CN101776610A - 一种病原微生物分析检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种病原微生物分析检测方法，其包含步骤：1)将经抗体修饰的免疫微珠装填于免疫识别/富集腔中；2)将待测样品溶液引入免疫识别/富集腔，被免疫微珠识别、捕获和富集；3)将裂解剂、生物发光试剂分别传输至免疫识别/富集腔中，与富集的病原微生物发生裂解反应和生物发光反应，生成发光复合物；4)用缓冲溶液洗脱步骤3)产生的发光复合物，通过发光检测，分析待测样品中的病原微生物。该方法在同一微流控芯片上实现了病原微生物的分选/富集、内涵物裂解、生物发光反应和定量检测，不仅减少了样品和试剂的消耗量，而且避免了多个分析步骤或过程导致的操作繁琐、分析时间过长和样品损失，提高了分析速度、检测准确度和灵敏度。

Description

一种病原微生物分析检测方法

技术领域

本发明属于微全分析技术在生物分析领域的应用，尤其涉及一种基于微流控芯片技术的病原微生物分析检测方法。

背景技术

强致病性病原微生物往往致病力强，如肠出血性大肠杆菌O157:H7(E.coli O157:H7)的最低感染剂量可少于10个病原菌。因此，发展对环境、食品和临床标本中病原微生物的快速、灵敏、特异的分析检测方法是人类社会预防传染性疾病扩散，确保人类健康的迫切需要。目前，常规的病原微生物检测方法主要有培养法、免疫学检测法和分子生物学法，且都因其自身研究手段的局限性而存在许多不足：传统的细菌培养法和生化鉴定法特异性低、耗时费力、对培养环境和操作人员要求严格，不适宜病原菌的快速检测。免疫学检测方法，如酶联免疫吸附试验(ELISA)、生物发光免疫分析法、免疫胶体金技术等一般需要提供数量较多的纯化细菌，或需对样品进行浓缩富集，同样难以在短时间内获得检测结果。PCR及其相关技术虽具有高度的特异性和灵敏度，但由于方法过度敏感，在检测过程中，因为样本污染、RNA非法转录、靶RNA低水平表达、引物设计不合理以及实验条件未优化、取材的局限等常常出现假阳性或假阴性结果。

相对于现有检测技术的缺陷，20世纪90年代初期出现的微流控芯片技术以其高度的集成化、微型化、分析手段的多样化、分析速度快、准确度高等特点，在技术上呈现出独特的优势，适合病原微生物快速检测的多项要求：首先，微流控芯片系统具有多种操作单元灵活组合、整体可控和规模集成的特点，可将整个病原微生物的样品处理和检测分析过程整合在一块芯片上；第二，通过MEMS加工，可以很容易的在芯片上刻蚀密集的分析通道阵列，大大增加了分析通量，并且芯片每一通道之间均相互独立，避免了样本的交叉干扰，分离分析过程完全在一个相对密闭的通道中进行，降低了操作者被感染的危险性。第三，鉴于芯片微通道的结构(微升级或纳升级)，微尺度下的高比表面积，流体传质、传热快，有效地降低了样品和试剂的消耗量，大大缩短整个分析时间，达到快速分析的目的。因此，利用微流控芯片技术进行微生物研究越来越受到人们的重视。

目前，经过十多年的发展，各种基于微流控技术开展的病原微生物预处理(Inami H，et al.Biosens Bioelectron.2009，24(11)：3299-3305；KulinskiMD，et al.Biomed Microdevices.2009，11(3)：671-678.)、富集/分选(Bao N，et al.J Chromatogr A，2008，1181(1-2)：153-158；Qiu J，et al.Talanta.2009，79(3)：787-795.)以及分离检测(Lee SJ，et al.Sensors and ActuatorsB，2008，132(2)：443 448；Zordan MD，et al.Cytometry A.2009，75(2)：155-162.)的新方法不断涌现。但现有的技术和方法主要是针对病原微生物分析检测中的某一单元或步骤，如富集/分选、预处理或分离检测展开的，即通常检测需要分几次完成，有大量的操作误差积累，且存在分析时间过长和样品损失大，有检测误差大、时间长、检测时消耗的药品和试剂量大等缺点。

因此，在同一微流控芯片上实现病原微生物的分选/富集、内涵物裂解、生物发光反应和检测一步完成的检测方法，是目前亟待即将的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种病原微生物分析检测方法，简化现有技术中病原微生物的分析检测过程，降低样品用量和试剂耗量，避免多个分析步骤或过程导致的操作繁琐、分析时间过长和样品损失，提高检测准确度和灵敏度。

本发明所述的病原微生物分析检测方法主要包含步骤：

1)取用于病原微生物检测的微流控芯片进行检测，所述微流控芯片包括盖片和基片，盖片和基片封接贴合，盖片上设置有两条流体传输通道、六边形免疫识别/富集腔、生物发光检测单元和两个储液池，免疫识别/富集腔的两端分别与第一、第二流体传输通道连通，第一储液池与第一流体传输通道连接、第二储液池与第二流体传输通道连接，第一、二储液池分别位于芯片的两端，储液池与外部传输装置相连，生物发光检测单元位于第二流体传输通道的末端或第二储液池，第二流体传输通道与免疫富集腔间为“台阶”状；

2)将经抗体修饰的免疫微珠装填于步骤1)所述的微流控芯片中的免疫识别/富集腔中；

3)将待测样品溶液通过流体传输单元引入免疫识别/富集腔中，被免疫微珠识别、捕获和富集，所述待测样品中被分析的病原微生物浓度为10¹-10⁵cfu·μL^-1，待测样品的用量为1-10μL/次；

4)将裂解剂、生物发光试剂分别传输至免疫识别/富集腔中，与富集的病原微生物发生裂解反应和生物发光反应，生成发光复合物；

5)用缓冲溶液洗脱步骤4)产生的发光复合物，通过发光检测，定量分析待测样品中的病原微生物，所述发光检测按1)所述的生物发光检测单元中完成。

步骤2)所述的微珠材质可是玻璃或聚苯乙烯等聚合物，所述抗体的适宜浓度为50-200μg·mL^-1。

步骤3)所述待测样品溶液的进样流速为1-5μL·min^-1，缓冲溶液的最佳冲洗流速为10μL·min^-1，冲洗时间为5-20min。

步骤4)所述生物发光试剂用量不低于5μL，发光试剂的传输流速为1μL·min^-1，发光检测时间5-30min。

本发明的优选实施例中，所用冲洗液均为pH＝7.20的0.01mol·L^-1PBS缓冲液。

由于微流控芯片的网络结构和微珠的微米级尺寸，以及生物发光检测的高灵敏特性，可以使病原微生物样品的进样，分选/富集、加试剂、混合、反应和内涵物的高灵敏检测在一块微流控芯片上实现。因此本发明采用微流控芯片进行病原微生物分析检测，其优点是：

1.利用微流控独特的网络结构和流体控制技术，将病原微生物样品的进样，分选/富集、加试剂、混合、反应和内涵物的高灵敏检测等功能集成在微芯片上，可大大简化分析流程，降低样品和试剂的消耗量，减少复杂操作程序所引入的操作误差，避免样品转移所产生的样品损失，从而提高方法的分析速度、检测准确度和灵敏度。

2.以抗体为识别分子，可增强检测特异性，利用共价修饰可便利地将相应抗体固载于微珠表面。微珠价格低廉，可根据样本的需要控制微珠的数量，保证检测灵敏度和检测范围。同时，利用微流控技术，可便利地将微珠导入/导出微芯片，芯片可反复多次使用而无污染，有利于保证测定的准确度。

3.微米级或纳米级微珠具有较大的比表面积，可增加抗原/抗体的结合几率，有利于加快免疫反应，缩短分析时间，提高病原微生物的检出速度。

4.将样品预处理(包括识别/富集、内涵物裂解)、生物发光反应和检测等功能集成至单一微流控芯片上，可使微流控芯片装置构造更为紧凑，利于发展微型化、便携化的病原微生物检测系统。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1为本发明芯片的结构简图；

图2为本发明芯片的侧视图。

在图1、2中，1为第一流体传输通道，2为免疫识别/富集腔，3为第二流体传输通道，4为免疫微珠，5为第一储液池，6为第二储液池。

图3为实施例1中本发明芯片对不同浓度E.coli O157:H7样品的捕获率。

图4为实施例2中用本发明芯片对E.coli O157:H7进行生物发光检测所得典型发光曲线。

图5为实施例2中细菌浓度-发光强度标准曲线，其相关系数r²为0.995。

图6为实施例2中用本发明芯片对实验菌株E.coli O157:H7以及对照菌株E.coli 25922和伤寒沙门氏菌进行生物发光检测所得发光强度。

具体实施方式

本发明的技术方案可以通过下述操作步骤完成：将含有病原微生物的样品通过进样储液池，在泵压驱动下通过流体传输通道进入免疫识别/富集腔中；腔内填充有经抗体修饰的微珠，该抗体是具有靶向各类病原微生物有机体的抗体，通过特异性的免疫识别反应，样品中的病原微生物被识别、捕获，并被富集于微珠表面；反应结束后，驱动裂解剂和生物发光试剂经进样储液池、流体传输通道进入微腔，富集的病原微生物被其中的裂解剂裂解后，释放出内涵物并生成发光复合物，通过运行缓冲溶液将生成的发光复合物洗脱至生物发光检测单元，进而实现高灵敏的生物发光定量检测。病原微生物的定量分析方法采用标准曲线法，结果以细菌浓度cfu·μL^-1表征。

运用模塑法(孟斐等.高等学校化学学报.2002，23(7)：1264-1268；刘长春等，微细加工技术，2004，1：58-61)制作出如图1所示微结构的PDMS盖片，经紫外光光化学处理后，将此盖片与玻璃基片封接即可得到完整的微流控芯片。参见图1和图2，该芯片由流体传输通道1、3、免疫识别/富集腔2、微珠4和第一、第二储液池5、6组成。盖片上设置有第一、第二流体传输通道1、3、六边形识别/富集腔2和第一、第二储液池5、6，填充有抗体修饰的微珠4的识别/富集2腔的两端分别与第一、第二流体传输通道1、3连通。识别/富集腔内的微珠呈单层排列。第一流体传输通道为入口通道，第二流体传输通道为出口通道；第一流体传输通道宽200μm，深70μm，长1cm；第二流体传输通道宽200μm，深30μm，长1.8cm。第一储液池和第二储液池的直径分别为1.5mm和3mm。第一储液池5与第一流体传输通道1连接、第二储液池6与第二流体传输通道3连接，第一、二储液池分别位于芯片的两端。所述识别/富集腔腔体长7mm、宽3mm，深70μm。识别/富集与通道相连的两斜边之间的夹角α为60°，其腔体深度为大于微珠直径的1倍并小于微珠直径的2倍。采用这种结构的六边形微腔，使其具有较大的有效腔体面积，可拥有较高的微珠填充率；六边形的稳定结构，可使装填的微珠排列为稳定的六边形晶格聚集模式，不易受到液流剪切的影响而保持其排列的稳定性；而且六边形腔体结构较相同体积的圆形、方形、菱形等几何形状具有更大的径向长度，液流进/出腔体时，流体的线速度沿腔体径向呈线性改变，减少了流速较大时腔体内产生死体积的可能性。腔内填充有经抗体修饰的微珠，微珠粒径为微米级，略小于腔体深度，使其在微腔内呈单层排列。微珠采用玻璃或聚苯乙烯材料。微珠表面固载的抗体为具有靶向各类病原微生物有机体的抗体，所述盖片材料为聚合物聚二甲基硅氧烷。储液池与外部传输装置相连，生物发光检测单元位于第二流体传输通道3的末端或第二储液池6，本实施例的发光检测位点位于出口储液池6中。第二流体传输通道深度小于富集腔深度，使第二流体传输通道3与免疫富集腔2为台阶状，防止微珠流入出口通道。

微珠表面固载抗体的方法如下：

准确称取10mg直径50μm玻璃微珠于离心管中，用Piranha溶液(H₂SO₄∶H₂O₂＝3∶1)浸泡过夜后，再用无菌超纯水洗涤5次，然后置于70℃干燥30min。在离心管中加入2％APTES丙酮溶液反应1min，依次用丙酮和无菌超纯水清洗5次。在10μL 1mg·mL^-1抗体工作液中加入50μL MES缓冲液、8μL 4mg·mL^-1EDC(-2mmol·ml^-1)和12μL 4mg·mL^-1NHS(-2mmol·mL^-1)，室温反应15min后，加入120μL 0.1mol·L^-1PBS缓冲液终止NHS-抗体活化酯形成反应，即得到抗体浓度为50μg·mL^-1的反应液。将反应液加入上述装有玻珠的离心管中，室温反应2h。反应完毕后用0.1mol·L^-1PBS清洗3次，得到经抗E.coli O157:H7多克隆抗体修饰的免疫微珠，置于4℃备用。

将芯片依次用75％酒精、无菌超纯水清洗后，用1％小牛血清白蛋白(BSA)封闭30min，再用pH＝7.20的0.01mol·L^-1PBS缓冲液清洗。将经抗体修饰后的微珠加入已注满0.01mol·L^-1PBS的芯片微通道入口储液池内，利用注射泵以10μl·min^-1流速正压驱动填充入免疫微腔内。该芯片免疫富集腔内的微珠易于导入和导出，在富集腔内成单层紧密排列。

针对不同的病原微生物检测需求，采用不同抗体，如鼠抗单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc，USA)，鼠抗霍乱弧菌单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc，USA)、鼠抗金黄色葡萄球菌单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc，USA)或鼠抗鼠伤寒沙门氏菌单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc，USA)等，按照上述方法及反应条件，以50-200μg·mL^-1浓度对微珠进行修饰，可以得到不同抗体修饰的微珠。将抗体修饰后的微珠填充入免疫富集腔后，采用本发明所述的检测方法，可分别对单核细胞增生李斯特菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌或鼠伤寒沙门氏菌等病原菌进行微流控芯片的免疫捕获/富集和生物发光分析检测。

本实施例采用标准菌株E.coli O157:H7和经抗E.coli O157:H7多克隆抗体(Kirkegaard & Perry Laboratories Inc，USA)修饰的微珠进行微流控芯片的分析检测。

下面通过具体实施例来进一步说明本发明，但并不局限于下述实施例。

实施例1：用图1所示芯片进行E.coli O157:H7捕获/富集研究

将LB培养基37℃增菌8h的E.coli O157:H7菌液用pH＝7.20的0.01mol·L^-1PBS按10，10²，10³，10⁴，10⁵倍梯度稀释，充分混悬后，分别取上述细菌悬液1μL(其菌液浓度如表1所示)加入至入口储液池中，以5μL·min^-1流速正压驱动至芯片微通道内，再用pH＝7.20的0.01mol·L^-1PBS以10μL·min^-1流速对微通道冲洗5min。整个研究以填充有抗体修饰的微珠芯片为实验组、填充有用BSA封闭的微珠芯片为对照组。利用平板计数法，分别对细菌样品进样液和在出口储液池中收集的冲洗液进行培养计数，根据公式：

计算实验组芯片和对照组芯片对细菌的捕获率和吸附率，再以实验组捕获率和对照组吸附率的差值作为本发明芯片的实际捕获率，其结果如表1和图2所示。

表1芯片对不同浓度细菌的捕获率

a：P＜0.01，与对照组比较；b：P＜0.05，与对照组比较

结果表明，在菌液浓度3.2×10¹-3.2×10⁵cfu·μL^-1范围内，本发明芯片对E.coli O157:H7细菌的实际捕获率可达91.75％～95.62％。由此可见，在一定的冲洗流速和冲洗时间条件下，可降低或清除芯片壁、微珠间隙产生的非特异性吸附或残留，本发明芯片针对靶向抗原的免疫识别/富集具有较高的捕获率。

实施例2：标准菌株E.coli O157:H7的生物发光检测

将LB培养基37℃增菌8h的E.coli O157:H7菌液用pH＝7.20的0.01mol·L^-1PBS缓冲液稀释10倍，菌液浓度为10⁵cfu·μL^-1。取此细菌悬液1μL加入至芯片入口储液池中，以5μL·min^-1流速正压驱动至芯片内，再用pH＝7.20的0.01mol·L^-1PBS缓冲液以10μL·min^-1流速冲洗5min，以降低或消除芯片壁、微珠间隙产生的非特异性吸附或残留。将生物发光试剂(BacTiter-Glo^TM Microbial Cell Viability Assay，Promega，USA)以1μL·min^-1流速正压传输至芯片中，于芯片出口储液池为发光检测点检测发光强度，以PMT光信号探测器采集信号，得典型发光曲线如图3所示。

按上述检测方法，以5min内平均每秒所得光子数的对数lg(Count·s^-1)为纵坐标，细菌浓度的对数值lg(cfu·μL^-1)为横坐标，进行回归分析，本分析方法在10¹-10⁵cfu·μL^-1浓度范围内，其回归方程为y＝0.728x+0.364，相关系数(R²)为0.995，如图4所示；方法的相对标准偏差(RSD)为10.74％；以平板计数法为对照，本方法的方法回收率为81.33％；此外，经与E.coli 25922菌株和伤寒沙门氏菌比较，E.coli O157:H7所得发光强度较对照菌株E.coli25922和伤寒沙门氏菌所得发光强度高出2-3个数量级，如表2和图5所示。结果表明，利用本发明方法进行E.coli O157:H7的分析检测具有较高的重现性、准确度和特异性，且20min内即可完成整个分析流程，大大提高了病原微生物的检测速度。

表2不同种类细菌的发光强度

实施例3：食品样品中E.coli O157:H7的生物发光检测

取两份洁净猪肉，每份5g，分别在无菌环境中切成体积为1mm³左右的碎块。将两份猪肉分别加至两支灭菌的离心管中，再加入经过8h增殖的E.coliO157:H7 1000μL和稀释10³倍的E.coli O157:H7 1000μL各一份，以及0.01mol·L^-1PBS 4mL各一份。将上述两组含不同浓度细菌悬液的猪肉样本涡旋混匀后，于1000rpm离心5min，然后各取1μL上清液(其进样菌液浓度见表3)加入至芯片入口储液池中，以5μL·min^-1流速正压驱动至芯片内，再用pH＝7.20的0.01mol·L^-1PBS缓冲液以10μL·min^-1流速冲洗5min。将生物发光试剂以1μL·min^-1流速正压传输至芯片中，于芯片出口储液池为发光检测点检测发光强度，以PMT光信号探测器采集信号，结果如表3所示。

表3食品样品的发光强度

Claims (5)

1.一种病原微生物分析检测方法，其特征在于，包含步骤：

1)取用于病原微生物检测的微流控芯片进行检测，所述微流控芯片包括盖片和基片，盖片和基片封接贴合，盖片上设置有两条流体传输通道、六边形免疫识别/富集腔、生物发光检测单元和两个储液池，免疫识别/富集腔的两端分别与第一、第二流体传输通道连通，第一储液池与第一流体传输通道连接，第二储液池与第二流体传输通道连接，第一、二储液池分别位于芯片的两端，储液池与外部传输装置相连，生物发光检测单元位于第二流体传输通道的末端或第二储液池，第二流体传输通道与免疫富集腔间为台阶状；

2)将经抗体修饰的免疫微珠装填于步骤1)所述的微流控芯片中的免疫识别/富集腔中；

3)将待测样品溶液通过流体传输单元引入免疫识别/富集腔中，被免疫微珠识别、捕获和富集，所述待测样品中被分析的病原微生物浓度为10¹-10⁵cfu·μL^-1，待测样品的用量为1-10μL/次；

4)将裂解剂、生物发光试剂分别传输至免疫识别/富集腔中，与富集的病原微生物发生裂解反应和生物发光反应，生成发光复合物；

5)用缓冲溶液洗脱步骤4)产生的发光复合物，通过发光检测，定量分析待测样品中的病原微生物，所述发光检测按步骤1)所述的生物发光检测单元中完成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的微珠材质可是玻璃或聚苯乙烯等聚合物。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体的浓度为50-200μg·mL^-1。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述待测样品溶液的进样流速为1-5μL·min^-1，缓冲溶液的冲洗流速为10μL·min^-1，冲洗时间为5-20min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述生物发光试剂用量≥5μL，发光试剂的传输流速为1μL·min^-1，发光检测时间为5-30min。

Images