JPH03503845A - 微小滴を形成しそして使用する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 微小滴を形成しそして使用する方法 発明の背景 望ましい細胞の測定または単離は、工業的微生物学および生物技術のほとんどの よ（確立された目標である（参照、例えば、Ｑｕｅｅｎｅｒおよび１ｉｖｅｒｙ 、工業的微生物学および生物技術のマニュアルＵＭｎｕａｌ　　ｏｆ　　Ｉｎｄ ｕｓｔｒｉａｌ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ　　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ］、ＤｅｍａｉｎおよびＳｏｌ。

ｍｏｎ（編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｓｏｃ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ。

ワシントンＤ、Ｃ，，１５５−１６９，１９８６；Ｗｈｉｔｅ　　ｅｔａｌ　　 、１ｂｉｄ、ｐｐ、２４　３１）ｏ選択の方法は、所望の細胞の優先的増殖およ び回収に基づき、しばしば可能である。例えば、所望の傾向が抗体またはある種 の化合物の不存在下に増殖する能力に対する抵抗性と結合するように、細胞を遺 伝子操作することによって選択を達成することができる。しかしながら、選択が よく働かないか、あるいはまったく働かない多数の場合が存在する。このような 場合において、細胞はしばしばスクリーニングにより、すなわち、細胞をクロー ニングし、同定し、そして１または２以上の望ましい性質を測定し、こうして特 定のクローンを同定し、物理学的に除去し、これにより単離する方法により、細 胞はしばしば同定される。

微生物をスクリーニングする方法の１つのよく確立された適用は、突然変異誘発 条件にあるいは遺伝子スプライシング手順に暴露され、こうして細胞の大きい集 団が生ずるが、それらのうち細胞非常に小さい数が有効である細胞、例えば、増 殖しかつ所望の分子を高いレベルで産生ずる細胞を包含する。ペトリ皿上でこの ような細胞を平板培養し、こうして分離したコロニーが生じ、次いで化学的にア ッセイし、こうして、例えは、有効なコロニーをラジオイムノアッセイの使用に より陽性（＋）のスコアを付けるか、あるいは測色インジケーターの使用により 着色する。このようなコロニー中の細胞の数は典型的には大きい。例えば、微生 物、例えば、バクテリアである細胞の場合において、このようなコロニーは典型 的には１０’〜ｌＯ”の細胞を含有する。次いで、有効なコロニーからの細胞を 除去し、そして媒質中に懸濁して、細胞の数を計数できるようにし、そして所望 の分子の蓄積した量または産生速度を定量的に決定することができる。このタイ プの手順はいくつかの工程を必要とし、そして現在一般に比較的巨視的実在物お よびマニュアル手順、例えば、ペトリ皿（最初のコロニーの形成のために）、視 的検査（陽性のコロニーの同定のために）、物理学的操作（コロニーの除去およ び懸濁のために）、物理学的測定（光散乱または他の手段による細胞の計数）、 化学的アッセイ（異なる時間に８ける分子濃度の決定のために）および計算（分 子の産生速度と既知の速度との比較のために）を使用して実施されている。

産生性菌株がすでに存在し、そして同一分子を産生ずるが、仕事がより高い速度 で、またはより高い最終濃度に産生する希な突然変異を探すとき、スクリーニン グはしばしば非常により困難である。このような場合において、陽性の細胞のス コアを付ける第１工程は不必要であるが、次いですべての細胞は相対的産生性に ついて定量的にアッセイしなくてはならない。これは一般に時間を消費する仕事 である。いくつかの巨視的操作およびアッセイのために、典型的なスクリーニン グの仕事は多数の最初のコロニーの形成および有意の手動労働を包含することが ある。

特定のモノクローナル抗体（ＭＡＢＳ）を高い速度で、そして高いレベルに産生 および分泌する望ましいハイブリドーマ細胞の単離は、他の一般の仕事である。

この一般の場合において、いつｔ；ん生存能力をもつハイブリッド細胞が細胞第 １段階技術により産生され、モしてＨＡＴ（／・イボキサンチン、アミノプテリ ン、チミジン）培地中で選択的増殖がほとんど安定なハイブリドーマが存在する ために十分な時間の間起こつｔ；とき、これらのハイブリドーマを所望のＡｂ（ 抗体）の産生についてスクリーニングしなくてはならない。典型的には、これは ｌより多いスクリーニング手順の使用を包含する。ポリクローナル試料をマイク ロタイターウェル（ｗｅｌり（例えば、１〜５ｍ（１）中で増殖し、これらは個 々の細胞の体積（例えば、ｖａ　ｅ　ｌ　ｌ−バクテリアについて約１０−”ｍ Ｑ−哺乳動物細胞について約１０−’ｍＱ）に比較して非常に大きい。所望の活 性を示すマイクロタイターウェルの内容物を十分に希釈し、こうして新しい組の ウェル中で培養したとき、ウェルがゼロまたは１つの最初の細胞を有する確率が 高いようにして、モノクローナルの産生を性質、例えば、特異性または親和性に ついてアッセイする。このような手順は広く使用されるが、面倒であり、そして 有意の手動労働を包含する。

アセチルコリンステアｌ／　−＋−（ＡＣｈ　Ｅ）の分泌速度がとくに高い、細 胞の単離の従来の方法は記載され、そしてゲルのカプセルの使用にに基づき、カ プセルは半透バリヤーをもち、特異的捕捉性実在物、例えば、阻害因子（１）ま たは抗体（Ａｂ）を入れるが、ＡＣｈＥ−１またはＡＣｈＥ−Ａｂ複合体の解放 または外方向の透過を許さない（参照、ＲＯｓｅ、欧州特許出顯第８４３００３ ６．３号、１９８４年１月２０日提出）。しかしながら、現実の透過性バリヤー 、例えば、透析膜として機能するものは広い分子量のカットオフを有し、そして Ａｂに対する有意の透過性およびＡＣｈＥ−Ａｂの有意の保持の両者を提供する ことができない。このようなバリヤーは複合体ＡＣｈＥ−Ｉについてにのみ機能 することができ、ここでＩはＡＣｈＥに比較して比較的小さい分子である。この 理由のｔ；めに、その代わりゲルの微小＠　（ＧＭＤ）のゲルのマトリックスに 関連する特異的結合部位を使用することが必要であるが、現在非現実的な性質を もつ仮定の半透膜を使用しない。

単離方法の他の形態は種々のゲルの立体配置を使用して、抗体（Ａｂ）分泌細胞 を単離し、所望の細胞付近の領域をコンディショニングすることによって望まし くない細胞の殺しを強調しく参照、Ｒｏｓｅｓ欧州特許出願第８３３０７１４４ ．２号、１９８３年１１月２２日提出）、ここで所望のまたは望ましくない細胞 の選択的染色または蛍光の標識、または細胞付近のゲル内の領域が記載されてい るが、捕捉したＡｂの定量的決定に基づく、定量的測定または単離の教示は存在 しない。

一般に固相イムノアッセイに関する方法は、主として液相または上澄み液中のＡ ｂおよびＡｇ（抗Ｗ）のアッセイを包含し、そして一般に洗浄容易な表面が好ま しいことを教示している（参照、例えば、オールタ不イティブ−ｆムノアッセイ （Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　　Ｉｍｍｕｎ。

ａｓｓｙ）、Ｗｉ　ｌｅｙ、Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ、１９８５；Ｖｏｌｔｅｒ（ 編）８０年代のイムノアッセイ　［Ｉｍｍｕｎｏａｓｓｙ　　ｆｏｒｔｈｅ　　 ８０ｓｌ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　　Ｐａｒｋ　　Ｐｒｅｓｓ。

バルチモア、１９８１）。

しかしながら、Ａｂを含有するゲル断片の使用はかさのあるＡｇ濃縮物の測定に ついて記載され、ここで巨視的体積のゲルをＡｂに関連させて調製し、巨視的ゲ ルを断片化してより小さいゲル粒子を形成し、次いで液状試料と接触させて液状 試料中に存在するＡｇを測定する（参照、Ｕｐｄｉｋｅ、固定化された酵素およ びタンパク質の生物医学的応用［Ｂｉｍｅｄｉｃａｌ　　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ ｎ　　ｏｆ　　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　　Ｅｎｚｙｍｅｓ　　ａｎｄ　　Ｐｒ ｏｔｅｉｎｓ］、Ｖｏｌ、２、Ｃｈａｎｇ　（編）、７１−８６．１９７７）。

測定のためのＧＭＤ　Ｓの以前の使用は、膜材料で被覆されているか、あ乙いは 他の液体、例えば、鉱油により取り囲まれｆ−Ｇ　Ｍ　Ｄの小さい体積内の、可 溶化した代謝物、例えば、代謝酸の細胞外の蓄積に基づく（参照、米国特許第４ ，４０１．７５５号および米国特許第４，６４３．９６８号、Ｗｅａ〜ｒｅｒ、 それらの開示をここに引用によって加える、およびＷｅａｖｅｒ　　ａｔ　　ａ ｌ、、Ａｎｒ＋、Ｎ、Ｙ−Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

、４３４　：　３６３−３７２．１９３４；ＷｅａｖｅｒＳＢｉｏｔｅｃｈ。

ａｎｄ　　Ｂｉｏｓｎｇｒ、Ｓｙｍｐ、１７．１８５−１９５．１９８６：Ｗｉ ｌｌｉａｍｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、５０ １：３５０　３５３、ｌ　９８７）。

凰離のｔ二めのＧＭＤｓの以前の使用は、細胞の内部からｗＩＩ成分子を解放す る溶菌手段、次いで、例えば、可溶性Ａｂを準備して免疫沈澱を形成し、これを ＧＭＤｓのゲルのマトリックス内に捕捉する手段の使用に基づく。次いで、この ような免疫沈澱物をさらに光学的標識したＡｂまたはＡｇと反応させ、次いで流 れサイトメーター／細胞ソーターを使用することができる。さらに、このような 免疫沈澱物を磁気分子で標識した後、ミカを使用してＧ　Ｍ　Ｄ　ｓを物理学的 に単離できることが記載されている。しかしながら、この先行技術の使用は分泌 または単離された分子の捕捉を基準としてＧＭＤＳ内の前に存在する結合部位使 用を教示されておらず、その代わり、ＧＭＤの一ゲルのマトリックス内に免疫沈 澱物を形成するために、可溶性ＡｂおよびＡｇなどの使用のみを記載している（ 参照、米国特許第４，６４３，９６８号、Ｗｅａｖｅｒ、その開示をここに引用 によって加える、およびＷｅａｖｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈ−ａｎｄ　　Ｂｉｏｅｎ ｇｒ、Ｓｙｍｐ、１７．１８５−１９５．１９８６）生物学的実在物、例えば、 細胞、ウィルス、核酸および抗体−抗原複合体の測定および単離は、純粋および 応用生物学においてよく確立されており、臨床的生物学、癌の診断および処置、 環境科学、食物の安全性、毒物学、および基本および応用生物学における研究お よび開発のような分野において多数の重要な応用をもつ。有意な数のアッセイお よび試験はウィルス、核酸および抗体−抗原複合体に向けられているが、最もよ く確立されたこのような生物学的実在物の測定を決定する方法は細胞ｔ：ついて の測定に関する。この理由で、生物学的実在物を測定および単離する先行技術の 方法の主要な特徴を、細胞についての測定を行う先行技術の方法を考慮すること によって例示する。

同様に、ウィルスの増殖を決定する先行技術の方法は、細胞培養物の使用を包含 し、こうして試料のウィルスは１または２以上の準備された細胞を感染し、そし て感染された細胞内で増殖し、しばしば細胞を溶解し、そして大きい数のウィル スを解放する。タラミゾイアの増殖を決定する先行技術の方法は、また、宿主細 胞内の増殖を包含する。

同様に、ウィルスの増殖への化合物および因子の作用を決定する先行技術の方法 は、細胞の培養物の使用を包含し、こうして試料のウィルスは１または２以上の 準備された細胞を感染し、そして感染された細胞内で増殖し、しばしば細胞を溶 解し、そして大きい数のウィルスを解放する。クラミゾイアの増殖を決定する先 行技術の方法は、また、宿主細胞内の増殖を包含する。

さらに、核酸の増殖を決定する先行技術の方法はサイクル的インキュベーノヨン を包含し、これは各サイクルで特定の核酸の倍化を包含する（参照、Ｍｕｌｌｉ ｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、米国特許第４．６８３．１９５号）。最後に、免疫学的 複合体、例えば、抗体−抗原複合体の増殖を決定する先行技術の方法は、反応成 分が溶液中に存在する均質な相中で実施するか、あるいは１または２以上の反応 成分が固体表面に取り付けられている同相を使用して実施する。

先行技術の細胞分析の方法は、２つの主要なりラスのアッセイを包含する。第１ クラスは、主要な試料試料から直接特定の細胞を急速に検出および同定するが、 細胞の生存能力を決定しない。この細胞において最も広く使用されているものは 、特異的配位子の結合アッセイ、例えば、イムノアッセイおよび遺伝子グローブ である。しかしながら１、それらは多数の細胞を必要とし、そして死亡した細胞 および生存能力をもつ細胞を区別しない。これらは、それらの使用を、十分な数 の細胞が存在する試料、および細胞の物理学的状態の直接の評価が無関係である 決定シこ限定する。第２クラスのアッセイは、主要な試料を直接使用するか、あ るいは主要な試料の二次培養物を使用する、生存能力をもつ細胞の測定に使用さ れる。はとんどの伝統的な広く使用されている方法は、平板の計数であり、これ は、多数の試験条件下に、増殖に基づいて、巣−の細胞の生存能力の決定を可能 とする。生存能力をもつ平板の計数の重要な属性は、試料中の細胞の濃度に対し て独立である。なぜなら、各コロニーの形成は最初の単一の細胞から進行するか らである。主要な欠点は、典型的な決定が１／２〜数日を必要とするので、その 遅さ、およびまた、労力および物質を必要とすることである。

生存能力をもつ平板培養の欠点は、その基本的属性に注目することによってより よく理解することができる。生存能力をもつ平板培養は、細胞の増殖、とくに所 定の条件についての増殖の存在または不存在を定量的に決定するための、よく確 立された、重要な方法であり、そしてしばしば最初の細胞の明確なコロニーへの 増殖に基づく。生存能力をもつ平板培養は、典型的には、第１ゲル表面上にわた ったゲル層を注ぐまたは注がないで、細胞の懸濁液をゲルを含有するベトリ皿上 に広げることを包含する。ゲルに栄養を与えて、適当な温度においてインキュベ ーション期間後、増殖の多数の世代が発生し、これは可視のコロニーの形成に導 く。多数の微生物について、可視コロニーの形成は２２〜３０世代についての増 殖を必要とし、したがって１０７〜１０’細胞を含有するコロニーを産生ずる（ 参照、５ｈａｒｐｅｖ微生物学の機械化［Ｍｅｃｈｎｉｚ　ｉｎｇ　　Ｍｉｃｒ ｏｂ　ｉｏ　ｌｏｇｙ］、Ａ、Ｎ、５ｈａｒｐｅおよび１１　Ｓ、Ｃ１ａｒｋ　 （編）Ｃｈａｒ　ｌ　ｓｅ　　Ｃ，Ｔｈｏｍａｓ、スプリングフィールド、ＩＬ −４０，１９７ｇ）。従来の生存能力をもつ平板培養はコロニーの形成に導き、 これによりコロニーの計数により生存能力をもつ細胞の計数のだめの基準を提供 し、コロニーの存在または不存在はゲル支持体中に存在する条件が増殖を支持す るか否かの推定を可能とするだけである。この理由で、従来の生存能力をもつ平 板培養定量的決定、例えば、細胞増殖速度および遅滞時間の決定よく適ない。な ぜなら、視的検査に基づく生存能力をもつ平板培養は形成したコロニーの数を計 数するが、細胞中の細胞の材料または細胞の構成成分の量が時間とともにいかに 変化するかを決定しないからである。コロニー内の栄養および代謝物質の濃度が 微小環境を構成し、これは一般に微小コロニーが増加して多数の細胞が密接した 大きいコロニー形成するとき、種々の方法で時間とともに変化する。大きいコロ ニー内の微小環境は、また、微小コロニー内の化学的組成物の有意の異質性を有 することがあるので、大きいコロニー内の異なる細胞は異なる増殖条件を経験す る。さらに、ある方法はゲルのスラブの上または中の光学的性質の決定の走査光 学的方法の直接の延長および応用に基づく。このような方法は比較的大きいコス トおよび大きさに悩まされ、そして、ゲルのスラブは比較的大さいので、インキ ュベーション条件をゲル内の細胞の部位において急速に変化することができない 。（参照、Ｇｌａｓｅｒ、微生物学において急速な方法および自動化についての ンンボジウムの微生物のプロシーディングの同定に対する新しいアプローチ［Ｎ ｅｗ　　Ａｐｒｏａｃｈｅｓ　　ｔｏ　　ｔｈｅ　　Ｉｄｅｎｇｉｆｉｃａｔｉ ｏｎ　　ｏｆ　　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　 　ｏｆ　　ａ　　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　　ｏｎ　　Ｒａｐｉｃｌ　　Ｍｅｔｈｏ ｄｓ　　ａｎｄ　　Ａｕｔｏｍａｔｉ。

ｎ　　ｉｎ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ］、Ｃ，−Ｇ、ＨｅｄｅｎおよびＴ、 ｌ１ｌｅｎｉ（編）Ｗ＋　ｌ　ｅＶｓニューヨーク、３−１２．１９７５）。

細胞または培養物の増殖および／または代謝の活性を急速に決定する計器を使用 する方法は、開発され、生存能力をもつ平板培養のアッセイの限雰を部分的にの み処理するだけである。これらは、増殖の決定のための光学的技術、例えば、液 状懸濁培養物中の多数の細胞のための光の散乱の変化するもの（参照、例えば、 ＥｄｂｅｒｇおよびＧｅ　ｒ　ｇｅ　ｒ。

微生物学および免疫学において急速な方法および自動化［ＲａｐｉｄＭｅｔｈｏ ｄｓ　　ａｎｄ　　Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ　　ｉｎ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ ｙ　　ａｎｄ　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ］、Ｋ、Ｏ，Ｈａｂｅｒｍｅｈｌ（編） 、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ベルリン、２１５＝２２１．１９８５）、 および分析した試料中の多数の細胞による変化を測定する代謝活性に基づく種々 の技術である。実施例は次のものを包含する：細胞外のｐＨの変化（参照、倒え ば、Ｃｏｗａｎ　　ａｎｄ　　５ｅｙｅｅｌ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　　ｆｏｒ　　 ｔｈｅ　　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｍｅｄｉｃａｌ　　Ｂａ ｃｔｅｒｉａ、ケンブリッジ大学印刷所、ケンブリッジ、１９７４；Ｍａｎｕａ ｌ　　ｏｆ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｆｏｒ　　Ｇｅｎｅｒａｌ　　Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌｏｇｙＸＰ、Ｇｅｈａｒｄｔｓ　　（編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ　　５ｏｃ ｉｅｔｙ　　ｆｏｒＭ　Ｉ　Ｃｒ　Ｏｂ　ｌ　ＯＩ　Ｏｇ　Ｖ　ｓワシントン、 １９８１）、二酸化炭素の解放（参照、例えば、Ｃｏｕｒｃｏｌ　　ｅｔ　　ａ ｌ、、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、２５＋２６　２９．１９８６；Ｍ ａｎｃａ　　ｅｔａｌ、、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、２３：４０１ 　４０３．１９８６）、電気的インピーダンス（参照、例えば、Ｓ　ｔ　ｅｗａ 　ｒｔ、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、４　：　２３５２４５．１８９９；Ｅｄｅｎお よびＥｄｅｎ、Ｉｍｐｅｄａｎｃｅ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｉｏｇｙ、Ｒｅｓｅａ ｒｃｈ、５ｔｕｄｉｅｓ　　Ｐｒｅｓｓ、　　レッチワース、１９８４　；Ｈａ 　ｌｄ　１ｅｙｊ；よびＹａｊｉｋｏ、ｒｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ　　Ｍｅｔｈｏ ｄｓ　　　ｆｏｒ　　　Ｒａｐｉｄ　　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｎａ ｌｙｓｉｓ、Ｎｅ１ｓｏｎ　（編）、ＶＣＨ，ワインハイム、１９３−２０９． １９８５；Ｂ１５ｈｏｐおよびＷｈｉｔｅ、Ｊ、Ｆｏ。

ｄ　　Ｐｒｏｔｅｃｔ、、４９ニア３９−７５３．１９８６）、化学ルミネッセ ンス（参照、例えば、Ｎｅｕｆｅｌｄ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｉｓｔｒｕｍｅｎｔ ａｌ　　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　　ｆｏｒ　　　Ｒａｐｉｄ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌｏｇｉｃａｌ　　Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎｅ１ｓｏｎ（編）、ＶＣＨ。

ワインハイム、５１−６５．１９８５；Ｒａｐｉｄ　　Ｍｅｔｈｏｄｓａｎｄ　 　　Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ　　　ｉｎ　　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　　　ａ ｎｄ　　ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙｘＫ、Ｏ，Ｈａｂｅｒｍｅｈｌ（編）、Ｓｐ　ｒ 　ｉ　ｎｇｅ　ｒ−Ｖｅ　ｒ　Ｉ　ａｇ、ベルリン、２１５−２２１．１９８５ ）または蛍光（参照、例えば、ＲｏｓｓｉおよびＷａｒｎｅｒ、ｌ５ｔｒ＋ｉｍ ｅｎｔａｌ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｆｏｒ　　Ｒａｐｉｄ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌｏｇｉｃａｌ　　Ａｒ＋ａｌｙｓｉｓ、Ｎｅ１ｓｏｎ　（編）、ＶＣＨ。

ワインハイム、１−５０．１９８５；Ｒａｐｉｄ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ａｎｄ 　　Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ　　ｉｎ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　　ａｎｄ　 　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、に、Ｏ，Ｈａｂｅｒｍｅｈｌ　　（＄Ｉｆ）、Ｓｐｒ 　ｉ　ｎｇｅ　ｒ−Ｖｅ　ｒ　ｌ　ａｇ、ベルリン、２１５−２２１．１９８５ ）。

すべてのこのような代謝活性の方法の欠点は、それらが大きい数の細胞の組み合 わせた作用に基づき、したがって一般に、平板培養に基づいて、分析した試料の 接種を目的とする最初のコロニーを得るための最初の手順を必要とし、こうして 少なくとも多数の細胞に基づく決定がモノポピユレーション、例えば、通常同一 型の細胞から構成されｔ；集団に基づくということである。この理由で、合計の 集団の細胞の決定はそれ自体急速であることがあるが、それは一般にゆっくりし た生存能力をもつ平板培養方法、またはその同等の方法により進行する。こうし て、合計の分析時間は、主要なまたは最初の試料の受容から細胞の増殖の決定ま でを計算して、両者の合計であり、したがってなお長い。

さらに、このような決定は大きいが、未知の数の細胞の組み合わせた作用に基づ くので、このような合計の集団の決定は実際に計数を生じない。対照的に、各々 が最初の単一の細胞に関連する、多数の債々の測定ｌこ基づく決定は、計数を生 ずる。

最後に、これらの合計の集団の方法は多数の細胞の組み合わせた作用に基づき、 決定に要求される時間は、細胞の数が減少するとき、すなわち、試料の細胞濃度 が減少するとき、有意により長くなる。

同様に、細胞増殖の測定の流れ細胞測定の先行技術の使用（参照、例えば、Ｈａ ｄｌｅｙ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｉｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　 ｆｏｒ　　Ｒａｐｉｄ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ａｎａｌｙｓｉ ｓＳ　Ｎｅ１ｓｏｎ　（編）、ＶＣＨ，ワインノ１イム、６７−８９．１９８５ ）は制限される。なぜなら、流れ細胞測定の従来の使用は、側々の細胞、または 自然に付着する細胞の塊について測定を実施し、したがってコロニーの形成の測 定を行うすることができないからである。

この理由で、流れ細胞測定の先行技術の使用は、ある体積の細胞の合計数のみを 測定して平均の増殖を決定することができ、そしてまた、したがって、注意を払 った体積の測定を包含し、そして単一の細胞の測定のシグナル対ノイズ比に依存 し、シグナル対ノイズ比は一般に多数の測定のだめに満足すべきものより低い（ 参照、例えば、５ｈａｐｉｏ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　　Ｆｌｏｗ　　Ｃｔｔｏｍ ｅｔｙ、Ｒ，Ｌｉ５ｓ、＝ニーヨーク、１９８５；Ｈａｄｌｅｙ　　ｅｔ　　ａ ｔ、、Ｉｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｆｏｒ　　Ｒａｐｉｄ　 　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎｅ１ｓｏｎ　（編 ）　、ＶＣＨ，ワインハイム、６７−８９．１９８５）。

同様に、定量的ｗ４微鏡検査および像分析と従来のゲル調製物、例えば、ゲルの スラブ、ペトリ皿などとの組み合わせは、コロニーの形成を決定することができ るが、マニュアルの態様において面倒である。従来のゲルのスラブ、ペトリ皿な どは物理学的操作性またはゲル内で十分に速い（小さい）特性拡散時間を提供す ることができないので、細胞は異なる増殖条件、例えば、栄養、薬物、ホルモン 、酵素、抗体および他の化学物質の濃度の急速な変化、に急速にかつ便利に暴露 することができない。

ざらに、従来のゲルのスラブ、ベトリ皿などは、それらの大きさのために、急速 に操作することができず、したがってゲルが連行した細胞を生体内条件に暴露す るために急速に使用することができない。例えば、アカロースのスラブを使用し て、詭い生物学的実在物、例えば、植物の原形質体を、遊離細胞およびアガロー スのビーズ中に連行された細胞の両者が障害されることが発見される場合におい て、保護することができる（参照、Ｐａ５ｚおよびＬｕｒｑｕｉｎ、ＢｉｏＴｅ ｃｈｎｉｑｕｅｓ５ニア１６−７１８、＋９８７）が、このようなゲルのスラブ は比較的長い特性拡散時間を宵し、そして動物中に急速に挿入して生物学的影響 を提供することができない。他の例として、試験の化学的治療の条件に暴露され る免疫欠損のマウス中の癌細胞の増殖を決定することによって、案内のヒトの癌 の化学的治療は、小さい組織片をマウス中に挿入することによってアプローチす ることができる（参照、ＢｏｇｅｎＳＡｎｎａｌ、ｃｈｉｒｕｒｇｉａｅ　　Ｇ Ｉｙｎａｅｃｏｌ、、Ｖｏｌ、２２：１１７１−１１７８、ｌ　９８６）が、従 来のゲルのスラブまたはベトリ皿をマウス中に挿入することは同様な繁雑であり 、かなりのマニュアルの操作を必要とする。例えば、約ｌＸｌ０’〜２ＸＩＯ’ のヒトの癌細胞を含有する側面上のクロット約１〜１．４ｍｍのスライスを調製 し、マウス中に挿入し、引き続いてこの大きい数の細胞のための組み合わせた増 殖を生ずる腫瘍の寸法の測定により決定することができる。しかしながら、コロ ニーの形成は決定されないので、このような手順はマニュアルの操作を必要とし そして、細胞の増殖、例えば、平均細胞の増殖速度またはより重要には、個々の 細胞の定量的増殖について定量的に急速に分析される、細胞調製物を生じない（ 参照、Ｆｉｎｇｅｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ　　Ｒｅｓ、、４７：３８２４−３８２９ ．１９８７）、さらに、加える物理学的力の不存在下に、ゲル材料内の分子の移 送は拡散により起こり、その特性拡散時間はゲルのスラブまたはペトリ皿のゲル 材料の厚さの二乗に依存する。これらの厚さは典型的には１０−’〜３Ｘ１０− ’ｃｍ以上である。この理由で、なお小さい分子についての特性拡散時間長く、 ｔ　ａ　＋　＋　＠＋　＋　＋　＋　”　Ｘ　”　／　Ｄにより推定することが でき、ここでＸはゲルの特性寸法または厚さである。拡散定数、Ｄ、は小さい分 子について約１０−’ａｍ２／ｓ　ｅｃであり、そして大きい分子、例えば、抗 体および酵素についてを意により小さく１、しばしば約１０−’ｃ　ｍ”／　ｓ 　ｅ　ｃであるので、典型的にはｊ　ｄｉ＋１ｍ＋＋ｓ＊は小さい分子について 約１７〜５０分であり、そして大きい分子について約２．８〜８．３時間である 。

一般に、約３ｔ□□０．１．、〜５ｔ□□１１１０．は拡散制御したプロセスに ついて９５〜９９％の完結である変化を得るために要求されることはよく知られ ている。こうして、９５％の完全な変化について３ｔ□１１＋＋ｉ＋＋に相当す る時間は小さい分子について約５０分〜約２．５時間であり、そして大きい分子 について約８．５時間〜約１日であり、そして９９％の完全な変化についてなお 長いので、外部の化学物質の濃度の一般手段によりゲルのスラブ、ペトリ皿また は大きいゲル粒子中に含有される細胞の部位において化学物質の濃度の急速な、 完全な変化を提供することは不可能である（参照、例えば、Ｎｉ１ｓｓｏｎ　　 ｅｔ　　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３０２；６２９　６３０．１９３３；Ｎｉ１ｓ ｓｏｎ　　ｅｔａｌ、、Ｅｕｒ、Ｊ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｏｌ、ａ　　１７：３１９−３２６．１９８３）。

従来のゲルのスラブまたはペトリ皿中の細胞の光学的測定に関連する光学的通路 の長さは、ゲルのスラブまたはベトリ皿の材料の厚さ、または全体厚さの有意の 部分にしばしば等しいであろう。この理由で、従来の巨視的ゲル調製物の大きさ は、また、ゲル調製物とともＩ：使用することができる、光学的測定を制限する 。なぜなら、光の吸収、光の散乱および自動蛍光は有意であり、そしてこのよう な巨視的ゲル内の細胞の個々のまたは小さい数の細胞について正確な測定を行う ことは困難となるからである。

生存能力をもつ平板培養の計数の主要な欠点は、遅さである：典型的な決定は０ ．５〜１日を要し、そ１７てまた、集中的な労力および材料を必要とする。他の 主要な欠点は、インキュベーションの間に存在する化学的または物理学的条件を 急速に変化することは、ペトリ皿の巨視的大きさは化学的条件の変化のための拡 散時間を遅くし、温度応答時間遅くするので、比較的不可能であることであり、 そして細胞の生存、細胞の増殖または他の細胞の挙動を変更し得る、条件または 影響の源付近のベトリ皿の表面上に細胞を配置することが一般に不可能であるこ とである。

生物学的実在物、とくに細胞の増殖を決定する先行技術の方法のこれらの制限に かんがみて、増殖条件の急速な変化を可能とし、小さい数の生物学的実在物、好 ましくは個々の生物学的実在物に基づき、したがって前のインキュベーションを 必要とせず、そして小さい数の生物学的実在物を含有する試料を使用して、種々 の条件下に生物学的増殖を決定することができる、生物学的増殖の決定の有意に より急速な自動化された方法は高度に望ましいであろう。

多数のアッセイおよび試験は、細胞を化合物および因子に暴露し、次いで生物学 的実在物の増殖の量の決定の前および／または後にインキュベーションすること に基づき、こうして生物学的実在物の殺し作用、生物学的実在物の阻害作用およ び生物学的実在物の増殖刺激作用などを直接ｌこ決定することができる。このよ うなアッセイおよび試験は広く使用され、そして臨床的微生物学、癌の診断およ び処置、環境科学、食物の安全、毒物学、および基礎および応用の生物学の研究 および開発のような分野において重要応用を有する。

生物学的実在物の増殖への化合物および因子の作用を決定する先行技術の方法は 、化合物および因子の作用の直接の試験を提供しないという欠点を有し、むしろ 作用を推論するか、あるいは直接の試験は有意なマニュアル工程を必要とし、コ ストおよびヒトの誤差の属性を伴う。

臨床的意味をもつ微生物の抗微生物の感受性を決定する先行技術の方法は、例示 的実施例を提供する。一般に、２つの広く異なるタイプのアッセイおよび試験が 現在用いられている。第１に、伝統的方法は臨床的試料、例えば、尿、血液、糞 便物質、ＣＮＳ流体などの収集を包含し、ここでこのような試料の物質をベトリ 皿上に直接床げるか、あるいは試料の物質を使用して、濃縮培地を有するｌまた は２以上のペトリ皿を接種して、存在することができる、比較的小さい数の微生 物細胞を増殖する。

１つのアプローチにおいて、種々の化合物および因子を異なる濃度で含有するい くつかのベトリ皿を、−次またはもとの試料とともに直接使用することができる 。あるいは、ペトリ皿上に直接に一次試料の＠養を使用し、生存能力の計数を得 ることができ、そして、しばしば先行技術において、１０’〜１０′細胞のコロ ニーを引き続く使用のための接種物として使用することができる。引き統〈試験 が増殖に基づく、一般の場合において、追加の系列のベトリ皿を使用することが でき、各々異なる濃度の異なる化合物または因子を有するか、あるいは最初のベ トリ皿の培養物からのコロニーを使用してかさのある培地を接種することができ る。

次いで、種々の明瞭のためおよび化合物を添加した種々のかさのある培地中の増 殖を実施することができる。重要な一般の実鬼例は、液状懸濁培養を包含し、パ ラメーター、例えば、光の散乱、電気的インピーダンスの変化、または二酸化炭 素の産生を測定する。細胞を添加しであるが、種々の因子および化合物を添加し ない、対照懸濁液と比較することによって、平均の細胞の増殖へのこのような因 子および化合物の作用を決定することができる。

他のかさのある培地の試験は、抗微生物感受性についてのゲルの培地、例えば、 （カービー−バウアー）ディスク拡散試験中で実施し、ここでゲルを含有する増 殖培地は表面上に配置された大きい数の細胞を有し、これによりゲルの表面を接 種する（参照、例えば、ＦｉｎｅｇｏｌｄおよびＭａｒｔｉｎ、Ｎａ１ｌｅｙ　 　ａｎｄ　　５ｃｏｔｔ’　　ｓ　　Ｄｉａｇｎｏｓｔ　ｉｃ　　Ｍｉｃｒｏｂ ｉｏｌｏｇｙ、Ｃ，Ｖ、Ｍｏ５ｂｙ、セントルイス、１９８２）。比較的高い濃 度の候補の抗微生物物質を含有する１まｔ：は２以上のディスクをゲルの中にま たは上に配置し、こうして候補の抗微生物物質の外方向の拡散は候補の抗微生物 物質の濃度の濃度の勾配を生ずる。インキュベーション後、阻害因子または殺さ れた細胞を有する領域の大きさおよび特性を観察し、モしてｍ胞の増殖への候補 の抗微生物化合物の作用を決定する基準として使用する。

このようなかさのある培地の増殖のアッセイおよび試験の一般の性質は、試験結 果は細胞の平均の応答に基づくであるということであり、−次試料の細胞の先行 技術の培養物は典型的にはかざのある培地の接種のためのコロニーを得ることを 必要とし、その結果全体のアッセイまたは試験は時間を消費し、しばしば１．２ またはそれ以上の日数を必要とし、そしてかさのあるアッセイおよび試験は抗微 生物感受性の細胞の集団を表さない。

細胞の増殖への因子および化合物の作用をアッセイおよび試験する有意により急 速なかつ自動化された方法は、したがって望ましい。小さい数の細胞、好ましく は個々の細胞に基づき、したがって小さい数の細胞を含有する試料中の細胞の決 定のだめの前のインキュベーションおよび増殖を必要としない決定は、高度に望 ましいであろう。

生存能力をもつ細胞の計数は、試料の体積当たりの生存能力をもつ細胞の数であ り、そしてここで−１と表示する。生存能力をもつ計数の決定は、生物学的研究 、臨床的微生物学、癌の研究および処置、環境科学、食物の安全性、毒物学、お よび基礎および応用生物学の研究および開発にとって重要であり、そしてそれら においてく使用されている。生存能力計数の現在の方法はゆっくりしており、そ して一般に労力を必要とし、そして計数を与えることを意味する多数のより新し い方法は笑際の生存能力をもつ細胞の計数に基づかない。その代わり、これらの 方法の多くは大きい数の細胞のある平均の性質を測定し、それらの性質は、よく 規定された条件下に、計数と相関関係をもつが、他の条件下に、一般に生存能力 の計数と正確に相関関係をもたない。

こうして、生物学的実在物の生物学的増殖により直接決定されるか、あるいは致 死的菌株によりそれほど直接的ではなく決定される生存能力に基づき、大きい数 の生物学的実在物を測定することができ、より正確な定量が可能であり、そして より自動化が可能である、従来の生存能力をもつ平板培養より急速な生物学的実 在物の生存能力の計数を提供する方法は、高度に望ましいであろう。

混合した生物学的問題の性質の決定は、しばしば重要である。なぜなら、生物学 的系は１つの型の生物学的実在物から決して構成されず、しかも混合した集団の 生物学的実在物の１または２以上のタイプの生物学的実在物の量または挙動を測 定することは望ましいからである。こうして、小さい多細胞の有機体、細胞の群 、個々の細胞、原形質体、小胞体、胞子、オルガ不う、寄生体、ウィルス、核酸 分子、抗体分子、抗原分子、および分子の凝集体の１より多いタイプのを含有す る生物学的系の試料を得ることは普通であるが、ｌまたは２以上の異なるタイプ の決定は特定の重要性をも゛つ。

混合した細胞の集団の決定が一般の問題を適切に表すので、混合した細胞の集団 の性質を決定する先行技術の方法を考察することによって、この一般の先行技術 を例示することは有用である。細胞の性質の決定は、構成的性質に基づく決定、 例えば、種形成に関する同定、特定の抗原または特定の遺伝子の存在による分類 、および挙動の性質に基づく決定を包含する。このような性質は、遅滞時間およ び倍化時間により反映される増殖、体積当たりの生存能力の計数または生存能力 をもつ細胞の数、増殖への化合物および因子の作用、例えば、最小阻止濃度また は最小バクテリア濃度による抗微生物感受性、または例えば、化学的治療因子の 感受性を包含する。これらの決定は、一般に、臨床的微生物学、癌の研究および 処置、環境科学、食物の安全性、毒物学、および基礎および応用生物学の研究お よび開発にとって重要であり、そしてそれらにおいて広く使用されている。しか しながら、増殖、生存能力の計数および増殖への化合物および因子の作用本質的 にすべての決定は、現在、モノポピユレーション、すなわち、すべての同一型の 細胞の試料または集団、を使用して実施なくてはならない。

多数のモノポピユレーションは主要なものと異なる細胞の小さい分画を有する混 合集団中の主要な部分の細胞をある成功をもって試験することができるが、この ような方法は、少ない細胞が主要な細胞に比較して数、生物学的活性または増殖 が有意である場合、失敗する。混合集団へ従来の方法が一般に応用不可能である ことは、従来の生存能力をもつ平板培養以外のほとんどの方法が、試料中のすべ ての細胞の作用または挙動に基づき、これにより試料中の細胞の平均の挙動に基 づくという事実から生ずる。したがって、一般に、混合集団は前以て未知の数で 存在する２またはそれ以上の細胞のタイプを含有し、こうして決定の結果は未知 の平均に基づく。

例えば、一方（Ａ）は急速に増殖し、そして他方（Ｂ）はゆっくり増殖する、２ つの細胞の型から成る混合したｍ胞の集団を考慮し、この場合において試料は１ ％のＡ８よび９９％のＢを含有する。時間の関数として細胞の合計の数を計数す ることによって増殖速度を決定し、そして試料をインキュページジンした場合、 集団の比較的組成は連続的に変化し、こうしである時間後、ＡおよびＢの型の両 者はほぼ等しい数で存在し、後にＡタイプが主要比率を占めるであろう。このよ うなプロセスの間、集団の平均は最初にタイプＢを表し、ある時間後、タイプＡ およびＢの平均の挙動を表し、後にタイプＡを表すであろう。各細胞のタイプの 数、およびインキュベーションの条件下のＡおよびＢの異なる増殖速度について 前もった知識をもたないと、一般に２つの細胞のタイプのみが存在することを知 らないので、タイプＡおよびＢの下に横たわる挙動を決定することができない。

この実施例を続けるために、合計の細胞の数の代わりに、活性、例えば、代謝主 としての速度（例えば、Ｃｏ２の産生）または代謝の作用（例えば、電気的イン ピーダンスの変化速度）を測定する場合、はんのわずかの見識を使用することが できるであろう。なぜなら、合計のパラメーターの変化速度のみを測定し、全体 の活性を一緒に生成する細胞の数およびタイプｌ二関して知識をもたないからで ある。これはすべての合計の集団の方法の基本的困難性を示す−それらは、すべ ての細胞が本質的に同一であるか、あるいは異なる細胞が合計の集団の小さい部 分を表さないかぎり、大きい数の細胞の測定に基づいて増殖または活性を決定す ることができない。こうして、合計の集団の活性の方法は一般に混合しｔ；生物 学的集団に適用することができない。

このような合計の集団の方法は、光学的技術、例えば、液状懸濁培養物中の多数 の細胞により光の散乱の変化（参照、例えば、Ｅｄ　ｂｅ　ｒｇおよびＢｅｒｇ ｅｒ、Ｒａｐｉｄ−Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ａｎｄ　　Ａｕｔ。

ｍａｔｉｏｎ　　ｉｎ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　　ａｎｄ　　Ｉｍｍｕｎ ｏｌｏｇｙ、に、Ｏ，Ｈａｂｅ’ｒｍｅｈｌ　（ＩＩ）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖ ｅ＋ｌａｇ、ベルリン、２１５−２２Ｌ　　１９８５）、および実施例が細胞外 のｐＨの変化である、分析した試料中の多数の細胞により変化を測定する技術に 基づく、種々の代謝活性（参照、例えば、Ｃｏ　ｗ　ａ、　ｎおよび５ｔｅｅｌ ’ｓ　　Ｍａｎｕａｌ　　ｆｏｒ　　ｔｈｅ　　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ 　　ｏｆ　　Ｍｅｄｉｃａｌ　　Ｂａｃｔｅｒｊａ、ケンブリッジ大学印刷所、 ケンブリッジ、１９７４；Ｍａｎｕａｌ　　ｏｆ　　Ｍｅｅｈｏｄｓ　　ｆｏｒ 　　Ｇｅｎｅｒａｌ　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ。

Ｐ、Ｇｅｈａｒｄｔ、（編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ　　５ｏｃｉｅｔｙ　　ｆｏｒ 　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ワシンＩ・ン、１９８１）、二酸化炭素の解放 （参照、例えば、Ｃｏｕｒｃｏｌ　　ｅｔ　　ａｌ、、１ｃｌｉｎ、Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ、、２５＋２６　２９．１９８６；Ｍａｎｃａｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、Ｃ ｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、２３：４０１−４０３．１９８６）、電気的イ ンピーダンス（参照、例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、４：２ ３５　２４５．１８９９；Ｅｄｅｎｔ’；よびＥｄｅｎ、Ｉｍｐｅｄａｎｃｅ　 　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ３’％　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、５ｔｕｄｉｅｓ　　Ｐｒ ｅｓｓ、　レツチワース、１９８４；ＨａｌｄｌｅｙおよびＹａｊｉｋｏ、Ｉｓ ｔｒｕｍｅｎｔａｌ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　　ｆｏｒ　　Ｒａｐｉｄ　　Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎｅ１ｓｏｎ　（編）、ＶＣ Ｈ、ワインハイム、１９３−２０９．１９８５；Ｂ１５ｈ’ｏｐおよびＷｈｉｔ ｅ、Ｊ。

Ｆｏｏｄ　Ｐｒｏｔｅｃｔ、、４９ニア３９−７５３．１９８６）、化学ルミネ ッセンス（参照、例えば、Ｎｅｕｆｅｌｄ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｉｓｔｒｕｍｅ ｎｔａｌ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｆｏｒ　　Ｒａｐｉｄ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｏｇｉｃａｌ　　Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎｅ１ｓｏｎ　（ＩＩＳ）、ＶＣＨ、ワイ ンハイム、５１−６５．１９８５；Ｒａｐｉｄ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ａｎｄ　 　Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ　　ｉｎ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

ｇｙ　　ａｎｄ　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、に、Ｏ，Ｈａｂｅｒｍｅｈｌ（編） 、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ベルリン、２１５−２２１．１９８５）ま たは蛍光（参照、例えば、Ｒｏｓｓｉ８よびＷａｒｎｅｒ、Ｉｓｔｒｕｍｅｎｔ ａｌ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｆｏｒ　　Ｒａｐｉｄ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ ｉｃａｌ　　Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎｅ１ｓｏｎ　（編）、ＶＣＨ、ワインハイム 、１−５０．１９８５；Ｒａｐｉｄ　　Ｍｅｔｈ。

ｄｓａｎｄＡｕｔｏｍａｔｉｏｎｉｒｉＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　　ａｎｄ　 　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、に−０，Ｈａｂｅｒｍｅｈｌ　　（編）、Ｓｐｒｉｎ ｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ベルリン、２１５−２２１　１９８５）を測定する技術 を包含する。すべてのこのような代謝活性の方法の欠点は、それらが大きい数の 細胞の組み合わせた作用に基づき、シｆ−。

かって一般に、平板培養に基づいて、分析した試料の接種を目的とする最初のコ ロニーを得るための最初の手順を必要とし、こうして少なくとも多数の細胞に基 づく決定がモノポピュレーンヨン、例えば、通常同一型の細胞から構成された集 団に基づくということである。この理由で、合計の集団の細胞の決定はそれ自体 急速であることがあるが、それは一般にゆっくりした生存能力をもつ平板培養方 法、またはその同等の方法により進行する。こうして、合計の分析時間は、主要 なまたは最初の試料の受容から細胞の増殖の決定までを計算して、両者の合計で あり、したがってなお長い。

混合集団のある種の構ＦＲ成分の性質は、混合集団に直接適用した方法を使用し て直接決定することができるが、アッセイした構成成分が存在することが決定さ れる意味においてのみであり、そして試料中のある細胞が構成成分をもたないこ とがあるという知識をもｔ；ない場合である。

例えば、特定の結合アッセイ、例えば、イムノアッセイまたは遺伝子プローブの アッセイを混合集団とともに直接使用して、特定の、予備特定した抗原または核 酸の配列を決定し、そして必要に応じて定量することができる（参照、例えば、 Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｃｏｌ　ｌ　ｉｎｓ　（ 編）、Ｗｉｌｅｙ、１９８５；Ｍｕｌｌｉｓｅｔ　　ａｌ、、米国特許第４．６ ８３，１９５号）。しかしながら、このような決定は、構成成分を有さない試料 中の存在し得る他の細胞について何をも明らかにせず、またアッセイした構成成 分の物質を有する細胞の存在する数を決定しない。

さらに、ある種の試験、例えば、抗微生物感受性は、一般に、抗微生物が有効で ある濃度の定量的決定を包含し、こうしてＭＩＣ（最小阻止濃度）およびＭＢＣ （最小バクテリア濃度）はしばしば決定される（参照、例えば、Ｆｉｎｇｏｌｄ およびＭａｒｔｉｎ、Ｂａ１ｌｅｙ　　ａｎｄ　　５ｃｏｔｔ’　　ｓ　　Ｄｉ ａｇｎｏｓｔｉｃ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃ，Ｖ、Ｍｏ　ｓ　ｂｙ、セ ントルイス、１９８２）、このような定量的結果は、異なる濃度において候補の 抗微生物化合物に対する細胞の応答を試験することによって直接得ることができ 、そして試料中に存在する特定の抗原または特定の核酸配列の合計の量の検出ま たは測定から実際に直接決定することができない。その代わり、現在の実施は試 料について実施した特定の構成成分に基づかず、一般の経験に基づく抗微生物物 質の有用な、または有用である思われる、濃度を推定することである。

したがって、一般に、特定の細胞の構成成分の存在、および合計の量を決定する ことができるが、２またはそれ以上の異なる細胞のタイプから成る試料または調 製物である、混合集団について直接、細胞の挙動、例えば、活性または増殖に基 づく、このような決定を行うことができない。この一般的制限は、この方法があ る前の工程を使用して、同一のタイプのすべてである細胞を得ることを必要とし 、希釈および平板培養して異なる細胞のコロニーを得るような方法を包含し、次 いで前記コロニーを使用してモノポピユレーションを接種および増殖することが できるか、あるいは他のものよりある種のタイプの細胞の増殖の好適である、選 択的増殖培地上の増殖させる。これらの現在の方法は、モノポピュレーンヨンを 生ずる、この前の工程が一般に襲いという欠点を有する。例えば、−次試料の希 釈、引き続くぺ１・り皿上で平板培養し−Ｃモノポピニレーンヨンの引き続く調 製のためのコロニーを得る方法は、細胞の適当に希薄な懸濁液をペトリ皿の表面 上に広げ、次いで最初の最初の細胞（またはコロニー形成単位、ＣＦＵ）をコロ ニーが得られるまで増殖することを必要とする。

同様に、特定の阻害因子を使用することによってモノポピユレーションを調製す ることは、高い毒性の特異性を必要とするので、ただ１つのタイプの細胞は阻害 因子または殺す因子への暴露のとき生き残り、そして生き残る細胞は有意にスト レスを受けず、損傷しないか、あるいは−次的にそれらの引き続く使用に影響を 与える方法で変更されない。その結果、選択的に毒性の培地へ暴露することによ って得られる細胞は、一般に、モノポピユレーションの細胞の性質の決定前に、 非選択的培地上の回収の期間を必要とする。

選択的培地上の細胞の増殖は、１つのクラスまたはタイプの細胞を得る他の広く 使用されている方法である。１つのタイプの細胞の特定の有用な性質、例えば、 特定の抗微生物化合物に対する抵抗性が知られている場合、混合集団を抗微生物 化合物、および試みる合計の集団の測定を有する増殖培地中に入れることができ る。しかしながら、ある細胞が増殖しない場合、抗微生物物質によりはじめて阻 害されることができか、あるいは抗微生物物質により殺される場合、ある種の酵 素および代謝物質活性をある期間の間なお保持することができる。次いで、一般 に、インキュベーション期間を使用しなくてはならず、その間非抵抗性細胞は殺 されか、あるいは抵抗性細胞が増殖するとき、より小さい混合集団またはそのよ り小さい部分を表すようにされる。これらの理由で、非抵抗性細胞が試料の細胞 の有意の部分からなる場合、有意の増殖期間を使用して、合計の集団の測定が抵 抗性細胞に主として基づくことを合理的に保証しなくてはならない。しかしなが ら、選択的培地を使用するこの増殖方法は、モノポピユレーション得ることと本 質的に同等であり、シｔ；がって混合集団の試料に直接にかつ急速に適用するこ とができる方法ではない。

全体に、混合集団について決定を行う現在の方法は、一般に、遅くそしてしばし ば労力を要する。なぜなら、まずモノポピユレーションまたは純粋な集団を得る ことが必要であるからである。前のモノポピユレーションについてのこの必要性 は基本的である。なぜなら、活性まｊ；は増殖に基づく現在の急速な方法は合計 の集団の方法であるか、あるいはいかに多数のまたはどんなタイプの細胞が存在 するかを決定しないで、特定の構成成分の細胞物質を決定するからである。

混合集団を直接取り扱う唯一の確立されｔ：方法は、適当な希釈合理的にの普通 の平板培養である、こうしてペトリ皿の表面上に広げられた細胞の懸濁液はよく 分離した細胞を有するという高い可能性を有する。これらの細胞を引き続いて、 ２２〜３０世代に相当する時間のインキュベーションにより１０’〜１０”細胞 の可視のコロニーに増殖させる。（参照、５ｈａｒｐ、Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　 　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ。

Ａ、Ｎ、５ｈａｒｐｊ；よびり、Ｓ、Ｃ１ａｒｋ　（編）、ＣｈａｒｌｓＣ，Ｔ ｈｏｍａｓ１スプリングフィールド、１９−４０．１９７８）。

急速に増殖する細胞、例えば、２０〜３０分の最適な条件下に倍化する時間をも つバクテリアについてさえ、要求されるインキュベー／３ン時間は長く、約７〜 １５時間であり、そして多数の他の微生物および哺乳動物について、要求される インキュベーション時間は数日である。

従来の生存能力をもつ平板培養の計数は大きい重要性を有し、そし、てすべての 他のものが比較される標準の方法であることが認識されている。

生存能力をもつ平板培養は、典型的には、細胞の懸濁液をゲルを含有するペトリ 皿の表面上に広げることを包含する。生存能力をもつ平板培養は一般に混合集団 とともに使用することができる。なぜなら、試料を希釈しそ（７てベトリ皿上に 広げる方法は個々の細胞を（統計学的に）分離する働きをし、そして、混合集団 の試料を直接使用することができる、特定の構成成分のアッセイ以外の、唯一の 現在の方法であるが、このような生存能力をもつ平板培養は典型的には生物学的 実在物、例えば、非常に急速に増殖する細胞について１／２日を必要とし、そし て他のものについて、よりゆっくり増殖する生物学的実在物はしばしば数日を必 要とするからである。

したがって、混合集団の試料とともに直接かつ急速に使用することができ、前の インキュベージコンを必要とせず、生物学的実在物の遺伝子または免疫学的反応 の組成について制限的仮定または高度に特異的な予備規格を必要とせず、そして また、比較的小さい数の試料の生物学的実在物を利用することができ方法を使用 して、決定を行う非常により急速な方法を有することは高度に望ましい。

非水性流体により囲まれた微小滴（ＭＤｓ）を測定する先行技術の方法は、また 、有意の欠点に悩まされ、そしてこのようなＭＤｓを固定的に物理学的に操作す る能力を実証しなかった。例えば、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの個々の分子の活 性を研究するためにロトマン（Ｒｏｔｍａｎ）により液状微小滴の従来の使用は 、噴霧によりこのような液状微小滴（ＭＤｓ）の形成を包含した。この方法にお いて、空気に含まれるＬＭＤｓは溶液から形成し、固体の表面上の静止するシリ コーンの流体上の衝突させ、次いで沈降させ、こうして生ずるＬＭＤｓをそれ以 上操作せず、その代わり手動的に蛍光顕微鏡検査を使用して観測された（ＰＮＡ Ｓ、４７：１９８１−１９９１　１９６１）。

ＬＭＤｓは同様に使用されて、ＬＭＤｓ内に含有されるバクテリアの細胞内のβ −Ｄ−ガラクトンダーゼの活性を測定し、そして蛍光ｉＩｌ微鏡検鏡検査用して ンリコーン流体により取り囲まれた静止ＬＭＤｓのマニニアル観測を包含した（ Ｒｅｖｅｌ　　ｅｔ　　ａｌ、、ＰＮＡＳ　　４７：１９５６−１９６７．１９ ６１）。

同様に、非水性流体により囲まれたＧＭＤｓの測定を包含する先行技術の方法は 、静止鉱油により囲まれたＧＭＤｓ中の微生物を、顕微鏡検査によりマニュアル で観測する光の吸収または蛍光の変化で検出ことをを包含しｔ；。さらに、ＧＭ Ｄｓを流れ細胞測定により測定することができ、ここで非水性流体は確立された 水性流体を置換し、このような測定は非水性流体中に懸濁されたＧＭＤｓの通過 を流れ細胞測定に通過させることを包含しくＷｅａｖｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、ａ ｎｄ　　ＢｉＯｅｎｇｒ、Ｓｙｍｐ、１７：１８５−１９５．１９８６）そして 非水性流体内のＧＭＤｓの有望な操作を生じない。

これらの理由で、非水性流体により囲まれた微小滴を物理学的に操作する改良さ れた手段を有することは高度に望ましいであろう。

さらに、微小滴（ＭＤｓ）の前の使用は、生存能力の計数に関する情報を推定す ることかでさることを示すが、高度に近似的であり、一般に１または小さい数の ＭＤの大きさのみを利用し、顕微鏡検査によるＭＤＳの観測の間のＭＤｓの視的 像の解釈に依存し７、そして面倒および困難に悩まされる。例えば、酵素β−Ｄ −ガラクトンダーゼの個々の分子の活性のロトマンによる研究は、蛍光顕微鏡検 査による比較的小さい数のＭＤｓの視的検査に依存する（ＰＮＡＳ、４７：ｌ９ ８１−１９９１１９６１）。さらに、個々の酵素の活性のこの研究は重要かつ基 本的であるが、この方法は十分に面倒および困難であり、ＭＤｓのこの使用は反 復または延長されず、そしてより自動化したまたはより定量的に精確な態様にお いて利用することができなかった。バクテリアのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの関 係する研究は、液状微小湾内中に含有されるノくクチリアを利用した（Ｒｅｖｅ ｌ　　ｅｔ　　ａｌ、、ＰＮＡＳ　　４７：１９５６−１９６７．１９６１）。

同様に、ゲルの微小滴（ＧＭＤｓ）の先行技術の使用は、鉱油により囲まれたＧ ＭＤｓ中の微生物を、顕微鏡検査により手動的に観測される細胞外の光の吸収ま たは蛍光の変化、血球針のグリッドに対する比較によりＧＭＤの直径の手動的推 定を使用して検出することを包含し、こうして１つまたは小さい数のＧＭＤの大 きさの範囲内のＧＭＤの体積の非常に大まかな推定を行うことができた（Ｗｅａ ｖｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ａｎｎ、ｈｌ　Ｙ、Ａｃｄ、Ｓｃ　ｉ、４３４　： 　３６３−３７２．１９８４；Ｗｉｌｌｉａｍｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ａｎｎ、 Ｎ、Ｙ、Ａｃｄ、ｓｃｉ。

５０１　：　３５０−３５３．１９８４）。このような決定の長たらしい、マニ ュアルの性質のために、典型的には１００以下のＧＭＤｓの直径が推定され、そ してポア７ソン統計学で占有されるＧＭＤｓの観測される数のフンシスチンシー を概算的に推定するために使用された。

ポアッソン統計学の式を使用する概算のコンシスチンシーは液体およびゲルの微 小滴の先行技術の使用において見いだされたが、ＭＤＳのこのような先行技術の 使用はＭＤ大きさの測定の不精確さ、大きい数のＭＤｓの測定が容易には出来な いこと、およびＭＤｓの占有の自己一致する数学的決定、これにより計数を提供 するであろう、より完全な反復の方式において数学的な統計学的分析を適用する ことの不可能性に悩まされた。さらに、このようなＭＤｓの先行技術の使用は、 ＭＤｓ＃？Ｌ二含有される生物学的実在物の生存能力を決定するだめの厳格な基 準を提供せず、したがって従来の平板培養方法により生ずる測定のタイプを提供 しなかった。

さらに、液状微小滴（ＬＭＤｓ）の先行技術の使用は、単一の酵素分子によるＬ ＭＤｓ（Ｒｏｔｍａｎ、ＰＮＡＳ　　４７：１９８１　１９９１．１９６１）か 、あるいはバクテリアおよび酵母菌によるＧＭＤｓの占有がポアッソン統計学ど 一致することの実証に制限される（Ｗｅａｖｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ａｎｎ、 Ｎ、Ｙ、Ａｃｄ、Ｓｃｉ、４３４：３６３−３７２．１９８４；Ｗｉｌｌｉａｍ ｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ａｎｎ、Ｎ。

Ｙ、Ａｃｄ、Ｓｃ　ｉ、５０１　：　３５０−３５３．１９８７）、　　しかし ながら、このような先行技術の実証は高い精度をもたない。なぜなら、非水性流 体により囲まれたこのようなＬ　Ｍ　Ｄ　ｓおよびＧＭＤｓの測定は、光顕微鏡 検査または蛍光顕微鏡検査を使用してＭＤｓの比較的小さい数の視的観測に基づ き、そして各付着した、多少変形した球状ＭＤのためのＭＤの体積をＭＤ体積の いくつかの範囲の各々内で推定することができる、個々のＭＤの直径の大きい数 の測定を包含しないからである。この理由で、計数の決定に向ける代わりに、こ れらの先行技術実証は、ポアッソン統計学との概算の一致を強調した。さらに、 これらのＭＤｓの使用は増殖に基づく細胞の生存能力の決定を包含しなかった。

これらの理由で、ＭＤｓの先行技術の使用は生存能力の計数の急速な決定に向け られなかった。

ゲルの微小滴（ＧＭＤｓ）は、細胞の分析法および細胞の単離法の両者を有意に 改良する一般的手段を提供する。ＧＭＤｓをより効率よく利用するために、ＧＭ Ｄｓの細胞の含量に対して独立に個々のＧＭＤｓの検出し、測定し、そして特性 決定する改良された手段を有することは高度に望ましい。例は、ングナルのトリ ガーの目的のＧＭＤｓの検出、ＧＭＤｓ連行細胞および非連行（遊離）細胞の区 別、ＧＭＤｓの体積（ＶＧＭ＋））の測定、および同時連行または同時提供され た結合部位の数の測定である。

ＧＭＤｓを測定する先行技術の方法は、非標識ゲルから作られ、そしてゲルの水 性液体中に溶解する色素を使用する、ＧＭＤｓの光学的測定を包含する（参照、 Ｗｅａｖｅｒｓ米国特許第４．４０１．７５５号および米国特許８４．６４３． ９６８号、それらの開示をここに引用によって加える）。例えば、可視光の顕微 鏡検査を使用して、アガロースＧＭＤｓ内の大きい微生物、例えば、酵母菌を観 測し、そしてこのような場合において、アガロースゲルそれ自体は、純粋なアガ ロースが光を弱く散乱し、そしてまた、ゲルに色を与えるような有意に光の吸収 をもたないので、かすかに見えることが発見された。多数の他のゲル材料、例え ば、アルギネートはより多く光を散乱し、これによりより光学的に区別可能であ るが、また、有意の色をもたない。先行支術のＧＭＤの測定において、純粋なア ガロースゲルから作られたＧＭＤｓを鉱油中に懸濁して、このようなＧＭＤｌｌ 製物の追加の属性は、光学的屈折率の差が光顕微鏡検査により純粋なアガロース を可視とすることである。

ＧＭＤｓ中の活性な鉱油の検出ｌ二関する１ｌｉｌＪ定は、ＧＭＤｓのアガロー スゲルの水性媒質中に溶解した光の吸収性または測色色素を利用することによっ てなされｌ；。例示的場合はボロモチセールブルー、色を最初の約７．６のｐＨ における「ブルー」から有意に低いつＨにおける「イエロー」の変化する、ｐＨ 感受性光の吸収性または測色のインジケーター色素の使用であり、この色素を細 胞が懸濁されている媒質中に溶解することによって提供される。次いで、ＧＭＤ ｓを鉱油中の分散によりつくり、こうして細胞がＧＭＤｓ中に捕捉されるが、可 溶化されたインジケーター分散は、ＧＭＤｓを取り囲む鉱油中の分散の可溶性が 比較的に劣るために、ＧＭＤｓ内で維持される（参照、Ｗｅａｖｅｒ　　ｅｔ　 　ａｌ、Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃｄ、Ｓｃ　ｉ、４３４　：　３６３−３７２．１ ９８４；Ｗｅａｖｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、ａｎｄ　　ＢＩｏｅｎｇｒ、Ｓｙｍｐ 、１７：１８５−１９５．１９８６；Ｗｉｌｌｉａｍｓ　　ｅｔ　　ａｌ。

、Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃｄ、Ｓｃ　ｉ、５０１　：　３５０　３５３．１９８７ ）。

このような可溶化された色素の場合において、ＧＭＤの鷹界およびＧＭＤに関連 する水性液体の体積が同一ではないことが時々観測される。

なぜなら、あるゲルの収縮が起こり、その結果水性液状媒質の薄い層が各ＧＭＤ のまわりを取り囲むからである。非含有水性体積の存在はある応用、例えば、イ ンキュベーションおよび固体表面上に静止するＧＭＤＳの測定において悪影響を 及ぼさないが、他の応用または操作において、非含有水性体積は困難を生ずる。

例えば、鉱油中に懸濁されたＧＭＤｓの撹拌の間、ＧＭＤｓと顕微鏡検査の容器 の壁との衝突は衝突するＧＭＤｓ内の水性媒質の部分的損失または化学的汚染を 生ずることがある。

同様に、衝突はＧＭＤＳ間で起こり、こうして多少の液体媒質はＧＭＤＳ間で交 換され、これは、また、可溶化された色素の部分的移送を生ずる。ＧＭＤｓ内の 微生物の代謝活性の測定に使用するｐＨインジケーター色素の例示的場合におい て、インジケーター色素はｐＨ変化に対する有意の緩衝剤であり得ることが発見 された。これは、代謝酸がＧＭＤｓの間でこのような衝突により、可溶化された Ｈ３によるばかりでなく、かつまた移送されたｐＨインジケーター色素に関する ［結合しｆ−ＪＨ’の移送により交換され得る結果である。

同様に、■または２以上の可溶化された蛍光インジケーター色素の使用は、測色 インジケーター色素の使用によりなされるより多い感受性および急速の微生物活 性の測定を鉱油中に懸濁したＧＭＤｓｌ：ｔ’；いて可能とするが、可溶化され た色素に関連する問題は同一である。こうして、ＧＭＤの性質の多数の先行技術 の測定は小さい光学的シグナルを有する。

なぜなら、はとんどのゲル材料による光の散乱は低く、光の吸収または色が弱い か、あるいはその材料は自己蛍光を有するからである。さらに、可溶化した色素 は、ゲル内の水性液体中に溶解しており、モしてＧＭＤＳが鉱油により取り囲ま れている場合、ＧＭＤｓ内に常に適切に拘束されているとは限らない。これらの 理由で、改良された測定可能性をもつＧＭＤｓｌおよびこのようなＧＭＤｓを測 定する方法を有することは、高度に望ましい。

ゲルの微小滴の従来の研究は、非水性流体、例えば、鉱油中のゲルの微小滴（Ｇ ＭＤｓ）の懸濁液が微生物の代謝物質、例えば、代謝酸の保持を生ずることを実 証した。次いで、これは測色８よび蛍光のｐＨインジケーターの使用による酸産 生微生物の検出および計数を可能とする（Ｗｅａｖｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ａ ｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃｄ、Ｓｃｉ、４３４：３６３−３７２．１９８４；Ｗｉｌｌ ｉａｍｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃｄ、Ｓｃｉ、５０１：３５ ０　３５３．１９８７）。

従来の研究において、光学的手段、例えば、測色および蛍光によるｐＨ変化の観 測は蛍光顕微鏡検査により達成された。しかしながら、このような先行技術の使 用は、高度に水溶性の化合物、例えば、代ｔＭ酸の無意味の化学的コミユニケー ジテンが、ＧＭＤｓがほとんど接触しているときでさえＧＭＤｓの間で起こるこ とを実証した。こうして、この上うなＧＭＤｓは本質的に化学的に単離されてお り、そして変更または変性されたこのようなＧＭＤｓの水性の内部の化学的組成 を容易にを有することができないことが発見された。

これらの従来のＧＭＤの方法の属性は、鉱油により取り囲まれたＧＭＤｓ（非水 性の取り囲まれたＧＭＤｓ）が化学的単離により提供され、こうして多数の化学 物質がＧＭＤｓ内に保持されることである。Ｃ，ＭＤＳの非常に小さい体積内の この保持は、個々の細胞、債々の酵素分子、マイクロコロニーなどについての測 定の重要なりラスのための基準である。このＧＭＤｓの従来の使用において、多 数の化学物質、とくに帯電したまたはイオン性の種、例えば、酸の溶解を本質的 に排除する可溶性を有する、非水性流体によりＧＭＤｓを取り囲むすることによ って、化学的保持は達成される。この理由で、このような化学物質は非水性流体 中に有意に入らず、したがって拡散および転化の組み合わせにより非水性流体を 通して輸送されることができない。

これはＧＭＤ内に生物学的に活性な実在物の細胞外産生物を朱持するために、お よびまた、細胞外および／または細胞内のアッセイの基準として、ＧＭＤ内に便 用する化学的アッセイの反応成分を提供または保持するために高度に望ましいが 、従来の使用は、非水性流体中に不溶性の化学物質について、いったんＧＭＤｓ が作られそして非水性流体により囲まれると、ＧＭＤ内部の化学的組成を変更す ることは不可能となった。

しかしながら、制御した条件下に、そして非水性流体がらＧＭＤｓを除宏せず、 次いで非水性流体によりＧＭＤｓを再懸濁または再び取り囲まないで、ＧＭＤｓ が非水性流体により取り囲まれた後、ＧＭＤの内部の流体の化学的組成を１また は２以上変更することができることは高度に望ましいであろう。

発明の要約 本発明は、細胞をゲルの微小滴（ＧＭＤＳ）中に組み込み、次いで、引き統く増 殖のインキュベーシヨンを行うか、あるいは行わないで、細胞に細胞内の分子を 分泌または解放させる条件にＧＭＤｓを暴露することによって、所望の細胞を単 離する方法に関する。各ＧＭＤｓ内に多数の結合部位を追加的に設けることによ って、解放または分泌された分子を十分に効率よく捕捉または結合し、結合され た分子は測定のための基準として、あるいはＧＭＤｓを、これによりこれらのＧ ＭＤｓ内ｌこｍ胞を物理学的に分類または単離するために使用することができる 。

この方法はＧＭＤｓの使用に基づき、それらの各々は同−ＧＭＤ内の十分な数の 結合部位に密接してマイクロクローンを含有する高い確率を有し、その局所的捕 捉またはアッセイまたは力の適用は問題の分子を産生、低産生または過剰産生ず る細胞を含有するＧＭＤｓの単離に使用することができる。

ＧＭＤｓ内に設けられた結合部位は、ＧＭＤｓのゲルに取り付けられた配位子、 またはＧＭＤｓ内に同時連行されｔ；ビーズ、細胞または他のの実在物の表面に 取り付けられた配位子であることができる。このような結合部位は高度に特異的 または相対的に非特異的であることができる。

なぜなら、解放または分泌された分子についてのアッセイを使用して、定量的量 を越えて結合した分子を有するＧＭＤｓを物理学的に分類または単離する引き統 〈プロセスを使用するか、あるいは使用しないで、ＧＭＤｓを分析する目的で、 ＧＭＤｓを定量的に標識するからである。

捕捉された分子についての多数の異なるアッセイは可能である。一般に、このよ うなアッセイは、捕捉された分子に結合することができ、これにより測定の目的 で、あるいはＧＭＤｓの単離を可能とする物理学的力を引き続いて加える目的で 、分子を標識することができる試薬の使用を包含する。

明確な測定工程を含まない単離の目的で、物理学的力をＧＭＤへ発揮できるよう 番こする標識分子を使用することができ、ここでこのような標識分子は解放また は分泌された分子に結合する。あるいは、標識分子は捕捉されｔ：分子へ結合す る介在分子へ結合することができる。

本発明の利点は、高い速度およびを意なオートメーションのための可能性を包含 する。ＧＭＤｓの大きさは小さいために、適当なアッセイを高い速度で自動的に 実施することができるか、あるいは分離を提供する力を短い時間内に使用して単 離を達成することができ、こうしてこの方法は望ましい細胞についての測定また は単離を従来の方法より急速に提供する。

ＧＭＤｓの先行技術の使用と対照的に、本発明は固相のイムノアッセイ、水性媒 質中に懸濁されたＧＭＤｓ内に、捕捉まｔ：は測定のための他の結合を実施する 手段を提供する。本発明の方法において、ＧＭＤｓは、また、細胞による栄養分 子の吸収および細胞による廃棄分子の解放を可能とすると同時に、ＧＭＤｓ内の １または２以上の細胞により分泌または解放された特定の分子を連続的に捕捉し 、そしてまた、ＧＭＤｓ内のｍ胞により分泌または解放された分子より大きい標 識分子との反応により測定を可能とする。これは、過去において、細胞付近に分 子を保持する手段として半透バリヤーを利用することによって達成されなかった 。

本発明は、また、１または２以上のマーカー実在物を含有するゲルの微小滴に関 し、こうしてマーカー実在物はこのようなゲルの微小滴の増強された基準を提供 する。本発明は、さらに、このようなゲルの微小滴を形成するか、あるいは前に 存在するゲルの微小滴内にマーカー実在物を導入またはつくる方法に関する。

本発明は、さらに、ゲルの微小滴（ＧＭＤｓ）内の生物学的実在物の増殖を決定 する方法に関し、こうして小さい数の生物学的実在物の増殖を急速に決定するこ とができる。ＧＭＤｓは小さいゲル実在物であり、約０．２〜ｌ、０００μの直 径であり、特別の場合において、それらの小さい大きさのために、インキュベー ／ヨンまたは測定の目的で物理学的に容易に操作され、そしてそれらの小さい大 きさのために、また、化学物質のための短い特性拡散時間を有する。この属性は 、増殖の決定のための、およびまた、引き続く測定のための条件の急速な変化を 可能とする。

本発明は、さらに、工程： ａ、結合部位および生物学的実在物をゲルの微小滴中に組み込み、そして ｂ１少なくとも１つのゲルの微小滴中に含有される生物学的物質の量を測定する 、 からなる、生物学的実在物の増殖を決定する方法に関する。

細胞をＧＭＤｓ中に組み込むことができ、こうして最初にゼロまたは１つの生物 学的実在物を含有するあるＧＭＤｓの高い可能性が存在し、これは個々の生物学 的実在物の増殖の決定を可能とするか、あるいは生物学的実在物をＧＭＤｓ中に 組み込むことができ、こうして最初にゼロまたは１つの生物学的実在物を含有す るあるＧＭＤｓの高い可能性が存在し、これによりｌより多い生物学的実在物ｌ こ基づく生物学的実在物の増殖の決定を行うことができる。ｌまたは２以上のイ ンキュベーション期間後、ｌまたは２以上のＧＭＤｓ内の生物学的物質の量を、 好ましくは生物学的物質のＩ：めの染料および光学的手段を使用することによっ て、測定する。あるいは、自然に発生する光学的ングナル、例えば、光の散乱ま たは自己蛍光を生物学的物質の分析のために使用することができる。

異なるインキュベーションをもつ測定した生物学的物質を比較することによって 、増殖の量および平板培養またはクローニングの効率を決定することができる。

この方法は、約１倍化時間内に、すなわち、２つの生物学的実在物のマイクロコ ロニーするための最初の単一の生物学的実在物のために要求される平均の時間内 に、非常に急速な決定を提供し、そして−次試料とともに使用することができ、 前の培養の必要性を回避する。

必要に応じて、増殖をいくつかの倍化時間に相当する時間の間行うことができる ので、安定な生物学的実在物の機能が生物学的実在物の増殖の原因であるという より大きいイｇ頼限界が存在する。例えば、哺乳動物の細胞の場合において、増 殖は最初の個々の細胞が２つの細胞、４以上の細胞、８以上細胞などマイクロコ ロニーを形成する期間にわたって追跡することができ、この増殖は約３２〜約６ ４の細胞、またはそれ以上のコロニーの形成に導く増殖を包含する。

生物学的物質の変化の決定は、顕微鏡による視的観測を包含する、いくつかの方 法で、または好ましくは、個々のＧＭＤｓ中に存在するｌまたは２以上の蛍光性 分子の測定のための流れ細胞測定またはデジタル蛍光顕微鏡検査を使用する自動 化された方法で、実施することができる。

ＧＭＤｓ内の生物学的実在物の部位における化学的濃度は、外部の化学的濃度に 対する応答で比較的急速に変化することができる。なぜなら、ＧＭＤｓについて の特性拡散時間、■□□１．１８１、は巨視的ゲル調製物についての丁□１１１ ＋＋ｉ＋ｔより短いからである。

本発明は、インキュベーション条件を急速に変化し、分析変化を急速に変化し、 生物学的実在物の増殖を定量的に急速に（しばしば約１生物学的実在物の倍化時 間で）決定し、最初の個々の細胞からのマイクロコロニーまたはコロニーの形成 に基づいて増殖を決定し、個々のクローンの増殖を決定し、−次試料を使用し、 前のインキュベー／ヨンを使用しないで、増殖を決定する手段を提供するという 有意の利点を有し、そして従来の生存能力をもつ平板培養に直接関係づけられる というそれ以上の利点を有する。

本発明は、また、微小満中の生物学的実在物の増殖への化合物および因子の作用 を決定する方法に関し、ここで大部分の微小滴、または有用な数の微小滴は最初 にせ口まｔ；は１つの生物学的実在物を含有する。１または２以上の化合物また は因子を、生物学的実在物を含有する微小滴の発生の前、間または後に、生物学 的実在物に暴露する。最初の個々の生物学的実在物、またはマイクロコロニーの 増殖は、微小滴を所望の条件下にインキュベーションし、次いで微小滴をｌまｊ ：は２以上の任意の大きい数の生物学的物質のための染料に暴露することによっ て、各微小滴において決定し、前記染料はゲルの材料を無意味に染色し、こうし て引き続く微小滴の光学的測定は各微小滴中の生物学的物質の量に関係する。

本発明は、さらに、最初に生存能力をもつ生物学的実在物を含有する微小滴を測 定および分析し、前記生存能力は最初の生物学的実在物、またはコロニー形成単 位の増殖の測定により決定され、あるいは生物学的実在物の生化学的活性および 物理学的完全性に対して応答する生体染料を使用することによって、生存能力の 計数を決定する方法に関する。ポアッソンまたは関係する確率の式を使用する統 計学的分析を使用して、微小滴を作るために使用しｊ；試料中の生存能力をもつ 生物学的実在物の体積当たりの数を決定する。体積当たりの生存能力をもつ生物 学的実在物の数は生存能力の計数、戸１、の定義である。

本発明は、まｔ；、混合した生物学的集団の試料について決定を行う方法に関し 、ここで試料の異なるタイプの生物学的実在物を微小滴（ＭＤＳ）を形成するプ ロセスの間に微小滴に統計学的に分離し、こうして有用な数の微小滴は任意の特 定のタイプのゼロまたは１つの生物学的実在物を最初に含有する高い確率を有す る。このようにして、混合集団の試料中に存在する異なるタイプの個々の生物学 的実在物を１ｉｌｉ微鏡的に異なるＭＤに分離される。引き続く増殖および化学 的および／まｔ：は物理学的測定は各分析したＭＤの測定に基づき、異なるタイ プの生物学的実在物を含有するＭＤｓを、生物学的実在物の増殖、生物学的実在 物の活性および生物学的実在物の構成成分に従い、区別する手段を提供する。こ の方法は生物学的実在物の決定を本来の混合集団の１つのタイプまたはクラスま たは種の生物学的実在物について行うことを可能とするが、もとの混合集団の生 物学的実在物をＭＤｓ中で直接使用するので、前の培養またはインキュベーショ ンを必要とせず、こうして直接混合集団の試料とともにＭＤｓを使用することに より、生物学的実在物の決定を急速に実施することができる。

本発明は、また、生物学的実在物を含有することができる微小滴を物理学的に操 作する方法に関し、ここで微小滴は非水性流体により囲まれており、こうして非 水性の取り囲む流体および微小滴内部の水性の電解質の物理学的および／または 化学的性質の差を利用して、微小滴に力を加える。電気的力、例えば、クーロン 力および起電力を使用してこのような微小滴を、非水性流体の導電性に依存して 、動かすことができる。

本発明は、また、生物学的実在物を含有することができる微小滴を化学的に操作 する方法に関し、ここで微小滴は非水性流体により囲まれており、こうして水溶 仕種およびアンビフィリック（ａｍｐｉｐｈｉｌｌｉｃ）種の両者を非水性流体 により囲まれｔ；微小滴に供給し、そしてさらにそのように供給される物質の量 を引き続いて各微小滴に′ついて決定することができる。この方法は、液状微小 滴および／またはゲルの微小滴を含有する乳濁液の使用を包含し、それらの微小 滴は他の微小滴と衝突し、そして化学物質を他の微小滴に移送することかでさる 。

この図面の部（ａ）は、Ｇ　Ｍ　Ｄ内に含有された生物学的実在物（１６）から 由来する解放された分子（１４）を捕捉することができる結合部位（１２）を有 するＧＭＤ（ｉｏ）を例示する。部（ｂ）は、生物学的実在物（２６）から由来 する捕捉され、解放された分子（２４）を有する、いくつかの結合部位（２２） をもつＧＭＤ（２０）を示し、他の解放された分子（２８）はＧＭＤを残す。部 （ｃ）は生物学的実在物（３６）、次いで結合標識分子（３８）から由来する捕 捉され、解放された分子（３４）を有する、いくつかの結合部位（３２）をもつ ＧＭＤ　（３０）を示す、邪（ｄ）は、結合した介在分子（４８）を有する、生 物学的実在物（４６）　、次いで結合標識分子（５ｏ）から由来する捕捉され、 解放された分子（４４）を有する、いくつかの結合部位（４２）をもっＧＭＤを 示す。

！λ客 この図面の部（ａ）は、インキュベーション前のいくつかの大きさのＧＭＤｓ（ ＩＱ）を例示し、より大きいＧＭＤｓの４つの各々は個々の細胞（１２）を含有 する。この図面の部（ｂ）は、１倍化時間に相当するインキュベーション後の同 −ＧＭＤｓ（１０）を例示し、より大きいＧＭＤ　ｓ　（２２）の３つの各々は ２つの細胞のマイクロコロニー（２４）を含有し、そして１つのより大きいＧＭ Ｄ（２６）は１つの増殖する細胞（２８）を含有する。この図面の部（ｃ）は２ 倍化時間に相当するインキュベーション後の同−ＧＭＤｓ（１０）を例示し、よ り大きいＧＭＤｓ（２２）の３つの各々は４細胞のマイクロコロニー（３２）を 含有し、そして１つのより大きいＧＭＤ（２６）は非増殖細胞（２８）を含有す る。この図面の部（ｄ）は３倍化時間に相当するインキュベーション後の同−Ｇ ＭＤｓ（１０）を例示し、より大きいＧＭＤｓ（２２）の３つの各々は８細胞の マイクロコロニー（４２）を含有し、そして１つのより大きいＧＭＤ（２６）は 非増殖細胞（２８）を含有する。部＜ｅ＞、（ｆ）、（ｇ）および（ｈ）は、そ れぞれ、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の測定に基づく生物学的物質に対 して比例するシグナルのヒストグラムである。

第３図 この図面の部（ａ）は、インキュベーション前のいくつかの大きさのＧＭＤｓ　 （Ｉ　Ｏ）を例示し、より大きいＧＭＤｓの４つの各々は個々の細胞（１２）を 含有する。この図面の部（ｂ）は、１倍化時間に相当するインキュベーション後 の同−ＧＭＤｓ　（１０）を例示し、より大きいＧＭＤＳ　（２２）の３つの各 孕は２つの細胞のマイクロコロニー（２４）を含有する。この図面の部（ｃ）は ２倍化時間に相当するインキュベージコン後の同−ＧＭＤｓ　（１０）を例示し 、より大きいＧＭＤｓ（２２）の３つの各々は４細胞のマイクロコロニー（３２ ）を含有する。この図面の部（ｄ）はインキュベーションを統けるが、増殖阻害 因子の存在下の同−ＧＭＤｓ（１０）を例示し、より大きいＧＭＤｓ（１２）の ３つの各々は４細胞のマイクロコロニー（３２）を含有する。部（ｅ）、（ｆ） 、（ｇ）および（ｈ）は、それぞれ、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の測 定に基づく生物学的物質に対して比例するシグナルのヒストグラムである。

第、１図 部（ａ）は２つのタイプの細胞、タイプＡの２細胞（１０）およびり４ブＢの２ 細胞（１２）から構成された混合集団を例示する。部（ｂ）は微小滴の形成を例 示１．１、こうして２つの微小滴（２０）の各々は１′つの最初のタイプＡの細 胞（ｌＯ）を含有し、２つの他の微小ｍ　（２２）の各々は１つの最初のタイプ Ｂの細胞（１２）を含有し、そして４つの他の微小滴（２４）はゼロの最初の細 胞を含有する。部（Ｃ）はインキュベージコン後の部（ｂ）におけるのと同一の 微小滴を例示し、Ａ細胞の２細胞のマイクロコロニー（３０）を含有する２つの 微小滴（２ｏ）、各々がタイプＢｍＭ！（１２）の８細胞のマイクロコロニー（ ３２）を含有する２つの微小ｉｎ　（２２）示し、そして４つの他の微小滴（２ ４）はゼロ細胞を含有する。部（ｄ）はインキュベーション前の生物学的物質に 対して応答すうシグナルのためのヒストグラムを例示し、そして部（ｅ）はイン キュベーション後の生物学的物質に対して応答すうングナルのためのヒストグラ ムを例示し、ここで細胞のタイプＡは細胞のタイ７’Ｂよりゆっくり増殖する。

本発明は、液体またはゲルの材料から構成された非常に小さい実在物であり、そ してゼロ、ｌまたは多殻の生物学的実在物を含有することができる微小滴Ｉ：関 する。さらに詳しくは、用語微小ｍ（ＭＤ）は、含有する生物学的実在物をもつ か、あるいはもたない、両者のゲルの微小滴（ＧＭＤ）　、液体の微小滴（ＬＭ Ｄ）を包含する。こうして、用語「ゲルの微小滴ｊまたはＦ液体の微小滴Ｊｆ７ ）特別の使用により制限されないかぎり、ｔｒｍｒ微小滴」は両者のゲルおよび 液体の微小滴を呼ぶ。

液体の微小滴（ＬＭＤ）は非常に小さい体積の主として液状材料であり、溶液、 典型的蚤こは無機および／または有機の化合物を有する水溶液を含有することか でさ、そしてさらに生物学的実在物を含有することができる。ＬＭＤｓは、他の 液体、例えば、非水性流体から構成される装界によるか、あるいは透過性のバリ ヤー、例えば、膜により定めらね、ており、こうして膜はＬＭＤ内に問題の生物 学的実在物を保持することができ、そしてまた他の生物学的実在物、例えば、分 子を通すことができる。

ＬＭＤｓは任意の形状をもつことができるが、１．、　Ｍ　Ｄ　ｓはＬＭＤｓの 境界に関連する界面力が変形可能なＬＭＤｓを丸める傾向をもつために、しばし ばほぼ球形である。他の力、例えば、ＬＭＤ懸濁液の撹拌に関連する流体力学的 力、表面への付着、または重力は球形から離れさせる。

さらに、ＬＭＤの体積の大きい部分を占める体積をもつ実在物を含有するか、あ るいは実在物により占められるＬＭＤｓは、非球形であるＬＭＤｓを生ずること ができる。こうして、例えば、非水性流体により囲まれた水溶液の薄い被膜によ り取り囲まれる細胞はＬＭＤである。同様に、非水性流体により囲まれｔ：水溶 液の薄い被膜により取り囲まれる非生物学的粒子は、また、ＬＭＤである。球形 である場合、ＬＭＤｓは約０゜２μ〜約１．０００μ、好ましくは約５μ〜約５ ００μの直径を有する。

一般に、ＬＭＤの体積は約８ＸｌＯ−１６−約Ｉ　Ｘ　Ｉ　Ｏ−’ｍＱ、、好ま ［−＜は約ｌＸｌ０−”−約Ｉ　Ｘ　ｌ　Ｏ−’ｍｕである。

液体の微小滴は種々の方法により形成することができ、こ７”Ｌらの方法は一般 によく知られており、そして液体噴射の破壊に基つく方法、噴霧法、および分散 を包含する。例えば、空気中に出る水性液体噴射を強制的にほぼ均一の体積の液 体の微小滴に破壊する（参照、例えば、Ｋａｃ）１ｅ１およびＭｅｎｋｅ、Ｆｌ ｏｗ　　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　　ａｎｄ　　Ｓｏｒｉｎｇ、Ｍｅｌａｍｅｄ　　 ｅｔ　　ａｌ、（編）、Ｗｉｌｅｙ、ニューヨーク、ｐｐ、４１−５９．１９７ ９）か、あるいは水性液体を噴霧（参照、例えば、Ｒｏｔｍａｎ、ＰＮＡＳ　　 ４７：１９８１　１９９１゜１９６１）することができる。同様に、分散液を使 用して水性液体の微小滴の非連続的水性相から成る乳濁液をつくることはよく確 立されている（参照、例えば、Ｗｅａｖｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ａｎｎ、Ｎ、 Ｙ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、４３４：３６３　３７２．１９８４）。

ＧＭＤＳは非常に小さい体積の実在物であり、少なくとも１つのゲル領域からな り、そして、必要な接触を用いないで、生物学的実在物、例えは、小さい多細胞 の有機体、細胞の群、個々の細胞、原形質体、小胞体、胞子、オルガ不う、寄生 体、ウィルス、核酸分子、抗体分子、抗原分子、および分子の凝集体を連行また は取り囲むことができる機械的マトリックスを提供する。ＧＭＤｓはゲル全体か ら成ることができ、この場合において、生物学的実在物の含有はゲルのマトリッ クス５こよる生物学的実在物の連行により起こることができる。生物学的実在物 を連行または固定化するゲルのマトリックスの一般的能力はよく知られており、 種々の巨視的ゲルの調製物、例えば、ベトリ皿、ゲルのスラブおよびゲルのビー ズについて確立されている（参照、例えば、Ｉｍｍｏｂ　ｉ　ｌ　１ｚｅｄ　　 Ｃｅ１ｌｓ　　ａｎｄ　　Ｏｒｇａ、ｎｅｌｌｅｓ、Ｖｏｌ、ＩおよびＩ　Ｌ　 Ｍａｔ　１ａｓｓｏｎ　（編）ＣＲＣ，Ｂｏｃａ　　Ｒａｔｏｎ、１９８３）。

あるいは、ＧＭＤｓは少なくとも１つの水性液体領域を取り囲むゲルのマトリッ クス材料のンエルから成ることができ、この場合におい−Ｃ１生物学的実在物の 含有はゲルのマ）　ＩＪソクス材料による生物学的実在物の取り込みにより起こ すことができるか、あるいは、生物学的実在物と接触させるかまたはさせないで 、ゲルのマトリックス材料で生物学的実在物を取り囲むことによって起こすこと ができる。

さらに、ＧＭＤｓはゲルの材料および液体の材料から構成された複数の領域から 成ることができる。複数のゲル領域をもつＧＭＤｓの代表的な立体配置は第２ゲ ル領域により完全に取り囲まれた第１ゲルの微小滴領域を包含し、ここで第２領 域は第１ゲル領域と異なるゲル材料から構成することができる。あるいは、第２ ゲル領域は第１ゲル領域と本質的に同一の材料から構成されることができるが、 第２ゲル領域は異なる実在物、例えば、取り込まれたビーズおよび巨大分子を含 有することができるか、あるいは第２ゲルは区別可能な分子、例えば、第２ゲル のマトリックスの構成成分に取り付けられた蛍光分子を有することができる。

同様に、ＧＭＤｓは少なくとも１つのゲル領域により囲まれた液体領域を含有す ることができる。このような液体領域をもつ代表的なＧＭＤＳは、少なくとも１ つの液体領域、例えば、ゲルにより囲まれｔ；水性液体のコアを取り囲むゲル材 料のシェルから成るＧＭＤｓを包含する。このようなＧＭＤｓは、ゲルのマトリ ックスと生物学的実在物を必然的に接触させないで、生物学的実在物を取り込む 一般的手段を提供する。なぜなら、ゲルのマトリックスは取り囲む生物学的実在 物に対して不透過性であること、およびＧＭＤｓがＧＭＤｓの任意の所望の物理 学的操作の間に無傷に止まるように、ゲルのマトリックスが十分に機械的に強い ことのみが必要であるがからである。

生物学的実在物を含有しないＧＭＤｓの液体領域Ｒよびゲル領域は、ＧＭＤの非 生物学的領域と呼ぶ。

ＧＭＤｓは任意の形状であることができるが、ＧＭＤｓはしばしばほぼ球形であ り、約０．２μ〜約１．０００μ、好ましくは約５μ〜約５００μの直径を有す る。一般に、ＧＭＤの体積は約８ＸｌＯ−１Ｓ〜約ＩＸ　Ｉ　Ｑ−’ｍ１２　、 好ましくは約ｌＸｌ０−”−約Ｉ　Ｘ　ｌ　Ｏ−’ｍ＋２である。

用語ゲルは高い水含量をもつ多孔質マトリックスを呼ぶ。構造は生物学的実在物 を取り込む能力を有すると同時に、ゲルのマトリックスの水性媒質内で多数の分 子を移送することができる。ゲルのマトリックスは、また、化学的溶液、典型的 には無機および／または有機の化合物を含有することができる。例えば、ゲルの ７トリツクスは、無機のイオン分子および／または有機のイオンおよび分子から 構成された、生理学的溶液または細胞の増殖培地を含有することができる。ＧＭ Ｄｓを作るための代表的な自然のゲル材料は、次のものを包含する：カツバー力 ラゲエナン、イオター力ラゲエナン、アルギン酸ナトリウム、フルセララン、ゼ イン、スクンニル化ゼイン、スクシニル化セルロース、アガロース、コラーゲン 、フィブリン、プロテオグリカン、エラスチン、ヒアルロン酸およびグリコタン パク質、例えば、フィブロネクチンおよびラミニン、および他の天然に産出する 細胞外７１−リツクスなど、代表的なゲル化可能な材料の合成水溶性ポリマーは 、次のものを包含する：ビニルピロリドン、２−メチル−５−ビニルピリジン− メチルアクリレート−メタクリ酸のコポリマー、ビニルアルコール、ビニルピリ ジン、ビニルピリジン−スチレンコポリマーなどから作られたもの。

ＧＭＤｓは、巨視的ゲル体積の再分割を包含する種々の方法によりつくることが できるが、好ましくは水性懸濁液を液体の微小滴に転化し、次いで液体の微小滴 の液体の状態からゲルの状態にすることによって形成または作られる。液体の微 小滴は非常に小さい変形可能な体積の液体であり、他の明確な液体または気体の 流体により囲まれているか、あるいは膜材料により被覆される。ＧＭＤｓをつく る一般的方法はまずＬＭＤｓを作ることを包含し、ここでＬＭＤｓはゲル化可能 な物質を含有する液体から作り、こうして引き続くゲル化条件への暴露のとき、 Ｌ　Ｍ　ＤＳはＧＭＤｓへ転化される。ゲルの状態は種々のよく知られている方 法により形成され、これらの方法は温度の変化、イオン濃度の変化、化学的濃度 、酵素触媒、Ｓよび光重合を包含する。

関連するゲル化方法はヒステリシスをもたない可逆的、ヒステリシスをもつ可逆 的または不可逆的であることができる。ヒステリシスをもたない可逆的である場 合に３いて、単に条件を逆転する、例えば、最初にゲル化した温度戻すことによ って、ＬＭＤｓをＧＭＤｓに転化し、そしてＧＭＤＳ　ｔｔＬＭＤｓに転化する ことができる。ヒステリシスをもつ可逆的ゲル化の場合に８いて、ゲル化を引き 起こすために要求な条件を越える、例えば、最初にゲル化を引き起こした温度に 戻し、次いでそれを通過することによって、ＬＭＤｓをＧＭＤｓに転化し、そし てＧＭＤｓをＬＭＤｓに転化することができる。不可逆的ゲル化の場合において 、ゲル化プロセスを逆転する条件は、ＬＭＤｓまたはＧＭＤｓ中に含有される生 物学的実在物に有害な条件をつくらないで、達成することができない。不可逆的 ゲル化の１つの例は、光重合により作られるＧＭＤｓの形成である。

１つの一般的手順において、液状懸濁液をノズルまたは振動オリフィスに強制的 に通して液体の流れを形成し、この流れは、毛管１射の表面張力のために、ある いはせん断力を加えることＩこよって、破壊して液体の微小滴を形成する。引き 続いて、液体の微小滴を条件、例えば、温度に暴露するか、あるいは液体の微小 滴をゲル化を引き起こすイオンを含有する溶液中に向けることによって、液体の 微小滴をゲル化する。ノズルまたは振動オリフィスのＧＭＤ　ｓを作る方法の１ つの属性は、大部分のＧＭＤｓがほぼ同一大きさであることである。

ＧＭＤｓを作る他の方法は、巨視的ゲル体積をまず作り、次いで巨視的ゲル体積 を断片化し、切断し、崩壊するか、あるいは細分割し、こうして複数の非常ｌこ 小さい体積のゲル断片ま！：はゲル粒子をつくることを包含する。この一般的方 法は、ＧＭＤｓが球形であることを必要とせず、またほぼ球形であることさえ必 要としないことを強調する。その代わり、ＧＭＤｓは非常ｌ二小さい体積のゲル 材料から成ることのみを必要とし、体積は約８ＸｌＯ−”−約Ｉ　ＸＩ　Ｏ−３ ｍＱ、好ましくは約ｌＸｌ０−”−約Ｉ　Ｘ　Ｉ　Ｏ−’ｍ（ｌである。

一般に、液体懸濁液からＧＭＤｓを作ることが好ましい。なぜなら、分散方法は より簡単であり、経費が低くそして一般に流体噴射より詰まりの問題がないから である。分散方法は液体の懸濁液を不混和性液体、例えば、重質アルコール、鉱 油またはシリコーン流体中に、手段、例えば、液体懸濁液および不混和性流体を 一緒に撹拌または渦形成し、次いで不混和性液体により囲まれｊ；液体の微小滴 を作ることによって、分散させることから成る。液体の微小滴は、種々のよく知 られているゲル化方法、例えば、イオン交換または＠室液化により、分散方法の 間または後にゲル化する。分散方法は、一般に、比較的広い範囲の大きさ、例え ば、約５μ〜５００μの直径のＧＭＤｓを作る。

ＧＭＤｓは、また、巨視的体積のゲルを非常に小さい体積のゲル粒子に断片化、 切断、崩壊または他の方法で転化することによって形成することができ、こうし て前記ＧＭＤｓは不規則の形状を有する。例えば、巨視的ゲルのスラブを形成す ることができ、ここで生物学的実在物、例えば、細胞はランダムな位置に取り込 まれており、ゲルのスラブを低い温度に冷却し、次いでゲルのスラブを４１！！ 械的Ｉこ詰めて、巨視的ゲルを片に断片化し、それらの多くは非常に小さい体積 を有し、これによりＧＭＤｓを構成する。

ＧＭＤｓは、また、１まｔ；は２以上の実在物のまわりｌこゲルの被膜を形成し 、こうしてゲルが実在物のまわりを完全にまたは本質的に囲む方法により、形成 することができる。例えば、冷たいゲルをより温かい材料の溶液と接触させ、前 記材料は冷却とゲル化し、ゲルの被膜を細胞の回りに形成することができ、こう して細胞はＧＭＤｓ中に組み込まれる。

この場合において、ＧＭＤｓｌｔｉｉ著に非球形であることがある。なぜなら、 ゲルの被膜は細胞の形状をもってしばしば形成するからである。、同様ｌコ、非 生物学的実在物、例えば、細胞培養物のマイクロキャリアーのビーズ、土の粒子 および食物粒子は、ゲル被覆方法により、ＧＭＤ！（中に組み込むことができ、 こうして生ずるＧＭＤ！！はしばしば組み込まれた非生物学的実在物に近似する 形状ををする。

Ｇ　Ｍ　Ｄ　ｓが非水性流体内で形成される場合において、ＧＭＤｓを水性媒質 中に移して、生物学的実在物を増殖、代謝、分泌、トランスメンブレンの電位の 発生、膜完全性および酵素活性に関Ｃる種々の条件に暴露し、そしてまたＧＭＤ ｓの測定および単離のために好適な条件に暴露することはしばしば望ましい。こ のような移送の／；めの例示的方法は、ＧＭＤの水性の内部が、天然に産出する 界面活性剤、例えば、血清中に存在するものを包含する、適当な界面活性剤を含 有する場合、おだやかな撹拌である。

複合体のゲルの微小滴 複合体のＧＭＤｓは、生物学的実在物を取り込むかか、あるいはそれらを囲むこ とができる非生物学的領域である、ゲル材料または液体材料の１より多い区別可 能な領域を含有するＧＭＤｓであり、そしていくつかの方法により形成すること かできる。こうして、複合体のＧＭＤｓは複数の非生物学的領域により特性決定 され、これらの領域は、さらに、第２性質を有する少なくとも１つの非生物学的 領域のすべてを実質的にまｔ；は完全に取り囲む、第１性質を有する少なくとも １つの非生物学的領域を有することによって特性決定されるつ複合体のＧＭＤｓ は両者のゲルおよび液体の領域を含有することができ、ここで液体の領域は１ま たは２以上のゲルの領域ｌこより取り囲まれているので、このような複合体のＧ 　Ｍ　Ｄ　ｓは少なくとも１つのゲルの領域を含有しなくてはならない。

しかしながら、生物学的実在物についての測定の実施、および生物学的実在物の 単離に有用であるためには、少なくともある複合体のＧＭＤｓは生物学的物質を 含有する。

１゛つの一般的方法において、第１ゲルの領域中に組み込むか、あるいは取り込 むことを望む、任意の細胞、微小ビーズまたは他のマーカー実在物または力連結 実在物を有する水性懸濁媒質を準備する。次いで、まず、ＧＭＤｓを第）ゲル化 可能な材料から、この開示のどこかに記載した方法のいずれかを使用して、形成 する。次いで、第１ＧＭＤｓを第２ゲル化可能な材料を含有する媒質中に懸濁し 、この第２ゲル化可能な材料は第１ゲル化可能な材料と同一であるか、あるいは 異なる組成であることができる。さらに、第２ゲル化可能な材料は、光学的性質 、例えば、光の散乱、光の吸収または測色、蛍光、時間遅延蛍光、リン光および 化学ルミネッセンスを有する材料から、部分的にまｔ：は完全に、構成して、第 ２ゲルの領域と第１ゲルの領域と区別することができる。このようにして、１ま たは２以上のこのような方法を使用することによって、第２ゲルは望ましい光学 的性質をもつ複合体のＧＭＤｓを提供することができ、この場合において２つの 区別可能なゲルの領域をＧＭＤ／ＧＭＤｓと呼ぶ。例えば、ＧＭＤの直径の決定 のための光学的／グナルは第２ゲルの領域から得ることができると同時に、高い 確率で、第１ＧＭＤ取り込み細胞と第２ゲルの領域との接触を回避することがで きる。

より一般に、少なくとも１つの領域が光の散乱、光の吸収または測色、蛍光、時 間遅延蛍光、リン光および化学ルミネッセンスから成る群より選択される光学的 性質をもつ第１材料を含有し、そして第２増殖が光の散乱、光の吸収または測色 、蛍光、時間遅延蛍光、リン光および化学ルミネッセンスから成る群より選択さ れる光学的性質をもつ、第２の光学的区別可能な材料を含有する、複合体のＧＭ Ｄｓを形成することは有用である。

あるいは、ビーズ、非生物学的粒子、結晶、非水性流体封入体、生存能力をもつ 細胞、死亡した細胞、不活性な細胞、ウィルス、胞子、原形質体、小胞体、染料 および色素を包含するマーカー実在物を第１ゲルの領域または第１ＧＭＤｓ中に 組み込み、そして生物学的実在物、例えば、小さい多細胞の有機体、細胞の群、 個々の細胞、原形質体、小胞体、胞子、オルガ不う、寄生体、ウィルス、核酸分 子、抗体分子、抗原分子、および分子の凝集体第２ゲルの領域中に組み込んで、 複合体のＧＭＤｓの測定を増強する手段を提供することができる。この場合にお いて、ビーズ、非生物学的粒子、結晶、非水性流体封入体、生存能力をもつ細胞 、死亡した細胞、不活性な細胞、ウィルス、胞子、原形質体、小胞体、染料およ び色素から成る群より選択されるマーカー実在物を含有する少なくとも１つのゲ ルの領域をもつ複合体のＧＭＤｓが得られる。このような複合体のＧＭＤｓは、 マーカー実在物の光学的性質が光の散乱、光の吸収または測色、蛍光、時間遅延 蛍光、リン光および化学ルミネッセンスから成る群より選択される場合において とくに有用である。複合体のＧＭＤｓは、また、第２性質を有する少なくとも１ つの非生物学的領域のすべてを実質的にまたは本質的に取り囲むマーカー実在物 を有する、少なくとも１つの非生物学的領域を有することによってさらに特性決 定される、複数の非生物学的領域により特性決定することができる。

複合体のＧＭＤｓを形成するために、いくつかの一般的方法を使用することがで きる。複数の非生物学的領域を有し、少なくとも１つの非生物学的領域が少なく とも１つの他の非生物学的領域と異なる性質を有する、ＧＭＤｓを生成する１つ の方法は、次の一般的工程からなる：　（ａ）この開示中のいずれかに記載した 方法のいずれかを使用して第１ゲルのＧＭＤｓを形成し、（ｂ）第２ゲルを形成 することができる材料中にゲルの微小滴を懸濁し、そして（Ｃ）第１ゲルのゲル の微小滴を第２ゲルのゲルの微小滴中に組み込み、これにより明確な非生物学的 ゲルの領域をもつゲルの微小滴を形成する。

複数の非生物学的領域を有し、ここで少なくとも１つの非生物学的領域が少なく とも１つの他の非生物学的領域と異なる性質を有する、ＧＭＤｓを生成する他の 一般的方法は、次の一般的工程から成る：（ａ）ＧＭＤｓを形成し、（ｂ）ＬＭ Ｄｓを形成することができる材料中に前記ＧＭＤｓを懸濁させ、そして第１ゲル のＧＭＤｓをＬＭＤｓ中に組み込み、これにより明確な非生物学的領域をもつ複 合体のＧＭＤｓ、この場合においてｌまたは２以上の液体の領域をもつ複合体の ＧＭＤｓを形成する。

複数の非生物学的領域を有し、ここで少なくとも１つの非生物学的領域が少なく とも１つの他の非生物学的領域と異なる性質を有する、ＧＭＤｓを生成するなお 他の一般的方法は、次の一般的工程を包含する；（ａ）液化することができる第 １ゲルのＧＭＤｓを形成し、（ｂ）第２ゲルを形成することができる材料中に前 記ＧＭＤｓを懸濁させ、（ｃ）前記第１ゲルのＧＭＤｓを前記第２ゲルのＧＭＤ ｓ中に組み込み、そして（ｄ）第１ゲルを液化し、これにより明確な非生物学的 領域をもつＧＭＤｓ、この場合において少なくとも１つの液体の領域をもつＧＭ Ｄｓを形成する。

生物学的実在物の測定および／または単離を包含する方法において本発明のゲル の微小滴を使用するために、複合体のＧＭＤｓは適当な生物学的実在物を含有し 、したがって生物学的物質を含有する懸濁液または溶液から形成すべきである。

本発明の複合体のＧＭＤｓは、生物学的物質が生物学的実在物、例えば、小さい 多細胞の有機体、細胞の群、個々の細胞、原形質体、小胞体、胞子、オルガ不う 、寄生体、ウィルス、核酸分子、抗体分子、抗原分子、および分子の凝集体の組 成物である場合において有用であり、そして細胞が動物細胞、植物細胞、昆虫細 胞、バクテリア細胞、酵母菌細胞、真菌細胞およびかび細胞から成る群より選択 されるか、あるいは正常のヒトの細胞、ヒトの癌細胞、病原性バクテリア、ｇＩ ｇ原性酵母菌、マイコプラズマ、寄生体、および病原性ウィルスから成る群より 選択される場合においてとくに有用である。

強磁性、反磁性、常磁性、誘電性、電気帯電性、電気泳動性、質量密度性、およ び光学的圧力性から成る群より選択されるカカップリング性質をもつ、カカップ リング実在物、例えば、ビーズ、非生物学的粒子、泡および非水性流体封入体は 、また、ｌまたは２以上のゲルの領域または液体の領域中に組み込んで、複合体 のＧＭＤｓの物理学的操作のための手段を提供することができる。こうして、カ カップリング性質をもつカカップリング実在物、例えば、ビーズ、非生物学的粒 子、泡および非水性流体封入体をもつ、ｌまたは２以上の領域を含有する複合体 のＧＭＤｓを提供することは有用である。このようなカカップリング実在物の提 供により、複合体のＧＭＤｓを力の適用により操作することができる。

本発明は、また、２つより多い区別可能なゲルの領域からなる複合体のＧＭＤｓ の産生に基本的方法の拡張を包含する。例えば、ＧＭＤ／ＧＭＤｓである複合体 のＧＭＤｓは、Ｇ　Ｍ　Ｄ　／　Ｇ　Ｍ　Ｄ　／　Ｇ　Ｍ　Ｄ　ｓ　、すなわち 、３つの区別可能なゲルの領域をもつ複合体のＧＭＤｓを形成するために、ＧＭ Ｄにおいで使用することができる。

１より多い非生物学的ゲルの領域を含有するＧＭＤｓを形成することができ、こ うしてこれにより複合体のＧＭＤｓが形成し、ここで前記複合体のＧＭＤｓは異 なるゲル材料および／または同一ゲル材料の領域から構成されるが、異なる取り 込むか、あるいは結合しｔ；実在物をもつ。

こうして、例えば、２つの異なるゲル材料から作られた複合体のＧＭＤＳである ＧＭＤｓは、柔軟な、低い密度のゲル、例えば、０．５％のアガロースから構成 された第１内部領域およびより硬い、高い密度のゲル、例えば、４％のアガロー スから構成された第２外部領域を含有することができる。この例示を続けると、 ０．５％のアガロースの第１内部領域は細胞への圧縮力を少なくして細胞の増殖 を支持するが、第２外部領域は増殖する細胞をよりよく拘束する。

少なくとも１つの液体の領域結晶ＧＭＤｓは、また、形成することができる。ゲ ル材料が液体の領域を取り囲むＧＭＤｓを形成する例示的方法は、次の通りであ る。、第１工程は引き続いて液化することができるゲル材料からＧＭＤｓを形成 する方法からなり、第２工程は第１　ＧＭＤ　ｓを完全に取り囲む第２ゲルの領 域から成るＧＭＤｓの形成からなり、こうして第２ゲル材料は第１ゲル材料と異 なり、そして第１ゲルを液化する条件下にゲルで止まることができ、そして第３ 工程は第１ゲル材料を液化することからなり、その結果ゲルの領域により囲まれ た液体の領域をもつＧＭＤｓがこれにより形成される。この方法のより特定の例 示は次の通りである。第１工程はアルギン酸ナトリウムを含有する液体の微小滴 を形成することからなり、アルギン酸ナトリウムをもつ生物学的実在物の懸濁を 振動オリフィスに強制的にを通し、これにより生物学的実在物およびアルギン酸 ナトリウムの両者を含有する生ずる噴射を破壊し、生ずる液体の微小滴をカル／ ラムイオンを含有する水性媒質中に入れて、アルギン酸カル７・ラムのＧＭＤｓ を形成する。第２工程は、濾過および遠心のような手段によりアルギン酸カル／ ウムのＧＭＤｓを濃縮し、熔融したアガロースを約３７℃において添加し、次い でアルギン酸カルシウムのＧＭＤｓの懸濁液を鉱油中に分散し、そして分散液を 冷却し、これによりアルギン酸塩のＧＭＤｓを含有するアガロースＧＭＤｓを形 成することからなる。第３工程は、前記複合体のＧＭＤｓを塩化ナトリウムおよ び本質的にゼロのカルンウムを含有する水性溶液Ｉ：暴露し、こうしてナトリウ ムおよびカルシウムのイオンは交換され、これによりアルギン酸カルシウムは複 合体のＧ　Ｍ　Ｄ　ｓ内で液化することができる。

１宜上、ｌより多いゲルおよび液体の領域から構成されたＧＭＤｓを複合体のＧ ＭＤｓと呼ぶこと、そしてＧＭＤ／ＧＭＤｓは液体である第１の形成した領域お よびゲルである第２の形成した領域をもって形成したＧＭＤｓを意味し、そして ＧＭＤ／ＧＭＤはゲルである第１領域およびゲルである第２領域をもつＧＭＤｓ を意味するような表示法を使用することは有用である。こうして、前のより特定 の例示において、ＷＣ２工程が完結すると、ＧＭＤ　（アガロース）／ＧＭＤｓ （アルギン酸カルシウム）からなるＧＭＤｓが形成し、そして第３工程が完結す ると、ＧＭＤ（アガロース）／ＬＭＤｓ（アルギン酸ナトリウム）からなるＧＭ ＤＳが形成する。

微小滴の測定 用語測定はパラメーターん量を定量する方法を呼び、そして用語検出を包含する 。なぜなら、検出はパラメーターが限界条件より大きいか、あるいはそれに等し いか否か、あるいは限界条件より小さいかを決定する粗い測定であるからである 。こうして、例えば、微小滴の光学的測定は微小滴に関連する少なくとも１つの 光学的シグナルを定量することを包含する。用語定量はある値をシグナルに割り 当てることを呼び、こうして前記定量パラメーターを２つの異なる値より多い２ つの内の１つに割り当てることを許す分解を有する。対照的に、検出は分解がパ ラメーターを２つの値の１つのみに割り当てることを許す測定を呼び、１つの値 は限界値以下にに相当し、したがって非検出であり、そして他方は限界値まｔ： はそれ以上にに相当し、したがって検出にに相当する。

微小滴およびその中に含有される生物学的実在物の測定および操作に関する多数 の有用な方法は、微小滴のパラメーターの測定を利用しないで、実施することが できるが、微小滴のパラメーター、例えば、微小滴の体積、ｖｌ、微小滴の直径 、Ｄ、、、、　　（はぼ球形である場合）、微小滴の質量および微小滴の移動性 が決定される感染、増大した測定および操作はしばしば達成される。

微小滴の体積、Ｖ６□、はＭｌ）を定める２つの流体の間の界面に関連する／グ ナルを測定するか、あるいはＭＤ内の流体およびＭＤに対して外部の流体の物理 学的性質の差に関連するングナルにより測定することができる。Ｖ６４の測定の ための物理学的基準は、光学的、秤量、沈降、場の流れの沈降分画、音響、磁気 、電気および熱的測定から成る群より選択することができる。

種々の測定はＭＤ内の流体およびＭＤに対して外部の流体の間の質量密度の差に 基づき、そして次のものを包含する：微量天秤による秤量、例えば、静めた圧電 センサー、加速の場、例えば、重力に基づく沈降の測定、回転の加速、例えば、 遠心および／または非遠心を基準とする求心の加速、これを使用して大きさに基 づいてＭＤｓを分離する、および場の流れの沈降の分画、ここでＭＤｓは大きさ に従いおだやかに分離される（参照、例丸ば、ＬｅｖｙおよびＦｏｘ、Ｂｉｏｔ ｅｃｈ、Ｌａｂ。

５：１４−２１，１９８８）。質量密度の差に部分的に基づく他の方法は、また 、他のパラメーターの差を包含し、そして音響に基づく測定、ここで取り囲む流 体に関するＭＤｓの音響的性質の変動を利用する（参照、例えば、Ｑｕａｔｅ、 Ｐｈｙｓｉｃｓ　　Ｔｏｄａｙ、Ａｕｇｕｓｔ１９８５、ｐｐ、３４−４２）、 磁気的測定、ここで磁気的性質、の存在下に常磁性、反磁性および強磁性の差を 利用する、および熱的測定、ここで取り囲む流体に関する熱的性質の差を利用す る、とくに熱伝導性、熱拡散性および比熱（参照、例えば、Ｂｏｗｍａｎ　　ｅ ｔ　　ａｌ、、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｈｐｙｓ、Ｂｉｏｅｎｇｒ、４：４３− ８０．１９７５）。

Ｖｌを測定する一般的に好ましい方法は、光の散乱、光の吸収または測色、蛍光 、時間遅延蛍光、リン光および化学ルミネッセンスから成る群より選択される光 学的測定を包含する。なぜなら、光学的測定は柔軟であり、急速でありそして非 接触測定であるからである。光の散乱を使用する例示的光学的測定は、ＭＤｓ内 の水性流体とＭＤに対して外部の非水性流体との間の屈折率の差に基づくことが できるか、あるいはＭＤＳ内の水性流体と非水性流体との間の光の吸収または測 色、リン光または化学ルミネッセンスに基づくことができる。

なおさらに詳しくは、蛍光はとくに感受性であるので、取り囲む流体に関するＭ Ｄの蛍光の差を利用することが好ましい。ＭＤ内の流体およびＭＤｓ１ｍ対して 外部の流体の両者は蛍光であることができるが、ＭＤ内の流体またはＭＤに対し て外部の非水性流体が有意の蛍光を有する測定を行うことが好ましい。こうして 、例えば、少なくとも１つの蛍光分子の型をＭＤｓ中に組み込み、こうして非蛍 光性の非水性流体により囲まれたとき、ＭＤの体積は蛍光分子に関連する合計の 蛍光の強度により決定することができ、そして前記蛍光分子が取り囲む非水性流 体中に有意に分配されないそれ以上の条件下に暴露する。なおさらに詳しくは、 蛍光分子、例えば、ＦＩＴＣ−デキストランは、ＭＤ内の流体からなる水性媒質 中に組み込むことができ、モしてＦＩＴＣ−デキストランの合計の蛍光放射強度 を測定する。同様ｌこ、少なくとも１つの蛍光分子の型をＭＤｓ取り囲む非水性 流体中に組み込み、こうして非蛍光性ＭＤの存在番こ関連する蛍光の減少はＶ、 ４測定の基準を提供する（参照、例えば、Ｇｒａｙ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｃｙｔ ｏｍｅｔｒｙ　　３：４２８　４３４、！９８３）。

一般に微小滴とともに使用することができる測定方法に加えて、ｌまたは２以上 のマーカー実在物結晶ＧＭＤｓを、また、少なくとも１つのＧＭＤのゲルのマト リックス中に組み込まれた少なくとも１つのマーカー実在物に関連するシグナル を測定することによって測定することができ、ここで前記マーカー実在物は測定 を行うことができる。測定前に存在するＧＭＤｓの場合において、マーカー実在 物を測定前に前に存在するＧＭＤｓ中に組み込むことができる。あるいは、ＧＭ Ｄｓの形成に使用する水性媒質中にマーカー実在物を供給することによって、マ ーカー実在物をＧＭＤｓ中に組み込むことができ、これによりＧＭＤｓの形成の 間にマーカー実在物はＧＭＤｓ中に組み込まれる。

ＧＭＤの体積の体積、■Ｇ１１ｌＤ％は、まずＧＭＤ内に含有されたマーカー実 在物を測定し、次いで少なくとも１つのゲルの微小滴中のマーカー実在物の量を 分析して、前記ゲルの微小滴の大きさまたは体積を決定することによって決定す ることができる。統計学的分析をＧＭＤの性質に関するｌまたは２以上のタイプ の測定に、および／または生物学的実在物に関する１または２以上のタイプの測 定に適用することができる。生物学的実在物の測定をＶＧＭＤの測定と組み合わ せ、こうしてＧＭＤｓ中の生物学的実在物の非生物学的領域に関する統計学的分 析を使用することかでき、そしてこのような組み合わせた測定のために、生物学 的実在物をＧＭＤｓ中に組み込んだ後、マーカー実在物に基づ＜ＧＭＤｓの測定 を行う。

マーカー実在物の例示的タイプは、ビーズ、非生物学的粒子、結晶、非水性流体 封入体、生存能力をもつ細胞、死亡しｔ；細胞、不活性な細胞、ウィルス、胞子 、原形質体、小胞体、染料および色素を包含する。非生物学的粒子は、無機材料 、例えば、シリカ、有機材料、例えば、木炭または炭素、および無機および有機 材料の組み合わせを包含し、ここで有機材料は生物学的または非生物学的由来で あることができる。このようなマーカー実在物は種々の測定、例えば、光学的、 秤量、沈降、場の流れの沈降分画、音響、磁気、電気および熱的測定の実施を可 能とする。

しかしながら、光の散乱、光の吸収または測色、蛍光、時間遅延蛍光、リン光お よび化学ルミネッセンスを使用することによって測定できるマーカー実在物を使 用して、ＧＭＤｓを光学的に測定することは好ましい。

マーカー実在物の存在がＧＭＤｓ内に灯された生物学的実在物に悪影響を及ぼす か、あるいはゲル材料のゲルのマトリックスを形成する能力に悪影響を及ぼす場 合において、ＧＭＤｓの形成前に、ゲル化可能な材料を予備処理して、少なくと も１つのタイプのマーカー実在物を少なくとも１つのゲル化可能な材料に取り付 け、これにより増強しｊ：測定性質を有するＧＭＤｓを形成する。こうして、例 えば、蛍光分子からなるマーカー実在物の化学的取り付けによりゲル化可能な材 料を予備処理することにより、ＧＭＤｓを蛍光により測定することができる。あ るいは、ＧＭＤｓをまず形成し、引き続いてマーカー実在物を導入する。例えば 、巨大分子、例えば、デキストランを蛍光性誘導体で漂識し、アガロースＧＭＤ ｓを前記巨大分子に！！露し、次いで蛍光性デキストランはアガロース中に拡散 し、次いで沈澱または複合化することができ、こうしてデキストランはゲル内に 取り込まれ、これによりＧＭＤｓにマーカー実在物が蛍光標識されたデキストラ ンの形態で取り付けられる。

ＧＭＤｓのある調製において、存意の数の生物学的実在物、例えば、細胞は懸濁 して遊離のままに残ることができる。これにより、ＧＭＤｓ内取り込まれた細胞 および遊離の細胞の両者を含有する懸濁液が生成し、ここで用語遊離の細胞は懸 濁して遊離でありかつＭＤｓ内に含有されない細胞を呼ぶ。この発生は通常望ま しくない。こうして、ＧＭＤｓ内に含有されＩ；細胞と遊離の細胞とを区別する 手段を提供することは高度に望ましい。例えば、ＧＭＤｓ内のマイクロコロニー の形成は、生物学的実在物、とくに細胞の増殖を決定する一般的方法を提供し、 そしてインキュベーンコン後シグナル細胞に対するマイクロコロニーの非生物学 的領域を定量的に比較することによって、平板培養の効率を直接に決定できるよ うにする。しかしながら、有意の遊離の細胞は時々懸濁して存在することがある 場合、遊離の細胞を通常ＧＭＤｓ内に拘束された細胞と区別することができない ので、有意の誤差が生ずることがある。このような場合において、ＧＭＤｓ内に 含有されたマーカー実在物の少なくとも１つのタイプを測定することが好ましく 、こうしてマーカー実在物および生物学的実在物の両者の測定により、生物学的 実在物をゲルの微小滴と関連付ける高い確率が存在することを決定できる。他の 場合において、マーカー実在物の測定は検出からなることができ、ここで１また は２以上のＧＭＤｓの検出は生物学的実在物の測定を、高い確率で、ＧＭＤｓ内 の前記生物学的実在物の含有と関連付けることを可能とする。例えば、ＧＭＤｓ 内の非増殖性の個々の細胞は懸濁して遊離する個々の細胞と区別することができ る。

引き続く統計学的分析を増強するために、測定した生物学的実在物に関連するＧ ＭＤについてのＶＧＭＤを決定することは、また、しばしば望ましい。この場合 において、マーカー実在物の型のために使用する測定したパラメーターを選択し て、生物学的実在物の測定に関係する測定したパラメーターと区別する。例えば 、二本鎖の核酸を含有する生物学的実在物は、ヨウ化プロビジウム（ＰＩ）を利 用するよく知られている染色のプロトコルを使用し、モしてＰＩに関連する赤い 蛍光を測定することによって測定することができ、一方マーカー実在物、例えば 、取り込まれた微小滴、または共有結合的に取り付けられたフルオレセインは、 緑の蛍光を使用して、ＶＧＭＤの測定の基準を提供する。なぜなら、緑の蛍光の シグナルの大きさはＶＧい。と比例するからである。ＶＧｙ６の測定および生物 学的実在物の測定の組み合わせは、さらに、生物学的実在物によりＧＭＤｓの占 有の頻度（ｆ　ｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｏｆ−ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎ）の基準を提供 し、これにより統計学的分析方法、例えば、ポアッソン統計学まグ；は修正した ポアッソン統計学を使用して提供されるものを増強する。

それをＧＭＤｓ中に組み込むときのＧＭＤの測定を増強する種々の物理学的性質 をもつ、マーカー実在物を選択することができる。マーカー実在物の測定の基準 を提供する、有用な物理学的性質は、光学的性質、秤量、質量密度の性質、音響 の性質、磁気の性質、電気の性質および熱的性質を包含する。それらの速度、特 異性、非混乱的性質および非接触性質のために、光学的測定、例えば、流れ細胞 測定装置、貫流ミクロ蛍光測定装置、光学的粒子分析装置、蛍光顕微鏡測定装置 、光学顕微鏡測定装置、像分析装置およびビデオ記録装置を使用してマーカー実 在物を測定することは好ましい。さらに詳しくは、通常、流れ細胞測定の場合に おいて、光学的パルス、例えば、最大パルスの大きさ、パルスの時間の完全性お よびパルスの期間を測定し、それのすべてはよく知られている（参照、例えば、 ５ｈａｐｉｒｏ、Ｐｒａｃｔ　１ｃａｌ　　ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙ、Ａ、 Ｒ，Ｌｉ５ｓ、ニューヨーク、１９８５）。

マーカー実在物は、また、よく知られている電気的測定、とくに電気的抵抗の測 定、電気的測定、これらは実際の分析の基準、例えば、粒子の測定に基づく電気 的抵抗を提供する（参照、例えば、Ｋａｃｈｅｌ、ＦＩＯＷ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒ ｙ　　ａｎｄ　　Ｓｏｒｔｉｎｇ、Ｍｅｌａｍｅｄ（編）、Ｗｉｌｅｙ、ニュー ヨーク、ｐｐ、６ｌ−１０４）、および誘電性賞（参照、例えば、Ｈａｒｒｉｓ 　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｅｎｚｙｍｅ　　Ｍｉｃｒｏｂ、Ｔｅｃｈｎｏｌ、９：１ ８１　　１８８．１９８７）を使用して測定することができる。これらの電気的 測定はよく知られては比較的容易でありかつ比較的コストが低いからである。

測定の統計学的分析 微小滴の使用は、一般に、生物学的試料に関する大きい非生物学的領域の個々の 測定を行う手段を提供する。これは大部分の確立された測定方法と対照的である 。なぜなら、大部分の確立された測定方法は、試料中に含有される生物学的実在 物により、２１１定したパラメーターへの合計の作用に対して応答性であるから である。こうして、有用な測定は小さい数の微小滴を使用して行うことができる が、一般に、大きい数の個々の微小滴の測定の使用は試料の生物学的実在物につ いて有意に改良された測定を行うのための基準を提供する。有意の測定の情報は 大きい数の微小滴の測定の統計学的分析を明瞭に実施しないで得ることができる が、測定の有意の改良は統計学的分析を微小滴の測定に適用することによって達 成される。

ｌより多いパラメーターを測定する、微小滴についての測定をしばしば行う。例 えば、光学的一定、とくに蛍光の測定を使用することは一般に好ましく、この場 合において同時の測定、例えば、緑の蛍光の測定および赤の蛍光の測定をしばし ば行う。混合した生物学的集団に関する測定の例示的場合において、緑の蛍光で 標識した抗体をを使用して、第１タイプの生物学的実在物に関連する生物学的物 質の量を測定することができ、そして赤の蛍光で標識した抗体を使用して、第２ タイプの生物学的実在物に関連する生物学的物質の量を測定することかでさる。

インキュベーション後、緑の蛍光および赤の蛍光のシグナルを使用して、各タイ プの生物学的実在物の量を決定することができ、こうして緑および赤の蛍光の占 有の頻度の分布を得ることができ、次いで統計学的に分析して増殖の変動、およ び遅滞時間の変動を両者のタイプの生物学的実在物について決定することができ る。しかしながら、この例示的場合において、微小滴の体積の測定と組み合わせ て統計学的分析を使用することは不必要であるが、緑および赤の蛍光の測定との 組み合わせは必要である。こうして、微小滴の測定の統計学的分析は一般に有用 であるが、核酸は微小滴のｖｍｌの使用を必然的に含まず、また統計学的分析は 微小滴の占有に必然的に関係しない。その代わりに、統計学的分析は生物学的実 在物それら自体に関係する測定の占有の頻度に関係づけることができる。

個々および多数の微小滴の占有 多くの場合に８いて、少なくとも概算的Ｉ；、生物学的実在物による微小滴の占 有の統計学的分布を決定することは有用である。ここで使用するとき、用語「占 有（ｏｃｃｕｐａｔ　１ｏｎ）　」は最初の生物学的実在物、すなわち、微小滴 の形成直後、およびインキュベーションを使用する前に、存在する生物学的実在 物の存在を呼ぶ。こうして、例えば、生物学的実在物が細胞である、代表的な場 合において、微小滴は、ゼロの占有、個々の占有、または多数のまたほの高い確 率を有することができる。ここで使用するとき、ゼロの占有または非占有は微小 滴がゼロの最初の細胞を含有する場合を呼び、個々の占有は微小滴が１つの最初 の細胞を含有する場合を呼び、そして多数の占有は微小滴が少なくとも２つの最 初の細胞を含有する場合を呼ぶ。インキュページ冒ン後、増殖は起こり、そして 細胞の大きさおよび数を増加させ、こうして個々に占有されｔ；微小滴は引き続 いて最初の単一の細胞の子孫の細胞を含有し、そしてそれにもかかわらず個々に 占有されたＭＤと呼び、そして多数に占有された微小滴は引き続いて最初の多数 の細胞の子孫細胞を含有し、そしてそれにもかかわらず多数に占有されたＭＤと 呼ぶ。

微小滴が少なくとも２つのタイプの生物学的実在物を含有する、一般の場合にお いて、用語占有は各タイプの生物学的実在物とともｊ；別々に使用することがで きる。こうして、例えば、２つのタイプの細胞、タイプＡおよびタイプＢ１から 構成された混合した生物学的集団の場合において、微小滴は最初に、インキュベ ーンランの前に、１つのＡ細胞およびいくつかのＢ細胞を含有することができる 。この場合において、微小滴はタイプＡ細胞により個々に占有されたと呼び、そ してタイプＢ細胞により多数に占有されたと呼び、そして同一表示をまた引き続 いて増殖を生ずるインキュベーションに対して使用する。すなわち、この例を続 けると、インキュベーションが引き続いてＡ細胞の子孫に導く場合、微小滴はな おタイプＡＭ胞により個々に占有されたと見なす。この用語は直接すべてのタイ プの生物学的実在物に拡張される。

ポアッソン統計学法を使用する分析 側々に占有された微小滴について測定を実施し、こうして測定を１つの生物学的 実在物に関する測定として解釈できるようにすることはしばしば好ましい。個々 の占有をもつ微小滴の有意の部分を有する微小滴を形成するＩ；めに、一般に、 異なる大きさの微小滴についての占有の分布を・推定することは有用である。生 物学的実在物が微小滴中に組み込まれている、微小滴を形成する多数の方法は、 ランダムであるか、あるいはランダム不スにより良好に概算され、こうしてｌま たは２以上のＭＤのパラメーター、例えば、直径まＩ：は体積を包含する統計学 的分析は異なる微小滴の占有の確率の決定のために有用である。

結局、一般に、ゼロの、個々のまたは多数の占有の高い確率を有する微小滴の大 きさを決定することは有用であり、こうして異なる大ささまたは体積の範囲の微 小滴中に、２つより小さい最初の生物学的実在物を有する、および少なくとも２ つの生物学的実在物ををするとう確率を推定することができる。懸濁した生物学 的実在物の濃度がおおよそ知られているか、あるいは推定することができるｉｆ 、懸濁液を希釈して、作られている特定の大きさまたは体積の液体の微小滴中に 平均の、既知の数の生物学的実在物を提供することができる。生物学的実在物の 平均の数と液体の微小滴の体積との間の関係を記載する故学的式または等式は、 ポアッソンの確率分布Ｐ　Ｃｎ　Ａｓである（参照、例えば１、Ｇｏｓｓｅｔ。

Ｂｉｏｍｅｔｒｉｋａ、５：３５１−３６０．１９０７；Ｗｅａｖｅｒｅｔ　　 ａｌ、、Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、４３４：３６３−３７２．１９８ ４　；Ｗｅａｖｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈ　　ａｎｄ　　Ｂｉ。

ｅｎｇｒ、Ｓｙｍｐ、１７．１８５−１９５．１９３５；Ｗｉ　ｌ　ｌ　ｉａｍ ｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、５０１：３５０− ３５３．１９８７）、これはその微小滴への適用において、体積Ｖ１．中に見い だされる最初の生物学的実在物の平均の数が　である場合、微小滴の体積Ｖ、、 ｄ中の最初の生物学的実在物の特定の数、ｎ、を見いだす確率Ｐ（ｎ刀壬与える 。さらに詳しくは、数学的関係を支配するＫはπ−／　Ｖ　−、、ここで戸は液 体の微小滴に転化された懸濁液中の生物学的実在物の濃度であり、そして用語「 平均の占有」は　であると定義され、そしてインキユベーシヨンの前に存在する 最初の生物学的実在物の平均の数を意味する。ランダムに分布した生物学的実在 物をもつ試料、例えば、よく撹拌された試料について、部分数の生物学的実在物 を見いだす確率はポアッソンの式により記載される。こうして、ゼロの最初の生 物学的実在物を有するか、あるいは占有されない確率はＰ　（Ｏｆｉｃあり、１ の最初の生物学的実在物を有するか、あるいは個々に占有される確率１ｊＰ（１ 刀、であり、２つの最初の生物学的実在物を有する確率はＰＣＬＤである、など 。あるＧＭＤｓの適用に対して興味ある場合は、ＬＭＤが最初に１より多いエタ ノールｌ二より占有される、すなわち、多数に占有される場合である。多数の占 有の確率はＰ（＞１．Ｆ）であり、そして、すべての可能な確率の合計は１であ るので、最初の多数の占有の確率は次の通りである： Ｐ（＞ｌ、Ｆ）−□９．。−Ｆ）　−Ｐ　（＋、ＩＴ）　　　　　　　　　　　 　（２）一般に、’ｉ−Ｍ　Ｄ　ｓからＧＭＤｓへの転移は体積の有意に変化を 含まない、すなわち、たいていの場合においてＶｍｄ−ＶＬＭＤ”Ｖ６ＭＤｏこ のような場合において、ポアッソンの確率はＬＭＤｓまたはＧＭＤｓで互換的に 使用することができる。体積の変化が有意である場合、体積のスケーリングファ クター、ｒｌ、いをＶＧＭＤ　−ｆ＋　＋　ｌ　”　ＬＭＤに従い使用し、こう してすべてのＧＭＤｓおよびそれらを作るとき使用したＬＭＤｓの体積の間に普 通の関係が存在する。このスケーリングファクター、ｆ　、、、、は、ゲル材料 の一般によく知られている巨視的性質である。

ＭＤｓをつくる方法において、試料の体積、■３、を追加の材料の体積、Ｖ　Ａ 　４　ｄ、と混合する。ＧＭＤの形成の場合において、体積Ｖ　Ａ　４４は通常 引き統＜ＧＭＤｓのゲルのマトリックスを形成するゲル化可能な材料を含有する 。ファクターｆｏによる対応する希釈は次の通りである：そしてＶ、およびＶ。

の両者の測定互換的にに直接計算される。したカ９って、希釈された生物学的実 在物の濃度、？、は、次により試料の生物学的実在物の濃度、戸１、に関係づけ られる：ここでｔはポアッソンの方程式において使用した生物学的実在物の濃度 である。

自然に凝集する生物学的実在物の場合において、ポアッソンの方程式において、 数学的パラメーター、ｎ、ｎ　おより、は、それぞれ、凝集体の特定の数、凝集 体の平均の数および凝集体の濃度を意味する。こうして、コロニー形成単位（Ｃ Ｆ　Ｕ）として自然に凝集する生物学的実在物について、ポアッソンの方程式に おいて、ｎ、ｎおよび−９は、それぞれ、ＣＦＵｓの特定の数、ＣＦＵｓの平均 の数およびＣＦ　Ｕ　ｓの濃度を意味する。

ある場合において、ある時においてｌより多いＭＤについて測定を行い、これに より個々のＭＤｓに関連するＭＤｓのクラスターまたは群について測定を行うこ とは望ましい。この場合において、ポアッソン統計学の式は適用するが、ただし Ｖ−をＶ　ｌ　ｒ　＊　＊　ｐで置換し、ここでＶ　ｊ　Ｉ　Ｉ　Ｓ　Ｐは群に おける個々のＤＭの体積の合計である。

ある場合において、例えば、ＭＤ内のｎの生物学的実在物の体積、ｎＶ□、はＭ Ｄの体積、Ｖｏｌの有意の部分である場合において、ポアッソンの式の修正され た形態を使用することは有用である。修正されｔ−ポアッソンの式は方程式（５ ）で与えられる。

ここで「平均の体積」−Ｖ−、−ｎＶａｔをＶ−で置換し、これはＶｉ＋ｔｇａ Ｖ、４の有意の部分である場合についての占有の頻度のよりよい記載を提供する 。この近似の方程式は、ｎ細胞を含有するＭＤの体積がゲルの微小滴の体積子ｎ Ｖ□であると定義され、そして２ｖｓｔＪ：り小さい体積のＭＤを２またはそれ 以上の公称同一である生物学的実在物が占有できないことと一致する。同一では ない生物学的実在物が最初に存在する場合において、量ｎＶＢＫはＶ　ｔ＋＋ｍ ｌｒ　ＢＥ、生物学的実在物の合計の体積により置換される。

ポアッソンの式の他の近似の修正された態様は、確率の各々について最初の２つ の表現は、次の通りである：Ｐ（ＬＲ”）　＝　ＯぼＶＭ、＜Ｖ、、　　：　（ １−ｅ　　　　”’）　ｉｆ　Ｖ、、＜Ｖ、、≦８Ｖ、、　　　　　　　（６ｂ ）これらの修正されたポアッソンの式または方程式は、Ｖ□ｇａゼロに近付く数 学的限定において方程式（１）と一致するが、ＭＤ内の最初の生物学的実在物の 体積がＶ、、の有意の部分である場合においてよりよい記載の結果を提供する。

さらに、統計学的分析の他の拡張または修正を使用して、分析したＭＤｓが有意 の範囲の体積を育する場合２分析することかでさる。このような分析の下に横た わる基本的概念は、ＭＤｓの各大きさの範囲が同一の確率の方程式、ことにリン 酸または修正しこポアッソン統計学に別々に従うということである。

本発明の好ましい実施態様は、すべての場合について最初に普通のポアッソン統 計学を使用するが、次いで方程式（５）によるか、あるいは方程式（６ａ）、（ ６ｂ）、（６ｃ）およびそれらの拡張により与えられるいずれかの態様を使用す る。占有が小さい体積の場合において、ＭＤｓは同一試料から作られた同一調製 物中の大きい体積のＭＤｓから得られるものと有意に異なる。また、Ｖ□がＶ。

の有意の部分である場合において、占有の確率の記載を提供するポアッソン統計 学の他の拡張を利用することができる。比較的大きさ、形状およびＭＤｓを形成 する手段に依存して、修正したポアッソン統計学の式の他の態様を利用すること ができる。

最も概念的な試料の測定は、１つのＭＤを同時に測定する測定に関する。このよ うな測定は、光学的、秤量、沈降、場の流れの沈降分画、音響、磁気、電気およ び熱的手段から成る群より選択される物理学的手段に基づく種々の測定装置を使 用してなすことができるが、好ましくは流れ細胞測定装置、貫流ミクロ蛍光測定 装置、光学的粒子分析装置、蛍光顕微鏡測定装置、光学Ｈ検鏡測定装置、像分析 装置およびビデオ記録装置の形態の光学的手段を使用して実施することができる 。電気的手段は、誘電性の測定装置または電気的抵抗に基づく粒子分析装置を包 含することができる。前のように、微小滴の測定は、このような測定装置におい て、２つより小さいＭＤが装置の測定体積内に同時に存在する確率が高いモード で装置を作動することによってなされる。こうして、流れ細胞測定の例示的場合 において、２つより小さいＭＤが光学的照明領域の焦点体積中に同時に存在する 確率が高いモードで計器を作動させる。さらに、ｌｉｔ微鏡検鏡示的場合におい て、２つより小さいＭＤが測定において使用する視野中に同時に存在する確率が 高いモードで計器を作動させる。

２つより小さいＭＤについて測定を行うことに関する利点は、同時に、測定を個 々の生物学的実在物またはそれらの子孫についての測定により解釈することがで きるので、解釈が簡単であることに関する。

多少より概念的に複雑な測定は、複数のＭＤｓがここでＭＤｓの群またはクラス ターと呼ぶ、少なくとも２つのＭＤｓを同時に測定する測定に関する。この開示 のどこかで記載するように、このような測定は、光学的、秤量、沈降、場の流れ の沈降分画、音響、磁気、電気および熱的手段から成る群より選択される物理学 的手段に基づく種々の測定装置を使用してなすことができるが、好ましくは流れ 細胞測定装置、貫流ミクロ蛍光測定装置、光学的粒子分析装置、蛍光Ｓ検鏡測定 装置、光学顕微鏡測定装置、像分析装置およびビデオ記録装置の形態の光学的手 段、または誘電性の測定装置まｔ：は電気的抵抗に基づく粒子分析装置を使用し て実施することができる。微小滴の測定は、このような測定装置において、少な くとも２つのＭＤｓが装置の測定体積内に同時に存在する確率が高いモードで装 置を作動することによってなされる。こうして、流れ細胞測定の例示的場合にお いて、少なくとも２つのＭＤｓが光学的照明領域の焦点体積中に同時に存在する 確率が高いモードで計器を作動させる。さらに、ａ検鏡の例示的場合において、 少なくとも２つのＭＤｓが測定において使用する視野中に同時に存在する確率が 高いモードで計器を作動させる。少なくとも２つのＭＤｓについて測定を行うこ とに関する利点は、同時に、例えば、多数のＭＤｓが占有されない場合において 、ＭＤｓのより大きい測定の処理速度、および一般により大きい測定領域の体積 のために測定装置の技術的！ＪＩ雑さの減少を包含する。

微小滴の最も概念的に簡単な使用は、個々に占有されたＭＤｓを包含する。なぜ なら、個々に占有されたＭＤｓの測定は最初の個々の生物学的実在物に関連する 生物学的物質の測定に容易に関係づけることができるからである。例えば、個々 に占有されたＭＤの測定は、最初の生物学的実在物の増殖の分析および解釈のた めの基準を提供する。

微小滴のより概念的な複雑な使用は、多数の占有をもつ微小滴を包含する。多数 の占有は、種々の理由で、例えば、より多い生物学的実在物を同一数のＭＤｓに ついて測定できること、またはＭＤｓないのより高い濃度で最初ｌこ生物学的実 在物を提供できるという理由で選択することができる。しかしながら、多数に占 をされたＭＤの測定それ自体は、多数のＭＤｓの測定、すなわち、２またはそれ 以上のＭＤｓの群またはクラスターの測定に本質的に等しい。ここで使用すると き、多数のＭＤｓの測定は２またはそれ以上のＭＤｓの測定を行うか、あるいは それらを組み合わせことから成る。例えば、５つのＭＤｓの多数の測定は、５つ のＭＤｓの同時の測定を行うか、あるいは５つのＭＤｓの下位群の測定を行い、 次いで下位群の測定を合計して多数のＭＤの測定を得ることから成る。

測定結果は個々の生物学的実在物により容易には解釈することができないが、な お、多数に占有されたＭＤｓについて測定を行うという利点は、個々に占有され たＭＤｓに比較してより高い速度で、および測定を行うためにより少ない材料お よび時間を必要とすることに関連するより低いコストで、生物学的実在物につい て測定を行うことを包含する。詳しくは、多数に占有されたＭＤｓの測定は、最 初の生物学的実在物の増殖の分析および解釈のための基準を提供し、ここで前記 増殖はＭＤの占有に関連する平均の増殖である。同様に、１つの超反応性の生物 学的実在物またはその子孫による分泌は、他の、分泌に劣る生物学的実在物のり 存在下に測定することができる。例えば、３つの細胞の平均の占有をもつＭＤｓ を測定する場合、測定は細胞中に存在する有意の変動なお反映することができる 。なぜなら、３つの細胞の平均の性質の測定は１つの異常の細胞に有意にｌコ影 響を与えられ、これにより異常の細胞が存在することを決定することができるか らである。測定は２〜約１０３の最初の生物学的実在物を含有する多数に占有さ れたＭＤｓを使用して通常であることがあるが、好ましくは２〜約ｌＯの最初の 生物学的実在物を含有する、多数に占有されたＭＤｓとともに使用される。

例えば、リン酸に従い、平均の占有が３であり、こうして７ｆ　ｗｅ　３、数学 的ポアッソンの確率の式は、下表に与えた、特定の占有値の分布、ｎｌを予測す る。

この例示において、占有されないＭＤｓを有する低い確率（０，０５）、占有さ れたＭＤｓを有する高い確率（０，６５）が存在する。個々のの占有の確率は０ ．１５であるので、多数の占有の確率は０．８０である。

こうして、ＭＤｓの８０％は最初に少なくとも２つの生物学的実在物を含有する 。しかしながら、平均の占有が高いこの例においてさえ、多数に占をされたＭＤ ｓは占有のピークの分布を有し、こうして２または３の最初の生物学的実在物を 有する０、２２４の等しい、最大の確率が存在し、そして４またはそれ以上の最 初の生物学的実在物を有する確率は急速に減少する。結局、７より多い最初の生 物学的実在物を有する確率、／’　（＞７．Ｔ）＋ま であり、これは低く、約０．００６である。この例示の要約において、ｎ−３を もつ多数に占有されたＭＤｓはｎ−２〜７のみが有意の確率を存する、多数に占 有されたＭＤｓを生ずる。

こうして、例えば、比較的巨視的な調製物、例えば、試験管と対照的に、細胞培 養フラスコまたはマイクロタイターウェルは、数千の生物学的実在物、例えば、 細胞とともにしばしば使用され、したがって生物学的実在物１；より合計の集団 への作用が小さく、この例において、単一の生物学的実在物が同−ＭＤ内の７ま たはそれ以下の他の生物学的実在物を有するということが高度に起こり得る。こ の理由で、単一の生物学的実在物の異常な性質、例えば、有意に大きい増殖また は有意に大きい分泌速度は、大きい部分的作用を有し、これにより、最適ではな いが、同一のＭＤ内の他の生物学的実在物の存在下に、測定することができる。

また、多数のＭＤｓ、すなわち、ＭＤｓの群またはクラスターについて測定を直 接実施することができ、ここでＭＤｓの１または２以上は多数に占有されている 。多数の多数に占有されたＭＤｓを測定するこのような方法は、ＭＤｓの群また はクラスターからなるＭＤｓのＭＤ体積の合計と同一の合計体積の１つの大きい ＭＤの測定に等しく、そしてなおより大きい処理測定速度を提供すると同時にＭ Ｄｓの他の利点、例えば、一般に血清型特性拡散時間、ＴＤｓをなお保持すると いう利点を有することができる。

非水性流体により囲まれｔ：＠小滴の操作ＭＤｓへ力を加える手段を準備して、 ＭＤｓを操作する、例えば、ＭＤｓの位置を変化または維持する手段を準備し、 こうして物理学的、化学的および生物学的源からの外部の影響を、測定、インキ ュベーションおよび単離のような目的で、与えることができる。ＭＤｓの位置の 変化または維持を達成する力を加える方法の１つのクラスを区別することは、有 用である。これらの２つのクラスは、非水性流体により囲まれたＭＤＳに依存す る力、およびＭＤのカカップリング実在物、または非水性流体または水性流体に より囲まれたＭＤｓの固有の性質に依存する力である。

ＧＭＤｓであるＭＤｓの場合において、非水性流体中のＧＭＤの形成後、ＧＭＤ ｓを懸濁したままにし、非水性流体により囲まれている間、沈降させるか、ある いはグリッドまたはフィルター上で捕捉させ、こうしてＧＭＤｓはここで水性Ｇ ＭＤの内部の流体およびＧＭＤを取り囲む非水性流体の性質の差を利用する生理 学的相互作用を使用して操作することができる。

あるいは、ＧＭＤｓを水性流体中で作る場合、ＧＭＤｓを非水性流体に移し、こ こでＧＭＤｓを水性ＧＭＤの内部の流体およびＧＭＤを取り囲む非水性流体の性 質の差を利用する生理学的相互作用を使用して操作する。

本発明において、ＭＤｓを非水性流体により取り囲んで、微小滴を取り囲むか、 あるいは懸濁する非水性の環境をつくる。代表的な適当な非水性流体は、液状炭 化水素、鉱油、シリコーン流体、フェロ流体、および重質アルコールを包含する 。本発明は、さらに、非水性流体により囲まれた微小滴を物理学的に操作して、 ＭＤＳ８よび取り囲む非水性流体の性質の差による、■または２以上の物理学的 力を加えることによって、このような微小滴の位置を変化させることを包含する 。

よりとくに、このような力はある群から選択された力を選択することによって加 えることができる。これらの力の大部分は一般に極めてよく知られているが、Ｍ Ｄｓの粒子大ごさに適用されるとき用語任意の圧力はより最近である（参照、例 えば１．Ａｓｈｋｉｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　　３３０；７６９− ７７１．１９８７）。本発明の方法において、電気泳動力、イオントホレシスカ 、界面動電力、峠電力およびクーロン力から成る群より選択される電気力を利用 することは好ましく、これらは実在物を取り囲む媒質の誘電性質と異なる電荷お よび／まグ；は誘電性質をもつ実在物に適用することができる、よく知られてい る力である。

このような電気的力を包含する特定の方法は、次の工程を使用する：（ａ）非水 性流体の環境を準備し、（ｂ）前記非水性流体の環境内に複数の帯電した電極を 準備し、ここで少なくとも２つの電極は反対の極性であり、（ｃ）電気的に帯電 しｌ；微小滴を形成することができる、電気的に帯電した物質を非水性環境中に 注入し、そして（ｄ）少なくとも１つの帯電した微小滴を少なくとも２つの電極 の間の電位の差に関連する電気力により動かす、こうして非水性流体内で微小滴 を生成し、微小滴を非水性流体中に導入し、非水性流体内で微小滴を動かし、そ して微小滴を非水性流体から取り出すすることができる。あるいは、任意の手段 により形成され、そして低い導電性の媒質により囲まれたＭＤｓをＭＤＳと帯電 した電極との接触により帯電させることができる。

こうして、このような力を使用して、ＭＤｓの位置を測定実在物に関して動かす ことができ、測定実在物は、例えば、測定の実在物は、光放射ダイオード、レー ザー、電気コンデンサー、電気インデューサー、電気レジスター、サーミスター 、熱電対、ファイバーオブチクス、７オトダイオード、フォトトランジスター、 フォトセル、圧電センサー、特定のイオン電極、酸素電極、二酸化炭素電極、ｐ Ｈ電極および誘電性質の測定を可能とする電極である。さらに詳しくは、このよ うな物理学的力を利用して、ＭＤｓこのような測定実在物接近させて動かし、Ｍ Ｄｓをこのよ５な測定実在物に接近させて維持し、そしてＭＤｓをこのような測 定実在物から離れる方向に動かすことができる。

ＭＤ　ｓ　ｌＩ：ｌまたは２以上のこのような測定実在物に関して物理学的に操 作することに加えて、本発明の方法において、物理学的力をまた利用して、測定 装置、例えば、光測定計器、光ｌｉ微検鏡蛍光顕微鏡、ルミノメータ−、フルオ ロメーター、７オトメーター、時間分解フルオロメーター、像分析ンステム、測 色計、スペクトロフルオリメーター、粒子カウンター、粒子測定／ステム、光音 響計器、音響吸収計器、音響！！微検鏡誘電スペクトロメーター、電気インピー ダンス測定計器、カロリメーター、熱的性質測定計器および圧電質量負荷計器中 に位置する微小滴を動かすことができる。

同様に、本発明の方法を使用して、ＭＤｓを他のＭＤｓと接触させるか、あるい は接触したＭＤｓを分離することができる。前者はＬＭＤｓの衝突および凝固を 増強するためにとくに有用であり、一方後者は弱く付着するＧＭＤｓの分離にと くに有用である。

同様に、非水性流体により囲まれたＭＤｓへ１または２以上の力を適用する方法 を使用して、微小滴を近接させて動かし、微小滴を近接して維持し、そして微小 滴を離れる方向に動かすことから成る群より選択される微小滴の物理学的操作を 提供り１、こうしてこのようなＭＤｓを物理学的な影響の外部源に暴露するか、 あるいは化学的影響源に暴露する。

非水性流体により囲まれたこのようなＭＤｓは、外部の影響の物理学的源、例え ば、熱、磁場、磁場、電磁輻射、光学的輻射、イオン化輻射、音響輻射および加 速の源に暴露することができる。化学的影響の適当な源は、取り囲む非水性流体 およびこのようなＭＤｓの水性の内部の両者中に溶解することができる化合物を 生成し、解放し、変性または消費するものを包含する。

最後に、このような操作のすべては、微小滴の少なくとも１つが少なくとも１つ の生物学的実在物、例えば、小さい多細胞の有機体、細胞の詳、個々の細胞、深 形質体、小胞体、胞子、オルガネラ、寄生体、ウィルス、核酸分子、抗体分子、 抗原分子、および分子の凝集体を含有する場合においてとくに実用性を有する。

本発明の他の実施態様において、非水性流体により囲まれたＭＤｓを化学的操作 することができる。本発明の実施態様は、ＭＤの内部の流体組成物の化学的操作 すると同時にＭＤｓを非水性流体により取り囲んで維持することに関する。本発 明は、これにより、非水性流体により囲まれたＭＤｓを水溶性の因子および化合 物に暴露し、そして水溶性化学的試薬をこのようなＭＤｓに添加し、これにより ＭＤｓを使用する生物学的および化学的アッセイおよび試験を実施する能力を有 意に拡張することができる。

さらに詳しくは、本発明は水溶性実在物および水不溶性実在物を、介在する非水 性流体を通してＭＤｓ中に供給し、引き続いてそのように供給されｔ：材料の量 を決定する手段を使用する方法から成る。主要なタイプの供給方法は、次の工程 を包含する：（１）　　　（ａ）供給すべき水溶性種、および（ｂ）各ＭＤへ供 給された水溶性材料の量を引き統いて測定することができる、水溶性の任意のイ ンジケータ一種を含有するＬＭＤｓまｔ：はＧＭＤｓの導入、または （２）　アンピフイリック種（水性および非水性の流体の両者に可溶性）を取り 囲む非水性流体中に溶解し、こうして非水性流体内で撹拌および拡散して、非水 性流体中のアンビフイリノク種の本質的に均質な分布を提供し、これは次いでこ のような種の非水性の囲まれｆ：ＭＤｓ中への分配を可能とする。

これらの方法のより完全な開示は、次の節において設けられている。非水性流体 により既に取り囲まれていない場合、まず微小滴を非水性流体からなる環境で取 り囲むことが必要である。

この実施態様の一般的方法は、非水性流体により囲まれたＭＤｓを、取り囲む非 水性流体の組成の変化により、ＭＤｓ内の少なくとも１つの化合物の濃度を変更 することによって、化学的に操作することを包含する。このような化学的操作を 達成する一般的手段は、少なくとも１つの化合物を非水性流体中に溶解し、こう して化学物質がＭＤｓの水性内部中に分配され、これによりＭＤｓの水性内部の 化学的組成を変化させることを包含する。

あるいは、非水性流体の組成をＭＤｓを非水性流体に添加することによって変更 することができ、こうしてＭＤｓは少なくとも１つの水溶性化合物を含有する。

このような化学的操作を達成する一般的手順は、次の工程からなる：（ａ）少な くとも１種の化合物を第１非水性流体中に溶解し、（ｂ）前記第１非水性流体を ＄２非水性流体と接触させ、前記第２非水性流体は少なくとも１つの微小滴を取 り囲み、前記化合物は第１非水性流体、第２非水性流体、および水性媒質中に溶 解することができ、そして（ｃ）前記化合物を第１非水性流体から第２非水性流 体中に、引き続し・で少なくとも１つの微小滴中に分配する。

しばしば、追加の混合工程を使用して、化合物を非水性流体から微小滴中に分配 するｔ：めに必要な時間を短縮することは望ましい。なぜなら、このような混合 は非水性流体中に化合物を溶解しｔ；とき生ずる、大きい濃度勾配を減少または 排除するからである。

非水性流体により囲まれたＭＤｓの化学的操作を達成する他の一般的方法は、非 水性流体中に追加のＭＤｓを供給することを包含し、こうして追加のＭＤｓはも とのＭＤｓへ供給すべき化合物を含有する。このような追加のＭＤｓは、乳濁液 を非水性流体に接触させることによって、乳濁液の形態で提供することができ、 こうして乳濁液の非連続相は本来もとのＭＤｓを取り囲んだものと同一であるか 、あるいは混和性の、非水性流体から溝底される。しばしば、乳濁液および非水 性流体の接触後、乳濁液および非水性流体を混合することによって、この方法を 改良することは望ましし１．。

この方法の他の態様は、乳濁液の非連続相がＬＭＤｓよりむしろ、ＧＭＤｓから 成る、乳濁液の使用を包含する。

ある応用において、化合物の多くがＭＤｓに供給される方法を知ることは不必要 であるが、ある応用、例えば、抗微生物物質の供給において、ＭＤｓの化学的操 作後の化合物の量または濃度を知ることはＩＬ要である。

このような測定の手段を提供するために、化合物と同一手段によりＭＤＳへ供給 される、測定可能な性質をもつ少なくとも１つのトレーサー化合物を準備するこ とは有用であり、こうして次いでＭＤｓをトレーサー　　゛化合物の量について 測定することができる。さらに、測定可能なトレーサーは、また、非水性流体と 接触する乳濁液の非連続相中に供給することができる。なぜなら、これはそのよ うに非水性流体と接触した乳濁液の合計量の測度を提供するからである。全体的 に、このようなトレーサ−の使用は重要であり、少なくとも１つのトレーサー化 合物の量の測定は、ＭＤｓへ供給された少なくとも１つの他の化合物の量の決定 を可能とするとする。

このようなトレーサーを測定するために、トレーサー化合物は、光学的性質、質 量密度の性質、音響性質、磁気性質、電気的性質および熱的性質から成る群より 選択される測定可能な性質もつように選択する。これらのうちで、光学的性質、 例えば、光の散乱、光の吸収まｔ；は測色、蛍光、時間遅延蛍光、リン光および 化学ルミネッセンスををもつトレーサーを利用することは好ましい。とくに有用 な光学的性質は、トレーサー化合物、例えば、フルオレセイン、ローダミン、ク マリン、ルシ７アーイエロー、フイコエリトリンおよびそれらの化学的誘導体を 使用すること番こよって提供することができる、蛍光である。

乳濁液の非連続相とＭＤｓとの間の衝突および接触を増大するために、乳濁液の 非連続相を電気的帯電させることができ、これは、例えば、水性媒質を導電性針 から撹拌した非水性流体中に強制的に供給し、その間大きい電位差を非水性流体 の容器の外側の大きい面積の電極において針の間に維持する二とによって、電気 的帯電したＭＤｓを形成するものと同様または同定の手段を使用する。

本発明の方法を実施するとき、ＭＤｓ内の化学的濃度を変更することは何月であ り、これは、性質、例えば、抗ウィルス活性、酵素阻害活性、抗微生物活性、抗 真菌活性、細胞障害性活性、および化学治療学的活性から成る群より選択される 性質をもつ化合物を併給することによってなされる。さらに、■または２以上の 酵素触媒の反応のための反応成分である化合物を供給することは有用であり、そ して反応成分、例えば、フルオレセイン−ジー・β−Ｄ−ガラク］・ビラノンド 、レゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトピラノ／ド、フルオレセイン・ジアセテート 、カルボキシフルオレセインジアセテート、フルオレセインイソチオシアネート ジアセテート、フルオレセインジガラクトンド、４−メチルウムペリフェロンブ チレート、４−メチルウムベリフェロンホスフニート、ｌ−ナフトールホスフェ ート、２−ナフトールホスフェート、３−μｍメチルーフルオレセインホスフニ ート、ナフトールＡｓホスフェート、ジアセチル２−７−ジクロロフルオレセイ ン、ホモバニリン酸、ホモバニリン酸十ローダミン鉛、ニコチンアミドアデニン ジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびレサズリンを利用することはとくに有用である 。

微小滴のインキュベーション インキュベーションは、生化学的および生物学的反応が起こる機会を有するよう な、時間間隔の条件を提供することから成る。インキュベーションは、生化学的 反応および遺伝子材料の複製、生物学的の合成、生物学的材料の劣化、代謝、分 泌、吸収、配位子の結合、抗体−抗原反応において起こるような特異的結合に基 づく凝集、分子複合体および凝集体の形成および／または増殖からなる反応、お よびウィルス、細胞および小さい多細胞の実在物の増殖からなる複合反応基こ関 する方法を包含する。こうして、インキュベーションの間、生物学的実在物は大 きさおよび／または数を増加し、そしてまた生化学的活性を示す機会を有する。

さらに、性質、例えば、抗ウィルス活性、酵素阻害活性、抗微生物活性、抗真菌 活性、細胞障害性活性、および化学治療学的活性を示す１まｊ；は２以上の化合 物の化学的濃度を変更することによって、このような化合物は生物学的実在物に 影響を与えることができる。

用語生物学的実在物は、液体の微小滴８よび／またはゲルの微小滴中に組み込む ことができる小さい生物学的構造体を呼び、そして小さい多細胞の有機体、細胞 の群、個々の細胞、原形質体、小胞体、胞子、オルガ不う、寄生体、つ１ルス、 核酸分子、抗体分子、抗原分子、および分子の凝集体を包含する。小さい有機体 は、受精卵、プラストマー、胚、小さい線虫および小さい寄生虫を包含し、これ らはＧＭＤｓ中に組み込むことができる大きさである。細胞の群はコロニー形成 単位、すなわち、ＣＦＵｓ、自然に凝集する細胞、およびまた１または２以上の インキュベーション後に細胞の増殖から生ずるマイクロコロニーを包含する。問 題の一般的型は、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、バクテリア細胞、酵母菌細胞 、真菌細胞およびかび細胞を包含する。オルガ不うは、ミトコンドリア、タロロ プアスト、リポソームおよびリソソームを包含する。

原形質体は、細胞壁をもつ細胞から、酵素的消化および他の壁除去方法によるか 、あるいは細胞壁の合成を欠く突然変異体により、作られたものを包含する。ウ ィルスは、単純ヘルペスウィルス、サイトメガロウィルス、ニブタインパールウ ィルス、アデニウイルス、インフルエンザＡまたはＢウィルス、パーインフルエ ンザ１，２または３ウイルス、流行性耳下腺炎ウィルス、コロナウィルス、ポリ オウィルス、コクサラキーＡおよびＢウィルス、エコーウィルス、ライノウィル スおよび肝炎ＡおよびＢウィルス、およびヒトの免疫欠損ウィルスまたはＨＩＶ を包含する。核酸はＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。抗体分子は動物、例えば、 ヒト、マウス、う／ト、ヤギ、イヌ、ブタおよびサルから得られたＩｇＡ、Ｉｇ ＧおよびＴｇＭを包含する。抗原分子は、多数の明確なエピトープおよび／また はオーバーラッピングするエビトーバウをもつ大きい抗原分子、および小さい分 子、例えば、ハプテンを包含する。分子の凝集体は、免疫沈澱物、ｌまたは２以 上の抗体に結合した抗原、血液をもつかまたはもたない、ハイブリダイゼ−７・ ヨンした核酸および２またはそれ以上の分子の非共有結合の複合体を包含する。

微小滴とともの生物学的実在物の使用の例の多くは細胞により記載したが、とく に細胞、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、バクテリア細胞、酵母菌細胞 、真菌細胞およびかび細胞を意図する。さらに、ここで使用するとき、生物学的 実在物は、また、■または２以上の標識分子、染料まＩ：は１または２以上の介 在分子と反応した前述のものを呼ぶ。

ＧＭＤｓ中の結合部位において分子の捕捉本発明は、ＧＭＤｓ内に１または２以 上の設けられた結合部位を含有するＧＭＤｓに関する。このようなＧＭＤｓを使 用してＧＭＤｓ内に設けられた結合部位を二分子を捕捉する。このようなＧＭＤ ｓ８よび方法はこのようなＧＭＤｓを使用して実施し、重要な測定、操作および 単離を実施することができる。分子を捕捉方法は、次の工程から成る：　（ａ） 特異的部位８．！：び生物学的実在物をＧ　Ｍ　Ｄ　ｓ中に組み込み、（ｂ）Ｇ ＭＤｓ中の生物学的実在物から解放された分子を拡散、対流まｔ；はＧＭＤＳ内 のド１ｊフトにより動かすようにさせ、こうしである分子は結合部位に直面し、 そしてこのような部位に結合し、これによりＧＭＤｓ内の結合部位において生物 学的実在物から解放された分子を捕捉する。

次いで、この方法によりＧＭＤｓ内に捕捉された分子は測定して、ＧＭＤｓ内に 含有された生物学的実在物の性質または挙動を決定する。捕捉された分子を測定 する何月な手段は、光学的、秤量、沈降、場の流れの沈降分画、音響、磁気、電 気および熱的手段から成る群より選択される物理学的手段を包含する。光学的測 定、例えば、光の散乱、光の吸収または測色、蛍光、時間遅延蛍光、リン光およ び化学ルミ不７Ｉセンスを使用することは好ましい。

捕捉された分子が１または２以上の測定可能な光学的性質を有する場合、捕捉さ れた分子はそれに関連する自然に発生する光学的ングナル、例えば、光の散乱、 光の吸収または測色、蛍光、時間遅延蛍光、リン光および化学ルミ不７センスを 測定することによって測定することができる。

本発明の実施において、しばしば、１または２以上のインキュベーションを提供 して、生物学的実在物からの分子の産生および／または解放を実施する異なる条 件を可能とすることは有用である。例えば、■または２以上のインキュベーショ ンを実施して、非増殖細胞からの分泌により解放された分子を結合部位に十分な 数で蓄積させて、捕捉された分子の測定をより容易に達成する。同様に、しばし ば、生物学的実在物、とくに細胞のための増殖条件を提供する１または２以上の インキュベーションを設けて、細胞の太ささおよび／または数を増加し、こうし てＧＭＤ内の生物学的実在物のＧＭＤ内で分子を産生および分泌する能力を増加 し、これによりこのようなＧＭＤｓ内の結合部位において分子を捕捉する。

ゲルの微小滴は、また、捕捉された分子の測定の基準で物理学的に単離し、次い で、必要に応じて、生物学的実在物を単離されたＧＭＤｓから、Ｇ　Ｍ　Ｄ　ｓ の溶解、ＧＭＤｓの機械的崩壊および生物学的実在物の増殖により分泌させ、こ うして単離されたＧＭＤｓ内に含有された生物学的実在物を捕捉された分子の測 定に基づいて物理学的に単離する。物理学的単離の例は、懸濁液からのＧＭＤｓ の取り出しおよび他の懸濁液中のＧＭＤｓの配置、流れ細胞測定／細胞分類器を 使用するＧＭＤｓの分類、顕微鏡検査によるＧＭＤｓの同定およびＧＭＤｓを除 去するためのマイクロ操作の利用、および光学的圧力を使用する既知の位置への ＧＭＤｓの移動を包含する。ＧＭＤｓの物理学的単離後、ＧＭＤｓ内に含有され た生物学的実在物をＧＭＤｓから、ゲルのマトリックスの溶解、ゲルのマトリ７ クスの機械的崩壊および少なくとも１つの生物学的実在物によりゲルのマトリッ クスからの増殖のような方法により解放することができる。

本発明のある使用において、捕捉され！二分子の測定を省略し、その代わりに、 ｌまたは２以上の捕捉された分子と相互作用する力を使用して、ＧＭＤｓを物理 学的に単離し、これによりその中に含有される生物学的実在物を単離する。次い で、ＧＭＤｓ内に含有された生物学的実在物をＧＭＤｓから、ゲルのマトリック スの溶解、ゲルのマトリ・ンクスのＩｆｆ的崩壊および生物学的実在物によりゲ ルのマトリ・ンクスからの増殖のような方法により解放することができ、こうし て単離されたＧＭＤｓ内Ｃ；含有された生物学的実在物を捕捉された分子と相互 作用する物理学的力に基づいて物理学的に単離する。

捕捉された分子を測定する場合、捕捉された分子は満足すべき測定を可能とする 性質を有する必要はない。この場合において、しばしＩｆ、ＧＭＤｓを測定可能 な性質をもちそしてまたそれに結合することができる１または２以上の標識分子 に暴露し、これにより捕捉された分子を標識することからなる、引き続く工程を 設けることができる。ｌまｊ：は２以上の標識分子への暴露後、標識分子を次い で物理学的または化学的手段を使用して測定する。標識分子の例は、抗体、抗原 、核酸、レクチン、レセプター、酵素阻害因子、およびプロティンＡを包含し、 すべては測定可能な標識をもつ。

本発明の実施において、光学的測定を使用して、捕捉された分子ｌこ結合した標 識分子を測定することが好ましく、この光学的測定は標識をもつ標識分子の測定 を包含し、この標識は光の散乱、光の吸収また：ま測色、ことができる。標識の 例は、抗体、抗原、核酸、レクチン、レセプター、酵素阻害因子、およびプロテ ィンＡを包含し、すべては測定可能な標識をもつ。

ＧＭＤＳ％およびＧＭＤｓ内に含有された生物学的実在物の物理学的単離は、物 理学的力とカップリングすることができる標識を有する標識分子を使用すること によって達成することができ、こうして標識分子への暴露後、標識した捕捉され ｔ二分子をもつＧＭＤｓを少なくとも１つの物理学的力により操作して、このよ うなＧＭＤｓを物理学的に単離する。

この実施態様において、磁性標識を準備しそして使用することは好ましい。

しばしば、捕捉された分子を含有するＧＭＤｓをｌまたは２以上の介在分子に、 ＧＭＤｓの標識分子への暴露の前にあるいはそれと同時に、暴露することは望ま しい。これは、次の工程により達成される：　（ａ）少なくとも１つの介在する 分子の型を供給し、そして（ｂ）標識分子を供給し、こうして介在する分子が捕 捉された分子に結合し、そして標識分子が介在する分子に結合するようにする。

介在分子の例は、抗体、抗原、核酸、レクチン、プロティンＡおよびアビジンを 包含する。介在分子として使用するために、標識分子として標識した抗体を得る ために使用しｊ；ものと異なる動物種から得られた、非標識抗体を使用すること は好ましい。例えば、捕捉された分子に対するマウス抗体を介在分子として使用 し、そして蛍光標識しＩ：ヤギ抗マウス抗体を介在分子のｔ：めの標識分子とし て使用することができ、こうしてこの介在分子への第１！露、および標識分子へ の第２または同時の暴露は、捕捉された分子を測定する能力を生ずる。

必要に応じて、介在分子は、また、■または２以上の標識を有することができ、 こうして介在分子および標識分子の両者の結合は捕捉された分子に関連する標識 の量を増加し、これにより捕捉された分子の測定を増強する。

細胞、胞子、原形質体、小胞体および小さい多細胞の有機体を包含する生物学的 実在物を使用して本発明を実施することは有用であり、そして小さい多細胞の有 機体および細胞、例えば、動物細胞、植物細胞、１虫細胞、バクテリア細胞、酵 母菌細胞、真菌細胞およびかび細胞を使用することは好ましい。

生物学的実在物が問題の分子を分泌しないかか、あるいは所望の速度より低い速 度で分子を分泌する場合において、ｌまたは２以上の外部の刺激により生物学的 実在物が細胞を解放するようにさせることは有用である。細胞、胞子、原形質体 、小胞体および小さい多細胞の有機体を刺激する一般的方法は、エレクトロポレ イションを生ずる電磁刺激の適用を包含する（参照、例えば１、Ｓｏｗｅｒｓお よびＬｉｅｂｅｒ、ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ、２０５　：１７９−１８４． １９８６）。

生物学的増殖の決定 ＧＭＤｓの先行技術の使用は、非常に小さい体積の細胞が占有したＧＭＤ内に含 有されたｌまたは２以上の生物学的実在物の、細胞の活性、よりとくに代謝活性 の決定に基づいた。このような活性の一般的特徴は、被膜の形態で、あるいはＧ ＭＤｓを鉱油中に懸濁することによって、透過性バリヤーをＧＭＤｓに形成する こと部位（参照、例えば、Ｗｅａｖｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、４３４：３６３−３７２．１９８４；Ｗｅａｖｅｒ、Ｂｉｏ ｔｅｃｈ、ａｎｄ　　Ｂｉｏｅｎｇｒ、Ｓｙｍｐ、ｌ’７，１８５−１９５．１ ９８６；Ｗｉｌｌｉａｍｓ　　　ｅｔ　　　ａｌ、、Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、５０１：３５０−３５３．１９８７）、ＧＭＤｓを使用する活性に基 づく決定は、非常に小さい体積のＧＭＤｓ内の細胞産生物の細胞外蓄積、および 非常に小さい体積の内の細胞外の環境の変化と化学的インジケーターまｊ；は化 学的ア・／セイとの組み合わせに基づく。この決定は、細胞外の環境中に解放さ れ、モしてＧＭＤの非常に小さい体積内に保持される、細胞産生物についての産 生速度の時間的積分に基本的にに基づく。ＧＭＤＳの産生に関するそれ以上の詳 細は、米国特許第４，３９９，２１９号、米国特許第４．４０１，７５５号およ び米国特許第４．６４３．９６８号、Ｗｅａｖｅｒ、に記載されており、それら の開示をここに引用によって加える。

ＧＭＤｓのこのような先行技術の使用において、細胞の増殖それ自体は決定され なかったが、その代わり、細胞の活性の蓄積された効果は、両者は活性／細胞お よび細胞の数のためであり、決定の基準である。こうして、例えば、透過性バリ ヤーをもつＧＭＤ内の細胞産生物の増加は、１つの高度に活性な細胞、例えば、 単一の酵母菌細胞の存在のためにであるか、あるいは急速に増殖していくつかの 細胞のマイクロコロニーを形成する最初のバクテリアののためであり、このマイ クロコロニーは個々のバクテリアの数倍の活性を有する。第」の例において、増 殖しない、単一の酵母菌細胞は、決定の基準であるが、第２例において、決定は 主として細胞の生物学的物質の増加、および、増殖による、対応する活性の増加 のためである。この例示により実証されるように、異なる細胞の型について、活 性による細胞外の化学的濃度の同一変化は、増殖の存在または不存在で、相対的 側々の細胞の活性および相対的増殖速度に依存して起こることができるので、こ の理由で、ＧＭＤｓの先行技術の使用は細胞の増殖を決定するための一般的手段 を提供しなかった。さらに、ＧＭＤｓの先行技術の使用の有意の利点は、細胞の 増殖が必ずしも決定の基準ではないことであり、一般に活性のタイプを知らなく てならない。

例えば、多数の微生物は有意の量の酸を産生し、透過性バリヤーをもつＧＭＤの 非常に小さい体積内の細胞外のｐＨの変化に基づ＜ＧＭＤの決定を可能とし、有 意の酸の産生は細胞の万能の性質ではない。この理由で、ＧＭＤｓの先行技術の 使用は細胞が示す生物学的活性のタイプの知識を必要とし、これに対して、対照 的に、本発明は非常にいっそう一般的である。

上の理由で、他の前の方法および代謝産生物に基づいて細胞を検出するＧＭＤｓ の先行技術の使用は、実際に、細胞の増殖の急速な決定、生物学的実在物が生物 学的物質および／または数を増加させる基本的方法を提供しない。対照的に、本 発明は生物学的実在物の増殖の決定の一般的手段を提供し、ここでＭＤｓ、好ま しくは水性流体または媒質により囲まれたＧＭＤｓ内の最初のおよび子孫の生物 学的実在物の取り込みは、ＭＤｓ内の生物学的物質の測定と組み合わせ、そして 、これは、ＭＤｓの大きさが非常に小さいために、インキュベーンヨン条件およ び分析条件をＭＤｓ内の小さい拡散時間のために、急速に変化させることができ る。ＧＭＤｓであるＭＤｓの場合において、本発明は、また、ゲルのマトリック ス内の小さい光学的通路の長さで光学的測定の実施を可能とする。これはゲルの マトリックス中の光の散乱、光の吸収または自己蛍光に関連する光学的測定の誤 差を減少する。

自然に凝集しそして互いに小さい数で付着する細胞の場合において、本発明はコ ロニー形成単位（ＣＦＵｓ）の増殖を決定する。

本発明の一般的実蒐において、ＭＤｓは前述の任意の手段により形成し、こうし て生物学的実在物、例えば、小さい多細胞の有機体、細胞の群、個々の細胞、原 形質体、小胞体、胞子、オルガネラ、寄生体、ウィルス、核酸分子、抗体分子、 抗原分子、および分子の凝集体をＭＤｓ中に組み込む。生ずるＭＤｓは生物学的 実在物を含有し、こうして異なる大きさのＭＤｓはほとんど占有されない、個々 に占有されるまたは多数に占有される高い確率を有する。次いで、生物学的物質 の測定は、個々にまたは小さい群でＭＤｓの測定することによって達成され、こ うして生物学的物質に対する応答性の測定を行う。生物学的材料は、生物学的実 在物、例えば、小さい多細胞の有機体、細胞の群、個々の細胞、原形質体、小胞 体、胞子、オルガ不う、寄生体、ウィルス、核酸分子、抗体分子、抗原分子、お よび分子の凝集体中に見いだされる構成分子および構造体から成る。こうして、 生物学的物質の例は、タンパク質、核酸、リン脂質、多糖類、酵素、抗体、細胞 レセプターおよび他のよく知られている生物学的分子を包含する。

生物学的物質の測定は、光学的、秤量、沈降、場の流れの沈降分画、音響、磁気 、電気および熱的手段から成る群より選択される物理学的手段に基づく測定によ り達成することができる。このような測定は、光学的性質、質量密度の性質、音 響性質、磁気性質、電気的性質および熱的性質に基づくことができる。光学的測 定、例えば、光の散乱、光の吸収または測色、蛍光、時間遅延蛍光、リン光およ び化学ルミネッセンスに基づく測定を利用することは好ましい。こうして、有用 な測定装置はは、流れ細胞測定装置、貫流ミクロ蛍光測定装置、光学的粒子分析 装置、蛍先願検鏡測定装置、光学顕微鏡測定装置、像分析装置およびビデオ記録 装置を包含する。

ある場合において、生物学的実在物の生物学的物質の自然に発生する光学的性質 を使用して、生物学的物質測定することができる。なぜなら、これは自然に発生 する光学的シグナルを提供するからである。自然に発生するシグナルの例は、光 の散乱、光の吸収または測色、蛍光、時間遅延蛍光、リン光および化学ルミネッ センスである。しかしながら、ＧＭＤｓ中の生物学的物質の測定を増強するため に、しばしば、染料のプロ１−コルを使用することは有用であり、このプロトコ ルは染料、例えば、生物学的組成を示す染料、酵素活性を示す染料、および細胞 膜の完全性を示す染料を利用すう。さらに詳しくは、蛍光の染料、光の吸収の染 料および光の散乱の染料の一般的カテゴリーＩこおい−Ｃ染料、および染料、例 えば、核酸の染料、タンパク質の染料、脂質の染料、細胞膜の染料、細胞壁の染 料、酵素活性に対して応答性の染料、トランスメ〉ブレンのポテン／ヤルＣ二対 して応答性の染料および細胞表面のレセプターの染料を使用することはしはしは 望ましい。なお他の有用なタイプの染料は、トランスメンブレンのボテン／ヤル 染料、膜排除染料および細胞内酵素活性応答性染料を包含する。

一般に、蛍光染料、例えは、ヨウ化プロピ／゛ウム、臭化エチジウム、ＦＩＴＣ （フルオレセインイソチオ／アネート）、フルオレセインジアセテ−１−、カル ホキ／フルオレセインジアセテートおよびＦＩＴＣ】アセテートを使用すること は好ましい。生物学的物質のための多数の他の適当な蛍光性染料はよく知られて いる（参照、例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　　ｏｆ　　Ｆｌｕ ｏｒｅｓｃｅｎｔ　　Ｐｒｏｂｅｓａｒｉｄ　　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　　Ｃｈ ｅｍｉ　Ｃａ１ｓ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｐｒｏｂｅｓ、ジャンクンヨンン ティー）。

本発明の一般的実施において、個々のまたは単一のＭＤｓの測定を主としてを包 含するＭＤｓの測定を行うことは好ましい。しかしながら、測定は、また、２ま ｔ；はそれ以上のＭＤｓの群について同時に行うことができる。同様に、インキ ュベーション前に２つ以下の生物学的実在物を含有する高い確率をもつ微小滴か ら主として成るＭＤｓについて測定を行うことは好ましいが、測定は、また、イ ンキュベーション前に少なくとも２つの生物学的実在物を含有する高い確率をも つ微小滴から主として成る微小滴の標本について行うことができる。

個々のＧＭＤｓまたはｇＧＭＤｓの群の体積の測定を必要としないで、ＧＭＤｓ 中の生物学的物質の量を測定することは有用であるが、しばしば、このようなＧ ＭＤの体積を測定ことは有用である。このデータを使用して、生物学的物質の測 定の分析または解釈のための基準を提供することができる。例えば、このような Ｇ　ｒｖｉ　Ｄの測定は測定したＧＭＤｓ中に含有された試料の体積の決定の基 準を提供する。なぜなら、測定したＧＭＤの体積を合計して、必要に応じて希釈 について補正して、分析し！二合計の体積を生ずることができるからである。

さらに、ＭＤの体積またはＭＤｓの群の体積を、統計学的式で分析することはし ばしば有用であり、この式はＭＤへのＭＤｓの占有およびＭＤｓの形成に使用し た懸濁液または溶液の平均の濃度と関係する。さらに詳しくは、ＭＤｓおよび生 物学的物質の量の測定を分析することは、しばしば、有用であり、こうして生物 学的物質の測定は、占有されているｊ；めの基準を提供する。次いで、ポアッソ ン統計学の式および修正しｌ；ポア・ｌソン統計学の式を使用することによって 、ＭＤｓおよび測定をさらに分析することは有用である。

対照分析を望む場合、ＭＤｓの１または２以上の標本をインキュベーションなし に測定する。次いで、他のＭＤｓを増殖の決定を行う条件下に！ゴし、そして１ つよＩ：は複数のインキュベーンヨン期間の間インキュベーションし、次いでＭ Ｄｓのあるものまたはすべてを、個々にまたは多数で、個々のＭＤｓまたはＭＤ ｓの群の中に存在する生物学的物質の量について測定する。このようなＭＤの測 定の結果は、対照またはインキュベーションの期間の間、生物学的物質の変化の 量として解釈し、そして生物学的物質のこのような変化はインキュベーンヨン期 間の間に起こった増殖の量に起因する。

生物学的物質の量の変化のこのような測定後、ｌまｔ：は２以上の力を加え、こ うして生物学的物質の量が最初に変化した生物学的物質を含有するＭＤｓを、生 物学的物質の量が最初に変化した生物学的実在物を含有しないＭＤｓから単離す る。

本発明の好ましい実施態様において、広い範囲の大きさをもつＭ　Ｄ　ｓを作り 、こうして大きさのある範囲はゼロまたは１つの最初の生物学的実在物を含有す る高い確率を有する。ＭＤｓの１つの下位集団をインキコベーショ〉なしに測定 して対照を提供し、モしてＭＤｓの１または２以上の他の下位集団を所望の条件 丁番こインキュベーションし、次いで各ＭＤ中の生物学的物質の相対的量につい て個々に測定する。

各ＭＤの体積、■１．、が知られているか、あるいは測定される場合を別々に考 慮することは有用であり、そして、また、試料が生物学的実在物をほぼ既知の濃 度、戸１、で含有することが知られいるので、試料を濃縮または希釈後、そして ゲル化可能な材料の添加後、生ずる濃度、Ｐｌを知り、そしてＭＤｓの調製に使 用しｔ；懸濁液である。

本発明の好ましい実施態様は、ＧＭＤｓであるＭＤｓの形成、次いで水性または 非水性の媒質中のこれらのＧＭＤｓの懸濁を包含する。これらのＧ　Ｍ　Ｄ’　 ｓの１または２以上のインキュベーション後、２またはそれ以上の生物学的実在 物のマイクロコロニーへの個々の生物学的実在物が増殖は起こるすることができ る。ＧＭＤｓが非水性流体により囲まれる場合において、ＧＭＤｓを非水性流体 から水性流体中に移す。次いで、生物学的実在物の生物学的物質の染料手順を使 用してｌまたは２以上の光学的測定の基準を形成し、こうして光学的シグナルの 大きさは各測定したＧＭＤ中に存在するゲルの微小滴の決定を提供する。

一般的本発明の代表的な場合において、ここでＭＤｓは水性媒質中に懸濁された ＧＭＤｓであり、生物学的実在物は、細胞、例えば、動物細胞、植物細胞、１虫 細胞、バクテリア細胞、酵母菌細胞、真菌細胞およびかび細胞である。蛍光性染 料を使用して核酸を染色し、色素に関連する蛍光をＧＭＤｓ、好ましくは個々の ＧＭＤｓ中で測定し、蛍光シグナルのある大きさの発生の頻度（ｆ　ｒｅｑｕｅ ｎｃｙ−ｏｆ−ｏｃｃｕｒｅｎｃｅ）を蛍光シグナルの大きさの関数として表示 する。このタイプのプロットは、一般に、ヒストグラムと呼ぶ。このような分析 が示すように、増殖する細胞をもつインキュベーションしたＧＭＤｓは、より大 きい大きさの蛍光において起こる蛍光ピークをもつヒストグラムを生成する。し ばしば、発生の頻度を対数蛍光に対してプロットすることは便利である。なぜな ら、対数期において増殖する細胞は、時間の関数として、平均の対数蛍光の直線 または比例の増加を示すからである。このようなプロットは一般ｔこピークを示 し、よりより長い時間の間インキュベーションしたＧＭＤｓについて、大きい平 均の蛍光は増加することが発見された。このようなピークの面積は、細胞の平均 の増殖の測度を提供し、これにより平均の増殖速度を提供する。このようなＧＭ Ｄに基づく平均の増殖速度の決定は、従来の、合計集団の方法に比較して優れる 。

本発明は、また、増殖速度の変動の測度まｔ；は増殖速度の検出可能を提供し、 これは蛍光のピーク内の蛍光の変動において反映され、蛍光測定装置それ自体に おいて変動または計器の誤差より大きく、そして従来の方法により決定されない 。

本発明は、また、生物学的実在物の増殖における遅滞時間の決定に使用すること ができる。遅滞時間は変化した条件への暴露後に対数増殖速度を達成するときの 遅延である。このような決定は、特定の変化［−だ条件下１こインキュベーショ ンしたＧＭＤｓ中の生物学的物質の量の変化の大きさを、対照条件下にインキュ ベーションした他のＧＭＤｓ中の生物学的物質の量の変化と比較することによっ てなされる。このような遅滞時間は、この開示のどこかに記載した増殖速度の決 定を利用する。

さらに、ある場合において、このような分析はほぼ最初のまｔ：は非インキュベ ー／Ｍンのピークの位置において蛍光のピークを明らかにし、そのピークの面積 は使用したインキュベーション期間についての非増殖細胞の測度を提供する。こ のような条件が細胞のタイプの増殖を通常支持する条件に相当する場合、増殖す る細胞をもつＧＭＤｓの数対増殖するおよび増殖しない両者の細胞の比はこれら の条件についてのＧＭＤｓにおけるクローニングまＩ；は平板培養の効率として 解釈することができる。多数の細胞の組み合わせられた作用に基づ〈従来の急速 な増殖の測定は、増殖しない細胞の直接の決定を提供しないが、その代わり、増 殖するおよび増殖しない細胞の組み合わせられた作用に基づく決定をはじめて提 供することができ、そして増殖する細胞および増殖しない細胞の相対的数は以前 には知られていなかった。

合計の数の１または２以上の生物学的物質から成る生物学的物質の測定に加えて 、しばしば、化合物を添加して、反応、例えば、適当な生物学的物質の劣化反応 および染料可能な生物学的物質のプロ７キング反応を利用し、こうして測定の増 強を達成することは有用である。例えば、合計染料可能な核酸を測定して増殖を 測定することが有用であり、水性媒質中のＧＭＤｓの場合において、複製するＤ ＮＡを含有する生物学的実在物について、ＲＮＡの劣化のプロセス、例えば、Ｒ ＮＡアーゼへのＧＭＤｓの暴露を提供することができ、ＲＮＡアーゼはＲＮＡを 劣化すると同時にＤＮＡを残し、こうして核酸染料への引き続く暴露はＧＭＤＳ 中のＤＮＡの測定を可能とする。次いで、このようなりＮＡの測定は生物学的実 在物の複製の決定のだめの基準を提供する。

本発明の方法は、最初にゼロま！：は１つの生物学的実在物の高い確率を有した ＭＤｓ内の生物学的物質の測定に基づく、生物学的実在物の増殖の決定を提供す ることができる。この生物学的実在物の増殖の決定の方法は、急速であり、しば しば約１の平均の世代または倍化時間を必要とする。しかしながら、この方法は 、また、有利により多くの世代または倍化時間を使用して実施して、可能な不安 定な細胞の増殖を停止しおよび／または感受性が低いおよび低い経費の光学的測 定装置を利用することができる。

占有されないかまｊ；は個々に占有されｊ；、ある大きさまたは体積の範囲、■ 、、７、のいくつかのＭＤｓの高い確率が存在する、好ましい実施態様を記載し たが、多数の占有の中程度または高い確率が存在する、生物学的実在物の懸濁液 の濃度、Ｐｌに関して、ある大きさの範囲のＭＤｓを使用する増殖の測定行うこ とができる。この場合において、個々のＭＤｓからの光学的シグナルの測定は各 ＭＤ内の合計の生物学的物質に関係し、したがって平均の増殖の決定に相当し、 ここで平均は各ＭＤの大きさについて最初に存在する生物学的実在物の小さい数 を纏える。例えば、ＭＤの形成直前の生物学的実在物の濃度、ｐｌが大きさＶ６ ４のＭＤｓ中のｎ＝３生物学的実在物を生ずる場合、平均の増殖の決定は３生物 学的実在物Ｉこ相当すＬＵ平均の増殖の挙動に相当する高い確率を有し、そして 多数の、典型的にはｌＯ−′以上の生物学的実在物の組み合わせられた作用に基 づ〈従来の方法により決定する二とができない、増殖の不均質または変動のある 面を明らかにすることができる。

あるいは、関係する実施態様において、ゼロまｔ：は１の生物学的実在物Ｉこよ る最初の占有の高い確率をもつＭＤｓは個々よりむしろ小さし１群で測定するこ とができる。これは、例えば、水性媒質中に懸濁したＧＭＤｓの流れ細胞測定の 測定において、有利であり、ここで測定の条件はいくつかのＧＭＤｓを光学的に 測定した領域に変移を存在させることができ、これによりＧＭＤの分析の速度を より高くすることかできる。同様に、これは、非水性流体中に懸濁するか、ある いは非水性流体により囲まれたジメチルスルホキッド顕微鏡検査を使用する測定 におし＼で有利であることがあり、ここで測定条件はいくつかのＭＤｓを測定視 野中に存在させることができ、これによりより高い速度のＭＤの分析を可能とす る。この実施態様において、２またはそれ以上のインキュペーンヨン期間の間イ ンキュベーションしたＭＤｓの群についての測定を比較し、そしてＭＤｓの群か らの光学的シグナルの差ＭＤｓの群内の生物学的実在物の物質の差から生ずると して解釈される。これらの差はＭＤｓの群内の生物学的実在物の増殖から発生す ると解釈される。例えば、インキュベーションしｆ：ＭＤｓの群についての測定 をインキュベーションしないＭＤｓの群についての測定と比較し、こうしてイン キュベージ３ンしたＭＤｓの群およびインキュベーションしないＭＤｓの群から の光学的ングナルの差は生物学的実在物の物質の差から生ずるとして解釈される 。

これらの差はインキュベーション期間の間の生物学的実在物の増殖から生ずると してさらに解釈される。この実施態様は前の実施態様に関係付けられ、いくつか の最初の生物学的実在物に相当する生物学的物質の光学的シグナルは測定の基準 を形成し、シｊ；がって平均の増殖の決定を提供する。なぜなら、いくつかの生 物学的実在物の平均の増殖の挙動に相当する高い確率を有するからである。こう して、この方法は増殖の異質性または変動性のある面を明らかにことができ、こ れらは多数の、典型的には１Ｏ−１以上の生物学的実在物の組み合わせられた作 用に基づ〈従来の方法により決定することができない。

本発明において、形成後、ＭＤｓを増殖を決定する所望の条件に配置する。典型 的には、ＭＤｓを水性または非水性の媒質中に懸濁させ、これは広い範囲の異な る化学的組成、および異なるｐＨ１温度、酸素および二酸化炭素の分圧などを提 供する。これにより、広い範囲の条件下に生物学的増殖を決定することができる 。懸濁の代わりに、ＭＤ、ｓを加えた力、例えば、重力まｔ：は遠心力の影響下 に沈降させることによって静止して保持することができる。ＧＭＤｓの場合にお いて、ＧＭＤｓを多孔質メノン二またはフィルターに対して還流により一時的に 捕捉することができ、この流れは捕捉されたＧＭＤｓを過ぎて増殖培地を供給す る。

ＭＤｓ内の化学物質の移送は、一般に、拡散により支配される。こうして、非水 性流体により囲まれたＭＤｓの場合において、ＭＤｓ内の生物学的実在物の化学 物質の供給および除去は非水性流体およびＭＤｓの内部の水性流体の間の化学物 質の分配により支配され、そしてさらにＭＤｓ内の拡散により支配される。ＭＤ ｓの比較的小さい大きさのために、特性拡散時間、■□＋＋＋−＋＋＋＋””２ ／　Ｄは短く、Ｘは拡散の移送が起こる特性距離であり、そしてｒ　ＩＪＤ　” 　Ｘ　ｏこれは１０００μ〜０．２μの直径をもつＭＤＳについて約４分〜約５ ＸＩＯ−’ｓｅｃのＴｄｉｌ＋＋＋ｔ＋＋を生じ、そしてＤ二ｌ　Ｏ−’ｃｍ２ ｓｅｃの小さい分子について５００μ〜５μの直径をもつＭＤｓについて約１分 〜約６Ｘ　ｌ　０−３ｓ　ｅ　ｃのＦ、ｌ＋＋＋、＋＋を生ずる。この値は、〜 １Ｄを取り囲む非水性流体とＭＤの内部の水性流体との間に容易に分配および拡 散され得る大きさの分子のほぼ代表である。

結局、非水性流体内の分配および移送の運動力学が制限されない場合、特性拡散 時間、■４、は変化を支配し、そして灯くあることができる。こうして、あるタ イプの分子、とくに非水性流体および水性の内部の媒質の両者中の宵意の溶解度 をもつものはこのようなＭＤｓ中の急速に変化することができる。

同様に、水性媒質により囲まれたＧＭＤｓ内の生物学的実在物への化学物質の供 給むよび除去は拡散により、モしてＧＭＤｓ取り囲む外部の水性媒質とＧＭＤｓ 内の水性媒質との間の分配により、主として支配される。なぜなら、ゲルのマト リ／クズは効果的に粘性流れをクランプする、すなわち、粘性流れに対する抵抗 性を増加するからである。外部の水性媒質とＧＭＤ内部の媒質との間の分配は、 しばしば、非選択的である。なぜなら、Ｇ　Ｍ　Ｄ　Ｓを形成するｔ；めに使用 する多数のゲルは、殆どの問題の化学物質を絶対的または部分的に排除しないか らである。しかしながら、ある場合において、ゲル材料は電荷まｌ；は大きさ排 障の性質を宵して、ＧＭＤｓの内部からある分子を絶対的または部分的に排除す ることができる。

さらに、従来の、より巨視的なゲルの調製物と比較してＧＭＤｓの大きさは比較 的に小ざいのために、特性拡散時間、’Ｆ＋ｌＩｍ＋＋。、＞：２／Ｄ、ここで Ｘは特性寸法、例えば、巨視的ゲルのスラブの厚さであり、モしてＤはゲル内の 水性液体内の拡散定数である、は、従来のゲル調製物についてより短い〜非常に 短い範囲であることができる。使用する生物学的実在物のタイプ、および問題の 化学物質に依存して、τｄ＋１１＋＋＋＋＋は広い範囲の値であり、これはｒ。

ｕｒｌ−ｘを使用することによって見ることができ、これは１０００μ〜０．２ μの直径をもつＧＭＤｓについて約４分〜約５Ｘ１０−’ｓｅｃの’ｄｉｌ＋＋ ＋１＋＋を生じ、そしてＤ：；１０−′０ｍ”ｓｅｃの小さい分子について５０ ０μ〜５μの直径をもつＧＭＤｓについて約１分〜約６ＸＩＯ−’ｓｅｃの丁ｄ 、ｌｊ＋ｔ＋＋＋、およびＤ＝ＩＯ−’Ｃｍ’ＳｅＣをもつ巨大分子についてほ ぼ１００倍長い７アクター生ずる。結局、巨大分子の濃度でさえ約２００μ以下 の直径をもつＧＭＤｓにおいて急速に変化させることができる。なぜなら、対応 する拡散時間は約１時間であり、こえは典型的な哺乳動物の細胞の倍化時間より 非常に小さい値であるからである。この値はより小さいＧＭＤｓにおいてなおよ り急速に変化させることができ、これはより小さい微生物、例えば、バクテリア および酵母菌とともに使用することができ、この微生物はより短い倍化時間を有 する。それ以上の例として、倍化時間、Ｔ２、が典型的には約２０分である、急 速に増殖するバクテリアとともに使用する２０μのＧＭＤｓは、小さい分子につ いて約Ｑ、１ｓｅｃおよび巨大分子について約１０ｓｅｃの適当に短い”ｄｉ１ １＋＋Ｉ＋＋を有する。

１または２以上のインキコベーンヨン後、ＭＤｓは、好ましくは光学的手段によ り、測定する。他の測定手段は、異なる量の生物学的物質を含有するＭＤｓの質 量密度に対して感受性の方法、例えば、秤量、沈降、および沈降の場の流れの分 画、および音響、磁性、電気および熱の性質に基づく方法を包含する。沈降の場 の流れの分画力は、同時に流体力学的力むよび沈降力を利用することによって提 供することができる（参照、例えば、Ｌ　ｅ　ｖ　ｙおよびＦｏｘ、Ｂｉｏｔｅ ｃｈ　　Ｌａｂ、６：１４−２１、＋９８８）。音響測定は、音響顕微鏡検査に おいて利用するようｌコ、生物学的物質の音の吸収および反射を利用する（参照 、例えば、ＱＵａｔｅ、Ｐｈｙｓｉｃｓ　　Ｔｏｄａｙ、Ａｕｇｕｓｔ　　１９ ８５、ｐｐ、３４−４２）。磁気の測定は、反磁性、常磁性および、場合に応じ て、生物学的物質の強磁性を利用する。熱の測定は生物学的物質の熱伝導性、熱 拡散性および比熱（参照、例えば、Ｂｏｗｍａｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ａｎｎ、 Ｒｅｖ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｂｉｏｅｎｇｒ、４　：　４３−８０．１９７５）。

電気的測定は、生物学的物質の電気抵抗および誘電性を利用し、こうしで種々の 振動数において誘電性質の測定は生物学的物質の測定を提供すｂ（参照、例えば 、Ｋｅｅｌ、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ　　ａｎｄ　　 八ｐｉ　Ｉ　１ｅａｔ　１ｏｎｓ、Ｔｕｍｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、（編）、オ・ ／クス７オード大学印刷所、オノクスフォード、　ｐｐ、４２７−４６８；Ｈａ ｒｒｉｓ　　　ｅｔ　　　ａｌ、、　Ｅｎｚｙｍｅ　　Ｍｉｃｒｏｂ、Ｔｅｃｈ ｎｏｌ、９：１８１　　１８６、１９８７）。生物学的実在物、例えば、細胞の 電気抵抗の測定は、細胞の大きさの測定手段を提供し、そして粒子の分析の基準 、例えば、コールタ−・カウンターである（参照、例えば、Ｋａｃｂｅｌ、Ｆｌ ｏｗ　　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　　ａｎｄ　　Ｓｏｒｔｉｎｇ、Ｍｅｌａｍｅｄ　 　ｅｔ　　ａｌ、（編）　、Ｗｉ　ｌ　ｅ　ｙ、　ニーニーヨーク、ｐｐ、６ｌ −１０４）。本発明において、好ましい電気的測定は水性媒質中に懸濁している か、あるいはそれにより囲まれたＧＭＤｓとともに利用し、好ましくは２μｗの 膜をもつ生物学的実在物とともに使用する。これらの実在物は小さい多細胞の有 機体、細胞、小胞体および原形質体を包含する。電気的測定は、まず規定された 電気抵抗性の媒質、例えば、生理的塩類溶液からのＧＭＤ内の媒質の急速な拡散 の交換、次いで粒子の分析装置、例えば、コールタ−・カウンターを通過する第 ２工程に基づく。このようなＧＭＤのゲルのマトリックスはこのような生物学的 実在物と比較１．て無視出来る電気抵抗を提供し、これによりＧＭＤｓ中に含有 される細胞に関連する生物学的物質の量の測定を可能とする。

現在、光学的測定を利用してＭＤｓ内に含有された生物学的物質を測定すること は好ましい。生物学的物質に対して感受性のよく知られている一般的な光学的測 定は、光の散乱、光の吸収または測色、蛍光、時間遅延蛍光、リン光および化学 ルミネッセンスを包含する。

ＭＤｓ内に含有された生物学的物質は、ある場合において、生物学的物質の自然 に発生する光学的性質を利用して適切に測定することができる。こうして、例え ば、生物学的物質の蛍光、生物学的物質による先の吸収、および生物学的物質に よる光の散乱は時々使用することができる。

しかしながら、光学的測定の前に、ＭＤｓ、とくに水性媒質により囲まれたＧ　 Ｍ　Ｄ　ｓを１または２以上の染料方法に暴露することは好ましい。

これらの方法は、一般に（例えば、核酸の染料）であることができるか、あるい はそれらは生物学的実在物および生物学的実在物の増殖の決定の目的に依存して 特殊化（例えば、蛍光標識した抗体）することができる。

非水性流体により囲まれたＭＤｓの場合において、染料は取り囲む非水性流体を 通して染料を非水性流体中ｌこ溶解することによって、あるいは非水性流体と接 触する乳濁液の非連続的相中に染料を供給することによって導入することができ る。水性流体または媒質により囲まれたＧＭＤｓの場合において、染料は取り囲 む水性流体を通して染料を水性流体中に溶解することによって導入することがで きる。

生物学的実在物をそれ以上使用しない増殖の分析を望む一般的場合において、生 物学的実在物を殺すものを包含する、生物学的実在物の染色方法を使用すること ができる。生物学的実在物のそれ以上の分析を望む場合において、生物学的実在 物を生存させる生物学的実在物の染色を使用する。この分野Ｉ：８いてよく知ら れているように、核酸の染料、タンパク質の染料、脂質の染料、細胞膜の染料、 細胞壁の染料、酵素活性に対して応答性の染料、トランスメンブレンのポテンン ヤルに対して応答性の染料および細胞表面のレセプターの染料のための生物学的 物質の染料が存在する。

ＭＤｓを適当な染料に暴露した後、ＭＤｓを個々に測定するか、あるいはＭＤｓ を小さい群で測定し、ただし群中の１つより多い生物学的実在物を含有するＬＩ Ｄを発見する確率は低い。蛍光化合物により染色された生物学的実在物の例示的 場合において、光学的分析、例えば、ディジタル蛍光顕微鏡検査を、ＭＤの性質 の測定の検出について使用するものと十分に異なる波長を使用する、個々のＭＤ ｓの測定に使用する。この方法は同時のまｔ：は系統的のＭＤの性質および前記 ＭＤとともに生物学的実在物の測定を可能とする。関連する蛍光のシグナルを獲 得しそして測定し、必要に応じて普通の手段によりスペクトルのオーバーラッピ ングを補正する。

ＭＤｓの相対的に小さい大きさは、より柔軟な分析を可能とする。例えば、従来 の流れ細胞測定は数百ミクロンのの流れの生物学的実在物のチャンネルの直径を 有し、従来の巨視的ゲル調製物を使用する流れ細胞測定の使用を禁止するが、流 れ生物学的実在物チャンネルの大きさ以下より多少小さい大きさの範囲のＭＤｓ の使用を容易に許す。

各ＭＤまたは測定したＭＤｓの群における生物学的実在物の染料のための光学的 シグナルの大きさを、個々の生物学的実在物の光学的シグナルと比較し、ここで このような個々の生物学的実在物がＭＤｓ中に取り込まれるか否かは問題ではな く、これにより目盛り定めを提供する。ＭＤの光学的シグナルを個々の生物学的 実在物のそれと比較すると、個々の生物学的実在物の増殖の決定の基準が得られ 、それについて増殖の決定を１世代時間内でしばしばなすことができるが、前置 て有意に培養して大きい数の生物学的実在物を得る必要はない。

大きい数のこのような個々の生物学的実在物の増殖の決定を行うことによって増 殖速度の分布、遅滞時間の分布、および平板培養の効率をコンピューターの計算 により自動的に決定することができる。ＭＤｓのマニュアルまｔ：は視的検査お よびスコアリングをまた使用することができるが、比較的労力を要し、したがっ てより誤差の発生の傾向があるので、好ましい方法は自動化測定手段を使用する ものである。

生物学的実在物上の化合物の作用の決定さらに本発明は、化合物の重要な性質を 決定する手段を提供するものであり、そしてその性質として剤は、生物学的実在 物上の化合物の作用、殊に、生物学的実在物の増殖に関係している。また本発明 は、生物学的実在物の態様における化合物または剤の作用に対して生物学的実在 物の感受性または抵抗性に関する生物学的実在物、殊に細胞の重要な性質を決定 するための手段を提供する。この手段は、ＭＤｓ中に含まれる生物学的実在物と 関係している生物学的物質の量を測定することによって決定することが可能な生 物学的実在物の増殖の態様への化学合物の作用を決定するために特に有用である 。

生物学的実在物の増殖への化合物の作用の決定の一般的方法は：工程 （ａ）　　ＭＤｓを少なくとも１つの化合物に暴露し、前記化合物は前記生物学 的実在物の増殖へのその作用を決定すべきであるようなものであり、そして （ｂ）　　少なくとも１つのＭＤ内の生物学的物質を測定する、からなる。

本発明のいくつかの応用において、ＭＤｓを生物学的実在物を既に含有している ものに供給することができるが、他の応用では、ゲル微小滴中に生物学的実在物 を先ず導入することが必要である。この導入はＭＤＳの形成のための前記した方 法のどれを用いても達成することができる。

本発明に使用されるように、微小滴の標本という言葉は、ＬＭＤｓの標本及びＧ ＭＤｓの標本の両者を含み、そしてサンプルから形成されたＭＤｓのサブセット にも及ぶ。例えば成るサンプルが約１．０’ＭＤｓの形成に達するように処置さ れた場合、これらのＭＤｓは、各々のＭＤｓの標本が約１０’ＭＤｓを含む１０ 個のほぼ等しいＭＤｓの標本に分けることができる。

生物学的実在物への化合物または剤の作用は一般に直ぐに表わされないが、成る 期間を過ぎることが容認される。例えば、少なくとも１回のインキュベーション は生物学的実在物への化合物または剤の作用をもたらすために一般的に望ましい 。さらに生物学的実在物への化合物または剤の作用は、その化合物または剤の異 なった濃度に対して少なくとも２つの微小滴の標本を暴露することによって、し ばしば有利に決定することができる。

化合物また１ｊ剤に対するＭＤｓにおける生物学的実在物の暴露によってもたら される変化を調べるために、少なくとも１つのＭＤｓの標本は化合物または剤に 暴露しないで、そうすることによって少なくとも１つは比較対照条件下におくこ とが、しばしば望ましい。

生物学的実在物への灸くの化合物及び剤の作用は本発明によって決定することが てき、抗体、抗微生物化合物、抗真菌化合物、化学治療学的化合物、毒性化合物 、細胞障害性化合物、不可逆的阻害因子、可逆的阻害因子、突然変異誘発性化合 物、危険物質、ホルモン、増殖因子、増殖増強因子、栄養化合物、ビタミン、食 物保存剤、ａ薬、寄生虫および殺虫剤のような化合物の作用を含んでいる。

さらに、生物学的実在物の多（の異なるタイプは、本発明において有用であり、 小さい多細胞の有機体、細胞の群、個々の細胞、原形質体（プロトプラスト）、 小胞体、胞子、オルカネラ、寄生体、ウィルス、核酸分子、抗体分子、抗原分子 および分子の凝集物を含んでいる。動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、バクテリア 細胞、酵母菌細胞、真菌細胞およびかび細胞のような細胞を使用することは好ま しい。

また他の本発明の態様によれば、 （ａ）　　少なくとも２回インキュベーンヨン期間を使用し、そして（ｂ）　　 インキュベーション期間の間の化合物の濃度を少な（とも１回変化することを用 いる ことによって度々達成される。

例えば増殖変化している化合物または剤の反転能力を試験することを所望するな らば、最初のインキュベーションはその化合物または剤を存在させて用い、続い てその化合物または剤を存在させないで２番目のインキュベーションを行うこと ができる。

制御された条件下では、（ａ）微小滴の１つの標本を少なくとも１つの変化する 濃度の少なくとも１つの化合物または剤に暴露し、（ｂ）増殖の対照として最初 のインキュベーションを用い、そして（Ｃ）引き続いてその化合物または剤に暴 露した少なくとも１つのインキュベーションを用いることによって、行なうこと ができる。かくすることにより、その化合物または剤を暴露することによって対 照を行なう一連の方法を提供することができる。

さらに、本発明は、（ａ）微小滴の少なくとも１つの標本を少なくとも１つの変 化する濃度の少なくとも１つの化合物に暴露し、（ｂ）その化合物に暴露しない 微小滴の少な（とも他の１つの他の標本を使用し、そして（ｂ）少なくとも１つ の暴露した標本および１つの対照標本の別のインキュベーションを用いることに より行なうことができる。

特に本発明の方法は、種々の化合物に対する微生物の抗微生物感受性を決定する ことができる。１またはそれ以上の微生物を含むＧＭＤｓの標本を、１またはそ れ以上の濃度の抗微生物に暴露し、そしてそれぞれ異なった濃度のインキュベー ションを使用することによって増殖を決定する 異なった濃度における増殖の量を比較することによって、これらの濃度における 微生物の増殖を禁止する化合物の効果が決定される。この決定は、試験された化 合物のその微生物の抗微生物感受性の決定に対応している。

関連した方法によれば化学療法的化合物のような化合物に対する癌細胞の感受性 の決定方法が提供される。その場合にはＧＭＤｓを使用するのが好ましい。また はそれ以上の癌細胞を含むＧＭＤｓの標本は、１またはそれ以上のｆｉ［の化合 物に暴露されそしてその増殖がそれぞれの異なった濃度のインキユベーシヨンを 用いることによって決定される。異なった濃度における増殖の量を比較すること により、これらの濃度における癌細胞の増殖を禁止する化合物の効果を決定する ことができる。この決定は、試験された化合物に対する癌細胞の化学療法的感受 性の決定に対応している。

本発明の利点は、小さい数の細胞、好ましくは２つの細胞より少ない細胞によっ 占められていることの高い可能性を有するＧ〜ｉＤｓの測定を行なうことが可能 であるという点である。

さらに、この測定は細胞を含む大多数のＧＭＤｓにも行なうことができる。

結果として、例えば、本発明は例えば１．０００細胞から１０．０００細胞の各 々の癌細胞の大多数の化学療法的感受性の決定能力を備えている。かくして大多 数の細胞によって増殖量の分配を決定することができる。この増殖は同じである 必要はなく、それによって決定されるべき癌細胞増殖における分配を可能にして いる。このことは、次に、その化合物に対する癌細胞の感受性の分配の決定方法 を提供することができる。

例えば、癌細胞の１０％よりなるサブ集団が成る化合物または化合物の混合物に 対し抵抗性があるとすれば、占められたＧＭＤｓの約１０％において有意義な増 殖が見出されることになる。このような決定は、優れた統計上の意義を有してい る。その理由は、大多数の各々のＧＭＤ測定が可能であり、そこではＧＭＤが２ つよりも少ない細胞より占められている可能性が高いからである。

このような例を挙げると、約１０％の細胞よりなる抵抗性サブ集団が、１０４細 胞を測定することを基礎にして見られた場合、抵抗性細胞に占められるＧＭＤｓ の数は、約１０３である。試料中における、そしてそれ故に抵抗性サブ集団のサ イズの決定における対応する統計上のエラーはランダムに起る事象を計測するエ ラーによっている。この統計上のエラーは、ぴ５テフフ弓−１１によって表わさ れることは知られている。かくしてこの説明においてエラーは、ｐｑ狛活口ｉ藤 ＝　ＪＴ７０”＝３２である。この値は、約３％のエラーに対応している。それ 故、抵抗性サブ集団のサイズの決定には高い正確性を有している。

ＧＭＤｓにおける生物学的物質の量の決定は、増殖および他の生物学的活性およ び機能を、ＧＭＤｓ中における細胞のような生物学的実在物によって測定するた めの基礎を備えている。

生物学的物質を測定するための適当な測定手段は、光学的、秤量、沈降、場の流 れの沈降分画、音響、磁気、電気及び熱的手段を含んでいる。

光学的測定手段、殊に光拡散、光吸収または測色、蛍光、時間遅延蛍光、リン光 および化学ルミネッセンスを使用することが好ましい。

他に説明したように、単一微小滴より主として成る微小滴のグループを同時に測 定するか、または少な（とも２つの微小滴より主としてなる微小滴のグループを 同時に測定することができる。また他に説明したように、測定された微小滴はイ ンキュベーションの前に２つの生物学的実在物より少なく含む高い可能性でゲル 微小滴より主としてなる。

結論として、本発明は増殖の測定は、少なくとも１つの化合物の作用に平板培養 効率、増殖速度分布、平均の増殖速度、増殖遅延時間分布および平均の増殖遅延 時間から成る群から選ばれた増殖特性挙動を決定することに使用される工程に用 いることができる。

生育しうる生物学的実在物の計数 また本発明は、容量当りの生育している生物学的実在物の数の決定方法を含んで いる。すなわち、その決定は生育している生物学的実在物の計数、生物学および 医学において広く使用される測定よりなる。例えば流体試料のｍ１当りの生育し ている微生物の数を決定することは一般的である。この方法に於いて、微生物の 数に基づいて、および微生物の生存能力の厳密な基準に基いて速く決定すること は重要である。既に述べたように小さい多細胞の有機体、細胞の群、個々の細胞 、原形質体（プロトプラスト）、小胞体、胞子、オルガネラ、寄生体、ウィルス 、核酸分子、抗体分子、抗原分子および分子の凝集物のような微生物実在物の増 殖を含むように増殖の概念を拡張することは度々可能である。しかしながら、本 発明の方法を動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、バクテリア細胞、酵母菌細胞、真 菌細胞およびかび細胞、特に正常ヒト細胞、ヒト癌細胞、病原バクテリア、病原 酵母、マイコブラズム、寄生虫および病原性ウィルスのような細胞に適用するこ とは好ましい。

本発明は、増殖に基いて生存能力の基準を用いて生物学的実在物を、また、生き た菌株を備えた基準を用いていくつかの生物学的実在物を早（計数する一般的手 段を提供する。

特に本発明によれば 工程： （ａ）　　少なくとも１つの生物学的実在物を含有する少なくとも１つのＭＤを 、生存能力をもつ生物学的実在物の数が決定される条件下に暴露し、 （ｂ）　　ＧＭＤｓ中の生物学的物質を測定し、（Ｃ）　　関連するＧＭＤｓの 体積を測定し、そして（ｄ）　　それによって試料中の体積当りの生存能力をも つ生物学的実在物の数を決定する からなる、試料の体積当りの生存能力を有する生物学的実在物の数を決定する方 法が提供される。

ＭＤ体積が知られていない場合、ＭＤ体積を測定する追加的工程が使用される。

この決定を行う前に、生物学的実在物をＭＤｓ中に導入することが必要である。

この方法は生物学的実在物を含む試料物質とＭＤ３を形成するための前記した方 法を用いることによって達成することができる。

生存能力の検出は、成る場合には、特に細胞の成るタイプには、膜ポテンシャル 応答性の染料のような生育している菌株、光吸収性染料トリパンプル（ｔｒｙｐ ａｎ　ｂｌ、ｕｅ）及び蛍光染料プロビジラムアイオダイド（ｐｒｏｐｉｄｉｕ ｍ　１ｏｄｉｄｅ）及びエチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｕｍ　ｂｒｏｍｉｄ ｅ）のような膜排除染料、蛍光ジアセテート、カルボキシ蛍光ジアセテート及び 蛍光イソチオシアネートジアセテートのような内細胞酵素／膜完全性染料を用い ることによって決定することができるが（例えばＳ　ｈａｐｉｒｏ、　　Ｐ　ｒ ａｃｔｉｃａｌ　Ｆ　ｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、　Ａ、　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８５参照）、生物学的実在物が生存能力があることを決 定するためにより厳密な基準を使用することが一般的に望ましい。

多くの生物学的実在物、殊に細胞及びウィルスが生物学的実在物が生育しつる能 力があること、すなわち、サイズおよび／または数において増加する能力がある ことを決定することによってのみ、生存能力があることが厳密に決定される。か （して本発明は、ＭＤｓ中における生物学的物質の量を測定する前に増殖の機会 を備えるために少なくとも１回のインキュベーションを行なう方法によって生物 学的実在物の計数をするのに利用することができる。

本発明を実施する場合にはＭＤｓ中の生物学的物質の量の変化を測定し、引続い て１回またはそれ以上のインキュベーションをすることが好ましい。特に各々の 生物学的実在物、特に細胞と関連する生物学的物質の量を少なくとも１回のイン キュベーションおよびまた引き続いて少なくとも１回のインキュベーションの前 に測定することがてきる各々の作業でＭＤｓを利用することが好ましい。そうす ることにより、生物学的物質の量の変化が測定される。かくして生物学的物質の 量の変化を生物学的実在物の生存能力の検出として使用するプロセスを実施する ことが特に有用である。

生物学的実在物の厳密な基準が生存能力の決定の基礎として要求されない場合及 び生物学的実在物が小さい多細胞の有機体、細胞の群、細胞、原形質体（プロト プラスト）、小胞体、胞子、オルガネラ及び寄生体よりなる場合には、短かいイ ンキュベーションかまたは実質的にインキュベーションなしにＭＤｓの体積測定 と組合せて生育している菌株を用いることによって本発明を実施することができ る。生育している菌株は生物学的実在物、特に細胞のまたはそれ以上の重要な生 物化学的または物理的機能に応答する。そのような機能は増殖より速い測定を可 能にする。

生育しＣいる菌株の代表的タイプはトランスメンブレ〉・のポテンシャル株：メ ブレン排除株および内細胞酵素活性応答性株を包含している。特異的な生育して いる株としては、シアニン染料、プロピジニウムアイオダイド（ｐｒｏｐｉｄｉ ｕａ＋　１ｏｄｉｄｅ）　、エチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕ＋ｅ　ｂｒ ｏｍｉｄｅ）　、蛍光ジアセテート、カルボキシ蛍光ジアセテートおよび蛍光イ ソチオシアネートジアセテートが含まれる。

かくしてＭＤｓを少なくとも１つの生育している菌株に暴露しそして引き続いて 生育している菌株および関連したＭＤｓの体積を測定することによって、生存能 力のある生物学的実在物の計数を行うことができる。

本発明は、ＭＤ測測定適用される統計的な分析をすることなく、適当な計数を行 うことができるが、より正確な決定は、生物学的物質測定およびＭＤ体積測定の 両方を利用する統計的分析を含んでいる。このような統計的分析は占有され或い は占有されない場合にも個々のＭＤの評価、または、ＭＤｓの標本を含んでいる 。追加的な情報はさらに生物学的物質の量による個々のＭＤを評価することによ って得られる。かくして生物学的実在物の増殖は生存能力を決定するための基礎 として測定され且つ使用される。個々のＭＤまたはＭＤｓの標本が占有されまた は占有されないとして評価された場合には、対応するＭＤの体積またはＭＤｓの 対応する標本の体積は利用される。かくしてＭＤｓ体積またはＭＤ標本体積の異 なる範囲の占有が起る統計学的頻度分布は、測定値から決定されそして試料の体 積当りの生育している生物学的実在物の平均的な数を決定するために使用される この頻度分布から決定される。この平均的な数は、ＭＤｓの形成に使用され、従 って試料の生育している数よりなる。

異なるＭＤ体積範囲中にＭＤｓにおける占有が起る頻度の測定値を用いてポアッ ソン統計学または修正したポアッソン統計学を用いることが好ましい。

細胞の生育プレー１−化、ランダム混合およびポアッソン確率分布の簡便、標準 方法においては、計数を行うのに使用される。必要ならば、繰返しの計算の用法 により、もし生物学的実在物がＭＤ創製プロセス中にＭＤｓ中にランダムに分布 しているならば、ポアッソン確率機能に述べられている自己矛盾決定の結果とな る。

最初のＰの試験的な値を用い、しかも測定されたＶ１ｉｎ分布の最初の占有分布 が計算される。Ｐの最初の値は計算された分布が測定されたものより多かれ少な かれ占有された結果となるかどうかにより調整される。

このプロセスは、好ましくは１０〜３０％以内に適用に応じて一致するまで続け られる。そしてこのＰの値は、Ｐｓを得る希釈のために訂正される。そしてそれ は所望の生育細胞の計数である。それは試料の体積当りの生育生物学的実在物の 数として表わされる。

測定値から決定されそして試料の体積当りの生育している生物学的実在物の平均 的な数を決定するために使用されるこの頻度分布から決定される。この平均的な 数は、ＭＤｓの形成に使用され、従って試料の生育しでいる数よりなる。

異なるＭＤ体積範囲中にＭＤｓにおける占有が起こる頻度の測定値を用いてポア ッソン統計学または修正したポアッソン統計学を用いること、　が好ましい。

細胞の生育プレート化、ランダム混合およびポアッソン確率分布の簡便、標準方 法においては、計数を行うのに使用される。必要ならば、繰返しの計算の用法に より、もし生物学的実在物がＭＤ創製プロセス中にＭＤｓにランダムに分布して いるならば、ポアッソン確率機能に述べられている自己矛盾決定の結果となる。

最初のＰの試験的な値を用い、しかも測定されたＶｕｏ分布の最初の占有分布が 計算される。ｐの最初の値は計算された分布が測定されたものより多かれ少なか れ占有された結果となるかどうかにより調整される。

このプロセスは、好ましくは１０〜３０％以内に適用に応じて一致するまで続け られる。そしてこのＰの値は、Ｐｓを得る希釈のために訂正される。そしてそれ は所望の生育細胞の計数である。それは試料の体積当りの生育生物学的実在物の 数として表わされる。

体積ＶＭＤの範囲中におけるＭＤｓの最初の生物学的実在物の平均数ｎは下記関 係式を通して試料中の細胞濃度Ｐに関係している。

Ｐｓ、生育数の決定が提供される。

ここで、ｆ［ｌは式（３）によって決定される希釈因子である。占有されたＭＤ ｓの統計的に意義する数のためのｎおよびＶＭ、、の決定は充分な正確性、典型 的には±１０％〜±３０％で決定されるべきＰｓを可能にする。この値は慣用の 生育プレート化によって得られる典型的な計数よりもよいかまたはほぼ同じであ る。所望により、Ｐｓにおける正確性の数は、占有され且つ占有されているＭＤ ｓおよび／またはＭＤｓのグループの大きな数で測定を行ない且つ用いることに よって行うことができる。

また、ポアッソン確率式または修正ポアッソン統計式のような適当な確率分布を 使用する計算がＭＤ標本中のサイズの範囲が非占有、個々の占有または多数占有 される高い確率を有することを同定するために自己矛盾的に使用される。

適当なＭＤｊｌｌｌ！プロセスの例は、この他にも説明されている。ＭＤサイズ の広い範囲を作り出すプロセスの有利性な試料細胞濃度Ｐの広い範囲ちを使用す ることができることである。このような条件は、ＭＤｓの大きな標本を有する試 料に有用であり、その標本ではそのＭＤｓのいくつかの有意義な分画が、非占有 または個々に占有されている高い確率を有することに対応する体積を有している 。

形成された、ＭＤｓは増殖決定のため所望の条件下におかれる。典型的には、Ｍ Ｄｓは分布され異なった成分及び異なったｐＨ，温度、酵素分圧および二酸化炭 素分圧などの範囲の媒体中に入れられる。そうして、他に説明したように広い範 囲の増殖媒体条件の下に、増殖を決定することができる。

インキュベーンヨン期間後、ＭＤｓは、生物学的実在物のタイプおよび増殖決定 の目的に応じてまたはそれ以上のステイニング（ｓｔａｉｎｉｎｇ）プロセスに 暴露される。生物学的実在物を更に使用することなく増殖分析を所望する一般的 な場合には、どのステイニングプロセスも生物学的実在物を殺す方法およびその 実在物を殺さない方法の両方を含めて、使用することができる。生育生物学的実 在物をさらに分析または使用することを所望する場合には、生物学的実在物を生 き残らせるステイニングが使用される。

適当なスティンにＭＤｓを暴露することに引き続いて、もし、グループ中にＭＤ を含む生物学的実在物の１つ以上が見出される硼素が小さいならばＭＤｓは個々 に測定されまたは小さなグループで測定され、蛍光物質によってスティンされた 細胞の例の場合は、デジタル蛍光マイクロコピイーまたはフローサイトメトリー のような光学的分析がＭＤの性質の測定のどの決定にも使用されるものとは充分 に異なった波長バンドを用いて、個々のＭＤｓまたはＭＤｓのグループの分析の 使用される。

かくして同時または一連のＭＤの性質およびＭＤｓ中の細胞の測定は可能となる 。関連した蛍光シグナルは必要ならば慣用手段によって重複したスペクトルを修 正して、捕捉されそして分析される。

各々のＭＤまたはＭＤダグループ中ける生物学的実在物中のスティンによって光 学的信号の大きさは個々の細胞の蛍光を個々の生物学的実在物がＭＤｓ中でエン トラップされ、それによって策定されるかどうかを比較する。そのＭＤまたはＭ Ｄグループを比較して、個々の生物学的実在物のその信号の大きさは、個々の生 物学的実在物の増殖の決定の基礎を備えている。例えば細胞の重要な場合では、 信号の大きさの比較は、２またはそれ以上の生物学的実在物のマイクロコロニー 中の個々の細胞の増殖の決定の基礎となる。この増殖は約−世代の間になされる が、大多数の細胞を得る培養の前に必要ではない。そしてこの増殖は１つから２ またはそれ以上の細胞に増殖するのに要求に決定されるような生育ＭＤｓが生育 細胞を含んでいることを創製するための基礎を備えている。

本発明は、小さい多細胞の有機体、細胞の群、個々の細胞、プロトプラスト、小 胞体、胞子、オルガネラ、寄生虫、ウィルス、核酸分子、抗体分子、抗原分子お よび分子の凝集物のような生物学的実在物の生育数を得るのに使用することが出 来る。本発明を使用することは動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、バクテリア細胞 、酵母細胞、真菌細胞およびカビ細胞のような細胞の計数に好ましい。

自然に発生する生物学的実在物の性質を使用するか或いはそのスティンを使用し て、ＭＤｓ中の生物学的実在物の測定する代表的な適当な方法は、光学的、秤量 、沈降、場の流れの沈降分画、音響、磁気、電気および熱的手段のような物理的 を含む。

生物学的物質およびゲル微小滴体積を光拡散、光吸収または測色、蛍光、時間遅 延蛍光、リン光および化学ルネッセンスのような光現像を用いて測定する光学的 測定を用いるのが好ましい。

乞？　ｆｉ４　ｆｆ１ｌ＋２ゴ木　ＨＤｓε／１７ｙ、３＜ｙ３／っのλ刊二シ フ゛フ゛鈎２て゛くり理Ｑ苓ｊ鷺ｉγ　ビｔ＝４つ−Ｌ　、／１Ｏ−ｔｔａ’３ Ａ（Ｃ））ことＰｕ３．Ｓ；で−７ｆ：、　Ｚ−＞　’５　）　Ｃ７＞ｃ４　＋ 　）　Ｋかｄ＋−仝？’！Ｗｊ７：’ｚ　（！５１２　’ｌ’　；’ｃ　ＡＺ− 、ｚ）？　／”ｒ”；’ｃｒ　＝　’　／ハ＝　’−４；ｉ　Ｌ　仏Ｊ　ｌ　ｃ ’ｉ’ｌ　イ？’−７六／ｌｐ　’＄４　ｔＣｉｌ）　ｙｇ　’、　１ｔｌｌｊ ’、　Ｑ”ｉｊイア　ｑ　を二ｑｈＤｓ　　””、二ｒｙ＝４４ｒ＝ｔ＝　。

今゛′７シマ／、ｒｌ、・７フ２１よ／／１こシφ４σＬ０り乞４てミ’ｌ＃′ ζそ〕。

こＩ＋ｉ陣ｒ−ｃＡす、　　／／ｌ　＝　ｔ　（４ターｊｈＪ　７１　’１４に イ子、：４４２．）’Ｄｊ７′ウスｆ　、　　／／ｌ力えイ％７ｔ、よｔ□−Ｌ ）のよし　全モろ春４Ｓ紀ろケめ己１５６・・＋ｌ＠ＨＤ５ｔυ　Ｓのりう：、 ｆｅｑｉに　？膚鋒第−うＩむ喧。

ご−７；ｒ（（、ｔ４ｊｊ、　’ａ　ｒ諏４ｔβＱｄ超肩’Ｌ　Ｕ　Ｊｒ？＋ｔ ”ａ　、　Ｍ−ｙ　？　。

、を静＜、／τ−ａ　、＝ａｔｔ＝工Ａ５ｕ、　−％　（７ｆ４Ｄ５２４ｋＴｌ ｒｌ　ｊ”’７　　［）＝　　−ｎ寸ｒイー７、−ヲ厖又−り了−ａ　　、　　 ”！；Ｌ　　イｄ＋＋〕ｃｉ’、７二６ハＤ、Ｑ／−１’５杓４乙５拘賞ケ噴Σ ）１生マ）ｈあ。

屯昼暑〆り＼−ご待Ｚ（−’ａ。

ＣｒＦｌ　１）Ｓ　　；ｆｆｈ　Ｑ−６１８９Ｓ　　ｑ４１−　／　二ｒ？’ｙ ｊつイ）ＰＬＱ（ｒ砲ｒのテｌｃ／マＦ“ル、フスｔこえ・埼ｆｈ姪層！５うは Ｊｌ＝ｒλ〜怖巳用（＼ｒてｒ−１貧・π？べＺビだ了−ヱ）。

ｑ蒔７−ｈｌ’ｌ荏漬ｈ＞７斤む凋ｔ）マーカークｈ゛めθ宕１・ｌＳ”？１ｒ −よ、マ、＠Ｊ４Ｓ、　トｔ４　Ｘ４Ａ￥）Ｉ’ｘ　ノ＝ｔ　、”’Ｉ　Ｃ７Ｈ Ｄｓと７２１か　ｑと／）ｓ　　の子１１のイ≠ｙｔｉこ：ｋｔＬ？　ンと〃′ 望たひコ。

４〃ｌ之１キ゛　　ハ”ｑウベ÷９’ｈ−ｂ必ｒうな、も１、的色空収。

孝ｉ（１さりる各マーカーク々？’Ｄ　Ｌ　ｔ’ｉｌ　＋　１３　＝こｌでＪ７ ７、名θＧＨＤと入１躯ＦｆＤ、の片イ？の才そい肱ザの少ｑ４　Ｌ　？１！／ 　’ｉ　ａＩ　Ｚ　’７”−？’ｌ　’Ｆａ　−乃１１　？ニーｆＺ　Ｊ−）” ’Ｚ　４＃Ｄｓのイ”４Ｊ’Ｌ　２．１＋＄３　”’　Ｚ　’：　７ｊ−Ｃ−１ ’＞　、　（’；；７ＪＪ、　６）　ｆｇ、３に／、、！遭洩煙巨乍磁静ｂｔｒ ｔ督−カマ〕マづ−？耐伽狡ｍε、屑ん１−ｎ：、　　４ｆ’ｍｌｔｒＭＪ７＞ う；ターの７リフイスｔこ＝ＴｉＡ　　（τ喧ルのヂｉ星Σダ８ンうシミ（之θ う沢んうｐβぞ自ｔ）つτこｌ−具飛虐’ｆｔう］〉初咋−７１と’ｊ　Ｘｋ脅 苑Ｊｔも）フッ茗医造引丙ｒラシメ４プゝイυλめ”ｌ　　ｔ（ｆρ１とに４ｈ ｖｓ　のを４Ｊ勧霞βブｌ）、鏝ｌ枦マーｐ−勿々゛褥の１０へ疋ゼ＆ノー形Ｄ ｉ２む６圧しｌＧ之ｆ歿祉とＡ力Ｚ−Ｚ鑓１ｆｔＬｙてＦ＋１．、、フレの７一 つ−ケｈ°拍の蛍ｌ以ｌよ、ｆっ４βθ！（７１＠４　ｋ扼１’に−１ｋＩＮ島 ｒ＝　７ｉｆｌ　’４　”’ｉ　／Ａ　Ｚｆ　５４）４の９乙と酩ｆ７“）ろ４ ソ？−ｔＨ’１ンタて汐〕矛・もて−ある。

混合生成ポピユレーションについての測定多（の試料が単種の生物物質を含み、 例えばすべての微生物が同種である、微生物のモノカルチャーであるが、生物学 または医学で得る試料の非常に多くは混合ポピユレーションであり、少くとも２ 種類の生物物質が試料中に存在し、一般に、異種間の相対的数も絶対数も前もっ てわかってはいない。本発明は混合ポピユレーション試料中の生物物質を測定す る一般的方法であって、試料の前処理が最小であるか又は必要とせず、迅速にそ のような測定を行うことのできる方法を提示する。本発明の一般的方法は：　（ ａ）混合ポピユレーションの試料から微小滴を作り、（ｂ）少くとも１種類の生 物物質に敏感な少くとも１回の測定を行い、さらに別の少くとも１種類の生物物 質に敏感な測定を１回行うという段階から成る。

この方法においては、各ＭＤが２個以下の生物物質を含む可能性が高いのが好ま しいが、各ＭＤが少くとも１個の生物物質を含む可能性の高い条件下で行うこと もできる。すべてではないが多くの場合、ＭＤの体積を測定する段階を加えて提 示するのがさらに望ましい。

例として、二種類の異なる生物物質工、および■を含み、特定の成長媒体を与え られると１の代謝酸生成および分泌が■より非常に速いというような試料からの ＬＭＤであるＭＤの形成を提示する。そこで、試料を希釈し、又は希釈せずに、 体積がＶＭＤ＝Ｖ１．ＭＤの範囲にあるような１゜ＭＤを形成することにより又 は基本的に同体積であるＬＭＤを形成することにより、非占有又は個々に占有さ れた可能性が高（、各占有ＬＭＤが初期の種類工又は初期の種類■の微生物を含 む確率の高いＬＭＤを形成することができる。吸光又は蛍光による光学的ｐＨ指 示薬を加えることにより、種類Ｉの酸生成が測定でき、微生物を含むＬＭＤを同 定することができるようにＬＭＤを培養することができ、混合ポピュし・−／コ ン中の１種類の生物物質の測定の基礎となる。

もうひとつの例として、ＧＭＤを異なる二種類の細胞、種類Ａおよび種ｇｆｆＢ を含む混合生物試料から成る懸濁液から形成し、さらに＝（ａ）種ｇｉＡは与え られた条件で種類Ｂより非常に速く成長し、（ｂ）種類Ａを種［Ａ表面抗原に対 するＧ　ｒｅｅｎ　　Ｆ　１ｕｏｒｅｓｃｅｎｅｅ標議抗体により標識すること ができ、種類８表面抗原に対するＲｅｄ　　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ標議抗体 によって標識することができると、種類Ａおよび種類Ｂの成長は別々におよび同 時に決定することができる。この例につき続けると、混合ポピユレーションの試 料の一部をＧＭＤに移し、それによってＧＭＤに両種類の細胞をそう人する。Ｇ ＭＤの標本は両抗体に同時に又は連続的に暴露し、抗体がＧＭＤに入りこんで、 表面抗原と結合し、両種類の細胞に関して生物的物質の量、この場合は表面抗原 の量を標識することができる。そして、ＧＭＤ中のＧｒｅｅｎ　　Ｆｌｕｏｒｅ ｓｃｅｎｃｅおよびＲｅｄ　　Ｆ　１ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅの量を測定し、それ によって種類Ａおよび種類Ｂを伴う生物物質の量を測定する。一つづいて少（と も１個の別のＧＭＤの標本を望みの条件で培養シ２、両種類の細胞を成長させる 。この標本の全部又は一部を同様に調製した蛍光標識抗体に暴露すると、種類Ａ 又は種類Ｂを伴う生物物質の量を区別して測定することができる。各種類の生物 物質の測定量を非−培養ＧＭＤ中各種類の生物物質の量と定量的に比較し、試料 中の各種類の細胞の成長の測定とすることができる。この例でわかるように、Ｇ ＭＤは、成長を測定するために生物を含んで使用することができるかＧＭＤの体 積は必ずしも測定する必要がない。

混合ポピユレーションの少くとも１種類の生物物質の測定が望まれていることが 多いが、このような測定法の結果を使用しで、１種類の生物物質を含むＭＤの物 理的単離の基礎とすることができる。このさらに進んだ方法においては、少くと もひとつの測定値は、対応するＭＤに少くともひとつの力を適用するための基礎 となる。この力によりそのようなＭＤに物理的操作が加えられ、そのようなＭＤ が物理的に単離される。

このようにして第１の種類の生物物質を含むＭＤを第１の種類の生物物質を含ま ないＭＤから単離する。そのようなＭＤの単離に続き、ＭＤ中に含まれる生物物 質は、この発明の他所に記載の方法によりＤＭから単離又は除去することができ 、これにより、生物物質の単離とすることができる。

混合ポピユレーション試料の測定がすべての場合に会合ＭＤの体積の測定を必要 としているわけではないが、はとんどの場合、本発明の実行にはＭＤ中の生物物 質の数の決定のために、ＭＤの体積の測定と統計的分析の利用が含まれている。

そのような場合、Ｐｏ１ｓｓｏｎ統計学又は修正Ｐｏ１ｓｓｏｎ統計学による統 計学的式を利用することが好ましい。このような式は体積ＶＭＤ、ＭＤ中の初期 の生物物質の特定占有又は数、ｎおよびこの体積のＭＤの生物物質の平均数、五 の関係を示している。このように、一般に良く知られており本発明の方法におい てはコンピューターの使用により容易に行うことのできるこれらの相互作用的式 を適用することにより、測定したＭＤが個々に占有されている確率を決定するこ とができる。さらに少くとも２種類の生物物質を区別することのできる方法を用 い、ＭＤ測測定少くとも２種類に分類することが可能で、それは、統計学的式に よるとたった１種類の生物物質の測定と関連している確率が高い。

この方法を要約すると、少くとも２種類の生物物質を区別する測定およびＭＤの 体積の測定についての統計学的分析の結果、混合ポピユレーション試料からの少 くとも１種類の生物物質に関連する可能性の高い測定値を得ることができる。本 発明の方法は、生物物質をＭＤ中に統計的に、通常は基本的に無作為に分離して おり、続く測定および統計学的分析が生物物質を別々に測定することを可能にし ているので、このような測定が可能なのである。このようにここに記述したこの 方法又は類似の、方法を用い測定ＧＭＤが２個以下の生物物質を含む確率の高い 条件下で混合試料に対する有用な測定を行うこともできる。

個別に占有されたＭＤを用いた測定を好ましいが、ＭＤが多重に占有されていて さえ、有用な測定を行うことができる。例えば前述のとおり、もし２種類の細胞 、種類Ａおよび種類Ｂを、表面抗原に対する抗体を利用して測定し、抗体のひと つがＧ　ｒｅｅｎ　　Ｆ　１ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ標識を有１〕、第２番目がＲ ｅｄ　　Ｆ　１ｕｏｒｅｓｅｅｎｃｅ標識を有する場合、各種類の細胞の成長は 別々に決定できる。

もうひとつの例においては問題のすべての種類の生物物質による平均占有、五、 が約ｎ−０，１５より大の時、個々の生物物質による量初の占有の確率は減少し 、ｎ＞＞Ｑ、１５の場合はほとんどのＭＤが多重に占有されることになる。しか しそのように多重に占有された場合でさえ、混合ポピユレーションから形成した ＭＤに関する有用な測定が可能である。例えば、ｉ＝３の場合、本発明の他所に 記載した通りある範囲の大きさＭＤに関し、ｎ＞７である確率は小さく、従って 他の種類が存在している中である種類が６個以上存在する確率は低い多くの場合 、生物物質はその性質、例えば生物素材の組成、又は成長が非常に異っており、 そのような場合、有用な測定を行うことができる。

しかしながら、前述のとおり、本発明の利用において好ましいのは、少くとも１ 個の生物物質を含む確率の高いＧＭＤを使用することである。

少くとも１種類の生物物質の成長を決定する測定と共に本発明を利用するのは特 に有用で、ＧＭＤの少くとも１標本を、少くとも１種類の生物物質の成長に影響 を与える条件に暴露することによりさらに広げることができる。例えば微生物学 においては選択的成長培地の利用は十分確立されている。そのような培地の利用 により、自然の成長が可能で、典型的には長期の培養によりて行われ、これは他 種の微生物が多量に存在する下で選択された微生物が倍増する時間が多量にある ということに対応する。特に微生物には成長しない又は選択された種類よる非常 に成長がおそいものが含まれる。本発明では同−又は類似の選択的培地を使用で きるが、長期間培養する必要はない。この場合、別個の占有の確率の高いＧＭＤ の同定には、Ｐ　ｏｉｓｓｏｎ統計学又は他の適した統計学の使用が好ましいが 必ずしも必要ではない。

本発明では、微小滴を少くども１種類の生物物質の成長に影響を与える条件に暴 露することにより行うのが有用であることが多い。例えば、ＭＤがＧＭＤであり 、選択的培地により１種類のバクテリアの成長はゼロとなり、２番目のバクテリ アが成長し、成長する種類の倍増時間がｔ２＝３０分であり、成長が始まるまで の遅滞時間が数分である例を考えてみよう。この場合、約１時間の培養の後、非 成長バクテリアはまだ率−バクテリアとして存在し、ｎ−１のＧＭＤ又は別個に 占有されたＧＭＤは、もし非成長型によって占有されていれば単一のバクテリア を含んでいるであろうし、もし成長型のバクテリアにより占有されていれば４個 のバクテリアのミクロコロニーを含んでいるのであろう。この例について続番フ ると、もし、各種類のバクテリアがプロビジウムヨーダイド占領の使用により、 基本的に同程度のＲｅｄ　　Ｆ　１ｕｏｒｅｓｃｅｕｃｅを有する場合は、非− 成長の単一細胞および４細胞を含むミクロコロニーは容易に区別できる。成長バ クテリアにより別個に占有されたＧＭＤは非−成長バクテリアニ、より別個に占 有されたＧＭＤの４倍のＲｅｄ　　Ｆ　１ｕｏｒｅｓｃｅｕｃｅシグナルを有す るであろう。

微小滴に含まれる少なくとも一種の型の生物学的物質の増殖をＭＤ内の他の型の 生物学的実在少なくとも一種の増殖と比較することにより本発明を実施すること をも有用である。倒えば再度二種の形式の細菌が混合した集団を含むが、選択さ れた条件が否定的ではないが、異なった増殖速度をもたらす静的とはいえない場 合関連する例を考慮しよう６特にＡ型が世帯時間ｔ　Ａ２−３０分、及びＢ型が 世帯時間ｔＡｘ−４５分を有する場合を考察する。こうした場合は個体の占有の 高い確率を有するＣＭＤを特定するポアッソンの統計又は他の適当な統計を使用 することが適当である。この場合、約６０分間の占有に続いて、数分間だけの遅 れ時間を考慮すれば、Ａ型細菌は約４細胞の微小コロニーとして個々に占有され たＭＤ中に存在するが、Ｂ型細菌は約２．５細胞のマイクロコロニーとして存在 するであろう。従って個々に占有されたＧＭＤ、即ち、始めに一つの細胞を含む ＧＭＤは、もしＡ型であれば約４細胞から成る微小コロニーか、又はＢ型であれ ば約２．５細胞の微小コロニーを有するであろう。この実例を続ければ各型の細 胞が沃化グロビジウム染色のプロトフルの使用に続いて本質的に同じ大きさの赤 い蛍光信号を有すれば、約４細胞の微小コロニー及び約２．５細胞の微小コロニ ーは、この場合赤い蛍光（８号が微小コロニーの大きさに比例するから容易に区 別できるであろう。この種の測定及び分析法を用いて、両者の型の細胞の平均成 長速度は混合試料から容易に速度できる。これは混合した集団について迅速な測 定を行う基本的な方法を例示している。本実施例は又二種以上の型の細胞に直接 的に延長することを含む、本実施例の多様な生物学的増殖を用いて、少なくとも 二種の生物学的実在を区別する、生物学的増殖に使用する、本発明の使用にを例 示する役に立つ。

本発明の一般的変法は少なくとも一種の生物学的物質が少なくとも一種の他の生 物学的物質と区別できるような充分な特異性を持った生物学的物質の使用を含む 。例えば表面抗原に対する蛍光標識された抗体はこうした生物学的物質の測定の 特異性なるものの一般的基本を提供する。

これは第一表面抗原に対する緑色蛍光標識された抗体及び第二表面抗原に対する 赤色蛍光標識された抗体を基礎とした実例によって両方の細胞種の増殖について 可能であることが前に記載された。

本発明の方法は更に混合集団試料の一種又は多種の生存数の算定を可能とする。

前に説明したように、異種の生物学的実在物の増殖が別個に及び同時に測定でき る。更にポアッソン統計又は他の適当な統計に基づいた統計解析と共にＭＤ容積 測定を利用することによって、少なくとも一種の生物学的実在物の生存数の算定 を行うことことから成る試料の単位体積当たりに生存する生物学的実在物の数が 一種又は多種の生物学的実在物について得ることができる。

選択的な培養条件下の増殖の差は一種又は多種のＧＤＭｓのインキ３ベーション をかような化合物と共番こ行うように、顕著に増殖を変える化合物にＤＧＭｓの 一種又は多種の試験試料を、Ｉｇ！することによって増大させることができる。

これは少なくども一種の生物学的実在物の増殖を顕著に変える二とにより、一種 又は多種の生物学的実在物を測定することを可能とする。適当な増殖変更化合物 の例は抗生物質、抗微生物性化合物、抗黴性化合物、化学療法化合物、毒性化合 物、細胞毒、不可逆的阻害剤、突然変異誘発物質、有害化合物、ホルモン、成長 因子、成長促進剤、栄養素、ビタミン、食品保存剤、殺虫剤及び殺毘虫剤を含ん でいる。

異なる増殖の測定及び／又は異種の生物学的物質を測定する測定を行う以外に、 本発明の方法は異種の生物学的実在物の機能を指示する測定を行うことにより更 に拡張することができる。より詳細には、少なくとも二種の生物学的実在物が生 物学的物質、生化学的活性、分子の生産、分子の分解、分解の文筆、新漬代謝、 膜の団結性、酵素活性、及び増殖から成る部類から選択された測定により測定さ れる測定を行うことが有用である。新陳代謝例えば細胞のような生物学的実在的 分子を生産する能力に相違があれば、生産におけるその差は、結合部位に捕捉す るために分子を放出するようなエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｌ ａｔｉｏｎ）のような刺激を用い、次いで測定することによって測定することが できる。

最後に、細胞のような生物学的実在物が或種の条件に暴露された時にそれらの酵 素活性に差があり、その結果として生じる酵素活性が測定されれば、この種の測 定も又生物学的実在物の種別を区別する。

上記のように、生物学的物質及び微小滴容積の測定には光散乱、光吸収又は比色 、蛍光、遅延蛍光、燐光及び化学発光のような光学滴現象を用いる、光学的手段 が好適である。又微小滴容積の測定を高度化するために、ビーズ、非生物学的粒 子、結晶、非水性液体包含物、生存細胞、死滅細胞、不活性細胞、ウィルス、胞 子、プロトプラスト、小嚢、染色剤、染料のような標識実在物を用いてＧＤＭｓ 中に標識実在物を組み込むことも屡々有用である。別法として、少なくとも一つ のゲルマトリ・ノクスの標識実在物を付着するようにＧＤＭｓを前処理すること も可能である。更に、微小滴形成後に、標識実在物を微小滴中に組み込むことも でさる。

別な測定手段は光学的、重量的、沈降的、フィールド・フロー（ｆｉｅｌｄＮｏ ｖ）的沈降分別的、音響的、磁性的、電気的及び熱的手段を含む。更に本明細書 の別な箇所に記載したように、光散乱、光吸収又は比色、蛍光、遅延蛍光、燐光 及び化学発光から成る部類から選択される光学的手段を用いることが有用である 。本発明のこの方法は測定の前に生物学的物質に影響を及ぼし、それにより少な くとも二種の生物学的実在物の間の区別を強調する少なくとも一つの化合物番こ 微小滴を暴露する追加的段階を含むこともできる。

本発明は小さい多細胞生物、細胞群、個々の細胞、プロトプラスト、小嚢、胞子 、小器官、寄生物、ウィルス、核酸分子、抗体分子、抗原分子、及び分子の凝集 物のような生物学的実在物の測定を行うために混合集団について利用することが でき、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、細菌細胞、酵母細胞、真菌類細胞及び糸 状菌細胞、及び正常なヒト細胞、ヒトの癌細胞、ｇＩＩＫ細菌、病原酵母、ミコ プラズマ属、寄生生物、及び病原ウィルスのような細胞について測定することが 好適である。

更に本発明は光散乱、光吸収又は比色、蛍光、遅延蛍光、燐光及び化学発光から 成る部類から選択される光学的信号のような、生物学的物質に関連して自然に発 生する光学的信号を測定することによって、少なくとも一つのゲル微小渦中の生 物学的物質の量を測定することにより実施することができるが、少なくとも一つ の生物学的物質の染色を含む少なくとも一つの染色工程を利用することが好適で ある。使用でさる代表的な種類の染色剤は生物学的組成の染色指示剤、酵素活性 の染色指示剤及び細胞膜団結性の染色指示剤のような染色剤である。

又少なくとも一つの染色が生物学的実在物の同定に使用され、又は自然に生じる 光学的信号が生物学的実在物の増殖を測定するために使用される、具体化におい て本発明を実施することも有用である。本発明の特に有用な一般的変法は少なく とも一つの蛍光標識抗体が生物学的実在物の同定に使用されるような使用を含む 。

従って本発明は既往法では容易になされなかった混合した生物学的集団について 各種の測定を行う際使用することができる。

生物学的実在物に及ぼす外部的影響の準備多くの試験及びアッセイにおいて、生 物学的実在物と化学的、生物学的因子又は物理的領域の外部的要因との相互作用 は極めて重大であり、ＭＤ測測定拡張する手段、及びこうした影響の効果を包含 する一離工程を提供することが極めて望ましい。生物学的実在物に及ぼすこうし た外部的影響を提供するために、生物学的実在物は、生物学的実在物を含むＭＤ ｓが発生源の近くの位置に導入され、発生源の近くの位置に保持されるか、又は 発生源の近くから引き離すことができるように、ＭＤｓ中に組み込まれる。本発 明の一般的実施において、影響源は生物学的影響源、化学的影響源、物理的影響 源、及び生物学的的１．化学的物理的影響源の組み合わせがＭＤｓにより提供さ れる。

しかし一般にＧＭＤｓであり、特に水性媒体がＧＭＤｓの水性内部媒体に接触し 、それにより化学的薬物及び小さい生物学的実在物がＧＭＤＳと水性媒体との間 で交換されるように、水性媒体により包囲されｆ−ＧＭＤｓであるＭＤｓを利用 することによって影響を及ぼすことが屡々好適である。又物理的影響の大部分の 種類が容易に与えられるが、交換できる化学薬物は一層限定され、及び比較的少 数の生物学的実在物が交換できるような非水性液体により包囲されたＬＭＤｓ及 び／又はＧＭＤｓを用いることによって影響を与えることも可能である。水で包 囲されＩ；ＧＭＤｓ、例えば包囲する水性媒体が水性成長媒体、生理学的液体、 ヒトの体液、動物の体液、器官の潅流液、細胞懸濁液、小さい多細胞生物の懸濁 液、動物組織の均質化物、植物組織の均質化物、細胞培養培地、生物学的物質を 含む微生物のための培養培地、微生物のための規定された培養培地、血液、血漿 、尿、大脳を髄液及び腸間液を含んでいる。ＧＭＤｓを一種又は多種の水媒体又 は環境に暴露すると、ゲルマトリックスの分子濾過特性によって、大部分の化学 的化合物及び成程度の生物学的実在物はゲルマトリ７クスの水性環境中に分配す ることによってＧＭＤに入ることができる。これらは屡々拡散によって、しかし 又流動及び／又は対流によって、ＧＭＤ内に輸送され、それによりＧＭＤｓ内に 含まれる生物学的実在物を、水性媒体内の化学的化合物及び／又は小さい生物学 的実在物に暴露することができる。

かようなＧＭＤｓの場合には、本発明はＧＭＤｓが内部に移動し、水性媒体内に 移動できるようにＧＭＤｓの操作を可能とする物理力に一般的手段により、生物 学的実在物を外部的影響に影響されるような手段を提供する。こうしたＧＭＤｓ の操作は一種又は多種の外部要因に近くにある水性環境の化学的化合物がＧＭＤ ｓｉこ入ることができ、それによってＧＭＤｓ内の生物学的物質実在物と相互作 用し、こうして生物学的実在物に影響を及ぼすように、ＧＭＤｓには外側である 影響下に近くにＧＭＤｓを位置させることができる。より詳細には、この方法は Ｇ　Ｍ、　’７　ｓには外部的である影響源に少なくとも一つのＧＭＤの近くに 影響を与えるように、少なくとも一種の生物学的実在物を含むＧＭＤｓの物理的 地理を利用して生物学的実在物に外部的影響を与える一般的手段を提供する。

しかし本発明の一層大きい一般性のｌ；めに水性液体又は非水性液体のいずれか により包囲されているＭＤｓのより一般的な場合を利用して本発明の大部分を記 載することが適当である。影響の設定に続いて、ＭＤ内に含まれている生物学的 実在物の生物学的性質に及ぼす影響の効果を決定することが一般に有用である。

これは特に生物学的物質、生化学的活性、分子の生産、分子の分解、分子の分泌 、新陳代謝、膜に団結性、酵素活性及び成長のような生物学的性質に対し適切で ある。一種又は多種の生物学的源による影響を弾力的に与えるためには細胞、栄 養補給細胞、動物組織、植物組織、動物組織の均質化物、植物組織の均質化物、 細胞培養培地、潅流された器官、動物全体、植物全体、細胞懸濁液、ゲル微小滴 内の生物学的実在物、細胞培養液、体液から成る部類から源を選択することによ りこうした生物学的影響を与えることが有用である。

本文で使用されたように、生物学的影響という用語は化学的化合物及び生物学的 起源を有し、生物学的源の近くの水性環境中に存在し得る７アージのような小さ い生物学的薬剤に関連した影響を記載している。代表的な生物学的源は細胞、栄 養補給細胞、動物組織、植物組織、動物組織の均質化物、植物組織の均質化物、 細胞培養培地、潅流された器官、動物全体、植物全体、細胞懸濁液、ゲル微小滴 内の生物学的ヂ在物、細胞培養液、体液を含んでいる。化学源は水性環境に一種 又は多種の化学的化合物を与える任意の実在物を含み、従って生物学的源を含む ことができる。物理的源は水性媒体中うの物理的条件の源である任意の実在物を 含む。これらの物理的過程は水性媒体中の化学的化合物の化学１！ｌ皮を変える 、熱、電気エネルギー、磁性エネルギー、光学的エネルギー、放射能性又はイオ ン化照射、及び音響的エネルギーを含んでいる。物理的源は又ＮＤｓに熱、電気 エネルギー、磁性エネルギー、光学的エネルギー、放射能及び音響的エネルギー を与える任意の実在物を含んでいる。

一種又は多種の外部的影響源に近い、近く保持された及び離れたＭＤｓ中に生じ る特殊な処理を含むＭＤｓを処理できる本発明の方法を用いることによって、外 部的影響は小さい多細胞器官、細胞群、固体細胞、プロトプラスト、小鼻、胞子 、小器官、寄生物、ウィルス、核酸分子、抗体分子、抗原分子、及び分子の凝集 物のような生物学的実在物に及ばずことができる。動物細胞、植物細胞、昆虫細 胞、細菌細胞、酵母細胞、真菌類細胞及び糸状菌細胞、及び正常なヒト細胞、ヒ トの癌細胞、病原細菌、病原酵母、ミコプラズマ属、寄生生物、及び病原ウィル スのような細胞に影響を与えることが特に有用である。哺乳類細胞の重要な場合 には、正常なヒト細胞、ヒトの癌細胞及びバイブリドーマ細胞に影響を与えるこ とが有用である。

多数の異なった及び！雑な生化学的迂回路が含まれており、及び異なった組織が 関与する複雑な生物学的影響を与えるためには、可逆的にＭＤｓ、特にＧＭＤｓ をマウス、免疫欠損マウス、不ズミ、ウサギ、霊長類、山羊、犬、馬、豚、モル モＺト及びヒトのような全動物内に位置させることが好適である。これらは外部 的影響の重要な生物学的源であり、追加的な関連源はこうした動物からの一種又 は多種の潅流された器官を含んでいる。従って例えば生物学的物質物以外に磁性 結合力的な実在物を含むＧＭＤｓは、動物中に挿入でき、そうして複雑な生物学 的影響を与えることができる。必要に応じ、ＧＭＤｓ内の生物学的実在物はＧＭ Ｄｓのゲルマトリ／シスに適当な分子量カットオフ性を付与することにより動物 による免疫応答から保護することができる。この保護を行う代表的な手段は一種 又は多種の生物学的実在物含有領域を取り囲む最外側のゲル領域が中程度に低分 子量カットオフしたゲルを使用する複合的なＧＭＤｓを使用することである。

それ自身ＭＤｓ内Ｉこ含まれている一種又は多数の源による影響を供給すること により追加的な柔軟性を付与することができ、及びこの一般的事例ではＭＤｓに 影響を与える相対的な位置であり、重要なものは影響されたＭＤｓである。こう していずれか又は両方の型ＭＤｓを処理することができる。本発明の柔軟性は分 子の選択的通過を可能とするゲルマトリックスがあるＧＭＤｓであるＭＤｓのた めにゲル物質を提供し利用することによって増大させることができる。

一種又は多種の影響源に関して物理的にＭＤｓを処理するために、本発明の方法 は電気力、磁性力、フィールド・フロー沈降分別力、音響力、光学的圧力、重力 、沈降力、非回転性加速力、遠心力及び求心力のような物理力を提供し、及びこ うした力の発生の手段は周知であるか又は本明細書の他所に記載されている。こ うした力を一層効果的に与えるためには、一種又は多種のカップリング実在物、 又はカップリング実在物を提供することが有用であり、こうした実在物は強磁性 、反磁性、常磁性、誘電性、電気荷電性、電気泳動性、質量密度性及び光学的圧 力性から成る部類から選択されたカップリング性と共にビーズ、非生物学的粒子 、泡、及び非水性液体包含から皮る部類から選択される。、磁性的力ラグリング 実在物をＭＤｓ中に組み込むことにより磁性力を付与するこ鉄鉱から成るもので ある。

影響源の近くのＭＤ処理のｔ；めの力は、フィールド・フロー沈降分別力、音響 力、光学的圧力、重力、沈降力、非回転性加速力のような物理力が利用できるよ うに、ゲル密度と異なった質量密度を持ったカップリング実在物を組み合わせる ことにより提供することができる。

物理的影響の源の実例は、癌細胞が熱及び／又はイオン化照射の施用により殺除 されることができる、癌の処置に熱及びイオン化照射の使用を含む操作及び測定 に関する。イオン化照射の使用は癌の治療のための治療方法として充分確立され ており、高温度の使用、又は高熱は、単独で又はイオン化照射と組み合わせて最 近治療法として確立された。こうした処置において、正常細胞の死に比較して大 きい癌細胞の死は一般に増大する傾向にあることが利用されている。加熱及び／ 又はイオン化照射Ｉコ対する癌細胞の感受性及び感受性の変化の試験管内試験を 行うために、癌細胞をＧ　Ｍ　Ｄ　ｓ中に組み込むことができる。次いで高温及 び／又はイオン化照射ｊこ対する！ｈＮから成る物理的影響にｊｌＴｈＷＬ、次 いで必要ｔこ応じてインキュベートする。次いで生物学的物質の量又は生化学的 活性の変化に関してＭＤｓの測定を行う。一つ又は多数の対照に対して生物学的 物質の量を測定し、それにより物理的影響に暴露されない対照細胞の増殖に比較 して物理的影響に暴露された細胞の増殖の尺度を提供することが好適である。更 に膜の団結性を試験する染色プロトコルを使用することができる。こうして蛍光 染色沃化プロビジラム、及びＦＩＴＣジアセテートのような生存染色を用いる追 加的な又は別個な染色を生存数の短期指示体の基礎として使用することができる 。

物理的影響の供与に関する本発明の方法は生体内条件に近似する条件下で行うこ ともできる。例えば試験すべきＧＭＤｓ含有細胞を免疫無防備状態のマウスのよ うな動物の体内に入れ、次いで動物をヒトを含む動物種に３ける高熱及び／又は イオン化照射処置Ｊこ近似する条件に暴露する。これは熱及び／又はイオン化照 射に関する物理的影響の組み合わせである外部的影響を細胞に与え、及び又はこ うして処置される動物内の生化学的環境に関する外部的生物学的影響を与えるも のである。細胞に及ぼすこうしｔ；外部的影響に供与に統いて、細胞の死、細胞 の生存、細胞の成長及び生化学的活性のような測定が本発明の開示中に別に記載 された本発明の態様を用いて行うことができる。従って熱の影響に対する暴露が 行われ、癌高温治療に関する条件下で細胞の死及び細胞の成長を測定するために 利用することができる。

同様に生物学的実在物、特に正常な哺乳類細胞及び癌にかかった哺乳類細胞に及 ぼすイオン化照射の物理的影響の効果は、完全に試験管内条件で、又はＭ　Ｄ　 ｓ　ｓ特にＧＭＤｓを試験動物に、又は場合によりヒトにでも、本質的に生体内 条件下で挿入することのいずれかにより、本発明の方法に従って試験することが できる。こうして本発明は癌照射治療に関する条件下で細胞の死及び細胞の成長 を測定するために利用することができる。

本発明の方法はイオン照射及び高温療法のような物理的処置と、確立された化学 療法及び七ツクローナル抗体等に基づく最新の療法を含む化学的処置の逐次的又 は同時的組み合わせを含む癌治療の組み合わせに適用することができる。

本発明の好適な具体化において、外部的影響の一種又は多種源が哺乳類細胞、酵 母細胞及び細菌細胞から成る部類から選択される。晴乳類細胞培養基において、 培養されｔ；哺乳類細胞のような生物学的実在物は“養育（ｆｅｅｄｅｒ）細胞 ″に暴露することができる。これらの“養育細胞“はこの場合は細胞の成長を高 める化合物である影響の外部源を構成する。

更に生物学的実在物、特に細胞を全動物、特にマウス、免疫欠損マウス、ラット 、ウサギ、霊長類、山羊、犬、馬及びヒトから成る部類から選択された動物によ り供与される複雑な生化学的影響にさらすことが好適である。例えば全動物の複 雑な代謝過程は一般に細胞培養基中で複製することが一般に困難な化学的化合物 の活性化及び分解を提供することができる。こうして本発明の使用は細胞のよう な生物学的実在物を、全動物からの化学的化合物の活性化及び代謝に由来する複 雑な外部的影響に可逆的に暴露する一般的手段を提供する。

本発明の好適な具体化において、生物学的実在物は細菌細胞、酵母細胞及び哺乳 類細胞、特に正常なヒトの細胞、癌のヒトの細胞及び／）イブリドーマの部類か ら選択される。

本発明はまた外部的影響が微小滴中に組み込まれ、それにより影響源が影響され る他のＭＤｓ内にある生物学的実在物に関して、源の位置を変えること番こより 処理できる生物学的実在物に影響する手段を提供する変法として使用することが できる。この一般例においては、異なる種類の力、例えば磁性力が影響するＭＤ ｓと共に使用され、同時に他の力、例えばＭＤｓの質量密度に依存する力が影響 するＭＤｓと共に使用される。最後に関連する具体化において、影響するＭＤｓ 源をＭＤｓ中に組み込むことができ、及びＭＤｓ中に含まれていない生物学的実 在物に及ぼす影響を与えるように得られるＭＤｓを処理することができる。例え ば養育細胞がＧＭＤｓにない培養細胞の近くに位置することができるように、及 び任意の所望のインキュベーンコン後に、ＧＭＤｓ含有養育細胞が容易に除去で きるように、養育細胞を磁鉄鉱のような磁性力カップリング実在物と共に備えて いるＧＭＤｓ中に組み込むことができる。

非水性液体により包囲されたＭＤｓの処理に適した力が本明細書に外に記載され ている。水性液体により包囲されているＧＭＤｓをて誘導し、ＧＭＤｓを影響源 に近接して保持し、そして影響源の近くからＧＭＤｓを除去するするｔ；めに任 意の種類の物理的力を使用することができる。

一般に物理力は前記部類から選択される。

電気力は電場のグラジェントを持った電場を含む印加電場とＧＭＤｓのゲルマト リックス内にある誘電粒子との相互作用により、又は一層一般的に電化群とＧＭ Ｄｓ内にあるゲルマトリックス又はカップリング実在物との相互作用により提供 できる。重力、非回転力、又は遠心力及び沈降力が総て周囲の水性媒体よりも異 なる質量密度を有し、対応する物理力場又は加速を与えるゲルマトリックス組成 物を利用することにより用いることができる。磁力はＧＭＤｓ内にカップリング 実在物を与えることにより適用することができる。該カップリング実在物はＧＭ Ｄｓを包囲する水性媒体と異なる反磁性、常磁性又は強磁性的性質を有している 。磁力を応用するための代表的なカップリング実在物は磁性粒子、磁性顆粒、７ エロフルイド（ｆｅｒｒｏｆ　Ｉｕｉｄ）含有物等である。好適な具体化はＧＭ Ｄｓ内の磁鉄鉱（Ｆｅｔｏｔ）を含む。他方、磁力を直接にＧＭＤｓの反磁性、 常磁性又は強磁性又は電気伝導性性質がＧＭＤｓを包囲する水性媒体の反磁性、 常磁性又は強磁性又は電気伝導性性質と異なるような事例にかけることもできる 。ＧＭＤｓのゲルマトリックスと、又はカップリング実在物の含有がＧＭＤｓを 包囲する水性媒体と異なる質量密度又は異なる機械的コンプライアンスを有する ＧＭＤｓをもたらすように、ＧＭＤｓ内に含まれるカップリング実在物と選択的 に相互作用する音響又は音響場をかけることにより音響場を適用することができ る。光学的圧力はゲルマトリックス又はＧＭＤｓ内に含まれるカップリング実在 物又はＧＭＤｓ内に含まれる大きいカップリング実在物と相互作用する光学的照 射を利用することによりかけることができる（例えば＾５ｈｋｉｎ等、Ｎａｔｕ ｒｅ　３３０ニア６９−７７１．１９７８参照）。沈降フィールド−７０−分別 力は水力学的力と沈降力を同時に利用することにより（例えば、Ｌｅｖｙ及びＦ ｏｘ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｌａｂ、６：１４−２１，１９８８）参照）、及びＧ ＭＤｓを分離するために使用できる。

一種又は多種の化合物に一回又は多数回暴露後、及び対照を用い又は用いずにに 一回又は多数回インキュベーションに続いてＭＤｓ、即ちＬＭＤｓ及びＧＭＤｓ は一回又は多数回染色工程に暴露される。該工程は本出願中に外に記載されてい るが、そこでも述べたように、自然に発生する信号が適当であれば、染色工程は 省くことができる。

適当な染色のＧＭＤｓを暴露後、一つの詳に一つ以上のＣを含むＧＭＤを発見す る確立は少ないなら、個々のＧＭＤｓは個々に、又は小さい群に分けて測定され る。蛍光化合物により染色されたＣの代表的場合には、ＧＭＤの性質及び該ＧＭ Ｄを有する細胞の同時的又は連続的測定が可能であるようｔこ、ＧＭＤ性質の測 定の任意の検出のために使用されるのと充分に異なる波長帯を用いてデジタル式 蛍光顕微鏡又は７０一式細胞計のような光学的分析法が個々のＧＭＤｓを分析す るために使用される。関連する蛍光信号は慣用の手段で得られ、必要に応じスペ クトルの重複について補正される。

多くの溶液および懸濁液は、Ｌ　Ｂ　Ｓ　Ｍ　ｓおよび分析物の実在物が存在し ない場合、ＬＢＳＭｓおよび分析物の実在物を溶液および懸濁液内にランダムに 分布させる。ここで使用するとき、用語存在しないは、ＬＢＳＭｓおよび分析物 の実在物が結合せず、そしてＬＢＳＭｓの分析物実在物への結合の不存在を包含 する。ＭＤｓの形成がＭＤｓを形成する溶液または懸濁液を小さい体積にランダ ムに分割する一般の場合において、ＭＤｓを占有する結合しないまたは存在しな いＬＢＳＭｓの確率はボア、。

ソンの式によりよく記載される。　さらに詳しくは、結合しないＬＢＳＭｓがラ ンダムに分布する場合、ＭＤｓ中の正確にｎｐの結合しないＬＢ　Ｓ　Ｍ　ｓを 発見する確率は、 であり、ここで平均の占有はｎ、であり、ｎｖ＝Ｖｈａｏρ１、ここでｖｔｉｏ は微小滴の体積であり、そしてρＦは、Ｎｌ２異なる結合部位（例えば、エピト ープ）を利用する一般の場合における、すべての存在しないまたは結合しない特 異的結合の分子であり、Ｎ　Ｂ１１の異なるＬＢＳＭｓは同一濃度において使用 し、したがって分析物実在物をもたないＭＤ中の結合しない標識のはＮｇｓρ、 である。

同様に、ランダムに分布した分析物実在物それゆえ　／ＴＬｓ　−’１１５ρヶ 　、ここでＶ藺りは微小滴の体積であり、核酸ρ６、は分析物の濃度である。可 変のｎＡｆｉはよく混合した系についてランダムであり、したがってｎ、に対し て独立である。

町定可箆２パル０）づ１え１ユ、１７１２代度つ余、朽マ・心びマ　メる）≦１ し１〜纜秩箸−←−ｒ、Ｑｓ。

イル１叉よ、？、　７＜／Ｌ１つ　Ｊ掟号ｊ１り　４シカＬ／−彩醪Ｓで５χ） ◇ぐ乙は、＝ｌｉギσン１鷲名〉／ン　、　仕、ｐ勾Ｇｊ、ｊ７〈め又４免、ｇ ６／Ｚ／１ｆ＝１）Ｑ　　”Ｚ７Ｌ’ＺＤｔ”７７＝’閂定ＬＩＤ　Ｙ／Ｊ　　 ？　（７Ｃ’　７コーー、７ず〃リグ携４Ｃｈ６ｊ辱、　　（、／；Ｊ”（−７ ）”乏と二ＺＬｂ”　Ｊ＜　ｊｆＱ；４’、７’　−Ｚ。

へ・−、−リ、　　−Ｑｔ’１７（べづ悠用夕姑っ之べＯっｃｖ＜−’；ｐｉｔ 、　　　−７；／：＜ｆＪ９／−Ｊ）−，５ｗｔ（、−ッ％ｉＬ　　ＬＥ＆／” ７ｓ回体炙め／″１り１膳ぶ〃シ優こと／ｌ；−１了　リ＼か＜１５Ｓと〆汁に 叡”　　　７４１（、，７４Ｑ　ｆ　　、、％、ｓ　　”）／、ニア２　　、　 −１：Ｅｊ）ｉ；ｙ）ノＺ、一般的には必要ではないが、ＬＳＢＭと分析物実在 物との反応後に追加段階を実施することがしばしば好適である。この追加段階は 、遊離しＳＢＭの濃度を減少させて、ＬＳＢＭ−分析物の濃度に関する遊離ＬＳ ＢＭの濃度をＭＤの生成前に減少させることからなっている。この方法では、比 較的高い濃度のＬＳＢＭを最初に使用してＬＳＢＭ−分析物実在的錯体を生成す る特異的結合反応をさらに急速に誘導することができる。

ＬＳＢＭを試料溶液または懸濁液に添加し、混合し、そして次に培養して、その 期間中にＬＳＢＭを分析物実在物に結合させた後に、残存している未結合のＬＳ ＢＭすなわち遊離ＬＳＢＭの濃度を減少させることがしばしば好ましい。これは 、遊離ＬＳＢＭが流動性実在物に遭遇しそして結合するような方法で流動性実在 物を加えるという追加段階により実施できる。適当な流動性実在物には、ビーズ 、非−生物学的粒子、結晶、非−水性流体包含物質、生存細胞、死滅細胞、不活 性細胞、ウィルス、胞子、プロトプラストおよび小胞が包含され、それは標識の ついた特異的結合用分子と密に結合可能な密に結合した分子を有する表面を有し ている。流動性実在物を区別するための１個以上の別の信号（例えば光拡散、蛍 光）の使用により、流動性実在物と組み合わされた標識信号は測定値の分析中に 無視することができる。一方、流動性実在物が分析物より相当多数の標識を結合 させる場合には、測定値の分析はそのような比較的多数の標識を区別することが でき、そしてそのような８Ｎ識をＬＳＢＭ−分析物錯体と組み合わされた標識と 混同させることはない。

本発明の方法の一般的な利点は、ＬＳＢＭ＝分析物錆分析物変体情報源であるた め、ＬＳＢＭの濃度を正確に知る必要がないことである。特に、供給されるＬＳ ＢＭの濃度は容易ｌ二わかるが、分析物との反応および結合後の濃度は一般的に わからない。これは流動性実在物の使用によってさらにわからなくなる。しかし ながら、測定値に正確さを与えるためには標識の濃度を知ることがしばしば望ま しい。本発明の利点は、しばしばかなり異なる量であるＶＭＤの中の多数のＭＤ を用いて標識の発生周波数を測定するため、そのような発生周波数をその後の分 析でρ、ｓ■のコンピューター処理できることである。

ＶＭＤからＶＭｏ＋ΔＶｏゎの容量範囲を有するＭＤを、試料をＬＳＢＭに暴露 しそして希望により浄化用実在物を添加するという次の段階に従いコノ範囲がｉ ’ｉ、−０，１５、；　Ａ　、−０、１５オヨＵ　Ｎ　ｍ　−−２ニョリＭ　定 すれるように考えることにより、本発明の詳細な説明する。この場合には、ポア ッソン式は下記の確率を予測する。

ｎｐ　　Ｐ（ｎ、Ｆｉｒ−０，１５）　　　ｎ、、　　Ｐ（ｎ、、Ｆｉ、、−０ −１５）０　０．８６０７　　　　　　　０　　０．８６０７１　０．１２９１ 　　　　　　　１　　０．１２９１２　０．００９６８　　　　　　２　　０． ００９６８３　０．０００４８４　　　　　　３　　０．０００４８４この説明 では０個の分析物を有するＭＤは約０．００９７の確率でＬＳＢＭによる不規則 的占有により２個の標識を有し、そして同じ容量のＭＤは０．１２９１の確率で １個の分析物実在物による占有による２債の標識を有する。２個の遊離ＬＳＢＭ による不規則的占有と比べて過剰なＬＳＢＭ−分析物占有から生じる２個の標識 の確率は、ＡＰ　−Ｐ（／ＩＡ、！２−ＸＡＡ−０．１５）−Ｐ（ｎ（−２５ｙ ｄ、１ｆ）　−０，１１９（１１）である。

従って、充分大量の占有されたＭＤが測定されるなら、ｎｒ”ＯＨよびｎｐ−１ の測定された発生周波数を基にした発生周波数における測定値と予測値との間の 相当する差異を測定することにより確率における差異を測定できる。

この説明を続けると、ｎｐ−０、ｎＦ−１８よびｎｙ−２に関するポアッソン確 率は ＰＣｎｒ−Ｘｒ＞　ｗ　ｅ”　　　　　　　　　　　　（１２）Ｐ（ｎｒ−ＩＸ ｒ）　−Ｔｔ”　　　　　　　　　　　（１３）従って、不規則的占有から生じ る２個の標識の測定確率は、式により、０個の不規則的発生標識の測定確率およ び１個の不規則的発生標識を測定確率に関連している。

不規則的に発生する標識の平均占育率は数学的関係式から得られる。

ｎｐ−０、ｎｐ−１およびｎｙ−２の実験的に測定された発生周波数を、ポアッ ソン確率を用いる計算により得られた確率と、定量的に比較することができる。

特に、実験的に測定された発生周波数ｆ（ｎｐ）およびポアッソン式を使用して 、発生周波数の測定値と不規則発生周波数の理論値との間の差異を計算する。絖 計学的に意義あるなら、これを使用して、この差異を分析物とＮＮ１５ＬＳＢと の錯体を用いるＭＤの発生に関して解釈することができる。これは、発生周波数 を測定しそして次にまず不規則的発生に伴う平均値ｎ、すなわち を計算しそして次にこれを差異の計算 において使用することにより、行われる。

この測定された差異は、分析物の濃度を計算するために、容量範囲△ＶＭＤ中の 測定されたＭＤの合計容量と共に使用される。より特に、［ここでＮＭＤは容量 範囲ＶＭ＋、からＶＭＤ＋△ＶＭＤ内で測定される］。

この説明をさらに統けると、分析物濃度１’Ａ−はから計算され、そしてそれに より分析物濃度の希望する測定結果が得られる。

この説明をさらに続けると、Ｉ’Ａ−の測定における誤差は公知の誤差分析方法 を使用することにより推定できる。上記で示されている如く、ρ４．の測定は測 定される発生周波数および測定されるＭＤ容量に依存し。

でいる。従って、ＰＡ、の測定における誤差は公知の誤差伝播方法を用いて、本 発明の方法の全体的な結果がρ□の測定値となりそして測定誤差の確定値ともな るように、計算することができる。

より一般的には、本発明の方法はＭＤ中での発生周波数の測定値およびＭＤの測 定値も利用しており、標識によるＭＤの不規則的占有と標識によるＭＤの非−不 規則的占有との間の比較を行うことができる。遊離標識による平均的占有値、ｎ ２、が０より小さい場合に使用できる一般的一方法は、略語Ｐ　（ｎ）三Ｐ（ｎ 、ｎ）と共に使用されているポアッソン式に関する数学的循環関係を利用してお り、その結果、循環式はであり、平均するど不規則的な場合の発生周波数の測定 値はに関連しており、そして広範囲の占有値にわたり標識によるＭＤの占有に関 する不規則性と比べた過剰量を計算するために直接使用出来る。

発生周波数においてかなりの測定誤差δｆ（ｎＪが予測される場合には、ＭＤ測 定値の統計学的分析のための別法を使用できる。この別法は、誤差を減少させる 公知の平均化方法を利用している。遊離ＬＳＢＭの発生とＭＤ中の分析物実在物 は統計学的に独立しているｔ；め、ｎＦ遊離標識すなわち遊離ＬＳＢＭとｎＡ１ 分析物実在物の特定の組み合わせが標識の合計量または数を有する確率はｎＬ− ｎ、＋Ｎ□ｎＡ＋である。このことはｎ、とｎＡｉの異なる組み合わせが同じｎ 、を生じ得ることを強調しており、そして一定のｎＬ値の確率を計算するために は同じｎＬを与える異なる確率にわたる合計が必要であることを示している。

この方式の基本的性質は、ｎＬがｎＬとｎＡｓの線状の組み合わせであること並 びにその結果として０．に関する確率関数はＰｒ（ｎｐ、ｎｙ）およびＰＡ＋（ ｎＡｓ、ｎＡｉ）の回旋により与えられることの認識である。従って、基本的な 確率理論の公知の結果を用いると、平均値ｎＬｓｎＦおよびｎＡｍは、 Ｔｔ　＝　％　”ＮｗＴａａ　　　　　　　　　　　　　　　（２３）により関 連しており、そしてこれらの同じ３種の因数の変動はｖｔ１！（ｎＬ）　＝　ｖ ａｒｃｎｒ）＋ＮＡ響（ｎｙ）　　　　　　　　　　　（２４）により関連して おり、ここで変動とは予測される輻または誤差の測定値である。上記の２種の数 学的関係並びにｎＬおよびｖａｒ（ｎＬ）を確定するための発生周波数の測定を 使用することにより、因数ｎＡ＋を計算できる。

この計算された値をＶＭＩ、の測定値と共にポアッソン統計式で使用してρ９． を計算する。

平均および変動における統計学的誤差は基本的な確率理論に従い同定することが でき、そして誤差伝播分析と共に使用してρ□における誤差を計算できる。

標識のついたモノクローナルおよびポリクローナル抗体を本発明におけるＬＳＢ Ｍとして使用することができる。モノクローナル抗体を使用する場合には、Ｎｏ は１個のＬＳＢＭ当たりの平均数として正確に知られている。［７かしながら、 ＬＳＢＭがポリクローナル抗体である関連ケースでは、幾分具なる数の抗体が個 々の分析物実在物に種々の程度で結合しているからもしれない。しかしながら、 そのような異なる数による結合は一般的には結合位置の平均数、Ｎｍ５ｓにより 同定することができる。結合されたＬＳＢＭの寅際数に８いて幾分変動があるか もしれないことすなわぢＮ、ｊ＝Ｎ、、±Ｌｓ付近の１ｔＮｓｓという分布があ るかもしれないことが認識されているため、Ｎ、ｓの値は最初の目盛りつけ実験 から決められる。この場合、発生周波数の測定値は（１）遊離標識に関するポア ッソン式と一致する不規則的分布および（２）幅δＮ６．を有するＮ□に位置す るピーク付き分布の重複が生じる。

ヌ□およびδＮ８５の両者が最初に目盛りつけ方法で測定されるため、一般的な 計算方式を発生周波数およびＭＤ容量の測定値と共に利用することができる。次 に発生周波数測定値を公知の計算手段により自己矛盾なしに比較して、一般的な 確率分布とする。これは遊離標識および平均分析物が結合されたＮ、、標識を有 する分析物に関するポアッソン関数の線状重複を含んでいる。特に、測定された 分布はＰ　ＣＬ＞１．＝　Ｐｒ（ｎｒＸｒ＞”ＮｊｆＰＡ、（ｎＡａＸａｍ）　 　　　　　　　　　（２５）と合致している。

ポアッソン式Ｐｖの引き算により、ＰＡ、が測定される。ｎＡｓの値は副次的に 結合されたＰから得られ、そして使用されたＭＤ容量の範囲にわたるＶＭＤと組 み合わされて希望する分析物濃度／’Ａ−を与える。

この方法をさらに、分析物の生物学的実在物が３種の非交差反応性抗体分子が仮 定されている３種の顕著な非重複エピトープを有する高分子であるケースにより 、説明する。３種の抗体分子のそれぞれを最大の予測分析物濃度のほぼ１０倍に 等しい濃度で供給することが好適である。

すなわち、最大予測分析物濃度がρＡ、−１ｏ−モル付近である場合には、３種 の抗体のそれぞれは約１０−’モルの濃度で供給される。試料に対する３種の抗 体の添加後に、生成した調合物を混合し、そして約１０秒間〜３Ｆ１９間、好適 には約２分間〜約２０分間、の培養時間が使用される。

これにより拡散遭遇および抗体が分析物に結合する機会が生じる。この特定結合 用の培養の後に、試薬またはゲル化可能物質を希望により加える。生成した調合 物を混合し、そしてこの開示中のどこかに記されている数種の方法のどれかによ り、好適には非−水性流体中への分散により、ＭＤを生成する。一般的には、特 定結合された標識と不規則的に分布した標識に関する確率との差異が最大である ような小さいＭＤを測定することが好適である。すなわち、差異 が、不規則的発生の確率と比較されたＭＤ内のＮ□標識の高度に起こりそうもな い組み合わせによる分析物の測定用の確率的基礎である。

分析物をＬＢＳＭＩ：Ｊｌ露した後の平衡状態または平衡状態付近を使用するこ とにより本発明の方法を実施することが好適であるが、平衡から離れた状態を使 用することもできる。非−平衡の場合には、分析物を含有している試料をＬ　Ｂ 　Ｓ　Ｍに対して平衡用または平衡付近用に必要な時間より相当短い時間にわた り暴露することができ、そして分析物およびＮａｓＬＳＢＭの比較的不完全な錯 体が生成する。すなわち、Ｎ、、Ｌ　Ｓ　ＢＭとの不正確な錯体が生成するだけ でなく、１個の分析物実在物に対して少ないＮ□ＬＳＢＭが結合されているさら に不完全な錯体も生成する。

これらの望ましくない寄与にもかかわらず、その他は同じ非−平衡状態で既知の 分析物濃度を使用する１回以上の目盛りつけ測定と定量的に比較するという別の 段階Ｉこより、非−平衡測定を実施することができる本発明の測定方法は、分析 物分子を夾際に数えることができるため、非常に低濃度の分析物分子に適用する ことができる。さらに、洗浄しなければならない固体相を使用せずに溶液中で測 定を実施することができる。さらに、測定方法が計数工程を含むことができるた め、本発明は高濃度から数桁低い濃度までの大変広い範囲の分析物濃度にわたる 測定手段を提供するものである。

本発明の方法を実施する前に、分析物上の２個以上の結合位置に結合可能な２個 以上の標識のついた特異的結合用分子を製造する当技術で公知の手段を用いて２ 個以上の特異的結合用分子を得る。ＬＳＢＭが抗体であるという重要なケースで は、この条件は少なくとも２個の抗体が同時にしかも特異的に分析物と結合でき るように分析物上で少なくとも２個の非−重複エピトープと結合する抗体を使用 することに相当している。

そのような標識のついた特異的結合用分子の例には、（ａ）１個の抗原実在物に 結合されている約１個の標識分子を有するモノクローナル抗体、（ｂ）１個の抗 原実在物に結合されている約１個の標識分子を有する抗原分子、（Ｃ）１個の抗 原実在物に結合されている約２個の標識分子を有するモノクローナル抗体、（ｄ ）１個の抗Ｗ実在物に結合されている同じ型の約２個の標識分子を有する抗原分 子、および（ｅ）分析物実在物の少なくとも２個の非−重複エピトープと結合可 能な少なくとも２個の抗体を含有しているポリクローナル抗体が包含される。

本発明の方法により、多種の型の実在物を測定することができる。特に、非−重 複性でありモして非−競合性の少なくとも２個の特異的結合位置を有する分析物 実在物を測定することができる４、抗原に対するＬＳＢＭが標識つき抗体である 抗原からなっている重要な一般的な種類の分析物実在物では、２個以上の異なる 位置で独立して結合できる抗原性分析物実在物を測定することができる。２個の そのような位置を有する分析物実在物の例には、例えばクリアチンキナーゼおよ びｈＣＧ（人間のコリオン性ゴナトドロフィン）の如きサンドイッチ検定により 検定可能な全ての抗原が包含される。３個のそのような位置を有する分析物実在 物の例には、プロインシュリンおよびＴＳＨ（チロトロピン）のβ−副単位が包 含される。例えばハプテン類の如き小さい分子の場合には、２個以上の特異的結 合用位置を有する検定しようとする分析物実在物はノ１グテンー単体分子錯体か らなっていてよい。

一方、分析物実在物が複数発生性の１個以上の結合位置を有する場合には、同一 または異なる標識つきのＬＳＢＭを使用してそれぞれの分析物実在物に複数回結 合させることができる。例えば、抗原性重合体は１個以上の複数エピトープを有 することができて、同一抗体が重合体上の複数の位置で特異的に結合できるため 、そのような抗体を本発明の方法で使用することができる。この説明を続けると 、１個以上の標識のついた抗体分子の形状の１個以上の標識のついた特異的結合 用分子を該抗体分子が重合体上の２個以上の特異的結合用位置で繰り返して結合 できるように分析物溶液または試料に暴露し、それにより、２個以上の標識のつ いた特異的結合用分子をそれぞれの分析物分子と組み合わせる。繰り返される結 合位置を有する他の分析物には、細胞およびウィルスが包含される。

本発明の一般的実施においては、例えば細胞、オルガネル、ウィルス、核酸、抗 体、酵素、構造的蛋白質、ホルモンおよび薬品の如き分析物実在物を分析物試料 を製造するための標準的な公知の方法のいずれかにより、液体溶液または液体懸 濁液状にする。生成しｌ二分析物調合物を次Ｃ；、混合しそして拡散が始まるの を待つｔ：後にそれぞれの分析物実在物１こ少なくとも２個のＬＳＢＭが結合で きる確率が高くなるようにして、標識のついた特異的結合用分子に暴露し、それ により、少なくとも２（１ｔのＬＳＢＭを含有している分析物実在物−鏝体を生 成する。第二に、この反応しｊ；調合物の一部または全部を次に使用して、１個 の分析物実在物−ＬＳＢＭ錯体により少なくとも１個のＭＤ、そして好適には少 なくとも１０３個のＭＤ、が個別的に占有される確率が高くなるようなＭＤを製 造する。第三に、少なくとも１個のＬＳＢＭを測定可能な測定手段を好適に利用 して、例えばポアッソン統計式の如き統計的分析法を使用することによりＬ　Ｓ 　Ｂ　Ｍによる占有およびＭＤの付随容量を測定できるような方法で、ＭＤおよ びＭＤの容量を測定する。次にコンピューターを使用して単独発生したＬＳＢＭ および複数発生したＬＳＢＭＩ：関するＬＳＢＭの測定された発生周波数を比較 することができ、その結果として、不規則的発生によるものより過剰な複数発生 は分析物実在物ｌこ対するＬＳＢＭの特異的結合によるものである。そのような 不規則的発生を越えた数を次を二統計学的分析法と共に使用して、結合されたＬ ＳＢＭを有する分析物実在物の数を計算ぼる。これを分析されたＭＤの容量と組 み合わせて、ＭＤを製造元である調合物中での容量当たりの分析物実在物の数を 与え、その容量当たりの数が分析物実在物の濃度である。

この方法の他の変法では、測定手段はＮｍ５ｌｌ識を測定できると１１うことだ けが必要であり、その理由はＭＤ内の遊離標識の発生がｎｐ＜Ｎ□に従う限りこ の測定で充分であるからである。

本発明で使用するのに適しているＬＳＢＭ用の標識には、酵素活性、生物学的活 性および蛍光が包含される。大量の蛍光性分子が存在している時には蛍光を容易 に測定することができるが、比較的少量の場合にはそれは次第に困難になり始め る。従って、本発明の検出限度はサイトメーター中で測定される蛍光に関しては 約１０３個の分子であるが、例えば定量的蛍光ｌｉ徽鏡の如き測定装置に関して はそれより低い。基本的限度は光損傷が生じる前ｔこ発する蛍光発生光子の数に 関連するようであるが、例えばフィコエリスリンの如き側々の蛍光性分子を測定 することもできる（マチス（ｍａｔｈｉｅｓ）他、フルオレッセンス・イン・ザ ・バイオメディカル°サイエンス（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　 Ｂｉｏ＋１ｅｄｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）、リス（Ｌｉｓｓ）、１２９−１ ４０頁、１９８６参照）。従って、分析物分子が数個の標識のついた特異的結合 用分子と特異的に結合している単独または複数の標識のついた特異的結合用試薬 を基にしｔ；測定を実行することができる。例えば、平均して３個の蛍光性標識 を３個の抗体のそれぞれに付着させることにより、９個の蛍光性標識分子がそれ ぞれ反応した分析物分子と組み合うこととなる。これらは、個々の蛍光性分子の 測定に向いている方法により容易に測定することができる。

しかしながら、一般的には蛍光性標識の測定と組み合わされる蛍光性信号の量は はるかに小さい。この理由のために本発明の好適な態様では、分析物の活性が小 胞、７アージまたは生化学的活性と関連しているような活性標識が使用される。

少なくとも１種の酵素標識が例えば光拡散、光吸収または比色計、蛍光、時間遅 延性蛍光、燐光村よび化学蛍光、特に蛍光、の使用により測定されるような１種 以上の活性酵素を利用することが好適である。下記の記載の多くでは、本発明は 酵素標識に関して記されており、ここでは少なくとも１種の型の酵素分子の活性 が標識の測定基礎となっておりそしてそれは一般的には巨視的ケースまたは非− 微小滴ケースでの使用に関しては公知である。そのような酵素活性測定は、酵素 を含有しているＭＤ内に１種以上の酵素触媒反応の蛍光性生成物を集めることに より一般的に実施され、そして一般的には蛍光性生成物まｊ：は蛍光性生成物類 を集めることのできる培養期間が必要である。

酵素に関するターンオーバー数ｌ；等しい速度である最大反応速度で酵素触媒反 応が進行できるような条件下で基質、コファクターなどが供されるという運動力 学的分析用の条件を与えることが好適である。これらの条件下では、生成物の抑 制、基質の消耗、または他の公知の酵素反応影響が生じるまでは生成物の集積は 時間に比例して起きる。一般的には、分析物実在物により占有されていないかま たは個別的に占有されているすなわち２個より少ない分析物実在物を含有してい る高い確率を有するＭＤの測定を使用することが好ましい。

対応する酵素触媒反応の１種以上の反応物を測定することにより１種以上の酵素 標識が測定されるような酵素活性測定法を直接使用する他に、酵素チャンネル生 成および７７′または酵素循環の使用ｌこより比較的大きい信号が一般的に得ら れ、こｔ′Ｌらの両方の方法はかさの大きい溶液用途用には良く確立されている が個々のまたは少数の酵素分子を測定するためのＭＤ中での使用に関してはこれ までに示唆または指示されでいない。

酵素チャンネル生成すなわち連動された酵素反応の使用は、例えば第一の酵素触 媒反応の生成物が第二の酵素触媒反応用の基質として作用し、そして第二の酵素 触媒反応の生成物が第一用の基質として作用し、それが続くことからなっている 。同様に、確立された酵素循環方法は、第一の酵素触媒反応の生成物が第二の酵 素触媒反応用の基質またはコファクターとなり、そして第二の反応の生成物が再 び第−用の基質となるような循環反応工程の使用により酵素標識を拡大測定する （例えば、シドル（Ｓｉｄｄｌｅ）、アルタ不−ティグ・イミュノアツセイズ（ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　Ｉｍｍｕｎｏａ、ｓｓａ、ｙｓ）、コリンズ（Ｃｏｆ ｆｉｎｓ）　（編集）、ウィリー、１９８５参照）。

各場合とも、大量の反応生成物がＭＤ中で得られる。本発明のこの変法を利用す るためには、別の酵素、基質、コファクターなどを、もし存在していないなら、 試料中に供給して、これらの別の酵素反応反応物および酵素が各ＭＤ中に確実に 存在しているようにする。

分析を希望する特定の分析物分子を含有している試料を例えば組織の均質化、撹 拌、溶解などの如き多数の公知の手段のいずれかにより水溶液または水性懸濁液 状にすることができる。

水溶液または水性懸濁液状の試料を生成するための上記の処理中または処理後に 、酵素標識のついた特異的結合用分子を試料に加えそして充分混合する。酵素標 識のついた特異的結合用分子は分析物分子の予測される最大量を基にした充分量 で提供されるため、分析物実在物の本質的に全てが反応し、そしてそれにより約 １０秒間〜３時間内に、そしてより最適な条件下では約２分間〜２０分間内に、 酵素標識のついた特異的結合用分子と結合する。

酵素触媒反応用の基質および／またはコファクターを前段階で加えることもでき るが、酵素生成物の生成量を最少にするためにはこれらの反応物を液体またはゲ ル微小滴の生成１前に加えることが好ましく、その理由は酵素生成物は本質的に 全ての液体またはゲル微小連中Ｉ；分布してしまいそして全ての液体またはゲル 微小滴中での望ましくない高い背景蛍光信号を生じるからである。

ＬＳＢＭを用いておよび用いないでＭＤの容量を測定するためには種々の方法を 使用できる。ある種の背景の発生、すなわち本質的に全ての液体まｊ；はゲル微 小滴中に均一に存在している蛍光は、そのような背景が微小滴容量の測定手段を 提供するために、ある場合には望ましい。この場合には、全てのＭＤは低水準の 蛍光を有しているが、未反応のＬＳＢＭまたは反応して分析物実在物と結合して いるＬＳＢＭを含有してし）るＭＤは増加した蛍光を有する。これは１種以上の 蛍光性生成物を有する反応に触媒作用を与える酵素標識と組み合わされるか、ま たは蛍光を増加させる１種以上の反応と連結させられる。

多くの測定方法では、個々のＭＤを測定することまたはＭＤ群を測定することが 可能であり、例えば比較的少ないＭＤが分析物実在物により占有されている場合 のように分析物実在物の試料濃度が低い場合にはしばしば後者が好ましい。下記 の章では、量Ｖ　ｇ　ｔ　＋　ｒ　ｐは一緒に測定されるＭＤ群の合計量であり 、そしてＭＤ群はｌ−１−１Ｏ０の、好適には１〜ＩＯＭＤの、範囲内のＭＤ数 を含有できる。

それぞれの分析されたＭＤ群に関するＶ　Ｊ　ｌ　＋　＋＋　ｅの検出および測 定用の１種以上の反応からの背景蛍光を利用するための変法として、１個以上の 蛍光性分子をＭＤの生成前に溶液または懸濁液中に低濃度で供給することもでき る。この背景濃度は、分析で使用される最大のＭＤ群の嚢内で１個以上の酵素分 子により生じる蛍光とは異なる最大のＭＤ群内の量に相当するように選択される 。

別の変法としては、ＭＤ群内での酵素アッセイで使用されたものとは異なる蛍光 性を有する蛍光性分子型を使用して各ＭＤ群のＶ　Ｋ　ｒ　＋　＋　ｐの検出お よび測定をすることができる。これは多数の個々のＭＤ群からの測定データのそ の後の数学的処理に有用である。

次に水溶液／懸濁液状の試料を使用して、この開示中のどこかに記されている数 種の方法のいずれかによりＬＭＤまたはＧＭＤを生成する。

好適な方法は寒天、トレーサー実在物、酵素アッセイ用試薬などを加えそして生 成した溶液／懸濁液を鉱油またはンリコーン流体中に分散させる。

次に生成したＭＤ調合物を培養させて酵素触媒反応（類）を進行させて、蛍光性 生成物（類）が酵素標識のついた特異的結合用分子を含有しているこれらのＭＤ 中に好適に集積させる。光学的測定装置の能力および使用する酵素（類）のター ンオーバー数によるが、培養時間は約３０分間以下から数時間までである。

寄与する酵素および測定装置は種々に選択される。しかしながら、これらの全て は個々の酵素分子の活性が測定される条件にかけられ、すなわちこの比較的多数 がそれぞれの分析物占有ＭＤ基内で測定される酵素標識のついた特異的結合用分 子により個々の分析物実在物を結合するにに充分な多数の酵素と結合される。酵 素の望ましい性質には、高いターンオーバー数、安定性、および特異性が包含さ れる。

培養期間後に、ＭＤ基の一部または全部が好適には治療的像分析能力を存する装 置を使用して光学的に測定される。代表的な適当な装置には、流動サイトメ）　 ＩＪ−装置、流動通過微量蛍光計装置、光学的粒子分析装置、蛍光！Ｉ微鏡装置 、先願微鏡装置、像分析装置およびビデオ記録装置が包含される。

１個以上の酵素分子の検出および測定の重要面は先行技術では明白１；記載また は議論されていなかったＣロットマン（Ｒｏｔ＋ｎａｎ）、　Ｐ　Ｎ　Ａ　Ｓ　 ｓ　　４７：１９８１−１９９１．１９６１参照）。特に、蛍光発生の自然発生 速度が少量中えの単一酵素分子の触媒効果が蛍光発生の自然発生速度のために一 般的には時間につむて増加する背景に対して区ＥＴＩがつくのに充分小さいとい う条件を使用することが重要であるとは開示されていない。

そのような自然発生速度は一般的にフルオゲン性基質に関して生じ、ここでは非 −蛍光性のフルオゲン性基質は自然発生的に腐食し、そして酵素触媒反応と同じ 蛍光性分子を生成する。ｔ）なりの自然発生蛍光を避けるための方法は一般的に 認識されていないか、または明白は知られてもいない。従って、自然発生蛍光を 最少にするために適している方法を本発明の一部として記載する。

一般的な一方法は、アンセイ条件下でフルオゲン性基質が１種以上の酵素分子に より触媒作用を受ける生成物分子のために蛍光が検出可能になるのに充分少量の 蛍光を生じるような酵素触媒反応を決めそして次に利用することであり、この方 式では、酵素標識のついた特定的結合用分子を含有している量、Ｖ　ｇ　ｌ　Ｔ 　、Ｐ、を考えることが基礎である。蛍光集積の自然発生速度はＶ　ｊ　＋　Ｔ 　＋　ｐに比例しているが、酵素触媒速ごはＶ　Ｋ　Ｌ　＊　＋　、とけ概略に ８いて独立している。

個々のＭＤまｔ：はＭＤ群からの蛍光発生量を自動的に測定可能な像分析能力を 有する定量的蛍光顕微鏡を使用することが好適である。一方、１個の酵素分子に よるＭＤ中の集積生成物と組み合わされた蛍光を検出することができそして背景 蛍光と区別できるような低水準の蛍光を測定可能な流動サイトメーターも使用す ることができる。例えば１０４〜１０’個の蛍光性分子の検出が可能な光学的測 定装置が公知である（例えば、シャピロ（ｓｈａｐｉ　１０）％　プラクティカ ル・フロー・サイトメトリー（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｕｔｏｍｅ ｔｒｙ）、リス（Ｌｉｓｓ）、ニューヨーク、１９８５参照）。

例えばβ−ガラリシダーゼの如き酵素をフルオゲン性基質であるフルオレセイン −ジーｂ−Ｄ−ガラクトピラノシドと共に使用することが好適であり、フルオレ セインは蛍光性生成物であり、大量の収量を有しており、そして１０’〜１０’ 個の蛍光性分子水準で容易に検出および測定できる（例えば、シャピロ、プラク ティカル・フロー・サイトメトリー、Ａ、Ｒ，リス、ニューヨーク、１９８５参 照）。他の有用な基質はＦＩＴＣ−ジアセテート（フルオレセインインチオシア ネート−ジアセテート）であり、それは蛋白質と強度にモして非−特異的に結合 するという望ましい別の性質を有している。従って、ＧＭＤが生成する前に試料 中に混合された適当量の例えばＢＳＡ　（牛の血清アルブミン）の如き安価な！ 白質を供給しそして次ｔ：ＧＭＤをＢＳＡを保有するのに充分なゲルまたは他の コーティングでコーティングすることにより、かなりの部分のＦＩＴＣが妨害さ れそして蛋白質により結合されて、酵素占有ＧＭＤが検出可能なＧＦを集める。

他の有用な酵素触媒反応は、フルオゲン性基質である４−メチルウンベリ７エイ ールホス７エートと共に利用されるアルカリ性ホスファターゼであり、それはこ の基質から蛍光性生成物である４−メチルウンベリフェロンおよび非蛍光性生成 物である無機燐酸塩への変性に触媒作用を与える（例えば、ギルバウルト（Ｇｕ ｉｌｂａｕｌｔ）、ハンドブック・オブ・工ンザイマティック・メソソズ・オブ ・アナリシス（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｏｆ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）、マーセル・デツカ−、ニューヨーク、１９７６参 照）。

製造物中の各々のＭＤグループの蛍光の量及び体積、■（グループ）、の測定の 後で、得られたデータを、好ましくはコンピューターを使用して、以下の方法で 分析する。■（グループ）の個々の値を加算し、それによって実際に分析された サンプルの測定値を与える。各々のＭＤダグループ中蛍光の量は、前に実施され た標準の検量線に関連して測定され、かくしてＭＤの体積の各々の範囲中の酵素 分子の数が決定される。典型的には、ＭＤは、約５　ｘ　１０”〜約５ｘｌＯ− ’ｍｌの範囲の体積を有し、それ故、典型的には５ｘｌＯ”〜７．９ｘｌＯ−” ｍｌ、８　ｘ　１０”−１，１９ｘ　１０−’ｍ　ｌ、１．２ｘｌＯ−’　〜１ ．５９ｘｌＯ−’ｍ１．１．６ｘｌＱ”〜２ｘｌＯ−’ｍ＋などのサイズ（体積 ）範囲でのＭＤ分析は、数学的に実施される。このような分析はまず個々のＶ（ グループ）測定値を利用し、そして各々の間隔中にかなりの数のＭＤグループが 存在するように、ＭＤグループ体積範囲を体積間隔に分割する。典型的には、鉱 物油中への分散によって作られたＭＤは、ＶＭＤが増加するにつれて鋭く上昇し そして次に緩やかに低下する体積分布を有し、その結果として大抵のＭＤグルー プは、はぼ力・ソトオフ（ｃｕｔｏｆｆ）サイズ（例えば１０ミクロン径、■（ グループ）＝５ｘｌＯ−’°ｍ、ｌ）のすぐ上の体積を有し、そして上で示した ように、■（グループ）におけるほぼ半分の大きさの体積間隔を選択することが 有用である。

次に、各々の体積範囲に最も良く自己一致する適合を見いだすために、ポアッソ ン分布を繰り返し計算して使用する。本件の場合には、もし特定の分子の濃度、 または数密度がθであるならば、体積Ｖ（グループ）のＭＤダグループ中このよ うな分子の平均数はｎ＝、ＱＶ（グループ）である。ポアッソン分布は細胞また 分子のような小さな実在物の統計的な分布を記述するために使用され、体積■（ グループ）中のｎ細胞または分子を見いだす確率はＰ　（ｎ、　　ｎ）によって 与えられる。測定値をＭＤグループの数に転換する目的のためには、ｎは各々の ＭＤダグループ中見いだされる酵素分子の数であり、モして五は■（グループ） の各々の値に関する酵素分子の引き続いて演算された平均の数である。酵素分子 なしくｎ＝０）のＭＤグループの測定値及び一つの酵素分子（ｎ＝１）を有する ＭＤグループをポアッソン分布の式に関して使用して、ランダムな占拠によって ＭＤグループの多重酵素占拠が起きる統計的な頻度を予測する。即ち、ｎ＝２、 ｎ＝３、ｎ＝−４などのランダムに起きるケースの数をコンピューター計算する 。

ｎ＝２、ｎ＝３などの酵素ラベルされた特定の結合分子を含む個々のＭＤグルー プの蛍光の測定によって見いだされたＭＤグループの数は、次に、■（グループ ）値の各々の範囲（間隔）のためのｎの最良の値を演算するために、そして次に 式 を適用することによってＰの最良の値を演算するために使用される。これは、評 価の中間値であり、それ故希釈されたサンプル中の体積あたりの分析実在物の数 である。次に、ＭＤ生成プロセスの間の希釈に関する補正係数、ｆＤを単純に演 算し、そしてそれによって、（元の）サンプル中の分析実在物の濃度、え、そし て、個々の酵素分子活性の測定値によって現されるように、個々のＭＤグループ 内の個々の分析実在物の測定値を基にしている。増加した蛍光を得るためには、 一般的には、少なくとも一つの培養を供給することが好ましく、この培養におい ては、変化した蛍光、通常は増加した蛍光を生じる酵素で接触促進された反応が 進行し得る。

最後に、ＬＳＢＭを供給しそして利用することに加えて、１またはそれより多い タイプの介在分子を供給しそして利用することも可能てあり、ここて介在分子は 分析実在物上の１またはそれより多いサイトに結合し、そして１またはそれより 多いＬＳＢＭ力劣１き続いて使用される。例えば、ラベルされていないマウスの 抗体のポリクーロン性製造物は介在分子として使用することがてき、ここてこれ らの介在分子はサンプルと混合されて、これらのラベルされていない介在分子の 分析実在物上の結合サイトへの結合を可能にする。酵素ラベルまたはその他の適 当なラベルを有するヤギ抗−マウス（ｇｏａｔ　ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ）抗体も また添加することができ、ヤギ抗−マウス抗体はＬＳＢＭである。

未結合の介在分子を除去またはパージすることがしばしば望ましく、これは、表 面結合されたそしてラベルされていないヤギ抗−マウス抗体に関してビード（ｂ ｅａｃｌｓ）を添加することによって達成することができる。このようなパージ ステップは、一般的に有用であり、モしてビード、非生物粒子、結晶、非水流体 包含物、生存細胞、死んだ細胞、不活性細胞、ビールス、胞子、原形質体及び小 胞のようなパージ実在物を供給することから成り、これらの実在物は、ラベルさ れた特定の結合分子をしっかりと結合することができる、しっかりと結合された 分子を有する表面を持ち、これらの分子は、必ずしも全部ではないが、未結合の 介在分子を除去して、分析実在物と会合されない介在分子−ＬＳＢＭの複合体の 出現を大幅に減らす。

ＬＳＢＭだけが使用される場合には、分析実在物を含むサンプルがＬＳＢＭにさ らされた後で、しかしＭＤが生成される前に残留する、必ずしも全部ではないが 多くの遊離のまたは未結合のＬＳＢＭを結合するために、１またはそれより多い パージステップもまた使用することができる。

重要なことには、ＭＤを生成しそして本方法の残りを実施する前にサンプルから パージ実在物を除去することは一般的に必要ではない。殆どの遊離のまたは未結 合のＬＳＢＭが除去されるようにＬＳＢＭを除去する場合か、またはラベルされ ていない介在分子が除去される場合には、除去されたＬＳＢＭ及び／または介在 分子のパージ実在物との会合は、測定方法の間にこのようなパージ実在物を同定 するための一般的な手段を与える。パージ実在物を区別する一般的な手段は、光 学的な性質、質量密度性質、音響（ａｃｏｕｓｔｉｃ）性質、磁気的な性質、電 気的な性質及び熱的な性質を基にした測定を含み、そして光散乱、光吸収または 比色（Ｃ０１ｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）、蛍光、時間遅延（ｔｉｍｅ−ｄｅｌａｙｅ ｄ）蛍光、燐光及び化学ルミネッセンスを使用することが好ましい。かくして、 パージ実在物を含むＭＤは、パーン実在物を含まないＭＤから容易に区別するこ とができ、測定されたＭＤの分析は、所望の評価及びテストを実施するための基 礎としてパージ実在物を含まないＭＤだけからの測定値を利用することができる 。

以下の非限定的な実施例は、本発明を一層詳細に説明することを意図している。

下記の非限定的実施例は本発明をより特定的に説明することを意図する。

Ｗ１旦泌性哺乳動物細胞の測定 マウスハイブリドーマ細胞（ＡＴＴＣＨＢ１１８）又はマウスミエローマ細胞（ Ｐ８１５型）より成る哺乳動物細胞を、下記の工程を使用して、アガロースＧ　 Ｍ　Ｄ　ｓに取り込み（ｅｎｔｒａｐｐｅ）、ビーズを細胞と一緒に取り込んだ 。

（０１）２０ｍｇのアガロース（■型超低温、シグマ・ケミカル）を０４ｍ１の 組織培養培地（１０％０％ラン血清を補充したＲＰＭＩ］、６４０）と−緒にし た。血清は細胞増殖のため及びＧＮＤ形成及び移入プロセスにとって重要である からである。

（０２）９０℃の水浴中で加熱して溶融を引き起こし、（０３）３７℃水浴中で 冷却し、 （０４）０．１モリリ培養培地中で又は、別法として／１イブリドーマ細胞によ り分泌される抗体に対する結合部位として作用する０　８ミクロンビーズ（パン デノクス・ラボラトリーズ社からのエビコンヤキ抗マウスＩｇＧポリスチレンア ・ｙセイ粒子）の０．２５％懸濁液０．　１ｍ７！中で完全に混合し、 （０５）１．４Ｘ１０’個の細胞を含む組織培養培地０．２ｍｉを加え、（０６ ）穏やかに混合し、 （０７）３７℃の鉱油５ｍｌを加えそして１０秒間急速に渦巻きさせ、それによ りいくらかの液体微少滴を形成させ、（０８）３７℃の追加の鉱油５ｍｌを加え 、１０秒間急速に渦巻させ、それにより更に多くの液体微少滴を生成させ、（０ ９）０℃水浴中で１５分間急冷し、アガロースゲル化を引き起こし、それにより ＧＭＤ形成を引き起こし、 （１０）１５ｍｆｆポリスチレン遠心管中の４ｍｌ細胞培養培地の上に鉱油−Ｇ ＭＤ懸濁液の半分（５ｍＡ）を注ぎ、（１１）約１００ｇで５分間遠心分離し、 これは大部分のＧ　Ｍ　Ｄ　ｓを培養培地中に移入するのには十分ではなく、（ １２）約４００ｇで３分間遠心分離し、これは大部分のＧＭＤｓを培養培地移行 させるのに十分であり、 （１３）鉱油を吸引しモしてＧ　Ｍ　Ｄ　ｓ−油を水−浦界面にクランプし、（ １４）培養培地中にＧ　Ｍ　Ｄ　ｓを含む管と油に懸濁させたＧ　Ｍ　Ｄ　ｓの 残りの半分を含む管の両方を、３７℃、５％ＣＯ２インキユベータ中に４５時間 入れ、 （１５）ＧＭＤｓをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、（１６）生存性と分 泌の試験のために試料を２つの副試料に分け、（１７）３０μＭカルボキシフル オレセインジアセテート（ｃＦＤＡ）中で１時間ＧＭＤｓをインキュベーション することにより生存性のための１つの副試料を試験し、２回洗浄し、そして３４ μｇ／ｍｉヨウ化プロピジウム（ＰＩ）と共にＰＢＳ中に懸濁させた。生存性細 胞は緑色に染まった。対照的にヨウ化プロピジウムは生存性細胞から排除される が死んだ細胞中に浸透しそして染色した（ＲＮＡ及びＤＮＡ）。

（１８）５０μｇ／ｍＡフルオレセイン結合ヤギ抗マウスＩｇＧを含む０゜５ｍ ＃ＰＢＳと３０分間ＧＭＤｓをインキュベーションし、次いで２回洗浄すること により他方の副試料を分泌について試験した。

（１９）青及び緑の励起下に蛍光顕微鏡法を使用して試料を観察した。

油中に懸濁させながらインキユベーンヨンしたＧＭＤｓは、殆ど増殖を示さなか った。更に、−緒に取り込まねたビーズを含む油墾濁ＧＭＤＳにおいては細胞の 死が殆ど共通であったが、−緒に取り込まれるビーズを含まない油懸濁ＧＭＤｓ は一般に生存性でありそして培養培地に移行させると増殖した。培養培地中に懸 濁させながらインキュベーションされた、ビーズを含む又は含まないＧＭＤＳ中 の細胞は、増殖して、５０−９０％の平板培養効率で、８−３２細胞の微少コロ ニーを形成した。

ミエローマ細胞系は、一般により多くの生きている細胞を示しそしてハイブリド ーマ細胞系は増殖する。ハイプリドーマ細胞が増殖して微少コロニーを形成した 及び工程１８により染色されて分泌を示したところの、−緒に取り込まれたビー ズを有するＧ　Ｍ　Ｄ　ｓは、多くの明るい緑色の小斑点を有することが顕微鏡 法により観察された。この緑色の蛍光は、サントイ、チアソセイＡｂ、−Ａｂ２ −Ａｈ、−ビーズによるものであった。微少コロニーからのＴｇＧ抗体（Ａｂ） の分泌が起こっており、ビーズに結合した抗１ｇＧにより捕捉されモしてＦＩＴ Ｃ−抗１ｇＧにより標識された。

非占有ＧＭＤｓ及び１つのみのハイプリドーマ細胞を有するＧＭＤｓは、これら の明るい緑色の小斑点を示さなかったが、ぼんやりした（ｄｉｍ）緑色であった 。これは、低レベルのＧ　Ｍ　Ｄ　ｓ間のクロスト−ニア　（ｃｒｏｓｓ　ｔａ ｌｋ）と単一細胞よりはむしろ微少コロニーの分泌を測定することの利点を示す 。ＩｇＧを分泌しないミエローマ細胞を含むＧＭＤｓは、これらの明るい緑色の 小斑点を持たなかった。油中でインキユベーンヨンしたハイプリドーマ細胞を有 するすべてのＧＭＤｓは、油がＧＭＤ内に分泌されたＩｇＧを保持するであろう という希望にもかかわらず、明るいみどり色の小斑点（捕捉された分泌の徴）に 欠けており、これは多分上記した細胞生存性の損失によるものである。

ビーズ及び培養培地中でインキュベーションされたハイプリドーマを有するＧＭ Ｄの流動細胞計測法は、２つのＧＭＤの母集団を示したつ一方の母集団は他方よ りも顕著に緑色である。

大腸菌の増殖を、４０ミクロン又はそれ以下の直径を有するゼロ又は１の初期Ｇ ＭＤ占有の高い確率を有するアガロース懸濁液中に個々のバクテリア細胞を導入 することにより決定した。渦巻きにより水性バクテリア細胞を鉱油中に分散させ そしてアガロース懸濁液を溶融させ、それによりＬＭＤｓを形成させ、これを一 時的に冷却するとＧＭＤｓを形成することによりＧＭＤｓを製造した。これらの ＧＭＤｓを穏やかな撹拌により水性増殖培地（ＹＰＤ）に移し、次いで３７℃で インキュベーションし、２０．４０．６０及び８０分の間隔でアリフォートを取 り出した。ＧＭＤＳを含む各アリフォートをナイロン網（２０−４４メツシユ） で分粒し１、洗浄しそして５０％メタノールに暴露して固定しそして細胞を振と うさせ１次いでそれらを５μＭヨウ化プロピジウム（ＰＩ）に暴露して、これに より“赤色”蛍光により二重鎖ＲＮＡ及びＤＮＡを染色する。各アリフォートの 一部を、４８８ｎｍレーザ励起を用いて、オルソＩＩｓ流動細胞計測法で測定し た。流動細胞計測器のマルチチャンネルアナライザーを使用して、Ｇ　Ｍ　Ｄ　 ｓの数対各ＧＭＤｓのログ赤色”蛍光としてログ赤色”蛍光ヒストグラムを計算 及び表示する。得られるヒストグラムは、最初に（ゼロインキュベーシゴン）得 られた小さな単一細胞蛍光を有する大きいピーク、２０分めにピークの肩に出っ 張りの出現、４０分めにより大きい平均蛍光を有する明白なピークの出現、及び 広がりを有するピークのそれぞれ６０分及び８０分のより大きい平均蛍光値への 更なる移動を示す。

慣用の方法による細胞増殖の別の決定は、大腸菌のこの株は３７℃でＹＰＤ中で ２４分の世代時間を有することを示した。この実施例の結果は、１世代時間より 短い２０分以内の増殖を示し、そし７て２個又はそれより多くの細胞の微少コロ ニーの形成は４０分を占め、これは６０分及び８０分で更に大きい微少コロニー にしたことを示した。

憲誇声伊１朱料−ヨウ化プロ（ピ２に斃切却する酵母増殖の決定鉱油と水性細胞 ／ビーズ懸濁液を渦巻きさせ、鉱油により取り囲まれたＬＭＤｓを形成させるこ とによる鉱油中での分散を使用してアガロースＧ　Ｍ　Ｄ　ｓ中に、クマリン標 識０．１ミクロン微少ビーズ（ポリサイエンス）により、酵母カンジダ・ウチル ス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｕｓ）を導入した。数分間の一時的冷却は、ＬＭ Ｄｓ内での溶融アガロースの形成ゲル化を引き起こし、それによりアガロースＧ 　Ｍ　Ｄ　ｓを形成した。ＧＭＤ調製物の試験片を穏やかな撹拌を用いてＹＰＤ 増殖培地を含む幾つかの管に移した。得られる水性ＧＭＤ＠濁液をゼロ−４時間 の間隔で穏やかに撹拌しながら２６℃でインキユベーンヨンした。ＧＭＤｓの試 験片又はアリフォートを０．２及び４時間めに取り出し、ナイロン網（２０−４ ４メツシユ）で分粒し、洗浄し、５０％メタ、ノールに暴露して細胞を透過及び 固定し、次いで５μＭヨウ化プロピンウム（ＰＩ）に暴露して二重鎖ＲＮＡ及び ＤＮＡを染色した。増殖の分析は、−緒に取り込まれた微少ビーズの緑色蛍光及 び結合したＰＩの赤色蛍光の測定のためにオルソＵｓ流動細胞計測計の４８８１ １励起を使用して、種々の時間に検数したＧＭＤｓを測定することにより行った 。

ＧＭＤの培養の間に、懸濁液中の遊離の細胞もまた分裂した。これらの細胞及び それらの子孫（ｐｒｏｇｅｎｃｙ）もまたＰＩを取り、そしてがくして赤い蛍光 ヒストグラムの“ｎ＝１′のピークに貢献し、ここでそれらは、赤い蛍光測定だ けを基にして未分裂のＧＭＤトラップされた細胞から区別することができた。そ れ故、赤い蛍光ヒストグラムは、同時に起きる“赤い′そして“緑の”蛍光シグ ナルを有するすべての光学的事例に関して発生させそして展示した。蛍光でラベ ルされたＧＭＤのこの使用は細胞成長の急速な測定を与え、そして遊離の細胞が ＧＭＤ中の成長しない細胞として数えられるのを防止した。

実施例４　着色ヨウ化プロビジウムを用いたマウス骨髄腫細胞の測定マウス融合 細胞（ＡＴＴＣＨＢ　　１１８）またはマウス骨髄腫細胞（Ｐ８１５型）から成 るは乳動物細胞は、以下の諸段階により細胞と共に捕獲されたビーズと、アガロ ースＧＭＤｓ中に捕獲された。

（１）コロｍｇのアガロース（ＩＸ型超低温、シグマ化学（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ ｍｉｃａｌ）　ハ、血清は細胞の生長にまたＧＭＤ生成と輸送工程における界面 活性剤として重要であるため、０．４ｍｌの組織培養培地（１０％胎児牛血清の 追加されたＲＰＭＩ　　１６４０）と混合された。

（０２）溶解するため、９０°Ｃ水浴中で加熱された。

（０３）３７°Ｃの水浴で冷却された。

（０４）Ｏ，１ｍｌ培養培地または、選択的に０．１ｍｌの、融合細胞が分泌す る抗体の結合部位として働く、０．　８ミクロンビーズ（バンデノクスラボラト リー社（Ｐａｎｄｅｘ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、　）のエビコンヤ ギ　アンチマウスＩｇＧポリスチレン測定粒子）、０．２５％懸濁液に十分に混 合された。

（０５）２．０ｘｌＯ７の細胞を含む１２ｍｌの組織培養培地を加えた。

（０６）穏やかに混合した。

（０７）３７°Ｃで５ｍｌの鉱油を加え、１０秒間急速に撹拌し、これによりい くらかの液微小滴を形成した。

（０８）３７°Ｃで５ｍｌの鉱油をさらに加え、１０秒間急伸に撹拌し、これに よりより多くの液微・ｊ＼滴を形成した。

（０９）ＯｏＣの水浴中で１０分間冷却し、アガロースをゲル化し、これにより ＧＭＩ〕を形成させた。

（１０）８ｍｌの鉱油−ＧＭＤ懸濁液を１５ｍ１のポリスチレン遠心管中、６ｍ ｌ細胞培養培地に加え、そして （１−１）５分間約４００ｇで遠心分離し、て、はとんどのＧＭＤｓを培養培地 に輸送した。（１２）水油界面で、鉱油とＧＭＤ−泊凝集塊を吸引した。

（１３）６ｍｌの培養培地にＧ〜ｉＤｓを輸送し、３７ＤＣ，５％二酸化炭素の 定温器中２５　ｃ　ｒｎ　　組織培養フラスコ中で培養した。

（１４）０．１２．１８．２４．そして４０時間の培養の後、１ｍｌのアリコー トが採取された。

（１５）モしてＧＭＤｓは、直ちにリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回リンス された。（］Ｇ６細胞は５０％メタノール１５０％ＰＢＳで固定され、最低１日 ４８Ｃで保存された。

（１７）ＧＭＤｓは次いてＰＢＳてリンスされ、８８ミクロンナイロンメツツユ でるかされた。

（１８）ＰＢＳ中、固定細胞を赤蛍光で染色する６　８μ／ｍｌのヨウ化プロビ ジウムで再懸濁させた。

（１９）緑励起下、蛍光顕微鏡で観察した。

Ｐ８１５細胞は、０時間では、ＧＭＤｓの約１５％が細胞に占められ、その９０ ％は単独で占められていた。１８時間で、はとんどの占拠されたＧＭＤｓは正確 に４個の細胞の集団を含み、前記ミクロコロニーは容易に、多重占拠ＧＭＤｓの 場合の、同じＧＭＤを含む他の細胞集団から識別された。４０時間の培養後、は とんどのミクロコロニーは球状に固く固まり、４から８以上の細胞が存在すると きは、集団中の個々の細胞を計数することは困難となる。ＰＡ２．６細胞はより ゆっくり生長した。

実施例５・染色ヨウ化プロピジウムを用いたは乳動物細胞の生長の測定顕微鏡の 代わりにふるい分けられ染色されたＧＭＤｓが、３５ｍＷ　　４８８ｎｍのレー ザー励起を用いた、オルソ　サイトフルオログラフＩＩｓ　　フローター・ター （Ｏｒｔｈｏ　Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｇｒａｆ　ＩＩｓ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍ ｅｔｅｒ）を通過したことを除き、実施例３と同じ操作をＧＭＤｓの生成に用い た。

前置散乱光と右角赤蛍光（ＲＦ、＞　６１０ｎｍ）は、７００から５０００の占 拠ＧＭＤｓを定量的に測定した。赤蛍光のヒストグラムはＲＦが時間と共に増加 する事をはっきりと示した。占拠ＧＭＤ対平均ＲＦは計算され、時間に対し、半 対数的な増加が見られた。倍増時間は、Ｐ８１５骨髄腫細胞では１０時間、融合 細胞系では１５．７時間であった。これらの値は顕微鏡からそして自由懸濁液中 のこれら細胞の培養から得られた値と同様であった。

実施例５：ＲＮＡ５ｅと染色ヨウ化プロビジウムを用いたは乳動物細胞の複製の 測定融合細胞を用い、ＰＩを加える前に、ＧＭＤｓが４時間３４°Ｃで、ＲＮＡ を除（ため１０クニソツ単位／ｍｌのＲＮＡ５ｅ（Ｘ−Ａ型、牛すい臓、ノグマ 化学）で培養し、ＰＩにＤＮＡのみを染色させたことを除き、実施例３と同じ操 作をＧＭＤｓの生成に用いた。これは、４から８の細胞のミクロコロニーに対し ても、全ＤＮＡが７％以下の分散係数でフローサイトメーターにより定量的測定 ができるため、細胞数のより正しい測定を可能とした。従って、ＤＮＡの測定は 、細胞サイクルのＧｌ中の、細胞中のＤＮＡの測定による標準化により量子化さ れうる。

初期に１．　２．　３．　４．　５そして　５の細胞に占拠されたＧＭＤｓの比 率はそれにより、Ｓ、　　Ｇ２、そしてＭ相の細胞によるいくらかの誤差を伴っ て、測定され、そのＤＮＡの全数は残余の値より大である。時間と共に、ＤＮＡ の測定値は、残余のＧＭＤＳの値の２、次いで４，８．そして１６倍の中間値に なりがちである。従って、時間に対する細胞の複製の数は測定された。

実施例７．生長可変性と平板効率の測定マウス骨髄ａ（Ｐ８１５型）細胞は、ま ず適当に、細胞培養培地（ＲＰＭＩ　　１６４０．１０％胎児生血清、１０ｍＭ 　　ＨＥＰＥＳ　　緩衝液、３００ｍｇ／ＬＬ−グルタミンの補充、５０Ｕ／ｍ ｌベニンリンそして５０）んｇ／Ｔｈｌのストレブトマインン、そし、てＧＭＤ ｓは、実施例５のように生成された。

ＧＭＤｓは次いで、１０ｍ１細胞培養培地の入った、７５ｃｍ　　組織培養フラ スコの底に置かれ、Ｏから４０時間培養された。定期的に、１ｍｌアリコートが 洗浄され、ＰＢＳ　（リン酸塩緩衝食塩水）に再懸濁され、等容量のメタノール が加えられて固定され、１またはそれ以上の時間待ち、洗浄され、６．８μｇ／ ｍｌのＰＩとＰＢＳに再懸濁された。４８８ｎｍの励起を持つオルトＩＩｓ　　 フローサイトメーター　がＰＩの”赤′蛍光の測定に使用された。

−赤”蛍光の結果的分布は、通常フローサイトメーターの機器能力より明らかに 大の分散を示し、そして婁団内での生長の可変性を示したと信じられ、それはさ もなければ使用できない測定能力である。

白熱（非蛍光）と蛍光励起光の併用による蛍光顕微鏡観察は、最大コロニーサイ ズが約３２細胞であることを示した。

平均倍増時間は、ＧＭＤ測定から平均”赤“蛍光の信号に対する時間の対数プロ ットにより、１０００以上の占拠されたＧＭＤｓについて、決定され、１２時間 であり、自由細胞、すなわち懸濁液中で自由でＧＭＤ中に含まれない細胞と同条 件下での簡便な方法により我々が得た値と良く一致した。

平板効率は、培養と共に、そのピークが基本的に非培養ピークと同じ位置にある 、小”赤′蛍光ピークの０から１５倍のピーク”赤”蛍光からの”赤”蛍光の信 号の積分によるデータから見積もられた。

最初の積分された”赤”蛍光は、単独の細胞、即ち、培養期間に生長しなかった 細胞の”赤“蛍光の寄与によると解釈される。

非培養ピークの”赤”蛍光ピークの１５倍のピーク”赤”蛍光から、測定された 最大の”赤゛蛍光までの”赤”蛍光の信号の積分が、続いて行われ、この第２の 積分は、２またはそれ以上の細胞による”赤“蛍光と解釈された。

この操作は、平板効率を、生長速度を決定するのと同じ実験から決定可能とし、 ９０％以上の推定平板効率を与えた。

実施例８　先願検鏡を用いたは乳動物細胞の生長の測定中国ハムスターの卵巣（ ＣＨＯ１Ｏ−４Ｂ）細胞の生長は、多くの世代にわたり、目盛り付き接眼レンズ を持つ光学顕微鏡で視覚検査により、または光学顕微鏡による顕微鏡写真により 、決定されるミクロコロニーサイズにより決定すべき、生長をさせるより大のＧ ＭＤｓを用いて決定された。簡便な条件下でのＣＨＯの生長が、まず確立された 。それから、単層の倍増時間は１３時間であり、カルノウムなしの懸濁液では１ ９．３時間、そして１０日後の軟アガロース中でのクローニング効率は９５％で 、一方アガロースＧＭＤｓ中でのクローニング効率は８０％であった。１００か ら４００ミクロンの大きさのＧＭＤｓは、鉱油申分散液で製造され、ＬＭＤｓと なり、それは一時的に冷却されＧＭＤｓとなった。ＧＭＤｓは、１０％胎児牛血 清を含む生長媒体の存在下、鉱油−ＧＭＤ乳液のおだやかな回転撹拌により水性 媒体に輸送され、３５ｍｍペトリ皿に置かれた。

ＧＭＤサイズ分布を決定するために、４００Ｘの倍率の逆顕微鏡と、接眼マイク ロメーターが、個々のＧＭＤｓの直径測定筒使用され、これらの値は、表示と計 算の為にコンビュウターに手入力された。

生長測定実験のために、１０１から１０１細胞／ｍｌの濃度の懸濁液のＣＨ○細 胞は、ＧＭＤの合成に使用された。個々のＧＭＤｓは、試験され、サイズと数が 記録された（０．１または多数）。観察された占有は、８０から２５０ミクロン でＧＭＤｓについてポアソン分布と良く一致した。ＧＭＤｓでのＣＨＯ細胞の生 長は、６６から１１０時間の期間の培養で観測され、初期（ゼロ時間）ケースと 比較した。

ＧＭＤｓのゲルマトリックスは、どんな個々の化合物によっても染色されず、そ の結果、ＧＭＤｓは注意された場合にのみ確認された。

ミクロコロニーは軟アガロースに似た形態を持つ。個々の細胞は確認できなかっ たのミクロコロニーのサイズの分布は、次いで細胞でＧＭＤｓを形成し測定し、 数回培養し、メタノールを加えて生長を止め、洗浄し、逆顕微鏡で観察するため にＧＭＤｓをペトリ皿に置き、種々のサイズのミクロコロニーは数えられた。

培養時間につれて、ミクロコロニーのサイズは増大した。最大のミクロコロニー は１２０またはそれ以上の細胞を持うていた。

実施例９　：　ＣＦＤＡを用いたは乳動物細胞の生長の測定マウス骨髄腫細胞（ Ｐ８１５型）とマウス融合（ＰＡ２．６　　ＡＴＣＣ列ＨＢ１］、８）細胞は、 調製で共に捕獲された多数の小ビーズと、２．５％と５％のアガロースと実施例 ３のようにしてアガロースＧＭＤｓ中に捕獲された。

ある（型Ａ）ＧＭＤの合成は、ＧＭＤ合成に使用された鉱油にかこまれながら培 養さとミクロコロニーは死を示す。

これら両染色を用いて以下が観察された。

水性細胞培養培地で培養されたＧＭＤｓは以下を示す。

１時間後７０から９０％が生育、 むミクロコロニーがＧＭＤｓの最も多くを占める。

鉱油中懸濁して培養されたＧＭＤｓは以下を示す・４２時間でＯから５０％が生 育、 ２５％アガロースＧＭＤｓ中の細胞は、時々２細胞に分裂し、生育性。

このようなＧＭＤの形成に続いて、Ｇ　Ｍ　Ｄ　ｓを含む小容量の鉱油を、２つ の平行電極間に電位が加えられている平行板キャバンタ／１ｙｃｈチャンバに移 し、そして種々の電位を２つの電極に加えるにつれて、蛍光顕微鏡法により、フ ルオレセイン含有Ｇ　Ｍ　Ｄ　ｓの運動を観察した。普通の鉱油を使用したこの 実施例では、結果はあいまいであった。何故ならば、電荷緩和時間は３０秒であ ると評価され、これは、Ｇ　Ｍ　Ｄ　ｓがこれらの実験で観測されるのに十分に 長い時間荷電していないであろうと予想させるからである。

鉱油の浴に入れた電極に電位を加え、その結果それらの電荷によりＧＭＤｓに対 して力を加えることができることにより、Ｇ　Ｍ　Ｄ　ｓの操作を試みた。一般 に、下記のことが観察された。Ｇ　Ｍ　Ｄ　ｓ上の電荷と反対符号の電極表面電 荷を引き起こす電位に荷電される電極付近のＧ　Ｍ　Ｄ　ｓは、電極に向かって 引かれる。このようなＧ　Ｍ　Ｄ　ｓの運動は顕微鏡を使用して観察することが できる。電位を、同じ大きさであるが反対の極性に変えると、同じＧＭＤが今度 は電極から反発されるような、反対符号の電極表面電荷を生じる。鉱油中への水 の導入は起こったらしいということ及びそれゆえｌこ加えた電位に応答したＧＭ Ｄｓの観測された運動は電気泳動によるものであると結論さねた。

実施例Ｘ■質量密度差によるＧ　Ｍ　Ｄ　ｓの操作０．５％−５％の範囲のゲル 濃度及び鉱油（パラフィン油と同等、重質：フィッシャー：セイボルド１６２分 ）で、シグマ型■アガロースを使用して鉱油中に分散させることにより、アガロ ースＧ　Ｍ　Ｄ　ｓの多くの異なる調製物を製造した。一時的冷却の後、分散プ ロセス中に形成されたＬＭＤｓはＧ　Ｍ　Ｄ　ｓに転化された。５℃乃至１０℃ の鉱油に取り囲まれた得られるＧ　Ｍ　Ｄ　ｓの操作は、冷凍遠心分離器で約１ ４００ｇの遠心分離を使用してＧ　Ｍ　Ｄ　ｓを鉱油を通して及び鉱油から種々 の水性媒体へと移動させることにより達成された。

実施例ｘｍ：ｉｔ、油により取り囲まれたＧＭＤｓ中への水溶性試薬の輸送下記 の工程に従って最初に液体ゲル化媒体を調製することによりＧＭＤｓを非水性流 体中に形成した。

１、　）　１．　ｍＡ’の水性緩衝液（２００ｍＭ酢酸塩緩衝液、ｐＨ８）を測 り取り、２）アガロース（■型、低い溶融温度、シグマ・ケミカル）５０ｍｇを 加え、 ３）調製物を８０℃（液化温度より上）に加熱し、４）調製物を４０℃（まだゲ ル化温度より上）に冷却した。

次いで酵素アルカリホスファターゼを液体ゲル化媒体に加え、鉱油ＩＱｍ／を加 え、渦巻きを使用して液体微少滴（１０−１００ミクロン）を生成させ、これを 約１０℃に冷却することによりゲル化させ、それにより酵素をアガロースＧ　Ｍ 　Ｄ　ｓに導入し、これを鉱油（パラフィン油と同等、重質：フィッシャー：セ イポルド１６２分）の管に懸濁させた。この酵素に対する基質、４−メチルウン ベリフェロンホスフェートを次いで少量の非極性溶媒（アセトン又はＤＭＳＯ） に溶解し、次いでこれを鉱油の第２の管に加えた。これらの２つの管の鉱油を穏 やかに混合すると、酵素基質は鉱油により取り囲まれたＧＭＤｓ中に入ることが でき、そして酵素触媒下の反応が起こり、それにより蛍光性生成物が生じ、これ は、ＧＭＤｓに導入された酵素活性の量に依存して、数分乃至数時間の期間の後 紫外線顕微鏡により見ることができる。これは、水溶性化学品（４−メチルウン ベリフェロンホスフェート）が鉱油により取り囲まれたＧＭＤｓに輸送されたこ とを示す。

実施例Ｘ■：　逆ミセルを使用した水溶性化合物のＧ　Ｍ　Ｄ　ｓ中への輸送鉱 油中に懸濁させたアガロースＧ　Ｍ　Ｄ　ｓを、実施例Ｉの方法と同様な方法を 用いて形成させた。次いで石けんと蛍光染料を含む少量の水を第２の管の鉱油に 加え、次いで渦巻きさせて逆ミセルを生成させた。１つはアガロースＧＭＤｓの 鉱油懸濁液であり、他方は鉱油中の逆ミセルのエマルジョンである、２つの管の 内容物を次いで混合し、それにより逆ミセルをＧ　Ｍ　Ｄ　ｓと衝突させた。こ れは、ミセル中に含まれた蛍光染料が、蛍光顕微鏡法により観察されるように、 Ｇ　Ｍ　Ｄ　ｓ中に輸送されることを可能とした。

実施例ＸＶ：ＧＭＤｓからノリコーン流体中のＧ　Ｍ　Ｄ　ｓへの化学品の迅速 な輸送 ｐＨ８，０の０．１Ｍ１−リス緩衝液中の１０００μｇ／ｍｘの４−メチルウン ベリフェロン（青色蛍光放射：紫外線励起）を含む溶液から、５０センチポイズ のノリコーン流体（ダウ・コーニング）中への分散によりアガロースＧＭＤｓを 形成させ、それにより、５０ｃｐシリコ一ン流体を含んで鳴る非水性流体により 取り囲まれた蛍光性ＧＭＤｓを生じた。これらの青色蛍光性ＧＭＤｓを含むノリ コーン流体の滴を、同じ方法によりしかし４−メチルウンベリフェロンを加えな いで（非蛍光性ＧＭＤｓ）製造された非蛍光性ＧＭＤｓを含む同様な滴と同じく 、血球計数器上に置いた。２つの滴を穏やかに混合し、得られる混合されたＧ　 Ｍ　Ｄ　ｓ調製物を蛍光顕微鏡法により観察した。

最初はこの２つのタイプのＧＭＤＳは青色蛍光と非蛍光性として容易に識別され たが、数分以内に最初非蛍光性であったＧ　Ｍ　Ｄ　ｓが徐々に青特表平３−５ ｏ：５ｓ４５（’５５） 色蛍光を得、それにより予め加えられたＧＭＤｓから最初は非蛍光性であったＧ 　Ｍ　Ｄ　ｓへの４−メチルウンベリフェロンの相当急速な輸送を示す。

実施例Ｘ　ＶＴ　：　　Ｇ　Ｍ　Ｄ　ｓから鉱油中のＧ　Ｍ　Ｄ　ｓへの化学品 の遅い輸送実施例■の如きして、アガロースＧ　Ｍ　Ｄ　ｓを分散により形成さ せた。

しかしこの場合には、鉱油（パラフィン油と同等、重質：フィッンヤー；セイボ ルド１６２分）を使用した。実施例■の場合と同じく、Ｇ　Ｍ　Ｄ　ｓを形成し た溶液は、ｐＨ８，０のＯ，１Ｍ）リス緩衝液中の１０００μｇ／ｍｌの４−メ チルウンベリフェロン（青色蛍光放射：紫外線励起）を含んでおり、それにより 鉱油を含んで成る非水性流体により取り囲まれた蛍光性Ｇ　Ｍ　Ｄ　ｓを生じた 。実施例■とは対照的に、非蛍光性Ｇ　Ｍ　Ｄ　ｓによる青色蛍光性の取得は数 分にわたって観測されながった。しかしながら、室温で一夜放置した後、最初は 非蛍光性であったＧ　Ｍ　Ｄ　ｓか弱い青色蛍光性となり、それにより、予め加 えられたＧ　Ｍ　Ｄ　ｓがら最初は非蛍光性であったＧ　Ｍ　Ｄ　ｓへの４−メ チルウンベリフェロンの遅い輸送を示す。

抱竺惣 ルーチンな実験を用いるだけで、本明細書に記載された本発明の特定の態様に対 する多くの均等物を、当業者は認識又は確認することができる。このような均等 物は下記の請求の範囲に包含されることを意図する。

ＦＩＧ、　１ ＦＩＧ、　２ 国際調査報告 ｌＡｌｆｉｌｌｌｌｌＭ−＾、、−、、＋、＊−Ｎ−，ＰＣＴ／υＳ　　８９１ ０１６９９国際調査報告 ＵＳ　８９０１６９９ ＳＡ　　　　２８５２３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、工程： ａ、結合部位および生物学的実在物をゲルの微小滴中に組み込み、そして ｂ、ゲルの微小滴内の結合部位において生物学的実在物から解放された分子を捕 捉する、 からなる、ゲルの微小滴内に含有された生物学的実在物から解放された分子を捕 捉する方法。 ２、捕捉された分子を測定する追加の工程を含む上記第１項記載の方法。 ３、捕捉された分子を、光学的、秤量、沈降、場の流れの沈降分画、音響、磁気 、電気および熱的手段から成る群より選択される物理学的手段により測定する、 上記第１項記載の方法。 ４、光学的測定は、光の散乱、光の吸収または測色、蛍光、時間遅延蛍光、りン 光３よび化学ルミネッセンスから成る群より選択される、上記第２項記載の方法 。 ５、捕捉された分子は捕捉された分子に関連する自然に発生する光学的シグナル を測定することによって測定し、前記光学的シグナルは、光の散乱、光の吸収ま たは測色、蛍光、時間遅延蛍光、リン光および化学ルミネッセンスから成る群よ り選択される、上記第４項記載の方法。 ６、少なくとも１つのゲルの微小滴を少なくとも１つのインキュベーションにか ける追加の工程を含む、上記第１項記載の方法。 ７、ゲルの微小滴、およびその中に含有される生物学的実在物を、捕捉された分 子の測定に基づいて物理学的に単離する、上記第２項記載の方法。 ８、ゲルの微小滴、およびその中に含有される生物学的実在物を、捕捉された分 子と相互作用する物理学的力に基づいて単離する、上記第１項記載の方法。 ９、ゲルの微小滴を標識分子に暴露する引き続く工程を有し、前記標識分子は捕 捉された分子に結合し、これにより捕捉された分子を標識することができる、上 記第１項記載の方法。 １０、標識分子は、抗体、抗原、核酸、レクチン、レセプター、酵素、阻害因子 、およびプロテインＡから成る群より選択され、それらのすべては測定可能な標 識をもつ、上記第９項記載の方法。 １１、標識分子は蛍光標識されている、上記第１０項記載の方法。 １２、工程： （ａ）少なくとも１つの介在する分子の型を供給し、そして（ｂ）標識分子を供 給し、こうして介在する分子が捕捉された分子に結合し、そして標識分子が介在 する分子に結合するようにする、追加の工程を含む、上記第１項記載の方法。 １３、ゲルの微小滴、およびその中に含有される生物学的実在物を、標識分子と 相互作用する物理学的力に基づいて単離する、上記第９項記載の方法。 １４、生物学的実在物は、小さい多細胞の有機体、細胞の群、個々の細胞、原形 質体、小胞体、胞子、オルガネラ、寄生体、ウイルス、核酸分子、抗体分子、抗 原分子、および分子の凝集体から成る群より選択される、上記第１項記載の方法 。 １５、外部の刺激により生物学的実在物が分子を解放するようにさせる追加の工 程を含む、上記第１項記載の方法。 １６、外部の刺激はエレクトロポレイションを引き起こす電磁的刺激である、上 記第１５項記載の方法。 １７、ゲルの微小滴内の分子を捕捉するために適当な少なくとも１つの結合部位 を含有するゲルの微小滴。 １８、少なくとも１つのゲルの微小滴中に含有されるマーカー実在物を測定する 工程からなる、ゲルの微小滴を測定する方法。 １９、少なくとも１つのゲルの微小滴中の生物学的実在物の量を測定し、これに より前記ゲルの微小滴の大きさを決定する追加の工程を含む、上記第１８項記載 の方法。 ２０、ゲルの微小滴をつくるプロセスの間に、マーカー実在物をゲルの微小滴中 に組み込む追加の工程を含む、上記第１８項記載の方法。 ２１、工程： ａ、生物学的実在物をゲルの微小滴中に組み込み、そしてｂ、少なくとも１つの 生物学的実在物を測定する、をさらに含む、上記第２０項記載の方法。 ２２、統計学的分析を少なくとも１つのウイブの測定に適用する、上記第２１項 記載の方法。 ２３、マーカー実在物は、ビーズ、非生物学的粒子、結晶、非水性流体封入体、 生存能力をもつ細胞、死亡した細胞、不活性な細胞、ウイルス、胞子、原形質体 、小胞体、染料および色素から成る群より選択される、上記第１８項記載の方法 。 ２４、マーカー実在物を、光学的、秤量、沈降、場の流れの沈降分画、音響、磁 気、電気および熱的手段から成る群より選択される物理学的手段により測定する 、上記第１８項記載の方法。 ２５、光学的測定は、光の散乱、光の吸収または測色、蛍光、時間遅延蛍光、リ ン光および化学ルミネッセンスから成る群より選択される、上記第１８項記載の 方法。 ２６、少なくとも１つのゲルのマトリックスを予備処理してマーカー実在物を取 り付ける追加の工程を含む、上記第１８項記載の方法。 ２７、マーカー実在物を前に存在するゲルの微小滴中に組み込む、上記第１８項 記載の方法。 ２８、ゲルの微小滴をゲルの微小滴の形成後分子に暴露し、こうして前記分子が ゲルの微小滴中に入ることができるようにし、そしてさらに前記分子を引き続い てゲルのマトリックス内で反応させて複合体を形成し、前記複合体はゲルの微小 滴から急速に出ることができず、これによりマーカー実在物を前に存在するゲル の微小滴中に組み込む、上記第２７項記載の方法。 ２９、少なくとも１つのマーカー実在物を少なくとも１つの生物学的実在物の測 定と組み合わせて測定して、生物学的実在物がゲルの微小滴と関連することを決 定する、上記第１８項記載の方法。 ３０、少なくとも１つのマーカー実在物を少なくとも１つの生物学的実在物の測 定と組み合わせて測定して、生物学的実在物に関連する生物学的物質の測定に関 連するゲルの微小滴の体積を測定する、上記第２９項記載の方法。 ３１、測定は限界条件と比較し、これによりゲルの微小滴の存在を決定すること からなる、上記第１８項記載の方法。 ３２、生物学的実在物は、小さい多細胞の有機体、細胞の群、個々の細胞、原形 質体、小胞体、胞子、オルガネうおよび寄生体から成る群より選択される、上記 第２１項記載の方法。 ３３、細胞は、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、バクテリア細胞、酵母菌細胞、 真菌細胞およびかび細胞から成る群より選択される、上記第３２項記載の方法。 ３４、ビーズ、非生物学的粒子、結晶、非水性流体封入体、生存能力をもつ細胞 、死亡した細胞、不活性な細胞、ウイルス、胞子、原形質体、小胞体、染料およ び色素から成る群より選択される少なくとも１種のマーカー実在物を含有するゲ ルの微小滴。 ３５、少なくとも１つの微小滴内に含有された生物学的物質の量を測定する工程 からなる、生物学的実在物を測定する方法。 ３６、少なくとも１つの微小滴を少なくとも１回インキュベーションして、生物 学的実在物を変化させ、次いで生物学的物質の量を測定し、引き続いて生物学的 物質の量の変化を測定する工程をさらに含む、上記第３５項記載の方法。 ３７、生物学的物質が最初に変化した生物学的実在物を含有する微小滴が、生物 学的物質が最初に変化した生物学的実在物を含有しない微小滴から車離されるよ うな方法で、微小滴、およびその中に含有されるを物理学的に単離する工程をさ らに含む、上記第３６項記載の方法。 ３８、微小滴の体積を測定する追加の工程を含む、上記第３５項記載の方法。 ３９、ポアッソン統計学および修正したポアッソン統計学から成る群より選択さ れる統計学的式を使用して、ゲルの微小滴の測定を統計学的に分析する追加の工 程を含む、上記第３５項記載の方法。 ４０、微小滴の測定の統計学的分析を実施する追加の工程を含み、前記分析した 微小滴の測定は生物学的物質の測定および微小滴の測定から成る群より選択され る、上記第３５項記載の方法。 ４１、生物学的物質を、光学的、秤量、沈降、場の流れの沈降分画、音響、磁気 、電気および熱的手段から成る群より選択される物理学的手段により測定する、 上記第３５項記載の方法。 ４２、光学的測定は、光の散乱、光の吸収または測色、蛍光、時間遅延蛍光、リ ン光および化学ルミネッセンスから成る群より選択される、上記第４１項記載の 方法。 ４３、微小滴を生物学的物質を示す少なくとも１種の染料で処理する工程をさら に含む、上記第４１項記載の方法。 ４４、生物学的実在物は、小さい多細胞の有機体、細胞の群、個々の細胞、原形 質体、小胞体、胞子、オルガネラ、寄生体、ウイルス、核酸分子、抗体分子、抗 原分子、および分子の凝集体から成る群より選択される、上記第３５項記載の方 法。 ４５、細胞は、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、バクテリア細胞、酵母菌細胞、 真菌細胞およびかび細胞から成る群より選択される、上記第４４項記載の方法。 ４６、生物学的物質の量を生物学的物質に関連する自然に発生する光学的シグナ ルを測定することによって測定する、上記第４２項記載の方法。 ４７、光学的測定は、流れ細胞測定装置、貫流ミクロ蛍光測定装置、光学的粒子 分析装置、蛍光顕微鏡測定装置、光学顕微鏡測定装置、像分析装置およびビデオ 記録装置から成る群より選択される装置を使用して行う、上記第４２項記載の方 法。 ４８、少なくとも１種の染料を生物学的実在物の同定のために使用し、そして少 なくとも１種の染料または自然に発生する光学的シグナルを使用して生物学的実 在物の増殖を決定する、上記第４３項記載の方法。 ４９、少なくとも１種の蛍光標識した抗体を生物学的実在物の同定のために使用 し、そして少なくとも１種の染料を使用して生物学的実在物の増殖を決定する、 上記第４７項記載の方法。 ５０、主として単一の微小滴から成る微小滴の群を同時に測定する、上記第３５ 項記載の方法。 ５１、主として少なくとも２つの微小滴から成る微小滴の群を同時に測定する、 上記第３５項記載の方法。 ５２、測定した微小滴は、インキュベーションの前に２つより少ない生物学的実 在物を含有する高い確率をもつ微小滴から主として成る、上記第３６項記載の方 法。 ５３、測定した微小滴は、インキュベーションの前に少なくとも２つの生物学的 実在物を含有する高い確率をもつ微小滴から主として成る、上記第３６項記載の 方法。 ５４、増殖の測定を分析して、平板培養効率、増殖速度分布、平均の増殖速度、 増殖遅滞時間分布および平均の増殖遅滞時間から成る群より選択される増殖特性 挙動を決定する追加の工程を含む、上記第３６項記載の方法。 ５５、染料可能な生物学的物質の劣化反応および染料可能な生物学的物質のブロ ッキング反応から成る群より選択される反応を利用する追加の工程を含む、上記 第４３項記載の方法。 ５６、生物学的実在物を微小滴中に組み込む追加の工程を含む、上記第３５項記 載の方法。 ５７、工程： ａ、微小滴を少なくとも１つの化合物に暴露し、前記化合物は前記生物学的実在 物の増殖へのその作用を決定すべきであるようなものであり、そして ｂ、少なくとも１つの微小滴内の生物学的物質を測定する、からなる、微小滴中 に含有される生物学的実在物の増殖への化合物の作用を決定する方法。 ５８、少なくとも１つのゲルの微小滴を少なくとも１回インキュベーションする 追加の工程を含む、上記第５７項記載の方法。 ５９、微小滴の少なくとも２つの標本を異なる濃度の化合物に暴露する、上記第 ５７項記載の方法。 ６０、化合物は、抗体、抗微生物化合物、抗真菌化合物、化学治療学的化合物、 毒性化合物、細胞障害性化合物、不可逆的阻害因子、可逆的阻害因子、突然変異 誘発性化合物、危険化合物、ホルモン、増殖因子、増殖増強因子、栄養化合物、 ビタミン、食物保存剤、農薬、寄生虫および殺虫剤から成る群より選択される、 上記第５７項記載の方法。 ６１、生物学的実在物は、小さい多細胞の有機体、細胞の群、個々の細胞、原形 質体、小胞体、胞子、オルガネラ、寄生体、ウイルス、核酸分子、抗体分子、抗 原分子、および分子の凝集体から成る群より選択される、上記第５７項記載の方 法。 ６２、細胞は、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、バクテリア細胞、酵母菌細胞、 真菌細胞およびかび細胞から成る群より選択される、上記第６１項記載の方法。 ６３、工程： ａ、少なくとも１つの微小滴を少なくとも２回インキニベーションし、そして ｂ、前記インキュベーションの間に少なくとも１つの化合物の濃度を少なくとも １回変化させる、 追加の工程を含む、上記第５８項記載の方法。 ６４、工程： ａ、少なくとも１つの微小滴を少なくとも１つの変化する濃度の少なくとも１つ の化合物に暴露し、 ｂ、引き続いて少なくとも１つの微小滴を第１のインキュベーションに増殖の対 照として暴露し、そして ｃ、引き続いて前記微小滴を前記化合物に少なくとも１つのインキュベーション の間に暴露する、 を含む、上記第６３項記載の方法。 ６５、工程： ａ、微小滴の少なくとも１つの標本を少なくとも１つの変化する濃度の少なくと も１つの化合物に暴露し、 ｂ、前記化合物に暴露しない微小滴の少なくとも１つの他の標本を使用して、増 殖の対照を準備し、そして ｃ、少なくとも１つの暴露した標本および１つの対照標本の別のインキュベーシ ョンを使用する、 を含む、上記第６３項記載の方法。 ６６、少なくとも１つの濃度の化合物を使用して、前記化合物の抗微生物特性を 決定する、上記第５７項記載の方法。 ６７、少なくとも１つの濃度の化合物を使用して、前記化合物に対する癌細胞の 感受性を決定する、上記第５７項記載の方法。 ６８、生物学的物質を、光学的、秤量、沈降、場の流れの沈降分画、音響、磁気 、電気および熱的手段から成る群より選択される物理学的手段により測定する、 上記第５７項記載の方法。 ６９、生物学的実在物を微小滴中に組み込む追加の工程を含む、上記第５７項記 載の方法。 ７０、測定した微小滴は、インキュベーションの前に２つより少ない生物学的実 在物を含有する高い確率をもつ微小滴から主として成る、上記第５８項記載の方 法。 ７１、測定した微小滴は、インキュべーションの前に少なくとも２つの生物学的 実在物を含有する高い確率をもつ微小滴から主として成る、上記第５８項記載の 方法。 ７２、増殖の測定を分析して、平板培養効率、増殖速度分布、平均の増殖速度、 増殖遅滞時間分布および平均の増殖遅滞時間から成る群より選択される増殖特性 挙動を決定する追加の工程を含む、上記第５８項記載の方法。 ７３、工程： ａ、少なくとも１つの生物学的実在物を含有する少なくとも１つの微小滴を、生 存能力をもつ生物学的実在物の数を決定すべき条件に暴露し、ｂ、微小滴中の生 物学的物質の量を測定し、ｃ、関連する微小滴の体積を利用し、そしてｄ、試料 中の体積当たりの生存能力をもつ生物学的実在物の数を計算する、 からなる、試料の体積当たりの生存能力をもつ生物学的実在物の数を決定する方 法。 ７４、関連する微小滴の体積を測定する追加の工程を含む、上記第７３項記載の 方法。 ７５、生物学的物質を測定する工程の前に、少なくとも１つの微小滴との少なく とも１回のインキュベーションを使用する追加の工程を含む、上記第７３項記載 の方法。 ７６、インキュベーション工程の前に生物学的物質の量を測定する追加の工程を 含む、上記第７３項記載の方法。 ７７、生物学的物質の量の変化を使用して生存能力を決定する、上記第７６項記 載の方法。 ７８、少なくとも１つの微小滴を少なくとも１つの生体染料に暴露する追加の工 程を含む、上記第７３項記載の方法。 ７９、統計学的分析を複数の微小滴の測定とともに使用して、試料内の生物学的 実在物の数を決定する、上記第７３項記載の方法。 ８０、統計学的分析はポアッソン統計学および修正したポアッソン統計学から成 る群より選択される式に基づく、上記第７９項記載の方法。 ８１、生物学的実在物は、小さい多細胞の有機体、細胞の群、個々の細胞、原形 質体、小胞体、胞子、オルガネラ、寄生体、ウイルス、核酸分子、抗体分子、抗 原分子、および分子の凝集体から成る群より選択される、上記第７３項記載の方 法。 ８２、生物学的物質を、光学的、秤量、沈降、場の流れの沈降分画、音響、磁気 、電気および熱的手段から成る群より選択される物理学的手段により測定する、 上記第７９項記載の方法。 ８３、生物学的物質および微小滴の体積を光学的に測定し、ここで前記光学的シ グナルは、光の散乱、光の吸収または測色、蛍光、時間遅延蛍光、リン光および 化学ルミネッセンスから成る群より選択される現象に基づく、上記第８２項記載 の方法。 ８４、微小滴を少なくとも１つの染料プロセスで処理する工程をさらに含み、こ こで少なくとも１種の染料は生物学的組成を示す染料、酵素活性を示す染料、お よび細胞膜の完全性を示す染料から成る群より選択される、上記第８３項記載の 方法。 ８５、染料は、核酸の染料、タンパク質の染料、脂質の染料、細胞膜の染料、細 胞壁の染料、酵素活性に対して応答性の染料、トランスメンブレンのポテンシャ ルに対して応答性の染料および細胞表面のレセプターの染料から成る群より選択 される、上記第８４項記載の方法。 ８６、生物学的実在物は、正常のヒトの細胞、ヒトの癌細胞、病原性バクテリア 、病原性酵母菌、マイコプラズマ、寄生体、および病原性ウイルスから成る群よ り選択される、上記第８１項記載の方法。 ８７、生物学的実在物を微小滴中に組み込む追加の工程を含む、上記第７３項記 載の方法。 ８８、工程： ａ、試料から微小滴をつくり、そして ｂ、少なくとも１つの型の生物学的実在物を少なくとも１つの他の型の生物学的 実在物を区別する、少なくとも１つの測定を行う、からなる、少なくとも２つの 型の生物学的実在物を含有する試料中の生物学的実在物を測定する方法。 ８９、各微小滴が２つより少ない型の生物学的実在物を含有する高い確率が存在 する′、上記第８８項記載の方法。 ９０、各微小滴が少なくとも１つの型の生物学的実在物を含有する高い確率が存 在する、上記第８８項記載の方法。 ９１、微小滴の体積を測定する追加の工程を含む、上記第８８項記載の方法。 ９２、第１型の生物学的物質を含有する微小滴を第１型の生物学的物質を含有し ない微小滴と区別するような方法で、微小滴を物理学的に単離する工程をさらに 含む、上記第８８項記載の方法。 ９３、統計学的式を使用して測定値を分析する追加の工程を含む、上記第８８項 記載の方法。 ９４、統計学的分析はポアッソン統計学および修正したポアツソン統計学から成 る群より選択される統計学的式を利用する、上記第９３項記載の方法。 ９５、少なくとも１つの型の生物学的実在物の増殖に影響を与える条件に微小滴 を暴露する工程をさらに含む、上記第８８項記載の方法。 ９６、微小滴中に含有される少なくとも１つの型の生物学的物質の増殖を、微小 滴内に含有される少なくとも１つの他の型の生物学的物質の増殖を比較する追加 の工程を含む、上記第９５項記載の方法。 ９７、生物学的実在物の増殖を使用して、少なくとも２つの型の生物学的実在物 を区別する、上記第９６項記載の方法。 ９８、少なくとも１つの型の生物学的実在物の生存能力の計数を得る工程をさら に含む、上記第９７項記載の方法。 ９９、少なくとも２つの型の生物学的実在物をゲルの微小滴を化合物に暴露する ことによって区別し、前記化合物は、抗体、抗微生物化合物、抗真菌化合物、化 学治療学的化合物、毒性化合物、細胞障害性化合物、不可逆的阻害因子、可逆的 阻害因子、突然変異誘発性化合物、危険化合物、ホルモン、増殖因子、増殖増強 因子、栄養化合物、ビタミン、食物保存剤、農薬、寄生虫および殺虫剤から成る 群より選択される、上記第９７項記載の方法。 １００、生物学的物質、生物学的活性、分子の産生、分子の減成、分子の分泌、 代謝、膜の完全性、酵素活性および増殖から成る群より選択される測定により、 少なくとも２つの型の生物学的実在物を決定する、上記第８８項記載の方法。 １０１、測定は、光学的測定は、光の散乱、光の吸収または測色、蛍光、時間遅 延蛍光、リン光および化学ルミネッセンスから成る群より選択される光学的手段 に基づく、上記第８８項記載の方法。 １０２、マーカー実在物を微小滴中に組み込んで、微小滴の体積の測定を増強す る、上記第９１項記載の方法。 １０３、測定は、光学的、秤量、沈降、場の流れの沈降分画、音響、磁気、電気 および熱的手段から成る群より選択される物理学的手段により行う、上記第８８ 項記載の方法。 １０４、微小滴を少なくとも１つの化合物に暴露する追加の工程を含み、前記化 合物は測定前に生物学的物質に影響を与え、これにより少なくとも２つの型の生 物学的実在物の間の区別を増強する、上記第８８項記載の方法。 １０５、生物学的実在物は、小さい多細胞の有機体、細胞の群、個々の細胞、原 形質体、小胞体、胞子、オルガネラ、寄生体、ウイルス、核酸分子、抗体分子、 抗原分子、および分子の凝集体から成る群より選択される、上記第８８項記載の 方法。 １０６、少なくとも１つのゲルの微小滴中の生物学的物質の量を、生物学的物質 に関連する自然に発生する光学的シグナルを測定することによって測定し、前記 光学的シグナルは、光の散乱、光の吸収または測色、蛍光、時間遅延蛍光、リン 光および化学ルミネッセンスから成る群より選択される、上記第８８項記載の方 法。 １０７、生物学的物質のための少なくとも１種の染料を包含する少なくとも１つ の染料プロセスを利用する工程をさらに含む、上記第８８項記載の方法。 １０８、染料は、生物学的組成を示す染料、酵素活性を示す染料、および細胞膜 の完全性を示す染料から成る群より選択される、上記第１０７項記載の方法。 １０９、少なくとも１種の染料は生物学的実在物の同定のために使用し、そして 少なくとも１種の染料または自然に発生するシグナルを使用して生物学的実在物 の増殖を決定する、上記第１０７項記載の方法。 １１０、少なくとも１種の蛍光標識した抗体を生物学的実在物の同定に使用する 、上記第１０８項記載の方法。 １１１、生物学的実在物は、正常のヒトの細胞、ヒトの癌細胞、病原性バクテリ ア、病原性酵母菌、マイコプラズマ、寄生体、および病原性ウイルスから成る群 より選択される、上記第８８項記載の方法。 １１２、微小滴を前記微小滴に対する作用を有する少なくとも１つの外部の物理 学的力に暴露する工程からなる、非水性流体により囲まれた微小滴を物理学的に 操作する方法。 １１３、物理学的力は、電気力、磁気力、場の流れの沈降分画力、音響力、光学 的圧力、重力、沈降力、非回転の加速力、遠心力および求心力から成る群より選 択される、上記第１１２項記載の方法。 １１４、電気力は、電気泳動力、イオントホレシスカ、界面動電力、静電力およ びクーロンカから成る群より選択される、上記第１１３項記載の方法。 １１５、非水性の環境は、液体炭化水素、鉱油、シリコーン流体、フェロ流体、 および重質アルコールから成る群より選択される、上記第１１２項記載の方法。 １１６、工程： ａ、非水性流体の環境を準備し、 ｂ、前記非水性流体の環境内に複数の帯電した電極を準備し、ここで少なくとも ２つの電極は反対の極性であり、ｃ、電気的に帯電した微小滴を形成することが できる、電気的に帯電した物質を非水性環境中に注入し、そしてｄ、少なくとも １つの帯電した微小滴を少なくとも２つの電極の間の電位の差に関連する電気力 により動かし、これにより非水性流体の環境中で微小滴を形成しそして動かす手 段を準備する、 からなる、非水性流体により囲まれた微小滴を物理学的に操作する方法。 １１７、物理学的力を使用して、微小滴を測定の実在物の付近に動かし、微小滴 を測定の実在物の付近に維持し、そして微小滴を測定の実在物から離すことから 成る群より選択される微小滴の操作を提供する、上記第１１２項記載の方法。 １１８、測定の実在物は、光放射ダイオード、レーザー、電気コンデンサー、電 気インデューサー、電気レジスター、サーミスター、熱電対、ファイバーオプチ クス、フォトダイオード、フォトトランジスター、フォトセル、圧電センサー、 特定のイオン電極、酸素電極、二酸化炭素電極、ｐＨ電極および誘電性質の測定 を可能とする電極から成る群より選択される、上記第１１７項記載の方法。 １１９、物理学的力を使用して、光測定計器、光顕微鏡、蛍光顕微鏡、ルミノメ ーター、フルオロメーター、フォトメーター、時間分解フルオロメーター、像分 析システム、測色計、スペクトロアルオリメーター、粒子カウンター、粒子測定 システム、光音響計器、音響吸収計器、音響顕微鏡、誘電スペクトロメーター、 電気インピーダンス測定計器、カロリメーター、熱的性質測定計器および圧電質 量負荷計器から成る群より選択される測定装置中に位置する微小滴を動かす、上 記第１１２項記載の方法。 １２０、物理学的力を使用して、少なくとも２つの微小滴を接触させる、上記第 １１２項記載の方法。 １２１、物理学的力を使用して、少なくとも２つの微小滴を分離する、上記第１ １２項記載の方法。 １２２、少なくとも１つの微小滴は、小さい多細胞の有機体、細胞の群、偶々φ 細胞、原形質体、小胞体、胞子、オルガネラ、寄生体、ウイルス、核酸分子、抗 体分子、抗原分子、および分子の凝集体から成る群より選択される少なくとも１ 種の生物学的実在物を含有する、上記第１１２項記載の方法。 １２３、微小滴を非水性流体からなる環境で取り囲む追加の工程を含む、上記第 １１２項記載の方法。 １２４、非水性流体の組成を変更することによって、少なくとも１つの微小滴内 の少なくとも１つの化合物の濃度を変更する工程からなる、非水性流体により囲 まれた微小滴を化学的に操作する方法。 １２５、非水性流体の組成は、少なくとも１種の化合物を非水性流体中に溶解す ることによって変更する、上記第１２４項記載の方法。 １２６、非水性流体の組成は少なくとも１つの微小滴を非水性流体に添加するこ とによって変更し、前記微小滴は少なくとも１種の水溶性化合物を含有する、上 記第１２４項記載の方法。 １２７、工程： ａ、少なくとも１種の化合物を第１非水性流体中に溶解し、ｂ、前記第１非水性 流体を第２非水性流体と接触させ、前記第２非水性流体は少なくとも１つの微小 滴を取り囲み、前記化合物は第１非水性流体、第２非水性流体、および水柱媒質 中に溶解することができ、そして ｃ、前記化合物を第１非水性流体から第２非水性流体中に、引き続いて少なくと も工つの微小滴中に分配する、からなる、上記第１２６項記載の方法。 １２８、非水性流体を撹拌し、これにより微小滴中への化合物の分配に必要な時 間を短縮する追加の工程を含む、上記第１２７項記載の方法。 １２９、少なくとも１つの微小滴を、微小滴を取り囲む非水性流体と乳濁液との 接触により添加する、上記第１２７項記載の方法。 １３０、乳濁液および非水性流体を接触後混合する、上記第１２９項記載の方法 。 １３１、乳濁液は非水性流体により取り囲まれたゲルの微小滴から構成されてい る、上記第１２９項記載の方法。 １３２、測定可能な性質をもつ少なくとも１種のトレーサー化合物を少なくとも １つの微小滴に供給する、上記第１２４項記載の方法。 １３３、少なくとも１種のトレーサー化合物を測定して、少なくとも１つの微小 滴に供給された少なくとも１種の他の化合物の量を決定する、上記第１３２項記 載の方法。 １３４、トレーサー化合物の測定可能な性質は、光学的性質、質量密度の性質、 音響性質、磁気性質、電気的性質および熱的性質から成る群より選択される、上 記第１３２項記載の方法。 １３５、光学的性質は蛍光であり、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、ル ツファーイエロー、フィコエリトリンおよびそれらの化学的誘導体から成る群よ り選択される分子を含有するトレーサー化合物に基づく、上記第１３４項記載の 方法。 １３６、乳濁液の非連続的相を電気的に帯電させて微小滴との接触を増強する、 上記第１３０項記載の方法。 １３７、少なくとも１つの微小滴内に含有された少なくとも１種の化合物の変更 した化学的濃度は、抗ウイルス活性、酵素阻害活性、抗微生物活性、抗真菌活性 、細胞障害性活性、および化学治療学的活性から成る群より選択される性質をも つ化合物により変更される、上記第１２４項記載の方法。 １３８、少なくとも１つの微小滴内に含有された少なくとも１種の化合物の変更 した化学的濃度は、酵素触媒反応のための反応成分である化合物により変更され る、上記第１２４項記載の方法。 １３９、反応成分は、フルオレセイン−ジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、レゾ ルフィン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フルオレセインジアセテート、カルボ キシフルオレセインジアセテート、フルオレセインイソチオシアネートジアセテ ート、フルオレセインジガラクトシド、４−メチルウムベリフェロンブチレート 、４−メチルウムベリフェロンホスフェート、１−ナアトールホスフェート、２ −ナフト−ルホスフエート、３−μ−メチル−フルオレセインホスフェート、ナ アトールＡＳホスフエート、ジアセチル２−７−ジクロロアルオレセイン、ホモ バニリン酸、ホモバニリン酸＋ローダミン鉛、ニコチンアミドアデニンジヌクレ オチド（ＮＡＤ）およびレサズリンから成る群より選択される、上記第１３８項 記載の方法。 １３９、微小滴を非水性流体からなる環境で取り囲む追加の工程を含む、上記第 １２４項記載の方法。