CN110988081A - 诊断结核病的方法 - Google Patents
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Abstract
制备了含有分枝菌酸抗原的脂质体以及结核分枝杆菌来源的电极固定抗原。将从疑似患有结核病的人类获得的诊断样品稀释,并将该诊断样品分为第一样品和第二样品。含有所述第一样品和氧化还原探针的对照样品暴露于所述脂质体。含有所述第二样品和氧化还原探针的测试样品暴露于不含分枝菌酸抗原的脂质体。所述对照样品与所述固定抗原接触,以使得在其中的抗体结合到所述抗原。所述测试样品与所述固定抗原接触,以使得在其中的抗体结合到所述抗原。通过电化学阻抗谱比较所述样品中结合的程度。任何观察到的所述对照样品的较低程度的结合是在所述诊断样品中的抗体结合到所述抗原的指标,表明人患有结核病。
Description
本申请为2014年5月15日递交的申请号为201480040159.4,发明名称为诊断结核病的方法的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种诊断结核病的方法。具体地,本发明涉及活动性结核病(activetuberculosis(TB))的血清学诊断方法,该血清学诊断方法基于检测哺乳动物受试者中针对源于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的脂质抗原的抗体。
背景技术
对于诸如TB的疾病,尽管已有报道在针对患有TB的患者血清中结核分枝杆菌的各种抗原的抗体的研究上取得了极大的进展,但迄今一直没有能足够有效地保证TB诊断结果的商业化血清学TB诊断测试(Weyer等人,2011年)。
本发明提供一种通过检测含有免疫球蛋白的体液样品中的替代标记物抗体诊断结核病的方法。替代标记物是疾病的指标,由宿主对感染的响应产生,而不是由感染因子自身产生。
所述替代标记物抗体是特异性地识别源自结核分枝杆菌的分枝菌酸抗原的抗体(Verschoor等人,1998年,US 7,122,577),且本申请人认识到,这样的抗体的流行率不会因HIV协同感染而受影响,HIV是引起AIDS的病毒(Schleicher等人,2002年)。本申请人还认识到,可通过竞争性结合抑制免疫测定的手段检测抗体,以便将该抗体与普遍存在的交叉反应抗胆固醇抗体区别(Verschoor等人,2005年,Thanyani等人,2008年,Benadie等人,2008年)。本申请人进一步认识到,可使用稀释的样品利用生物传感技术实时检测抗体与固定在传感器表面上的含分枝菌酸抗原的脂质体的结合,以提高检测的灵敏度和特异性相比于标准免疫测试如ELISA(Verschoor等人,2005,Thanyani等人,2008年,Lemmer等人,2009年)。本申请人进一步认识到,使用电化学阻抗谱(EIS)技术,可以在具有嵌入分枝菌酸抗原的自组装脂质单层上对替代标记物抗体进行终点检测(Mathebula等人,2009年,Ozoemena等人,2010年)。
在所引用的现有技术中,已经给予适用于结核病的诊断的技术缩写“MARTI”,即分枝菌酸抗体实时抑制测试(Lemmer等人,2009年)。然而,由于所述MARTI-测试需要昂贵且费力的生物传感器技术,如表面等离子体共振(surface plasmon resonance)、伴随低样品通量以及高维护要求,其应用是具有挑战性的。Mathebula等人(2009年)和Ozoemena等人(2010年)的电阻抗谱技术试图找到一种所述替代标记物抗体的生物传感器检测方法,以更适合于实际诊断应用。尽管技术上成功,但其偏离了将MARTI作为终点抗体结合检测测试予以实施的原理,当使用较多的血清样品组进行验证时,会预期到不足的灵敏度。
本发明通过以新颖的方式配置电阻抗的测定,将电阻抗生物传感器途径应用于MARTI-测试的原理,对现有技术提供了改进。这需要排除抗体-抗原在电极传感器表面暴露后的洗涤步骤,并包含与含抗体的样品结合的氧化还原探针或类似的导电物质。这种设置通过防止低亲和力的生物标志物抗体连同未结合的血清成分的洗除提高了测试的灵敏度。本发明利用价格低廉、耐化学溶剂、丝网印刷型、一次性的电极使MARTI-测试的原理适用于高样品通量。另外,本发明为抑制的样品和非抑制的样品提供了连续注射,即将所述抑制的样品和非抑制的样品依次暴露于相同的传感器表面,这使得每个样品仅需要一个一次性的电极即可进行全面分析。
以前已经探索了用于TB的检测的各种方法。基于压电的生物传感器(He等人,2002年,Ren等人,2008年)、基于DNA结合的生物传感器(Das等人,2010年)、基于磁弹性的生物传感器(Pang等人,2008年),基于声波的生物传感器(He等人,2003年),以及基于SPR的DNA传感器(Duman和Erhan,2010)。然而,这些创新旨在直接的杆菌检测,并未涉及低亲和力的抗体的洗除。Pang等人(2008年)的方法中使用痰样品,并已知为适合HIV协同感染的患者。用于TB检测的生物传感器具有巨大的科学和商业利益,但对肺外、儿科和HIV协同感染的群体中还没有提供解决方案。
Mathebula等人(2009年)为可使用电化学阻抗谱(EIS)检测结核抗分枝菌酸抗体的生物标志物提供了原理的证明。EIS本质上是一种检测具有电流的电极表面上的变化的分析技术。这篇文献建议使用共价连接的自组装单层,以形成包含分枝菌酸的电容层。然而,在其目前的配置中,所述方法由于费力的电极抛光和化学方法,不能用于高样品通量。本申请人现已发现丝网印刷电极(SPEs)与电化学阻抗谱结合可以用于检测抗分枝菌酸的抗体。
丝网印刷技术或丝网印刷已知多年,并已成功地用于生产丝网印刷电极。在本发明的方法中,金“墨水”用于图1中所示的陶瓷氧化铝载体上,以产生三个电极的系统。可通过如图2和图3中所示的高温固化或低温固化将所述金电极固化。这避免了费力的抛光的要求(García-González等人,2008年)。在电极系统中,控制参数如表面粗糙度和自组装单层(SAM)的重现性是重要的。高通量抗体检测要求用于控制所述表面粗糙度的方法应被优化,以在获得重现性结果中提供置信度。
丝网印刷使高品质的一次性的电极重复生产价格低廉。由于用于诊断目的的表面再生是不切实际的,一次性是很重要的。当使用替代技术(例如,Biacore SPR生物传感器)时,必须在每次分析前,对石英杯(cuvette)的金表面进行化学再生。这可能导致当使用自组装单层膜(SAMs)时,引起该表面的蚀刻。此外,促溶剂(chaotropic agents)如尿素可能存在于血清中;这些试剂对电极具有破坏影响(Dijksma,2003年)。这可以通过不定误差(indeterminate error)破坏重现性和精确度。由于这些因素,表征多次再生之间的表面变化是极其困难、昂贵且不切实际的。一次性的SPEs为重现性和成本提供了解决方案。
电化学阻抗谱是由Oliver Heaviside(Barsoukov和MacDonald,2005年)于1880年首次提出的。大约125年后,电化学技术被证明适用于在自组装单层(SAMs)上监控结合相互作用(Campuzano等人,2006年)。电荷转移经氧化还原探针发生在溶液中的工作电极、参考电极和对电极上。简单地说,在该池的E1/2处的恒定电压保持在基于所定义的扫描参数的一组不同频率上。交流电流具有幅度和相位角。该相位角由于系统中的变化而发生改变,包括由于增加的电容的离子扩散。频率响应分析(FRA)在本测定中测定。EIS用于研究两组参数:影响材料的例如导电性,介电常数,电荷迁移率,带电荷种类的平衡浓度,主体反应速率的那些参数,以及属于电极材料界面,包括吸附反应速率常数,界面区域上的电容和电极自身中的中性物质的扩散系数的那些参数(Barsoukov和MacDonald,2005年)。SAMs形成制约了电荷转移的绝缘层,从而产生电容(Gebbert等人,1992年)。由于通过物理吸附的抗体结合,在电解质-SAM-工作电极界面产生电荷转移电阻(Rct)(Tudorache和Bala,2007年)。可以使用EIS技术量化Rct,并在本文使用用作分析的基础。
在电位脉冲(脉冲电流检测)的期间,可以通过阻抗测量实现抗体-抗原响应的直接、不含标记的检测。通过结合蛋白质在SAM上形成一个附加层,使得能够检测所引入的电极的电容的改变和/或电荷转移电阻的改变(Berggren和Johansson,1997年)。
使用循环伏安法(cyclic voltammetry)校准系统是需要的,以确定该系统的平衡电位(E1/2)(见图4)。该值用于EIS以测量在工作电极(WE)和对电极(counter electrode)(CE)之间的电流扰动。当使用金作为该工作电极时,用于测量之前报道的SAMs的对电极的例子为氯化银,且氧化还原探针是铁氰化物或[Fe(CN)6]4-/[Fe(CN)6]3-(Mathebula等人,2009年)。
工作电极作为在界面区域交换的电子的来源,必须是生物惰性的(换句话说,它们将不会产生响应所施加的电势的电流)。金由于其惰性和导电性能,以前已经用作工作电极。它很容易与乙酰半胱氨酸或任何硫醇缀合,在硫和金表面之间形成高度稳定的配位共价键。如果所述硫是长链烷烃或类似分子的一部分,则会形成绝缘层。如果所述电极是会被重新使用的,则必需去除形成的绝缘层。这要求所述电极在每次使用之间必需被清洁或被抛光。这是不切实际的,且具有引入可测误差(determinate error)的可能性。
使用一次性电极防止表面吸附效果和由于过度清洁造成的损伤,因此极大程度地提高重现性。所述电极可在装置外制备,且被设置应用于电极抛光和电极涂覆是不切实际的护理点(point of care)(POC)中。
在水溶液中,电极-电解质界面可以使用由附着到所述电极表面的疏水性化合物/分子/纳米颗粒组成的SAMs进行改性。N-(2-巯基乙基)十八烷酰胺(MEODA)之前已经被Ozoemena等人(2010年)和Mathebula等人(2009年)使用,以及11-硫醇癸酸(MEA)已被Zhang等人(2009年)使用。Ozoemena等人(2010年)使用的Au-MEODA-MA原理包括将半胱胺附着到金,随后共价连接硬脂酸,并最终通过疏水相互作用结合分枝菌酸。被认为,这定向了该分枝菌酸垂直于朝下的疏水部分,并且所述分枝菌酸的基序和其他亲水基团朝向SAM的外表面。这允许与抗分枝菌酸抗体结合,提供了可以使用EIS进行TB诊断所需的证据。
以前的工作已经表明,自组装单层膜(SAMs)阻碍电流的流动。由于金表面覆盖有长链烷基硫醇,几乎所有的电流被所报道的用丁硫醇情况下的69Ωcm2的动态电阻阻断,相比之下硫辛酸在40Ωcm2具有较低电阻40Ωcm2,其允许氧化还原对(探针)穿透到这样的程度,使获得的结果与裸金几乎相同(Berggren和Johansson,1997年)。此外,当TB感染的患者的血清中的抗分枝菌酸抗体(Anti-MA Ab’s)结合到含分枝菌酸的固定层时,已经被证明会增加这种阻抗的发生(使用具有分枝菌酸的SAM)(Ozoemena等人,2010年,Mathebula等人,2009年)。这是在结核病诊断中使用EIS原理的重要的证明信息。
测量阻抗的标准方法是向界面施加单一频率,并在特定的频率测定最终电流的相位移动和幅度,或对响应进行快速傅立叶变换分析(Barsoukov和MacDonald,2005年)。图5描述了用于构造Nyquist图的兰德尔等效电路(Randle’s equivalent circuit)。
循环伏安法的可视化表示和EIS有助于理解第一原理。图4示出复合的SAM缀合到金电极上的效应。由于表面因疏水组分开始变化,电流的流动减小,且形状从S形(a)变化到较少S形(b),再变化到椭圆形(c)。此处,人们必须假定线性函数,且观察到电位降低(E)等于电流(I)乘以溶液电阻(Rs)。
E=I×Rs
这意味着,随着形成SAM(以及绝缘增加),如果E和Rs是保持恒定的,电流将减小。在EIS中,随着Nyquist图的半圆的大小的增加,并因此增加了电阻Rct,这将可视化(见图5和图6)。
发明内容
因此,根据本发明,提供了一种通过检测活动性结核病的替代标记物诊断结核病的方法,所述方法包括以下步骤:
取出结核分枝杆菌来源的分离的分枝菌酸抗原或其合成的类似物在脂质体载体中制备含分枝菌酸抗原的脂质体;
在电极上固定结核分枝杆菌来源的分离的分枝菌酸抗原或其合成的类似物,以在所述电极上制备结核分枝杆菌来源的固定抗原;
从疑似患有活动性结核病的人类或动物中获得诊断样品,所述诊断样品可能含有针对所述固定分枝菌酸抗原的替代标记物抗体;
稀释部分或全部所述诊断样品,并将所述稀释的样品的部分或全部分为第一样品和第二样品;
通过将氧化还原探针与所述第一样品结合制备对照样品,并将所述对照样品暴露于含有所述分枝菌酸抗原的脂质体;
通过将氧化还原探针与所述第二样品结合制备测试样品,并将所述测试样品暴露于不含有分枝菌酸抗原的脂质体;
将所述对照样品与所述固定分枝菌酸抗原接触,以使得在所述对照样品中的任何抗体结合到所述固定分枝菌酸抗原;
将所述测试样品与所述固定分枝菌酸抗原接触,以使得在所述测试样品中的任何抗体结合到所述固定分枝菌酸抗原;以及
通过电化学阻抗谱比较所述对照样品和所述测试样品中的抗体结合到在所述固定分枝菌酸抗原的程度,观察到的由所述对照样品示出的任何较低的结合是所述诊断样品中存在针对所述分枝菌酸抗原的抗体的指标,该指标表示所述诊断样品来源的人类或动物患有活动性结核病,从而由此诊断所述人类或动物患有活动性结核病。
所述脂质体具有脂质双层膜状纳米结构,该纳米结构用于支撑或包含脂质抗原,在本发明中的所述脂质抗原为分枝菌酸。人类或动物的诊断可以在获得所述诊断样品的24小时之内进行,优选是在获得所述样品的同一天进行。这是本发明的重要优点,因为许多现有技术的诊断程序是冗长且费力的。
分枝菌酸抗原的固定化是通过结合结合剂和聚合物直接将分枝菌酸抗原结合到自组装单层,以在所述电极上获得含分枝菌酸抗原的自组装单层。所述自组装单层可以包括硫醇化的疏水性物质。所述硫醇化的疏水物质可以是十八烷硫醇。
所述电极可以是丝网印刷电极。含分枝菌酸抗原的自组装单层可以以涂层的形式在所述丝网印刷的电极的表面上。自组装单层是在合适的条件下自然形成地附着到表面上的一化合物层或分子层。
所述方法可包括通过首先将所述电极表面暴露于疏水性物质,其后将其暴露于所述分枝菌酸抗原,以形成含有所述分枝菌酸抗原的自组装单层。或者,所述方法包括通过将所述电极表面暴露于所述疏水性物质和所述分枝菌酸抗原的混合物中,以形成所述含有分枝菌酸抗原的自组装单层。
所述对照样品和测试样品可以依次接触相同的丝网印刷电极的固定抗原。或者,所述对照样品和所述测试样品可以分别地与单独的丝网印刷电极的固定抗原接触。在前者的情况下,当所述对照样品和所述测试样品依次与固定抗原接触时,所述测试样品代替所述丝网印刷电极上的对照样品。所述测试样品可以被泵到所述表面上并简单地替代所述对照样品,而无需任何中间洗涤步骤。换句话说,在所述丝网印刷电极的固定抗原与所述对照样品进行接触和所述丝网印刷电极的固定抗原与所述测试样品进行接触之间,无需对所述丝网印刷电极进行任何洗涤。这是本发明的一个重要优点。其中,所述对照样品和所述测试样品分别与单独的丝网印刷电极上的固定抗原接触,所述样品可以同时接触所述单独的电极。
如上文所述,所述诊断样品可能包含针对所述固定分枝菌酸抗原的替代标记物抗体。换句话说,如果诊断样品来源的人类或动物具有活动性结核病,所述诊断样品将包含针对到所述固定分枝菌酸抗原的替代标记物抗体。
所述第一样品和所述第二样品分别与氧化还原探针的结合可在缓冲溶液中中进行。与所述第一样品和第二样品结合的所述氧化还原探针可以是相同的。
分枝杆菌的感染可能是引起选自肺部结核病和肺外结核病的疾病的感染类型。分枝菌酸抗原可以是从结核分枝杆菌中提取的,并且所述抗体是抗结核分枝杆菌的抗体,或抗其分枝菌酸组分的抗体。所述分枝菌酸抗原可以是选自同源化合物和非同源化合物的混合物的形式。
人类或动物来源的样品可以选自血液样品、脊髓液样品和天然地含有抗体的样品。所述样品可以是选自HIV阳性的人类。尤其地,所述抗体可以是低亲和力的抗体。
将所述对照样品和所述测试样品暴露于所述固定的分离的分枝菌酸抗原,可以包括将所述对照样品与含分枝菌酸抗原的脂质体进行预培养,以及将所述测试样品与不含所述分枝菌酸抗原的脂质体进行预培养。
在本发明的方法中,所述丝网印刷的电极可以是简单地抛光,被覆盖在ODT-己烷中以形成自组装单层,随后在无水乙醇中洗涤。然后施加在己烷中的分枝菌酸,随后进行另一次乙醇洗涤。然后丝网印刷的电极可以用循环伏安法表征(在氧化还原探针溶液中)以确定E1/2,并随后进行EIS(频率响应分析)以确定基线。在“对照步骤”中的被抑制的样品,即具有含分枝菌酸的脂质体的稀释的血清样品和氧化还原探针可以被泵到所述表面上,从而替换所述第一步骤中的氧化还原探针溶液。所述“对照步骤”中的溶液然后可以允许短暂固定时间的结合,然后用EIS分析。在“测试步骤”中,用“测试步骤”中的溶液替换“对照步骤”溶液,即具有不含MA的脂质体的稀释的血清样品和氧化还原探针可被泵到所述电极的表面。这将所述电极如之前的步骤那样短暂暴露于所述“测试步骤”溶液短暂的固定时间。在发生结合后,然后可对该信号进行第三次分析。比较抑制的样品和非抑制的样品之间的差别。如果差异是实质性的,则患者被认为是TB阳性。
本发明还提供了一种用于通过检测指示活动性结核病的替代标记物抗体诊断结核病的试剂盒,所述试剂盒包括一个或多个丝网印刷电极,结核分枝杆菌来源的分离的分枝菌酸抗原或其合成的类似物,缓冲液形成试剂,氧化还原探针形成试剂和脂质体形成试剂。
附图说明
本发明以示例的方式,参考以下附图和所附的非限制性实施例进行解释,其中:
图1显示出具有导电层(a)以及具有和不具有绝缘层(b)的DropsensTM[利亚内拉(阿斯图里亚斯),西班牙]丝网印刷电极;
图2显示出在高温下在丝网印刷电极上固化的“墨水”(DropsensTM丝网印刷的金电极目录)的扫描电子显微镜图像;
图3显示出在低温下在丝网印刷电极上固化的“墨水”(DropsensTM丝网印刷的金电极目录)的扫描电子显微镜图像;
图4显示出5mM的K3[Fe(CN)6]溶液中用于将复合SAM结合到金电极上,以毫伏(mV)作为电势(E)的单位和以微安培(μA)作为电流(i)的单位的在10mV/s的扫描速率下的典型的循环伏安图;(a)金和硫辛酸,(b)金、硫辛酸和抗体,(c)金、硫辛酸、抗体和1-十二硫醇(Berggren和Johansson,1997年);
图5显示出了兰德尔等效电路(a),描述具有反应物和/或产物扩散到界面的单一步骤的电荷转移过程的反应,以及与该兰德尔等效电路相关联的Nyquist图(b);Cdl是双层的电容,Rs是溶液电阻,Rct是电荷转移电阻(电子转移的速度),以及Zw是沃伯格阻抗(Warburg impedance)(电解液电阻);对于Nyquist图(b),Z'是实时频率和Z″是假定频率。质量传递控制的正斜率是在扩散过程中(线性或径向)(Dijksma,2003年,Barsoukov和MacDonald,2005年,第70页)
图6显示了在以下固定化步骤中Rct增加的Nyquist图(Z假定针对Z实时):(a)金层的电沉积;(b)11-MUA单层的组装;(c)抗人类IgG的固定;(d)人类IgG的结合;(e)再生(Zhang等人,2009年);
图7显示了使用耐溶剂电极的TB阴性(ASPA004)和TB阳性(ASPA019)的患者的血清的抑制结合百分比的平均值。误差线代表n=4时的标准偏差。
具体实施方式
实施例1
低亲和力的抗分枝菌酸抗体的检测
材料
(1)分枝菌酸购自Sigma Aldrich公司,德国。测试试剂均购自Sigma。乙醇、丙酮、氯仿、己烷和二甲基甲酰胺购自Merck,南非。
(2)PBS缓冲液(20×)由以下物质构成:160g的NaCl、4g的KCl、4g的KH2PO4,4g的无水Na2HPO4,溶于1升的dddH2O中。PBS/AE缓冲液(1×):0.25g的NaN3和0.3802g的EDTA溶解于50ml的20×PBS缓冲液和800ml的dddH2O中,将其用1M的乙酸调节至pH 7.44,并用dddH2O补足至1升的最终体积,之后使用过滤系统通过0.22μm的滤片过滤。
(3)将1mM的六氰高铁溶液(铁氰化物/亚铁氰化物),即[Fe(CN)6]4-/[Fe(CN)6]3-(购自Bio-Zone化学品公司,南非),在1×的PBS/AE缓冲液中制成。使用Autolab PGstat302(Autolab,荷兰)通过GPES和FRA软件完成分析。
(4)从HIV阳性的患者中采集的血液样品新鲜递送到实验室用于血清制备。样品在采样后和进行处理前的8个小时内保持在15℃。血液凝结后(采样后的2-4小时),使用塑料巴斯德吸液管将血清从血液凝块移除,并将血清转移到1.5ml的Eppendorf离心管中。然后将血清样品在微型离心机中离心(360g,5分钟,4℃)以除去任何仍存在的细胞物质。然后取该血清样品(500μL部分)分装到1.8ml的冻存管(品牌产品,Nunc国际公司,丹麦),并保存在-70℃。当以这种方式获得足够数量的样品时,作为安全预防措施,将它们再次融化并用r-射线照射(30Gy,照射盒子上的每个侧面5分钟,比勒陀利亚大学医院)(Vermaak,2005年),以灭活任何病毒活性。从该步骤中,样品被最终冷冻在-70℃,直到用于MARTI分析。此处,使用MARTI阳性的对照样品(ASPA019)和MARTI阴性对照样品(ASPA004)。
方法
(1)电分析:将裸丝网印刷电极[DRP-220AT,Dropsens,Llanera(阿斯图里亚斯),西班牙]短暂地打磨,并在己烷中润洗,在含0.1mM铁氰化钾/亚铁氰化钾的PBS/AE(氧化还原探针溶液)中表征。在具有0.00244V的跨步电势和0.025V/s的扫描速率的-0.336V至0.6V的电势窗之间实施循环伏安法。这允许在流动池(flow cell)中确定每个特定电极的E1/2。通过进行峰值搜索,E1/2被发现是约为0.15V。使用EIS(频率响应分析)用FRA软件(MetrohmAutolab,荷兰)在池的E1/2处进行从2kHz到1Hz的分析。
(2)然后用0.1M的ODT-己烷溶液涂覆电极,然后在无水乙醇中漂洗,然后在40μl的0.5mg/ml的MA-己烷溶液中涂覆。将其用无水乙醇再次洗涤,然后进行分析,以使用EIS技术在(1)中提及的E1/2处确定基线。
(3)稀释血清样品并将其与脂质体培养,以制备“对照步骤”溶液和“测试步骤”溶液。
使用在室温下放置至完全解冻的患者的血清进行抑制研究。将1/500倍稀释的血清,与“对照步骤”中的含有分枝菌酸的脂质体,或与“测试步骤”中的不含分枝菌酸的脂质体,进行20分钟的预培养。然后将它们依次注射到电极表面上用于结合抑制研究。对照溶液和测试溶液如(4)和(5)分别示出的,允许结合10分钟。
(4)“对照步骤”。在培养后,所述抑制样品(在PBS/AE缓冲液中的具有含MA的脂质体的稀释的血清样品和氧化还原探针)被泵到所述表面上,其取代了氧化还原探针溶液。所述“对照步骤”溶液允许短暂固定时间的结合,然后用EIS进行分析。
(5)“测试步骤”:用“测试步骤”(非抑制的样品),即血清样品尚未被暴露于抗原并且其中抗体结合活性仍保持最大时,替换所述“对照步骤”溶液。在进行结合如(4)中的相同时间后,对信号进行第三次分析。比较抑制样品和非抑制的样品之间的差异。
(6)如果检测到所述对照样品和测试样品之间的实质性差异,则患者被认为是TB阳性。
结果与讨论
患有活动性结核病的患者会表现出针对分枝杆菌细胞壁分枝菌酸的提高的抗体水平。所述抗体先前已经用包括ELISA、波导和共振镜生物传感器的各种技术进行了检测。Schleicher等人(2002年)发表的利用ELISA的结果提供了57%的精确度。使用共振镜生物传感器,检测抗分枝菌酸抗体的生物标记物达到82%的精确度(Thanyani等人,2008)。本申请人现已表明,由Verschoor等人(2005年)在MARTI测定中的抑制测定的原理,可以应用于通过安培技术,即电化学阻抗谱(EIS)的手段检测响应值。由抗体结合到表面上的差异的结果,产生区分TB阳性和TB阴性的血清的能力。
为了研究是否MARTI的原理可以应用到EIS系统中,本申请人研究了将氧化还原探针连同抑制的脂质体或非抑制的脂质体加入到血清稀释液中。在理论上,在抗体暴露后对清洗步骤的需求可期待被消除,从而保持检测低亲和力生物标志物抗体的结合的能力。制备了如所描述的脂质体(Thanyani等人,2008年),但含有氧化还原探针的PBS/AE(0.1mM的铁氰化物/亚铁氰化物)用作悬浮液。在氧化还原探针的存在下制备所述血清稀释液和脂质体。含氧化还原探针的PBS/AE缓冲液也可使用于抑制步骤中和在固定化到电极表面上之后的测量中。在将非抑制血清样品暴露到所述传感器表面后,进行第二次测量。该样品含有血清、氧化还原探针、PBS/AE缓冲液和不含MA的脂质体。不限于此,本申请人认为,这可以通过以下机理发生,其中随着“测试步骤”溶液的注射,“对照步骤”中的未结合的抗体和脂质体会同时从电极移除。本申请人还相信,本发明的方法可以自动化。
通过从Rct数值计算出抑制抗体结合到固定化有MA的传感器表面的百分数差值,观察到TB阴性和TB阳性血清之间的差异。在这种情况下,电荷转移电阻的增加是抗体结合到在所述表面上的分枝菌酸的指标。其发生是由于固定的抗原(分枝菌酸)和血清样品中的抗体结合形成免疫复合体。由于分枝菌酸跨电极表面固定在SAM中,所述免疫复合体通过增加外层和电极之间的距离降低了电容,并由此增加了电荷转移的阻力(Rct)。这阻碍了在电极-电解质界面处的界面电子转移动力(Hays等人,2006年)。
图7中的数据表明TB阳性和TB阴性的血清之间的接近50%的信号差异,该差异是统计上显著的。这表示TB-感染的血清中抗分枝菌酸抗体结合到传感器表面的程度。结果建议,为了TB诊断的目的,如果使用了为了本发明的目的专门设计的耐SPEs的溶剂,使用SPEs将抗体结合到分枝菌酸仅可用于MARTI TB测试的目的。
最后,Mathebula等人(2009)和Ozoemena等人(2010年)为在TB血清学诊断中使用EIS铺平了道路,提供了基础和原理。本申请人现已表明,高样品通量诊断可以通过减轻费力的电极抛光、昂贵电极和复杂的碳化二亚胺表面化学来实现。此前基于抗-MA的抗体检测的EIS TB测试可能需要长达一个星期。本发明的方法使用丝网印刷电极允许将时间减少为一天,并具有将时间减小到低于一个小时的潜力。丝网印刷电极先前已经被试图用于诊断TB(Diaz-Gonzalez等人,2005年)。他们的制造的系统使用碳丝网印刷的电极,酶依赖性三明治测定法,高度稀释的血清样品(1:10 000)和2×90分钟的培养步骤。由于需要通过一个洗涤步骤将游离的抗体与结合的抗体分离,他们潜在的诊断时间更长,并受到检测高亲和性的抗体的限制。有限的文献信息涉及用于免疫传感器的耐溶剂电极。在1997年,和Turner研究了用于过氧化氢的检测的耐溶剂碳丝网印刷的电极的使用。Potyrailo等人(2004)使用耐溶剂的电极评估聚合物-溶剂的相互作用。然而该申请人未意识到将耐溶剂丝网印刷的电极用于TB的诊断的应用。
因此本发明提供一种实时抗体检测方法。实时检测方法是指记录抗体结合抗原的过程的实际时间和结合事件。对于MARTI诊断,这个术语指的是检测在该过程中任何时间的抗体与固定的抗原的结合,而无需洗去任何多余的未结合的抗体。与表面等离子共振生物传感器允许随时间连续记录抗体结合到固定的抗原相反,本发明中的EIS在暴露于抗原后的特定时间测量抗体,但仍然不需要洗涤步骤以除去未结合的抗体来使得记录该结合事件能够进行。
本发明的方法相应地提供一种新的用于结核病诊断的方法,且本申请人的观点认为,本方法可以产生用于TB诊断的护理点设备。
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Claims (13)
1.一种用于制备检测分枝菌酸抗原的替代标记物抗体存在的丝网印刷电极的方法,所述方法包括:
通过将结核分枝杆菌来源的分离的分枝菌酸抗原或其合成的类似物结合到包括硫醇化的疏水性物质的自组装单层,在丝网印刷电极上固定所述结核分枝杆菌来源的分离的分枝菌酸抗原或其合成的类似物,从而以含有所述分枝菌酸抗原的自组装单层涂层的形式,在所述电极的表面上制备固定分枝菌酸抗原,其中所述硫醇化疏水性物质是长链烷硫醇。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述硫醇化疏水性物质是十八烷硫醇。
3.根据权利要求1所述的方法,其中通过首先将所述电极的表面暴露于所述疏水性物质,其后将其暴露于所述分枝菌酸抗原,以形成所述含有分枝菌酸抗原的自组装单层。
4.根据权利要求1所述的方法,其中通过将所述电极的表面暴露于所述疏水性物质和所述分枝菌酸抗原的混合物中,以形成所述含有分枝菌酸抗原的自组装单层。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,所述分枝菌酸抗原是从结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)提取的。
6.根据权利要求1所述的方法,其中,所述分枝菌酸抗原为同源化合物或非同源化合物的混合物的形式。
7.一种在24小时内以高样品通量检测样品中分枝菌酸抗原的低亲和力替代标记物抗体存在的方法,所述方法包括步骤:
取出结核分枝杆菌来源的分离的分枝菌酸抗原或其合成的类似物在脂质体载体中制备含分枝菌酸抗原的脂质体;
获得根据权利要求1所述方法制备的丝网印刷电极,所述电极在其表面含有固定的所述结核分枝杆菌来源的分离的分枝菌酸抗原或其合成的类似物;
将从人或动物获得的样品分为第一样品和第二样品;
通过用氧化还原探针与所述第一样品结合制备对照样品,并将所述对照样品暴露于含有所述分枝菌酸抗原的脂质体;
通过用相同的所述氧化还原探针与所述第二样品结合制备测试样品,并将所述测试样品暴露于不含分枝菌酸抗原的脂质体;
将所述对照样品与在所述丝网印刷电极上的所述固定分枝菌酸抗原接触,以使得在所述对照样品中的任何抗体结合到所述固定分枝菌酸抗原;
依次将所述测试样品与相同的所述丝网印刷电极上的所述固定分枝菌酸抗原接触,不需要电极再生,以使得在所述测试样品中的任何抗体结合到所述固定分枝菌酸抗原;以及
在所述丝网印刷电极与所述对照样品进行接触和所述丝网印刷电极与所述测试样品进行接触之间,无需对所述丝网印刷电极进行任何洗涤步骤以去除未结合抗体或低亲和力抗体,通过电化学阻抗谱比较所述对照样品和所述测试样品中的抗体结合到所述固定分枝菌酸抗原的程度或范围,观察到的由所述对照样品示出的任何较低的结合,例如约50%的差异,是所述样品中存在针对所述分枝菌酸抗原的抗体的指标。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述分枝菌酸抗原是从所述结核分枝杆菌中提取的,并且所述抗体是抗所述结核分枝杆菌的抗体,或抗其分枝菌酸组分的抗体。
9.根据权利要求7所述的方法,其中所述分枝菌酸抗原为同源化合物或非同源化合物的混合物的形式。
10.根据权利要求7所述的方法,其中所述样品选自血液样品、脊髓液样品和天然地含有抗体的样品。
11.根据权利要求7所述的方法,其中所述样品是来自HIV阳性的人类或动物。
12.根据权利要求7所述的方法,其中暴露对照样品和测试样品到脂质体包括将所述对照样品与含分枝菌酸抗原的脂质体预培养和将所述测试样品与不含分枝菌酸抗原的脂质体预培养。
13.一种在24小时内检测样品中分枝菌酸抗原的低亲和力替代标记物抗体存在的试剂盒,所述试剂盒包括:
一个或多个丝网印刷电极,所述丝网印刷电极含有固定的结核分枝杆菌来源的分离的分枝菌酸抗原或其合成的类似物,其结合到硫醇化的疏水性物质的自组装单层涂层,其中所述硫醇化疏水性物质是长链烷硫醇,
所述结核分枝杆菌来源的分离的分枝菌酸抗原或其合成的类似物,
至少一种缓冲液形成试剂,
至少一种氧化还原探针形成试剂,和
至少一种脂质体形成试剂。
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