CN113447446B - 利用斜入射光反射差定量检测还原性多组分生物小分子的芯片及应用和检测方法 - Google Patents

利用斜入射光反射差定量检测还原性多组分生物小分子的芯片及应用和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了利用斜入射光反射差定量检测还原性多组分生物小分子的芯片及应用和检测方法，该芯片由导电玻璃上生长聚苯胺纳米层制成聚苯胺纳米层覆盖的导电玻璃；然后在聚苯胺纳米层通过微点样技术加入辣根过氧化物酶和检测目标物的氧化酶，制成微阵列芯片；制成的芯片利用斜入射光反射差技术对复杂组分中的生物小分子进行了定量检测，表现出了检测灵敏度高、特异性好和检测范围宽的优点，能完全满足临床血清样品的分析需要，同时由于聚苯胺优良的电化学可调性，通过简单的电化学还原实现了对双酶修饰后聚苯胺的重复使用，在健康评价及疾病诊断中有着广阔的应用前景。

Description

利用斜入射光反射差定量检测还原性多组分生物小分子的芯片及应用和检测方法
技术领域
本发明涉及检测领域，具体涉及利用斜入射光反射差定量检测还原性多组分生物小分子的芯片，还涉及该芯片的应用和检测方法。
背景技术
多组分定量检测生物小分子对于健康评估和疾病诊断具有重要意义。目前定量检测多组分中生物小分子的方法主要依赖于天然酶或者人工合成酶对底物的特异性催化氧化作用，并结合电化学技术、比色法及荧光法等手段来读取处理得到特定信号。电化学方法由于氧化还原峰的重叠，难以实现单电极对多组分物质的同时检测，而比色法和荧光法也很难在对多组分检测中实现高特异性，且无法重复使用。
斜入射光反射差(OIRD)技术是近二十年来发展起来的一种能实现非标记、实时在线的探测界面变化的光学方法，其基本原理是通过测量斜入射到界面的反射光的两个偏振光分量(s和p)的差值变化来检测界面上发生的物理化学变化过程。界面上由于组分改变、结构变化等引起的介电常数或尺度在空间与时间上的细微变化，均可引起入射光s和p分量反射率的发生不同改变，从而获得OIRD信号。因此，急需一种基于斜入射光反射差检测的芯片，实现多组分同时检测，且能够重复使用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种利用斜入射光反射差定量检测还原性多组分生物小分子的芯片，本发明的目的之二在于提供所述利用斜入射光反射差定量检测还原性多组分生物小分子的芯片在检测生物小分子中的应用；本发明的目的之三在于提供利用所述的芯片检测生物小分子的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、利用斜入射光反射差定量检测还原性多组分生物小分子的芯片，所述芯片由导电玻璃上生长聚苯胺纳米线层，制成聚苯胺纳米线层覆盖的导电玻璃；然后在聚苯胺纳米线层上通过微点样技术加入辣根过氧化物酶和检测目标物的氧化酶固定，制成微阵列芯片。
优选的，固定辣根过氧化物酶和检测目标物的氧化酶前在聚苯胺纳米层上固定聚二甲基硅氧烷膜形成具有微孔的阵列结构，辣根过氧化物酶和检测目标物的氧化酶加入形成的微孔中。
优选的，所述生长聚苯胺纳米层的厚度为0.1-100μm，聚苯胺纳米线直径为10-200nm。
优选的，所述固定辣根过氧化物酶和检测目标物的氧化酶的方法如下：将含有辣根过氧化物酶和检测目标物的氧化酶的溶液点样于聚二甲基硅氧烷膜的微孔中，孵化12小时后用0.01M，pH7的PBS缓冲液和水清洗去除未固定的酶，氮气吹干即可。
更优选的，所述检测目标物的氧化酶为辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶或胆固醇氧化酶。
2、所述利用斜入射光反射差定量检测还原性多组分生物小分子的芯片在检测生物小分子中的应用。
优选的，所述生物小分子为葡萄糖、乳酸和胆固醇中的至少一种。
3、利用所述的芯片检测生物小分子的方法，包括如下步骤：将检测目标物溶解于浓度为0.01M、pH5的PBS缓冲液，采用OIRD信号强度检测目标物。
优选的，检测后还包括芯片再生，具体是检测结束后用0.01M、pH7的PBS缓冲液进行清洗，之后以饱和甘汞为参比电极，碳棒为对电极，被部分氧化过后的PANI/FTO为工作电极的标准三电极体系，在0.01M、pH 5的PBS缓冲液中采用循环伏安法将芯片还原。
优选的，所述OIRD的条件使用波长632.8nm，s/p偏振调制频率50K Hz的椭圆偏振极化光以入射角60度左右从背面斜入射到导电玻璃表面，反射光基频为50K Hz，倍频为100KHz。
本发明的有益效果在于：本方法利用斜入射光反射差技术对复杂组分中的生物小分子进行了定量检测，表现出了高检测灵敏度、优异的检测特异性和宽的检测范围，能完全满足临床血清样品的分析需要。同时，由于聚苯胺优良的电化学可调性，通过简单的电化学还原实现了对双酶修饰后聚苯胺的重复使用。因此这种方法作为一种分析装置在健康评价及疾病诊断中有着广阔的应用前景。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为构建过程图(a：OIRD装置的光路图以及OIRD芯片结构图；b：OIRD芯片制备过程示意图(以GOD-HRP@PANI/FTO为例)；c：基于双酶检测生物小分子的原理图)。
图2为FTO表面的聚苯胺及性能检测(a：沉积到FTO表面的聚苯胺FESEM图，左上角插图为PANI/FTO光学照片；b：聚苯胺薄膜切面FESEM图；c：PANI，HRP以及固定了HRP的聚苯胺的FTIR表征；d：电化学方法氧化聚苯胺时的原位OIRD信号响应曲线)。
图3为OIRD检测氧化氢(a：HRP@PANI/FTO检测不同浓度过氧化氢的原位OIRD信号响应，N.C.表示不含过氧化氢的阴性对照；b：对不同浓度过氧化氢检测的OIRD信号强度)。
图4为利用双酶-PANI/FTO定量检测生物小分子(a和b：GOD-HRP@PANI/FTO检测不同浓度葡萄糖的原位OIRD信号响应曲线以及OIRD信号强度；c和d：LOD-HRP@PANI/FTO检测不同浓度乳酸的原位OIRD信号响应曲线以及OIRD信号强度；e和f：COD-HRP@PANI/FTO检测不同浓度胆固醇的原位OIRD信号响应曲线以及OIRD信号强度)。
图5为GOD-HRP@PANI/FTO芯片特异性检测评(a和b：分别为不含葡萄糖和含有1mM葡萄糖的PBS缓冲液、含有1mM乳酸的PBS缓冲液，含有10μM胆固醇的PBS缓冲液以及含有饱和浓度尿酸的PBS缓冲液；c：含有10mM葡萄糖的PBS缓冲液及含有10mM葡萄糖和10％人血清的PBS缓冲液)。
图6为聚苯胺薄膜厚度对检测双氧水的影响(a：不同扫描圈数检测双氧水信号曲线；b：不同扫描圈数对应的ΔI)。
图7为芯片再生(a：HRP@PANI/FTO检测10μM过氧化氢再生循环9次信号强度恢复率；b：GOD-HRP@PANI/FTO检测1mM葡萄糖再生循环8次OIRD信号强度恢复率)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明利用透明导电玻璃(FTO)为基底，先在FTO电聚合生长聚苯胺纳米线形成聚苯胺纳米线层，再将辣根过氧化物酶(HRP)和检测目标物的氧化酶通过微孔阵列结构的PDMS膜(聚二甲基硅氧烷)固定，构建微阵列芯片；在检测小分子时，其氧化酶催化氧化目标小分子，生成过氧化氢，而后者在HRP酶作用下氧化聚苯胺纳米线，导致斜入射光反射差的信号变化，从而实现对目标小分子的检测，芯片基本结构和检测原理见图1。斜入射光反射差使用一束椭圆偏振的极化光(波长632.8nm，s/p偏振调制频率50K Hz)以入射角60度左右从背面斜入射到FTO玻璃表面，反射光中的交流成分(基频50K Hz，倍频100K Hz)的幅值和相位角由两台锁相放大器记录。
更优选的，在固定辣根过氧化物酶(HRP)和检测目标物的氧化酶前在聚苯胺纳米线层上固定聚二甲基硅氧烷膜，聚二甲基硅氧烷膜形成具有微孔的阵列结构，然后辣根过氧化物酶和检测目标物的氧化酶加入形成的微孔中，聚二甲基硅氧烷膜将个固定酶的微孔间隔开来。
实施例1、利用斜入射光反射差检测还原性多组分生物小分子的芯片构建
1)聚苯胺薄膜覆盖的FTO制备(PANI/FTO)，具体步骤如下：
通过循环伏安法，以碳棒为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，FTO(14±1Ω/□，导电层厚度约为350nm)为工作电极，以0.1M苯胺，0.5M硫酸溶液电解质溶液，在FTO表面电沉积聚苯胺，扫描电势范围为-0.2V～0.9V，扫速为6mV s-1，优化扫描圈数为5，反应结束后用大量乙醇和二次水清洗沉积了聚苯胺的FTO，以去除未反应的苯胺分子。
图2中a和b为沉积了聚苯胺的FTOFESEM图。从图2中a和b可以看出，聚苯胺膜厚约为10.3μm，由10-200nm左右直径(平均直径100nm)致密的纳米线组成，这种结构具有高的比表面积和孔隙率，有利于提高酶的负载量和检测过程中目标分子的扩散。
2)实时监控沉积到FTO表面的聚苯胺的氧化态变化
以饱和甘汞电极和碳棒分别作为参比电极和对电极，沉积聚苯胺的FTO作为工作电极，OIRD能够原位监测聚苯胺氧化态的变化。在PBS缓冲液(0.01M，pH5)中通过电化学方法(LSV)氧化聚苯胺(电势范围：-0.1V～0.7V，扫速：10mV s-1)，并同时记录OIRD光学信号。结果如图2中d所示，从-0.1V正扫到约0.45V左右时，阳极电流出现并逐渐增大，期间还原态聚苯胺转变为部分氧化态聚苯胺，并伴随着离子的掺杂/脱掺杂。在原位实时的OIRD响应中，OIRD信号随着电位的增加而增加，并在0.5V左右光学信号明显增强，这表明OIRD技术能够灵敏地检测到聚苯胺氧化还原态的变化。
3)PANI/FTO上的酶固定
采用吸附法在上述PANI/FTO基底上固定酶。具体是将具有微孔阵列结构的PDMS(聚二甲基硅氧烷)膜固定到PANI/FTO表面，形成微孔阵列，在微孔中加入溶液；或采用微点样技术，将含酶的溶液点样于PANI/FTO基底形成微阵列芯片，孵化12小时后用0.01M，pH7的PBS缓冲液和二次水清洗去除未固定的酶，并用温和氮气吹干。当用于过氧化氢检测时，所用酶溶液为含0.4mg mL-1HRP的PBS溶液；检测其它小分子物质如葡萄糖、乳酸或胆固醇时，所用溶液则为含0.4mg mL-1HRP和小分子物质氧化酶如葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶或胆固醇氧化酶(最优浓度分别为0.8mg mL-1，1.2mg mL-1以及12mg mL-1)的PBS溶液；图2中(c)红外光谱说明HRP已成功固定到芯片上。
实施例2、芯片的应用
1)利用HRP-PANI/FTO定量检测H2O2
首先，通过HRP催化分解H2O2时产生的强氧化性中间体来(如·OH)氧化聚苯胺，并通过OIRD技术实时检测聚苯胺氧化态的变化来定量检测过氧化氢。OIRD检测时，不同目标检测物溶解于浓度为0.01M、pH5的PBS缓冲液，在加入含有目标检测物前，先在PBS缓冲液中扫描获得平稳基线。实验结果如图3所示，当加入含有H2O2的溶液后，OIRD信号开始逐渐增强并约在12min后达到平台，在阴性对照(加入不含H2O2的PBS缓冲液)实验中，发现并没有明显的OIRD信号强度(ΔI＝I–I0，其中I和I0分别代表最终信号和初始信号)变化。且OIRD信号强度与H2O2浓度(1μM～100mM)的对数呈正相关，根据Mb+3Sd定义，固定了HRP的聚苯胺/FTO芯片对H2O2检测限达到了1μM。
2)利用双酶-PANI/FTO定量检测生物小分子
对于检测不同的目标生物小分子需要不同的双酶组合(检测葡萄糖用葡萄糖氧化酶GOD和HRP，检测乳酸用乳酸氧化酶LOD和HRP，检测胆固醇用胆固醇氧化酶COD和HRP)，固定双酶方法同上。不同浓度的生物小分子均分别溶解在0.01M，pH5的PBS缓冲液中，其中溶解胆固醇时使用超声的方法，固定母液中的胆固醇浓度为10μM。实验结果如图4所示，在检测葡萄糖时，OIRD信号强度与其浓度(1μM～100mM)对数呈正相关，由Mb+3Sd定义，对葡萄糖的检测限为1μM。同样，检测乳酸时，OIRD信号强度在乳酸浓度范围为1μM～1mM之间内与其浓度的对数呈正相关的关系，且检测限为1μM。在一个数量级的浓度范围内对胆固醇进行了检测，结果显示OIRD信号强度在浓度1.25μM到10μM之间时与其浓度大小正相关，且检测限为1.25μM。
3)多组分检测及特异性评估
在进行复杂组分中对生物小分子进行定量检测前，首先以GOD-HRP@PANI/FTO为例评估了芯片的检测特异性。结果如图5中a所示，在分别只存在1mM乳酸，10μM胆固醇，饱和浓度尿酸的情况下，OIRD信号没有发生明显的变化，但是当其中分别含有1mM的葡萄糖后，如图5中b所示，结果说明在存在干扰物的情况下，其信号强度与只含有1mM葡萄糖时的几乎相同，说明干扰物存在的情况下并不会影响对葡萄糖的检测。接着，在含有10％人血清的PBS缓冲液中对10mM的葡萄糖进行了检测，如图5中c所示，其OIRD信号强度与检测只存在10mM葡萄糖的PBS缓冲液相近，说明这种技术有着用于检测血清试样的可行性。以上结果可知所制备的固定双酶后的PANI/FTO具有高特异性，对4组(A～D)含有不同组分的溶液进行了多路检测，结果如表1所示。
表1、多通道检测定量检测4种不同多组分溶液中的生物小分子信号
Figure BDA0003136772070000051
结果显示，每组中对不同组分的检测信号强度恢复率接近100％，说明这种基于双酶的OIRD芯片在多通道检测领域具有巨大的应用潜力。
实施例3、聚苯胺薄膜厚度对检测信号的影响
为了探究聚苯胺薄膜厚度对检测信号的影响，按照实施例1的方法，区别是控制扫描圈数为4、5、6和7，然后按实施例2的方法检测H2O2，检测结果如图6所示。结果显示，扫描圈数在4～7均可以检测出H2O2，其中4～6信号更强，5圈信号最强，扫描圈数为4～7时，聚苯胺纳米层的厚度为0.1-100μm，扫描圈数为5时聚苯胺纳米层的厚度为10.3μm。表明聚苯胺纳米层的厚度为0.1-100μm均可用于检测，其中厚度为10.3μm效果最佳。
实施例4、芯片的再生
由于聚苯胺优异的电化学可逆性，通过简单的电化学还原方法就能实现对部分氧化态的聚苯胺的再生。以HRP@PANI/FTO芯片以及GOD-HRP@PANI/FTO芯片为例，分别以10μM过氧化氢和1mM葡萄糖为测试样品，每次检测结束后，用0.01M，pH7 PBS缓冲液进行清洗，之后以饱和甘汞为参比电极，碳棒为对电极，被部分氧化过后的PANI/FTO为工作电极的标准三电极体系，在0.01M，PH 5的PBS缓冲液中采用循环伏安法(电势范围0V～0.1V，扫速：1mVs-1,圈数：6)将芯片还原，结果如图7所示。结果显示，在经过至少8次循环后，这两种芯片依然保持接近100％的信号回复率，说明了这种OIRD芯片具有突出的可重复使用性能。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (6)

1.利用斜入射光反射差定量检测还原性多组分生物小分子的芯片在检测生物小分子中的应用，其特征在于：所述芯片由导电玻璃上生长聚苯胺纳米线层，制成聚苯胺纳米线层覆盖的导电玻璃；然后在聚苯胺纳米线层上固定聚二甲基硅氧烷膜形成具有微孔的阵列结构，再将辣根过氧化物酶和检测目标物的氧化酶加入形成的微孔中并固定在聚苯胺纳米线层上制成微阵列芯片；所述聚苯胺纳米线层的厚度为0.1-100μm，聚苯胺纳米线直径为10-200nm；所述生物小分子为葡萄糖、乳酸和胆固醇中的至少一种。
2.根据权利要求1所述利用斜入射光反射差定量检测还原性多组分生物小分子的芯片在检测生物小分子中的应用，其特征在于：生长聚苯胺纳米线层的方法是以导电玻璃为工作电极，以含苯胺和硫酸的溶液为电解质溶液，在电势范围为-0.2V～0.9V，扫速为6mV s-1条件下在导电玻璃表面电沉积聚苯胺，反应结束后用乙醇和水清洗去除未反应的苯胺分子即可。
3.根据权利要求1所述利用斜入射光反射差定量检测还原性多组分生物小分子的芯片在检测生物小分子中的应用，其特征在于：所述固定辣根过氧化物酶和检测目标物的氧化酶的方法如下：将含有辣根过氧化物酶和检测目标物的氧化酶的溶液点样于聚二甲基硅氧烷膜的微孔中，孵化12小时后用0.01M，pH7的PBS缓冲液和水清洗去除未固定的酶，氮气吹干即可。
4.利用斜入射光反射差定量检测还原性多组分生物小分子的芯片检测生物小分子的方法，其特征在于，包括如下步骤：将检测目标物溶解于浓度为0.01M、pH5的PBS缓冲液，采用OIRD检测目标物；所述芯片由导电玻璃上生长聚苯胺纳米线层，制成聚苯胺纳米线层覆盖的导电玻璃；然后在聚苯胺纳米线层上固定聚二甲基硅氧烷膜形成具有微孔的阵列结构，再将辣根过氧化物酶和检测目标物的氧化酶加入形成的微孔中并固定在聚苯胺纳米线层上制成微阵列芯片；所述生长聚苯胺纳米线层的厚度为0.1-100μm，聚苯胺纳米线直径为10-200nm；所述生物小分子为葡萄糖、乳酸和胆固醇中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的芯片检测生物小分子的方法，其特征在于：检测后还包括芯片再生，具体是检测结束后用0.01M、pH7的PBS缓冲液进行清洗，之后以饱和甘汞为参比电极，碳棒为对电极，被部分氧化过后的PANI/FTO为工作电极的标准三电极体系，在0.01M、pH 5的PBS缓冲液中采用循环伏安法将芯片还原。
6.根据权利要求4所述的芯片检测生物小分子的方法，其特征在于：所述OIRD的条件使用波长632.8nm，s/p偏振调制频率50K Hz的椭圆偏振极化光以入射角60度左右从背面斜入射到导电玻璃表面，反射光基频为50K Hz，倍频为100K Hz。
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