CN103472237B - 一种生物敏感芯片及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物领域，具体涉及一种生物敏感芯片及其制备方法和用途。本发明所要解决的问题是提供一种生物敏感芯片，包括银纳米芯片、固定在银纳米芯片上的11-巯基十一烷酸以及与11-巯基十一烷酸连接的抗体。本发明还提供了上述生物敏感芯片的制备方法，包括以下步骤：在银纳米芯片上固定11-巯基十一烷酸，活化11-巯基十一烷酸后与抗体连接。本发明还提供了上述生物敏感芯片的用途，利用此生物敏感芯片上的抗体通过抗体抗原特异性反应来检测目标抗原蛋白。

Description

一种生物敏感芯片及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种生物敏感芯片及其制备方法和用途。

背景技术

成功制备生物敏感芯片是实现生物传感器特异检测目标物质的关键步骤。由于生物反应中抗体对目标抗原有着极高的特异选择性，抗体分子常被固定在各种各样的传感载体表面用于免疫检测（Phillips TM,Queen WD,More NS,Thompson AM.Protein A coated glass beadsuniversal support medium for high-performance immunoaffinity chromatography.JournalofChromatography,1985,327:213-219）。物理吸附是一种可将抗体分子固定在载体表面的传统技术，但由于抗体分子对溶液pH变化、温度、离子强度和基底材料较为敏感，易从载体表面脱落，使用寿命较短。并有研究发现直接吸附固定在载体表面上的抗体分子的生物活性通常有所降低，可能是由于直接固定在载体表面上的抗体分子的空间构象改变，空间位阻增大，不利于抗体抗原自由结合的缘故（Anderson GP,Jacoby MA,Ligler FS,King KD.Effectiveness of protein A for antibody immobilization for a fiber optic biosensor.Biosensors&Bioelectronics,1997,12(4):329-336），另一个原因可能是抗体分子的功能域在固体表面上趋向的随意性，由于物理吸附的随意性，一些抗体分子的功能域被掩盖，失去同抗原分子结合的能力。而共价键合法则可使抗体活性分子通过共价键与不溶性载体结合而固定，此种方法的特点是结合牢固，抗体分子不易脱落，使用寿命长；同时可实现抗体分子定向固定，有效改善抗体与抗原间的结合，从而克服物理吸附方法的缺点。针对不同分析物，常用的共价结合方法也有所不同，目前常见的有自组装、链霉素-亲和素等固定技术。如Dutra等（DutraR F,Kubota L T.Clin.Chim.Acta,2007,376(1～2):114～120）采用链亲和素自组装膜的方法在纳米芯片表面偶联修饰标记有亲和素的抗肌钙蛋白T的抗体，随后利用修饰后的芯片连续检测样本溶液中该蛋白，其检出限可达到0.01μg/L。心肌肌钙蛋白T(TnT)是心肌损伤的高特异性和高灵敏度的标志物，利用链霉素-亲和素共价固定技术可快速高灵敏检测人体中的该蛋白，在临床诊断领域中具有可观的应用前景。但此种检测方法需要对目标蛋白进行标记才能实现特异检测，在临床检测前先要进行目标蛋白标记，增加了检测费用和步骤，因此发展快速高特异且免标记的生物敏感芯片技术势在必行。

发明内容

本发明解决的第一个技术问题是提供一种生物敏感芯片。本发明的生物敏感芯片包括：银纳米芯片、固定在银纳米芯片上的11-巯基十一烷酸以及与11-巯基十一烷酸连接的抗体。

其中，上述生物敏感芯片中，所述的与11-巯基十一烷酸连接的抗体为：抗白蛋白单克隆抗体、抗SCCA单克隆抗体或抗HE4单克隆抗体。

本发明解决的第二个技术问题是提供一种上述生物敏感芯片的制备方法。该方法包括以下步骤：

a、在15～25℃下将银纳米芯片浸泡于0.1～5mM11-巯基十一烷酸无水乙醇溶液中6～24h，分别用无水乙醇、超纯水清洗，氮气吹干；

b、在15～25℃下将步骤a所得的芯片浸泡在7.5～150mM EDC.HCl和1.5～30mM NHS等体积混合水溶液中活化表面羧基1～10小时，用超纯水清洗，氮气吹干；

c、在步骤b所得的芯片表面滴加浓度为1μg/ml～30μg/ml、体积为1μl～30μl的单克隆抗体，在1～10℃冰箱中冷藏6～14h，PBS清洗，氮气吹干。

优选的，上述生物敏感芯片制备方法，步骤a中，温度为20℃，11-巯基十一烷酸的浓度为1mM，浸泡时间为12h。

优选的，上述生物敏感芯片制备方法，步骤b中，温度为20℃，EDC.HCl的浓度为75mM，NHS的浓度为15mM，表面活化羧基2h。

优选的，上述生物敏感芯片制备方法，步骤c中，冷藏温度为4℃，冷藏时间为10h。

优选的，上述生物敏感芯片制备方法，步骤c中，采用pH=7.4、0.01M的PBS（磷酸盐缓冲溶液）抗体稀释液来稀释单克隆抗体和清洗芯片；滴加抗SCCA单克隆抗体浓度为5μg/ml、抗白蛋白单克隆抗体浓度为10μg/ml或抗HE4单克隆抗体浓度为10μg/ml，体积均为10μl。

具体的，上述生物敏感芯片制备方法，在制备的过程中，分别对银纳米芯片以及a、b和c每步步骤所制备出的芯片进行紫外最大吸收波长检测。

本发明解决的第三个技术问题是提供一种上述生物敏感芯片的用途。该用途为：可以用来对抗原标准品进行检测，检测方法包括以下步骤：在上述所得生物敏感芯片表面滴加目标蛋白，33～39℃水浴20～120min，超纯水清洗，氮气吹干，检测紫外最大吸收波长。

优选的，上述生物敏感芯片的用途中，水浴温度为37℃，水浴时间为60min。

本发明通过上述各个步骤所获得的紫外最大吸收波长，进行比较，根据紫外最大吸收波长的变化程度，得出是否能够检测抗原标准品。

本发明所述的氮气吹干，意为在有氮气的条件下将所制备的芯片处理干，而本发明此步骤的实现不仅仅只限于将芯片用氮气吹干。

本发明采用氨基偶联共价键合法使生物活性分子通过共价键与不溶性纳米载体结合固定，具有以下优点：a、共价固定生物分子（特异的单克隆抗体），使纳米芯片可用来检测不同的特异生物蛋白；b、可通过增加表面固定生物分子的结合力而提高纳米敏感芯片的灵敏度；c、同时使纳米芯片表面的非特异性结合强度降低；d、此方法抗体生物分子结合牢固，不易脱落，可使生物敏感芯片实用寿命长，可克服普通吸附法抗体分子易从载体表面脱落，使用寿命较短的缺点；同时可克服直接吸附法会影响降低抗体分子的生物活性的缺点。

本发明利用氨基偶联共价键合法制备的生物敏感芯片与目前生物蛋白常用检测方法如放射免疫分析法、酶联免疫分析法（传统生化分析方法）等相比，它可将传感芯片的灵敏性和生物反应的特异性结合在一起，其优点有：可原位快速检测医学生物蛋白分子在人体组织液（血液、尿液、脑脊液等）的含量，准备好的生物敏感芯片检测目标蛋白时间可控制在1小时内；整个检测过程无需任何标记；检测灵敏度高，可达pg级；特异性好，分辨率高，非特异结合性小；成本相对较低；仪器微小化，便携性好，因而拥有广阔的应用前景。并可用于生物实验室研究许多生物化学成份相互间的作用，也可用于连续监测吸附和解吸及分子的缔合和解离过程。

本发明制备的生物敏感芯片基于贵金属纳米粒子对周围介质环境变化敏感的基本原理，可将生物分子吸附引发的金属纳米颗粒外界介质折射率的改变转化为可测量的峰值吸收波长的有规律的移动以实现对传感器表面样品的检测。它是一种灵敏、特异、简单、快速且可有望精确定量和实时检测的替代新方法，在临床实验诊断中具有重要的实用价值。它是纳米技术与生物技术交叉渗透形成的新技术，是纳米技术的重要组成部分，也是将来生物医学领域中的一个重要发展方向。纳米材料的介入为免疫分析的发展提供了无穷的想象空间，由于其量子尺寸效应和表面效应，可把免疫分析方法的性能提高到新的水平，使其不仅检测的速度快、精度高、可靠性好，还可实现多功能化和选择检测。采用局域表面等离子体共振效应传感技术，将其用于人体内肿瘤标志物（CA125、CEA、AFP、SCCAg）的联合检测，可实现将生物传感与化学生物学、电磁物理学、临床医学相结合，研制新一代免疫传感器，方法较传统的ELISA和放射性免疫分析（RIA）简单、快速，可望作为一种临床诊断分析的工具。

附图说明

图1：银纳米芯片；

图2：银纳米芯片表面自组装11-巯基十一烷酸单分子层；

图3：孵育EDC.HCl和NHS，活化表面羧基；

图4：固定单克隆抗体，成功制备生物敏感芯片；

图5：不同浓度的抗原标准品与生物敏感芯片进行免疫反应；

图6：银纳米芯片俯视图。

具体实施方式

一种生物敏感芯片，包括：银纳米芯片、固定在银纳米芯片上的11-巯基十一烷酸以及与11-巯基十一烷酸连接的抗体。

上述生物敏感芯片的制备方法及对抗原的检测方法，通过以下步骤实现：

a、首先检测银纳米芯片的紫外最大吸收波长；

b、在15～25℃下将银纳米芯片浸泡于0.1～5mM11-巯基十一烷酸无水乙醇溶液中6～24小时，分别用无水乙醇、超纯水清洗，氮气吹干后检测紫外最大吸收波长；

c、在15～25℃下将步骤b所得的芯片浸泡在7.5～150mM EDC.HCl和1.5～30m MNHS等体积混合水溶液中活化表面羧基1～10小时，用超纯水清洗，氮气吹干后检测紫外最大吸收波长；

d、在步骤c所得的芯片表面滴加浓度为1μg/ml～30μg/ml、体积为1μl～30μl的单克隆抗体，在1～10℃冰箱中冷藏6～14h，pH=7.4，浓度为0.01M的PBS清洗，氮气吹干检测紫外最大吸收波长；

e、在上述步骤d所得的生物敏感芯片表面滴加目标蛋白，33～39℃水浴20～120min，超纯水清洗，氮气吹干检测紫外最大吸收波长。

本发明通过上述各个步骤所获得的紫外最大吸收波长，进行比较，根据紫外最大吸收波长的变化程度，得出是否能够检测抗原标准品。

由于局域表面等离子体共振效应（Localized Surface Plasmon Resonance，LSPR）是当单个金属纳米粒子或不连续的金属纳米结构被入射光照射时，入射光子频率与金属表面自由电子的集体振荡频率匹配发生共振产生的一种特殊光学现象。基于贵金属纳米的LSPR生物传感器的性能主要由其折射率灵敏度(RIS)和消光光谱的半高全宽(FWHM)决定。其中RIS值代表周围环境单个折射率的变化对应的光谱峰值位置的移动量，单位为nm/RIU。为了纳米传感器的传感性能，总是尽可能希望拥有更高的折射率灵敏度及更窄的谱线宽度。

光在金属纳米结构中的行为可用麦克斯韦方程配合适当边界条件进行较精确描述。米氏(Mie)理论与甘氏(Gans)理论能精确描述单个球形和椭球形金属纳米颗粒的消光特性，但对实际制造的金属纳米粒子而言，其消光特性还与颗粒间的电场耦合等因素有关。考虑到时域有限差分法(FDTD)为最简单、直观、精确的电磁学计算方法，采用其来计算与实际制造相贴近的金属纳米粒子的消光特性，推知某种金属纳米结构折射率灵敏的大小仅仅取决于其峰值波长。并推知金属纳米结构的形状参数L是影响其光学特性的主要因素，但对于复杂形状，目前还无法求得精确的解析解。考虑到圆盘、正方柱体以及三角柱体结构简单，且为理论分析及实验中应用最多的三种金属纳米结构。因此我们对不同宽高比下的上述三种形状纳米结构的消光特性进行分析，结果发现相同宽高比下，三角柱形纳米粒子峰值波长最大，提示其折射灵敏度相对较高，且三种形状的金属纳米结构形状参数L与宽高比的关系拟合曲线也证实了上述发现。

本发明所采用的银纳米芯片的制作方法如下：

（1）基板预处理是实现纳米球自组装的重要步骤。首先选取尺寸25mm×2mm的精抛光硅酸盐玻璃片作基板，在玻璃片表面用真空镀层机沉积一层5nm铬层，把制作好的基板放入浓硫酸和双氧水配成的洗液（H₂SO₄︰30%H₂O₂=3︰1）中加热至80℃浸泡60分钟，去除杂质。然后用超纯水反复冲洗，再放入氨水、双氧水及水配成的溶液（NH₃︰H₂O₂︰H₂O=1︰1︰5）中超声波处理60分钟，取出后用超纯水反复冲洗，放入二次蒸馏水中备用。

（2）纳米球自组装定位模板处理好后，立即进行纳米球自组装。根据模拟结果，选取直径300-500nm之间，浓度为1%至3%的单分散聚苯乙烯纳米球水溶胶进行自组装，采用胶态晶体法在处理好的基板上制作出特殊的规则结构，并对聚苯乙烯纳米球自组装层进行刻蚀。然后利用刻蚀后的聚苯乙烯纳米球排列结构作模板，通过真空镀层机在其表面沉积一层几十纳米厚的金属层，在球与球间隙处填充金属，通过相关工艺，去除聚苯乙烯纳米球自组装层，仅留下球与球间隙处的金属，得到阵列化的金属纳米阵列结构。

本发明虽采用精抛光硅酸盐玻璃片作基板来制备银纳米芯片，但是都是采用基板对紫外可见光不吸收、不反射，对所测的物质不产生干扰的原理，那么，本发明也可以采用别的对紫外可见光不吸收、不反射的其他材质，比如石英等。

贵金属（如银，金，铜）纳米粒子具有很强的局域表面等离子体共振效应，在紫外-可见光波段展现出很强的光谱吸收，且吸收光谱峰值对纳米粒子周围电介质环境变化非常敏感。它可将分子反应吸附引发的局域表面折射率微小变化转换成可测量波长移动响应，而实现对其表面吸附分子的有效检测。

本发明采用此银纳米芯片，但是由于贵金属都有局域表面等离子体共振效应，那么，也不排除可以采用金、铜、铂等其它金属的可能。

由于11-巯基十一烷酸分子结构特殊，一个末端具有活性巯基，易于和银作用，另一端具有活性羧基，易于与氨基发生反应，所以本发明采用11-巯基十一烷酸氨基偶联来制备生物敏感层。11-巯基十一烷酸氨基偶联成层法是常用的共价键固定法，多用于酶层和免疫分子层的制作，可通过11-巯基十一烷酸分子末端的巯基与贵金属纳米粒子形成离子键，从而在纳米表面形成11-巯基十一烷酸的巯基自组装单分子层（self-assembled monolayer，SAM），并通过11-巯基十一烷酸分子另一末端的羧基与抗体分子末端的氨基形成酰胺键（在EDC.HCl等催化剂作用下），从而使抗体间接固定在金属纳米表面，具有简单、结合牢固、耐用等优点。

本发明在实验的过程中，主要是通过实验中对每一步反应时间、浓度范围进行固定其余变量，逐一变量进行梯度摸索，观察抗体固定后的Δλmax的红移值来确定，红移越明显，说明此条件变量值越优。

本发明通过采用反复(≥10次)测试抗体抗原稀释液后的LSPR消光光谱变化，得出Δλmax标准偏差作为该光谱仪器检测噪音值，取3倍噪音值作为最小有效响应信号，本发明发明人通过大量实验发现及验证，Δλmax≥5nm（消光峰红移大于3倍噪音值)即为有效，其准确率可达99%。

紫外-可见光光谱测试平台可对微纳金属复合结构纳米粒子阵列进行光谱分析，研究不同形状、不同结构参数的微纳金属复合结构纳米粒子阵列的局域表面等离子体共振（LSPR）特征峰值。此测试平台的硬件主要分为卤钨灯和光谱仪两大部分，卤钨灯输出光波长范围从220nm到1020nm，经过准直后变为平行光束，光谱仪对入射光分光处理后可获得结构的吸收、透射光谱。

本发明制备的生物敏感芯片基于贵金属纳米粒子对周围介质环境变化敏感的基本原理，可将生物分子吸附引发的金属纳米颗粒外界介质折射率的改变转化为可测量的LSPR峰值吸收波长的有规律的移动以实现对传感器表面样品的检测。它是一种灵敏、特异、简单、快速且可有望精确定量和实时检测的替代新方法，在临床实验诊断中具有重要的实用价值。它是纳米技术与生物技术交叉渗透形成的新技术，是纳米技术的重要组成部分，也是将来生物医学领域中的一个重要发展方向。纳米材料的介入为免疫分析的发展提供了无穷的想象空间，由于其量子尺寸效应和表面效应，可把免疫分析方法的性能提高到新的水平，使其不仅检测的速度快、精度高、可靠性好，还可实现多功能化和选择检测。采用LSPR传感技术，将其用于人体内肿瘤标志物（CA125、CEA、AFP、SCCAg）的联合检测，可实现将生物传感与化学生物学、电磁物理学、临床医学相结合，研制新一代免疫传感器，方法较传统的ELISA和放射性免疫分析（RIA）简单、快速，可望作为一种临床诊断分析的工具。

本发明中PBS为磷酸盐缓冲溶液，按常规方法配制；NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；EDC.HCl为1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐。

实施例所采用的紫外-可见光谱仪购自中国科学院光电技术研究所光学元件厂，构造如下：宏观紫外-可见消光谱的测量是利用带有探测器的Ocean Optics USB4000光纤光谱仪；光源为DH-2000UV-VIS-NIR光源，为非偏振光，所有的光谱测量都是在标准的几何传输路径进行的；探测光纤的通光孔径为0.6mm。

实施例所采用的玻璃基板为双面精抛光K9玻璃基底，规格尺寸：20mm×10mm×2mm，购自中国科学院光电技术研究所光学元件厂，再通过上述所给的方法，制备银纳米芯片。

实施例中所采用的抗白蛋白单克隆抗体，购自Novus公司，批号NB500-417；抗SCCA单克隆抗体，购自Santa Cruz公司，批号TA502325；抗HE4单克隆抗体，购自Abnova公司，批号H00010406-M01。

实施例1 抗白蛋白单克隆抗体生物敏感芯片制备及对白蛋白的检测

a、首先检测银纳米芯片的紫外最大吸收波长；

b、20℃下将银纳米芯片浸泡于1mM 11-巯基十一烷酸乙醇溶液12小时，分别用无水乙醇、超纯水清洗，氮气吹干后检测紫外最大吸收波长；

c、20℃下将银纳米芯片浸泡在75mM EDC.HCl、15mM NHS等体积混合水溶液中活化表面羧基2小时，用超纯水清洗，氮气吹干后检测紫外最大吸收波长；

d、银纳米芯片表面滴加10μg/ml抗白蛋白单克隆抗体溶液10μl，4℃冰箱过夜10小时，pH=7.4、浓度为0.01M的PBS清洗，氮气吹干检测紫外最大吸收波长；

e、银纳米芯片表面滴加1ng/ml白蛋白标准品溶液10μl，37℃水浴60min，超纯水清洗，氮气吹干检测紫外最大吸收波长。

表1 抗白蛋白单克隆抗体生物敏感芯片制备及检测结果

	裸片	MUA	EDC催化后	单克隆抗体	白蛋白
						λ(nm)	533.91	580.45	588.00	596.68	604.38
Δλmax(nm)	0	+46.54	+7.55	+8.68	+7.70

本发明在生物敏感芯片上成功固定抗白蛋白单克隆抗体，在抗白蛋白单克隆抗体为10μg/ml的固定浓度下，检测白蛋白标准品的有效浓度范围为1ng/ml～1μg/ml。

实施例2 抗SCCA单克隆抗体生物敏感芯片制备及对SCCA的检测

a、首先检测银纳米芯片的紫外最大吸收波长；

b、20℃下将银纳米芯片浸泡于1mM 11-巯基十一烷酸乙醇溶液12小时，分别用无水乙醇、超纯水清洗，氮气吹干后检测紫外最大吸收波长；

c、20℃下将银纳米芯片浸泡在75mM EDC.HCl、15mM NHS等体积混合水溶液中活化表面羧基2小时，用超纯水清洗，氮气吹干后检测紫外最大吸收波长；

d、银纳米芯片表面滴加5μg/ml抗SCCA单克隆抗体溶液10μl，4℃冰箱过夜10小时，pH=7.4、浓度为0.01M的PBS清洗，氮气吹干检测紫外最大吸收波长；

e、银纳米芯片表面滴加5ng/ml SCCA标准品溶液10μl，37℃水浴60min，超纯水清洗，氮气吹干检测紫外最大吸收波长。

表2 抗SCCA单克隆抗体生物敏感芯片制备及检测结果

裸片

MUA

EDC催化后

单克隆抗体

SCCA

λ(nm)	653.91	690.45	697.13	703.30	713.94
						Δλmax(nm)	0	+36.54	+6.68	+6.17	+10.64

本发明在生物敏感芯片上成功固定抗SCCA单克隆抗体，在抗SCCA单克隆抗体为5μg/ml的固定浓度下，检测SCCA标准品的有效浓度范围为5pmol～50nmol，可满足临床上检测微量肿瘤标志物的需要。

实施例3 抗HE4单克隆抗体生物敏感芯片制备及对HE4的检测

a、首先检测银纳米芯片的紫外最大吸收波长；

b、20℃下将银纳米芯片浸泡于1mM 11-巯基十一烷酸乙醇溶液12小时，分别用无水乙醇、超纯水清洗，氮气吹干后检测紫外最大吸收波长；

c、20℃下将银纳米芯片浸泡在75mM EDC.HCl、15mM NHS等体积混合水溶液中活化表面羧基2小时，用超纯水清洗，氮气吹干后检测紫外最大吸收波长；

d、银纳米芯片表面滴加10μg/ml抗HE4单克隆抗体溶液10μl，4℃冰箱过夜10小时，pH=7.4、浓度为0.01M的PBS清洗，氮气吹干检测紫外最大吸收波长；

e、银纳米芯片表面滴加500pmol HE4标准品溶液10μl，37℃水浴60min，超纯水清洗，氮气吹干检测紫外最大吸收波长。

表3 抗HE4单克隆抗体生物敏感芯片制备及检测结果

	裸片	MUA	EDC催化后	单克隆抗体	HE4
						λ(nm)	592.58	619.85	624.86	630.97	645.45
Δλmax(nm)	0	+27.27	+5.01	+6.11	+14.48

本发明在生物敏感芯片上成功固定抗HE4单克隆抗体，在抗HE4单克隆抗体为10μg/ml的固定浓度下，检测HE4标准品的有效浓度范围为10pmol～10nmol，可满足临床上检测微量肿瘤标志物的需要。

Claims (5)

1.一种生物敏感芯片的制备方法，所述生物敏感芯片包括有银纳米芯片、固定在银纳米芯片上的11-巯基十一烷酸以及与11-巯基十一烷酸连接的抗体，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

a、在20℃下将银纳米芯片浸泡于1mM 11-巯基十一烷酸无水乙醇溶液中12h，分别用无水乙醇、超纯水清洗，氮气吹干；

b、在20℃下将步骤a所得的芯片浸泡在75mM EDC.HCl和15mM NHS等体积混合水溶液中活化表面羧基2小时，用超纯水清洗，氮气吹干；

c、在步骤b所得的芯片表面滴加抗SCCA单克隆抗体浓度为5μg/ml、抗白蛋白单克隆抗体浓度为10μg/ml或抗HE4单克隆抗体浓度为10μg/ml，体积均为10μl，在4℃冰箱中冷藏10h，采用pH＝7.4、0.01MPBS清洗，氮气吹干。

2.根据权利要求1所述的生物敏感芯片制备方法，其特征在于：在制备的过程中，分别对银纳米芯片以及a、b和c每步步骤所制备出的芯片进行紫外最大吸收波长检测。

3.一种生物敏感芯片，包括有银纳米芯片、固定在银纳米芯片上的11-巯基十一烷酸以及与11-巯基十一烷酸连接的抗体，其特征在于：所述生物敏感芯片根据权利要求1或2所述的生物敏感芯片制备方法制备得到。

4.权利要求3所述的生物敏感芯片的用途，所述的与11-巯基十一烷酸连接的抗体为抗白蛋白单克隆抗体，其特征在于：可以用来对抗原标准品进行检测，检测方法包括以下步骤：在权利要求3所述的生物敏感芯片表面滴加目标蛋白，33～39℃水浴20～120min，超纯水清洗，氮气吹干，检测紫外最大吸收波长。

5.根据权利要求4所述的生物敏感芯片的用途，其特征在于：水浴温度为37℃，水浴时间为60min。