CN101936992A - 快速检测大肠杆菌的方法及所用到的微流控芯片及其制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测大肠杆菌的方法，包括以下步骤：先用羊抗大肠杆菌抗体标记功能化荧光纳米颗粒，然后将其添加到待测样品中，使待测样品通入到微流控芯片中，用信号供给系统在芯片中提供相应的频率与电压，并在一定流速下观察记录电极附近的荧光信号，最后据此判断待测样品中是否含有大肠杆菌及其浓度大小。本发明用到的微流控芯片包括贴合成一体的基片与盖片，其间设有毛细管通道，通道两端分别连接盖片上的进样口和出样口，通道内装设有对铂电极。本发明的方法具有特异性好、灵敏度高、成本低、速度快、选择性和适应性强等优点。

Description

快速检测大肠杆菌的方法及所用到的微流控芯片及其制备工艺

技术领域

本发明涉及一种病原菌检测技术，尤其涉及一种大肠杆菌的检测方法及检测用芯片及其制备方法。

背景技术

在人类社会的发展历程中，疾病自始至终扮演着对人类生存繁衍具有最大威胁的杀手角色。而各种病原菌对食物、水体、环境空气和土壤等污染所引发的疾病严重危害着人类的健康。目前，常见病原菌的检验方法存在着检测周期长、工作量大、所需试剂多，而且假阴性率高，灵敏度低，或假阳性率高，特异性差等缺点。因此，建立快速、简便、准确、特异地病原菌检测方法对于人类感染性疾病的预防、早期诊断和正确治疗，对传染病暴发与流行的有效管理和控制以及减少工、农、畜、牧、渔业中病原菌感染所导致的经济损失等方面都具有重要的意义。

传统的病原菌检测方法是建立在对病原菌的选择性培养和标准生化分析之上。对某些病原菌而言，传统的培养法具有较高的灵敏度和选择性，例如，结核杆菌培养法被誉为结核病诊断的“黄金标准”。然而，传统的培养法也存在严重的不足：（1）细菌培养的方法操作繁琐且非常耗时（一般需几天到数周），而且不能同时检测多种病原菌；（2）病原菌的浓度往往较低，会在取样和计数上出现失误；（3）不适于检测一些难以或无法进行人工培养的病原菌。为此，各种病原菌的快速诊断方法与传感技术陆续发展起来，包括有：基于分子生物学的方法（分子诊断技术），如核酸放大试验（nucleic acid amplification tests，NAA tests）、DNA探针等；基于免疫学的方法（血清学诊断技术），如酶联免疫吸附分析、免疫色谱分析、乳胶凝集试验等；基于电化学与电测量技术的电化学生物传感技术，如阻抗生物传感器、电位生物传感器、安培生物传感器等；基于光学测量原理发展的光纤生物传感器和表面等离子体共振生物传感器以及流式细胞术等。这些方法在缩短检测时间、提高检测灵敏度和准确性等方面作出了重要贡献。然而，随着检测样品复杂性程度的提高以及检测任务紧迫性的增强，现有病原菌检测传感技术依然面临了严峻的挑战。生物医学、物理学、材料科学和分析化学等领域新技术的出现为现有病原菌检测传感技术提供了新的契机。例如纳米技术的发展，微流控技术，介电泳技术的融入，这些都有望突破传统病原菌检测传感技术的模式，使病原菌的检测方法朝着快速、灵敏、简捷方便和自动化的方向发展。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种特异性好、灵敏度高、成本低、速度快、选择性和适应性强的快速检测大肠杆菌的方法，同时还提供一种该方法中用到的结构简单的微流控芯片，以及该芯片的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种快速检测大肠杆菌的方法，包括以下步骤：先用羊抗大肠杆菌抗体标记功能化荧光纳米颗粒，然后将标记抗体后的功能化荧光纳米颗粒添加到待测样品中，并使待测样品通入到微流控芯片中，使用信号供给系统在所述微流控芯片中提供相应的频率与电压，并在一定流速下观察记录电极附近的荧光信号，最后根据荧光信号的强弱判断待测样品中是否含有大肠杆菌或者测定出待测样品中大肠杆菌的浓度大小。

本发明提出的上述技术方案采用功能化荧光纳米颗粒标记技术与介电泳富集技术相结合，其基本原理是：先制备出功能化的荧光纳米颗粒，再利用该荧光纳米颗粒表面的功能化基团标记上待测大肠杆菌抗体，如果待测样品中含有大肠杆菌，则标抗后的荧光纳米颗粒将通过其外表面标记的大肠杆菌抗体与目标大肠杆菌进行特异性结合，再通过使用微流控芯片中的介电泳装置可使得结合了功能化荧光纳米颗粒的目标大肠杆菌在微流控芯片中表现出正介电泳行为，并使目标大肠杆菌在电场强度高的区域聚集（即微流控芯片中的铂电极周围聚集），目标大肠杆菌结合的荧光纳米颗粒所携带的荧光信号可被显微成像系统（例如倒置荧光显微镜）所观察记录，从而实现对大肠杆菌的快速检测；待测样品中存在的非目标物质（例如未结合目标大肠杆菌的荧光纳米颗粒）则不会产生正介电泳行为，也不会被电场捕获，这些非目标物质将被水冲走，从而保证了检测结果的灵敏度和准确性。

上述的各技术方案中，所述检测对象大肠杆菌主要是指对人体具有致病性的几类大肠杆菌，其中优选是指肠出血性大肠杆菌（EHEC），根据检测对象的不同，所选用的大肠杆菌抗体作适应性调整即可，例如大肠杆菌O6的检测可选用兔抗肠致病性大肠杆菌O6抗体；大肠杆菌 DH5α的检测可选用兔抗大肠杆菌DH5α多克隆抗体；大肠杆菌 K12的检测可选用鼠抗大肠杆菌 K12抗体。根据我们反复实验的结果，本发明的技术方案特别优选适用于大肠杆菌O157︰H7（E. coli O157︰H7），相应的大肠杆菌抗体则选用羊抗大肠杆菌抗体即可。与此相类似的，本发明的技术方案甚至可用于大肠杆菌以外的其他革兰氏阴性致病菌的检测，例如沙门氏菌的检测对应选用沙门氏菌特异性抗体，百日咳杆菌对应选用Bordetella pertussis-百日咳杆菌IgM抗体检测试剂，霍乱弧菌对应选用小鼠单克隆IgA抗霍乱弧菌抗体，伤寒杆菌对应选用伤寒杆菌 IgM 抗体，痢疾杆菌对应选用志贺氏痢疾杆菌单克隆抗体等。

上述的各技术方案中，所述功能化荧光纳米颗粒优选是指SiO₂外壳内包裹钌吡啶染料的纳米颗粒，且SiO₂外壳表面修饰有用于接枝所述羊抗大肠杆菌抗体的羧基。该功能化荧光纳米颗粒优选采用以下方法进行制备：先将10体积的环己烷、2.0～2.6体积的表面活性剂和2.0～2.4体积的正己醇混合均匀，向混匀后的混合液中加入0.1～0.13体积的0.1M钌吡啶染料和0.5～1体积的水，搅拌均匀后形成反相微乳液；向该反相微乳液中加入氨水和0.13～0.27 体积的正硅酸乙酯，反应一段时间后加入0.02～0.05 体积的N-（丙基三甲氧基硅烷）-乙二胺-三乙酸钠，反应完全后得到羧基化的包裹钌吡啶染料的二氧化硅纳米颗粒微乳液体系；然后加入乙醇破乳，离心收集纳米颗粒，洗涤后制得上述的功能化荧光纳米颗粒（即羧基化的包裹钌吡啶染料的二氧化硅纳米颗粒）。

上述的各技术方案中，需要在功能化荧光纳米颗粒的羧基上接枝有具有对大肠杆菌（例如E.coli.O 157︰H7）特异性识别的羊抗大肠杆菌抗体。该功能化荧光纳米颗粒表面修饰羊抗大肠杆菌抗体的优选方法是：取1ml功能化荧光纳米颗粒，12000 rpm离心10min，去上清，加入MES缓冲液超声分散，离心冲洗一次后加入1ml的MES缓冲液，再加入N-羟基琥珀酰亚胺（即NHS）、1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺碳化二亚胺（即EDC），恒温摇床共孵育，再加入浓度为1mg/ml羊抗大肠杆菌抗体，恒温摇床共孵育2h，12000rpm离心10min，去上清，加入1ml去离子水中，再加入1%的牛血清蛋白（BSA）封闭，12000rpm离心10min，去上清，充分分散在1ml去离子水中后放入4℃冰箱以备用。

在本发明的上述各技术方案中，由于使用信号供给系统在微流控芯片中提供了相应的频率与电压的正弦交流电，这使得微流控芯片主通道的电极附近存在非匀强电场，电极周围及其间隙电场强度较强，结合了标抗功能化荧光纳米颗粒的目标大肠杆菌进入交流电场后会被诱导产生极化，从而产生定向移动，因此通过调整供给的频率与电压，可使目标大肠杆菌在电极周围富集而其他非目标物质则不会产生正介电泳行为。经过我们反复的优化实验，所述信号供给系统优选为函数波形发生器，其提供的频率优选为250KHz～1MHz（最优选500KHz），其提供的电压优选为8.5V_p-p～10V_p-p（最优选8.5V_p-p）；所述微流控芯片中的流速优选控制在0.2μL/min～ 0.6μL/min（最优选0.6μL/min）。

在本发明的上述各技术方案中，还需要用到微流控芯片，作为一个总的技术构思，本发明还提供一种优选的微流控芯片：所述微流控芯片包括贴合成一体的两块板状物，这两块板状物分别是微流控芯片的基片与盖片，在所述基片与盖片之间设有毛细管通道，所述毛细管通道的两端分别连接盖片上的进样口和出样口，所述毛细管通道内还设有对铂电极。

上述的微流控芯片中，所述毛细管通道的宽度优选为80μm～90μm，深度为20μm～30μm；所述对铂电极的长度为75μm～80μm，对铂电极之间的间隔宽度为15μm～25μm；所述进样口和出样口的孔径优选为1.8mm～2.2mm。

作为一个总的技术构思，所述微流控芯片的制作方法优选包括以下步骤：

1）盖片的制作：将聚二甲基硅氧烷前聚体和固化剂混合均匀得到PDMS体系，真空脱泡后，将PDMS体系浇注在预制好的硅质阳模板上，烘干、固化后取出，自阳模板剥离得到PDMS盖片；

2）基片的制作：利用光刻技术中的去胶工艺（life-off工艺）在玻片上沉积铂微电极，即先在一玻片基底涂上光刻胶，经过曝光、清洗等步骤在玻片上得到光刻胶模版；为了增强铂电极与基底的粘附力，在基底上沉积一层镍，然后在镍层上沉积一层铂，洗去光刻胶模板后即得到所需的基片；

3）贴合封装：将上述制得的基片和PDMS盖片进行清洗后在显微镜下进行可逆贴合，得到上述的微流控芯片。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

（1）特异性好，选择性强：在标记特异性抗体的功能化荧光纳米颗粒和特定高频交流电场的双重识别下，可以最低限度的限制假阳性信号或者假阴性信号的产生；

（2）速度快，操作简单：在标记有特异性抗体的功能化荧光纳米颗粒识别目标病原菌后，无需进行分离等其他处理步骤，可直接通入微流控芯片中进行检测，操作简单、便捷；

（3）灵敏度高：单个功能化荧光纳米颗粒含有数以千计的荧光分子，因此单个病原菌即可产生很强的荧光信号，再经过交流电场的特异性富集后信号变得更强，极大地提高了本发明检测方法的灵敏度；

（4）成本低，实验费用及仪器便宜：经过电场富集后的荧光信号非常强，可以直接用光电倍增管进行信号检测，且微流控检测芯片可以重复使用；

（5）应用范围广泛、适应性强：同时使用标记不同抗体的功能化荧光纳米颗粒，在使用相同或不同种荧光染料的条件下还可以对多种病原菌进行同时检测（例如由于抗体的特异性、介电泳的选择性、荧光颜色的差异等均可用于区别不同的病原菌），从而大大提高了检测方法的适用范围和应用领域。

附图说明

图1为本发明快速检测大肠杆菌的方法检测原理示意图。

图2为本发明实施例中提供的不同交流电频率对微流控芯片中E.coli.O 157︰H7富集能力影响的考察结果图。

图3为本发明实施例中提供的不同交流电电压对微流控芯片中E.coli.O 157︰H7富集能力影响的考察结果图。

图4为本发明实施例中溶液的不同流速对微流控芯片中E.coli.O 157︰H7富集能力影响的考察结果图。

图5为本发明实施例中在微流控芯片通入不同待测样品的检测结果对比图；其中，a图～d图各幅子图为微分干涉相差DIC的成像图，e图～h图的各幅子图为荧光条件下倒置荧光显微镜中的成像图；而且，a图、e图是空白对照样品的检测结果图，b图、f图为Abs-RuBpy-COOH-SiNP溶液的检测结果图，c图、g图为金黄色葡萄球菌液的检测结果图，d图、h图为E.coli.O 157︰H7待测样品的检测结果图。

图6为本发明实施例中进行E.coli.O 157︰H7检测时测定的相对荧光强度与E.coli.O 157︰H7浓度的对数关系的标准曲线图。

图7为本发明实施例中微流控芯片的立体结构示意图。

图8为图7中P处的局部放大图（俯视）。

图例说明：

1、基片；2、盖片；21、进样口；22、出样口；3、毛细管通道；4、对铂电极。

具体实施方式

实施例：

一种如图1所示的本发明的快速检测大肠杆菌O 157︰H7（简称E.coli.O 157︰H7）的方法，包括以下步骤。

（1）制备功能化荧光纳米颗粒：将环己烷7.5 mL、表面活性剂曲拉通X-100 1.6 mL和正己醇1.6 mL混合均匀，向混匀后的混合液中加入80 μL、0.1M的钌吡啶溶液，400μL水作为分散相，搅拌均匀后形成反相微乳液；向该反相微乳液中加入100μL 氨水和100 μL正硅酸乙酯，反应24 h后得到RuBpy-SiNP微乳液体系；再采用反相微乳液体系中功能化基团同步修饰方法在上述制得的RuBpy-SiNP表面修饰羧基基团，即在上述反应24 h后的RuBpy-SiNP微乳液体系中加入20μL的N-（丙基三甲氧基硅烷）-乙二胺-三乙酸钠，室温搅拌继续反应24h后，加入乙醇破乳，离心收集其中的纳米颗粒，并依次用乙醇、水洗涤收集的纳米颗粒，冷却干燥后制得包裹钌吡啶染料的表面羧基化（COOH-）的二氧化硅纳米颗粒，即本实施例的功能化荧光纳米颗粒（简称RuBpy -COOH-SiNP）。

（2）标记羊抗E.coli.O 157︰H7抗体：通过EDC/NHS交联法对上述制得的RuBpy – COOH- SiNP进行抗体标记，具体操作是：首先，将步骤（1）制得的RuBpy-COOH-SiNP用灭菌水离心清洗一次，再超声分散到灭菌的MES缓冲液中得RuBpy-COOH-SiNP溶液；取1ml功能化荧光纳米颗粒，12000 rpm离心10min，去上清，加入MES缓冲液超声分散，离心冲洗一次后加入1ml的MES缓冲液，再加入N-羟基琥珀酰亚胺（即NHS）、1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺碳化二亚胺（即EDC），恒温摇床共孵育，再加入浓度为1mg/ml羊抗大肠杆菌抗体，恒温摇床共孵育2h，12000rpm离心10min，去上清，加入1ml去离子水中，再加入1%的牛血清蛋白封闭，12000rpm离心10min，去上清，制得本实施例的修饰抗体的功能化荧光纳米颗粒（简称Abs-RuBpy-COOH-SiNP）。

（3）E.coli.O 157︰H7溶液的配制：从二代E.coli.O 157︰H7中取50μL加入到一定LB培养液中，用摇床200r/min、37℃培养3h，培育出三代E.coli.O 157︰H7；从三代E.coli.O 157︰H7中取1mL，8000rpm/min离心5min，去上清，加入1mL灭菌水，洗涤，8000rpm/min离心5min，去上清，加入1mL灭菌水，逐级稀释到合适浓度作为一组待测样品，并用涂板法确定该组待测样品的E.coli.O 157︰H7的浓度值；将上述步骤（2）制得的Abs-RuBpy-COOH-SiNP与逐级稀释得到的这一组E.coli.O 157︰H7溶液以个数比为1︰1000进行混合，在37℃共孵育2h。

（4）工艺参数优化及检测结果考察：将上述步骤（3）共孵育后的某一种待测样品溶液通入到微流控芯片中，用函数波形发生器在微流控芯片中提供相应的频率与电压，并在一定流速下观察记录微流控芯片中对铂电极附近的荧光信号，我们分别以不同频率、不同电压、不同流速三个变量下观察到的荧光信号进行分析、考察和优化。

在函数波形发生器的电压为10V_P-P、流速为0.2μL/min的条件下，我们分别考察了100KHz、250KHz、500 KHz、750KHz、1MHz、5MHz、10MHz不同频率下4.3×10³ cfu/ml E.coli.O 157︰H 7在监测区域的聚集情况，30min后检测其荧光信号的强弱，频率优化结果如图2所示；由图2可见，250KHz～1MHz 条件下均可达到较好的效果，500KHz是最优频率。

在函数波形发生器的频率为500KHz、流速为0.2μL/min的条件下，我们分别考察了10V_P-P、9.5V_P-P、9V_P-P、8.5V_P-P、8V_P-P、7.5V_P-P、7V_P-P、6.5V_P-P不同电压下4.3×10³ cfu/ml E.coli.O 157︰H 7在监测区域的聚集情况，30min后检测其荧光信号的强弱，电压优化结果如图3所示；由图3可见，虽然相对荧光强度为下落趋势，但在10V_P-P～8.5V_P-P之间下落趋势较缓，效果较好，因此可选择8.5V_P-P作为最优电压。

在函数波形发生器的频率为500KHz、电压为8.5 V_P-P的条件下，我们分别考察了0.2μL/min、0.3μL/min、0.4μL/min、0.5μL/min、0.6μL/min、0.7μL/min、0.8μL/min、0.9μL/min、1μL/min不同流速下2.8×10²cfu/ml E.coli.O 157︰H 7在监测区域的聚集情况，30min后检测其荧光信号的强弱，流速优化结果如图4所示；由图4可见，虽然相对荧光强度为下落趋势，但在0.2μL/min～0.6μL/min之间下落趋势较缓，效果较好，因此可选择0.6μL/min作为最优流速。

以上述优化后的工艺参数作为检测条件，即在函数波形发生器的电压为8.5V_P-P、频率为500KHz、流速为0.6μL/min的条件下，分别将一定浓度的Abs-RuBpy-COOH-SiNP、与Abs- RuBpy-COOH-SiNP孵育2h后的2.8×10⁶ cfu/ml金黄色葡萄球菌液以及2.8×10⁶ cfu/ml的 E.coli.O 157︰H 7待测样品分别通入微流控芯片中，稳定一段时间后打开函数波形发生器，20min后在微流控芯片流道中的对铂电极处监测并记录，其结果如图5所示。

由图5中的a图、b图、e图、f图可以看出，空白对照和单纯的Abs-RuBpy-COOH-SiNP颗粒在该频率下不会产生介电泳行为，不会被电极所捕获，从而可有效减少功能化荧光纳米颗粒产生的假阳性信号；由图5中的c图、g图可以看出，金黄色葡萄球菌虽然会产生介电泳行为，会被电极所捕获，但是标抗后的功能化荧光纳米颗粒只是很少的被非特异性吸附在金黄色葡萄球菌表面，因此荧光信号十分微弱；由图5中的d图、h图可以看出，E.coli.O 157︰H7既产生介电泳行为，会被电极所捕获，又被标抗后的功能化荧光纳米颗粒特异性识别并结合到E.coli.O 157︰H 7的表面，因此可检测出很强的荧光信号；由此可见，通过介电泳的特异性富集以及标抗后的功能化荧光纳米颗粒的特异性识别的双重选择可大大降低假阳性信号，并提高检测灵敏度，实现对目标大肠杆菌的检测。

（5）标准曲线的测定：在函数波形发生器的电压为8.5V_P-P、频率为500KHz、流速为0.6μL/min的条件下，进行标准曲线的测定；用微量注射器将一组E.coli.O157︰H7溶液从低浓度到高浓度（浓度分别为：4.2×10¹cfu/ml、1.2×10²cfu/ml 、4.2×10³cfu/ml、4.2×10⁴cfu/ml、4.2×10⁵cfu/ml、4.2×10⁶ cfu/ml）依次通入微流控芯片的一个进样孔中；稳定一段时间后，打开函数波形发生器，当待测样品溶液流经微流控芯片的测试区（即对铂电极所在的区域）时，通过调节电压及频率使其产生正介电泳运动，并使目标大肠杆菌富集在电极周围，80min后在微流控芯片流道的对铂电极处用倒置荧光显微镜的CCD以及图像记录设备监测并记录样品荧光强度的变化，根据所得的数据绘制标准曲线如图6所示。

由图6可以看出，随着E.coli.O 157︰H 7浓度的提高，相对荧光强度不断增大，检测下限约为6.4×10¹cfu/ml；线性相关方程为y = 476668x - 845591，其中x表示待测样品中目标大肠杆菌的浓度C₀的对数值，单位为cfu/ml，y表示荧光强度F₀。

本实施例中用到一种如图7、图8所示的本发明的微流控芯片，该微流控芯片包括贴合成一体的两块板状物，这两块板状物分别是微流控芯片的基片1与盖片2（PDMS盖片），在基片1与盖片2之间设有毛细管通道3，毛细管通道3的两端分别连接盖片2上左侧的进样口21和右侧的出样口22，毛细管通道3内的中段位置还设有对铂电极4。毛细管通道3的宽度D为80μm，深度为20μm；对铂电极4的长度L为75μm，对铂电极之间的间隔宽度A为22.5μm。进样口21、出样口22的孔径为2mm。本实施例微流控芯片中各个尺寸的设计都是根据微流控芯片的大小及液体流速的要求经过反复实验后确定出来的优选方案。

本实施例的微流控芯片是按以下步骤制作：

1）盖片的制作：将聚二甲基硅氧烷前聚体和固化剂按10︰1的质量比混合均匀得到PDMS体系，真空脱除气泡后，将PDMS体系浇注在预制好的SU8硅质阳模板上（阳模板按照上述微流控芯片的结构和尺寸预先制作好），然后置于烘箱中75℃温度下烘干40min左右，固化后取出，自阳模板剥离得到PDMS盖片；

2）基片的制作：利用光刻技术中的去胶工艺在玻片上沉积铂微电极，即先在一玻片基底涂上光刻胶，经过曝光、清洗等步骤在玻片上得到光刻胶模版；为了增强铂微电极与基底的粘附力，在基底上先沉积一层镍，再在镍层上沉积一层铂，洗去光刻胶模板后即得到所需的基片；

3）贴合封装：将上述制得的基片和PDMS盖片分别用丙酮、酒精、超纯水超声清洗20min后，烘干，PDMS用12W、254nm的紫外光灯照射3h，改性，在显微镜下进行可逆贴合，得到本实施例的微流控芯片。

Claims (8)

1.一种快速检测大肠杆菌的方法，包括以下步骤：先用羊抗大肠杆菌抗体标记功能化荧光纳米颗粒，然后将标记抗体后的功能化荧光纳米颗粒添加到待测样品中，并使待测样品通入到微流控芯片中，使用信号供给系统在所述微流控芯片中提供相应的频率与电压，并在一定流速下观察记录电极附近的荧光信号，最后根据荧光信号的强弱判断待测样品中是否含有大肠杆菌或者测定出待测样品中大肠杆菌的浓度大小。

2.根据权利要求1所述的快速检测大肠杆菌的方法，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌O157︰H7。

3.根据权利要求1所述的快速检测大肠杆菌的方法，其特征在于：所述功能化荧光纳米颗粒是指SiO₂外壳内包裹钌吡啶染料的纳米颗粒，且SiO₂外壳表面修饰有用于接枝所述羊抗大肠杆菌抗体的羧基。

4.根据权利要求1或2或3所述的快速检测大肠杆菌的方法，其特征在于：所述信号供给系统为函数波形发生器，其提供的频率为250KHz～1MHz，其提供的电压为8.5V_p-p～10V_p-p；所述微流控芯片中的流速控制在0.2μL/min～0.6μL/min。

5.根据权利要求4所述的快速检测大肠杆菌的方法，其特征在于：所述函数波形发生器提供的频率为500KHz，提供的电压为8.5V_p-p；所述微流控芯片中的流速控制在0.6μL/min。

6.一种用于权利要求1～5中任一项所述的微流控芯片，所述微流控芯片包括贴合成一体的基片与盖片，在所述基片与盖片之间设有毛细管通道，所述毛细管通道的两端分别连接盖片上的进样口和出样口，所述毛细管通道内装设有对铂电极。

7.根据权利要求6所述的微流控芯片，其特征在于：所述毛细管通道的宽度为80μm～90μm，深度为20μm～30μm；所述对铂电极的长度为75μm～80μm，对铂电极之间的间隔宽度为15μm～25μm；所述进样口和出样口的孔径为1.8mm～2.2mm。

8.一种如权利要求6或7所述微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：

（1）盖片的制作：将聚二甲基硅氧烷前聚体和固化剂混合均匀得到PDMS体系，真空脱泡后，将PDMS体系浇注在预制好的硅质阳模板上，烘干、固化后取出，自阳模板剥离得到PDMS盖片；

（2）基片的制作：利用光刻技术中的去胶工艺在玻片上沉积铂微电极，即先在一玻片基底涂上光刻胶，经过曝光、清洗步骤在玻片上得到光刻胶模版；然后在基底上沉积一层镍，在镍层上沉积一层铂，洗去光刻胶模板后即得到所需的基片；

（3）贴合封装：将上述制得的基片和PDMS盖片进行清洗后在显微镜下进行可逆贴合，得到微流控芯片。

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