KR20160101775A

KR20160101775A - 수직형 정지액체상 랩온어칩, 이를 이용한 분석물질 검출장치 및 검출방법

Info

Publication number: KR20160101775A
Application number: KR1020150024104A
Authority: KR
Inventors: 최석정
Original assignee: 강릉원주대학교산학협력단
Priority date: 2015-02-17
Filing date: 2015-02-17
Publication date: 2016-08-26

Abstract

본 발명은 입자(particle)를 포함하는 반응물(reactant)과 분석물질(analyte)을 포함하는 시료(sample)의 혼합용액이 담겨지는 시료공간; 상기 시료공간의 하부와 연결설치되고, 내부에 검출용액(detection solution)이 담겨지는 검출공간; 상기 시료공간과 상기 검출공간을 연결하는 채널; 및 상기 채널에 위치하여, 상기 혼합용액 및 검출용액의 혼합을 방지하며, 외부압력에 의해서 상기 채널을 개방하는 공기밸브;를 포함하는 수직형 정지액체상 랩온어칩에 관한 것이다.

Description

수직형 정지액체상 랩온어칩, 이를 이용한 분석물질 검출장치 및 검출방법{vertical stationary liquid phase lab-on-a-chip, device for detecting analytes with the lab-on-a-chip and method using the same}

본 발명은 수직형 정지액체상 랩온어칩 및 이를 이용한 분석물질 검출장치 및 검출방법에 관한 것이다.

ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 와 같은 면역분석(immunoassay)은 항체를 이용하는 검출 방법으로 질병이나 연구에 널리 사용되고 있다. 예를 들어 샌드위치 ELISA 방법에서는 분석물질의 서로 다른 부위에 결합하는 두 종류의 항체를 사용하는데 그 가운데 한 항체는 면역플레이트(immunoplate) 와 같은 고체상(solid phase)에 고정시켜 포획항체(capture antibody)로 사용하고 다른 항체는 효소와 연결하여 표지화 항체(labelled antibody) 로 사용한다. 포획항체가 있는 고체상에 분석물질을 포함하는 시료를 더하여 반응시키면 분석물질이 항체에 결합한다. 이 상태에서 고체상 표면을 세척 완충용액(washing buffer) 으로 세척하면 분석물질을 제외한 나머지 모든 물질을 제거할 수 있다. 여기에 다시 표지화 항체를 넣어 반응시키고 결합하지 않은 표지화 항체를 세척 완충용액으로 세척하면 고체상에는 분석물질의 양에 비례하여 효소가 결합하게 된다. 따라서, 효소 활성을 측정함으로써 분석물질의 양을 측정할 수 있다.

이와 같은 ELISA 방법에서 고체상에 항체를 고정시키는 이유는 고체상에 결합하지 않고 액체상(liquid phase) 에 남아있는 물질들을 쉽게 제거할 수 있기 때문이다. 다른 면역 분석법에서는 고체상(solid phase)에 항체와 결합할 수 있는 이차항체나 단백질 G(protein G) 를 고정시켜 사용하기도 하고 항원을 고정시키기도 한다.

고체상으로는 면역플레이트(immunoplate)와 같은 플라스틱 표면이 많이 사용되지만 표면적이 넓은 장점으로 인하여 입자를 사용할 수도 있다. 특히 자성입자(magnetic particle)는 자석을 이용하여 포집하거나 이동시킬 수 있는 장점을 가지고 있어 불순물이 많이 포함되어 있는 시료에서 분석물질을 분리하는 전처리(pretreatment) 에 많이 이용되고 있다. 예를 들면 분석물질에 대한 항체를 고정시킨 자성입자를 시료에 넣고 반응시키면 분석물질이 자성입자에 고정된 항체에 결합하게 된다. 자력을 튜브 벽에 가하면 자성입자는 모두 튜브 벽에 달라붙게 되고 나머지 용액을 제거함으로써 불순물을 모두 제거할 수 있다.

그러나 종래의 면역분석법을 자동화하기 위해서는 액체를 이동시켜야하기 때문에 펌프가 필요하고, 장치 내에 세척 완충용액이 담긴 통과 액체의 이동을 위한 튜브들이 필요하며, 또한 면역플레이트나 액체 주입장치를 이동시키는 이송장치가 필요하기 때문에 장치가 크고 복잡해지는 문제점이 발생되었다.

이와 같은 문제점을 해결하기 위해 정지 액체상에서 고체상인 입자를 이동시킴으로써 면역분석법을 시행하는 기술(등록특허 제10-1398764호)이 제안된 바 있다. 상기 기술은 입자(particle)를 포함하는 반응물(reactant)과 분석물질(analyte)을 포함하는 시료(sample) 의 혼합용액이 담겨지는 시료공간(11)(sample chamber), 검출용액(detection solution)이 담겨지는 검출공간(12)(detection chamber) 그리고 시료공간(11)과 검출공간(12) 사이에 위치하여 상기 혼합용액과 검출용액이 섞이는 것을 방지하는 채널(13)(channel) 을 포함하는 정지액체상 랩온어칩(10)(stationary liquid phase lab-on-a-chip, SLP LOC)에서 입자를 시료공간(11)에서 검출공간(12)으로 이동시킴으로써 분석물질을 검출할 수 있는 기술이 개시되어 있다.

그러나 상기와 같은 기술은 정지액체상 랩온어칩(10)(SLP LOC)을 수평으로 하여 입자를 이동시킬 경우 자석을 이동시킬 리니어 액추에이터나 원심력을 가할 수 있는 장치가 필요하여 검사 장치의 구조가 복잡해지는 문제점이 있었다. 반면에 상기 정지액체상 랩온어칩(10)(SLP LOC)를 수직으로 설치할 경우에는 상기 시료공간(11)과 검출공간(12) 사이의 용액이 혼합되며, 중력에 의한 입자의 이동을 막기 위해 공간들 사이에 밸브를 설치해야 하기 때문에 상기 정지액체상 랩온어칩(10)(SLP LOC)의 구조가 복잡해지는 문제가 발생하였다.

KR 등록 제10-1398764호

본 발명은 시료공간과 검출공간에 수용되는 용액이 혼합되는 것을 방지하며, 중력에 의한 입자의 이동을 제어할 수 있는 수직형 정지액체상 랩온어칩을 제공하고자 한다.

본 발명은 상기 수직형 정지액체상 랩온어칩을 이용하여 분석물질의 검출과정을 간단하게 수행할 수 있는 분석물질 검출장치 및 검출방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 입자(particle)를 포함하는 반응물(reactant)과 분석물질(analyte)을 포함하는 시료(sample)의 혼합용액이 담겨지는 시료공간; 상기 시료공간의 하부와 연결설치되고, 내부에 검출용액(detection solution)이 담겨지는 검출공간; 상기 시료공간과 상기 검출공간을 연결하는 채널; 및 상기 채널에 위치하여, 상기 혼합용액 및 검출용액의 혼합을 방지하며, 외부압력에 의해서 상기 채널을 개방하는 공기밸브;를 포함하는 수직형 정지액체상 랩온어칩을 제공하고자 한다.

본 발명은 상기 수직형 정지액체상 랩온어칩; 상기 검출공간의 일측면에 설치되는 전기화학 분석용 전극; 및 상기 정지액체상 랩온어칩 외부에 위치하여, 상기 입자를 상기 시료공간에서 상기 분석용 전극으로 이동시키며, 자석으로 이루어진 이동수단; 을 포함하여, 상기 전극에서 발생하는 전기화학적 신호를 측정하는 것을 특징으로 하는 분석물질 검출장치를 제공하고자 한다.

본 발명은 상기 분석물질 검출장치를 이용하여, 상기 시료공간에서 상기 분석물질을 포함하는 시료와 상기 입자를 포함하는 반응물을 혼합하여 입자-분석물질 복합체를 형성하는 단계; 상기 검출공간에 압력을 가하고, 상기 채널을 개방하는 단계; 상기 입자-분석물질 복합체를 상기 이동수단에 의해서, 상기 검출공간으로 이동시켜, 상기 분석용 전극에 고정시키는 단계; 및 상기 검출공간에서 전기화학적인 방법으로 상기 분석물질을 검출하는 단계; 를 포함하는 분석물질 검출방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 수직형 정지액체상 랩온어칩은 시료공간과 검출공간 사이에 공기밸브를 포함함으로써, 상기 시료공간과 검출공간에 수용되는 용액의 혼합을 방지할 수 있으며, 중력에 의한 입자의 이동을 제어할 수 있는 효과가 있다.

본 발명의 수직형 정지액체상 랩온어칩은 수직으로 배열되어 있기 때문에, 입자를 검출공간으로 이동시킬 때 입자의 이동방향과 중력의 방향이 동일하여 입자의 이동 효율이 좋다.

본 발명의 수직형 정지액체상 랩온어칩을 이용한 분석물질 검출장치 및 검출방법은 상기 수직형 정지액체상 랩온어칩에 전기화학적 분석용 전극을 포함함으로써, 신속하게 경제적으로 분석물질을 분석할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 종래기술의 정지액체상 랩온어칩을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예 따른 수직형 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 수직형 정지액체상 랩온어칩에 설치된 공기밸브를 제거하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 수직형 정지액체상 랩온어칩을 이용한 분석물질 검출장치를 도시한 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 분석물질 검출장치를 이용하여 분석물질을 검출하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 분석물질 검출장치의 사진을 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 분석물질 검출장치를 도식적으로 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 분석물질 검출장치를 이용하여 실시예에서 TMB(3,3´, 5,5´-tetramethylbenzidine) 용액에 서로 다른 양의 horseradish peroxidase (HRP) 를 넣고 반응시킨 후 생성된 생성물을 전기화학의 순환전압전류법(cyclic voltammetry) 방법으로 분석한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 실시예에서 비오틴기를 갖는 biotin-HRP(horseradish peroxidase)와 스트렙트아비딘으로 기능화된 자성입자를 혼합하여 자석으로 자성입자를 전극 표면에 고정시켜 반응시키고 생성물을 순환전압전류법으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 실시예에서 비오틴기가 없는 HRP(horseradish peroxidase)와 스트렙트아비딘으로 기능화된 자성입자를 혼합하여 자석으로 자성입자를 전극 표면에 고정시켜 반응시키고 생성물을 순환전압전류법으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 0.45V 에서 비오틴기가 없는 HRP 와 biotin-HRP 효소 농도에 따른 전류값을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 수직형 정지액체상 랩온어칩에 관한 것으로, 입자(particle)를 포함하는 반응물(reactant)과 분석물질(analyte)을 포함하는 시료(sample)의 혼합용액이 담겨지는 시료공간, 상기 시료공간의 하부와 연결설치되고, 내부에 검출용액(detection solution)이 담겨지는 검출공간, 상기 시료공간과 상기 검출공간을 연결하는 채널 및 상기 채널에 위치하여, 상기 혼합용액 및 검출용액의 혼합을 방지하며, 외부압력에 의해서 상기 채널을 개방하는 공기밸브를 포함한다.

본 발명에서 랩온어칩이라 함은 실험실에서 행해지는 혼합, 반응, 분리, 분석 등의 여러 가지 조작이 구현되도록 제작된 칩으로, 정지 액체상 랩온어칩은 랩온어칩 내에서 액체가 전혀 움직이지 않는 것을 의미하는 것이 아니라, 액체상을 이동시키는 종래의 방법과는 달리 주요 분석단계에서 액체상을 이동시키는 대신 고체상을 이동시킴으로써 분석을 수행할 수 있는 것을 의미하는 것이다. 이와 관련하여 보다 상세한 설명은 후술하도록 한다.

이에 더하여, 채널은 상기 시료공간 및 검출공간보다 직경이 작게 형성될 수 있으며, 상기 검출공간의 겉면은 플렉서블한 재질로 형성되며, 상기 검출공간의 겉면에 압력을 가하여, 상기 공기밸브를 제거할 수 있다.

또한, 상기 수직형 정지액체상 랩온어칩은 진동을 가하는 진동수단을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 시료공간은 아랫부분이 점진적으로 갈수록 폭이 좁아지는 원추형으로 형성되며, 상기 검출공간은 윗부분의 소정부분이 점진적으로 갈수록 폭이 좁아지는 역원추형으로 형성될 수 있다.

특정 양태로서, 상기 공기밸브는 상기 검출공간의 상부까지 소정부분 연장될 수 있다.

또한, 본 발명은 수직형 정지액체상 랩온어칩을 이용한 분석물질 검출장치에 관한 것으로, 상기 수직형 정지액체상 랩온어칩, 상기 검출공간의 일측면에 설치되는 전기화학 분석용 전극, 상기 정지액체상 랩온어칩 외부에 위치하여, 상기 입자를 상기 시료공간에서 상기 검출공간으로 이동시킬 수 있는 자석으로 이루어진 이동수단을 포함하며, 상기 전극에서 발생하는 전기화학적 신호를 측정하는 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 전극은 금(Au), 코발트(Co), 백금(Pt), 은(Ag), 탄소나노튜브(carbon nanotube), 그래핀(graphene) 및 탄소(carbon)으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으며, 상기 전기화학적 신호는 순환 전압전류법(cyclic voltammetry), 양극 벗김 전압전류법(anodic stripping voltammetry, ASV), 네모파 전압전류법(square wave voltammetry, SWV), 펄스 전압전류법(differential pulse voltammetry, DPV) 및 임피던스법(impedance)으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 이용하여 측정할 수 있다.

이에 더하여, 본 발명은 상기 분석물질 검출장치를 이용하는 분석물질 검출방법에 관한 것으로, 상기 시료공간에서 상기 분석물질을 포함하는 시료와 상기 입자를 포함하는 반응물을 혼합하여 입자-분석물질 복합체를 형성하는 단계, 상기 검출공간에 압력을 가하고, 상기 채널을 개방하는 단계, 상기 입자-분석물질 복합체를 상기 이동수단에 의해서, 상기 검출공간으로 이동시켜, 상기 분석용 전극에 고정시키는 단계 및 상기 검출공간에서 전기화학적인 방법으로 상기 분석물질을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

이때, 상기 입자는 포획입자와 표지입자를 포함하며, 상기 입자-분석물질 복합체는 포획입자-분석물질-표지입자일 수 있으며, 상기 포획입자는 상기 분석물질에 특이적인 일차수용체가 고정된 자성입자이며, 상기 표지입자는 상기 분석물질에 특이적인 상기 일차수용체가 고정되며, 표지물질로 기능화된 비자성 입자일 수 있다.

또한, 상기 포획입자는 비중이 검출용액보다 크며, 상기 표지입자는 비중이 검출용액과 같거나 검출용액보다 작은 것을 특징으로 한다. 이때, 상기 검출용액은 글리세롤, 설탕 및 피콜(Ficoll)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 첨가하여 비중을 증가시킬 수 있다.

한편, 상기 표지입자는 직경이 100nm 이하인 나노입자일 수 있다.

특정 양태로서, 상기 표지물질은 효소일 수 있으며, 이때, 상기 전극 표면에 고정된 표지입자의 효소 반응에 의해서 상기 분석물질을 생성물로 전환되는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하도록 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

따라서, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

도 2는 본 발명의 일 실시예 따른 수직형 정지액체상 랩온어칩을 도시한 도면, 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 수직형 정지액체상 랩온어칩에 설치된 공기밸브를 제거하는 과정을 나타낸 도면, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 수직형 정지액체상 랩온어칩을 이용한 분석물질 검출장치를 도시한 도면, 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 분석물질 검출장치를 이용하여 분석물질을 검출하는 과정을 나타낸 도면, 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 분석물질 검출장치의 사진을 나타낸 도면, 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 분석물질 검출장치를 도식적으로 나타낸 도면, 도 8은 본 발명의 분석물질 검출장치를 이용하여 실시예에서 TMB(3,3´, 5,5´-tetramethylbenzidine) 용액에 서로 다른 양의 horseradish peroxidase (HRP) 를 넣고 반응시킨 후 생성된 생성물을 전기화학의 순환전압전류법(cyclic voltammetry) 방법으로 분석한 그래프, 도 9는 본 발명의 실시예에서 비오틴기를 갖는 biotin-HRP(horseradish peroxidase)와 스트렙트아비딘으로 기능화된 자성입자를 혼합하여 자석으로 자성입자를 전극 표면에 고정시켜 반응시키고 생성물을 순환전압전류법으로 측정한 결과를 나타낸 그래프, 도 10은 본 발명의 실시예에서 비오틴기가 없는 HRP(horseradish peroxidase)와 스트렙트아비딘으로 기능화된 자성입자를 혼합하여 자석으로 자성입자를 전극 표면에 고정시켜 반응시키고 생성물을 순환전압전류법으로 측정한 결과를 나타낸 그래프, 도 11은 0.45V 에서 비오틴기가 없는 HRP 와 biotin-HRP 효소 농도에 따른 전류값을 나타낸 그래프이다. 이하, 도 2 내지 도 11과 실시예를 통해 본 발명인 수직형 정지액체상 랩온어칩, 이를 이용한 분석물질 검출장치 및 검출방법을 상세히 설명한다.

도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 수직형 정지액체상 랩온어칩(100)은 입자(particle)를 포함하는 반응물(reactant)과 분석물질(230)(analyte)을 포함하는 시료(sample)의 혼합용액이 담겨지는 시료공간(110), 상기 시료공간(110)의 하부와 연결설치되고, 내부에 검출용액(detection solution)이 담겨지는 검출공간(120), 상기 시료공간(110)과 상기 검출공간(120)을 연결하는 채널(130) 및 상기 채널(130)에 위치하여, 상기 혼합용액 및 검출용액의 혼합을 방지하며, 외부압력에 의해서 상기 채널(130)을 개방하는 공기밸브(131)를 포함하여 구성된다.

여기서, 입자(200)라 함은 분석물질(230) 또는 분석물질(230)에 의해 생성되는 생성물(product)과 결합하여 입자-분석물질(230) 복합체 또는 입자-생성물 복합체를 형성할 수 있는 물질일 수 있다. 이를 위하여 입자에는 분석물질(230)에 특이적인 수용체(receptor)나 분석물질(230)에 의해 생성되는 생성물에 특이적인 수용체가 고정되어 있을 수 있다. 본 발명에서 입자(200)는 포획입자(210)(capture particle)와 표지입자(220)(labeling particle)일 수 있다. 보다 구체적인 설명은 후술하기로 한다.

또한, 본 발명은 혼합용액과 검출용액이 정지 상태로 담겨지는 것을 특징으로 하며, 상기 시료공간(110)과 검출공간(120)은 채널(130)과 연결된 부분을 제외한 다른 면이 밀폐될 수 있다.

여기서, 혼합용액과 검출용액이 정지되어 있다는 것은 용액이 전혀 움직이지 않는 것을 의미하는 것이 아니라 액체상을 이동시키는 기존의 방법과는 달리 주요 분석단계에서 액체상을 이동시키는 대신 고체상(입자)을 이동시킴으로써 분석을 수행할 수 있는 것을 의미하는 것이다.

이에 더하여, 본 발명의 채널(130)은 상기 시료공간(110)과 검출공간(120)보다 직경이 더 작을 수 있으며, 상기 공기밸브(131)는 시료공간(110)과 검출공간(120) 내에 담긴 용액들이 섞이는 것을 방지하기 위하여 설치될 수 있다. 이때, 상기 공기밸브(131)는 채널(130)에 설치되어, 본 발명의 수직형 정지액체상 랩온어칩(100)에 포함된 용액이 서로 혼합되지 않아 용액이 담긴 상태로도 보관이 용이할 수 있다.

참고로, 채널(130)이 시료공간(110)과 검출공간(120)의 직경보다 넓을 경우에는 시료공간(110)에 시료와 입자(200)의 혼합물을 더할 때 압력에 의해 공기밸브(131)가 빠져나갈 수 있지만 채널(130)의 직경이 좁을 때는 큰 압력을 가하기까지 공기가 채널(130)에 그대로 머물러 있기 때문에 두 공간을 효과적으로 분리할 수 있다. 일 예로, 시료공간(110)과 검출공간(120)의 직경이 10mm 일 때, 채널(130)의 직경이 1mm 이하일 수 있다.

이에 더하여, 상기 시료공간(110)은 아랫부분이 점진적으로 갈수록 폭이 좁아지는 원추형으로 형성되며, 상기 검출공간(120)은 윗부분의 소정부분이 점진적으로 갈수록 폭이 좁아지는 역원추형으로 형성될 수 있다. 여기서 소정부분이라 함은 윗면의 일부분 또는 검출공간(120)의 전체부분을 의미할 수 있다.

한편, 시료공간(110)의 바닥 면이 아래로 갈수록 원추형으로 형성된 것은 시료공간(110)에 포함되는 입자(200) 또는 분석물질(230)이 아래에 위치한 검출공간(120)으로 용이하게 이동하기 위함이다. 또한, 검출공간(120) 윗면의 일부분 또는 전체가 위로 갈수록 폭이 좁아지는 역원추형으로 형성된 것은 검출공간(120)에 포함된 검출용액이 채널(130)을 채우는 과정에서 검출공간(120)에 기포가 남지 않도록 하기 위함이다.

이를 위해, 검출공간(120)의 한 면에 이동이 가능한 플러그를 설치하거나 검출공간(120)의 일부분을 변형 가능하도록 제작할 수 있다. 플러그는 검출공간(120)의 한 면에 형성된 구멍에 설치될 수 있으며 플러그를 설치하는 구멍과 검출공간(120)은 좁은 관으로 연결될 수 있다. 플러그를 설치한 경우에는 플러그를 안쪽으로 이동시킴으로써 압력을 가할 수 있다.

한편, 도 3에 도시된 바와 같이, 상기 검출공간(120)을 플렉서블한 재질로 형성하여 변형이 가능하도록 제작할 수 있다. 이 경우 상기 검출공간(120)의 외면에 압력을 가하여, 상기 공기밸브(131)를 제거할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 검출공간(120)의 외면에 압력을 가하면, 검출공간(120) 내부의 검출용액이 채널(130)로 밀려나가면서, 채널(130)을 채우도록 할 수 있으며, 이때, 공기밸브(131)가 채널(130)에서부터 밀려나가 공기가 시료공간(110)의 상부로 이동할 수 있다.

이에 더하여, 상기 공기밸브(131)는 상기 검출공간(120)의 상부까지 소정부분 연장될 수 있다. 이는 온도 변화나 작은압력으로 검출용액이 미세하게 채널(130)쪽으로 밀려 올라가는 경우 채널(130)까지 채워지는 것을 방지하기 위함이다.

또한, 본 발명의 수직형 정지액체상 랩온어칩(100)은 시료를 반응물과 반응시키거나 입자(200)의 이동을 보다 촉진시키기 위하여 진동을 가하는 진동수단(미도시)을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 수직형 정지액체상 랩온어칩(100)을 이용한 분석물질(230) 검출장치에 관한 것으로, 상기 수직형 정지액체상 랩온어칩(100), 상기 검출공간(120)의 일측면에 설치되는 전기화학 분석용 전극(310), 상기 수직형 정지액체상 랩온어칩(100) 외부에 위치하여, 상기 입자(200)를 상기 시료공간(110)에서 상기 검출공간(120)으로 이동시킬 수 있는 이동수단(320)을 포함하며, 상기 전극(310)에서 발생하는 전기화학적 신호를 측정하여 분석물질(230)을 검출하는 것을 특징으로 한다.

이에 더하여, 상기 이동수단(320)은 수직형 정지액체상 랩온어칩(100)의 하부에 상하로 이동 가능하도록 자석을 설치할 수 있다. 이러한 자석은 자력을 한 지점으로 집중시키기 위하여 자석의 끝 부분이 원뿔과 같이 뾰족한 구조로 형성될 수 있다. 일 예로, 영구자석 위에 철과 같은 강자성체 원뿔을 붙여놓을 수 있다. 특히, 전극(310)표면에서 효소 반응이 많이 일어나도록 하기 위해서는 자력이 작업 전극(310)의 중앙에 집중되도록 자석을 설치할 수 있다.

또한, 본 발명의 전극(310)은 금(Au), 코발트(Co), 백금(Pt), 은(Ag), 탄소나노튜브(carbon nanotube), 그래핀(graphene) 및 탄소(carbon)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으며, 상기 전기화학적 신호는 순환 전압전류법(cyclic voltammetry), 양극 벗김 전압전류법(anodic stripping voltammetry, ASV), 네모파 전압전류법(square wave voltammetry, SWV), 펄스 전압전류법(differential pulse voltammetry, DPV) 및 임피던스법(impedance)으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 이용하여 측정할 수 있다. 특히, 일 실시예로 순환전압전류법(cyclic voltammetry)과 같은 전기화학적인 방법으로 측정할 수 있으며, 이러한 경우 전극(310)은 작업전극(working electrode)외에 상대전극(counter electrode)과 기준전극(reference electrode)을 추가로 설치할 수 있다. 이와 같은 전극(310)들은 검출공간(120) 내에 돌출된 형태로 설치될 수 있으며, screen printed electrode(SPE) 형태로 제작하여 검출공간(120)의 한 면에 설치할 수도 있다.

이에 더하여, 본 발명은 상기 분석물질 검출장치(300)를 이용하는 분석물질 검출방법에 관한 것으로, 상기 시료공간(110)에서 상기 분석물질(230)을 포함하는 시료와 상기 입자(200)를 포함하는 반응물을 혼합하여 입자-분석물질 복합체를 형성하는 단계, 상기 검출공간(120)에 압력을 가하고, 상기 채널(130)을 개방하는 단계, 상기 입자-분석물질 복합체를 상기 이동수단(320)에 의해서, 상기 검출공간(120)으로 이동시켜, 상기 분석용 전극(310)에 고정시키는 단계 및 상기 검출공간(120)에서 전기화학적인 방법으로 상기 분석물질(230)을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

이때, 상기 입자(200)는 상술한 바와 같이 포획입자(210)와 표지입자(220)를 포함하며, 상기 입자-분석물질 복합체는 포획입자-분석물질-표지입자일 수 있으며, 상기 포획입자(210)는 상기 분석물질(230)에 특이적인 일차수용체가 고정된 자성입자이며, 상기 표지입자(220)는 상기 분석물질(230)에 특이적인 상기 일차수용체가 고정되며, 표지물질로 기능화된 비자성 입자일 수 있다.

일 예로, 자성이 있는 포획입자(210)로 항원을 포획한 상태에서 다시 효소 표지와 연결되어 있는 표지항체를 항원에 결합시키면 포획항체-항원-표지항체로 구성된 샌드위치 형태의 복합체가 형성된다. 자석으로 포획입자(210)를 모은 상태에서 포획입자(210)에 결합하지 않은 물질들을 세척하고 포획입자(210)에 결합한 효소 표지의 활성을 측정함으로써 항원의 양을 결정할 수 있다.

그러나, 표지항체를 사용할 경우 항체 한 분자에 대개 한 개 정도의 효소 표지가 연결되어 있기 때문에, 미량의 항원을 검출하기가 어렵다. 따라서, 감도를 높이기 위하여 표지항체 대신 분석물질(230)과 결합할 수 있는 수용체와 표지물질이 모두 고정된 표지입자(220)를 사용할 수 있다. 특히, 자석으로 포획입자(210)를 이동시킬 때 표지입자(220)가 함께 모이면 안되기 때문에, 상기 표지입자(220)는 실리카입자, 세라믹 입자, 유리 입자, 폴리스티렌 입자 등 자성이 없는 비자성입자를 사용할 수 있다

이때, 상기 포획입자(210)는 결합반응 이후 시료 공간 하부에 있는 검출공간(120)으로 이동시켜야 하기 때문에 비중이 검출용액보다 큰 것이 바람직하다. 또한, 표지입자(220)일 경우 시료공간(110)이 검출공간(120)의 상부에 있어, 표지입자(220)가 중력에 의해 검출공간(120)으로 이동할 수 있기 때문에 표지입자(220)는 비중이 검출용액과 같거나 검출용액보다 작은 가벼운 입자를 사용하는 것이 바람직하다. 일 예로, 본 발명에서 표지입자(220)는 폴리스티렌 입자일 수 있다. 또한, 표지입자(220)는 작고 가벼운 나노입자를 사용할 경우 샌드위치 구조가 보다 안정해지는 효과가 있고, 박테리아나 바이러스를 검출할 경우 한 개의 박테리아나 바이러스에 여러 개의 표지입자(220)가 결합하여 감도가 더 증가하는 효과가 있기 때문에 표지입자(220)는 직경 100nm 이하의 나노입자를 사용하는 것이 바람직 하다.

이에 더하여, 검출용액은 글리세롤, 설탕 및 피콜(Ficoll)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 첨가하여 비중을 증가시킬 수 있다.

표지로는 전기화학적인 반응이 가능한 물질 또는 효소를 사용할 수 있는데 그 가운데 효소는 신호를 크게 증폭시킬 수 있다는 장점이 있다. 효소 표지로는 전기화학적인 방법으로 활성을 측정할 수 있는 효소라면 모두 사용할 수 있으며 대표적으로 horseradish peroxidase(HRP)와 alkaline phosphatase(AP)를 예로 들 수 있다. HRP의 활성 측정용 기질로 사용되는 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)는 효소 반응의 결과 산화된 형태의 TMB를 순환전압전류법(cyclic voltammetry)과 같은 전기화학적인 방법으로 측정할 수 있다. AP 효소 역시 p-nitrophenyl phosphate를 기질로 사용하여 반응시킨 후 전기화학적인 방법으로 분석하는 것이 가능하다.

특정 양태로서, 상기 표지물질은 효소일 수 있으며, 이때, 상기 전극(310) 표면에 고정된 표지입자(220)의 효소 반응에 의해서 상기 분석물질(230)을 생성물로 전환되는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 >

실시예 1. 수직형 정지액체상 랩온어칩을 이용한 분석물질 검출장치의 제조

본 실시예에서는 수직형 정지액체상 랩온어칩을 이용한 분석물질 검출장치를 제조하였다. 본 실시예에 따라 제조된 분석물질 검출장치의 사진은 도 6에 나타내었으며, 이의 도식적인 도면은 도 7에 나타내었다.

수직형 정지액체상 랩온어칩은 아크릴로 제작된 베이스, SPE 전극, 전극 위에 검출공간을 형성하기 위한 PDMS 몸체, 시료공간으로 사용된 주사기, 검출공간을 덮고 주사기를 수용할 수 있는 아크릴 커버로 구성되어 있다. 아크릴 베이스는 자석이 전극 바로 밑면까지 도달할 수 있도록 하기 위해 전극이 위치한 부분에 직경 8 mm의 구멍을 뚫어놓았다. SPE 전극은 DropSense(Oviedo, Spain)에서 C220AT 타입을 구입하였다. PDMS 몸체는 SPE 전극 위에 직경 8 mm의 우물이 형성되도록 제작하였다. 주사기는 1 ml 용량의 주사기를 절단하여 사용하였으며 주사기의 끝 부분이 아크릴 커버에 꼭 끼워지도록 제작하였다.

특히, 검출공간의 아래에 자석이 위치하도록 제작하였으며, 이때, 검출공간의 외면은 플렉서블한 재질로 형성되어 자석을 위로 이동시켜 압력을 가함으로써, 공기밸브를 제거할 수 있다.

실시예 2. 수직형 정지액체상 랩온어칩을 이용한 분석물질 검출장치의 효율성 테스트

본 발명은 자성입자인 포획입자를 시료공간에서 검출공간으로 이동시킴으로써 포획입자에 결합한 물질만 선택적으로 이동시키는 것이다. 따라서, 본 실시예에서는 본 발명의 분석물질 검출장치를 이용하여 포획입자에 결합한 물질만 선택적으로 이동하는 것을 확인하기 위하여 실험을 실시하였다.

먼저, 효소의 농도에 따른 전류값을 측정하기 위하여 검출공간에 HRP의 기질인 TMB(3,3,5,5-Tetramethylbenzidine, Sigma) 용액 150㎕ 를 채운 후, 0.8V 부터 -0.5V까지 환원 사이클부터 시작하여 순환전압전류법(cyclic voltammetry)을 이용하여, 전압에 따른 전류의 값을 측정하였다. 그 다음 상기 검출공간에 TMB 용액 150㎕ 와 HRP(horseradish peroxidase) 효소(Sigma) 0.01ng 을 넣고 30분을 반응시킨 후 역시 동일한 순환전류법을 이용하여 전류값을 측정하였다. 그리고, 상기와 같은 방법으로 TMB 용액 150㎕ 에 HRP 효소 0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng 을 넣고 반응시킨 후 전류값을 측정하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 0.45V 에서의 전류가 효소 농도에 비례하여 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

다음으로 검출공간에 TMB 용액 150㎕ 을 채우고, 시료공간에 비오틴(biotin)기를 갖는 HRP(horseradish peroxidase) 효소인 비오틴-HRP 0.1ng 과 스트렙트아비딘 단백질로 기능화된 자성입자인 SA-MP(life technologies) 10㎍ 을 추가하였다. 그리고, 채널에 형성된 공기밸브는 제거하고, 외부에 구비된 이동수단인 자석을 이용하여 자성입자를 전극 표면으로 이동시킨 상태에서 30분 반응시켰다. 그 후 위와 동일한 순환전류법을 이용하여 전류값을 측정하였다. 그리고, 비오틴-HRP 효소 1ng, 10ng, 100ng 으로 이와 동일한 실험을 시행하였다. 그 결과 도 9에 나탄난 바와 같이, 0.45V에서 효소 농도에 비례하는 전류가 관찰되었다.

그리고, 비오틴기가 없는 HRP 효소로 상기와 동일한 실험을 실시하였다. 여기서, 비오틴기가 없는 HRP는 SA-MP 에 결합하지 않는 효소를 의미한다. 이에 대한 실험 결과는 도 10에 나타내었다. 그 결과, 0.45V에서 비오틴기가 없는 HRP 효소는 양이 증가하여도, 전류의 변화가 거의 없는 것을 확인할 수 있었다.

두 실험에서 0.45V 에서의 전류를 효소농도에 대하여 도 11에 그래프로 나타내었다. 즉, 자성입자에 결합하는 biotin-HRP는 효소 농도에 비례하여 전류가 증가하지만 자성입자와 결합하지 않는 HRP 는 전류변화가 거의 없는 것을 확인할 수 있었다.

이 결과를 통해 수직형 정지액체상 랩온어칩을 이용하면 자성입자에 결합한 효소만을 선택적으로 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 분이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

10: 정지액체상 랩온어칩 11: 시료공간
12: 검출공간 13: 채널
100: 수직형 정지액체상 랩온어칩
110: 시료공간 120: 검출공간
130: 채널 131: 공기밸브
200: 입자
210: 포획입자 220: 표지입자
230: 분석물질 240: 생성물
300: 분석물질 검출장치
310: 전극 320: 이동수단

Claims

입자(particle)를 포함하는 반응물(reactant)과 분석물질(analyte)을 포함하는 시료(sample)의 혼합용액이 담겨지는 시료공간;
상기 시료공간의 하부와 연결설치되고, 내부에 검출용액(detection solution)이 담겨지는 검출공간;
상기 시료공간과 상기 검출공간을 연결하는 채널; 및
상기 채널에 위치하여, 상기 혼합용액 및 검출용액의 혼합을 방지하며, 외부압력에 의해서 상기 채널을 개방하는 공기밸브;를 포함하는 수직형 정지액체상 랩온어칩.
제1항에 있어서,
상기 채널은
상기 시료공간 및 검출공간보다 직경이 작게 형성되는 것을 특징으로 하는 수직형 정지액체상 랩온어칩.
제1항에 있어서,
상기 검출공간의 겉면은 플렉서블한 재질로 형성되며,
상기 검출공간의 겉면에 압력을 가하여, 상기 공기밸브를 제거하는 것을 특징으로 하는 수직형 정지액체상 랩온어칩.
제1항에 있어서,
상기 시료공간은 아랫부분이 점진적으로 갈수록 폭이 좁아지는 원추형으로 형성되며, 상기 검출공간은 윗부분의 소정부분이 점진적으로 갈수록 폭이 좁아지는 역원추형으로 형성된 것을 특징으로 하는 수직형 정지액체상 랩온어칩.
제1항에 있어서,
상기 공기밸브는
상기 검출공간의 상부까지 소정부분 연장되는 것을 특징으로 하는 수직형 정지액체상 랩온어칩.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 수직형 정지액체상 랩온어칩;
상기 검출공간의 일측면에 설치되는 전기화학 분석용 전극; 및
상기 정지액체상 랩온어칩 외부에 위치하여, 상기 입자를 상기 시료공간에서 상기 검출공간으로 이동시킬 수 있는 자석으로 이루어진 이동수단; 을 포함하며, 상기 전극에서 발생하는 전기화학적 신호를 측정하는 것을 특징으로 하는 분석물질 검출장치.
제6항에 있어서,
상기 분석물질 검출장치는 진동을 가하는 진동수단을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분석무질 검출장치.
제6항에 있어서,
상기 전극은
금(Au), 코발트(Co), 백금(Pt), 은(Ag), 탄소나노튜브(carbon nanotube), 그래핀(graphene) 및 탄소(carbon)으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 분석물질 검출장치.
제6항에 있어서,
상기 전기화학적 신호는
순환 전압전류법(cyclic voltammetry), 양극 벗김 전압전류법(anodic stripping voltammetry, ASV), 네모파 전압전류법(square wave voltammetry, SWV), 펄스 전압전류법(differential pulse voltammetry, DPV) 및 임피던스법(impedance)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 분석물질 검출장치.
제6항에 따른 분석물질 검출장치를 이용하여,
상기 시료공간에서 상기 분석물질을 포함하는 시료와 상기 입자를 포함하는 반응물을 혼합하여 입자-분석물질 복합체를 형성하는 단계;
상기 검출공간에 압력을 가하고, 상기 채널을 개방하는 단계;
상기 입자-분석물질 복합체를 상기 이동수단에 의해서, 상기 검출공간으로 이동시켜, 상기 분석용 전극에 고정시키는 단계; 및
상기 검출공간에서 전기화학적인 방법으로 상기 분석물질을 검출하는 단계; 를 포함하는 분석물질 검출방법.
제10항에 있어서,
상기 입자는 포획입자와 표지입자를 포함하며,
상기 입자-분석물질 복합체는 포획입자-분석물질-표지입자인 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 분석물질 검출방법.
제11항에 있어서,
상기 포획입자는 상기 분석물질에 특이적인 일차수용체가 고정된 자성입자이며,
상기 표지입자는 상기 분석물질에 특이적인 상기 일차수용체가 고정되며, 표지물질로 기능화된 비자성 입자인 것을 특징으로 하는 분석물질 검출방법.
제12항에 있어서,
상기 포획입자는 비중이 검출용액보다 크며,
상기 표지입자는 비중이 검출용액과 같거나 또는 검출용액보다 작은 것을 특징으로 하는 분석물질 검출방법.
제12항에 있어서,
상기 표지입자는
직경이 100nm 이하인 나노입자인 것을 특징으로 하는 분석물질 검출방법.
제12항에 있어서,
상기 표지물질은 효소인 것을 특징으로 하는 분석물질 검출방법.
제15항에 있어서,
상기 입자-분석물질 복합체를 상기 이동수단에 의해서, 상기 검출공간으로 이동시켜, 상기 분석용 전극에 고정시키는 단계는
상기 전극 표면에 고정된 표지입자의 효소 반응에 의해서 상기 분석물질을 생성물로 전환되는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분석물질 검출방법.
제10항에 있어서,
상기 검출용액은 글리세롤, 설탕 및 피콜(Ficoll)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 첨가하여 비중을 증가시키는 것을 특징으로 하는 분석물질 검출방법.