CN107619775A - 一种适用于pcr层析法的便携式核酸检测平台 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种适用于PCR层析法的便携式核酸检测平台，其特征在于：反应耗材包括依次螺旋套进的取样管、反应管以及检测卡，其中取样管具有密闭的管盖；反应管中间有能够刺破取样管底部薄膜的棱锥结构；检测卡点样孔具有内螺旋和棱锥结构，反应管可以旋入被刺破，保证反应环境密闭，检测结果不被污染；本发明还涉及一种便携式温度控制循环仪的概念图，具有体积小，循环快等特点，与上述耗材组合后，结合相应的预装反应试剂进行检测，避免了反应过程中的污染，结果直接可视，更重要的是，该平台便于携带，十分适于野外或现场的检测,适合于即时检验（POCT）推广。

Description

一种适用于PCR层析法的便携式核酸检测平台

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及微量样本快速处理，快速扩增和免疫层析判读等多项技术集成和改进的便携式检测平台，尤其适用于室外快速检测。

背景技术

PCR又称聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction )，是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断。PCR的问世，引起了一场分子生物学的革命，它大大加快了各种生物基因组结构研究的过程，有力地推动了现代生物学由细胞水平向分子水平、基因水平的发展，在分子生物学史上具有跨时代的意义。

近些年来，PCR技术发展突飞猛进，不但在基础生物学研究方面起到了重要的工具作用，在医学检测，防疫学检测等领域等发挥的作用越来越重要，在医学检测方面，已经有成熟的荧光定量PCR产品面世，不但能够检测传染病系列，还能检测目标SNP位点、癌症检测等。为疾病诊断提供直接的证据。另外，在农业、工业、海关、检疫等方面的检测学应用上，已经有机构或公司开始研发各类荧光定量PCR检测试剂盒，PCR技术相对于传统的检测方式，有特异，敏感，时效短，准确度强等优势。

随着PCR技术在上述相关领域的应用，也有其相应的局限性也逐渐凸显。如，在基层医疗PCR检测方面，目前的PCR检测方式只能适用于大型医疗机构使用，原因在于荧光定量PCR仪造价昂贵，属于精密仪器，并且需要建立规范的PCR实验室，将取样、核酸提取、核酸扩增等区间严格分开，以避免气溶胶的污染，不适用于基层或偏远地区的检测；

另外，PCR检测技术在海关、农业、防疫等应用的过程中，很多情况下需要现场取样，现场处理并判读结果，当前的技术还不能满足这些要求，需要发明研发相应的便携式核酸检测装置以解决这些问题。

由此可以看出，传统的PCR检测技术有严苛的环境要求，对仪器要求高，本发明涉及一种密闭环境下采样、反应、检测管，通过螺纹旋接的方法，减少了各反应过程之中的气溶胶污染；同时，在个反映管之中预装相应的反应液储存，搭配微型的温控仪和免疫层析试纸，搭建用于PCR层析法的便携式核酸检测平台，十分适于野外现场检测和基层医疗机构的应用推广。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是整合和改进现有的技术，提供一种适用于基层医疗机构和其他现场实时检测的基因检测平台。本发明要解决的另一个技术问题是解决在PCR反应过程中的气溶胶污染，以及杜绝野外环境下对PCR反应的不利影响。

一种适用于PCR层析法的便携式核酸检测平台，包括反应耗材、预装反应液、便携式温度循环仪等几个模块。

其中：所述的采样管具有可密闭的管盖，底部具有耐高温薄膜材料，中间位置设有只允许气体和液体自上而下单方面通过的刚性瓣膜。瓣膜和耐高温薄膜材料之间形成的空间预装核酸微量释放剂。

所述的反应管具有内螺纹结构，中间部分具有能够刺破薄膜的棱锥结构，可以使液体在离心的情况下汇入下端预装了PCR扩增反应液的空间内。

所述的检测卡，应该具有反应管类似的棱锥突起，可以刺破反应管底部的薄膜结构，汇聚PCR扩增产物至胶体金试纸的加样垫上，从而判读结果。

作为优选方案，取样管的瓣膜使用高密度聚丙烯薄膜，为三瓣结构，在离心力的作用下，可以使瓣膜以上的液体穿过瓣膜，与下层预装的微量核酸释放剂混匀，取样管底端包裹的耐高温薄膜，一种优选方案为PP材料。在高温下不变形，并且影响反应。

作为优选方案，反应管使用PP材料制作，棱锥的尖角为20-45^o,棱锥地盘为楼空，可以使得裂解反应液向下流汇入预装的PCR扩增体系。底部包裹的耐高温薄膜为PP材质。

作为优选方案，检测卡使用PE塑料制作，中央的棱锥与反应管类似。

在使用过程中，去微量血液、体液、蚊虫研磨液或菌液，加入到采样管的上腔，再加入适量的封闭剂进行封闭，封闭剂可以是液体石蜡或矿物油，离心混合，将取样管旋入PCR仪的带内螺纹的加热模块中，运行裂解程序。作为一个优选方案，裂解程序为90℃10min-4℃5min。

将采样管在PCR仪上选下，取相对应的反应管，旋入到反应管中。此时反应管的棱锥结构轻易刺破取样管底部的薄膜结构，裂解产物流下，与反应管中预装的PCR扩增试剂混合。由于使用了螺纹接合的方式，保证了空间的密闭性。

将上述反应管旋入到PCR仪的带内螺纹的加热模块中，运行相应的PCR扩增程序。待反应结束后，将上述反应管取下，取相应的检测卡，将反应管竖立旋入到检测卡中，采样卡刺破反应管底部的薄膜，其中液体汇聚到检测卡加样孔，由于使用螺旋接合的方式，保证了气密性，液体沿着胶体金检测试纸层析，判读结果。

和现有技术相比，本发明具有以下优点：1，使用螺纹结构接合，在整个裂解、扩增以及检测过程中，保证气密性，可以解决PCR反应过程中的气溶胶污染的情况。2，取样管和反应管中预装相应的试剂，可以解决在野外实时检测中取样加样等过程的污染。3，本发明介绍的一种一种便携式温度控制循环仪结构简单，只包含加热模块和制冷模块，耗能低，体积小。由于使用了圆形的代内螺纹的结构，使加热的面积扩大，增大了热传递的效率。通过设置相应的反应程序，可以适用于DNA或RNA的全部PCR程序，也可以运行恒温扩增PCR（LAMP）程序。简单的结构使得其兼容性强。4，检测卡可以设计为联卡或单卡，通过胶体金免疫层析技术，是反应直观可读，提高检测效率，及适用于卫生监察、户外科学考察、基层医疗机构诊断、海关快速检疫等相关领域的推广。

说明书附图。

图1 采样管、反应管和检测卡的接合方式。

图2 采样管立体图及剖面结构。

图3 反应管立体图及剖面结构。

图4 棱锥结构示意图。

图5 检测卡结构示意图。

图6 一种便携式温度控制循环仪的概念图。

具体实施方式

一下接合附图和具体实施例对本发明进一步介绍。

实施例1。

使用本发明介绍的平台检测猪携带流行性乙型脑炎病毒携带率，养殖场现场检测。其步骤如下。

1）用一次性注射器取猪耳静脉血5ul，加入到取样管中，加入30-50ul的灭菌液体石蜡，瞬时离心，使血液经过瓣膜，与预装的RNA核酸微量释放剂混合。

所述的RNA微量核酸释放机的组成为：500mM的 KCl、 20% Triton X-100、100mg/ml的蛋白酶K、120mM 的 NaOH、pH值6的 DMS0、终浓度 10%的BSA。将上述取样管旋入到PCR仪中，运行裂解程序：90℃10min-4℃5min。

2）裂解程序完成后，将取样管竖直旋入到反应管中，反应管预装的PCR扩增试剂组成为：无RNA酶水 23.8ul， 5×buffer 10ul ，DNTP Mix 2.0ul，Enzyme Mix 2.0ul，JEV-F1（10mM） 0.6ul，JEV-R1（10mM） 0.6ul，RNA酶抑制剂 1ul。

根据流行性乙型脑炎特异性设计引物，并在引物上标记可以被蛋白抗体特异性识别的分子，举例设计的引物如下：

JEV-F1:DIG-CTCGTGCTTTCGCCTCGAAACTCTA;

JEV-R1:CTCGTGCTTTCGCCTCGAAACTCTA-Biotin。

3）将上述反应管旋入PCR仪中，运行PCR扩增反应，程序如下：第一阶段：95℃，1min酶激活；第二阶段：50℃，30min逆转录；第三阶段：95℃，5min预变性；第四阶段：[95℃，15sec；60℃，45sec] 45个循环；第五阶段：25℃，10sec仪器冷却。

4）待扩增反应结束后，将反应管旋下，去对应的检测卡，垂直旋入，待层析结束后判读结果。

使用的免疫层析试纸制备如下：胶体金颗粒标记鼠IgG和地高辛抗体；检测线标记生物素抗体，控制线标记羊抗鼠抗体。

结果分析，若血液样本中含有流行性乙型脑炎病毒，则检测卡T线显色，若不携带流行性乙脑病毒，试纸T线不显色。

实施例2

使用本发明介绍的平台检测食品生产设备表面志贺氏菌。

根据本发明的特点，其步骤可以分为以下几步。

1）采样：使用一次性灭菌的棉签，沾取无菌水，在规定区域进行涂抹取样，后将棉签上的水滴入取样管中，约5-10ul。加入30-50ul无菌液体石蜡进行封闭。

2）裂解：瞬时离心，使血液经过瓣膜，与预装的RNA核酸微量释放剂混合。

所述的DNA微量核酸释放机的组成为：50mM的 KCl、 25% Triton X-100、10mg/ ml的蛋白酶K、120mM 的 NaOH、pH值8的 DMS0、终浓度 15%的BSA。将上述取样管旋入到PCR仪中，运行裂解程序：90℃10min-4℃5min。

3）裂解程序完成后，将取样管竖直旋入到反应管中，反应管预装的PCR扩增试剂组成为：纯化水 24.8ul， 5×buffer 10ul ，DNTP Mix 2.0ul，Enzyme Mix 2.0ul，SC-F1（10mM） 0.6ul，SC-R1（10mM） 0.6ul。

根据志贺氏菌不同亚型基因的保守型，设计通用性引物，并使用分子标记，引举例为：

Shi-F1:DIG-ATTACGGTAATCCGAATTAACCGA;

Shi-R1:ATTGTTGCCATTACGTCGAGGTCA-Biotin。

4) 将上述反应管旋入PCR仪中，运行PCR扩增反应，程序如下：

。

5) 待扩增反应结束后，将反应管旋下，去对应的检测卡，垂直旋入，待层析结束后判读结果。

使用的免疫层析试纸制备如下：胶体金颗粒标记鼠IgG和地高辛抗体；检测线标记生物素抗体，控制线标记羊抗鼠抗体。

结果分析，若样本中含志贺氏菌，则检测卡T线显色，若无志贺氏菌感染，试纸T线不显色。

本文应用了具体个例对本发明的原理和实施方式进行了阐述，以上实施例说明只用于帮助理解本发明的核心思想和方法，帮助本领域的技术人员了解实施。此外，本领域技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 宝瑞源生物技术（北京）有限公司

<120> 一种适用于PCR层析法的便携式核酸检测平台

<141> 2017-09-20

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> Japanese encephalitis virus

<400> 1

ctcgtgcttt cgcctcgaaa ctcta 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Japanese encephalitis virus

<400> 2

ctcgtgcttt cgcctcgaaa ctcta 25

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Shigella Castellani

<400> 3

attacggtaa tccgaattaa ccga 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Shigella Castellani

<400> 4

attgttgcca ttacgtcgag gtca 24

Claims (4)

1.一种适用于PCR层析法的便携式核酸检测平台,其特征在于包括反应耗材、预装反应液、便携式温度循环仪等几个模块，其中：

所述的采样管（1）具有密闭的管盖（11）、刚性瓣膜（12）、外侧螺纹（13）、耐高温硬质塑料（14）；所述的反应管（2）具有内部螺纹（21）、棱锥结构（22）、外侧螺旋（23）、耐高温硬质塑料（24）；所述的检测卡（3）具有内螺纹的点样孔（31）、棱锥结构（32）、判读视窗（33）；所述的便携式温度循环仪（4）具有内螺旋的加热模块（41）、制冷模块（42）、温度传感器（43）。

2.根据权利要求1所述的采样管（1）中，刚性瓣膜采用硅胶或硬质塑料膜，允许气体和液体在离心的作用下，由上至下单向通过。

3.根据权利要求1所述的棱锥结构（22）（32）中，棱锥（22）在采样管和反应管旋接的过程中，可以刺破耐高温塑料膜（14）；棱锥（32）在采样管和检测卡旋接的过程中，可以刺破耐高温塑料膜（24）。

4.根据权利要求1所述的便携式温度循环仪（4）中，加热模块（41）材料不局限于电阻加热块，电热陶瓷等材料；取样管（1）的外侧螺纹（13）、反应管（2）的外侧螺纹（23）可以旋入加热模块（41）。