CN105954237A - 一种表面等离子共振仪芯片及其制备方法 - Google Patents

一种表面等离子共振仪芯片及其制备方法 Download PDF

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苏荣欣
黄仁亮
叶慧君
齐崴
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Abstract

本发明涉及一种表面等离子共振仪芯片及其制备方法；芯片是基于多巴胺接枝透明质酸和谷胱甘肽修饰的表面等离子共振仪芯片；包括玻璃片基底，上面镀有铬层和金膜层。首先通过酰胺化反应合成多巴胺接枝透明质酸，然后通过多巴胺氧化聚合时的粘附性将透明质酸连接到金膜表面，进一步通过迈克尔加成反应将谷胱甘肽修饰到透明质酸表面，从而获得一种基于多巴胺接枝透明质酸与谷胱甘肽修饰的表面等离子共振仪芯片。本发明的芯片在单一蛋白(牛血清蛋白、溶菌酶、β‑乳球蛋白)以及复杂体系牛奶中均具有比多巴胺接枝透明质酸修饰的芯片更好的抗污染性能。本发明的芯片具有优良的抗污染性能，且制备方法简便，原料易于合成，有很好的可行性和实用性。

Description

一种表面等离子共振仪芯片及其制备方法
技术领域
本发明属于表面等离子共振谱仪抗污染芯片的设计和制备方法；特别是一种基于多巴胺接枝透明质酸和谷胱甘肽修饰的表面等离子共振仪芯片及其制备方法，
背景技术
表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,简称SPR)仪是20世纪80年代出现的一种生物传感器技术，当入射光从高折射率介质入射到低折射率介质时，会发生全反射，此时若在介质交界面处镀一层金属薄膜(金或银)，入射光产生的渐逝波会引起金属表面自由电子发生集体振荡，进而形成等离子体，当渐逝波与表面等离子体振荡的频率和波数相等时，即产生共振现象(SPR)，导致能量从渐逝波转移到表面等离子波中，使反射光的强度大大减弱，呈现衰减全反射现象，当反射光的强度为零时的入射角称为共振角。共振角与金属薄膜界面介质折射率有关，而折射率又随结合在金属薄膜表面的分子质量而变化，故可通过分析共振角来获得分子间相互作用的信息，由于其具有检测快速且无需标记等特点，已被广泛应用于蛋白质组学、药物研发、临床诊断、食品安全和环境监测等领域，并且显示出广阔的应用前景。
SPR芯片是表面等离子共振仪最为核心的组件，提供产生SPR信号的必须物理条件，主要包括耦合器件、金属膜和表面基质。然而，应用表面等离子共振仪进行分析测试时，传感芯片的表面污染是一个普遍存在的问题，来自样品中的生物分子或微生物的非特异性吸附将降低定量检测的准确性，产生假阳性结果。因此，开发有效抵抗非特异性吸附的表面是提高表面等离子共振传感器灵敏度和精确度的首要问题。
发明内容
本发明目的在于提供一种基于多巴胺接枝透明质酸(HADA)和谷胱甘肽(GSH)修饰的表面等离子共振仪芯片及其制备方法。该芯片制备成本低，修饰方法简单且不依赖于表面的材料，相比单独的多巴胺接枝透明质酸具有更好的抗蛋白能力。
本发明是通过以下技术方案加以实现的：
一种表面等离子共振仪芯片；是基于多巴胺接枝透明质酸和谷胱甘肽修饰的表面等离子共振仪芯片。
本发明的表面等离子共振仪芯片；如图1所示，在玻璃片基底(1)上设置有涂层2-3nm厚的铬层(2)，在铬层上设置有45-50nm厚的金膜层(3)；在金膜(3)上修饰一层多巴胺接枝透明质酸层(4)，在多巴胺接枝透明质酸层(4)上修饰一层谷胱甘肽层(5)。
和可以在金膜层(3)和多巴胺接枝透明质酸层(4)之间设置一层5-10nm厚的二氧化硅层(6)。
本发明的表面等离子共振仪芯片的制备方法；步骤如下：
1)用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液配制浓度为5-15mg/mL的多巴胺接枝透明质酸溶液；将清洗干净的SPR芯片浸入上述多巴胺接枝透明质酸溶液中，常温下浸泡2-12h后取出，用乙醇和去离子清洗使芯片表面清洗洁净，并用氮气吹干备用；
2)用pH＝8.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液配制浓度为5-15mg/mL的谷胱甘肽溶液；将修饰有透明质酸的SPR芯片浸入上述谷胱甘肽溶液中，常温下浸泡12-24h后取出；用乙醇和去离子清洗使芯片表面清洗洁净，并用氮气吹干。
磷酸盐缓冲液包括10mM磷酸盐、138mM氯化钠和2.7mM氯化钾。
三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液包括50mM三羟甲基氨基甲烷。
三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液预先用高纯氮进行脱气处理。
本发明的有益效果
1)本发明研制的基于多巴胺接枝透明质酸修饰的SPR芯片(HADA-Au)具有较好的抗蛋白能力。在溶菌酶、牛血清蛋白、β-乳球蛋白中非特性吸附量分别为2.27ng/cm2、21.42ng/cm2、16.00ng/cm2，见附图3，远低于各蛋白在SPR裸金芯片表面的非特异性吸附量，见附表1。而在牛奶中的非特异性吸附量为175.75ng/cm2，相比牛奶中的蛋白在裸金表面上的非特异性吸附量提高了近一倍。
2)本发明研制的基于多巴胺接枝透明质酸与谷胱甘肽修饰的SPR芯片(HADA-G-Au)具有相比单纯多巴胺接枝透明质酸修饰的SPR芯片(HADA-Au)具有更好的抗蛋白能力。在溶菌酶、牛血清蛋白、β-乳球蛋白中非特异性吸附量分别为0.59ng/cm2、7.51ng/cm2、1.52ng/cm2，在牛奶中的非特异性吸附量为34.41ng/cm2，见附图3，相比于多巴胺接枝透明质酸修饰的SPR芯片(HADA-Au)抗蛋白能力提高一倍以上。
3)本发明研制的基于多巴胺接枝透明质酸与还原性谷胱甘肽修饰的SPR芯片(HADA-G-Au)具有生物功能化作用，如可通过固载牛血清蛋白抗体进而检测其抗原。
4)本发明研制的基于多巴胺接枝透明质酸与还原性谷胱甘肽修饰的SPR芯片(HADA-G-Au)具有高稳定性，干燥状态下储存3个月或pH为7.4磷酸盐缓冲液中储存7天后，抗污染性能无变化。
5)相比传统商业化的抗污染材料SPR芯片的制备方法，本发明研制的基于多巴胺接枝透明质酸与谷胱甘肽修饰的SPR芯片(HADA-G-Au)的制备方法更为简便，且成本低廉，生物相容性好。
附图说明
图1基于多巴胺接枝透明质酸与还原性谷胱甘肽修饰的SPR芯片(HADA-G-Au)；其中，1-玻璃片基底，2-铬层，3-金膜层，4-多巴胺接枝透明质酸层(HADA)，5-谷胱甘肽层(GSH)。
图2基于多巴胺接枝透明质酸与还原性谷胱甘肽修饰的SPR芯片(HADA-G-SiO2)；其中，1-玻璃片基底，2-铬层，3-金膜层，4-多巴胺接枝透明质酸层(HADA)，5-谷胱甘肽层(GSH)，6-二氧化硅层。
图3多巴胺接枝透明质酸修饰的SPR芯片(HADA-Au)及多巴胺接枝透明质酸与谷胱甘肽修饰的SPR芯片(HADA-G-Au)对1mg/mL的溶菌酶(Lysozyme)、牛血清蛋白(BSA)、β-乳球蛋白溶液以及牛奶中蛋白的非特异性吸附量。
表1SPR裸金芯片对1mg/mL的溶菌酶(Lysozyme)、牛血清蛋白(BSA)、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin)、牛奶中蛋白的非特异性吸附量。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明：
在玻璃片基底(1)上涂覆一层2-3nm厚的铬层(2)和45-50nm厚的金膜层(3)，即获得SPR裸金芯片。然后通过疏水相互作用在金膜(3)上修饰一层多巴胺接枝透明质酸层(HADA)(4)，再利用多巴胺基团氧化聚合时形成的醌基与还原型谷胱甘肽上的巯基之间的迈克尔加成反应，将谷胱甘肽修饰在多巴胺透明质酸层上，形成一层谷胱甘肽层(GSH)(5)。或在SPR裸金芯片的基础上先修饰一层其他材料的薄层，如附图2：在金膜层(3)上涂覆一层5-10nm厚的二氧化硅层(6)，然后利用多巴胺基团与基底间的氢键作用在二氧化硅层(6)上修饰一层多巴胺接枝透明质酸层(HADA)(4)，再通过迈克尔加成反应在多巴胺透明质酸层上修饰一层谷胱甘肽层(GSH)(5)，即获得SPR二氧化硅芯片。
基于多巴胺接枝透明质酸(HADA)和谷胱甘肽(GSH)修饰的表面等离子共振仪芯片制备方法，步骤如下：
a)多巴胺接枝透明质酸(HADA)的修饰
用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(包括10mM磷酸盐，138mM氯化钠和2.7mM氯化钾)配制浓度为5-15mg/mL的多巴胺接枝透明质酸(HADA)溶液；将清洗干净的SPR芯片浸入上述多巴胺接枝透明质酸(HADA)溶液中，常温下浸泡2-12h后取出，用乙醇和去离子清洗使芯片表面清洗洁净，并用氮气吹干备用；
b)透明质酸表面谷胱甘肽(GSH)的修饰
用pH＝8.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液(包括50mM三羟甲基氨基甲烷)配制浓度为5-15mg/mL的谷胱甘肽(GSH)溶液；将修饰有透明质酸的SPR芯片浸入上述谷胱甘肽(GSH)溶液中，常温下浸泡12-24h后取出；用乙醇和去离子清洗使芯片表面清洗洁净，并用氮气吹干即可。
实施例1
1)裸金芯片制备
如附图1所示，采用电子束蒸发镀膜技术在BK7玻璃基底(1)上涂覆一层2-3nm厚铬层(2)和一层45-50nm厚金膜(3)，获得了裸金芯片。
2)裸金芯片预处理
将步骤1)获得的裸金芯片置于紫外臭氧清洗仪中，紫外灯光照30min后取出，用乙醇、水依次清洗三次，氮气吹干备用。
3)多巴胺接枝透明质酸(HADA)的合成
用十二水合磷酸氢二钠和磷酸二氢钾配制pH＝7.4的10mM磷酸盐缓冲液。取1.2g透明质酸(HA)溶于120mL上述磷酸盐缓冲液中，用1.0M盐酸将溶液的pH调至5.5，然后向溶液中加入575.1mg(3mmol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，搅拌15min后加入568.92mg(3mmol)多巴胺，用1M盐酸将溶液的pH值维持在5.5且在室温下搅拌反应2小时。将反应后的溶液置于透析袋(MWCO:8000-14000)中，且在pH＝5.0的水溶液中透析2天，再在去离子水中透析12h。将透析后的溶液冻干得到粉末状的产物(HADA)，于-20℃下储存备用。
4)裸金芯片表面多巴胺接枝透明质酸修饰
将30mg多巴胺接枝透明质酸(HADA)溶于6mL的磷酸盐缓冲溶液中，至最终浓度为5mg/mL。然后将2)获得的芯片浸泡在上述溶液中，在水浴摇床中于37℃且100rpm的摇速下反应4h。反应后的芯片用无水乙醇、水依次清洗三次，氮气吹干。即获得基于多巴胺接枝透明质酸(如附图1中的4所示)修饰的SPR芯片(HADA-Au)。
5)透明质酸芯片表面谷胱甘肽修饰
用三羟甲基氨基甲烷和盐酸配制pH＝8.5的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。用预先脱气的上述三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液配制浓度为5mg/mL的谷胱甘肽溶液，将4)获得的透明质酸修饰的SPR芯片浸入上述溶液中，常温下浸泡12h后取出。用乙醇和去离子水依次清洗3次，并用氮气吹干备用，即获得如附图1中的透明质酸与谷胱甘肽(如附图1中的4,5所示)修饰的SPR芯片(HADA-G-Au)；
6)多巴胺接枝的透明质酸与谷胱甘肽修饰的SPR芯片(HADA-G-Au)表面蛋白吸附量检测
将步骤5)获得的多巴胺接枝透明质酸与谷胱甘肽修饰的SPR芯片(HADA-G-Au)用柏油贴合到SPR系统的棱镜上。以pH为7.4的磷酸缓冲液为流动相，流速为25μL/min。待基线平稳后，往定量环中注入250μL 1mg/mL的牛血清白蛋白，经流动相推动蛋白溶液到达芯片表面，由SPR系统测定共振角实时变化曲线，20min后读取SPR共振角变化值，并计算非特异性吸附量。
实施例2
具体操作方法如下：
1)裸金芯片制备
如附图1所示，采用电子束蒸发镀膜技术在BK7玻璃基底(1)上涂覆一层2-3nm厚铬层(2)和一层45-50nm厚金膜(3)，获得了裸金芯片。
2)裸金芯片预处理
将步骤1)获得的裸金芯片置于紫外臭氧清洗仪中，紫外灯光照30min后取出，用乙醇、水依次清洗三次，氮气吹干备用。
3)多巴胺接枝透明质酸(HADA)的合成
用十二水合磷酸氢二钠和磷酸二氢钾配制pH＝7.4的10mM磷酸盐缓冲液。取1.2g透明质酸(HA)溶于120mL上述磷酸盐缓冲液中，用1.0M盐酸将溶液的pH调至5.5，然后向溶液中加入575.1mg(3mmol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，搅拌15min后加入568.92mg(3mmol)多巴胺，用1M盐酸将溶液的pH值维持在5.5且在室温下搅拌反应2小时。将反应后的溶液置于透析袋(MWCO:8000-14000)中，且在pH＝5.0的水溶液中透析2天，再在去离子水中透析12h。将透析后的溶液冻干得到粉末状的产物(HADA)，于-20℃下储存备用。
4)裸金芯片表面多巴胺接枝透明质酸修饰
将30mg多巴胺接枝透明质酸(HADA)溶于3mL的磷酸盐缓冲溶液中，至最终浓度为10mg/mL。然后将2)获得的芯片浸泡在上述溶液中，在水浴摇床中于37℃且100rpm的摇速下反应2h。反应后的芯片用无水乙醇、水依次清洗三次，氮气吹干。即获得基于多巴胺接枝透明质酸(如附图1中的4所示)修饰的SPR芯片(HADA-Au)。
5)透明质酸芯片表面谷胱甘肽修饰
用三羟甲基氨基甲烷和盐酸配制pH＝8.5的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。用预先脱气的上述三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液配制浓度为10mg/mL的谷胱甘肽溶液，将4)获得的透明质酸修饰的SPR芯片浸入上述溶液中，常温下浸泡24h后取出。用乙醇和去离子水依次清洗3次，并用氮气吹干备用，即获得如附图1中的透明质酸与谷胱甘肽(如附图1中的4,5所示)修饰的SPR芯片(HADA-G-Au)；
6)多巴胺接枝的透明质酸与谷胱甘肽修饰的SPR芯片(HADA-G-Au)表面蛋白吸附量检测
将步骤5)获得的多巴胺接枝透明质酸与谷胱甘肽修饰的SPR芯片(HADA-G-Au)用柏油贴合到SPR系统的棱镜上。以pH为7.4的磷酸缓冲液为流动相，流速为25μL/min。待基线平稳后，往定量环中注入250μL 1mg/mL的牛血清白蛋白，经流动相推动蛋白溶液到达芯片表面，由SPR系统测定共振角实时变化曲线，20min后读取SPR共振角变化值，并计算非特异性吸附量为16.98ng/cm2。
实施例3
具体操作方法如下：
1)裸金芯片制备
如附图1所示，采用电子束蒸发镀膜技术在BK7玻璃基底(1)上涂覆一层2-3nm厚铬层(2)和一层45-50nm厚金膜(3)，获得了裸金芯片。
2)裸金芯片预处理
将步骤1)获得的裸金芯片置于紫外臭氧清洗仪中，紫外灯光照30min后取出，用乙醇、水依次清洗三次，氮气吹干备用。
3)多巴胺接枝透明质酸(HADA)的合成
用十二水合磷酸氢二钠和磷酸二氢钾配制pH＝7.4的10mM磷酸盐缓冲液。取1.2g透明质酸(HA)溶于120mL上述磷酸盐缓冲液中，用1.0M盐酸将溶液的pH调至5.5，然后向溶液中加入575.1mg(3mmol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，搅拌15min后加入568.92mg(3mmol)多巴胺，用1M盐酸将溶液的pH值维持在5.5且在室温下搅拌反应2小时。将反应后的溶液置于透析袋(MWCO:8000-14000)中，且在pH＝5.0的水溶液中透析2天，再在去离子水中透析12h。将透析后的溶液冻干得到粉末状的产物(HADA)，于-20℃下储存备用。
4)裸金芯片表面多巴胺接枝透明质酸修饰
将30mg多巴胺接枝透明质酸(HADA)溶于3mL的磷酸盐缓冲溶液中，至最终浓度为10mg/mL。然后将2)获得的芯片浸泡在上述溶液中，在水浴摇床中于37℃且100rpm的摇速下反应4h。反应后的芯片用无水乙醇、水依次清洗三次，氮气吹干。即获得基于多巴胺接枝透明质酸(如附图1中的4所示)修饰的SPR芯片(HADA-Au)。
5)透明质酸芯片表面谷胱甘肽修饰
用三羟甲基氨基甲烷和盐酸配制pH＝8.5的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。用预先脱气的上述三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液配制浓度为10mg/mL的谷胱甘肽溶液，将4)获得的透明质酸修饰的SPR芯片浸入上述溶液中，常温下浸泡24h后取出。用乙醇和去离子水依次清洗3次，并用氮气吹干备用，即获得如附图1中的透明质酸与谷胱甘肽层(如附图1中的4,5所示)修饰的SPR芯片(HADA-G-Au)；
6)多巴胺接枝透明质酸修饰的SPR芯片(HADA-Au)表面蛋白吸附量检测
将步骤4)获得的多巴胺接枝透明质酸修饰的SPR芯片(HADA-Au)用柏油贴合到SPR系统的棱镜上。以pH为7.4的磷酸缓冲液为流动相，流速为25μL/min。待基线平稳后，往定量环中注入250μL 1mg/mL的溶菌酶或牛血清白蛋白或β-乳球蛋白或牛奶(30mg/mL)，经流动相推动蛋白溶液到达芯片表面，由SPR系统测定共振角实时变化曲线，20min后读取SPR共振角变化值，并计算非特异性吸附量。如附图3所示，在溶菌酶或牛血清白蛋白或β-乳球蛋白中非特异性吸附量分别为2.27ng/cm2、21.42ng/cm2、16.00ng/cm2，远低于各蛋白在SPR裸金芯片表面的非特异性吸附量，见附表1。而对于来自牛奶中的蛋白，表面的非特异性吸附量为175.75ng/cm2，相比裸金表面上牛奶的非特异性吸附量提高了近一倍。
表1蛋白在SPR裸金芯片表面的非特异性吸附量
7)多巴胺接枝透明质酸与谷胱甘肽修饰的SPR芯片(HADA-G-Au)表面蛋白吸附量检测
将步骤5)获得的多巴胺接枝透明质酸与谷胱甘肽修饰的SPR芯片(HADA-G-Au)用柏油贴合到SPR系统的棱镜上。以pH为7.4的磷酸缓冲液为流动相，流速为25μL/min。待基线平稳后，往定量环中注入250μL 1mg/mL的溶菌酶或牛血清白蛋白或β-乳球蛋白或牛奶(30mg/mL)中，经流动相推动蛋白溶液到达芯片表面，由SPR系统测定共振角实时变化曲线，20min后读取SPR共振角变化值，并计算非特异性吸附量。如附图3所示，表面蛋白的非特异性吸附量分别为0.59ng/cm2、7.51ng/cm2、1.52ng/cm2，34.41ng/cm2。相比于多巴胺接枝透明质酸修饰的SPR芯片(HADA-Au)抗蛋白能力提高一倍以上。
实施例4
具体操作方法如下：
1)裸金芯片制备
如附图1所示，采用电子束蒸发镀膜技术在BK7玻璃基底(1)上涂覆一层2-3nm厚铬层(2)和一层45-50nm厚金膜(3)，获得了裸金芯片。
2)裸金芯片预处理
将步骤1)获得的裸金芯片置于紫外臭氧清洗仪中，紫外灯光照30min后取出，用乙醇、水依次清洗三次，氮气吹干备用。
3)多巴胺接枝透明质酸的合成
用十二水合磷酸氢二钠和磷酸二氢钾配制pH＝7.4的10mM磷酸盐缓冲液。取1.2g透明质酸(HA)溶于120mL上述磷酸盐缓冲液中，用1.0M盐酸将溶液的pH调至5.5，然后向溶液中加入575.1mg(3mmol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，搅拌15min后加入568.92mg(3mmol)多巴胺，用1M盐酸将溶液的pH值维持在5.5且在室温下搅拌反应2小时。将反应后的溶液置于透析袋(MWCO:8000-14000)中，且在pH＝5.0的水溶液中透析2天，再在去离子水中透析12h。将透析后的溶液冻干得到粉末状的产物(HADA)，于-20℃下储存备用。
4)裸金芯片表面多巴胺接枝透明质酸修饰
将30mg多巴胺接枝透明质酸(HADA)溶于3mL的磷酸盐缓冲溶液中，至最终浓度为10mg/mL。然后将2)获得的芯片浸泡在上述溶液中，在水浴摇床中于37℃且100rpm的摇速下反应12h。反应后的芯片用无水乙醇、水依次清洗三次，氮气吹干。即获得基于多巴胺接枝透明质酸(如附图1中的4所示)修饰的SPR芯片(HADA-Au)。
5)透明质酸芯片表面谷胱甘肽修饰
用三羟甲基氨基甲烷和盐酸配制pH＝8.5的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。用预先脱气的上述三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液配制浓度为10mg/mL的谷胱甘肽溶液，将4)获得的透明质酸修饰的SPR芯片浸入上述溶液中，常温下浸泡24h后取出。用乙醇和去离子水依次清洗3次，并用氮气吹干备用，即获得如附图1中的透明质酸与谷胱甘肽层(如附图1中的4，5所示)修饰的SPR芯片(HADA-G-Au)；
6)多巴胺接枝透明质酸与谷胱甘肽修饰的SPR芯片(HADA-G-Au)表面蛋白吸附量检测将步骤5)获得的多巴胺接枝透明质酸与谷胱甘肽修饰的SPR芯片(HADA-G-Au)用柏油贴合到SPR系统的棱镜上。以pH为7.4的磷酸缓冲液为流动相，流速为25μL/min。待基线平稳后，往定量环中注入250μL 1mg/mL的牛血清白蛋白，经流动相推动蛋白溶液到达芯片表面，由SPR系统测定共振角实时变化曲线，20min后读取SPR共振角变化值，并计算非特异性吸附量为15.92ng/cm2。
实施例5
具体操作方法如下：
1)二氧化硅芯片的制备
如附图2所示，采用电子束蒸发镀膜技术在BK7玻璃基底(1)上涂覆一层2-3nm厚铬层(2)和一层45-50nm厚金膜(3)，然后在金膜上涂覆一层5-10nm厚的二氧化硅层(6)，获得了表面为二氧化硅的芯片。
2)二氧化硅芯片预处理
将步骤1)获得的二氧化硅芯片置于紫外臭氧清洗仪中，紫外灯光照30min后取出，用乙醇、水依次清洗三次，氮气吹干备用。
3)多巴胺接枝透明质酸的合成
用十二水合磷酸氢二钠和磷酸二氢钾配制pH＝7.4的10mM磷酸盐缓冲液。取1.2g透明质酸(HA)溶于120mL上述磷酸盐缓冲液中，用1.0M盐酸将溶液的pH调至5.5，然后向溶液中加入575.1mg(3mmol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，搅拌15min后加入568.92mg(3mmol)多巴胺，用1M盐酸将溶液的pH值维持在5.5且在室温下搅拌反应2小时。将反应后的溶液置于透析袋(MWCO:8000-14000)中，且在pH＝5.0的水溶液中透析2天，再在去离子水中透析12h。将透析后的溶液冻干得到粉末状的产物(HADA)，于-20℃下储存备用。
4)二氧化硅芯片表面多巴胺接枝透明质酸修饰
将45mg多巴胺接枝透明质酸(HADA)溶于3mL的磷酸盐缓冲溶液中，至最终浓度为15mg/mL。然后将2)获得的芯片浸泡在上述溶液中，在水浴摇床中于37℃且100rpm的摇速下反应12h。反应后的芯片用无水乙醇、水依次清洗三次，氮气吹干。即获得基于多巴胺接枝透明质酸(如附图2中的4所示)修饰的SPR芯片(HADA–SiO2)。
5)透明质酸芯片表面谷胱甘肽修饰
用三羟甲基氨基甲烷和盐酸配制pH＝8.5的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。用预先脱气的上述三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液配制浓度为15mg/mL的谷胱甘肽溶液，将4)获得的透明质酸修饰的SPR芯片浸入上述溶液中，常温下浸泡12h后取出。用乙醇和去离子水依次清洗3次，并用氮气吹干备用，即获得如附图2中的透明质酸与谷胱甘肽层(如附图2中的4，5所示)修饰的SPR芯片(HADA-G-SiO2)；
6)多巴胺接枝透明质酸与谷胱甘肽修饰的SPR芯片(HADA-G-Au)表面蛋白吸附量检测
将步骤5)获得的多巴胺接枝透明质酸与谷胱甘肽修饰的SPR芯片(HADA-G-Au)用柏油贴合到SPR系统的棱镜上。以pH为7.4的磷酸缓冲液为流动相，流速为25μL/min。待基线平稳后，往定量环中注入250μL 1mg/mL的牛血清白蛋白，经流动相推动蛋白溶液到达芯片表面，由SPR系统测定共振角实时变化曲线并计算蛋白吸附量。
本发明公开和提出的一种表面等离子共振仪芯片及其制备方法，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

Claims (7)

1.一种表面等离子共振仪芯片；其特征是基于多巴胺接枝透明质酸和谷胱甘肽修饰的表面等离子共振仪芯片。
2.如权利要求1所述的芯片；其特征是在玻璃片基底(1)上设置有涂层2-3nm厚的铬层(2)，在铬层上设置有45-50nm厚的金膜层(3)；在金膜(3)上修饰一层多巴胺接枝透明质酸层(4)，在多巴胺接枝透明质酸层(4)上修饰一层谷胱甘肽层(5)。
3.如权利要求2所述的芯片，其特征在金膜层(3)和多巴胺接枝透明质酸层(4)之间设置一层5-10nm厚的二氧化硅层(6)。
4.权利要求1的表面等离子共振仪芯片的制备方法；其特征是：
1)用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液配制浓度为5-15mg/mL的多巴胺接枝透明质酸溶液；将清洗干净的SPR芯片浸入上述多巴胺接枝透明质酸溶液中，常温下浸泡2-12h后取出，用乙醇和去离子清洗使芯片表面清洗洁净，并用氮气吹干备用；
2)用pH＝8.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液配制浓度为5-15mg/mL的谷胱甘肽溶液；将修饰有透明质酸的SPR芯片浸入上述谷胱甘肽溶液中，常温下浸泡12-24h后取出；用乙醇和去离子清洗使芯片表面清洗洁净，并用氮气吹干。
5.如权利要求4所述的方法，其特征是磷酸盐缓冲液包括10mM磷酸盐、138mM氯化钠和2.7mM氯化钾。
6.如权利要求4所述的方法，其特征是三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液为50mM三羟甲基氨基甲烷。
7.如权利要求4所述的方法，其特征是三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液进行预先脱气处理。
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