CN1153970C - 同时检测结合对的两个成员的方法 - Google Patents

同时检测结合对的两个成员的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1153970C
CN1153970C CNB008124671A CN00812467A CN1153970C CN 1153970 C CN1153970 C CN 1153970C CN B008124671 A CNB008124671 A CN B008124671A CN 00812467 A CN00812467 A CN 00812467A CN 1153970 C CN1153970 C CN 1153970C
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
antigen
conjunction
mark
binding affinity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB008124671A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1382258A (zh
Inventor
D��P������
D·P·柯林斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bioergonomics Inc
Original Assignee
Bioergonomics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bioergonomics Inc filed Critical Bioergonomics Inc
Publication of CN1382258A publication Critical patent/CN1382258A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1153970C publication Critical patent/CN1153970C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2474/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by detection mode or means of detection
    • G01N2474/20—Immunohistochemistry assay
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/968—High energy substrates, e.g. fluorescent, chemiluminescent, radioactive
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/971—Capture of complex after antigen-antibody reaction
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/973—Simultaneous determination of more than one analyte
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/974—Aids related test
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

Abstract

同时免疫学测定生物样品中一结合对的两个成员A和B(如抗体和抗原)，通过：1)使样品与结合于颗粒的抗-A抗体一起培育，产生颗粒-抗体-A复合物；2)培育该复合物与标记的抗-A和抗-B抗体；和3)用流式细胞计数法检测这些标记。

Description

同时检测结合对的两个成员的方法
技术领域
本发明涉及同时检测生物样品中结合对的两个成员的方法。
发明背景
用于输血和输注血液成分的血制品必须常规筛检有无感染因子如人免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎病毒、人T-淋巴细胞嗜性病毒和巨细胞病毒的存在。通常用酶免疫试验分析(EIA)或放射免疫试验(RIA)通过鉴定病毒抗原或通过检测针对病毒的免疫应答(即宿主产生的抗病毒抗体)来检测这些因子。免疫试验技术检测感染早期的病毒污染能力有限，对于HIV，病毒感染和免疫试验技术检测之间的窗口期大约是2-4周，对于丙肝病毒(HCV)达10周左右。逆转录酶聚合酶链式反应(RTPCR)或支链DNA分析等技术能缩短感染和检测之间的时间段，但用于单个献血者其花费使人望而却步，而且不能消除窗口期。
Kortright等于1987年6月15日提交的美国专利号4,870,003公开了一种检测HIV抗原和抗HIV抗体的系统，包括用固定化的抗HIV抗体捕获病毒抗原，并用生物素标记的人抗HIV抗体进行检测。在实验前，在病人的样品中加入已知浓度的病毒抗原。根据突出的抗原是增加还是降低光密度，间接测定HIV抗原/抗HIV抗体结合对的成员之一是否存在。Kortright等的专利没有表明可用两种不同标记的抗体(一种对成员A具有特异性，另一种对于成员B具有特异性)同时测定结合对的两个成员。
发明简述
本发明的基础是一种同时检测生物样品中结合对的两个成员(如配体和受体或抗原和宿主抗体)的快速和灵敏的方法。例如，本发明的方法可提高检测早期感染的能力，从而及早治疗感染。
本发明的特征是一种同时检测生物样品中结合对的两个成员A和B的方法。生物样品选自血液、血浆、血清、尿、脑脊液、痰液、泪液、羊水、玻璃体液、唾液和组织培养上清液。该方法包括提供一种固相试剂，该试剂包括用捕获抗体包被的颗粒，该捕获抗体对此结合对的成员A有特异性结合亲和力；在如果存在成员A，生物样品可与颗粒结合的情况下使生物样品与该固相试剂接触，形成第一反应颗粒。捕获抗体可以是单克隆抗体。使第一反应颗粒与对成员A具有特异性结合亲和力的一抗接触(其中一抗用第一标记标记)，并与对该结合对的成员B具有特异性结合亲和力的二抗(其中二抗用第二标记标记)接触，形成第二反应颗粒。一抗和二抗可以是单克隆。用流式细胞计数法测定第二反应颗粒上的第一和第二标记(如荧光团)。
在一些实施例中，基本上所有的捕获抗体都排列(orient)在颗粒上，这样捕获抗体的抗原结合区域可用于结合该结合对的成员A。
结合对的成员A可以是一种抗原，而成员B可以是一种宿主抗体。该抗原可以是病毒抗原，如丙肝抗原、乙肝抗原或人免疫缺陷病毒抗原、或自身抗原如谷氨酸脱羧酶。结合对的成员A也可以是一种配体，如细胞因子，而成员B可以是受体，如细胞因子受体。另外，成员A可以是一种酶，而成员B可以是底物。例如酶可以是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3或天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1，而底物可以分别是聚(ADP-核糖)聚合酶或白细胞介素原-1(proInterleukin-1)。
本发明的特征还包括同时检测生物样品中结合对的两个成员A和B的试剂盒。该试剂盒包括：一固相试剂，它包括用对此结合对成员A有特异性结合亲和力的捕获抗体包被的颗粒；和对此结合对成员A具有特异性结合亲和力的一抗，其中一抗用第一标记标记；和对该结合对成员B有特异性结合亲和力的二抗，其中二抗用第二标记标记。基本上所有的捕获抗体都排列在颗粒上，这样捕获抗体的抗原结合区域可用于结合该结合对的成员A。该试剂盒还包括标签或包装插页，它说明固相试剂、标记的一抗和标记的二抗可用于流式细胞计数法同时测定生物样品中结合对的两个成员A和B。
从下面的详述和权利要求将会明白本发明的其它特征和优点。
附图简述
图1是示意图，代表检测成员A和宿主抗成员A抗体(成员B)的试验。
图2A-2H是分布图，表示用流式细胞计数法同时检测乙肝病毒(HBV)表面抗原、抗HBV宿主抗体、HCV核心抗原和抗HCV宿主抗体。图2A是正常样品中的HBV抗原和抗体。图2B是正常样品中的HCV抗原和抗体。图2C是HBV阳性样品中的HBV抗原和抗体。图2D是HBV阳性样品中的HCV抗原和抗体。图2E是HCV阳性样品中的HBV抗原和抗体。图2F是HCV阳性样品中的HCV抗原和抗体。图2G是HBV阳性/HCV阳性样品中的HBV抗原和抗体。图2H是HBV阳性/HCV阳性样品中的HCV抗原和抗体。
发明详述
免疫试验方式
总的说，本发明使用了同时检测生物样品中结合对成员的夹心免疫试验法。结合对包括能形成复合物的分子的任何组合，包括由核酸、蛋白质或小分子和蛋白质组成的配对，核酸对可以是DNA：RNA对或DNA：DNA对。例如，单链(ss)DNA和mRNA等DNA/RNA结合对，可以用作PCR产物检测系统。ssDNA和病毒DNA等DNA/DNA对可用于竞争试验来定量测定病毒的每条扩增的DNA。
蛋白质，或小分子和蛋白质结合对的非限制性例子包括激素、细胞因子、肽、药物、病毒蛋白质或其它抗原和同源受体或宿主抗体。病毒蛋白/受体结合对可以是例如HIV gp120和可溶性CD4。药物和药物受体结合对可以是，例如可卡因和多巴胺受体。肽和肽受体结合对可以是，例如乙酰胆碱和蝇蕈碱受体或多巴胺和多巴胺受体。激素和激素受体结合对可以是，例如胰岛素和胰岛素受体。细胞因子和细胞因子结合对可以是，例如肿瘤坏死因子(TNF)和TNF1型或2型受体或白细胞介素2(IL-2)和IL-2受体。抗原和抗体配对可以是，例如病毒蛋白质和宿主抗病毒蛋白质抗体或自身抗原和宿主抗自身抗原抗体。HIV p24/人抗HIV抗体、HIVgp120/人抗HIVgp120抗体、HBV表面抗原/人抗HBV表面抗原抗体和HCV核心蛋白质/人抗-HCV核心抗体是病毒蛋白质和宿主抗体结合对的例子。自身抗原和宿主抗自身抗原抗体结合对可以是，例如谷氨酸脱羧酶(GAD)和宿主抗-GAD抗体。
可检测的其它蛋白质结合对是酶和酶底物结合对。例如，酶/底物配对可以是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3/聚(ADP-核糖)聚合酶或天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1/白细胞介素原-1。
成员A可以是结合对的任一成员，它能被对成员A具有特异性结合亲和力的捕获抗体包被的颗粒的固相试剂所捕获。例如，如果要同时检测的结合对是HIVgp120/宿主抗HIV gp120抗体，可用对HIV gp120具有特异结合亲和力的抗体或抗宿主免疫球蛋白(Ig)包被颗粒。
使生物样品与包被的捕获抗体颗粒接触，而捕获成员A。本文所用的合适的生物样品含有细胞或细胞物质，包括例如血液、血浆、血清、尿、唾液、痰、泪液、玻璃体液和脑脊液。其它样品可包括体外组织培养液/上清液。可用非离子去污剂(如0.5％ Triton-X 100或Nonidet P40，Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)处理生物样品，使病原体的核心抗原暴露。
可在促进成员A(如存在)与颗粒结合的条件下使固相试剂和生物样品接触，形成第一反应颗粒。这些条件可包括：室温下，采用磷酸缓冲盐水(PBS)配的含有1％胎牛血清(FBS)和0.1％叠氮化钠的缓冲液，或在生理pH条件下使用任何生物液。然后，使第一反应颗粒与两组标记的抗体(即报道抗体)接触，形成第二反应颗粒。一抗对成员A具有特异性结合亲和力，用第一标记标记。一抗能与成员A结合，而同时成员A与捕获抗体结合。这样捕获抗体与一抗必须成对起作用。二抗对结合对的成员B具有特异性结合亲和力，用第二标记标记。在该方法中特别有用的是荧光标记的抗体。
图1提供了检测成员A和宿主抗-成员A抗体的试验的示意图。在该实施例中，生物素化捕获抗体对成员A具有特异性结合亲和力，并通过亲和素与捕获珠偶联。一抗对成员A具有特异性结合亲和力，用藻红素(第一标记)标记。二抗用花青-藻红素(第二标记)标记，对宿主Ig(成员B)具有特异性结合亲和力。第一反应颗粒包括成员A、宿主抗成员A抗体、捕获抗体和固相试剂(如抗原捕获珠)，第二反应颗粒中包括第一反应颗粒和两种标记的抗体。
可用流式细胞计数法测定第二反应颗粒上的标记量。本文所用的术语“测定”指定性和定量测定。换言之，术语“测定”包括报道标记在第二反应颗粒上的存在与否，和测定存在的标记量。使用滤光片分开发射的荧光，并用光电倍增管分别放大单个发射光信号，流式细胞计数法能测定至少三种范围的分离的荧光发射波长。与颗粒有关的发射荧光强度与生物样品中存在的分析物的浓度成正比。因此，使用具有不同发射光谱的不同染料(其中各染料与不同抗体偶联)，可分析每种颗粒群中的多种分析物。流式细胞计数法还能分辨不同粒径的颗粒，如直径约7微米的颗粒可与直径约10微米的颗粒相区别。因此可用多种荧光染料的组合和2或3种不同平均粒径的颗粒群检测其它成分。
抗体生产
可用标准方法产生对成员A或成员B具有特异性结合亲和力的抗体。另外，可购得抗体，例如从BiosPacific(Emeryville，CA)、Coulter(Hialeah，FL)、MaineBiotechnology Service(Portland，ME)或Biodesign International(Kennebunk，ME)。本文所用的术语“抗体”包括能与成员A或成员B的表位决定簇结合的完整分子及其片段。术语“表位”指抗原上与抗体互补位结合的抗原决定簇。表位决定簇常常由分子(如氨基酸或糖侧链)的化学活性表面基团组成，通常具有特异性三维结构和特异性带电特征。表位通常具有至少5个连续的氨基酸。因此术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体，人源化或嵌合抗体、单链Fv抗体片段，Fab片段和F(ab)2片段。单克隆抗体特别有用。
一般感兴趣的蛋白质是重组，化学合成或纯化天然蛋白产生的，然后用于免疫动物。可通过注射感兴趣的蛋白质来免疫各种宿主动物(例如家兔、鸡、小鼠、豚鼠和大鼠)。可用佐剂增强依赖于宿主物种的免疫应答，佐剂包括弗氏佐剂(完全和不完全的)、矿物凝胶(如氢氧化铝)、表面活性物质(如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阳离子、肽、油乳剂、匙孔 血蓝蛋白(KLH)和二硝基苯酚)。多克隆抗体是对一特定抗原具有特异性的抗体分子的异质性群体，包含在接种动物的血清中。可用标准杂交瘤技术制备单克隆抗体，它是针对抗原中所含的特定表位的抗体的均质性群体。具体说，单克隆抗体能用培养连续细胞系生产抗体分子的技术获得，如Kohler，G.等，Nature，1975，256：495所述，人B-细胞杂交瘤技术(Kosbor等，Immunology Today，1983，4：72；Cole等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1983，80：2026)和EBV杂交瘤技术(Cole等“单克隆抗体和癌症治疗”Alan R.Liss Inc.1983，77-96页)所述。这些抗体可以是任何一类免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任一亚类。可在体外或体内培养杂交瘤来产生本发明的单克隆抗体。
嵌合抗体是一种分子，其中不同部分衍生自不同种动物，例如具有衍生自小鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白的稳定区的嵌合抗体。可用标准技术产生嵌合抗体。
可用已知技术产生对成员A或B具有特异性结合亲和力的抗体片段。例如这些片段包括但不限于：可通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab’)2片段，通过还原F(ab’)2片段的二硫键产生的Fab片段。另外，可构建Fab表达文库。见例如，Huse等，1989，Science 246：1275。可通过一氨基酸桥(如15-18个氨基酸)连接Fv区的重链和轻链片段，产生一单链多肽，形成单链Fv抗体片段。可用标准技术制备单链Fv抗体片段。见例如美国专利号4,946,778。
产生后，用标准免疫试验法测试抗体及其片段对成员A或成员B的识别，这些方法包括例如ELISA技术或RIA。见“分子生物学中的短方案”，11章，GreenPublishing Associates and John Wiley and Sons，Ausubel，F.M等编，1992。合适的抗体优选对重组和天然蛋白质具有相等的结合亲和力。
另外，可在荧光夹心试验法中以下列方式评估抗体形成结合对的能力。可用生物素化抗体(例如抗病毒蛋白质抗体)包被珠，然后与2纳克/毫升合适的蛋白质(如重组病毒蛋白)以100微升体积温育约30分钟。用2毫升缓冲液(含有1％FBS和0.1％叠氮化钠的PBS溶液)洗涤珠两次后，将珠与约0.5微克藻红素标记的抗体一起温育。能产生强荧光信号的抗体对适用于本发明的试验。
固相试剂
合适的颗粒(如珠)具有约2-15微米的平均直径，可以是聚苯乙烯、磁铁或顺磁性颗粒。例如，颗粒可具有约4-11微米的平均直径。典型的平均粒径为约4-5微米、7-8微米和10-11微米。颗粒可购自例如Spherotech Inc.，Libertyville，IL。可用捕获抗体通过已知技术包被颗粒。例如可用生物素化捕获抗体包被亲和素或链霉亲和素包被的顺磁珠。通常将亲和素或链霉亲和素包被的珠重悬浮在盐溶液(如PBS)中，与生物素化抗体在饱和条件下(每3.9×107微米珠约40微克蛋白质)混合，室温温育。结合完成后，洗涤珠，用例如含有1％FBS和0.1％叠氮化钠的PBS缓冲液封闭。
当测定核酸结合对时，可将亲和素或链霉亲和素包被的珠与生物素化核酸偶联。可用标准的缺口翻译反应掺入生物素-11-dUTP用生物素标记核酸。
在具体实施例中，基本上所有的捕获抗体都排列在颗粒上，使得抗原结合区能用于结合成员A，而提高了试验的整体灵敏度。术语“基本上所有”表明至少80％，优选至少90％(如95％-99％)抗体以该形式排列。可通过测定与藻红素标记的山羊抗小鼠抗体的结合有关的荧光，并与标准荧光颗粒比较定量估计排列百分率。当抗体主要在抗原结合区以外的氨基酸残基上生物素化时，抗体的抗原结合区能用于结合成员A。因此在抗体的生物素化过程中，使用约5∶1到10∶1的生物素：抗体摩尔比和其它标准反应条件。例如，在约8.1的pH下可使用生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯或生物素琥珀酰亚胺酯。另外，在pH4.5-5.0时可使用生物素肼。
由于捕获生物样品中的成员A不限于常规试验的200微升或以下的反应体积，从而提高了试验灵敏度。易于从大体积生物样品中用磁性分离或离心收集颗粒。另外，每个颗粒含有平均约180,000-240,000个抗体结合位点，约300,000-350,000个生物素化抗原结合位点。因此，各颗粒结合能力强，对抗原浓度的分析有效范围大。
可检测标记
通过采用发射的有色光与其它荧光团发射光有反差的荧光团来标记，可清楚的观察各标记抗体。例如，可使用下列荧光团的组合：7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)，TexasRedTM(Molecular Probes，Inc.Eugene，OR)，5-(和-6)-羧基-X-罗丹明、丽丝胺罗丹明B、5-(和-6)-羧基荧光素、荧光素-5-异硫氰酸酯(FITC)、7-二乙基氨基香豆素-3-羧酸、四甲基罗丹明-5-(和-6)-异硫氰酸酯、5-(和-6)-羧基四甲基罗丹明、7-羟基香豆素-3-羧酸、6-[荧光素5-(和-6)-氨甲酰基]己酸、N-(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二吖-3-茚(indacene)丙酸、曙红-5-异硫氰酸酯、赤藓红-5-异硫氰酸酯、藻红素(B-、R-或花青-)、异藻青素、Oregon GreenTM和CacadeTM蓝乙酰叠氮(Molecular Probes，Inc.Eugene，OR)。
也可用半导体纳米晶体标记抗体。水溶性纳米晶体由包封在硅壳中的不同大小的镉-硒/镉-硫核心-外壳纳米晶体组成，或由溶于巯基乙酸中的镉-硒/锌-硫纳米晶体组成。这些水溶性纳米晶体具有狭窄的、可调谐的、对称的发射光谱，是光度测定稳定的。见Bruchez，Jr.等，Science，1998，281：2013-2016；和Chan等，Science，1998，281：2016-2018。
多种抗原和宿主抗体的检测
可用标记组合，如Oregon GreenTM(Molecular Probes，Inc.Eugene，OR)、藻红素和花青-藻红素检测两种抗原和一种宿主抗体。例如，可用对HCV具有特异性结合亲和力的藻红素标记抗体，对HBV表面抗原具有特异性结合亲和力的OregonGreenTM标记抗体和花青-藻红素标记的抗宿主Ig抗体，同时检测HCV、HBV表面抗原、宿主抗-HCV抗体和宿主抗-HBV表面抗原抗体。用三种不同标记和两群具有不同粒径(如平均直径为7-8微米和10-11微米)的颗粒能同时检测多达6种不同的待测病毒抗原和宿主抗体。用第三群平均粒径不同的颗粒能检测多达9种不同的待测病毒抗原和宿主抗体。
一旦病人血清阳转(即产生宿主抗体)，在血浆样品中难于检测到病毒抗原，因为病毒颗粒上捕获或报道抗体的结合位点已被宿主抗体封闭。本发明克服了该困难，因为用具有不同标记的两种抗体同时检测宿主抗体和病毒抗原(或结合对复合物的两个成员)。用这种方式检测结合对复合物的两个成员提供两种信号，显示了例如病毒抗原和宿主抗体。这是一种更灵敏的实验，提供了传统免疫实验方法所不能获得的信息(例如，宿主是否已经血清转化)。因此，可用本方法在传统免疫试验法不能检测的情况下检测病毒抗原。如本文所述，可用包被了对病毒蛋白质具有特异性结合亲和力的单克隆抗体的颗粒捕获病毒抗原，用针对血清阳性个人中病毒蛋白质的报道单克隆抗体检测其存在。可同时通过标记的山羊抗人Ig检测针对病毒蛋白质的宿主抗体。检测到病毒蛋白质但没有检测到宿主抗体表明宿主最近被感染，未发生血清阳转，而检测到病毒蛋白质和宿主抗体表明感染和血清阳转均存在。在一些样品中，当一抗结合位点不能使用时，可检测到宿主抗体，但检测不到病毒蛋白质。虽然病毒蛋白质在这种情况下不能直接检测到，但病毒蛋白质仍然存在于样品中，因为针对病毒蛋白质的抗体包被的捕获珠捕获的是病毒抗原和宿主抗体的免疫复合物。
本发明将通过下列实施例进一步描述，这不限制权利要求中所述的本发明的范围。
实施例
实施例1-蛋白质的生物素化：以5毫克/毫升浓度偶联抗体；以1毫克/毫升浓度偶联病毒抗原。为了生物素标记的抗-病毒蛋白抗体和病毒抗原，用合适大小的Centricon(Amicon)滤膜将蛋白质交换成100mM KH2CO3缓冲液(pH8.3)。
在使用之前立即制备生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯(Molecular Probes，Eugene，OR)的DMSO(10毫克/毫升，Sigma Chmical Co.，St.Louis，MO，目录号#D8779)溶液，并以5∶1到10∶1的摩尔比加到要生物素化的蛋白质中。轻微漩涡振荡蛋白质溶液，在蛋白质溶液中加入生物素/DMSO并充分混合进行反应。蛋白质和生物素酯在室温下避光反应1小时。在10毫升Sephadex-25凝胶柱或旋转柱上用1X PBS洗脱，将游离生物素与偶联的蛋白质分开。收集各组分各1毫升，测A280纳米吸光值收集代表A280第一峰的组分并合并，丢弃剩余的组分，包括代表第二个A280峰的那些组分。
当使用旋转柱时，在4根旋转柱之间平均分配反应混合物，用Serofuge离心机高速旋转2分钟。收集通过柱的物质，用1X PBS装满柱进行洗涤，在Serofuge中高速旋转2分钟，重复5次。将收集的物质重新等量分配在4根柱中，然后用Serofuge离心机高速旋转2分钟。收集通过柱的物质，合并，重新分析A280并测定浓度。偶联蛋白储藏在4℃。
实施例2-分析物捕获珠的产生：充分混合，完全重悬浮亲和素包被的顺磁珠(7微米，Spherotech，VM-60-100)制备分析物捕获珠。将珠(通常3.8×106珠)置于50毫升离心管中，与30毫升1XPBS混合。用磁铁将珠留在试管壁上，除去全部PBS。用PBS洗涤珠两次以上。
最后一次PBS洗涤后，在珠中加入所需体积的生物素化抗体(通常40微克)和2毫升1X PBS。连续漩涡振荡至少3小时，或漩涡振荡1小时，重新悬浮珠，然后4℃储藏过夜。储藏过夜的珠翌日早晨再漩涡振荡2小时。用约30毫升含有1％FBS和0.1％NaH3的PBS缓冲液洗涤偶联珠3次。将珠重新悬浮在19.25毫升相同缓冲液中，储藏在4℃直到使用。
为了用荧光素衍生物Oregon GreenTM(Molecular Probes，Eugene，OR)标记抗体，将抗体以5毫克/毫升浓度交换成100mM KH2CO3缓冲液(pH9.0)。在抗体中以25∶1摩尔比加入Oregon GreenTM(10毫克/毫升的二甲亚砜溶液，DMF)，室温避光温育1小时。在G-25 Sephadex柱上将抗体与游离Oregon GreenTM分开。用2-亚氨基硫烷(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)以1625∶1的摩尔比修饰荧光染料，硫-SMCC(Pierce)以20∶1的摩尔比修饰抗体，产生R-藻红素(PE，IntergenBioDiagnostics，Purchase，NY)和花青-藻红素(Cy5PE)偶联物。将修饰的荧光染料和抗体一起在室温下避光温育1小时。在Sephacryl S-300-HR柱(Sigma ChmicalCo.，St.Louis，MO)上，将荧光染料偶联的抗体与游离荧光染料和抗体分开。亲和纯化山羊F(ab’)2抗人Ig抗血清(重链和轻链特异性)并以小鼠、马、牛、大鼠和家兔抗体吸收，再用PE或Cy5-PE标记。可改变荧光染料和蛋白质的比例来优化对特定抗体或病毒抗原的荧光信号。
实施例3-病毒抗原和宿主抗体的检测：从New York Biologicals(Southampton，NY)、Scantibodies Laboratories(Santee，CA)或IntergenBioDiagnostics(Purchase，NY)获得了正常个人的和HCV、HIV或HBV阳性个人的血浆样品。用Triton-X 100去污剂0.5％的最终浓度处理血浆样品，来裂解病毒膜，在测试前暴露出核心颗粒。从BiosPacific(Emeryville，CA)或IntergenBioDiagnostics获得了大肠杆菌衍生的病毒抗原。在正常非病原性血清样品中加入抗原，产生参比标准曲线，用于波尖和回收分析。
在Coulter EPICS ProfileII、Coulter XL或Partec PAS流式细胞计数仪上，用线性正向/侧向光散射门控珠群，进行流式细胞计数分析。对数放大荧光信号。用滤光片将发射荧光分成不同色光。用525纳米带通滤光片收集绿色荧光(Oregon Green和FITC)，用565纳米带通滤光片收集橙色荧光(PE)，用630纳米长通滤光片收集红色荧光(Cy5PE)。
用PE-和Cy5PE-标记的F(ab’)2山羊抗人Ig(重链和轻链特异性)抗体温育样品。在各种情况下，在具有捕获抗原的珠上检测到宿主抗病毒抗体，而在来自正常样品或不正确的病毒的珠上检测不到。用对HCV核心抗原具有特异性结合亲和力的PE标记抗体，对HBV表面抗原具有特异性结合亲和力的Oregon Green标记抗体，和Cy5PE标记的山羊抗人Ig抗体检测到HBV表面抗原和抗-HBV抗体，以及HCV核心抗原和抗HCV抗体。如图2A-2H中所示，分别和同时检测HCV、HBV和宿主抗体是可能的。
其它实施例
应理解虽然已联合实施例的详细描述描述了本发明，但是上述描述仅为了说明，不是为了限制由权利要求的范围限定的本发明的范围。其它方面、优点和修改在权利要求的范围内。

Claims (21)

1.一种同时测定生物样品中结合对复合物内两个成员A和B的方法，其特征在于，该方法包括：
a)提供一种固相试剂，所述固相试剂含有用对所述结合对的所述成员A具有特异性结合亲和力的捕获抗体包被的颗粒；
b)在所述成员A如存在，与所述颗粒结合的条件下，使所述生物样品与所述固相试剂接触，形成第一反应颗粒；
c)使所述第一反应颗粒与对所述成员A具有特异性结合亲和力的一抗接触，并和对所述结合对的所述成员B具有特异性结合亲和力的二抗接触，形成第二反应颗粒，其中所述一抗用第一标记标记，所述二抗用第二标记标记，和
d)用流式细胞计数法测定所述第二反应颗粒上的所述第一和第二标记。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，基本上全部所述捕获抗体排列在所述颗粒上，从而所述捕获抗体的抗原结合区域能与所述结合对的所述成员A结合。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述成员A是抗原，所述成员B是宿主抗体。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述抗原是病毒抗原。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述病毒抗原是丙肝抗原。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述病毒抗原是乙肝抗原。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述病毒抗原是人免疫缺陷病毒抗原。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述抗原是自身抗原。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述自身抗原是谷氨酸脱羧酶。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述成员A是配体，所述成员B是受体。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述配体是细胞因子，所述受体是细胞因子的受体。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述成员A是酶，所述成员B是是底物。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述酶是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3，所述底物是聚(ADP-核糖)聚合酶。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述酶是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1，所述底物是白细胞介素原-1。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一和第二标记是荧光团。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物样品选自血液、血浆、血清、尿、脑脊液、痰、泪液、羊水、玻璃体液、唾液和组织培养上清液。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获抗体是单克隆抗体。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一抗是单克隆抗体。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二抗是单克隆抗体。
20.一种用于同时测定生物样品中结合对的两个成员A和B的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
a)一种固相试剂，所述固相试剂含有用对所述结合对的所述成员A具有特异性结合亲和力的捕获抗体包被的颗粒，其中基本上全部所述捕获抗体排列在所述颗粒上，从而所述捕获抗体的抗原结合区域能与所述结合对的所述成员A结合；
b)对所述结合对的所述成员A具有特异性结合亲和力的一抗，其中所述一抗用第一标记标记；和
c)对所述结合对的所述成员B具有特异性结合亲和力的二抗，其中所述二抗用第二标记标记。
21.如权利要求20所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标签或包装插页，其中所述标签或包装插页表明所述固相试剂、所述一抗和所述二抗可用于流式细胞计数同时测定生物样品中一结合对的两个成员A和B。
CNB008124671A 1999-07-30 2000-07-28 同时检测结合对的两个成员的方法 Expired - Fee Related CN1153970C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/365,065 1999-07-30
US09/365,065 US6383740B2 (en) 1999-07-30 1999-07-30 Methods for simultaneously detecting both members of a binding pair

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1382258A CN1382258A (zh) 2002-11-27
CN1153970C true CN1153970C (zh) 2004-06-16

Family

ID=23437334

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB008124671A Expired - Fee Related CN1153970C (zh) 1999-07-30 2000-07-28 同时检测结合对的两个成员的方法

Country Status (14)

Country Link
US (3) US6383740B2 (zh)
EP (1) EP1203236B1 (zh)
JP (1) JP4111712B2 (zh)
CN (1) CN1153970C (zh)
AT (1) ATE343788T1 (zh)
AU (1) AU768736B2 (zh)
BR (1) BR0013298A (zh)
CA (1) CA2380487C (zh)
DE (1) DE60031548T2 (zh)
ES (1) ES2275528T3 (zh)
IL (2) IL147855A0 (zh)
RU (1) RU2251111C2 (zh)
WO (1) WO2001009608A1 (zh)
ZA (1) ZA200200809B (zh)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6383740B2 (en) * 1999-07-30 2002-05-07 Bioergonomics, Inc. Methods for simultaneously detecting both members of a binding pair
US6762032B1 (en) * 1999-08-23 2004-07-13 Biocrystal, Ltd. Compositions, assay kits, and methods for use related to a disease condition comprising multiple sclerosis and/or a pro-MS immune response
DE10006432A1 (de) * 2000-02-14 2001-08-16 Ganzimmun Inst Fuer Ganzheitli Verfahren zum Nachweis von Helicobacter pylori in Stuhl- und Speichelproben
US7101683B2 (en) * 2001-06-26 2006-09-05 Abbott Laboratories Methods for the simultaneous detection of HCV antigens and HCV antibodies
CA2450710C (en) * 2001-06-26 2013-11-26 Abbott Laboratories Methods for the simultaneous detection of hcv antigens and hcv antibodies
EP1436424A4 (en) * 2001-09-18 2005-11-16 Us Genomics Inc DIFFERENTIAL MARKING OF POLYMERS FOR HIGH RESOLUTION LINEAR ANALYSIS
FR2839555B1 (fr) * 2002-05-10 2007-07-27 Bio Rad Pasteur Procede de detection simultanee d'un antigene et d'un anticorps d'un microorganisme infectieux
US7402397B2 (en) 2002-05-21 2008-07-22 Monogram Biosciences, Inc. Detecting and profiling molecular complexes
US20040229380A1 (en) * 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui ErbB heterodimers as biomarkers
US20040229294A1 (en) 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui ErbB surface receptor complexes as biomarkers
US7282330B2 (en) * 2002-05-28 2007-10-16 U.S. Genomics, Inc. Methods and apparati using single polymer analysis
WO2003100101A1 (en) * 2002-05-28 2003-12-04 U.S. Genomics, Inc. Methods and apparati using single polymer analysis
US20040152070A1 (en) * 2003-02-04 2004-08-05 Shah Dinesh O. Method of detection of HCV antibodies in combination assay or sole antibody assay
WO2005037071A2 (en) * 2003-10-14 2005-04-28 Monogram Biosciences, Inc. Receptor tyrosine kinase signaling pathway analysis for diagnosis and therapy
GB0325483D0 (en) * 2003-10-31 2003-12-03 Plasmacute As Assay
WO2005089524A2 (en) * 2004-03-19 2005-09-29 U.S. Genomics, Inc. Compositions and methods for detection of single molecules
US7842475B2 (en) * 2008-01-08 2010-11-30 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Stabilization of solid support assay reagents
ES2569380T3 (es) 2008-06-30 2016-05-10 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Detección de CD31 diseminada, diagnóstico de aterotrombosis y trastornos autoinmunitarios, y procedimientos para analizar rutas de señalización
US10545149B2 (en) * 2008-10-06 2020-01-28 Morehouse School Of Medicine Detection of HIV-related proteins in urine
US20100297607A1 (en) 2009-05-20 2010-11-25 Jian Zheng Reagents For HCV Antigen-Antibody Combination Assays
BR112012010233A2 (pt) * 2009-10-30 2016-03-29 Daiichi Sankyo Co Ltd método de medição da intensidade da fluorescência de uma corante fluorescente sensível á voltagem
WO2014209994A2 (en) * 2013-06-24 2014-12-31 President And Fellows Of Harvard College Printed three-dimensional (3d) functional part and method of making
ES2792873T3 (es) * 2014-09-22 2020-11-12 Japan Science & Tech Agency Método para detectar molécula diana y kit para su uso en dicho método
CN108982872B (zh) * 2018-07-25 2022-04-05 苏州丰泰医疗用品贸易有限公司 一种基于微球和荧光标记的快速检测抗原或抗体方法
CN110850067B (zh) * 2018-08-21 2023-08-15 上海恒润达生生物科技股份有限公司 嵌合抗原受体亲和力检测方法
CN114599977A (zh) * 2019-12-30 2022-06-07 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 用于检测传染性疾病的试剂盒、方法及免疫分析仪
WO2023215230A1 (en) * 2022-05-01 2023-11-09 Western Michigan University Homer Stryker M.D. School Of Medicine Assay for rapid protein multimer detection, characterization and quantification

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3322373C2 (de) * 1983-05-19 1986-12-04 Ioannis Dr. 3000 Hannover Tripatzis Testmittel und Verfahren zum Nachweis von Antigenen und/oder Antikörpern
US4870003A (en) * 1987-06-15 1989-09-26 Coulter Corporation Simultaneous enzyme immunoassay for detecting antigen and/or antibody in humans
US5091206A (en) 1987-10-26 1992-02-25 Baxter Diagnostics Inc. Process for producing magnetically responsive polymer particles and application thereof
NO164622C (no) * 1988-05-11 1990-10-24 Tore Lindmo Binaer immunometrisk partikkelbasert metode for maaling av spesifikke serum-antigener ved hjelp av vaeskestroemsmikrofotometri og et ferdigpreparert maaloppsett derav.
CA1335880C (en) 1988-07-14 1995-06-13 Thomas P. O'connor Detection of an antibody and antigen in an immunoassay
CA2008100A1 (en) 1989-01-20 1990-07-20 Hubert Bayer Method for the determination of immunologically detectable substance
EP0473065A3 (en) 1990-08-29 1992-08-26 Abbott Laboratories Simultaneous assay for detecting two or more analytes
US5776709A (en) * 1991-08-28 1998-07-07 Becton Dickinson And Company Method for preparation and analysis of leukocytes in whole blood
DE4236189A1 (de) * 1992-10-27 1994-04-28 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur simultanen Bestimmung von Antigenen und Antikörpern
US5981180A (en) * 1995-10-11 1999-11-09 Luminex Corporation Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and methods
AU1080999A (en) 1997-10-14 1999-05-03 Luminex Corporation Precision fluorescently dyed particles and methods of making and using same
AU2322099A (en) 1998-01-16 1999-08-02 Luminex Corporation Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and methods
JP3514729B2 (ja) 1998-07-30 2004-03-31 株式会社先端生命科学研究所 Ｃ型肝炎ウイルスの測定方法
US6383740B2 (en) * 1999-07-30 2002-05-07 Bioergonomics, Inc. Methods for simultaneously detecting both members of a binding pair

Also Published As

Publication number Publication date
IL147855A0 (en) 2002-08-14
AU6392200A (en) 2001-02-19
WO2001009608A9 (en) 2002-09-06
US20090011443A1 (en) 2009-01-08
WO2001009608A1 (en) 2001-02-08
EP1203236A1 (en) 2002-05-08
CA2380487A1 (en) 2001-02-08
ES2275528T3 (es) 2007-06-16
CN1382258A (zh) 2002-11-27
JP4111712B2 (ja) 2008-07-02
WO2001009608A8 (en) 2001-05-03
IL147855A (en) 2007-07-04
ZA200200809B (en) 2003-06-25
EP1203236B1 (en) 2006-10-25
CA2380487C (en) 2009-10-06
RU2251111C2 (ru) 2005-04-27
US6383740B2 (en) 2002-05-07
US20020132231A1 (en) 2002-09-19
ATE343788T1 (de) 2006-11-15
AU768736B2 (en) 2004-01-08
US20020012907A1 (en) 2002-01-31
JP2003506684A (ja) 2003-02-18
DE60031548D1 (de) 2006-12-07
US7410802B2 (en) 2008-08-12
BR0013298A (pt) 2002-04-02
DE60031548T2 (de) 2007-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1153970C (zh) 同时检测结合对的两个成员的方法
JP3958797B2 (ja) 抗原特異的ＩｇＭ検出
US9523685B2 (en) Multiplex method for detecting an infection
CN107817232A (zh) 用于进行过敏症和自身免疫性疾病的诊断测定的自动化免疫分析系统
US20050221297A1 (en) Diagnostic reagent for hepatitis C virus infection
CN1245561A (zh) 抗原特异性lgG的检测
JP2001504572A (ja) Ｈｉｖ抗原及びｈｉｖ抗体を検出するためのアッセイ
CN111751527A (zh) 新型冠状病毒IgG和IgM抗体检测试剂盒及其制备方法和应用
Nerurkar et al. Detection of genital herpes simplex infections by a tissue culture-fluorescent-antibody technique with biotin-avidin
Mortimer et al. The use of saliva for viral diagnosis and screening.
EP4113121A1 (en) Antigen for 2019 novel coronavirus and detection use thereof
US11604192B2 (en) Immunoassay for detecting Zika virus infection
CN112585468A (zh) 用于寨卡病毒免疫测定的方法和试剂
JPS61286755A (ja) 発光微粒子を使つた固相免疫検定法および組成物
CN110954695A (zh) 诺如病毒gi和gii型量子点联检试纸条及其制备方法和应用
US20140065601A1 (en) Method and kit for estimating human immunodeficiency virus (hiv) incidence
Wu et al. Comparison of three protein A-gold immune electron microscopy methods for detecting rotaviruses
Woodtayakorn et al. Comparative Study of Respiratory yncytial Virus in Nasopharyngeal Aspirates Using Conventional Cell Culture, Shell Viral Centrifugation Culture, Immunofluorescence and Biotin-Avidin Enzyme Linked Immunosor.. bent Assays
Ansarl et al. Diagnosis of viruses by immunoassays
Venkataramanan et al. Rapid screening of foot-and-mouth disease virus antibody secreting hybridomas by immunodot

Legal Events

Date Code Title Description
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20040616

Termination date: 20120728