CN105400886A - 一种解链式水解探针实时荧光pcr - Google Patents

Abstract

一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征是一种能两两相互结合的TaqMan水解探针，随着特异PCR产物竞争结合而解链、水解而产生荧光；其荧光PCR技术特征是常规5’荧光探针的3’末端添加5-8个与探针中部序列反向互补的碱基后再添上淬灭基团，一探针尾部与另一探针中部互补结合，同时其中部又与另一尾部也结合的二聚体，探针相互结合规避了与过量引物的非特异性聚合扩增，间接也降低了反应基线荧光值。整合无引物二聚体的中部同序引物策略，无热盖的矿物油密闭措施来控制PCR非特异性反应。

Description

一种解链式水解探针实时荧光PCR

技术领域：

本发明属于分子生物学及核酸扩增PCR技术领域，具体涉及一种解链式水解探针及实时荧光PCR技术。

背景技术：

核酸扩增PCR技术是随着现代分子生物学的进步而一起发展、成熟的，早在1953年，核酸DNA双螺旋模型及其中心法则开创了现代分子生物学及奠定了聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)的基础，甚至Khorana于1971年就直接提出了核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。1983年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的KaryMullis在研究核酸测序方法时产生了核酸扩增的灵感：于试管中模拟天然的DNA体内复制过程。提供一种合适的条件---模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间，就可成几何级数地扩增已知两端序列的一段DNA分子。经过一系列探索、发展和耐热聚合酶、热循环仪的发明、应用，Cetus公司于1987年申请了首个PCR发明专利(USPatent4,683,202)。

PCR技术以其独有的高灵敏度、强特异性、简便快速和纯度要求低的特点而成为生命科学研究的核心基础技术。但传统的PCR(又称为终末PCR)需将产物凝胶电泳检测进行结果分析，传统的PCR由于PCR产物量变异大的局限性，只能检测反应终末产物的定性而不能精确定量，同时也没有解决气雾胶污染、引物二聚体、非特异性扩增等难题，因此传统的PCR结合产物凝胶电泳检测方法不适用于临床检验等应用检测。1992年Higuchi等首次提出了采用动态PCR方法和封闭式荧光检测方式对目的基因数量进行分析，为解决传统PCR的难题提出了新思路。1996年由美国AppliedBiosystems公司推出实时荧光定量PCR技术，所谓实时荧光定量PCR技术，是指实时荧光PCR定量分析是通过实时检测扩增产物量(产物标记荧光强度)与起始靶基因量直接相关而定量。扩增产物量增加的荧光信号达到对数期的循环数Ct值(Cyclethreshold)与靶模板起始拷贝数的对数存在负相关线性关系。即起始模板稀释一倍达到同样对数期荧光强度所需的扩增循环就要增加一个循环数(Ct)。该技术实行完全闭管式操作，避免了传统PCR开盖引起的产物污染问题，减少了假阳性结果的出现，同时也避免了对环境的污染。相比于传统PCR电泳的方法，该技术操作简便，检测结果以更客观的数据形式展现，从而对样本进行阳性、阴性和可疑的判定，保证了结果的准确性。

实时荧光定量PCR扩增产物增加的信号既可通过染料法来显示，又可采用带淬灭基团的探针法来检测。染料法即在PCR反应体系中，加入过量荧光染料(如SYBRGreenI)，荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。非特异的染料法成本较低，但面临着类似于传统PCR非特异性扩增产物干扰的假阳性问题。探针法即PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。与染料法相比，探针法在一定程度上避免了假阳性问题的出现，其特异性有引物和探针双重保证，进一步增加了结果的可信度。

被淬灭的荧光探针即可以通过降解而激活，如1995年美国PE公司研制出了Taq酶水解的荧光标记探针及实时荧光定量PCR技术(LivakKJ，etal.，1995，GenomeRes：4：357-362)，于1997年申请了水解探针(商品名：TaqMan)PCR发明专利(USPatent6,485,903)，以及Epoch公司在水解荧光探针基础上增加结合效率的MGB探针(USPatent7,205,105)。相较于TaqMan探针，该探针大大改善了本底信号的干扰，其较短的探针设计不但增强了淬灭效果，降低了荧光背景，同时能够较好地区分等位基因，可以检测单个碱基的突变(SNP)。2009年，美国的IgorV.Kutyavin提出了一种新的PCR检测技术-Snake系统，该系统通过在一条引物5’端添加一段与该条引物扩增产物探针5’端结合位点前面序列相同的特定碱基片段，使再一次扩增的产物自身3’端能够形成茎环状二级结构，再与探针结合后可作为Taq酶最佳的水解底物，增强了Taq酶5’→3’外切核酸酶的效率。不同于TaqMan，Snake系统可以使用较短的探针来改善荧光背景，在信号的产生和序列检测，尤其是单核苷酸检测方面有较强的优势。

被淬灭的荧光探针也可以通过二级结构改变而激活，分子信标Molecularbeacon(TyagiS，etal，1996，NatBiotechnol14：303-308)正是这样一种茎环结构的杂交探针，于1999年申请了Molecularbeacon发明专利(USPatent05925517)，这一结构使荧光基团与淬灭基团紧密接触，从而有效的解决了TaqMan较高的背景荧光问题。其它双杂交(FRET)探针，蝎形(Scorpion)探针，Sunrise-Primer，LuxPimers等使用范围局限于一定的应用，不明显优于水解探针TaqMan方法，且与本发明路线、原理不同。目前临床检验使用最广的是水解探针TaqMan实时荧光PCR，而基础科研还是广泛使用基于荧光染料SYBRGreenI的实时荧光PCR。

常规PCR检测终末反应-平台期扩增产物，一般只需扩增25至30个循环；而实时荧光PCR检测的是对数初期的循环数Ct值，TaqMan等标记探针PCR至少需要扩增40个循环，基于荧光染料SYBRGreenI的实时荧光PCR为了发挥更高灵敏度通常需要扩增45个循环。因此实时荧光PCR技术存在着更严重的引物二聚体非特异性扩增问题，过量的一对引物3’末端互补延伸产生二聚体，再大量被非特异性扩增。引物二聚体一般借助3’末端多个互补碱基配对、互为引物延伸形成二聚体，引物对之间多个连续互补序列可通过常规引物设计方法避免，但有1-2个互补序列不可避免，由于DNA链可弯曲转向，末端少数碱基互补可借助3’末端外的多个不连续互补碱基的合力结合、延伸产生二聚体，在随后热循环中以二聚体为模板结合引物大量非特异性扩增、并结合染料。在不加模板的基于染料SYBRGreenI实时荧光PCR实验中，绝大多数一对引物产生二聚体的循环阈值(Ct值)一般在30个循环左右(JannineBrownie，etal，1997，NucleicAcidsResearch25：3235-3241)，严重干扰低浓度靶分子定量和弱阳性误读。

其实常被忽略的是TaqMan等探针实时荧光PCR亦存在引物二聚体问题，只是不见引物二聚体发射荧光，但会耗尽PCR系统成份，降低扩增效率及灵敏度。更严重的是TaqMan等探针与过量引物之间亦会杂交互补、延伸，在不加模板，仅加一对引物与TaqMan探针的SYBRGreenI实时PCR的Ct值提前至35～25个循环左右，说明引物加探针PCR会形成一些“带探针序列的二聚体、三聚体”，随后非特异性扩增的“二、三聚体”竞争结合大量TaqMan探针，导致弱阳性模板不易结合探针而可能漏检。TaqMan-分子信标的使用，在一定程度上解决了荧光基线的问题，增加了探针的特异性，但直接首尾端的互补，并没有杜绝引物和探针的聚合现象(孔德明等，2003，化学学报，755-759)。为了消除或减少引物与探针结合、延伸的非特异性扩增干扰，本发明“一种解链式水解探针实时荧光PCR”整合了5’端TaqMan探针的荧光标记和结合探针中部序列的3’端分子信标MolecularBeacon标记淬灭基团的技术路线，并对其结构进行调整，使探针分子之间相互结合，从而消除或减少与引物聚合的非特异性问题。

发明内容：

为了克服标记探针与引物对间形成聚合体造成的TaqMan实时荧光PCR的非特异性干扰靶扩增，以及引物非特异性竟争结合导致弱阳性标本容易漏检的局限。本发明“一种解链式水解探针实时荧光PCR”，其综合了水解荧光探针TaqMan和分子信标MolecularBeacon的原理技术，并对其结构进行调整，探针5′端具有与水解荧光探针TaqMan的相同作用机理，利用Taq酶5’-3’外切酶活性水解与靶序列杂交的探针而切割释放报告荧光基团；探针3’端靶序列外添加5～8个与离5’端3～14个后面的中部序列反向互补的碱基再标记淬灭荧光基团。由于环状结合部分较短杂交使自身较难形成锅柄样结构，但两探针两段结合力大而很容易互补结合，这样不仅加强抑制本底荧光，也规避了探针与过量引物间形成非特异性杂交延伸的聚合体，兼容了Molecularbeacon本底低和TaqMan灵敏、特异的优点，从而消除或减少了引物和探针聚合出现指数扩增而干扰检测结果，见图1。联合使用热盖时，在反应的过程中，矿物油表面的残留反应液会被蒸发至热盖而继续残留在矿物油表面，随着反应条件的变化，也会经历循环的过程，产生较多的含有扩增产物的气雾胶。而不使用热盖时，矿物油表面的残留液会蒸发至管盖，离矿物油下面的反应液较远，其温度也不易随着模板扩增而变化，产生的气雾胶也较少。所以，在进行实时荧光定量PCR检测时，单独使用矿物油封闭而不加热盖是保证检测结果准确性的前提。

所述的一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征是一种TaqMan和MolecularBeacon重新组合并对其结构进行调整的解链式探针及实时荧光PCR技术，其关键是探针5’端荧光基团标记的常规碱基序列仍能被Taq酶的外切酶活性水解产生荧光，3’端靶序列外添加5～8个与5’端3～14个碱基之后的中部序列反向互补的人为碱基再标记淬灭荧光基团的解链式探针实时荧光PCR检测技术。

所述的解链式探针是指模板序列探针5′末端标记荧光素且在PCR中可被DNA聚合酶外切酶活性水解；3’端靶结合序列外添加5～8个与5’端4～10个碱基之后的中部序列反向互补的人为碱基再标记淬灭荧光基团，由于环状结合部分较短杂交使自身较难形成锅柄样结构，但两探针两段结合力大而很容易互补结合，这样不仅加强抑制本底荧光，也规避了探针与过量引物间形成非特异性杂交延伸的聚合体，兼容了Molecularbeacon本底低和TaqMan灵敏、特异的优点。

所述的荧光探针设计策略原则是：首先选取一段小于40nt的靶荧光探针序列并遵守一般常规荧光探针设计所有原则，再在其3′末端多加5～8个与离5’端4～10个后面的中部序列反向互补的碱基，且在最末端标记淬灭剂TAMRA(6-羧基-四甲基-罗丹明rhodamine)、DABCYL或BHQ1等，则探针5′端可选择标记荧光素FAM、HEX或TET。

所述的实验条件同于一般常规TaqMan探针实时荧光PCR反应体系。为了更进一步增加扩增特异性和减少循环前低温非特异性反应，联合采用各种热启动DNA聚合酶，化学修饰耐热聚合酶或加热缓释Mg²⁺缓冲液等各种PCR优化方法，将更加极大地完善本发明一种解链式水解探针实时荧光PCR质量。

所述的引物采用中部5-8个碱基同序的引物对以减少引物二聚体PD程度，从而减少对靶扩增的竞争性抑制，提高灵敏度。

所述的PCR反应液加等体积的矿物油单独使用，封闭反应液，不联用热盖条件。

所述的技术用于基因检测试剂盒，盒成份包括：核酸提取试剂，5mMdNTPs，TaqDNA聚合酶及其缓冲液，荧光探针，上游引物F/下游引物R，标准对照物，纯化水dH₂O，矿物油。

在一般PCR反应体系中，既存在引物与靶模板结合的特异性扩增，亦存在过量引物与过量非特异模板，包括引物与引物，或引物与探针等短Oligo杂交、延伸的聚合体非特异性扩增，这种非特异性扩增一般在30个左右热循环开始进入对数增长期，非特异性扩增开始严重起来，对于一般PCR而言，30个热循环扩增产物量足够用了，大多PCR可以结束了，如果没有二聚体扩增产物的污染以及污染被反复扩增，引物二聚体对于大多数30个热循环以内的PCR影响不太大。而实时荧光PCR第30-40个热循环正位于其黄金检测窗口期，因此严重干扰低浓度靶分子精确定量和弱阳性标本准确定性。仅仅引物与非特异模板结合扩增是为线性扩增，远赶不上指数放大，所以引物二聚体指数扩增才是非特异主要原因。引物二聚体的形成是因为过量的一对引物3’末端存在互补序列而杂交、并互为引物延伸产生引物二聚体，在随后热循环中以二聚体为模板非特异性指数扩增，大量产生引物二聚体DNA。引物对3’末端存在的多个连续互补碱基可通过常规引物设计原则而避免，但由于核酸DNA仅由4种碱基排列组合，核酸Oligo末端有1-2个互补碱基就无法避免；由于DNA单链易弯曲转向，引物对3’末端1-2个互补碱基虽不够独立形成稳定氢键，但仍可借助引物转向后3’末端外的多个互补碱基包括多个不连续互补碱基的氢键合力而结合，延伸数个碱基后产生稳定的互补序列，进而产生完整的引物二聚体。引物二聚体虽不直接干扰TaqMan探针工作，但其竞争性地消耗PCR试剂成份包括引物、聚合酶、酶底物等，显著降低扩增效率，进一步减低TaqMan实时荧光PCR检测灵敏度。

TaqMan等探针实时荧光PCR反应中，过量的一对引物还会与过量的较长探针杂交聚合，首先产生两种引物与探针序列杂交、部分延伸的不完整二聚体，两种不完整二聚体再在PCR热循环反应中互为引物而杂交、延伸并被大量非特异性指数扩增，产生带部分探针序列的“引物-部分探针-引物”三聚体。一般探针序列两末端的标记率均只有70％-80％左右，剩余20％的3’末端羟基游离的探针Oligo会直接与两种引物3’末端杂交、延伸并大量指数式扩增，产生非特异性扩增的“引物-探针”聚合及假阳性反应(夏乾峰.二聚体突变引物定量PCR技术的研发及其临床应用[D].重庆医科大学，2011.)，见表2。带部分探针序列的二聚体、三聚体将与特异性靶分子竞争结合荧光标记TaqMan探针，部分探针序列的竟争结合并不能使其5’端标记荧光基团被水解，但是减少了TaqMan探针与特异性靶分子结合几率从而也就减少了TaqMan探针5’端特异性水解，降低了系统检测灵敏度，造成弱阳性标本不被检出、有漏检的可能。TaqMan探针法中引物二聚体的竞争性抑制作用可引起浓度低一个数量级的靶分子出现假阴性(陆中奎.热带医学杂志，2013，13(6)：752-755)。

水解探针TaqMan是一种实时荧光PCR检测寡核苷酸探针，它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对并尽量靠近一端引物，但又不重叠(间隔一个碱基以上)的一段寡核苷酸(＜40nt)，其5’末端标记报告荧光基团，淬灭剂TAMRA(6-羧基-四甲基-罗丹明rhodamine)则连接在3’末端。当探针完整时，通过共振能量转移(FRET)作用，因荧光基团发射的荧光与淬灭剂的接近而被抑制、产生荧光淬灭效应。当PCR反应时，完整的探针先与目标序列配对杂交，当引物退火延伸，新合成的DNA链接近探针杂交位置时，DNA聚合酶利用其所带的外切酶活性将探针切开，使报告荧光基团释放到反应缓冲液中，当荧光基团与淬灭基团分离时就发出荧光，DNA链合成继续进行，直到扩增循环结束。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。

分子信标(MolecularBeacon)是一段双重标记的寡核苷酸(25-40nt)，形成具有一个环(探针)和一个自身末端互补的茎(添加序列)的发夹结构。荧光报告分子标在5’末端，抑制作用范围小的淬灭基团Dabcyl[4-(4’-二甲氨基苯基偶但氮)安息香酸]标在3’末端。室温条件下，分子信标形成发夹结构，荧光报告分子和淬灭基团通过信标自身互补形成的茎结构紧密靠近在一起，因而抑制了荧光信号。当PCR变性后退火时，分子信标遇到靶DNA链，根据热力学原理，信标探针将与靶DNA结合而不是形成发夹结构。由于茎结构破坏，荧光报告基团与弱作用淬灭基团相对分离开，报告基团得以发射荧光。

综合水解探针和分子信标技术原理，本发明“一种解链式水解探针实时荧光PCR”是互补的部分推后至中部的水解荧光探针及其实时荧光PCR。探针5′端具有与水解荧光探针TaqMan的相同作用机理，利用Taq酶5’-3’外切酶活性水解与靶序列杂交的探针而切割释放报告荧光基团；探针3’端靶序列外添加5～8个与离5’端3～14个后面的中部序列反向互补的碱基再标记淬灭荧光基团。由于环状结合部分较短杂交使自身较难形成锅柄样结构，但两探针两段结合力大而很容易互补结合，这样不仅加强抑制本底荧光，也规避了探针与过量引物间形成非特异性杂交延伸的聚合体，兼容了Molecularbeacon本底低和TaqMan灵敏、特异的优点，从而消除或减少了引物和探针聚合出现指数扩增而干扰检测结果。同时根据Hands(NucleicAcidsRes.，Vol.25-16p3215)技术完全同序引物绝没有PD扩增，又根据中国专利(一对部分同序引物减少其二聚体的方法：中国，CN201010105371.8)部分同序引物部分减少PD程度，同序放在引物中部的关键部位能最大程度地减少PD。

本专利使用上海生工生物工程有限公司生产的引物、dNTPs，TaqDNA聚合酶，荧光探针，上游引物/下游引物等PCR成分配制PCR反应液，在西安天隆TL-988II和上海宏石SLAN-96P实时荧光PCR仪进行实时荧光PCR反应，并对实验结果进行分析。

本专利采用SYBRGreenI染料法检测普通引物对和中部同序引物对的PD扩增发现，普通引物对的本底Ct值在30左右，中部同序引物对的本底Ct值在38左右，中部同序引物对的PD非特异性扩增明显低于普通引物对(图2)。采用一种解链式水解探针实时荧光PCR法检测普通引物对和中部同序引物对结合解链式水解探针检测系列稀释的β-globin模板，结果显示，普通引物对可以检测到3×10³copies/mL稀释度(如图3A)，中部同序引物对可以检测到3×10²copies/mL稀释度(如图3B)，TaqMan探针法中使用中部同序引物对检测灵敏度相比于普通引物对好一个数量级。HBV中部同序引物结合解链式水解探针检测结果灵敏度达Ct35-37，见实施例。

尽管TaqMan及MolecularBeacon探针法实时荧光PCR使用荧光探针绕开了PD的非特异性信号；但是引物对与探针之间仍存在一定的聚合非特异性扩增，其产物能结合并水解荧光TaqMan/MGB探针，产生本底Ct值33-36左右的内源性假阳性扩增，尽管扩增曲线很低，但经过5-7次重复PCR反应后，扩增曲线显著增高，且本底Ct值逐渐前移，见表2。

本专利对比TaqMan探针、Molecularbeacon和解链式水解探针(探针序列见表1)的假阳性积累实验，结果显示TaqMan探针和Molecularbeacon开始即产生假阳性，并随着实验次数的增多逐渐加重；解链式水解探针从第7次重复PCR反应开始才产生假阳性，随着实验次数的增多缓慢加重(表2、图4)。解链式水解探针的性能明显好于TaqMan探针和Molecularbeacon。

表1探针序列

表2假阳性积累结果

实时荧光PCR“闭管热盖操作”代替单独使用矿物油或联合使用矿物油均不密闭，热循环条件下塑料PCR管盖大量泄漏气雾胶，就是联合使用矿物油，加矿物油时溅起的油面上少量PCR反应液在热盖条件下仍有效扩增泄漏，只不过较单独“闭管热盖操作”的气雾胶程度要轻一些而已；热盖较单独矿物油反而是一种退步。单独使用矿物油密闭是保证TaqManPCR稳定可靠的前提保证。本专利使用TaqMan探针在热盖、矿物油加热盖及矿物油无热盖三种条件下进行假阳性聚合实验，结果显示，矿物油无热盖(单独使用矿物油)PD严重程度低于其他两组(如图5)。

附图说明：

图1.为一种解链式水解探针示意图，白色圆圈代表荧光基团，黑色圆圈代表淬灭基团，长线条代表碱基序列。探针5′端具有与水解荧光探针TaqMan的相同作用机理，利用Taq酶5’-3’外切酶活性水解与靶序列杂交的探针而切割释放荧光基团；探针3’端靶序列外添加5～8个与离5’端3～14个后面的中部序列反向互补的碱基再标记荧光基团。由于环状结合部分较短杂交使自身较难形成锅柄样结构，但两探针两段结合力大而很容易互补结合。

图2.为SYBRGreenI染料法检测普通引物对和中部同序引物对的PD扩增，结果显示，普通引物对PD非特异性扩增的Ct值在30左右，中部同序引物对PD非特异性扩增的Ct值在38左右，中部同序引物对的PD非特异性扩增明显低于普通引物对。

图3.为普通引物对和中部同序引物对进行稀释的β-globin模板梯度实验，结果普通引物对可以检测到3×10³copies/mL稀释度，中部同序引物对可以检测到3×10²copies/mL稀释度，解链式水解探针实时荧光PCR法中使用中部同序引物对检测灵敏度相比于普通引物对好一个数量级。

图4.为TaqMan探针、Molecularbeacon和解链式水解探针的假阳性积累，结果单TaqMan探针和Molecularbeacon开始即产生假阳性，并随着实验次数的增多逐渐加重；解链式水解探针从第7次重复PCR反应开始才产生假阳性，随着实验次数的增多缓慢加重。

图5.为TaqMan探针在热盖、矿物油加热盖及矿物油无热盖三种条件下进行假阳性聚合实验，结果热盖的假阳性随PCR重复次数增加而前移幅度最大，热盖加矿物油稍好于热盖，矿物油无热盖(单独矿物油)的假阳性PD严重程度均低于其他两组。

图6.为人乙型肝炎病毒解链式水解探针实时荧光PCR检测标准品pHBcore10倍稀释标准曲线，结果Ct值依次为15.6，19.1，23.2，26.4，29.3，31.5，35.4，本底对照Ct值在40循环内基本为一直线。对应的拷贝数为其2.8×10⁹，2.8×10⁸，2.8×10⁷，2.8×10⁶，2.8×10⁵，2.8×10⁴，2.8×10³copies/mL，和本底0copies/mL。

图7.为人乙型肝炎病毒解链式水解探针实时荧光PCR检测国家线性灵敏度参考品L0-L63次重复检测，结果线性灵敏度参考品L0-L5检出全部为阳性，定量浓度值也符合给出参考范围，相关系数R²不低于0.98。

图8.为人乙型肝炎病毒解链式水解探针实时荧光PCR检测国家阳性参考品P1-P9，检测结果全部为阳性。

图9.为人乙型肝炎病毒解链式水解探针实时荧光PCR检测国家阴性参考品N1-N8，检测结果全部为阴性。

具体实施例：

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、条件、步骤及应用所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实例一：人乙型肝炎病毒实时荧光PCR检测：

探针法实时荧光PCR主要以TaqMan探针为代表，也包括增加结合力的MGB探针和锁核酸LNA碱基探针。扩增产物增加的信号通过带淬灭基团的荧光探针来检测。一般TaqMan探针5′端标记FAM、VIC、NED等荧光基团，3′末端标记TAMRA、DABCYL或BHQ1等淬灭基团，被淬灭荧光的TaqMan探针通过Taq酶的5′外切酶水解而游离荧光基团产生荧光。TaqMan探针设计尊循以下一般原则：1)探针的T_m值比引物的T_m值要高10℃以上；2)探针5′端不能是G碱基，被酶切降解的G仍具有淬灭报告荧光作用；3)探针中的G不能多于C；4)避免单一核苷酸成串，尤其是G；5)富含AT的序列要增加长度，以达到符合要求的T_m值，但探针必须＜40nt，否则淬灭效率低，反应本底高；6)探针退火时，其5′端应尽可能接近引物，同时又不重叠，离引物的3′端至少一个碱基远；7)检测单碱基变异(SNP)时，突变点尽量置于探针中间或靠近5′端，探针尽可能短；8)探针做mRNA表达分析时，探针序列应包括外含子/-/外含子边界；9)探针的3′端必须淬灭剂封闭以防止PCR扩增时延伸。

本发明采用解链式水解探针实时荧光PCR反应，选取靶基因(临近下游一端引物)的一段代表性序列(nt：2306-2444)，靶特异性序列(/互补序列)5’端标记报告荧光染料FAM，利用Taq酶5’-3’外切酶活性水解与靶序列杂交的探针而切割释放荧光基团；探针3’端靶序列外添加5～8个与离5’端3～14个碱基后面的中部序列反向互补的碱基再标记淬灭基团TAMRA，由于环状结合部分较短杂交使自身较难形成锅柄样结构，但两探针两段结合力大而很容易互补结合，这样不仅加强抑制本底荧光，也规避了探针与过量引物间形成非特异性杂交延伸的聚合体，兼容了Molecularbeacon本底低和TaqMan灵敏、特异的优点，从而消除或减少了引物和探针聚合出现指数扩增而干扰检测结果。同时根据一般探针设计原则设计一条含反义2’-O-Methyl碱基的探针。

本实例精选乙型肝炎病毒(HBV)核心Core区(CDR：2306-2444)一段序列作为HBV同序引物置换的核酸扩增靶特异序列，展示两端各20碱基Core区(nt：2306-2444)序列如下：

AB540584Core区(nt：2306-2444)

CAAATGCCCCTATCTTATCAAC——GTCGCAGAAGATCTCAATCTC

根椐一般引物选取原则以尽量减少引物二聚体和中国专利(一对部分同序引物减少其二聚体的方法：中国，CN201010105371.8)部分同序引物综合考虑，设计HBVcore探针法荧光PCR引物：

HBVc引物序列如下：

THBVFc：5′-caaatgcccctatcttateaac-3′

THBVRc：5′-gagattgagatcttctgcgac-3′

其中F代表上游引物序列，R代表下游直接靶特异引物，粗体代表同序碱基。

根椐一般探针选取原则和解链式水解探针综合考虑，设计HBVcore探针法荧光PCR解链式水解探针：

TqHBc：5’-FAM-cgtctgcgaggcgagggagttcttcttctagaactc-TAMRA-3’

或反义碱基探针：5’-FAM-cgtctgcgaggc/i2omeg/agg/i2omeg/agttcttcttctagc-BHQ1-3’

(1)临床血标本DNA提取：

柱离心方法：取全血200μL，加等体积的饱和酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)抽提一次，再氯仿抽提一次，上清加3倍的DNA结合缓冲液(6M碘化纳NaI)移至商业DNA纯化柱(质粒小提纯化柱，详细步骤按Qiagen/Tiagen说明书进行)，洗涤缓冲液(含70％EtOH的2MNaI液)洗柱两次，加40μLdH2O洗脱收集纯化的样本。大量体积酚-氯仿抽提液须加1/10体积的3M乙酸钠(pH5.2)和2.5倍无水乙醇或等体积的异丙醇沉淀。

PEG沉淀方法：取血清100μL，加100μL的16％PEG沉淀液，涡流混匀，高速离心10分钟，弃上清，剩余浓缩沉淀中加入50μL煮沸裂解液，轻混，置沸水或金属浴中煮沸10分钟，高速离心10分钟，上清即提取的DNA溶液。

微磁珠方法：采用盐酸胍/异硫氰酸胍裂解，核酸在高浓度4M胍盐条件下结合至聚苯乙烯微磁球硅烷化表面羟基(Melzaketal，1996)，用小于pH6.0的缓冲液洗涤，大于pH8.5缓冲液洗脱。微磁球法已经越来越多地取代酚-氯仿抽提液体方法和硅吸附膜离心柱方法。

取血清100μL于1.5mLEP管中，加等体积的胍盐裂解液5分钟，加0.8mL稀释中和液后再加25μL顺磁纳米硅化微球结合，将试管置于磁分离试管架吸附固定磁微球，弃液后，加0.8mL洗液洗涤一次，最后磁微球加50μL洗脱液收集DNA。

(2)TaqMan实时荧光PCR反应：

由于TaqMan探针PCR每个模板每次循环最多释放一个荧光基团，其反应荧光强度远低于SYBRGreenI荧光染料法(每3-4bpDNA能结合一个SYBRGreenI分子)，所以TaqMan法必须采用较大体积的50μL反应体系，以使PCR仪器能接受到足够强度的荧光信号。

首先每个PCR反应管加2μL缓释引物R(2.5μM)，缓释引物热启动和防产物气雾胶污染。再按表3配方取1.5mL的EP管配制不含待测模板和引物R的反应混合液。

(^☆探针荧光会逐渐衰减，旧标记探针可相应多加一些。所用引物、dNTPs，TaqDNA聚合酶，荧光探针，引物F/引物R等均购自上海生工生物工程有限公司，10×PCRbuffer有本公司自主生产。)

所配的反应混合液共0.95mL分装于预加缓释引物的PCR反应管/或8联排管，每管38μL分装25管。其中一管加10μL纯化水dH₂O作为PCR系统阴性对照，其余管按顺序加入10μL待检DNA后，表面再小心、缓慢地沿管壁加上50μL矿物油封闭，短瞬离心，切记不要混匀！以防破坏缓释。为了检测结果的可靠性，每次检测必须设立实验阳性阴性对照和定量校准品(根据是否定量需要)。

每个检测可平行2-3份×50μL计平均Ct值，分析统计结果。

标准曲线：

以pUC-HBcore(3.36kb，分子量MW＝2.1×10⁶，计1μg＝2.8×10¹¹copy分子)计算，相应标准品梯度分子拷贝数为：2.8×10⁹copies/mL，2.8×10⁸copies/mL，2.8×10⁷copies/mL，2.8×10⁶copies/mL，2.8×10⁵copies/mL，2.8×10⁴copies/mL和2.8×10³copies/mL。

反应管上实时荧光PCR仪(调整仪器激发光波长FAM：480nm，检测光波长FAM：520nm)。按使用说明书设置运行程序，首先进行一个预反应50℃2分-94℃3分钟；然后PCR扩增40个热循环：94℃30秒，58℃60秒；于58℃读取荧光值。

(3)实验结果分析：

HBV核心抗原质粒对照pUC-HBcore标准定量曲线的最左边第一条扩增曲线约为2.8×10⁹copies/mL，随之作10倍稀释，最后一条扩增曲线为没有模板的本底对照，结果本底对照Ct值在40循环内基本为一直线，在PCR反应内几乎没有扩增Ct值(图6)。

购买中检所乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量标准品(批号0711)线性灵敏度参考品(图7)及阳性参考品(图8)检测结果基本一致，阴性参考品全为基线反应(图9)。线性灵敏度参考品的灵敏度可达Ct35-37。

(4)临床试验结果：

临床研究对比上海克隆生物高技术有限公司检测700份临床样本，包括慢性乙型肝炎332例，急性乙型肝炎156例，乙型肝炎带原者56例，肝癌6例，其中B基因型103例，C基因型436例，D基因型11例；肝硬化8例，肝囊肿7例，丙型肝炎8例，甲肝3例，戊肝2例，健康人102例，糖尿病等其他疾病20例。本研究共包含干扰样本10例(溶血样本4例，脂血样本3例，甘油三酯样本3例)，检测结果均为阴性，表明干扰物质对检测结果无显著影响。

与上海克隆生物高技术有限公司试剂相比，阳性符合率为99.64％，阴性符合率为98.01％，总体符合率为99.29％。经Kappa检验，kappa值为0.966，大于0.8，说明两种试剂的检测结果高度一致。本试剂试剂测量值为Y变量，对比试剂测量值为X变量拟合线性回归方程，Y＝0.969x+0.373，其斜率为(95％可信区间)为0.969，P＜0.001，线性回归方程具有统计学意义(F值46518.951，P＜0.001)，相关系数(R)为0.993，P＜0.001，R²为0.985。说明两试剂检测结果具有高度相关性。

Claims (7)

1.所述的一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征是借鉴MolecularBeacon首尾自身结合的一种两两相互结合并随扩增产物解链的TaqMan荧光探针及PCR技术；其关键是探针5’端荧光基团标记的常规碱基序列仍能被Taq酶的外切酶活性水解产生荧光，3’端靶序列外添加5～8个与5’端3～14个碱基之后的中部序列反向互补的人为碱基再标记淬灭荧光基团的新性能探针实时荧光PCR检测技术，以减少实时荧光定量PCR的本底非特异性。

2.根据权利要求1所述的一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征在于，所述的解链式探针是指模板序列探针5′末端标记荧光素且在PCR中可被DNA聚合酶外切酶活性水解；3’端靶结合序列外添加5～8个与5’端4～10个碱基之后的中部序列反向互补的人为碱基再标记淬灭荧光基团，由于环状结合部分较短杂交使自身较难形成锅柄样结构，但两探针两段结合力大而很容易互补结合，这样不仅加强抑制本底荧光，也规避了探针与过量引物间形成非特异性杂交延伸的聚合体，兼容了Molecularbeacon本底低和TaqMan灵敏、特异的优点。

3.根据权利要求1所述的一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征在于，所述的荧光探针设计策略原则是：首先选取一段小于40nt的靶荧光探针序列并遵守一般常规荧光探针设计所有原则，再在其3′末端多加5-8个与5’端4～10个碱基之后的中部序列反向互补的人为碱基，且在最末端标记淬灭剂TAMRA(6-羧基-四甲基-罗丹明rhodamine)、DABCYL或BHQ1等，则探针5′端可选择标记荧光素FAM、HEX或TET。

4.根据权利要求1所述的一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征在于，所述的实验条件同于一般常规TaqMan探针实时荧光PCR反应体系；为了更进一步增加扩增特异性和减少循环前低温非特异性反应，联合采用各种热启动DNA聚合酶，化学修饰耐热聚合酶或加热缓释Mg²⁺缓冲液等各种PCR优化方法，将更加极大地完善本发明一种解链式水解探针实时荧光PCR质量。

5.根据权利要求1所述的一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征在于，所述的引物采用中部5-8个碱基同序的引物对以减少引物二聚体PD程度，从而减少对靶扩增的竞争性抑制，提高灵敏度。

6.根据权利要求1所述的一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征在于，所述的PCR反应液加等体积的矿物油单独使用，封闭反应液，不联用热盖条件。

7.根据权利要求1所述的一种解链式水解探针实时荧光PCR，其特征在于，所述的技术用于基因检测试剂盒，盒成份包括：核酸提取试剂，5mMdNTPs，TaqDNA聚合酶及其缓冲液，荧光探针，上游引物F/下游引物R，标准对照物，纯化水dH₂O，矿物油。