′ａ拌されているＡｂにゆっくり加え、室
温て゛１．５時ＩＩ！１１！！拌した。結合しなかった
ビオチン化試薬は０．０２％ＮａＮ３を使用し、ＰＢＳ
に対しで透析することによー〕で分離した，，接合体は
ＰＢＳ／０．０２％Ｎａ口３中に保存した。

Ａ．ＮＥＳ−Ｆの製造：Ａｂｈｏｏβ−７ルオレセイン
は、ＮＨＳ／ＥＤＡＣ化学によって製造した。

（このＡｂｈＣ６βはｈＣＧのβ−サブユニットに対し
て特異性のモノクローナル抗体であり、標準七ノク【コ
ーナル抗体技術を使用して、実験室′Ｃ製造した〉。こ
の抗体（プロテインＡカラムで［１したちの）を０．１
Ｍ　　ＮａＨＣ○３、ｐＨ８．２中に透析した。６−カ
ルボキシフルオレセイン、スルホーＮＥＳおよびＥＤＡ
Ｃは、Ｐ２ｏ５上で一夜にわたり乾燥させた。スルホー
ＮＦＳ２．ＩＮ！ｉ（９．７μモル）　、ＥＤＡＣ１．
７４ＩＲｇ（９．０６μモノＬ，）　およＵ　６　−　
Ｃ　０　０口一Ｆ２．６ｊｌ９（１６．９μモル）を乾
燥ＤＭＦ１３８μｌ中に溶解し、明所で、４℃において
一夜にわたりａｎした。シリカ板上でクロロホルム；メ
タノール：酢１９０：１０：１を使用する簿層クロ７ト
グラフィ（ＴＬＣ）を行ない、Ｎ　ｌ−Ｉ　Ｓ　−　Ｆ
エステル反応が完了に達したかを決定した。

８．Ａｂｈｃ６β−フルオレセイン： 魔拌されているＡｂ（３〜５■／ｄ）に、３０倍モル過
剰のＮ｝−１８−Ｆをゆっくり加え、この反応は室温で
２時間進行させた。未反応のＮＨＳＥはＰＢＳ／０．０
２％Ｎａ口。に対して透析することによって分離し、接
合体はこのａ衝液中に保存した。

抗フルオレセイン抗体は、ブＯナイン八カラムで精製し
た。この接合体はチオール化抗フルオレセインＡｂとマ
レイミド化目ＲＰとの反応によって製造した。チオール
化ＡｂＦはＳＡＭＳＡとの反応によって製造した。口Ｒ
Ｐは、スルホーＳＭＣＣとの反応によって、マレイミド
化した。下記のプロトコールをＡｂ，一日ＲＰ接合体の
製造に使用した。

口ＲＰ（９．６■．”　ｄ　）は、マレイミド化処周１
の間、５０ｌＨホ・ク＃ＩＩｌ！緩ＩＩ液中に保持した
，この口ＲＰに、１０倍過剰のスルホーＳＭＣＣ（同一
ホウ酸塩緩１！ｉ液中）を加え、反応を２５℃で２時間
、進行させた。この反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘ　　
Ｇ２５カラムに通し、緩衝液Ｃ（０．１〜ＩＮａ｝−ｆ
　　ＰＯ　　，０．ＩＭ　　ＮａＣＩ、５ｍ｝１２４ ＥＤＴＡ，Ｉ）８７．５）中に透析した。

ＡｂＦをチオール化するために、５０ｌｌＨ４炭酸塩１
１１ｉ液、ｐＨ９．５中のＡ　ｂ　１　７．　９ａｙ／
ｄおよび乾燥ジメチルホルム７ミド（ＤＭＦ）中に０．
１Ｍで溶解したＳ−アセチルメルカブト無水コハクＰＩ
Ｉ（ＳＡＭＳＡ）を使用した。ｉｌｌ痒ざれているＡｂ
１に、２４ｆＲモル過剰のＳＡＭＳＡをゆっくり加え、
４℃で１．５時間、反応させた。過剰の試薬は３ｅｐｈ
ａｄｅｘ　　Ｇ　−　２　５カラムでゲノレク口マトグ
ラフィによって分謔した。生戒物は、緩衝液Ｃ中に透析
した。脱アシル化は、誘導されたＡｂＦをヒドロキシル
アミンの溶液中でインキュｌ＼一卜することによった達
成した。ｌ１！拌されている、誘導されたＡｂＦに、ヒ
ドロ↓シルアミンの１Ｍｌ！をゆっくり加え（１００ｓ
Ｍのヒドロキシルアミン最終濃度まで〉、窒素雰囲気の
Ｆに、２５℃で１時間、インキュベートした。このＡｂ
，−Ｓｌ一目；Ａ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ　−　２　
５カラムで精製した。

接合体は、Ａｂ１−Ｓ口に１２倍モル過剰の口ＲＰ−マ
レイミドを加え、室温で３時間攪拌した。

反応は、２−メルカブト酢酸の添加（１−Ｈの最終濃度
まで）および１５分間の攪拌によって、止めた。ヨード
酢酸を加え（２１１８の最終濃度）、過剰の２−メルカ
ブト酢酸を抑え、この反応を５分問、進行さセタ。接合
体は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　ｓ　．　２　０　０力ラム
で精製した。接合体の最終濃度は、ＩｇＧ当り６．２Ｈ
ＲＰ７：−、１　．　　４ＪＩ９／ｘｄｌ’Ｑアッた。

ｈＣＧアッセイブロトコール アッセイは、１２Ｘ７５ａｍ使い捨てガラスチュ−ブ中
で、標準血清試料または未知血清試料１００μｌ１アッ
セイ！１１液中の０．４μｇ／ｄ（２Ｏｎｇ／試ＩＩ）
ＡｂＦ一口ＲＰ５０μ！および７ツセイ標識液中の６μ
ｇ７／ＩＩｌ．ビオチン−ＡｂｈｃＧｃｙ（　３０　０
　ｎｇ　／試験）と０．６μｚ／ＭＩＡ　ｂｈｏｏβ−
　Ｆ　（３　０ｎＭ試１）との混合物５０μｌを順に添
加することによって行なった。この７ツセイ混合物は、
おだやかに混合し、次い′Ｃ″３７℃で１３分間、イン
キュベートした。インキュベーシ３ンの後に、結合した
シグナル発生体（八ｂ，−ＨＲＰ）を非結合成分から分
離するために、各チューブにＧＢ−アビジン０．６５ｇ
を添加し、３７℃で１３分間インキュベートし、次いで
洗浄！ｌＷＪ液（１０ｅＨ　　＋）ンＷＦＡ、ｐｆｌ７
．２）４ｘｌｍで洗浄した。洗浄の後に、Ｉ−Ｉ　Ｒ　
Ｐ　Ｗ質（ＴＭＢ／尿素ト１２０２＞　０．２５ｄ／チ
ューブを加え、３７℃で５分間、インキュベートした。

反応は、１Ｎ　　Ｈ　　Ｓ０４１ｄの添加によって止め
た。発色２ 樋をＡ　　で測定した。

４５０ ｈＣＧアッセイの結果 このアッセイおよび対照アツセイ（　Ｈｙｂｒ　ｉ　ｔ
ｅｃｈＴａｎｄｅｍ−Ｅ　）で、４４の患者の未知試料
を試験した。

スカツターダラムから誘導された等式はｙ＝０．９５４
ｘ−３．２お上びγ＝０．９５６　（γは相関係数）で
あった。

以上の記述および実施例は、その好ましい態様における
混合物を完全に開示するためのものである。本技術分野
の通常の熟練者には様々な改変が自明であろうが、これ
らは本発明の特．ｉ′！Ｆ　Ｍ求の範囲に包含されるも
のである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、患者血清試料中ジゴキシン濃度に対する例１
の結果と既知のＲＩＡＩＩとの相関を示すグラフであり
、そして第２図は例２によって測定サレタ血清試料（ｎ
ｌＪ／ｄｊ！）もしくはＲＩＡ（Ｅｉ床実験室であらか
じめ測定された〉とＴ３濃度との相関を示すグラフであ
る。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）アツセイメジウム中に （ｉ）被験物質の含有が疑われるサンプルおよび （ｉｉ）上記被験物質の検出に有用な複数の試薬であっ
   て、ひとつは支持体をひとつは標識を包含する試薬を加
   え、 （ｂ）上記メジウムと上記支持体を分離し、上記サンプ
   ル中の被験物質の存在または量に関連する上記標識の存
   在または量を上記メジウムまたは支持体について観察す
   ることからなる被験物質のイムノアッセイを行う方法に
   おいて、上記試薬の２種として第一および第二の接合体
   を使用し、その各接合体は、上記アツセイメジウム中で
   互いに相補性の特異的結合対（ｓｂｐ）のメンバーから
   なり、その各メンバーは小分子に結合し、この小分子は
   各接合体で互いに異なる改良方法
2. （２）被験物質のイムノアッセイを行う方法において、 （ａ）（ｉ）上記被験物質の受容体と上記被験物質の類
   縁体からなる第一の特異的結合対（ｓｂｐ）の一方に結
   合した第一の小分子、 （ｉｉ）第一の小分子に対する第一の受容体に結合した
   標識、 （ｉｉｉ）上記被験物質の含有が疑われるサンプル、 （ｉｖ）上記被験物質または上記第一のｓｂＰの上記の
   一方に相補性でＸに結合する第二のｓｂｐのメンバー（
   Ｘは第二の小分子（Ｚ）またはその第二の小分子に対す
   る第二の受容体（抗−Ｚ）である）、 （ｖ）Ｙに結合した支持体（ＹはＺまたは抗−Ｚであり
   、ＹはＸとは実質的に異なる）を水性メジウム中に混合
   し、 （ｂ）上記メジウムと上記支持体とを分離し、 （ｃ）上記サンプル中の被験物質の存在または量に関連
   する上記標識の存在または量を上記メジウムまたは上記
   支持体について観察することからなる方法
3. （３）第一の小分子の分子量は１５０〜１０００である
   請求項（１）または（２）記載の方法
4. （４）第二の小分子の分子量は１５０〜１０００である
   請求項（１）または（２）記載の方法
5. （５）イムノアッセイを行うにあたり、 （ａ）（ｉ）第一の小分子と（イ）被験物質（Ａ）に相
   補性の第一の特異的結合対（ｓｂｐ）メンバーまたは（
   ロ）上記被験物質の類縁体との接合体（Ｃ１）、 （ｉｉ）上記被験物質の含有が疑われるサンプル、 （ｉｉｉ）第二の小分子と（イ）上記被験物質に相補性
   の第二のｓｂｐメンバーまたは（ロ）上記被験物質の類
   縁体との接合体（Ｃ３）を水性メジウム中に混合し（た
   だしこの場合、Ｃ１およびＣ３の少なくとも一方は、上
   記被験物質に相補性のｓｂｐメンバーを含有する）、 （ｂ）この水性メジウムを工程（ａ）と同時にまたは工
   程（ａ）に続くインキュベーション後に、上記第二の小
   分子に対する第二の受容体に結合した支持体（Ｓ）と、
   上記接合体（Ｃ１）を含む複合体が上記支持体に上記サ
   ンプル中の上記被験物質の存在の関数として結合する条
   件下に、混合し、 （ｃ）上記水性メジウムを上記支持体とインキュベート
   し、 （ｄ）上記メジウムと上記支持体とを分離し、 （ｅ）標識と第一の小分子に対する第一の受容体との接
   合体（Ｃ２）が上記水性メジウム中に存在しない場合は
   その接合体（Ｃ２）溶液を支持体と混合し、 （ｆ）上記標識の存在または量を上記支持体について観
   察する請求項（１）記載の方法
6. （６）サンプル中の被験物質の検出のためのイムノアツ
   セイを行うにあたり、 （ａ）（ｉ）第一の小分子と上記被験物質の順縁体との
   接合体（Ｃ′１）、 （ｉｉ）上記被験物質の含有が疑われる上記サンプル、 （ｉｉｉ）第二の小分子と上記被験物質に相補性の抗体
   との接合体（Ｃ′３）、 （ｉｖ）標識と上記小分子の一方に相補性の抗体との接
   合体（Ｃ′２）を水性メジウム中に混合し、 （ｂ）この水性メジウムを工程（ａ）と同時にまたは工
   程（ａ）に続くインキュベーシヨン後に、上記小分子の
   他方に対する受容体に結合した支持体（Ｓ）と、上記標
   識を有する複合体が上記サンプル中に存在する上記被験
   物質の量に相反する関係で上記支持体表面に結合する条
   件下に混合し、 （ｃ）上記メジウムと上記支持体を分離し、 （ｄ）上記標識の存在または量を上記メジウムまたは上
   記支持体について観察する請求項（１）記載の方法
7. （７）サンプル中における存在が疑われるモノエピトー
   プ抗原を検出するにあたり、上記サンプル中の上記抗原
   の量に相反する関係で、複合体標識−Ａｂ＿Ｆ：Ｆ−ハ
   プテン：Ａｂ＿ハ＿プ＿テ＿ン−Ｘ：Ｙ−支持体 （式中、標識−Ａｂ＿Ｆは標識に結合した第一の小分子
   （Ｆ）に対する抗体であり、Ｆ−ハプテンは上記抗原の
   類縁体に結合した上記第一の小分子であり、Ａｂ＿ハ＿
   プ＿テ＿ン−Ｘは第二の小分子（Ｘ）に結合した上記抗
   原に対する抗体であり、Ｙ−支持体は支持体に結合した
   上記第二の小分子に対する受容体である） を形成させる工程からなる請求項（１）記載のアッセイ
8. （８）サンプル中の抗体被験物質（Ａ）の検出のための
   アッセイを行うにあたり、 （ａ）（ｉ）第一の小分子と（イ）上記抗体被験物質に
   相補性の抗体または（ロ）上記抗体被験物質の抗原との
   接合体（Ｃ″１）、 （ｉｉ）標識と上記第一の小分子の第一の受容体との接
   合体（Ｃ″２）、 （ｉｉｉ）上記抗体被験物質の含有が疑われるサンプル
   、 （ｉｖ）（イ）上記抗体被験物に相補性の第二の抗体ま
   たは（ロ）上記抗体被験物質の抗原と第二の小分子との
   接合体（Ｃ”３）を水性メジウム中に混合し、 （ｂ）この水性メジウムを工程（ａ）と同時にまたは工
   程（ａ）に続くインキュベーション後に、上記第二の小
   分子に対する第二の受容体に結合した支持体（Ｓ）と、
   上記標識を含む複合体が上記サンプル中の上記被験物質
   の存在の関数として上記支持体の表面に結合する条件下
   に混合し、 （ｃ）上記メジウムと上記支持体とを分離し、 （ｄ）上記サンプル中の抗体の存在または量に関連する
   上記標識の存在または量を上記メジウムまたは支持体に
   ついて観察する請求項（１）記載の方法
9. （９）サンプル中に存在するハプテンを検出するにあた
   り、複合体 標識−Ａｂ＿Ｆ：Ｆ−ハプテン：Ａｂ＿ハ＿プ＿テ＿ン
   −Ｘ：Ｙ−支持体 （式中、標識−Ａｂ＿Ｆは標識に結合した抗−フルオレ
   セイン抗体であり、Ｆ−ハプテンはフルオレセイン結合
   ハプテンであり、Ａｂ＿ハ＿プ＿テ＿ン−Ｘはビオチン
   に結合した抗−ハプテン抗体であり、Ｙ−支持体は支持
   体に結合したアビジンである）を形成させる工程からな
   る請求項（１）記載のアッセイ
10. （１０）被験物質のイムノアッセイを行うためのキット
    であって、 （ａ）第一の小分子と上記被験物質に相補性の第一の特
    異的結合対（ｓｂｐ）メンバーとの接合体、および（ｂ
    ）第二の小分子と上記被験物質の類縁体であるかまたは
    上記被験物質に相補性の第二のｓｂｐメンバーとの接合
    体をパッケージした形のキット