JP2008522170A - 粒子に基づく結合アッセイ法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、形成された免疫複合体または任意の生体分子複合体を、結合されていない物質から、使用する粒子と互いに適合性のある孔、開口からなる多孔性の表面(例えば格子)上で分離することに関する。本発明は、試料中の分析物の検出と定量化のための、粒子の大きさや異なる性質を利用する二粒子アッセイ形式で実施される不均一系の免疫アッセイを開示する。本方法では、試料のなかから分析物を捕らえ、体液からその分析物を分離し、区別するために大きい粒子を使用する一方、標識手段として小さな粒子を使用する。
標本に含まれる抗原を検出し定量化するために、幾つかの方法が、免疫アッセイ技術を用いる。現在、二種類の免疫アッセイ系が使われている。均一系では、アッセイは一段階で行われる。不均一系では、免疫アッセイは二段階で行われる。追加の一段階は、結合された物質を結合されなかった物質から分離するために必要である。一般に、抗体または抗原が吸着または化学結合により結合している固体の支持体表面が、結合相として使われる。免疫反応の性能と分離段階の効率を向上させるために多くの固体支持体表面が開発されている。
a)多孔性表面;
b)該分析物と特異的に結合して第一の結合複合体を形成する結合物質が付着している粒子を含む、第一の結合成分;および
c)第二の結合成分と該第一の結合複合体が互いに結合して第二の結合複合体を形成するように、該第一の結合複合体に特異的に結合する結合物質が付着している、検出できるように標識された粒子を含む第二の結合成分
を含む、試料に含まれる分析物の存在および/または量を検出するためのキットをも提供し、ここで第一の結合複合体および/または第二の結合複合体は多孔性表面上に保持されうる。
図1は免疫複合体形成の例示的な方法を開示している。図は第一の結合成分が第二の結合成分とともに該免疫複合体をいかに形成するかを説明する。まず通常はリガンドまたは抗リガンドである結合物質(2)でコーティングされた捕捉粒子(1)が第一の結合成分を形成する。トレーサー粒子(3)と、通常はリガンドまたは抗リガンドである結合物質(2)が第二の結合成分を形成する。次に、これらの結合成分は、試料中に存在する、通常はリガンドまたは抗リガンドである分析物(4)と接触すると凝集し、該免疫複合体(5)が結果として形成される。
本発明で使用され、本明細書において説明される概念は以下のような応用された意味を持つ:
・結合物質
特定の分子の独特な部位(例えばエピトープや抗原決定基)を認識し、そこに結合することができる任意の分子、リガンドもしくは抗リガンド、化合物、またはそれらの組み合わせ;
・リガンドまたは抗リガンド
免疫アッセイで使用される抗原や抗体のような、他の分子と複合体を形成する分子;
・第一の結合物質
捕捉粒子にコーティングされている、またはコーティングされる結合物質;
・第二の結合物質
標識粒子にコーティングされている、またはコーティングされる結合物質;
・捕捉粒子
高分子、プラスチック、ガラス、金属、セルロースなどからなる、結合物質の担体や固相として使われる固体粒子であって、不溶性にされているもの;または、リポゾーム、細胞、ウイルスを含む微生物のような、異なる非固体(弾性の)材料も捕捉粒子として機能することができる;
・標識
視覚または機器により検出または測定され得る信号を発生する、または発生するようにさせることができる物質;
・標識粒子
検出できるように標識された、任意の種類の高分子、プラスチック、ガラス、金属、セルロースなどからなる固体の粒子;またはリポゾーム、細胞、ウイルスを含む微生物のような、異なる非固体(弾性の)材料も標識粒子として機能することができる;
・第一の結合成分
第一の結合物質でコーティングされた捕捉粒子を含む成分;
・第二の結合成分
第二の結合物質でコーティングされた標識粒子を含む成分;
・結合成分
第一の結合成分および/または第二の結合成分を意味する;
・第一の結合複合体
分析物と第一の結合成分との複合体を意味する;
・第二の結合複合体
第一の結合複合体(第一の結合成分と分析物)と第二の結合成分の複合体を意味する;
・第三の結合複合体
分析物と第二の結合成分との複合体を意味する;
・免疫複合体または他の生体分子複合体
第一の、第二の、または第三の結合複合体を意味する;
・分析物
試料溶液中の存在が定量的または定性的に評価される化合物や物質であって、結合物質によって認識されて結合され得る、特異的な空間的または極性的配置を少なくとも一つは含むもの;分析物は溶液中で遊離(分離)していてもよく、または例えば細胞膜に結合していてもよい;
・分離装置
多孔性の表面が装備された、多孔性表面を囲む装置;
・多孔性表面
第二の結合成分や他の結合していない材料は通過させるが、第一の結合成分は通過させない、非結合材料から免疫複合体または他の生体分子複合体を分離するために使用される表面;多孔性表面は第一の結合複合体も第二の結合複合体も通過させない;多孔性表面は孔や開口を含む;
・孔または開口
これらの用語は本明細書において互換的に使用される;孔/開口は、第二の結成分や他の非結合材料が多孔性表面を通過する手段である;
・孔/開口の大きさ
粒子や材料が通過する能力を制限する孔/開口の寸法を意味する;大きさとは、例えば孔/開口の平均直径を意味することもあれば、孔/開口の平行する側面間の距離を意味することもある;
・粒子の大きさ
孔/開口を通過する能力を制限する粒子の寸法を意味する;大きさとは、例えば球状の粒子の平均直径を指し得る;
・分離手段または台
多孔性表面と同じ意で使用される;
・格子、グリル
粒子の大きさに比例した寸法の孔や開口のある多孔性表面の具体的な例である;
・二次元形式
物質は、表面を通過できないために、多孔性表面上を水平に移動する;多孔性表面の孔/開口よりも大きな粒子は二次元的に分離される;第一の結合成分、第一の結合複合体および第二の結合複合体は二次元分離される;
・三次元形式
物質は、表面を通過できるので、多孔性表面上を水平に移動し、かつ多孔性表面を通して垂直に移動する;多孔性表面の孔/開口よりも小さな粒子は三次元的に分離される;第二の結合成分は三次元分離される。
本発明は免疫複合体、または他の生体分子複合体を、該複合体が生成された後、非結合材料から分離する手段として、多孔性表面を使用する。複合体の分離は厳密に、多孔性表面(分離手段)上で起こる。
以下の実施例は本発明を説明する。特に示さない限り、使用される方法は標準的な生化学的、分子生物学的技術である。実施例は単に例として提示されるものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
ポリクローナルF(ab')2フラグメントを利用して、免疫複合体の分離に使用される格子上の該複合体の形成を測定する、第一および第二の粒子に結合した結合物質を用いるhCRPの連続的アッセイの手順(図4)
ヒトC反応性タンパク(hCRP)アッセイは炎症の指標として使用される。本実施例ではhCRPはキャリブレーター試料の中で測定された。まず、hCRPを0〜10mg/lの濃度で含む試料と緩衝液(trisベース)0.1mlを小さな遠心分離管に加える。その後10μlの抗CRP F(ab')2フラグメントでコーティングされた0.25%ラテックス粒子(直径10μm)を加え、管を5分間、混ぜながらインキュベートする。インキュベーションの後、管を0.5〜3分遠心分離(約16000×g)し、上清は廃棄する。CRPが結合したラテックス粒子は、次に遠心分離と吸引により非結合のCRPを除くために洗浄する。粒子は0.1mlの緩衝液に再び懸濁され、標識を含む結合物質でコーティングされたラテックス粒子(0.125%懸濁液、ラテックス粒子直径0.1μm)10μlを加える。5分間インキュベートした後、形成された免疫複合体、すなわち第一の結合物質を有する捕捉ラテックス-CRP-第二の結合物質を有する標識ラテックスが、反応成分を7.5μm(孔の直径)格子に移すことにより分離され、該格子(直径3mm)に通して濾過される。濾過工程は図2と図3に示されている。洗浄の後、格子に結合した免疫複合体の蛍光信号がカウントされる。信号は格子の免疫複合体の量に相関し、従って該複合体中のCRPの量、ゆえに試料中の分析物の量に相関する。
モノクローナル抗体を利用して、免疫複合体の分離に使用される格子上の該複合体の形成を測定する、第一および第二の粒子に結合した結合物質を用いるhSHBGの連続的アッセイの手順(図5)
ヒト性ホルモン結合グロブリン(hSHBG)アッセイは、ホルモン状態の一つの指標として使用される。本実施例では、細胞培養液の試料中の組換えhSHBGを測定した。まず、hSHBGを0〜200nmol/lの濃度で含む試料と緩衝液0.1mlを小さな遠心分離管に加える。その後モノクローナル抗SHBG抗体でコーティングされた0.25%ラテックス粒子(直径10μm)10μlを加え、管を5分間、混ぜながらインキュベートする。インキュベーション後、管を0.5〜3分遠心分離(約16000×g)し、上清は廃棄する。SHBGが結合したラテックス粒子は、次に遠心分離と吸引により非結合のSHBGを除くために洗浄する。粒子を0.1mlの緩衝液に再び懸濁し、標識を含む結合物質でコーティングされたラテックス粒子(0.125%懸濁液、ラテックス粒子直径0.1μm)10μlを加える。結合物質はモノクローナル抗体であり、第一の結合物質とは異なるSHBGへの特異性をもつ。5分間インキュベートした後、形成された免疫複合体、すなわち第一の結合物質を有する捕捉ラテックス-SHBG-第二の結合物質を含む標識ラテックスは、反応成分を7.5μm(孔の直径)格子に移すことにより分離され、該格子(直径3mm)に通して濾過される。濾過工程は図2と図3に示されている。洗浄の後、格子に結合した免疫複合体の蛍光信号がカウントされる。信号は格子上の免疫複合体の量に相関し、従って該複合体中のSHBGの量、ゆえに試料中の分析物の量に相関する。
Claims (21)
- (a)分析物に特異的に結合する結合物質が付着している粒子を含む第一の結合成分を、多孔性表面に加える工程;
(b)試料を該多孔性表面に加える工程;
(c)検出できるように標識された粒子を含む第二の結合成分を、該多孔性表面に加える工程;ならびに
(d)該多孔性表面上の検出できるように標識された粒子によって生成される、該試料中にある分析物の存在および/または量を示す信号を検出する工程
を含む、試料中の分析物の存在または量を検出するための方法であって、
ここで、該多孔性表面は、該第二の結合成分の該表面の通過を許すが、該第一の結合成分は通過させず、
該第一の結合成分と該分析物は互いに結合して第一の結合複合体を形成し、
該第二の結合成分と該第一の結合複合体が互いに結合して第二の結合複合体を形成するように、該検出できるように標識された粒子には、該第一の結合複合体に特異的に結合する結合物質が付着しており、かつ
第一の結合複合体および/または第二の結合複合体は多孔性表面上に保持される、方法。 - 試料と第一の結合成分を表面に加える前に互いに接触させる、請求項1記載の方法。
- 工程(a)が工程(b)の前に行われる、請求項1記載の方法。
- 試料、第一の結合成分、および第二の結合成分を、多孔性表面に加える前に互いに接触させる、請求項1記載の方法。
- 多孔性表面を通過することができる洗浄液を、工程(d)の前に該表面に加える工程をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 第二の結合成分が、分析物に特異的に結合する結合物質が付着している、検出できるように標識された粒子を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 多孔性表面が、金属、プラスチック、セラミック、ガラスまたはシリコンである材料を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 多孔性表面が分離装置を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 多孔性表面が、二次元および三次元形式の両方を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 多孔性表面が格子である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 第一の結合成分または第二の結合成分の粒子が、
(a)合成ポリマー、プラスチック、ガラス、金属もしくはセルロースを含むか;または
(b)リポゾーム、細胞もしくは微生物である、
前記請求項のいずれか一項記載の方法。 - 第一の結合成分の粒子が第二の結合成分の粒子よりも大きな平均直径をもつ、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 第一の結合成分の粒子が0.1μmから200μmの平均直径をもつ、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 第二の結合成分の粒子が1nmから1000nmの平均直径をもつ、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 多孔性表面が、二つの平行な側面をもち、平行な側面間の距離が第一の結合成分の粒子の平均直径よりも小さな、開口/孔を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 粒子を実質的にコーティングするのに十分な量の結合物質が、吸着または共有結合によって該粒子に結合している、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 結合物質が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはそのF(ab')もしくはF(ab')2フラグメントを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 粒子が、発光性、放射標識性、発色性、または磁性の材料を用いて検出できるように標識される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 分析物が抗原である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 抗原がC反応性タンパク質(CRP)または性ホルモン結合グロブリン(SHBG)である、請求項19記載の方法。
- (a)多孔性表面;
(b)分析物に特異的に結合して第一の結合複合体を形成する結合物質が付着している粒子を含む、第一の結合成分;および
(c) 第二の結合成分と該第一の結合複合体が互いに結合して第二の結合複合体を形成するように、該第一の結合複合体に特異的に結合する結合物質が付着している、検出できるように標識された粒子を含む、第二の結合成分
を含む、試料中の分析物の存在および/または量を検出するためのキットであって、第一の結合複合体および/または第二の結合複合体は、多孔性表面上に保持されうる、キット。
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