CN103205425B - 抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其通过结合引物3’端的反义寡核苷酸来干扰PCR引物3’末端非特异性的扩增，所述的反义寡核苷酸是特指一段4-14base由反义碱基组成的寡聚核苷酸。其基本特征在于反义碱基寡核苷酸保留Watson碱基配对杂交性能，但失去了作为PCR扩增模板和引物功能，通过纳米微球固相化反义寡核苷酸来间接固相化引物于PCR系统缓释热启动，配合矿物油封闭PCR而杜绝气雾胶交叉污染，使PCR反应不会产生非特异性扩增。反义寡核苷酸适用于有引物退火、延伸的各种PCR技术包括阵列扩增技术。

Description

抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸

技术领域：

本发明属于分子生物学及分子检验领域的核酸扩增技术领域，具体涉及通过反义“死”寡核苷酸竞争非特异性模板来干扰引物聚合等非特异性扩增的技术领域。

背景技术：

核酸扩增技术起源于1971年，Korana首先提出核酸体外扩增设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。其思想种子进入到现代分子生物学发展的土壤就会生根、发芽。终于1983年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Kary Mullis在研究核酸测序方法时产生了核酸扩增的灵感：于试管中模拟天然的DNA体内指数式复制过程。其基本原理：提供一种合适的条件---模板DNA，寡聚核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间，就可成几何级数地扩增已知两端序列的一段DNA分子。经过一系列探索、发展和耐热聚合酶、热循环仪的发明、应用，Cetus公司于1987年申请了首个PCR发明专利(US Patent 4,683,202)。

核酸扩增PCR反应由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：拟扩增的模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至54℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：升温至72℃左右，DNA模板--引物结合物在耐热DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，尊循碱基反向配对与半保留复制原理，按5’-3’方向合成一条新的与模板DNA链反向互补的半保留复制链，不断重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。一般PCR进行30个循环就能将待扩目的基因呈指数扩增放大数百万倍以上，超过30个循环引物二聚体非特异性扩增就极剧增加。反应最终的DNA扩增量可用Y＝(1+X)ⁿ计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100％，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期PCR产物逐渐增加，进入一定循环后靶序列DNA片段的增加呈指数形式即对数期，随着扩增产物的累积及PCR成份的消耗，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，达到“停滞效应”平台期。

随着1985-1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到Taq耐热DNA聚合酶以及pfu、Vent、Tth等其它耐热聚合酶的发现应用，PCR技术逐渐成熟、实用，并因其高灵敏度、操作简便而快速传播全世界，因而1989年称为“PCR爆炸年”。PCR技术已成为生命科学领域最重要的核心基础技术，Kary Mullis也因此荣获1993年诺贝尔化学奖。

在以后的二十年里，多达数十种PCR新改进，新方法不断涌现，被发明，包括反转录PCR(RT-PCR)，原位PCR，连接酶链反应(Ligase chain reaction，LCR)，标记PCR(Labeled primers，LP-PCR)，反向PCR(reverse PCR，扩增两引物外侧未知序列)，不对称PCR(asymmetric PCR)，降落PCR(touchdown PCR)，重组PCR(recombinant PCR)，巢式PCR(nest PCR)，多重PCR(multiplex PCR)，免疫-PCR(immuno-PCR)，mRNA差异PCR，链替换扩增(Stranddisplacement amplification，SDA)，依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-basedamplification，NASBA)，转录依赖的扩增系统(Transcript-based amplification system，TAS)，Qβ复制酶(Q-beta replicase)催化RNA扩增，滚环扩增(Rolling circle amplification，RCA)，环介导的等温扩增(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)等，尤其是各种实时荧光PCR(Real-time PCR)技术的发展实现了从定性测定到精确定量的飞跃，如荧光染料SYBR Green I实时荧光PCR和各种荧光探针Taqman(Hydrolysisprobe)，FRET Hybridition probes，andMolecular Beacons PCR，详见综述(Maisa L.Wong and Juan F.Medrano，BioTechniques39：75-85，July 2005)。核酸扩增技术不仅极大提升了基因克隆技术也提高了核酸检测灵敏度、效率，PCR应用已拓展到生物学的众多领域。PCR技术已不是单一技术方法，而是包括一系列理论、方法学及应用的新学科。详细综述于PCR书籍(黄留玉等“PCR最新技术原理、方法及应用”化学工业出版社2005年)，PCR广泛应用于分子克隆、测序、基因重组、蛋白质工程等生命科学研究，及医疗、农林、畜牧、环保、食品等众多检测应用领域，已成为二十一世纪生物学最核心的基础技术。近年来，在PCR基础上为提高检测效率而发展出了许多增加热循环速度的快速微流体缩微PCR(lab-on-chip)和多重靶检测的高通量纳升PCR芯片(PCR-on-chip)，详见论文SURVEY and SUMMARY，Da Xing(2007)Nucleic AcidsRes.，Vol.35，No.13，p4223-4237，截至目前全世界PCR专利或相关的设计更是多达四至五位数以上。

综上，常规终末检测PCR只能定性分析，灵敏度不够，低于1000拷贝数标本测不了否则引物二聚体非特异性扩增导致假阳性结果，以及扩增产物汽雾胶再污染所致假阳性等难题，常规PCR加产物凝胶电泳检测方法难以适用临床检验等应用检测。1992年Higuchi等首次提出了采用动态PCR方法和封闭式荧光检测方式对目的基因数量进行分析，为解决传统PCR的难题提出了新思路。实时荧光PCR定量分析是通过实时检测扩增产物量(产物标记荧光强度)与起始靶基因量直接相关而定量。扩增产物量增加的荧光信号达到对数期的循环数Ct值(Cycle threshold)与靶模板起始拷贝数的对数存在负相关线性关系。即起始模板稀释一倍达到同样对数期荧光强度所需的扩增循环就要增加一个循环数(Ct)。扩增产物增加的信号既可通过产物DNA结合荧光染料显示，如基于荧光染料SYBR Green I的实时荧光PCR(US Patent6,569,627)；又可采用带淬灭基团的荧光探针来检测。被淬灭的荧光探针即可以通过降解而激活，如1995年美国PE公司研制出了Taq酶水解的荧光标记探针及实时荧光定量PCR技术(Livak KJ，et al.，1995，Genome Res：4：357-362)，于1997年申请了水解探针(商品名：TaqMan)PCR发明专利(US Patent 6,485,903)，以及Epoch公司在水解荧光探针基础上增加结合效率的MGB探针(US Patent 7,205，105)。被淬灭的荧光探针也可以通过二级结构改变而激活，分子信标Molecular beacon(Tyagi S，et al，1996，Nat Biotechnol 14：303-308)正是这样一种茎环结构的杂交探针，于1999年申请了Molecular beacon发明专利(US Patent 05925517)。其它双杂交(FRET)探针，蝎形(Scorpion)探针，Sunrise-Primer，Lux Pimers等使用范围局限于一定的应用，不明显优于水解探针TaqMan方法。荧光染料SYBR Green I的实时荧光PCR法灵敏度可达数个拷贝，定量精确，但引物二聚体扩增结合荧光的假阳性限制了其临床应用；而水解探针TaqMan实时荧光PCR增加了一道特异探针杂交，非特异性引物二聚体扩增不产生荧光，广泛用于临床检验，但也存在灵敏度低一个数量级，定量线性关系不精确。

不同于常规PCR检测终末反应-平台期扩增产物，一般PCR只扩增25至30个循环产物量就够用了；而实时荧光PCR需要检测低至10拷贝靶分子的近Ct40循环数，TaqMan等标记探针PCR至少需要扩增40个循环，基于荧光染料SYBR Green I的实时荧光PCR为了发挥更高灵敏度通常需要扩增45个循环。因此实时荧光PCR技术存在着更严重的引物二聚体非特异性扩增问题，极过量的仅四种碱基排列组合的一对引物存在25％以上的同源性，也具有25％的互补性，引物对3’末端少量互补杂交后在聚合酶作用下延伸形成引物二聚体，在随后热循环中以二聚体为模板被游离引物大量非特异性扩增、并结合染料。在不加模板的基于染料SYBR Green I实时荧光PCR实验中，绝大多数一对引物产生二聚体的本底循环阈值(Ct值)一般在30个循环附近，有些引物对本底Ct值甚至不到25个循环，位于靶分子定量检测范围Ct值15-37循环或“黄金检测窗口”之内，严重干扰低浓度(拷贝数)靶分子的定量和弱阳性误读。其实常被忽略的是TaqMan等探针实时荧光PCR亦存在引物二聚体问题，只是不见引物二聚体发射荧光，但会竞争PCR系统成份，降低扩增效率而导致灵敏度降低，弱阳性易漏检；定量也不准确，低浓度(拷贝数)线性关系及重复性不佳。

实时荧光PCR“闭管分析”多数情况下并不完全密闭，也存在扩增产物汽雾胶再污染的难题，除螺旋盖毛细管外，大多数0.2ml PCR试管或96孔板，在热循环95℃变性时，高温高压下就会有一些气雾胶溢(挤)出管盖，一个气雾胶颗粒就含有10⁵个分子拷贝，气雾胶不仅含高浓度已扩增阳性靶分子，更多的是过量一对引物间产生的引物二聚体扩增或引物-探针聚合体的扩增，且每一个检测反应管/孔都会产生引物二聚体非特异性指数扩增。随着重复同一PCR，泄漏的污染物会得到反复地指数扩增、积聚，随后的实时荧光PCR不是从0循环开始而是从上次PCR结束循环数开始，污染物越来越多。扩增产物汽雾胶再污染一般采用dUTP代替dTTP产物再结合尿嘧啶-DNA-糖基酶(UDG/UNG，US Patent 6,090,553)选择性降解污染产物，UDG/UNG随后PCR热变性失活，但在实际工作中对大量的引物二聚体含dUTP扩增产物降解作用有限，并不能消除或推后SYBR Green I实时荧光PCR本底引物Ct值。

为了克服引物二聚体造成的PCR假阳性结果使SYBR Green I实时荧光PCR等核酸扩增技术不利于临床检测分析的局限，本发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”在充分优选的一对引物基础上，采用一段与引物3’末端互补的4-14base反义寡核苷酸来模拟潜在的非特异性模板DNA，竞争性地结合引物3’末端而干扰抑制过量引物非特异性扩增；或使用3’末端固相化任意序列4-9base(优选5-7)反义碱基寡核苷酸结合引物热启动缓释，再进行核酸PCR扩增，既不干扰靶分子特异性扩增，其本底又在PCR45个循环内基本为一直线，没有非特异性扩增值干扰。再辅助以矿物油封闭下的一端引物缓释热启动及UNG修饰处理使核酸应用检测在PCR反应内没有引物二聚体累积，PCR多重封闭没有气雾胶产生或仅没有扩增的气雾胶，万一可能的产物泄露也可进一步被UNG有效酶解，多重保证不产生假阳性非特异性反应，使核酸扩增检测绝对可靠。

发明内容：

核酸扩增PCR技术非特异性高背景主要是由引物二聚体(Primer Dimer)反复扩增、累积造成的。目前采用的种种抑制引物二聚体PD非特异性扩增的试剂、措施对引物-引物和靶-引物之间的作用缺乏特异针对性，没有根本解决PD非特异性扩增的限制。本发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”从关键的引物作用差异化来解决特异问题。根据引物与特异模板为引物全长碱基都互补作用，而与非特异模板为仅引物3’末端互补起主要作用的推想。就提出一种摸拟非特异模板的反义“死”寡核苷酸来同非特异模板竞争引物3’末端，通过限制反义“死”寡核苷酸长度使其不能同特异模板竞争全长引物，从而大大减少引物二聚体非特异性扩增的技术途径。

本发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其基本特征在于能结合引物3’端的反义寡核苷酸来干扰PCR引物3’末端非特异性的策略，所述的反义寡核苷酸是特指一段4-14base由反义碱基组成的寡聚核苷酸。其关键特征在于反义碱基寡核苷酸保留Watson碱基配对杂交性能，但失去了作为PCR扩增模板和引物功能，反义干扰寡核苷酸与非特异性模板竞引物而PCR热循环条件下不能与特异靶模板竞争引物，使一对引物PCR反应内不会产生引物二聚体非特异性扩增。反义寡核苷酸适用于有引物结合、延伸的各种PCR技术包括阵列扩增等技术。

所述发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”其特征是所述核酸扩增技术的一端引物缓释热启动，所述的引物缓释是引物杂交吸附于某一固体微球交联的反义寡核苷酸，并溶解于某一比重大且粘性强的液体，固相微球可逆吸附与释放引物。预加样的缓释引物常温下不进入PCR反应液使扩增不能进行，热变性后引物完全释放入PCR反应液启动PCR运行，并且要不干扰PCR。引物缓释热启动适用于有引物作用的各种热循环PCR技术。

所述发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其特征在于固体微球一般包括纳米(/小于20微米)葡聚糖凝胶或聚苯乙稀微球，表面带弱阳性电荷的纳米至微米级颗粒物质如壳聚糖(Chitosan)，弱阴性离子交换树脂/纤维素微球。微球表面带活性基团以氨基首选，因为带正电荷的氨基微球本身亦可吸附核酸负电荷。

所述发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其特征在于引物缓释溶剂一般采用比重大且粘性强的液体如15％-20％Dextran(w/v，葡聚糖)液，天然粘胶等，所述的引物缓释溶剂溶解引物预先加入PCR管底室温下不与后加的反应液混匀，在PCR热变性后粘稠引物才被热混匀而释放入反应体系启动扩增。

所述发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其特征在于引物缓释配合PCR反应液表面用矿物油封闭，从而杜绝PCR产物气雾胶挤出管盖外二次污染，矿物油面上溅出的反应液因缺少缓释引物而PCR成份不全，所以没有扩增产物泄漏。

所述发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其特征在于反义干扰寡核苷酸选择一种4-9base任意碱基反义寡核苷酸，采用任意碱基组合的每一个序列位置均四种碱基排列的寡核苷酸，排列组合数＝4ⁿ(n为序列碱基数)，覆盖了所有潜在的非特异性结合。任意碱基反义寡核苷酸采用纳米活性微球共价交联固相化，加入1-5μM的固相化反义寡核苷酸就可结合多数引物而间接固相化引物并抑制热循环中引物非特异性扩增。

所述发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其特征在于反义干扰寡核苷酸选择一种4-14base特异碱基反义寡核苷酸，所述的特异碱基反义寡核苷酸序列与引物3’末端序列互补，优选5’-3’方向平行互补，加入0.1-100pM的特异反义寡核苷酸结合特异配对引物，抑制PCR反应中引物非特异性扩增。采用比重大且粘性强的溶剂如葡聚糖溶解反义寡核苷酸结合引物，粘稠引物与其它PCR成份短暂分隔而缓释热启动。

所述发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其特征在于反义干扰寡核苷酸的反义碱基包括2’-O-Methyl RNA、2’-Fluoro RNA、2’-O，4’-C-methylene bridge RNA(LNA锁核酸)、和PNA(肽核酸)、Morpholino、N3’-＞N5’Phosphoramidate等。其中RNA类反义碱基包括2’-O-Methyl RNA、2’Fluoro RNA、2’-O，4’-C-methylene bridge RNA(LNA锁核酸)组成的反义干扰寡核苷酸3’末端羟基封闭。

所述发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其特征在于反义干扰寡核苷酸的反义碱基可间隔1-5个正常碱基而合成嵌合DNA，这种经济嵌合的特异碱基反义寡核苷酸适合大部分PCR；而较短的任意碱基反义寡核苷酸全部采用反义碱基，特别适合多重PCR。

所述发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其特征在于其技术用于基因检测试剂盒，盒成份包括：核酸提取试剂，dNTPs，Taq等DNA聚合酶及其缓冲液，逆转录酶及其缓冲液，上游引物F/下游引物R，荧光染料或探针，标准对照物，纯化水dH₂O，矿物油。

本发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其应用的PCR扩增基本原理、操作流程及适用范围均同于一般常规核酸扩增PCR技术，只是引物结合了一段短“反义”碱基寡核苷酸序列。虽然反义寡核苷酸(Antisense Oligonucleotides，Stein C.A，2002，MolecularCancer Therapeutics Vol.1，p347-355，Minireview)大量应用于代谢研究和作为治疗药物，但目前尚未见为了减少引物二聚体非特异性扩增的引物结合“反义”碱基寡核苷酸方法。本发明内容主要是以荧光染料SYBR Green I实时荧光PCR技术来书写、实验及应用，原因是基于染料SYBR Green I实时荧光PCR技术原理简单、直观，定量数据容易分析，并不是表示本发明技术仅限于SYBR Green I实时荧光PCR这一技术。本发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”适用于有引物杂交、延伸的各种核酸扩增技术而解决其引物二聚体非特异性扩增的根本问题。

核酸扩增系统一般由模板、引物、底物和聚合酶及相应的缓冲液组成，其中引物不仅决定着检测的特异性，而且扩增产物直接从引物延伸而来，靶核酸扩增数百万倍是由于过量的数百亿倍的引物作用所致，一对扩增引物往往使用5μM/L或5pM/μl浓度(反应终浓度0.1μM/L或0.1pM/μl)，折算成分子数为5×6.02×10¹⁷/L或5×6.02×10¹¹/μl.其数目远远过量于模板浓度，甚至较最终扩增产物分子数目也高出千倍以上。一对引物每条浓度必须3-5μM/L或3-5pM/μl才能有效的特异性扩增靶模版，如此极过量的一对引物3’末端彼此间有互补即相互杂交延伸产生二聚体，再大量被非特异性扩增。引物二聚体形成一般是借助其3’末端多个互补碱基反向配对、互为引物延伸形成二聚体，引物对之间多个连续反向互补碱基可通过常规引物设计方法规避。但碱基仅四种组成排列，引物3’末端与非特异性模板有1-2个互补序列不可避免，同时DNA单链有一定柔性弯曲度，引物3’末端少数碱基互补就可借助其互补区外的多个断续配对碱基的合力结合、延伸一些序列，延伸了的引物对之间易多个碱基互补杂交、延伸产生二聚体，在随后热循环中以二聚体为模板被游离引物大量非特异性扩增、并结合染料，在不加模板的基于染料SYBR Green I实时荧光PCR本底对照实验中，引物二聚体非特异性扩增一般在30个左右热循环开始进入对数增长期，非特异性扩增开始严重起来，对于一般PCR而言，30个热循环扩增产物量足够用了，大多PCR可以结束了，如果没有二聚体扩增产物的污染以及污染被反复扩增，引物二聚体对于大多数30个热循环以内的PCR影响不太大。绝大多数一对引物产生二聚体的本底循环阈值(Ct值)一般在30-32个循环附近，实时荧光PCR第30-38个热循环仍位于1000-10拷贝靶分子检测范围或黄金检测窗口期，因此严重干扰低浓度靶分子精确定量和弱阳性标本准确定性(附图1)。引物形成二聚体理论上是低于引物间杂交Tm值温度时耐热聚合酶部分催化作用，但是热变性热启动PCR的本底引物Ct值也仅推后1-3个循环数，多在Ct33个循环左右。因此热启动仅能破坏一对引物3’末端个别1-2个碱基杂交，引物二聚体大部分成因还应该是源于热循环引物退火温度54℃时末端少数互补碱基再借助3’末端外的引物间多个不连续配对互补碱基的合力结合、而延伸产生二聚体；也存在可能引物退火温度时，其3’末端分子热运动碰撞Taq酶催化每次延伸一两个碱基。

还有常常被大家忽略的是TaqMan等探针实时荧光PCR亦存在引物二聚体问题，只是不见引物二聚体发射荧光，但会耗尽PCR系统成份，降低扩增效率使弱阳性定量不准或漏检。更严重的是TaqMan等探针与过量引物之间亦会有互补杂交、延伸，一些TaqMan探针实时荧光PCR的本底循环阈值(Ct值)在36-38个循环附近，亦有一定的假阳性误诊。在不加模板，仅加一对引物与TaqMan探针的SYBR Green I实时PCR的本底Ct值提前至25个循环左右，说明引物加探针PCR会形成一些“带探针序列的二聚体、聚合体”，随后非特异性扩增的“二聚体、聚合体”竞争结合大量TaqMan探针，导致一定的假阳性和低浓度靶模板不易竞争探针所致灵敏度降低而弱阳性漏检。

核酸扩增假阳性结果可能的原因还包括：(1)过量引物与无关DNA模版的非特异性杂交、扩增，首先引物设计除考虑靶基因外，样本中所有核酸DNA可能交叉杂交的大段连续碱基序列均必须排除在引物选项之外，这样即使存在个别区少量杂交也仅导致线性扩增，非特异性扩增不聚焦；不容易产生一对引物恰好都非特异性杂交于一段无关DNA的指数式扩增。其次，因无关DNA模板浓度比较低，过量的引物与低浓度随机无关序列DNA要进行比较多个循环才有可能非特异性Ct值，但加样过多模版也会提升引物二聚体PD所致的本底Ct值。(2)扩增产物气雾胶再污染，其主要成份是引物二聚体，也包含阳性扩增产物片段。防止气雾胶溢出扩散的关键是采用螺旋盖PCR管、加矿物油封闭等密闭措施，但即使PCR反应液表面加一层矿物油也因加样/矿物油时溅出的或液面管壁上残留的PCR混合液仍然能在热盖条件下有效PCR扩增，并有产物气雾胶溢出，造成下次同一重复PCR交叉污染。防止这种污染的一个措施是同时采用dUTP代替dTTP的底物(dNTP)，dUTP不影响正常PCR扩增，但PCR产物气雾胶污染因含dUTP的单链/双链DNA均被扩增体系预加的UDG酶降解，理论上UDG酶可从含dUTP六个碱基以上的DNA片段切除dUTP，对于大于100bp阳性靶分子片段比较有效，而实际PCR检测中对于引物二聚体作用降解极其有限，可能引物二聚体太短，含dUTP密度不够而量又大。

核酸扩增系统的引物、底物和聚合酶及相应的缓冲液buffer和Mg²⁺离子成份均是长期实验优化结果，允许变化的范围非常窄，简单的浓度改变对引物二聚体非特异性扩增和靶特异性扩增的效果基本均是平行的作用。如使用降低一半浓度的常规引物能显著降低二聚体的形成量，但也同时平行急剧降低特异性靶模板扩增数量，使正常PCR不能进行。改变聚合酶及相应的缓冲液buffer和Mg²⁺、K⁺离子效果基本也是同样结果。但对于扩增100-200bp短模板常规实时荧光PCR尤其TaqMan探针法而言，使用降低一半常规浓度dNTP底物可提高部分扩增效率。核酸扩增技术常常采用多种PCR增强剂，如甜菜碱(Betaine)，二甲基亚砜(DMSO)，甲/乙酰胺和二甲基甲酰胺(DMF)等增加扩增效率、平行推前约1-2个Ct值，更主要还是有效增进模板二级结构解链而增加扩增效率，但也都平行增加引物二聚体本底Ct值，而对靶特异扩增和引物二聚体非特异性扩增没有特别选择性。寻找解决引物二聚体非特异性扩增关键性措施还得从引物的靶特异配对和碱基互补非特异性杂交的差异化规律去探索。

本发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其原理是基于PCR过量引物3’末端与任意DNA有任何碱基互补都会杂交延伸尤其是过量引物3’末端与过量引物作为模板DNA间更易杂交延伸进而一对引物间互为模板和互为引物形成引物二聚体非特异性扩增，短的非特异性杂交虽没有引物-靶特异性杂交优势但极度过量亦带来一定程度非特异性延伸扩增，且引物二聚体一旦形成就是其引物最具竞争优势的指数扩增模板。最根本核心特征是这种非特异性杂交区因引物优选设计而会很短，潜在的非特异性扩增模板序列一定是引物3’末端互补碱基序列。因此一条创新思路就是利用“反义”寡核苷酸模拟非特异性扩增模板，仅竞争性地结合引物3’末端而因修饰的“反义”碱基序列既不能充作扩增模板也不能充作扩增引物，这种仅保留结合功能“死的”反义寡核苷酸长过非特异性杂交区而选择性地竞争抑制引物非特异性扩增；“反义”寡核苷酸又明显短于引物-靶特异性杂交长度而不影响热循环条件下特异性靶扩增Ct值。在PCR反应循环内消除了引物二聚体的扩增(附图2)，也就杜绝了连续、反复同一PCR扩增时累积气雾胶的污染之源。

本发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其内容是采用各种3’端羟基封闭的反义寡核苷酸，包括第一代的Methylphosphate Oligonucleotides(甲基磷酸骨架寡核苷酸)，Phosphorothioate Oligonucleotides(硫代磷酸骨架寡核苷酸)，这种第一代反义寡核苷酸能抵抗核酸酶水解而应用于gene silence/knockout(基因沉默或敲去)研究和作为抗癌药物，但对某些保真度不高的核酸聚合酶如Taq没有抑制，起不到较好的“反义”作用。新一代的反义寡核苷酸仅保留碱基结合功能而失去了作为扩增模板或引物等核酸基本性能，包括2’-O-Methyl RNA、2’Fluoro RNA、2’-O，4’-C-methylene bridge RNA(LNA锁核酸)、和PNA(肽核酸)、Morpholino、N3’-＞N5’Phosphoramidate等。不同于代谢研究和药物使用13-25nt(nucleotides)长反义寡核苷酸，本发明“抑制引物非特异性扩增的反义寡核苷酸”是采用4-14nt/base末端羟基封闭的反义寡核苷酸，其序列与引物3’最末端碱基序列互补配对，平行方向互补配对抑制引物非特异性扩增效果明显优于反向互补配对。依据反义寡核苷酸长短不同，引物(5μM浓度)中含0.1pM-100pM不等，较长的反义寡核苷酸加低浓度的而较短的依次增加浓度得到最佳引物非特异性抑制效果。由于反义寡核苷酸有效使用浓度明显低于引物浓度，反义寡核苷酸既可采用全长反义碱基序列也可以采用正常碱基与反义碱基间隔的策略，采用正常碱基与反义碱基间隔的反义寡核苷酸经济便宜，但这种部份反义寡核苷酸是一把双刃剑，既抑制引物非特异性扩增又可部分成为引物非特异性模板，其在引物(5μM浓度)中的量不能超过10pM-1000pM，否则引物二聚体非特异性扩增本底Ct值明显前移。RNA类反义碱基序列不能有效作为扩增模板但仍可为引物，其末端羟基必须封闭但可仅限于3’末端，可采用乙酰化、磷酸基团、氨基、烷基、醛基、羧基、生物素、地高辛、胆固醇、及各种淬灭基团等选一种经济高效交联来封闭末端羟基的延伸；反义寡核苷酸3’末端最后一个碱基也可采用双脱氧碱基或3’Inverted dT来封闭末端的延伸。反义寡核苷酸结合抑制一条引物就能有效抑制非特异性扩增，一对引物都设制反义寡核苷酸可进一步降低非特异性本底但PCR体系也带来更多的复杂性、和不确定交叉非特异性。不同的PCR体系最终需要通过实验来检验取舍。

本发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，其反义寡核苷酸亦可采用一些变通方法，如首先常规合成正常普通碱基的寡核苷酸，在其碱基未脱保护情况下作广泛的烷基化、酰基化、卤代、及氧化等化学修饰，其末端羟基可简单卤氢酸反应卤代封闭，最后脱碱基保护基生成保留碱基特异性结合的抑制非特异性扩增反义寡核苷酸。其次设计与引物3’最末端碱基序列互补配对的短4-7nt/base全反义碱基寡核苷酸，再连续合成串联的重复序列反义寡核苷酸二聚体或化学交联成重复序列反义二聚体及一些变通。最佳的策略还是合成4-9nt/base全反义碱基寡核苷酸全排列集合，即4-9nt/base序列包含所有排列组合的每一个序列位置均四种碱基排列，排列组合数＝4ⁿ(n为序列碱基数)，覆盖了所有的非特异性杂交，引物(5μM浓度)中含量＝100pM-1pM×4ⁿ(n为序列碱基数)不等的反义寡核苷酸NNNN-NNNNNNNNN(N为任意碱基)混合物可以抑制任意可能的引物非特异性扩增。以7nt/base为例，引物(5μM浓度)中含量＝10pM×4⁷＝1.64×10⁵pM＝1.64×10^-1μM。使用1-2μM的3’末端固相化(交联微球)任意序列4-9base反义碱基寡核苷酸不仅抑制任意可能的引物非特异性扩增，还可以使引物结合固相化反义碱基寡核苷酸并溶于15-20％Dextran(葡聚糖)液中而间接固相化，这种固相引物又可轻易被PCR热启动释放。于18％Dextran中的一端缓释固相化引物预先加入PCR管底，再依次小心沿管壁加入PCR反应液、样本模板和矿物油封闭，固相化引物由于Dextran比重大而沉于管底，不要混匀以免破坏缓释层，短瞬离心使固相化引物颗粒和加矿物油冲起的反应液下沉。进行PCR反应热变性后释放引物进入PCR反应液，恢复所有成份后PCR有效扩增，既不干扰靶分子特异性Ct值，其本底又在PCR45个循环内基本为一直线。PCR时热盖并不能封闭扩增反应，仍需要加矿物油封闭，但在矿物油面上的残留反应液PCR时会挥发至管顶而挡住荧光光路，所以有矿物油时PCR仪仍需要设置热盖，而热盖条件下残留反应液留在矿物油面上仍能有效热循环扩增，所以设置热盖但不要等热盖升温就开始PCR，首先变性95℃2-5分钟使矿物油面上的残留反应液尽量挥发挤出管外再等热盖升温至105℃，同时管底预置的固相化缓释引物使矿物油面上的残留反应液因缺少一引物成份而绝不会扩增导致扩增产物气雾胶交叉污染；固相化缓释引物还使矿物油下面PCR反应液热启动，避免低温时启动非特异性扩增。PCR多重封闭没有气雾胶产生或仅没有扩增的气雾胶，万一可能的扩增产物泄露也可进一步被UNG有效酶解，多重保证不产生假阳性非特异性反应，使核酸扩增应用检测绝对可靠。

消除常温时聚合酶非特异性扩增的热启动PCR还包括其它PCR成份如dNTP缓释，更常见的方法还是聚合酶Taq修饰抑制和蜡包Mg²⁺离子热启动释放，热启动聚合酶Taq又包括端N缺失的KlenTaq，抗Taq酶抗体和Taq酶抑制寡核苷酸Aptamar，抑制非特异性扩增效果都不是十分明显，且抗体、Aptamar用量太大而抵消了一点热启动优势。本发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”，聚合酶Taq(5U/μl)中加入微量0.5-0.7mg/100ml Poly-PhosphoricAcid(Sigma04101，多聚磷酸)单独使用不影响靶特异扩增Ct值，而多聚磷酸所带负电菏常温时结合抑制Taq酶、推后引物本底Ct值2-3个循环，与反义寡核苷酸结合缓释引物联用特别有效，相互加倍作用双重热启动，进一步保证了靶特异扩增可靠性。

本发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”典型的几种反义寡核苷酸引物PCR实例：

1.RNA类反义干扰寡核苷酸PCR：

常见的RNA类反义核苷包括2’-O-Methyl RNA、2’Fluoro RNA、2’-O，4’-C-methylenebridge RNA(LNA锁核酸)等，这类反义干扰寡核苷酸在PCR过程中不能作为扩增模板，其合成采用成熟的亚磷酰胺固相法，5’连接DMT的四种苯甲酰保护环外氨基的A、C、丁酰保护环外氨基的G和T核苷亚磷酰胺修饰单体均有很多商业公司供应，化学合成从3’-5’方向，第一步控孔玻璃珠CPG-3’固相5’DMT核苷脱DMT帽和分别活化单体成亚磷酰胺四唑、第二步偶联单体与5’脱帽羟基而延伸一个碱基、第三步盖帽-乙酰化封闭未反应的5’脱帽羟基、第四步氧化-碘液氧化而稳定亚磷酯键，循环一至四步延伸至所需碱基长度；最后氨解脱保护及反向柱纯化，末端羟基采用乙酸酐在N-甲基咪唑作用下乙酰化封闭延伸功能，或3’标记磷酸。现有太多的商业公司提供合成服务，又既可以购买ABI公司全自动合成仪合成，较短寡核苷酸也可手工固相法合成。序列在充分优选的一对引物基础上，采用一段与引物3’末端互补的4-14base反义寡核苷酸，而LNA锁核酸碱基亲和力高出RNA3-7℃、高出DNA2-5℃，所以LNA选用一段与引物3’末端互补的3-9base反义寡核苷酸。反义干扰寡核苷酸方向优选5’-3’方向与引物3’最末端平行配对互补的序列，既可合成全长反义碱基序列也可以与引物3’最末端互补的采用反义碱基及每个反义碱基间隔1-5个正常碱基的策略，采用正常碱基与反义碱基间隔的反义寡核苷酸经济易合成，但这种部份反义寡核苷酸既抑制引物非特异性扩增又可部分成为引物非特异性模板，最多加量须少于最佳抑制量的10-100倍。反义寡核苷酸来模拟潜在的非特异性模板DNA，竞争性地结合引物3’末端并干扰抑制过量引物非特异性扩增；再进行常规核酸PCR扩增，既不干扰靶分子特异性扩增，其本底又在PCR45个循环内基本为一直线。

一对上下游引物(5μM/L)，其中一条加入0.1pM-100pM不等，较长的反义寡核苷酸加低浓度的而较短的依次增加浓度、实验得到最佳引物非特异性抑制效果，反义寡核苷酸引物于15％-20％Dextran(葡聚糖，w/v)和0.1M NaCl中稀释2-4倍作为热启动缓释引物，粘稠比重大的葡聚糖溶解引物预先加入管底室温下不与后加的反应液混匀，在PCR热变性后粘稠引物才释放入反应体系启动扩增。底物dNTP(10mM)采用dUTP代替dTTP的底物，dUTP不影响正常PCR扩增，但PCR产物气雾胶污染因含dUTP的单链/双链DNA均被扩增体系预加的UDG酶降解，理论上UDG酶可从含dUTP六个碱基以上的DNA片段切除dUTP，对于大于100bp阳性交叉污染片段降解比较有效。创新的10×PCR反应buffer：含0.6M Tris-CL(pH8.3)，0.1MKCL，30mM(NH₄)₂SO₄，16mM MgCL(TaqMan探针18mM)使扩增效率提高并更加耐受杂质干扰。Taq酶(5U/μl)加0.0006％Poly-Phosphoric Acid(多聚磷酸，w/v)作为热启动聚合酶并含(UDG酶(1U/μl)。

进行25μl反应体系实时荧光PCR，首先加2μl的缓释引物(1.25μM)于PCR管底，不必换吸头；按比例配制PCR反应液：

于PCR管靠近管底缓释引物处小心加入5μl样本或标准品DNA，每管换一加样吸头；再依次加PCR反应液18μl/管于PCR管壁中部小心滑下管底；最后，每PCR管沿上部管壁小心加30μl矿物油。短瞬离心沉降可能溅起的反应液，不要混匀！以免破坏管底缓释层。

反应管上实时荧光PCR仪(调节发射光480nm和检测波长520nm)，设置扩增反应条件：预反应50℃2分钟-95℃3分钟进行UDG酶切非特异DNA和模板充分变性；进行45次热循环实时荧光PCR扩增，变性94℃20-30秒，退火54℃30秒，延伸72℃20-30秒并读取荧光值。同时设置热盖但不用等热盖升温就开始PCR，以防热盖条件下矿物油面上残留反应液扩增气雾胶泄漏交叉污染。如不用热盖，残留反应液会挥发至管顶冷凝后挡住荧光光路。

进行正常碱基间隔反义碱基嵌合的干扰Oligo试验：如1μM的Oligo5’-g aag acg ct-3’(序列表中的SEQ ID NO：1，第4、第7位g为2’-O-Methyl RNA碱基，3’端标记磷酸)作10倍稀释梯度抑制荧光PCR，两组有模板和无模板实时荧光PCR对干扰Oligo梯度对比实验，加10μlOligo梯度/25μlPCR，A组有模板时干扰Oligo从0μM-1μM对特异模板Ct值没影响，Ct值都在13左右；B组无模板PCR，干扰Oligo1μM×10^-5-1μM×10^-7抑制本底扩增的效果最好，本底Ct值明显推后；干扰Oligo低于1μM×10^-8抑制不够，而高于1μM×10^-4嵌合干扰Oligo又起了部份非特异模板作用，Ct值反而前移。结果见附图3。

也可进行非荧光普通PCR，不加SYBR Green I的反应液进行常规终末PCR35次热循环反应，扩增条件相同，矿物油代替热盖，产物用1.5％-2％琼脂糖凝胶电泳检测(电泳时荧光染料影响电泳迁移率)。

2.非磷酸骨架反义寡核苷酸PCR：

新型的非磷酸骨架反义寡核苷酸包括Peptide Nucleic Acids(PNA，肽核酸)、Morpholino、N3’-＞N5’Phosphoramidate等。以PNA为例，肽核酸是以中性酰胺键为骨架的一种DNA类似物，以(2-氨乙基)甘氨酸结构单元为骨架，碱基部份通过亚甲基羰基连接于主骨架上，碱基与骨架间隔3个键，相邻碱基间隔6个键，其结构上与天然核酸具有相似性，使PNA对核酸分子具有独特的序列识别结合功能。同时，PNA中性酰胺键骨架不带负电荷，与核酸杂交时没有静电排斥作用，因此PNA与互补序列的核酸杂交时比相应的DNA寡核苷酸亲和力每碱基Tm值要高1-2℃，可选用一段与引物3’末端互补的4-10base反义寡核苷酸。重要的是非磷酸骨架使PNA不仅具有抵抗核酸酶的性能，而且PNA在PCR过程中既不能充作扩增模板也不能充作扩增引物，末端不用封闭，因而可作为最有效的反义干扰寡核苷酸来干扰、抑制引物非特异性扩增。

反义寡核苷酸PNA单体(四种碱基通过一个亚甲羰基臂连接2-(氨乙基)甘氨酸)可以购自美国AB公司或PerSeptive Biosystems公司，其寡核苷酸合成采用Boc或Fmoc固相肽合成法，DCC碳二亚胺催化缩合酰胺键。国内外有很多公司提供这类合成服务，也可购买多肽固相合成仪或手工合成，目前PNA主要是单体较贵，人手工合成PNA简单、高效，并容易对产品进行修饰或合成类似物。PNA类反义干扰寡核苷酸长度选择4-10base，方向优选与引物3’最末端互补并5’-3’和N-C方向平行配对的序列，既可合成全长反义碱基序列也可以合成PNA与DNA嵌合体。

一对上下游引物(5μM/L)，其中一条加入1pM-100pM不等，较长的反义寡核苷酸加低浓度的而较短的依次增加浓度、实验得到最佳引物非特异性抑制效果，反义寡核苷酸引物于15％-20％Dextran(葡聚糖，w/v)和0.1M NaCl液中稀释2-4倍作为热启动缓释引物。底物dNTP(10mM)采用dUTP代替dTTP的底物，dUTP不影响正常PCR扩增，但含dUTP的扩增气雾胶交叉污染可被预加的UDG酶降解。创新的10×PCR反应buffer：含0.6MTris-CL(pH8.3)，0.1M KCL，30mM(NH₄)₂SO₄，16mM MgCL(TaqMan探针18mM)。Taq酶(5U/μl)加0.0006％Poly-Phosphoric Acid(多聚磷酸，w/v)作为热启动聚合酶并含(UDG酶(1U/μl)。

进行25μl反应体系实时荧光PCR，首先加2μl的缓释引物(1.25μM)于PCR管底，不必换吸头；按比例配制PCR反应液：

于PCR管靠近管底缓释引物处小心加入5μl样本或标准品DNA，每管换一加样吸头；再依次加PCR反应液18μl/管于PCR管壁中部小心滑下管底；最后，每PCR管沿上部管壁小心加30μl矿物油。短瞬离心沉降可能溅起的反应液，不要混匀！以免破坏管底缓释层。

反应管上实时荧光PCR仪，设置扩增反应条件：预反应50℃2分钟-95℃3分钟；进行45次热循环实时荧光PCR扩增，变性94℃20-30秒，退火54℃30秒，延伸72℃20-30秒并72℃读取荧光值。同时设置热盖但不用等热盖升温就开始PCR，以防溅出的反应液扩增泄漏污染。

也可不加SYBR Green I的反应液进行常规终末PCR35次热循环反应，扩增条件相同，矿物油代替热盖，产物用1.5％-2％琼脂糖凝胶电泳检测(电泳时荧光染料影响电泳迁移率)。

3.反义寡核苷酸固相化引物PCR：

一般PCR污染太顽固，有必要进一步增强Dextran(葡聚糖)缓释引物强化隔绝引物热释放效果，通过纳米微球固相化反义寡核苷酸来间接固相化缓释引物，使溶于Dextran(葡聚糖)的微球固相化缓释引物分别、预先加入PCR管底与后续加入的PCR反应液、样本在室温条件下有效隔绝分离，热变性后再自动混匀而启动扩增。反义5-7nt/base寡核苷酸仅需极微量10-100pM就能有效抑制引物非特异性扩增，而固相化反义寡核苷酸需要相要等于引物浓度的量来间接固相化缓释引物。所以固相化反义寡核苷酸采用任意碱基组合的每一个序列位置均四种碱基排列的寡核苷酸，排列组合数＝4ⁿ(n为序列碱基数)，反义寡核苷酸使用量＝100pM×4ⁿ(n为碱基数)，过量加入的固相化反义寡核苷酸就可结合多数引物序列而间接固相化引物并抑制热循环中引物非特异性扩增，特别对多重PCR系统多对过量引物的非特异性扩增抑制明显。

合成4-9nt/base全反义碱基寡核苷酸全排列，优选5-7nt/base序列包含所有排列组合的每一个序列位置均四种碱基排列，覆盖了所有的非特异性杂交，其混合物可以抑制任意可能的引物非特异性扩增。新一代的反义核苷均可选择，只是RNA类反义寡核苷酸3’末端须交联微球来封闭，以PNA为优选，其末端交联纳米(小于20微米)葡聚糖凝胶或聚苯乙稀微球的氨基等活性基团，带正电荷的氨基微球本身亦可吸附核酸负电荷。以6nt/base为例，引物(5μM浓度)中加1-5μM优选2-4μM的末端交联微球的任意序列NNNNNN反义碱基寡核苷酸不仅抑制任意可能的引物非特异性扩增，还可以使引物结合固相化反义碱基寡核苷酸并溶于15％Dextran(葡聚糖)液中而间接固相化，这种固相引物又可轻易被PCR热启动自动混匀释放。于15％Dextran中的一端缓释固相化引物预先加入PCR管底，再依次小心沿管壁加入PCR反应液、样本模板和矿物油封闭，固相化引物由于固相微球和粘稠葡聚糖而沉于管底，与反应体系有效隔绝，短瞬离心使固相化引物颗粒和加矿物油冲起的反应液沉淀。PCR反应热变性后释放固相化引物进入反应液，恢复所有成份后PCR有效扩增，既不干扰靶分子特异性Ct值，其本底又在PCR45个循环内基本为一直线。同时设置热盖但不用等热盖升温就开始PCR，以防溅出的反应液扩增泄漏污染。固相化缓释引物还使矿物油下面PCR反应液热启动，避免低温时启动非特异性扩增。PCR多重封闭尽量减少气雾胶产生或仅无扩增的气雾胶，万一可能的扩增产物泄露也可被UNG有效酶解，多重保证不产生非特异性反应，使核酸扩增应用检测绝对可靠。

一对上下游引物(5μM/L)，其中一条加入2-4μM的末端交联微球的任意序列NNNNNN反义碱基寡核苷酸，固相化反义寡核苷酸引物于15％Dextran(葡聚糖，w/v)和0.1M NaCl液中稀释2-4倍作为热启动缓释引物。底物dNTP(10mM)采用dUTP代替dTTP的底物，dUTP不影响正常PCR扩增，但含dUTP的扩增气雾胶交叉污染可被预加的UDG酶降解。创新的10×PCR反应buffer：含0.6M Tris-CL(pH8.3)，0.1M KCL，30mM(NH₄)₂SO₄，16mM MgCL(TaqMan探针18mM)。Taq酶(5U/μl)加0.0005％Poly-Phosphoric Acid(多聚磷酸，w/v)作为热启动聚合酶并含UDG酶(1U/μl)。

进行25μl反应体系实时荧光PCR，首先加2μl的固相引物(1.25μM，用前混匀微球)于PCR管底，不必换吸头；按比例配制PCR反应液：

于PCR管靠近管底缓释引物处小心加入5μl样本或标准品DNA，每管换一加样吸头；再依次加PCR反应液18μl/管于PCR管壁中部小心滑下管底；最后，每PCR管沿上部管壁小心加30μl矿物油。短瞬离心沉降可能溅起的反应液，不要混匀！以免破坏管底缓释层。

反应管上实时荧光PCR仪，设置扩增反应条件：预反应50℃2分钟-95℃3分钟；进行45次热循环实时荧光PCR扩增，变性94℃20-30秒，退火54℃30秒，延伸72℃20-30秒并72℃读取荧光值。PCR时热盖并不能封闭扩增反应，仍需要加矿物油封闭，但在矿物油面上的残留反应液PCR时会挥发至管顶而挡住荧光光路，所以有矿物油时PCR仪仍需要设置热盖，而热盖条件下残留反应液留在矿物油面上仍能有效热循环扩增，所以设置热盖但不要等热盖升温就开始PCR，首先变性95℃2-5分钟使矿物油面上的残留反应液尽量挥发挤出管外再热盖升温至105℃，同时管底预置的固相化缓释引物使矿物油面上的残留反应液因缺少一引物成份而绝不会扩增导致扩增产物气雾胶交叉污染。

也可不加SYBR Green I的反应液进行常规终末PCR35次热循环反应，扩增条件相同，矿物油代替热盖，产物用1.5％-2％琼脂糖凝胶电泳检测(电泳时荧光染料影响电泳迁移率)。

本实例3反义寡核苷酸固相化引物PCR也可与实例1和实例2特异序列的反义干扰寡核苷酸联合使用，以增强抑制引物非特异性扩增作用。缓释引物还可加入终浓度10％-20％的近纳米级Chitosan(壳聚糖)微珠(＜30μm或＞400目颗粒，便于用微量加样头吸取，壳聚糖微珠表面氨基正电荷常温下吸附引物磷酸基负电荷而高温完全解吸热启动，氨基微珠结合引物如因加样/矿物油时溅出至液面管壁上的残留颗粒可快速离心沉底，进一步提升缓释高可靠性。壳聚糖微珠自己制备是将购买的壳聚糖溶解于酸性溶液中再快速到入磁力搅拌的等量碱液中，调节体积比实验得到所需大小的壳聚糖微珠。

4.反义寡核苷酸引物等温扩增：

在热循环PCR技术发展不久，一系列的不依赖于热循环解链的等温(/恒温)基因扩增技术也有了长足的发展。核酸等温扩增术的特点是扩增反应的全过程(除初始的杂交步骤外)均在单一温度，无需专门的扩增仪器下进行，而不像PCR反应那样，需要经历几十个温度变化的循环过程。等温扩增技术的这一特点，使得它们对所需仪器的要求大大简化，检测时间显著缩短，因而适合于现场快检或床边检测。比较代表性的有：链置换扩增、滚环扩增、环介导或连环恒温扩增、解旋酶依赖扩增、和核酸序列依赖扩增(Nucleic Acid Sequence BasedAmplification，NASBA)，转录介导扩增(Transcription Mediated Amplification，TMA)等。其中又以RNA扩增技术灵敏度最高，应用比较成熟。转录介导的扩增方法(即转录RNA扩增技术)包括TMA和NASBA。TMA(PNAS，USA87：p1874和US Patent：5,766,849)是一种利用AMV/M-MLV逆转录酶和T7RNA多聚酶2种酶的共同作用，在等温条件下来扩增RNA或DNA的反应系统，主要扩增原理为：目标序列在逆转录酶作用下，以与T7启动子嵌合的引物为引导进行逆转录，逆转录酶的RNA酶H活性将杂合链上的RNA降解以后，合成末端带T7启动子的双链DNA，T₇等RNA聚合酶识别启动子而无需启始引物，催化一个DNA分子转录出七百条目标RNA序列，部分RNA又可以作为模板进行下一个循环，整个反应是一个自催化过程。NASBA[Nature350(6313)p91和US Patent：7,074,558]的原理与TMA相似，但仅一条引物5’端加上T7启动子序列，进而DNA仅一条链转录；在核酸提取和扩增产物及信号检测方法上也有所不同。转录介导的扩增方法扩增效率极高，灵敏度高于实时荧光定量PCR技术，且因整个反应在试管中恒温进行，减少了热循环PCR产物气雾胶的交叉污染。与RT-PCR比较，该技术可减少样品中抑制性物质的影响，不受背景中DNA的干扰，单链RNA序列是特异的靶序列，产物RNA不易发生交叉污染，降低检测交叉污染的假阳性率。整个反应过程由三种酶控制，操作次数少，并大大缩短检测产生结果的时间。但恒温反应仍存在一定的引物非特异性扩增。

一对引物两5’端都可加上噬菌体启动子序列，从而cDNA双链均带有启动子序列，双链同时大量转录RNA和负链(anti-sense)RNA产物，其扩增灵敏度极高，非特异性扩增也容易极度放大；适度采用一条引物5’端带上噬菌体启动子序列，而另一条引物不带启动子或部分比列带启动子使cDNA仅一条或部分链转录RNA，适当调低扩增灵敏度，以期适应不同检测本底要求的灵敏度窗口。一对上游引物(5μM/L)，其中一条加入1pM-100pM不等，较长的反义寡核苷酸加低浓度的而较短的依次增加浓度、实验得到最佳引物非特异性抑制效果，反义寡核苷酸引物于18％Dextran(葡聚糖，w/v)中稀释2-4倍作为热启动缓释引物。底物dNTP(10mM)和0.1M rNTP。10×反应buffer：(pH8.5的40mM Tris-CL，50mM KCL，12mM MgCL，2mM DTT和15％DMSO)。AMV/M-MLV逆转录酶和T7RNA多聚酶(2U/μl)。等温扩增反应一般于简易恒温金属浴或水浴箱中进行。配制反应液：

于0.2/0.5ml的EP管，水浴65℃变性5分钟，再41℃5分钟后加各1μl的T7polymerase，M-MLV和RNaseH(0.2U)，加1μl的5μM灯标探针检测，最后加40μl矿物油封闭，于金属浴41℃反应60-90分钟。置EP管于便携式掌上荧光阅读仪在激发波长491nm检测，发射光515nm读值。

5.固相反义寡核苷酸引物PCR芯片：

通常的实时荧光PCR单个检测仅能扩增一至几个目标序列，对于一些高通量的应用领域就显得很有限，这主要是受到多种荧光染料光谱交叠和多重高浓度引物之间相互作用的限制，目前要实现多于四重荧光定量PCR非常困难，而且对设备要求较高。普通核酸杂交式的基因芯片技术提供了数百乃至上万通量的多重同步检测，但由于核酸杂交信号相加的低灵敏度而受限；美国ABI等公司将指数扩增高灵敏度的定量荧光PCR技术率先引入基因芯片微装置，开启了PCR芯片时代。本发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”应用于PCR芯片(Real-time PCR on Chip)，实时荧光定量PCR技术通过反义寡核苷酸干扰引物非特异性结合延伸从而解决了困扰PCR领域二十多年的引物二聚体非特异性扩增的似乎难以逾越的一道障碍，彻底解决了PCR芯片单点反应技术。将高通量的许多不同单点反应实时荧光定量PCR缩微于芯片载体上，芯片阵列分布的每一点引物不同而同样反应液和相同样本，一块芯片检测同一样本的许多靶指标，同时高通量定量众多靶分子实时荧光PCR。

采用微纳阵列多重检测，而阵列每一点仍为分隔的单重实时荧光定量PCR，即PCR芯片。单点PCR反应腔是由独立的光刻纳升-微升级的圆井组成，首先是在4英寸硅片上涂覆光刻胶，然后用设计数十-数千点阵的掩膜版做光刻，曝光和显影完成后，用ICP-RIE(InductivelyCoupled Plasma Reactive Ion Etching)深硅刻蚀设备刻蚀硅片，最后用氧等离子体设备去除光刻胶并清洗后完成。反应腔壁修饰上PEG(聚乙二醇)，PEG可以在PCR腔壁上通过硅氧键共聚焦形式形成一层高度亲水的聚合物层，可有效防止腔壁对PCR聚合酶以及核酸的吸附，从而达到不影响PCR反应的目的。具备微纳阵列圆井的硅芯片每点圆井依次装载不同引物对，封装就算完成了，引物对缓释配方用来保证反应腔内预置的引物只有在PCR反应时才释放出来。使用时拆除芯片封装，配制PCR反应液并加入样本DNA，使之均匀分布芯片PCR腔，再加矿物油于芯片表面密闭，最后硅芯片盖上带胶面的薄盖玻片。这样设计的目的主要是保证反应腔的密闭性和防止反应腔之间引物的串扰。

引物对的装载，在充分优选的系列引物对基础上，一对上下游引物(5μM/L)的其中一条加入2-5μM的末端交联微球的任意序列NNNNNN5-7个反义碱基寡核苷酸，通过反义寡核苷酸固相化引物于低融点1-2％Agarose(琼脂糖，w/v)和0.1M NaCl中稀释作为热启动缓释引物，用纳升液体分配系统将不同的引物准确地分配相应纳升量到微纳PCR反应腔底部。干燥后，将相应的另一条引物(5μM/L)熔于含Betaine(甜菜碱)热石蜡中稀释为另一缓释引物，用纳升液体分配系统将不同的引物准确地分配相应纳升量到微纳PCR反应腔前一引物表面上。由于先后有琼脂糖高分子材料和石蜡双层封闭，PCR引物被包裹起来，只有在PCR反应的高温条件下才能全部释放出来，这样芯片各矩阵点样品检测就通过芯片PCR腔而隔出了足够的独立分离空间，避免不同特异引物间的串扰。将待测样品完成DNA或者是RNA提取后，与PCR聚合酶等混合后加到PCR芯片上，在加矿物油和盖上盖玻片后用机械负压装置压紧，进行PCR反应。而隔绝芯片PCR腔内的引物对及引物与样本DNA间非特异性扩增则通过任意序列NNNNNN反义碱基干扰寡核苷酸来模拟潜在的非特异性模板DNA，竞争性地结合引物及其末端并抑制过量引物非特异性扩增。再进行芯片PCR扩增，既不干扰靶分子特异性扩增，其本底又在PCR45个循环内基本为一直线，没有非特异性扩增值增加。

以100点微纳阵列PCR芯片为例，每点进行2.5μl反应体系实时荧光PCR，按以下比例配制PCR反应液和加样本DNA：

将样本DNA和PCR反应液加到PCR芯片面上，芯片每点PCR腔预含100nl的固相引物(2.5μM)对。最后，每个PCR芯片面上小心加上250μl矿物油和盖上盖玻片后上机械负压装置压紧，短瞬离心沉降可能溅起的反应液，不要混匀！以免破坏管底缓释层。

反应芯片上实时荧光PCR装置，设置扩增反应条件：预反应50℃2分钟-95℃3分钟；进行45次热循环实时荧光PCR扩增，变性94℃20-30秒，退火54℃30秒，延伸72℃20-30秒并72℃读取荧光值。芯片实时荧光PCR装置激发光采用激光或卤钨灯光源，波长480nm滤光片和520nm半导体致冷CCD相机检测；芯片置于冷热循环风道上，升温风速流从上往下吹，降温风速流从下往上吹，以防溅出的反应液蒸发挡住荧光光路。

本发明“抑制引物非特异性扩增的反义干扰寡核苷酸”PCR实验操作，与一般常规PCR基本一样，标本核酸提取纯化，采用常规方法制备，没有特殊要求。样本DNA提取制备方法包括煮沸法，PEG沉淀法，酒精沉淀法，碱裂解法，旦白酶K消化法，酚氯仿抽提法，离心结合柱法，及胍盐抽提磁微珠结合法。样本总RNA提取制备一般采用异硫氰酸胍一步法或Trizol试剂快速抽提，一般不用纯化mRNA，必要时采用PolyA纤维素或磁微珠固相法纯化。反转录(RT)即可分步反应，亦可与PCR一步反应。快速检测选择一步RT-PCR单管反应，单管加入两种不同的酶，即用于RT的反转录酶(如AMV或M-MLV突变体、SuperScript II/SuperScript反转录酶等)，常规PCR时DNA聚合酶没有限制，用于实时PCR采用热稳定DNA聚合酶(如Taq、Taq Plus等)。热稳定DNA聚合酶活性在反转录过程中被其抗体所抑制，进入PCR过程的高温变性使反转录酶失活，同时也使热稳定DNA聚合酶抑制抗体失活，使扩增反应顺利进行。还有一种策略是使用既具有反转录酶活性，又具有DNA聚合酶活性的Tth耐热聚合酶。其PCR反应体系的底物和聚合酶及相应的缓冲液buffer和Mg²⁺离子浓度可以与一般普通PCR反应体系相同或通用。

本发明优点：

(1)反义干扰Oligo抑制了热循环反应内的非特异性扩增，而固相化缓释引物配合矿物油封闭就杜绝了气雾胶污染，可靠的综合挫施适合临床分子诊断，临床诊断绝不能有引物非特异性假阳性结果，简单的干扰Oligo挫施解决了临检关键问题，特别适用于传染性疾病的实时荧光PCR检测及准确诊断。

(2)适合多重(/元)PCR扩增技术，多重过量引物更难以逾越的引物非特异性扩增障碍只有通过反义干扰Oligo才能克服，特别适用于肠道或呼吸道病源多重荧光PCR检测。

(3)适合微流体PCR扩增技术，微流体PCR缩微装置更加不容易控制引物非特异性扩增，仅添加一点干扰Oligo试剂就能解决微流体PCR非特异性问题。

附图说明：

图1、图2.为加反义干扰Oligo前后对比的两组SYBR Green I实时荧光PCR作10倍稀释标准曲线实时荧光图。图1.为加反义干扰Oligo前的SYBR Green I实时荧光PCR作10倍稀释标准曲线，其10³拷贝/每反应-10¹拷贝/每反应和无模板空白对照的Ct值全重叠在31个循环处，非特异性扩增严重。图2.为加反义干扰Oligo后的SYBR Green I实时荧光PCR作10倍稀释标准曲线，不仅高拷贝模板Ct值线性好，低10³拷贝-10¹拷贝/每反应也好，线性分布均匀。尤其是无模板空白对照，即仅含一对引物本底PCR在加反义干扰Oligo后本底Ct：31值变为50循环之内均为一条直线，无Ct值，抑制引物非特异性扩增明显。

图3.为一正常碱基间隔反义碱基嵌合的干扰Oligo从1μM作10倍稀释抑制荧光PCR，两组有模板和无模板实时荧光PCR对稀释干扰Oligo对比实验，A组有模板时干扰Oligo从0μM-1μM对特异模板Ct值没影响，Ct值都在13左右；B组无模板PCR，干扰Oligo1μM×10^-5-1μM×10^-7抑制本底扩增的效果最好，本底Ct值明显推后；干扰Oligo低于1μM×10^-8抑制不够，而高于1μM×10^-4嵌合干扰Oligo又起了部份非特异模板作用，Ct值又前移。

图4.乙型肝炎病毒(HBV)标准定量曲线：HBV核心抗原质粒对照pUC-HBcore 0.1μg/ml约10¹⁰/ml拷贝，作10倍稀释模板的SYBR Green I法标准定量曲线，最左边第一条扩增曲线为0.1μg/ml模板约10¹⁰拷贝，随之作10倍稀释，最后一条扩增曲线为没有模板的本底对照，结果本底对照Ct值在45循环内基本为一直线，在PCR反应内几乎没有扩增Ct值。标准定量曲线梯度分布均间隔3.3个Ct值，尤其低拷贝梯度拉得开，扩增效率100％。多次重复性非常好。

图5.为乙肝HBV改良TaqMan法实时荧光PCR分析，结果pUHBcore标准定量曲线梯度较好，本底对照Ct值在40循环内基本为一直线，在PCR反应内几乎没有扩增Ct值。

具体实施方式：

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、条件、步骤及应用所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实例一：人乙型肝炎病毒SYBR Green I实时荧光PCR：

乙型病毒性肝炎(简称乙肝)由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)引起的一种世界性的传染性疾病。在我国人群中乙肝感染率非常高，极大的危害了人们的身体健康。目前乙肝的检测方法主要有酶免疫法、放免法、化学发光法、免疫荧光法、核酸扩增(PCR)荧光定量法等。酶免疫法应用较广，但是实时荧光PCR分析法可以精确测定乙型肝炎病人的病毒基因，对感染者病毒复制水平的判断，病情传染性及抗病毒药物疗效监测具有无法替代的重要作用。

乙型肝炎病毒(HBV)为部分双链DNA病毒，主要有三段种型特异保守区，分别位于表面抗原HBsAg区，X区和核心Core区，大部分HBV实时荧光PCR研究集中选择核心Core区和表面抗原HBsAg区。HBV核心Core区有正负双链DNA，表面抗原HBsAg区仅含负链DNA单链，且大量二级结构亦集中于此区域，影响PCR扩增效率。比较大多数发表的核心Core区PCR引物序列，仍存在一些明显的引物间形成二聚体碱基互补序列，甚至不符合一般引物设计通用原则，试用PCR实际引物二聚体大都在Ct值30循环处。

本发明精选乙型肝炎病毒(HBV)核心Core区(CDR：2306-2444)一段序列作为HBV同序引物置换的核酸扩增靶特异序列，展示两端各20碱基Core区(nt：2306-2444)序列(SEQ ID NO：2)如下：

AB540584Core区(nt：2306-2444)

CAAATGCCCC TATCTTATCA AC------GTCGCAGAAGA TCTCAATCTC

HBVcore实时荧光PCR引物设计：

本发明根椐一般引物选取原则以尽量减少引物二聚体来综合考虑、设计：

(1)选取含种型特异保守序列的100-300bp片段作为靶保守区；(2)引物长16-25base，解链温度Tm在52-60℃，引物间差小于2-3℃；(3)一对引物GC含量50％，分布均匀；(4)一对引物间不要有连续3个或以上碱基互补序列，避免4个以上重复序列和二级结构；(5)引物3’末端最后5个碱基避免连续3个以上G/C碱基；(6)引物3’最末端一般选择单个G或C碱基，如选T减少引物二聚体但也降低了特异性结合；(7)引物3’最末端绝对不能选“GC或CG夹”结尾，产生严重引物二聚体非特异性扩增。(8)一对引物中间部分6-8base相同序列能减缓引物二聚体非特异性扩增值。

HBVc引物序列如下：

HBVcF：5’-at gcc cct atc tta tca ac-3’      即SEQ ID NO：3，

HBVcR：5’-g att gag atc ttc tgc gac-3’      即SEQ ID NO：4。

其中F代表上游特异引物序列，R代表下游特异引物序列，粗体代表同序碱基。

由于下游引物HBVcR3’末端有过多的GC，所以设计争对HBVcR引物反义干扰寡核苷酸，其序列为：5’-g aag acg ct-3’，即SEQ ID NO：5，其中第4、第7位g为2’-O-Methyl RNA反义碱基，3’末端标记磷酸基团封闭(合成定购于上海生工生物工程有限公司)。引物HBVcF(5μM)用20％Dextran(w/v)和0.1M NaCl液稀释四倍成1.25μM作为缓释引物；HBVcR(5μM)加入千分之一体积的2nM反义干扰寡核苷酸使引物中含2pM浓度。

另以临床检验的已知HBV阳性标本血清煮沸法上清为模板，选定全长Core区(1900-2450)片段两侧序列合成带酶切位点引物扩增模板550bp片段，将该片段酶切并克隆至pUC₁₉载体作为乙肝模拟定量对照DNA(pHBVc)，并且CPG酶甲基化后以pUC₁₉(1ng/ml)液从0.01μg/ml点开始作10倍稀释6-7次生成10倍梯度定量标准品，最后加2％甘油冻存。

聚合酶Taq(5U/μl)中加入微量0.5-0.7mg/100ml Poly-Phosphoric Acid(Sigma04101，多聚磷酸)，其所带负电菏常温时结合抑制Taq酶而热启动释放Taq酶活性，与反义寡核苷酸结合缓释引物联用双重热启动，进一步保证了靶特异扩增可靠性。并再加10％-20％量的UDG酶。

(1)标本处理：

采用一步煮沸法，取50μl-100μl血清加等量的煮沸缓冲液(用前充分混匀微珠，剪大口吸头吸取)，轻混，置沸水浴10分钟，经4℃短暂冷确后高速离心10分钟，取上清加样5μl。

弱阳性标本采用PEG沉淀HBV，取血清500μl加500μl 20％(w/v)PEG液，Vortex混匀，高速离心10分钟，弃上清950μl，浓缩沉淀留50μl加50μl煮沸缓冲液，余同上煮沸法，加样5μl。但PEG沉淀回收率平均为60％，定量检测必须计算损失。或另购商业提取盒。2×煮沸缓冲液：0.02N NaOH，0.02％SDS(w/v)，25mM KoAc，10mM(NH₄)₂SO₄，0.5％G25(v/v)，0.5M Betaine，0.5％Glycerol(v/v)和0.05％Gelatin(w/v)。

(2)SYBR Green I荧光PCR反应：

采用25μl反应体系，由于SYBR Green I对单链和低于0.1μg/ml(10¹⁰拷贝数)DNA结合率极低，荧光本底很低，但对进入对数期扩增的高浓度DNA结合率增加数千倍，荧光信号强列使SYBR Green I PCR系统灵敏敏度高于探针法PCR一个数量级，(反应体系25μl荧光信号已大大过剩，还可以减低至纳升级，更加适合高通量的微纳PCR芯片反应)。

首先每个PCR管先加2μl的缓释引物(1.25μM)于管底！不必换吸头；再加5μl样本或标准品于PCR管的近管底处，每管换一加样吸头；再加反应混合液18μl于相应PCR管壁中部，小心就不必换吸头；最后，每反应管再沿上部管壁小心加30μl石蜡油，不要混匀，以防破坏缓释！短瞬离心；缓释引物可以被变性95℃释放热启动和防产物汽雾胶污染。

每个检测可平行2-3份×25μl计平均Ct值，分析统计结果。

上实时荧光PCR仪(西安天隆公司TL988型和MJ Inc.DNA Engine Option^TM2，仪器激发光波长：480nm，检测光波长：520nm)，按使用说明书操作。首先预反应50℃2分钟-95℃2分钟，然后45个循环：94℃20-30秒，54℃30秒，72℃20-30秒。于72℃读取荧光值。

也可不加SYBR Green I的反应液进行常规终末PCR35次热循环反应，扩增条件相同，矿物油代替热盖，产物用1.5％-2％琼脂糖凝胶电泳检测(电泳时荧光染料影响电泳迁移率)。

(3)实验结果分析：

模拟阳性基因质粒pHBcore定量标准品作10倍稀释梯度，其系列浓度与拷贝数的换算及SYBR Green I实时荧光PCR产生的Ct值线性关系见下表：

质粒pHBcore标准品DNA，MW：2.1×10⁶

SYBR Green I实时荧光PCR实时结果见附图4，作10倍稀释模板的标准定量曲线，表左边第一条扩增曲线为0.01μg/ml模板约10⁹拷贝，随之10倍稀释，最后一条扩增曲线为没有模板的本底对照，本底对照Ct值在45PCR循环内几乎没有扩增Ct值。

血清样本加等量煮沸缓冲液后上样5μl，较标准品5μl稀释了一倍。根据标准曲线Ct值所得样本拷贝数或国际单位须乘两倍，按下表样本换算。Ct值＜37为阳性，Ct＞38为阴性，一般不必作融解曲线分析，阳性Tm值87℃，Tm＜78℃为阴性。

HBV DNA MW：1.57×10⁶～2.09×10⁶

通过大量培养乙型肝炎病毒(HBV)的检测和1000余例所收集的临床标本实验，40％阳性标本病度滴度分布于10³-10⁹IU/ml范围内，同TaqMan探针法比较和上海复星公司、广洲达安公司试剂比较，同样拷贝数标本DNA的检测Ct值要早3-4个循环数，灵敏度高出一个数量级。尤其对弱阳性标本和大量阴性血清的重复检测结果非常稳定，远好于其它方法和试剂。

实例二：HBV改良TaqMan探针法实时荧光PCR：

探针法实时荧光PCR主要以TaqMan探针为代表，也包括增加结合力的MGB探针和锁核酸LNA碱基探针。扩增产物增加的信号通过带淬灭基团的荧光探针来检测。一般TaqMan探针5’端标记FAM、VIC、NED等荧光基团，3’末端标记TAMRA、DABCYL&BHQ等淬灭基团，被淬灭荧光的TaqMan探针通过Taq酶的5’外切酶水解而游离荧光基团产生荧光。TaqMan探针设计尊循以下一般原则：1)探针的T_m值比引物的T_m值要高10℃以上；2)探针5’端不能是G碱基，被酶切降解的G仍具有淬灭报告荧光作用；3)探针中的G不能多于C；4)避免单一核苷酸成串，尤其是G；5)富含AT的序列要增加长度，以达到符合要求的T_m值，但探针必须＜40nt，否则淬灭效率低，反应本底高；6)探针退火时，其5’端应尽可能接近引物，同时又不重叠，离引物的3’端至少一个碱基远；7)检测单碱基变异(SNP)时，突变点尽量置于探针中间或靠近5’端，探针尽可能短；8)探针做mRNA表达分析时，探针序列应包括外含子/-/外含子边界；9)探针的3’端必须淬灭剂封闭以防止PCR扩增时延伸。

本发明采用改良TaqMan探针的实时荧光PCR反应，其探针3’末端再人为增加6-8个与5’端互补的碱基，以使3’淬灭基团靠近5’荧光基团。整合TaqMan与Molecular beacon技术优点，其改良探针选取靶基因(临近下游一端引物)的一段代表性序列(nt：2374-2405)，靶特异性序列(/互补序列)5’端标记报告荧光染料FAM，利用Taq酶5’-3’外切酶活性水解与靶序列杂交的探针而切割释放荧光基团；探针3’端靶序列外添加几个与5’端互补碱基再标记淬灭基团BHQ-1，探针两末端类似Molecular beacon分子内末端互补形成锅柄样结构，不仅降低了探针与过量引物间形成非特异性杂交延伸的聚合体，也抑制降低了本底荧光2-4倍，，兼容了Molecularbeacon本底低和TaqMan灵敏、特异的优点。

本实例同样精选乙型肝炎病毒(HBV)核心Core区(CDR：2306-2444)一段序列作为HBV同序引物置换的核酸扩增靶特异序列，展示两端各20碱基Core区(nt：2306-2444)序列如SEQID NO：6所示，即：

AB540584Core区(nt：2306-2444)

CAAATGCCCC TATCTTATCA AC------GTCGCAGA AGA TCTCA ATCTC

根椐同样一般引物选取原则以尽量减少引物二聚体来综合考虑、设计HBVcore探针法荧光PCR引物：

HBVc引物序列如下：

THBVFc：5’-ca aat gcc cct atc tta tca ac-3’，即SEQ ID NO：7，

THBVRc：5’-gag att gag atc ttc tgc gac-3’，即SEQ ID NO：8。

其中F代表上游引物序列，R代表下游直接靶特异引物，粗体代表同序碱基。

设计争对THBVFc引物反义干扰寡核苷酸PNA，其序列为SEQ ID NO：9：5’-g ttg-3’(合成定购于PD Biocem Co.，Ltd)，THBVFc(5μM)加入千分之一体积的100nM反义PNA使引物中含100pM浓度。THBVRc用18％Dextran(w/v)和0.1MNaCl液稀释成2.5μM缓释引物。

探针序列如SEQ ID NO：10所示，即：cc tag aag aag aac tcc ctc gcc tcg cag acg，采用其反意链并加3’末端茎结构碱基，

TqHBc，如SEQ ID NO：11所示，即：5’-FAM cgt ctg cga ggc gag gga gtt ctt ctt ctagg cac acg BHQ-1-3’

(1)临床血标本DNA提取：

离心柱方法：取血清100μl.，加100μl的样本煮沸缓冲液，轻混，置沸水或金属浴中煮沸10分钟，高速离心10分钟，上清加3倍的6M碘化纳N_aI液移至商业DNA纯化柱(核酸硅吸附膜柱)，加洗涤缓冲液(含70％EtOH的2M N_aI液)离心洗涤两次，加50μl dH₂O离心洗脱收集纯化的样本。(煮沸上清可直接PCR)。微磁珠方法：采用盐酸胍/异硫氰酸胍裂解，核酸在高浓度4M胍盐条件下结合至聚苯乙烯微磁球硅烷化表面羟基(Melzak et al，1996)，用小于pH6.0的缓冲液洗涤，大于pH8.5缓冲液洗脱。微磁球法已经越来越多地取代酚-氯仿抽提液体方法和硅吸附膜离心柱方法。

取血清100μl于1.5ml试管中，加等体积的胍盐裂解液5分钟，加0.8ml稀释中和液后再加25μl顺磁纳米硅化微球结合，将试管置于磁分离试管架吸附固定磁微球，弃液后，加0.8ml洗液洗涤一次，最后磁微球加50μl洗脱液收集DNA。

(2)TaqMan实时荧光PCR反应：

由于TaqMan探针PCR每个模板每次循环最多释放一个荧光基团，其反应荧光强度远低于SYBR Green I荧光染料法(每3-4bp DNA能结合一个SYBR Green I分子)，所以TaqMan法必须采用较大体积的50μl反应体系，以使PCR仪器能接受到足够强度的荧光信号。当然也成比例增加了PCR反应基线荧光本底，TaqMan探针3’末端增加几个与5’端互补的碱基，以使3’淬灭基团靠近5’荧光基团降低本底荧光2-4倍而不影响特异扩增。

首先每个PCR反应管加2μl缓释引物R(2.5μM)，缓释引物热启动和防产物气雾胶污染。再按以下配方取1.5ml的EP管配制不含待测模板和引物F的反应混合液，

(^☆探针荧光会逐渐衰减，旧标记探针可相应多加一些。)

所配的×25次反应混合液共0.95ml分装于预加缓释引物的PCR反应管/或12管排管，每管38μl分装25管。其中一管加10μl纯化水dH₂O作为PCR系统阴性对照，表面再小心、缓慢地沿管壁加上50μl矿物油封闭，短瞬离心，切记不要混匀！以防破坏缓释。

含2μl缓释引物R和38μl反应液的PCR管加10μl待检DNA，表面再小心、缓慢地加上50μl矿物油封闭。为了检测结果的可靠性，每次检测必须设立实验阳性阴性对照和1-6个定量校准品(根据是否定量需要)，实验对照参与提取DNA过程，模拟阳性定量校准品是0.1μg/ml作10倍梯度稀释，如90μl dH₂O加10μl标准品，混匀后吸出10μl加入下一个10×倍稀释点90μl dH₂O，余以此类推。

每个检测可平行2-3份×50μl计平均Ct值，分析统计结果。

标准曲线：

模拟标准0.1μg/ml，0.1μg/ml×10^-1，×10^-2，×10^-3，×10^-4，×10^-5，×10^-6稀释点。以pUC-HBcore(3.36kb，分子量MW＝2.1×10⁶，计1μg＝2.8×10¹¹copy分子)计算，相应标准品梯度分子拷贝数为：5.6×10⁹/ml，5.6×10⁸/ml，5.6×10⁷/ml，5.6×10⁶/ml，5.6×10⁵/ml和5.6×10⁴/ml。

反应管上实时荧光PCR仪(调整仪器激发光波长FAM：480nm，检测光波长FAM：520nm)。按使用说明书设置运行程序，首先进行一个预反应50℃2分-94℃2分钟；然后PCR扩增40个热循环：94℃30秒，58℃60秒；于58℃读取荧光值。矿物油封闭表面残留反应液蒸发至管盖会挡住光路，仍需设置热盖但不用等热盖升温就开始PCR。

(3)实验结果分析：

HBV核心抗原质粒对照pUC-HBcore 0.01μg/ml约10⁹/ml拷贝，作10倍稀释模板的标准定量曲线，最左边第一条扩增曲线为0.01μg/ml模板约10⁹拷贝，随之作10倍稀释，最后一条扩增曲线为没有模板的本底对照，结果本底对照Ct值在40循环内基本为一直线，在PCR反应内几乎没有扩增Ct值(见附图5)。阴性参考品全为基线反应。多次重复性非常好。

购买中检所乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量标准品(批号0711)阳性参考品及定量参考品L1-L5标准检测结果基本一致，阴性参考品全为基线反应。临床试验400例阳性标本99％与上海复星公司试剂盒检测结果符合，阴性血清检测未出现假阳性反应。多次重复性非常好。

Claims (10)

1.一种反义干扰寡核苷酸抑制引物非特异性扩增的方法，其特征在于：使用能结合引物3'端序列的反义寡核苷酸来干扰PCR引物3'末端非特异性的策略，所述的反义寡核苷酸是特指一段4-9base由反义碱基组成的寡聚核苷酸；其关键特征在于反义碱基寡核苷酸保留Watson碱基配对杂交性能,但失去了作为PCR扩增模板和引物功能,反义干扰寡核苷酸与非特异性模板竞引物3'末端而PCR热循环条件下不能与特异靶模板竞争引物,使一对引物PCR反应内不会产生引物二聚体非特异性扩增；所述反义干扰寡核苷酸在一对引物基础上，采用一段与引物3'末端互补的4-9base反义寡核苷酸来模拟潜在的非特异性模板DNA，竞争性地结合引物3'末端而干扰抑制过量引物非特异性扩增，或使用3'末端固相化任意序列4-9base反义碱基寡核苷酸结合引物热启动缓释,再进行核酸PCR扩增，既不干扰靶分子特异性扩增，也没有非特异性扩增干扰。

2.根椐权利要求1所述的反义干扰寡核苷酸抑制引物非特异性扩增的方法，其特征在于：所述核酸扩增技术的一端引物缓释热启动,所述的引物缓释是引物杂交吸附于某一固体微球交联的反义寡核苷酸,并溶解于某一比重大且粘性强的液体,固相微球可逆吸附与释放引物；预加样的缓释引物常温下不进入PCR反应液使扩增不能进行,热变性后引物完全释放入PCR反应液启动PCR运行,并且要不干扰PCR；引物缓释热启动适用于有引物作用的热循环PCR技术。

3.根椐权利要求2所述的反义干扰寡核苷酸抑制引物非特异性扩增的方法，其特征在于：所述的固体微球一般包括小于20微米的葡聚糖凝胶或聚苯乙稀微球,表面带弱阳性电荷的纳米至微米级壳聚糖,弱阴性离子交换树脂/纤维素微球。

4.根椐权利要求1所述的反义干扰寡核苷酸抑制引物非特异性扩增的方法，其特征在于：所述的引物缓释溶剂一般采用15％-20％葡聚糖(w/v)液,或天然粘胶,所述的引物缓释溶剂溶解引物预先加入PCR管底室温下不与后加的反应液混匀,在PCR热变性后粘稠引物才被热混匀而释放入反应体系启动扩增。

5.根椐权利要求1所述的反义干扰寡核苷酸抑制引物非特异性扩增的方法，其特征在于：所述的引物缓释配合PCR反应液表面矿物油封闭而杜绝PCR产物气雾胶挤出管盖外二次污染,矿物油面上溅出的反应液因缺少缓释引物而PCR成份不全,所以没有扩增产物泄漏。

6.根椐权利要求1所述的反义干扰寡核苷酸抑制引物非特异性扩增的方法，其特征在于：所述的反义干扰寡核苷酸选择一种4-9base任意碱基反义寡核苷酸,采用任意碱基组合的每一个序列位置均四种碱基排列的寡核苷酸,排列组合数＝4ⁿ，n为序列碱基数,覆盖了所有潜在的非特异性结合；任意碱基反义寡核苷酸采用权力要求2所述的微球共价交联固相化,加入1-5μM的固相化反义寡核苷酸就可结合多数引物而间接固相化引物并抑制热循环中引物非特异性扩增。

7.根椐权利要求1所述的反义干扰寡核苷酸抑制引物非特异性扩增的方法，其特征在于：所述的反义干扰寡核苷酸选择一种4-9base特异碱基反义寡核苷酸,所述的特异碱基反义寡核苷酸序列与引物3'末端序列互补,加入0.1-100pM的特异反义寡核苷酸结合特异配对引物,抑制PCR反应中引物非特异性扩增；采用 权利要求4所述的溶剂葡聚糖溶解反义寡核苷酸结合引物,粘稠引物与其它PCR成份短暂分隔而缓释热启动。

8.根椐权利要求1所述的反义干扰寡核苷酸抑制引物非特异性扩增的方法，其特征在于：所述的反义干扰寡核苷酸的反义碱基包括2'-O-Methyl RNA、2'-Fluoro RNA、2'-O,4'-C-methylene bridge RNA锁核酸(LNA)、和肽核酸(PNA)、Morpholino、N3'->N5'Phosphoramidate。

9.根椐权利要求1所述的反义干扰寡核苷酸抑制引物非特异性扩增的方法，其特征在于：所述的反义干扰寡核苷酸的反义碱基可间隔1-5个正常碱基而合成嵌合DNA,这种经济嵌合的特异碱基反义寡核苷酸适合大部分PCR；而较短的任意碱基反义寡核苷酸全部采用反义碱基,适合多重PCR。

10.根椐权利要求1所述的反义干扰寡核苷酸抑制引物非特异性扩增的方法，其特征在于：5U/μl聚合酶Taq中加入微量0.5-0.7mg/100ml Sigma04101多聚磷酸单独使用不影响靶特异扩增Ct值,而多聚磷酸所带负电荷常温时结合抑制聚合酶、推后引物本底Ct值2-3个循环,与反义寡核苷酸结合缓释引物联用特别有效,相互加倍作用双重热启动,进一步保证了靶特异扩增可靠性。