CN108693144A - 基于sprm技术进行复用性单细胞蛋白质组学监测方法 - Google Patents

Abstract

一种基于SPRM技术进行复用性单细胞蛋白质组学监测方法，在第一定点捕捉芯片中的捕捉位点周围，以放射状点阵形式修饰不同蛋白质的特异性识别抗体；向微管路注入待检测细胞溶液，使其在单细胞捕捉位点处产生不同的SPR响应信号；筛选出3‑6种SPR响应信号强的待测细胞的分泌蛋白标志物；在第二定点捕捉芯片中的单细胞捕捉位点周围，以扇形结构修饰不同抗体，向微管路注入待检测细胞溶液；在第二定点捕捉芯片中的扇形结构的两侧分别修饰条码形不同蛋白质的特异性识别抗体；向微管路注入细胞裂解液，对比不同条码处的SPR响应信号的强弱，实现高灵敏度监测。本发明能够实现多种分泌蛋白质的原位、动态监测，提高蛋白质分子的吸附固定量及其检测灵敏度。

Description

基于SPRM技术进行复用性单细胞蛋白质组学监测方法

技术领域

本发明涉及一种单细胞蛋白质组学监测方法。特别是涉及一种基于SPRM技术进行复用性单细胞蛋白质组学监测方法。

背景技术

蛋白质组不仅能为生命活动规律提供物质基础，其研究也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。通过对正常个体及病理个体间的蛋白质组比较分析，可以找到某些“疾病特异性的蛋白质分子”，它们可成为新药物设计的分子靶点，也可以为疾病的早期诊断提供分子标志。细胞异质性是基础医学和疾病研究中广受关注的特性。通过单细胞测量有助于深入了解该特性，并建立细胞功能/表型及细胞外微环境差异与细胞内状态变化之间的关系，为此单细胞蛋白质组学检测具有重要意义。

大多数单细胞蛋白质的检测(未改性的内源性目标)是免疫测定，包括酶联免疫吸附测定(直接法或者三明治法)、免疫细胞化学方法以及采用空间条码或者质谱流式细胞技术实现多种蛋白质复合检测的新免疫测定形式。其中流式细胞仪和酶联免疫斑点检测技术等传统方法是单细胞分析的金标准。另一种细胞蛋白质组学检测方法是质谱测定法，它能够检测大多数蛋白质的同源异构体。

然而流式细胞仪和酶联免疫斑点检测技术等传统方法通常包括复杂的功能化、固定化、孵育和洗脱步骤，需要较长的检测时间。所以，他们仅限于静态测量，不能满足在单细胞分析中增加动态信息的需求。质谱测定法的测量灵敏度无法满足单细胞关键信号蛋白的检测需求。目前细胞蛋白质分析主要集中在表面蛋白质和分泌蛋白质，并且现有测量方法大多只能实现表面蛋白质/细胞内蛋白质/分泌蛋白质中一类蛋白质的检测，缺少复用性能够实现多种靶蛋白(包括细胞内信号转导通路)检测的技术。另外，因为受到检测灵敏度的限制和定量检测前复杂的细胞/蛋白质捕捉、释放、转移流程的影响，现有测量方法大多不适合单细胞检测。

表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)现象对金属表面一定穿透深度内的电解质折射率的变化具有非常高的灵敏度。SPR传感器按照测量原理可以分为两大类：SPR光谱技术和SPR成像技术(SPR imaging,SPRi)。与SPR光谱技术相比，SPRi技术更适合对活细胞进行测试分析，因为该技术通过获得生物芯片表面的图像，既可以测量细胞的SPR信号，还可以监测细胞的位置或者形态。采用SPRi技术实时监测细胞内、外活动的过程中能够保持细胞的完整性。

测量局部折射率分布情况的SPRi技术特别适合于单细胞监测。通过在SPRi传感器的金膜表面修饰抗体阵列，能够进行蛋白质浓度、蛋白质之间相互作用等监测。但是，通过现有的点样仪、电聚合系统等只能在SPRi传感器的金膜表面修饰直径在百微米量级的抗体位点，所以目前SPRi技术只能用于蛋白质溶液或者细胞群的分泌蛋白质/细胞内蛋白质的检测，无法实现单细胞的复用性多蛋白监测。SPRi技术采用显微镜物镜(一般称为SPRmicroscopy,SPRM)或者棱镜对光和表面等离子共振波进行耦合。SPRM技术采用高数值孔径的物镜能够使空间分辨率达到入射光的光学散射极限。SPRM技术与基于棱镜的SPRi技术相比的优势是空间分辨率高、可以获得无失真图像。同时，由于SPRM技术视场范围比较小(100×100μm²)，十分适合单细胞的观测分析。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种能够进行蛋白质的高灵敏度检测的基于SPRM技术进行复用性单细胞蛋白质组学监测方法。

本发明所采用的技术方案是：一种基于SPRM技术进行复用性单细胞蛋白质组学监测方法，是在特异性单细胞定点捕捉芯片实现，包括如下步骤：

1)在第一特异性单细胞定点捕捉芯片中的单细胞捕捉位点周围，采用喷墨打印技术以放射状点阵形式修饰不同蛋白质的特异性识别抗体；

2)打开控制阀，向微管路注入待检测细胞溶液，使待检测细胞在单细胞捕捉位点处分泌蛋白质分别与所述的不同蛋白质的特异性识别抗体结合，产生不同的SPR响应信号；

3)分别对比不同点阵位置处的SPR响应信号的强弱，筛选出3-6种SPR响应信号强的待测细胞的分泌蛋白标志物；

4)根据筛选出的3-6种待测细胞的分泌蛋白标志物，在第二特异性单细胞定点捕捉芯片中的单细胞捕捉位点周围，采用喷墨打印技术以扇形结构修饰不同抗体，增大单种蛋白质的特异性识别抗体结合面积，打开控制阀，向微管路注入待检测细胞溶液，用于实现多种分泌蛋白质的原位、动态监测；

5)采用喷墨打印技术在第二特异性单细胞定点捕捉芯片中的扇形结构的两侧分别修饰条码形不同蛋白质的特异性识别抗体；

6)打开控制阀，采用缓冲液冲洗待测细胞所在微管路的特定通道，然后向微管路注入细胞裂解液，调整微管路内的局限化往返液流，将细胞裂解后的蛋白质均匀分布并吸附固定在条码形不同蛋白质的特异性识别抗体的表面，对比不同条码处的SPR响应信号的强弱，实现细胞内部多种蛋白质的高灵敏度监测。

步骤1)、步骤4)和步骤5)在采用喷墨打印技术修饰不同抗体时，为参考测量保留无抗体修饰位点。

步骤5)所述的条码形是指C形或条形或S形。

在第一特异性单细胞定点捕捉芯片和第二特异性单细胞定点捕捉芯片的微管路上在修饰抗体之前，先修饰二维纳米复合结构，用于利用二维纳米复合结构对蛋白质分子的吸附增强效应及所激发的局域表面等离子共振效应，提高蛋白质分子的吸附固定量及监测灵敏度。

本发明的基于SPRM技术进行复用性单细胞蛋白质组学监测方法，具有如下优点：

1、在蛋白质特异性识别抗体点阵中设置无抗体位点，用于SPRM的参比测量，以消除分泌蛋白质监测过程中液体环境变化、温度变化、光源波动和背景光的影响。

2、在扇形抗体条码之间设定间隔区域，消除由相邻扇区扩散过来的蛋白质影响，实现多种分泌蛋白质的原位、动态监测。

3、通过调整微管路内的局限化往返液流，将细胞裂解后的蛋白质均匀分布并吸附固定在条码区域的表面，实现细胞内部多种蛋白质的高灵敏度检测。

4、利用二维纳米复合结构对蛋白质分子的吸附增强效应及其所激发的局域表面等离子共振效应，提高蛋白质分子的吸附固定量及其检测灵敏度。

附图说明

图1是本发明中所使用的特异性单细胞定点捕捉芯片的结构示意图；

图2是本发明中在特异性单细胞定点捕捉芯片的微流路内修饰二维纳米复合结构示意图；

图3是采用放射状点阵形式修饰不同蛋白质的特异性识别抗体的结构示意图；

图4是采用扇形结构修饰不同蛋白质的特异性识别抗体的结构示意图；

图5a是本发明中单细胞裂解后在局限化往返液流中运动到左侧条码处示意图；

图5b是本发明中单细胞裂解后在局限化往返液流中运动到右侧条码处示意图。

图中

1～10：放射形状的不同抗体修饰区 0：无抗体参考区

11～15：扇形结构的不同抗体修饰区 21：S形微流路

22：监测流路 221：凹槽阵列

222：金膜 223：单细胞捕捉位点

23：液体入口 24：液体出口

25：控制开关阀 26：控制开关阀

27：金纳米颗粒 28：石墨烯

29：细胞裂解物 30：条码形状的不同抗体

31：玻璃基底

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明的基于SPRM技术进行复用性单细胞蛋白质组学监测方法做出详细说明。

本发明的基于SPRM技术进行复用性单细胞蛋白质组学监测方法，在特异性单细胞定点捕捉芯片的基础上，通过在细胞捕捉位点周围修饰抗体点阵/条码，利用二维纳米复合结构的高表面积-体积比及其所激发的局域表面等离子共振效应，提高蛋白质分子的吸附固定量及其监测灵敏度，结合SPRM技术的高空间分辨特性，实现单细胞分泌蛋白质与内部蛋白质的复用性原位监测。

所述的特异性单细胞定点捕捉芯片如图1所示，包括有：S形微流路21，形成在S形微流路21水平部分中的监测流路22，所述S形微流路21的一端形成有1个以上的液体入口23，所述S形微流路21的另一端形成有1个以上的液体出口24，所述S形微流路21的垂直部分均形成有一个液体入口23和一个液体出口24，每个所述液体入口23和每个所述液体出口24上都设置有控制开关阀25，所述S形微流路21的垂直部分上位于液体入口23和液体出口24之间设置有控制开关阀26。在监测流路22上等间隔的形成有凹槽阵列221，并在底部铺有金膜222，在两个凹槽阵列之间设置有单细胞捕捉位点223。

如图1所示，对应特异性单细胞定点捕捉芯片的蛇形微管路结构，在玻璃晶圆表面加工金膜结构，以在金膜表面产生SPR效应，构建特异性单细胞定点捕捉芯片。采用喷墨打印技术在金膜表面修饰抗体阵列，特异性定点捕捉待测细胞，并利用SPRM系统，获取待测细胞周围SPR响应信号的图像信息。获得特异性单细胞定点捕捉芯片表面的折射率变化信息，直接反映芯片表面的细胞捕捉信息和蛋白质浓度变化信息。利用监测得到的反射率变化量与特异性单细胞定点捕捉芯片表面抗体点阵/条码特异性吸附固定蛋白质数量之间的相关性，实现单细胞分泌蛋白质和内部蛋白质的原位、多蛋白、动态监测。

本发明的基于SPRM技术进行复用性单细胞蛋白质组学监测方法，是在特异性单细胞定点捕捉芯片实现，其特征在于，包括如下步骤：

1)在第一特异性单细胞定点捕捉芯片中的单细胞捕捉位点周围，采用喷墨打印技术以图3所示的放射状点阵形式修饰6种以上不同蛋白质的特异性识别抗体，在采用喷墨打印技术修饰不同抗体时，为参考测量保留无抗体修饰位点，图3中，1-10表示不同的抗体，0表示无抗体修饰位点；

根据待测细胞的大小，在特异性单细胞定点捕捉芯片表面修饰直径与细胞直径相近的抗体位点，以特异性吸附固定单个细胞。针对细胞分泌蛋白质的多样性和稀少性，紧邻捕捉细胞的抗体位点，在其周围依次喷印多种抗体点阵(图3中以10种抗体为例，依次用1至10表示)，每个抗体位点的直径为10μm(可以根据实际监测结果进行优化调整)，并保留两组无抗体的位点(图3中用0表示)，用于SPRM的参比测量，以消除分泌蛋白质的监测过程中液体环境变化、温度变化、光源波动和背景光的影响。另外，针对长时间监测蛋白质分泌特性的情况，本发明将同种抗体的点阵，参考细胞捕捉位点的圆心沿径向排列，通过对比分析同种抗体点阵的SPRM信号的点间差异和时间差异，获取蛋白质分泌特性监测过程中蛋白质在微米范围内的扩散特性。采用上述基于抗体点阵修饰的SPRM技术，可以识别监测细胞的分泌蛋白特性，筛选细胞的分泌蛋白标志物。此外，还可以根据监测得到的蛋白质扩散曲线，对抗体修饰图形进行优化，提高细胞分泌蛋白质的监测精度。

2)打开控制阀，向微管路注入待监测细胞溶液，使待监测细胞在单细胞捕捉位点处分泌蛋白质分别与所述的不同蛋白质的特异性识别抗体结合，产生不同的SPR响应信号；

3)分别对比不同点阵位置处的SPR响应信号的强弱，筛选出3-6种SPR响应信号强的待测细胞的分泌蛋白标志物；

4)根据筛选出的3-6种待测细胞的分泌蛋白标志物，在第二特异性单细胞定点捕捉芯片中的单细胞捕捉位点周围，采用喷墨打印技术以图4所示的扇形结构修饰不同抗体，其中，1-5表示不同的抗体，0表示无抗体修饰位点，用于增大单种蛋白质的特异性识别抗体结合面积，打开控制阀，向微管路注入待监测细胞溶液，用于实现多种分泌蛋白质的原位、动态监测；

5)如图5所示，采用喷墨打印技术在第二特异性单细胞定点捕捉芯片中的扇形结构的两侧分别修饰条码形不同蛋白质的特异性识别抗体，所述的条码形是指C形或条形或S形。在采用喷墨打印技术修饰不同抗体时，为参考测量保留无抗体修饰位点；

6)打开控制阀，采用缓冲液冲洗待测细胞所在微管路的特定通道，然后向微管路注入细胞裂解液，调整微管路内的局限化往返液流，将细胞裂解后的蛋白质均匀分布并吸附固定在条码形不同蛋白质的特异性识别抗体的表面，对比不同条码处的SPR响应信号的强弱，实现细胞内部多种蛋白质的高灵敏度监测。

在单细胞的内部蛋白质监测方面，本发明可以对捕捉到的细胞进行裂解处理，并在原位进行细胞内多种蛋白质的高灵敏度监测。对于细胞裂解后的蛋白质监测而言，重要的不再是连续实时监测，而是快速即时监测，这样可以减少蛋白酶的消化分解作用对蛋白质监测结果的影响。现有细胞内蛋白质检测方法中，多在裂解液中添加蛋白酶抑制剂，来抑制蛋白酶的消化分解作用。针对细胞内部蛋白质检测的需求，本发明在特异性单细胞定点捕捉芯片表面单细胞捕捉位点前/后设置抗体条码区域(如图5所示)，利用往返液流将细胞裂解后的蛋白质均匀分布到抗体条码区域。因为微流控芯片内微管路的高度局限化，所以短时间段内的缓慢液流不会导致液段内生物分子的严重扩散稀释。同时，往返液流能够将液段内细胞裂解后的蛋白质运送到细胞捕捉位点前/后的抗体条码区域，促进加快蛋白质与对应抗体的结合。还有一点非常重要的是，SPRM传感技术仅对传感芯片表面倏逝波穿透深度范围(300nm左右)内的介质变化敏感，所以利用往返液流改变微管路内液段位置对测量结果的影响较小，并且可以通过在抗体条码区域中设定无抗体修饰条码，采取参考测量方式消除液体环境变化、温度变化、光源波动和背景光的影响。

在细胞内部蛋白质监测中，首先采用PBS缓冲液冲洗待测细胞所在蛇形微管路的特定通道3次，去除微管路中随细胞进入的干扰蛋白质。然后注入裂解液，并采样记录位于单细胞捕捉位点前/后的抗体条码区域的SPRM图像，获得基线SPR信息。接着在完全裂解芯片表面吸附固定的细胞之后，以固定流速使裂解液往返流经该细胞捕捉位点前后的抗体条码区域，将细胞裂解后的蛋白质均匀分布到抗体条码区域，使细胞内部的多种蛋白质充分与条码区域内的抗体结合。最后采样记录蛋白质与抗体结合后抗体条码区域的SPRM图像，扣除基线SPR信息，计算不同蛋白质的浓度，完成蛋白质的高灵敏度监测。

本发明的基于SPRM技术进行复用性单细胞蛋白质组学监测方法，在第一特异性单细胞定点捕捉芯片和第二特异性单细胞定点捕捉芯片的微管路内在修饰抗体之前，还可以先修饰二维纳米复合结构，如图2所示，用于利用二维纳米复合结构对蛋白质分子的吸附增强效应及所激发的局域表面等离子共振效应，提高蛋白质分子的吸附固定量及监测灵敏度。

为了提高蛋白质分子的吸附固定量及其监测灵敏度，本发明对特异性单细胞定点捕捉芯片表面进行石墨烯-金纳米颗粒复合结构化修饰(如图2所示)，充分利用二维纳米复合结构对蛋白质分子的吸附增强效应及其所激发的局域表面等离子共振效应。石墨烯的高表面-体积比使得其能够更加有效的吸附生物分子，石墨烯的六元环单位可以和生物分子的碳基环结构形成π堆积键来增加生物分子的固定量，石墨烯的生物兼容性使得其适合于蛋白质分子的吸附固定。既可以采用化学气相沉积法制备石墨烯，并利用激光对石墨烯进行图形化，亦可以采用其他石墨烯的制备和图形化工艺在芯片表面加工石墨烯。金纳米颗粒具有良好的生物兼容性，激发局域表面等离子共振的金纳米颗粒直径要小于入射光波长。通常情况下，导电电子被束缚在金纳米颗粒四周做自由振荡。当入射光照射金纳米颗粒时，导电电子受光激发以一定的频率作集体振荡，外部待测介质环境不同，导电电子集体振荡的频率就不同。产生的局域表面等离子共振现象，一方面表现为对特定波长下的光子吸收，另一方面表现为金纳米颗粒四周电磁场的强度增强。在石墨烯表面加工金纳米颗粒，既可以采用化学溶液法或者电沉积法，还可以采用FIB聚焦离子束纳米电加工等技术。在二维纳米复合结构化修饰的SPRM传感芯片表面，采用喷墨打印技术图形化特异性定点捕捉待测细胞的抗体阵列以及识别监测细胞分泌蛋白质和内部蛋白质的抗体点阵/条码，进而实现复用性单细胞蛋白质组学监测。

本发明公开和揭示的所有组合可以通过借鉴本文公开内容产生，尽管本发明的组合已通过详细实施过程进行了描述，但是本领域技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本发明所述的装置进行拼接或改动，或增减某些部件，更具体地说，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容之中。

Claims (4)

1.一种基于SPRM技术进行复用性单细胞蛋白质组学监测方法，是在特异性单细胞定点捕捉芯片实现，其特征在于，包括如下步骤：

1)在第一特异性单细胞定点捕捉芯片中的单细胞捕捉位点周围，采用喷墨打印技术以放射状点阵形式修饰不同蛋白质的特异性识别抗体；

2)打开控制阀，向微管路注入待检测细胞溶液，使待检测细胞在单细胞捕捉位点处分泌蛋白质分别与所述的不同蛋白质的特异性识别抗体结合，产生不同的SPR响应信号；

3)分别对比不同点阵位置处的SPR响应信号的强弱，筛选出3-6种SPR响应信号强的待测细胞的分泌蛋白标志物；

4)根据筛选出的3-6种待测细胞的分泌蛋白标志物，在第二特异性单细胞定点捕捉芯片中的单细胞捕捉位点周围，采用喷墨打印技术以扇形结构修饰不同抗体，增大单种蛋白质的特异性识别抗体结合面积，打开控制阀，向微管路注入待检测细胞溶液，用于实现多种分泌蛋白质的原位、动态监测；

5)采用喷墨打印技术在第二特异性单细胞定点捕捉芯片中的扇形结构的两侧分别修饰条码形不同蛋白质的特异性识别抗体；

6)打开控制阀，采用缓冲液冲洗待测细胞所在微管路的特定通道，然后向微管路注入细胞裂解液，调整微管路内的局限化往返液流，将细胞裂解后的蛋白质均匀分布并吸附固定在条码形不同蛋白质的特异性识别抗体的表面，对比不同条码处的SPR响应信号的强弱，实现细胞内部多种蛋白质的高灵敏度监测。

2.根据权利要求1所述的基于SPRM技术进行复用性单细胞蛋白质组学监测方法，其特征在于，步骤1)、步骤4)和步骤5)在采用喷墨打印技术修饰不同抗体时，为参考测量保留无抗体修饰位点。

3.根据权利要求1所述的基于SPRM技术进行复用性单细胞蛋白质组学监测方法，其特征在于，步骤5)所述的条码形是指C形或条形或S形。

4.根据权利要求1所述的基于SPRM技术进行复用性单细胞蛋白质组学监测方法，其特征在于，在第一特异性单细胞定点捕捉芯片和第二特异性单细胞定点捕捉芯片的微管路上在修饰抗体之前，先修饰二维纳米复合结构，用于利用二维纳米复合结构对蛋白质分子的吸附增强效应及所激发的局域表面等离子共振效应，提高蛋白质分子的吸附固定量及监测灵敏度。