TWI569007B - 基於導電高分子之導電度變化的電阻式膽固醇感測器及其測量方法 - Google Patents

基於導電高分子之導電度變化的電阻式膽固醇感測器及其測量方法 Download PDF

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Description

基於導電高分子之導電度變化的電阻式膽固醇感測器及 其測量方法
本發明係關於一種膽固醇感測器，特別是一種基於導電高分子之導電度變化的電阻式膽固醇感測器。
由於異常膽固醇值可顯示臨床疾病(例如：心臟疾病、高血壓、動脈硬化及腦血栓等)，因此膽固醇檢測已吸引不少注意。依據世界衛生組織所公佈的報告顯示，2008年全球估算有17.3萬人死於心血管疾病，並且每年的死亡人數不斷地增加。監測膽固醇值的血液是至為關鍵的，藉此可估計心腦血管疾病的潛在風險並防止由於這些疾病所造成的死亡。許多研究持續致力於膽固醇感測器之發展。
另外，對低價及拋棄式電子膽固醇感測器定點照護的健康監測的需求日益增加。電子生物感測器，例如電化學、場效應晶體管式或阻性生物感測器，得益於成熟的微製造技術因此價格便宜並且體積小。因此，其有可能被開發為小型化及拋棄式且具有高靈敏度及快速響應的電子微感測器，其可以檢測典型生理環境中的膽固醇值以達成常規監測。
大多數電化學感測器是以伏安法檢測膽固醇，其中膽固醇氧化酶被固定在電極並氧化膽固醇為膽甾烯酮(cholestenone)。氧化態的膽固醇氧化酶藉由電極被氧化，因此及酵素反應的催化作用可以繼續。使用不同的電極材料以提高電荷轉移速率，或以更有效率地固定膽固醇氧化酶(ChOx)。
多壁碳奈米管(Multiwall carbon nanotubes，MWCNT)、導電聚合物-MWCNT複合物，MWCNT/屏蔽印刷碳電極(SPCE)、導電聚合物、石墨烯或奈米結構金屬氧化物(例如氧化鋅奈米柱(NRs)、氧化鋅奈米球、銳鈦型二氧化鈦及SnO2奈米顆粒)被報導為可提高電荷轉移率或ChOx固定效率的電極材料。ChOx-固定的ZnO NR開閘場效應晶體管(FET)亦被報導能夠靈敏地檢測膽固醇。
然而，電化學感測器及FET式感測器相較於電阻式生物感測器在感測器設計或測量系統方面會更加地複雜。電阻式感測器展現導電度變化，其直接正比於膽固醇值，因此就裝置製造及訊號測量而言更為簡單。因此，如何開發用以檢測膽固醇的電阻式生物感測器是目前極需努力目標。
本發明之目的之一是開發簡單、具成本效益及高靈敏度的電阻式膽固醇感測器。
依據本發明之一實施例，一種電阻式膽固醇感測器，包含：一基材、一導電高分子層、有一膽固醇氧化酶層及一感測元件。導電高分子層設置於基材上並具有一辣根過氧化物酶設置於其上，以及導電高分子層之材料為一導電高分子，其中導電高分子被氧化後其導電度會降低。膽固醇氧化酶層設置於導電高分子層上並具有一膽固醇氧化酶，其中膽固醇氧化酶與導電高分子層為分 離設置。感測元件與導電高分子層電性連接，且感測元件測量導電高分子層之導電度。
依據本發明之另一實施例，使用上述電阻式膽固醇感測器的膽固醇測量方法，包括：提供上述電阻式膽固醇感測器；施加具有膽固醇之一液體樣本至膽固醇感測器，以使液體樣本至少覆蓋導電高分子層及膽固醇氧化酶層，從而通過膽固醇及膽固醇氧化酶反應產生過氧化氫，所生成的過氧化氫可以氧化辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶通過氧化導電高分子進行還原，從而導致導電高分子的導電度下降；以及計算液體樣本之膽固醇濃度，其係基於導電高分子層在施加液體樣本前後之一導電度下降率。
以下藉由具體實施例配合所附的圖式詳加說明，當更容易瞭解本發明之目的、技術內容、特點及其所達成之功效。
1‧‧‧基材
2‧‧‧導電高分子層
3‧‧‧第一電極
4‧‧‧第二電極
5‧‧‧膽固醇氧化酶層
6‧‧‧過氧化物酶
7‧‧‧膽固醇氧化酶
圖1a顯示本發明一實施例之電阻式膽固醇感測器。
圖1b顯示使用PANI之電阻式膽固醇感測器。
圖1c顯示鍍有PANI之電阻式感測器照片之頂視圖。
圖2a至2f分別顯示5μl的100mg/dL、150mg/dL、200mg/dL、250mg/dL、300mg/dL及400mg/dL水溶性膽固醇之即時檢測，以未使用過的感測器在100毫伏恆定偏壓下操作。
圖3a顯示以未使用過的感測器測量每一膽固醇濃度(包括100mg/dL、150mg/dL、200mg/dL、250mg/dL、300mg/dL及400mg/dL)所得到的導電度變化平均百分比及及誤差棒(標準差)。
圖3b顯示無ChOx固定的電阻式感測器測試之即時測量。
請參照圖1a，本發明之電阻式膽固醇感測器包含一基材1、一導電高分子層2、一膽固醇氧化酶層5、一第一電極3及一第二電極4。導電高分子層2設置於基材1上並具有過氧化物酶6設置於其上。過氧化物酶6可包括但不限於辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)、乳過氧化物酶(lactoperoxidase)或微過氧化物酶(microperoxidase)。導電高分子層2之材料為一導電高分子。本發明之導電高分子可包含聚乙炔(polyacetylene)、聚吡咯(polypyrrole)、聚聯苯(polyparaphenylene)、聚噻吩(polythiophene)、聚呋喃(polyfuran)、聚苯並噻吩(polythianaphthene)或聚苯胺(polyaniline,PANI)。導電高分子之表面可以丙烷磺內酯(propane sultone)修飾。
膽固醇氧化酶層5設置於基材1上並具有一膽固醇氧化酶(cholesterol oxidase,ChOx)7，其中膽固醇氧化酶7與導電高分子層2為分離設置。感測器的簡單製程使得感測器具有成本效益並可作為拋棄式使用。
在一實施例中，膽固醇氧化酶可被其他氧化酶所取代以檢測其他待測物。其他氧化酶包含但不限於葡萄糖氧化酶、乙醇氧化酶(alcohol oxidase)等。
在本發明中，基材之材料並未特別限制。此外，第一電極及第二電極之材料及大小並未特別限制，只需便於導電及量測即可。導電高分子層之導電度可由一感測元件(圖未示)測量，其中感測元件與導電高分子層電性連接。
在一具體實施例中，成本效益且高度敏感的膽固醇感測器，其由膽固醇氧化酶(cholesterol oxidase,ChOx)、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)及聚苯胺(polyaniline,PANI)所組成，基於具有快速響應之酵素誘發之聚苯胺導電度變化。在施加一液體樣本後，通過膽固醇及ChOx反應產生過氧化氫， 其中ChOx是被固定於透析膜之中。所生成的過氧化氫可以氧化HRP，HRP通過氧化PANI進行還原，從而導致聚苯胺薄膜的導電度下降。還原態HRP可由過氧化氫再次被氧化，以及氧化/還原之循環繼續進行，直到所有的過氧化氫進行反應，從而因為所有過氧化氫分子所貢獻的訊號而得到高靈敏度的感測器。
本發明之電阻式膽固醇感測器的反應如下列所示。
其中PANI(re)及PANI(ox)分別代表還原態及氧化態PANI薄膜。在本發明中，第一反應式之過氧化氫產生及第二反應式之PANI氧化都是自發性的。因此，並無必要對施加任一外部偏壓來觸發任一氧化或還原反應(這是大多數電化學感測器在進行感測時所需)，因此可避免因外部偏壓導致非必要的氧化或還原反應所造成的任何干擾。同時，此感測器的訊號測量非常容易及簡單。
在一實施例中，膽固醇感測器所檢測的膽固醇為接近100mg/dL到400mg/dL之生理濃度範圍。結果顯示膽固醇值與PANI導電度變化的線性關係。PANI導電度在施加膽固醇前後之下降率可為10%至60%，較佳者為20%至50%。當PANI為單獨存在而無固定的膽固醇氧化酶之時，此微感測器顯示未與膽固醇反應，這說明膽固醇檢測必需要酵素反應。
最後計算液體樣本之自由基濃度，其係基於導電高分子層2在施加液體樣本前後之導電度下降率。其中導電高分子層2之導電度可分別測量為導電高分子層之一第一導電度、一第二導電度，其中第一導電度為導電高分子層在施加具有自由基之液體樣本之前的導電度，以及第二導電度為導電高分子層在施加具有自由基之液體樣本之後的導電度。導電度下降率為基於第一導電度及 第二導電度之變化率。舉例而言，導電度下降率為第一導電度與第二導電度之差值除以第一導電度。
在一實施例中，導電高分子層之第一導電度及第二導電度之測量係藉由施加一偏壓至導電高分子層並測量導電高分子層之電流而取得。其中導電高分子層電性連接第一電極及第二電極，偏壓係施加至第一電極及第二電極。
本發明採用超靈敏過氧化氫微感測器，其使用辣根過氧化物酶(HRP)固定於聚苯胺(PANI)來檢測過氧化氫。過氧化氫可以氧化HRP，及再氧化的HRP可被還原以再次氧化高導通的PANI薄膜。PANI提供一個可供HRP直接電化學還原的有效表面。氧化態PANI顯示為導電度降低。上述的高靈敏度有賴於PANI的累積導電度變化，其是經由HRP催化作用使PANI自發地消耗掉所有的過氧化氫分子。
為了安置這兩種反應，首先PANI旋塗於Si3N4/Si基板上的Au電極，隨後丙烷磺內酯修飾(N-烷基化PANI)，以確保其在中性溶液中具有高導電度，然後以HRP固定。接著置放ChOx固定之透析膜於HRP-固定PANI之旁邊以進行膽固醇檢測。
此感測器之高靈敏度歸因於酵素訊號放大，其是藉由累積PANI薄膜的導通變化。此外，感測器只需要很小的樣本量。所開發的膽固醇感測器具有優勢，例如低成本、小尺寸、快速響應及容易操作，這使得它成為日常個人醫療保健監控的良好選擇。
以下通過具體實施例配合附圖詳加說明，可更容易瞭解本發明的目的、技術內容、特點及所達成的功效，並據以實施，但不能以此限定本發明的保護範圍。
聚苯胺翠綠亞胺(emeraldine)基底是購自Sigma-Aldrich公司。0.3克聚苯胺翠綠亞胺基底粉末溶解於5ml雙甲基亞碸(DMSO)，並攪拌6小時。接著聚苯胺溶液與相同體積0.5M硫酸混合，反應24小時。硫酸可提高PANI薄膜的導電度及穩定性。此後，滴1.5μl PANI溶液於一微晶片上並以1600處轉30秒，接著於大氣中以60℃烘烤30分鐘。
微感測器是由兩個金屬電極所組成，其是由200埃的Ti及1000埃的Au以電子束蒸發器沉積於Si3N4/矽基板之上。金電極的範圍及寬度分別為500μm及100μm。兩個金屬電極之間的分隔為10μm。通過測量裝置的電流-電壓特性，PANI/金界面被確認為具有電阻。鍍有PANI的裝置維持在-0.2V 10分鐘，然後以DI水清洗，接著再浸入1.2M NaOH溶液之中20分鐘。此裝置接著用氮氣乾燥。將丙烷磺內酯中滴加於PANI薄膜之上，並使其等待8小時。此裝置然後用DI水清洗以除去過量的丙烷磺內酯。
HRP及1,4-二胺基苯(1,4-diaminobenzene)均購自Sigma-Aldrich公司。HRP酵素是以具有25mM之1，4-二胺基苯的120單位cm-3的檸檬酸磷酸緩衝液(pH=5.5)進行製備。已製備的裝置接著被置放於HRP酵素溶液中20分鐘，隨後施加0.4V進行4分鐘。然後用緩衝液洗滌感測器，以除去未結合的HRP。
ChOx溶液是以磷酸鹽緩衝液(Phosphate Buffer Saline,PBS)(pH=7.0)製備為22單位/ml。ChOx(貨號9028-76-6)是購自Sigma-Aldrich公司。接著將一片透析膜(2mm x 2mm)浸泡於ChOx溶液中4℃、24小時。接著將ChOx固定之透析膜置放於晶片上的HRP-固定的PANI薄膜的一旁。在膽固醇檢測期間，溶液能夠包覆透析膜及HRP-固定PANI兩者。
在室溫下測量感測器在0.1V直流偏壓下的電流大小，其係使用Agilent B1500款測試計分析計，其中透析膜及PANI層暴露於膽固醇溶液。以檸 檬酸PBS緩衝溶液製備的不同濃度膽固醇(pH值=7.0)直接滴到未使用過的感測器並分別測量其電流。
水溶性膽固醇是購自Sigma-Aldrich公司。以未使用過的感測器測試5μl的生理濃度膽固醇，包括100mg/dL、150mg/dL、200mg/dL、250mg/dL、300mg/dL及400mg/dL。
圖1b顯示電阻式膽固醇感測器及酵素反應之示意圖。圖1c顯示膽固醇感測器圖式之頂視圖，其中感測元件為一探針。此外亦進行對照組實驗，其是將沒有ChOx的透析膜置放在HRP-固定的PANI之一方並以數滴400mg/dL膽固醇溶液在相同pH值及直流偏差下測試，藉以確認PANI的導電度變化只有在膽固醇氧化酶存在下通過酵素反應時發生。
圖2a、2b、2c、2e、2e及2f分別顯示5μl的100mg/dL、150mg/dL、200mg/dL、250mg/dL、300mg/dL及400mg/dL水溶性膽固醇之即時檢測，以未使用過的感測器在100毫伏恆定偏壓下操作。感測器的電流是以每分鐘方式測量。在膽固醇溶液加入感測器之前，所測量的電流表現出非常好的穩定性。
當膽固醇溶液加入時，僅在1分鐘之內，電流迅速降低及維持穩定，表現出電阻式膽固醇感測器的快速響應。電阻式膽固醇感測器的快速響應是由於兩個酵素反應的高反應速率。此外，由於對膽固醇溶液覆蓋ChOx固定之透析膜及HRP固定之PANI兩者，因此由透析膜區域所產生的過氧化氫需要擴散到HRP固定之PANI的區域。
由於檢測中使用的膽固醇樣本溶液僅需小體積(5μl)，過氧化氫擴散時並不需要花費太長的時間。每個未使用過的感測器測量所有膽固醇濃度每次所需要的響應時間不到1分鐘，這對於實際應用而言是可接受的。每個濃度的膽固醇以四個未使用過的感測器進行測量。
圖3a顯示以未使用過的感測器測量每一膽固醇濃度(包括100mg/dL、150mg/dL、200mg/dL、250mg/dL、300mg/dL及400mg/dL)所得到的導電度變化平均百分比及及誤差棒(標準差)，分別為28.17%(1.26%)、33.37%(1.23%)、37.31%(1.79%)、42.76%(1.26%)、48.92%(2.41%)及5772%(0.51%)。
微感測器的導電度變化顯示其與膽固醇值具有非常好線性相關，如圖3a所示，代表感測器響應具有很不錯的線性關係。此電阻式膽固醇感測器的靈敏度為每mg/dL膽固醇00985%，這是由適配導電度下降率的平均百分比與膽固醇值的線性回歸線的斜度所得出數字。
線性回歸的R2為0.99934，說明相對良好的適配以及從而得到可靠的校正曲線。適配導電度變化平均百分比的良好線性回歸及數個微感測器的微小誤差棒顯示不同感測器之間的良好均勻度，這代表感測器製造處理程序具有極佳的可重複性及穩定性。此結果顯示於生理膽固醇值範圍內，因此感測器具有非常高的靈敏度。此感測器之高靈敏度歸因於酵素訊號放大，其是藉由累積每一反應物所造成的導通變化。
此外亦以無ChOx固定的感測器測試即時測量，其中連續滴以5ul的400mg/dL膽固醇如圖3b所示。結果顯示在沒有ChOx固定的感測器上每滴5μl的膽固醇溶液並未產生顯著電流變化，這驗證了在不存在ChOx的情形下，感測器不與膽固醇響應。因此可以得出這樣的結論，PANI之氧化僅發生於ChOx及HRP都存在的情形之下，因此，代表酵素反應在整個感測處理程序中都是必要的。
總而言之，將膽固醇氧化酶固定之透析膜及辣根過氧化物酶固定之導電聚合物(聚苯胺)整合在一起，使得微感測器可用於檢測生理濃度的膽固醇(在pH=7.0下從100mg/dL到400mg/dL)。過氧化氫是由膽固醇及氧氣反應之間的 反應(經由膽固醇氧化酶催化)產生。產生的過氧化氫進一步與高導通的PANI反應(通過HRP催化)，導致PANI的導電度降低。
本發明之電阻型感測器已被驗證為膽固醇檢測的非常有用且簡單的開發平台。上述的膽固醇感測器顯示出良好的電流穩定性，快速響應(小於1分鐘)，高靈敏度及良好線性。此感測器還具有許多優勢，例如低成本、小尺寸及容易操作，其可以作為製造達成常規個人監測膽固醇值的便攜及拋棄式裝置。
以上所述之實施例僅是為說明本發明之技術思想及特點，其目的在使熟習此項技藝之人士能夠瞭解本發明之內容並據以實施，當不能以之限定本發明之專利範圍，即大凡依本發明所揭示之精神所作之均等變化或修飾，仍應涵蓋在本發明之專利範圍內。
1‧‧‧基材
2‧‧‧導電高分子層
3‧‧‧第一電極
4‧‧‧第二電極
5‧‧‧膽固醇氧化酶層
6‧‧‧過氧化物酶
7‧‧‧膽固醇氧化酶

Claims (11)

  1. 一種電阻式膽固醇感測器，包含：一基材；一導電高分子層，其設置於該基材上並具有一過氧化物酶設置於其上，以及該導電高分子層之材料為一導電高分子，其中該導電高分子被氧化後其導電度會降低；一膽固醇氧化酶層，其設置於該導電高分子層上並具有一膽固醇氧化酶，其中該膽固醇氧化酶與該導電高分子層為分離設置；及一感測元件，其與該導電高分子層電性連接並用以測量該導電高分子層之導電度。
  2. 如請求項1所述之電阻式膽固醇感測器，更包含一第一電極及一第二電極，其中該導電高分子層電性連接該第一電極及該第二電極。
  3. 如請求項1所述之電阻式膽固醇感測器，其中該導電高分子包含聚乙炔(polyacetylene)、聚吡咯(polypyrrole)、聚聯苯(polyparaphenylene)、聚噻吩(polythiophene)、聚呋喃(polyfuran)、聚苯並噻吩(polythianaphthene)或聚苯腔(polyaniline,PANI)。
  4. 如請求項1所述之電阻式膽固醇感測器，其中該導電高分子為聚苯胺。
  5. 如請求項1所述之電阻式膽固醇感測器，其中該導電高分子之表面以丙烷磺內酯修飾。
  6. 如請求項1所述之電阻式膽固醇感測器，其中該膽固醇氧化酶層包含一透析膜，以及該膽固醇氧化酶設置於該透析膜之中。
  7. 如請求項1所述之電阻式膽固醇感測器，其中該過氧化物酶包括辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)、乳過氧化物酶(lactoperoxidase)或微過氧化物酶(microperoxidase)。
  8. 一種使用請求項1至7之任一之電阻式膽固醇感測器的膽固醇測量方法，包括：提供該電阻式膽固醇感測器；施加具有膽固醇之一液體樣本至該電阻式膽固醇感測器，以使該液體樣本至少覆蓋該導電高分子層及該膽固醇氧化酶層，從而通過膽固醇及膽固醇氧化酶反應產生過氧化氫，所生成的過氧化氫可以氧化辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶通過氧化導電高分子進行還原，從而導致導電高分子的導電度下降；以及計算該液體樣本之膽固醇濃度，其係基於該導電高分子層在施加該液體樣本前後之一導電度下降率。
  9. 如請求項8所述之膽固醇測量方法，更包含：測量該導電高分子層之一第一導電度、一第二導電度，其中該第一導電度為該導電高分子層在施加具有膽固醇之該液體樣本之前的導電度，以及該第二導電度為該導電高分子層在施加具有膽固醇之該液體樣本之後的導電度，以及該導電度下降率為基於該第一導電度及該第二導電度之變化率。
  10. 如請求項9之膽固醇測量方法，其中該導電高分子層之該第一導電度及該第二導電度之測量係藉由施加一偏壓至該導電高分子層並測量該導電高分子層之電流而取得。
  11. 如請求項8述之膽固醇測量方法，其中該液體樣本為一血液樣本。
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