CN116908432A

CN116908432A - 一种基于光切割的荧光分析检测黄曲霉毒素b1含量的方法

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Publication number: CN116908432A
Application number: CN202310835039.4A
Authority: CN
Inventors: 贾永梅; 周国华; 刘陪炼; 陈益丽; 李志果; 刘玉革
Original assignee: Lingnan Normal University
Current assignee: Lingnan Normal University
Priority date: 2023-07-07
Filing date: 2023-07-07
Publication date: 2023-10-20

Abstract

本发明公开了一种基于光切割的荧光分析检测黄曲霉毒素B1含量的方法，涉及生物检测技术领域。所述方法包括利用荧光探针组合对黄曲霉毒素B1的含量进行检测的步骤；所述Aptamer的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，FAM基团标记于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的3’端；所述PC‑strand的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，TAMRA基团标记于SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的5’端，PC基团标记于SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的10bp和11bp处碱基之间。本发明提供的方法可以实现对于黄曲霉毒素B1的光敏性检测，并且检测灵敏度高，特异性强。

Description

一种基于光切割的荧光分析检测黄曲霉毒素B1含量的方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种基于光切割的荧光分析检测黄曲霉毒素B1含量的方法。

背景技术

随着科技发展，人们生活水平日益提升，对于食品安全要求越来越高。食品在生产储存等过程中如果保存不当易产生黄曲霉毒素，尤其易发生霉变农作物中如玉米、大豆等或其制品。黄曲霉毒素毒性和致癌性极强，特别是黄曲霉毒素B1(AFB1)，已被世界卫生组织列为I类致癌物质。为了确保食品的安全，如何采取相关检测技术检测食品毒素AFB1一直以来都是被探讨的话题之一。

现有技术中AFB1的检测方法主要有比色法、荧光法、电化学法、高效液相色谱法(HPLC)、表面等离子共振法、新型荧光适配体传感器等，但目前大多数带有靶标识别单元的生物传感器是“被动型”的，即目标探针“始终处于活跃状态”，一旦与靶标分子AFB1反应即输出特异性信号，很难实现该过程的可控调控和精准控制。对于实际检测样品，由于样品的复杂性，如组分多、丰度低、结构复杂等特点，需要在追求高灵敏度、高特异性的基础上实现实时、原位的可控激活，实现对靶标分子AFB1的精准检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于光切割的荧光分析检测黄曲霉毒素B1含量的方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的方法可实现对黄曲霉毒素B1的光敏性检测，且检测灵敏度高，特异性强。

本发明利用光的即时操作和远程触发性，开发“活性抑制”状态的生物传感器可避免现有技术的缺陷。在生物传感过程中，处于“活性抑制”状态的靶标识别单元即使在有靶标分子AFB1存在时，仍处于惰性状态，直到特定时间，被选择性激活转换到“开启”状态，与靶标分子AFB1结合，实现荧光信号输出。

基于此，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种基于光切割的荧光分析法检测黄曲霉毒素B1含量的荧光探针组合，包括荧光探针Aptamer和PC-strand；

所述Aptamer的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，FAM基团标记于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的3’端；

所述PC-strand的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，TAMRA基团标记于SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的5’端，PC基团标记于SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的10bp和11bp处碱基之间；

所述PC基团的结构式如下：

本发明还提供上述的荧光探针组合在制备基于光切割的荧光分析法检测黄曲霉毒素B1含量的试剂盒中的应用。

本发明还提供一种基于光切割的荧光分析法检测黄曲霉毒素B1含量的试剂盒，所述试剂盒包括上述的荧光探针组合。

本发明还提供上述的荧光探针组合或试剂盒在检测黄曲霉毒素B1含量中的应用。

本发明还提供一种基于光切割的荧光分析法检测黄曲霉毒素B1含量的方法，包括以下步骤：

(1)Aptamer溶液、PC-strand溶液和Tris缓冲溶液混合反应后进行紫外光照射，得到混合反应体系溶液；

(2)取相同体积的步骤(1)得到的混合反应体系溶液，分别加入体积相同但浓度不同的黄曲霉毒素B1标准溶液，反应后分别检测荧光强度，之后绘制得到关于黄曲霉毒素B1浓度和荧光强度的标准曲线；

(3)取步骤(1)得到的混合反应体系溶液，加入待检样品溶液，反应后检测荧光强度，之后根据所述标准曲线，核算得到所述待检样品溶液中的黄曲霉毒素B1含量；

在步骤(1)中，所述Aptamer的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，FAM基团标记于SEQID NO.1所示核苷酸序列的3’端；所述PC-strand的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，TAMRA基团标记于SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的5’端，PC基团标记于SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的10bp和11bp处碱基之间；

所述PC基团的结构式如下：

在步骤(3)中，所述混合反应体系溶液与所述待检样品溶液的体积比与步骤(2)中的混合反应体系溶液和黄曲霉毒素B1标准溶液的体积相同。

进一步地，在步骤(1)中，在所述Aptamer溶液、所述PC-strand溶液和所述Tris缓冲溶液的混合溶液中，所述Aptamer的浓度为0.15μmol/L；所述PC-strand的浓度为0.24μmol/L。

进一步地，在步骤(1)中，所述混合反应的温度为4℃。

进一步地，在步骤(1)中，所述紫外光照射的辐照强度为5mW/cm²。

进一步地，所述紫外光照射的辐照时间为8min。

进一步地，在步骤(2)和步骤(3)中，所述反应的温度均为37℃。

本发明公开了以下技术效果：

本发明以荧光标记的DNA单链Aptamer作为荧光探针，以具有光学活性基团标记的PC-strand与荧光探针Aptamer部分互补，形成双链，此时猝灭基团TAMRA与荧光基团FAM的距离较近，荧光猝灭；在光照条件下，PC-strand在光敏基团位置打开，形成两段，并分别与荧光探针Aptamer形成双链，此时，PC-strand与Aptamer的结合力较弱。当靶标分子AFB1存在时，AFB1与荧光探针Aptamer特异性结合，形成二级结构，而PC-strand与荧光探针Aptamer形成的双链结构被破坏，猝灭基团TAMRA远离荧光基团FAM，荧光恢复。基于Aptamer对AFB1具有特异性识别的作用，当加入与AFB1具有类似结构的赭曲霉毒素(OTA)或玉米赤霉烯酮(ZEN)时，荧光没有恢复，通过监测荧光信号变化，实现对靶分子AFB1的特异性检测，并应用于食物(如大米、玉米、大豆等)中AFB1的检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明检测方法的原理示意图；

图2为AD双链、A-PD双链和A-nPD双链的示意图；

图3为Aptamer溶液的浓度优化实验的荧光检测结果；

图4为Aptamer与PC-strand反应温度的优化实验结果；其中，(A)为荧光曲线图；(B)为柱状图；

图5为PC-strand浓度筛选实验结果；其中，(A)为荧光曲线图；(B)为点状图；

图6为碱基影响实验的结果；其中，A为1号试管加入AFB1标准液前后的荧光强度检测结果；B为2号试管加入AFB1标准液前后的荧光强度检测结果；

图7为PC健影响实验的结果；其中，A为1-4号试管的荧光强度检测结果；B为5-8号试管的荧光强度检测结果；

图8为光照影响实验的结果；其中，A为1-2号试管的荧光强度检测结果；B为3-4号试管的荧光强度检测结果；

图9为光照对AFB1检测的凝胶电泳图；M代表20bpDNAleadermarker，1为Aptamer，2为PC-strand，3为在没有光照条件下Aptamer+PC-strand+AFB1，4为在有光照条件下Aptamer+PC-strand，5为在有光照条件下Aptamer+PC-strand+AFB1；6为Aptamer+AFB1；方框部分为PC-strand链光照射后，PC键断开的产物片段；

图10为光照时间影响实验的结果；其中，A为荧光曲线图；B为点状图；

图11为光照对Aptamer结构影响的圆二色谱图；其中，A为光照条件下Aptamer、Aptamer+PC-strand和Aptamer+PC-strand+AFB1的结构图；B为没有光照条件下Aptamer、Aptamer+PC-strand和Aptamer+PC-strand+AFB1的结构图；

图12为反应温度对AFB1检测的影响；其中，A为荧光曲线图；B为折线图；

图13为AFB1灵敏度的检测结果；其中，(A)为荧光曲线图；(B)为折线图；

图14为特异性实验结果；其中，A为荧光曲线图；B为柱状图；

图15为玉米水应用探究实验结果；其中，A为荧光曲线图；B为点状图；

图16为大米水应用探究实验结果；其中，A为荧光曲线图；B为点状图；

图17为大豆水应用探究实验结果；其中，A为荧光曲线图；B为点状图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明是基于光切割下进行的实验探究，如图1所示，基本原理为：荧光探针Aptamer与具有光学活性基团标记的PC-strand部分互补，形成双链(图2中A-PD)，由于猝灭基团TAMRA与荧光基团FAM距离较近，使得荧光猝灭；在光照条件下，PC-strand在光敏基团位置打开，PC-strand断裂形成两段，分别与荧光探针Aptamer形成双链(图2中AD和A-nPD)，此时，Aptamer与PC-strand形成两段双链结构，结合力较弱，当引入AFB1时，Aptamer对AFB1具有特异性识别作用，形成二级结构，此时Aptamer与PC-strand形成的双链结构被破坏，猝灭基团TAMRA远离荧光基团FAM，荧光恢复。基于Aptamer对AFB1具有特异性识别的作用，当加入与AFB1具有类似结构的赭曲霉毒素(OTA)或玉米赤霉烯酮(ZEN)时，荧光没有恢复，通过检测荧光信号的变化，实现对靶标分子AFB1的特异性检测，并应用于食物(如大米、玉米、大豆等)中AFB1的检测。

在以下实施例中，Aptamer、PC-strand、None-PC-strand和DNA均由上海生物工程有限公司合成，其中：

Aptamer：

5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-FAM-3’

(SEQ ID NO.1)；

PC-strand：5’-TAMRA-GGGCCTAGCG-PC-AAGGGCAC-3’(SEQ ID NO.2)；

None-PC-strand：5’-TAMRA-GGGCCTAGCGAAGGGCAC-3’(SEQ ID NO.3)；

DNA：5’-TAMRA-GGGCCTAGCG-3’(SEQ ID NO.4)。

PC的化学结构式如下：

实施例1

1方法

1.1Aptamer溶液的浓度优化

取7支离心管，取不同体积的Aptamer(1μmol/L)溶液于离心管中，再分别加入Tris(10mMTris、120mMNaCl、5mMKCl、pH＝7.2)缓冲溶液，充分混匀，反应总体积为80μL。在7支离心管中Aptamer的终浓度为0.5μmol/L、0.25μmol/L、0.2μmol/L、0.15μmol/L、0.1μmol/L、0.07μmol/L、0.03μmol/L，充分混匀，检测其荧光强度。荧光强度检测条件：激发波长为480nm、扫描范围为490-700nm、电压为700V、狭缝为5/5。

1.2Aptamer与PC-strand反应温度的筛选

取4支离心管，均分别加入Aptamer、PC-strand和Tris(10mMTris、120mMNaCl、5mMKCl、pH＝7.2)缓冲溶液，充分混匀，反应总体积为80μL。Aptamer的终浓度为0.15μmol/L，PC-strand的终浓度为0.18μmol/L。将4支离心管中溶液分别于4℃、15℃、25℃、37℃下反应1h，检测其荧光强度。

荧光强度检测条件：激发波长为480nm、扫描范围为490-700nm、电压为700V、狭缝为5/5。

1.3PC-strand浓度的筛选

取12支离心管，均分别加入Aptamer、PC-strand和Tris(10mMTris、120mMNaCl、5mMKCl、pH＝7.2)缓冲溶液，充分混匀，反应总体积为80μL，于4℃下反应1h后，检测荧光强度。其中，Aptamer的终浓度为0.15μmol/L，PC-strand的终浓度分别为0、0.03μmol/L、0.06μmol/L、0.09μmol/L、0.12μmol/L、0.15μmol/L、0.18μmol/L、0.21μmol/L、0.24μmol/L、0.27μmol/L、0.3μmol/L、0.33μmol/L。

1.4碱基的影响

取2支离心管，如表1所示，分别加入Aptamer、DNA/PC-strand和Tris(10mMTris、120mMNaCl、5mMKCl、pH＝7.2)缓冲溶液，充分混匀，反应总体积为80μL，于4℃下反应1h，再加入AFB1标准液，于37℃下反应1h后，检测荧光强度。其中，Aptamer的终浓度为0.15μmol/L，PC-strand的终浓度0.24μmol/L，DNA终浓度为0.24μmol/L，AFB1标准液终浓度为150ng/mL。

表1

1.5PC健的影响

取8支离心管并编号1-8，如表2所示，进行如下操作：

1-4号离心管中均分别加入Aptamer、DNA和Tris缓冲溶液，5-8号离心管中分别加入Aptamer、none-PC-strand和Tris缓冲溶液充分混匀，1-8号均于4℃下反应1h。之后，1-2、5-6号离心管不经过光照处理，2号和6号离心管中加入AFB1标准液，于37℃下反应1h后，检测荧光强度，反应总体积为80μL。1号和5号离心管做为2号和6号实验的对照组，不加入AFB1标准液。3-4、7-8号离心管紫外光(辐照强度5mW/cm²)照射20min，4号和8号离心管中加入AFB1标准液，于37℃下反应1h后，检测荧光强度，反应总体积为80μL。3号和7号离心管做为4号和8号实验的对照组，不加入AFB1标准液。

Aptamer的终浓度为0.15μmol/L，none-PC-strand的终浓度0.24μmol/L，DNA终浓度为0.24μmol/L，AFB1标准液终浓度为150ng/mL。

表2

1.6光照的影响

取4支离心管编号1-4，分别均加入Aptamer、PC-strand和Tris缓冲溶液于4℃下反应1h，1-2号离心管紫外光(辐照强度5mW/cm²)照射20min后，2号离心管中加入AFB1标准液，于37℃下反应1h后，检测荧光强度，反应总体积为80μL。1号离心管做为2号离心管的对照组实验，不引入AFB1标准液。3-4号离心管不经过紫外光照射处理，4号离心管中加入AFB1标准液，于37℃下反应1h后，检测荧光强度，反应总体积为80μL。1号离心管做为2号离心管的对照组实验，不引入AFB1标准液。

其中，Aptamer的终浓度为0.15μmol/L，PC-strand的终浓度0.24μmol/L，AFB1标准液终浓度为150ng/mL。

30％丙烯酰胺(5mL)、5×TBE缓冲溶液(2mL)、甲酰胺(2mL)、尿素(4.2g)、10％过硫酸铵(90μL)和四甲基乙二胺(90μL)混合均匀，装入凝胶电泳板中，室温放置至胶凝固，每个样孔板中加入DNA样品(10μL)、6×loadingbuffer(2μL)和Gelred染料(1μL)，90V电压，1.5小时停止电泳实验，取胶在凝胶电泳成像仪下观察DNA样品条带。

1.7光照时间的影响

取10支离心管编号1-10，均加入Aptamer、PC-strand和Tris缓冲溶液于4℃下反应1h，紫外光(辐照强度5mW/cm²)照射0min、1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min，再向10支离心管中加入AFB1标准液，于37℃下反应1h后，检测荧光强度，反应总体积为80μL。

取4支离心管编号1-4，均加入Aptamer、PC-strand和Tris缓冲溶液于4℃下反应1h，4号离心管紫外光(辐照强度5mw)照射8min后，3号离心管和4号离心管均加入AFB1标准溶液37℃，反应1h，测其圆二色谱，反应总体积为80μL。

Aptamer的终浓度为0.15μmol/L，PC-strand的终浓度0.24μmol/L，AFB1标准液的浓度为150ng/mL。

圆二色光谱仪测试条件：光谱扫描范围为200-340nm，间隔为0.5nm，用Tris缓冲溶液扣除光谱背景。

1.8AFB1反应温度的筛选

取4支离心管编号1-4，均分别加入Aptamer、PC-strand和Tris缓冲溶液，于4℃下反应1h，紫外光(辐照强度5mW/cm²)照射8min，再加入AFB1标准液，于不同温度(4℃、15℃、25℃、37℃)下反应1h后，检测荧光强度，反应总体积为80μL。

1.9AFB1检测灵敏度

取13支离心管编号1-13，均分别加入Aptamer、PC-strand和Tris缓冲溶液，于4℃下反应1h，之后紫外光(辐照强度5mW/cm²)照射8min，之后加入不同浓度AFB1标准液，37℃反应1h后，检测荧光强度，反应总体积为80μL。

其中，Aptamer的终浓度为0.15μmol/L，PC-strand的终浓度0.24μmol/L，AFB1标准液终浓度为0ng/mL、0.00625ng/mL、0.0875ng/mL、0.0125ng/mL、0.025ng/mL、0.0625ng/mL、0.625ng/mL、6.25ng/mL、62.5ng/mL、625ng/mL。

1.10AFB1检测特异性

取6支离心管编号1-6，均分别加入Aptamer、PC-strand和Tris缓冲溶液，于4℃下反应1h，之后紫外光(辐照强度5mW/cm²)照射8min，取1号离心管做为对照组样品，不加入真菌毒素，2-4号离心管中分别加入真菌毒素AFB1标准液、OTA标准液和ZEN标准液，5号离心管加入AFB1标准液和OTA标准液，6号离心管中加入AFB1标准液和ZEN标准液，37℃反应1h后，检测荧光强度，反应总体积为80μL。

其中，Aptamer的终浓度为0.15μmol/L，PC-strand的终浓度0.24μmol/L，AFB1标准液、OTA标准液、ZEN标准液终浓度均为150ng/mL。

1.11AFB1检测应用实验

食物样品中AFB1提取：食物样品(玉米、大米、大豆)，用粉碎机碎成粉末，根据中国食品安全国家标准(GB5009.22-2016)中的方法提取食物样品中黄曲霉毒素AFB1。简而言之，取3g食物样品加入10mL甲醇/水(7:3)溶液，30℃震荡反应1小时，过滤，滤液4℃、12000rpm离心10min。收集上清液，经过0.45μm过滤器过滤，加入3mLTris溶液，混合均匀，4℃条件下储存备用。

食物样品中AFB1检测：

取90μL食物样品(玉米、大米、大豆)提取液，加入不同体积的AFB1标准液，混合均匀，制备成不浓度AFB1浓度的食品样品溶液(AFB1的浓度分别为0ng/mL，0.075ng/mL,0.125ng/mL，0.75ng/mL和1.25ng/mL)，4℃条件下储存备用。

取5支离心管编号1-5，均加入Aptamer、PC-strand和Tris缓冲溶液，Aptamer的终浓度为0.15μmol/L，PC-strand的终浓度0.24μmol/L，于4℃下反应1h，紫外光(辐照强度5mW/cm²)照射8min，之后分别加入上述不浓度AFB1浓度的食品样品溶液，37℃反应1h，反应总体积为80μL。

AFB1溶液中检测条件：激发波长为480nm、扫描范围为490-700nm、电压为700V、狭缝为5/5。

2实验结果

2.1Aptamer浓度筛选结果

Aptamer是一种荧光探针，其具备良好的荧光特性，而TAMRA可有效猝灭FAM荧光，所以在使用PC-strand之前，需要对Aptamer浓度进行筛选，选择出具备良好发光反应效应的，同时也为了达到节省原液以及经济原则。从图3中发现，随着荧光探针Aptamer浓度增加，荧光强度逐渐增强，当浓度为0.15μmol/L时，荧光值为225.78633，可以确定选用浓度为0.15μmol/LAptamer溶液去参与后续实验。

2.2Aptamer和PC-strand的反应温度筛选结果

温度会在一定程度上对荧光猝灭的效果产生影响，为了后续实验加入AFB1时，荧光恢复到最佳效果，需要对其反应的温度进行优化，选择出荧光猝灭的最佳温度。根据实验作出的Aptamer与PC-strand反应温度的优化荧光曲线图和柱状图来看(如图4所示)，可以看出随着反应温度的增加，其荧光值增强，说明低温有利于Aptamer与PC-strand的杂化，反应温度为4℃的荧光猝灭效果最佳，故后续实验所用的温度为4℃。

2.3PC-strand浓度的筛选结果

根据图5可以看出，随着PC-strand浓度的增加，Aptamer的荧光强度逐渐降低，当其浓度为0.24μmol/L(C_Aptamer:C_PC-strand＝1:1.6)时，其荧光猝灭趋于平稳。因此，在后续实验中，选择PC-strand的浓度为0.24μmol/L。

2.4碱基的影响

如图6所示，在没有光照的条件下，AFB1为150ng/mL时，由于FRET效应，A-PD荧光变化较弱，荧光信号增强2.1倍(图6中B)，而不包含PC健以后的8个碱基的AD产生很明显的荧光信号变化，荧光信号增强7.37倍(图6中A)。说明增加碱基数，AFB1的Aptamer与DNA的结合力较强，降低传感性能。

2.5PC健的影响

如图7所示，没有光照，在有150ng/mLAFB1存在时，没有PC健的A-nPD荧光信号增加210％；没有PC健及8个碱基的AD荧光信号增加601％。在有光照及150ng/mLAFB1存在时，A-nPD荧光信号增加223％，AD荧光信号增加613％，光照对A-nPD和AD荧光变化没有影响。说明在A-PD中引入PC健是检测AFB1的时间门控设计的关键。

2.6光照的影响

如图8所示，在辐照强度为5mW/cm²的条件照射后，在AFB1为100ng/mL时，其的荧光强度增强430％，而没有经过辐照强度为5mW/cm²的条件照射，在AFB1为100ng/mL时，其的荧光强度增强178％。结果表明，光照可活化传感功能，且拓宽检测范围。

从图9可知，在光照条件下，PC-strand的PC键断开。

2.7光照时间的影响

如图10所示，在辐照强度为5mW/cm²的条件下，AFB1为100ng/mL时，A-PD的荧光强度逐渐增强，长时间的光照，令更多的PC健断开，产生更多的光活化探针，进而与AFB1结合的量较多，荧光增强，但在8min后，逐渐平稳。结果表明，光照可活化传感功能，且辐照时间为8min。

如图11所示，圆二色谱谱图中，CD_280nm正峰为碱基互补配对峰，CD_240nm负峰为DNA螺旋结构峰，A-PD在辐照强度为5mW/cm²的条件照射后，在AFB1为100ng/mL时，CD_280nm正峰增加39.1％，CD_240nm负峰降低565％。而没有经过辐照强度为5mW/cm²的条件照射，在AFB1为100ng/mL时，CD_280nm正峰降低20.0％，CD_240nm负峰降低163.8％。结果表明，光照更有利于AFB1与适配体结合，构型发生变化。

2.8反应温度对AFB1检测的影响

如图12所示，由于温度对适配体特异性识别靶标分子影响较大，因此，在辐照强度为5mW/cm²的条件下，AFB1为100ng/mL时，反应温度的变化对反应体系的荧光强度影响较大，当反应温度为37℃时，其荧光值最大。因此，在后续反应中，选择37℃为反应温度。

2.9AFB1检测灵敏度实验结果

如图13所示，在光照8min后，荧光值随着AFB1浓度(0～625ng/mL)的增加而增加，根据图13中(B)折线图中的拟合直线和标准方差的计算得出，检测的检出限LOD为

2.10AFB1检测特异性实验结果

如图14所示，在光照8min后，当体系中存在AFB1(100ng/mL)时，荧光强度增加4.4倍；当体系中存在相同浓度的OTA或ZEN(100ng/mL)时，荧光强度基本没有变化，而向体系中添加相同浓度的AFB1后，荧光强度显著增加。结果表明，该体系对AFB1具有较好的选择性。

2.11AFB1检测应用性

如图15所示，在光照8min后，当体系中存在AFB1时，荧光强度随着AFB1的浓度增加而逐渐增强。结果表明，该传感器在大米体系中对AFB1具有较好的应用性。

如图16所示，在光照8min后，当体系中存在AFB1时，荧光强度随着AFB1的浓度增加而逐渐增强。结果表明，该传感器在玉米体系中对AFB1具有较好的应用性。

如图17所示，在光照8min后，当体系中存在AFB1时，荧光强度随着AFB1的浓度增加而逐渐增强。结果表明，该传感器在大豆体系中对AFB1具有较好的应用性。

综上所述，本发明进行了一系列的探究，并且从实验得出的结果中选用了最佳值。即选用的Aptamer溶液最佳浓度为0.15μmol/L、最佳tris缓冲溶液(10mMTris、120mMNaCl、5mMKCl、pH＝7.2)。证明了光切割对于Aptamer与PC-strand反应的荧光猝灭的效果较佳，Aptamer与PC-strand反应温度最佳温度为4℃、反应最佳时间为20min、以及Aptamer与PC-strand的最佳浓度比值为1:1.2。还证明了在光切割后加入AFB1能荧光恢复的实验的可行性以及光切割的最佳时间为20min。选用了AFB1最佳反应温度为37℃，以及检测了AFB1的灵敏度，并计算得出检测的灵敏度为0.07018ng/mL。并将该实验方法应用于食物样品如玉米、大米、大豆等中检测AFB1的含量。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种基于光切割的荧光分析法检测黄曲霉毒素B1含量的荧光探针组合，其特征在于，包括荧光探针Aptamer和PC-strand；

所述PC基团的结构式如下：

2.一种如权利要求1所述的荧光探针组合在制备基于光切割的荧光分析法检测黄曲霉毒素B1含量的试剂盒中的应用。

3.一种基于光切割的荧光分析法检测黄曲霉毒素B1含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的荧光探针组合。

4.一种如权利要求1所述的荧光探针组合或权利要求3所述的试剂盒在检测黄曲霉毒素B1含量中的应用。

5.一种基于光切割的荧光分析法检测黄曲霉毒素B1含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

在步骤(1)中，所述Aptamer的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，FAM基团标记于SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的3’端；所述PC-strand的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，TAMRA基团标记于SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的5’端，PC基团标记于SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的10bp和11bp处碱基之间；

所述PC基团的结构式如下：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，在所述Aptamer溶液、所述PC-strand溶液和所述Tris缓冲溶液的混合溶液中，所述Aptamer的浓度为0.15μmol/L；所述PC-strand的浓度为0.24μmol/L。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述混合反应的温度为4℃。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述紫外光照射的辐照强度为5mW/cm²。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述紫外光照射的辐照时间为8min。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(2)和步骤(3)中，所述反应的温度均为37℃。