JP2001509891A - 分析物の免疫学的測定の方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は測定すべき分析物または分析物に特異な結合相手で被覆された磁性粒子と分析物に特異な結合相手または測定すべき分析物で被覆された直接検出可能な非磁性粒子を用いあるいは間接的に検出可能な非磁性物質を用い、反応混合物の培養を行って検体中の分析物を免疫学的に測定する方法に関する。この方法は次に磁性試験片を用いて磁性粒子を反応混合物から分離し分析物濃度を直接測定することを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】 分析物の免疫学的測定の方法 本発明は磁性および非磁性粒子を用いて検体溶液中の分析物（測定対象物質） を免疫学的に測定する方法に関する。 磁性および非磁性粒子を用いて分析物を測定する免疫学的方法は例えばＷＯ９ ５／０４２７９に開示されている。これらの方法において、磁性粒子は培養（イ ンキュベーション）の後に磁場によって反応溶液中で沈澱する；分析物は次に上 澄液中で測光的に測定される。JP・０５−５２８４９は磁石を備えたクロマトグ ラフ方式を述べている。この方式で毛管媒体(capillary medium)は濾過器の役割 を果たす。分析物を濾過器あるいは毛管中を通させる力は磁力である。 これらの既知の方法は多くの欠点をもっている。反応溶液中での沈降による粒 子の磁性分離には、さらに洗滌または分離工程がなければ分析物を直接測光的、 蛍光分析的または電気化学的に検出することはできないという欠点がある。濾過 装置がないと濾過器あるいは毛管が容易につまったり、粘度の問題が生じたりま た分析物がクロマトグラフ材に早々と、すなわち結合反応の前に、吸着され、し たがって確実に分析できるのは選ばれた検体材料だけであるということになる。 本発明は磁性粒子を用いて行う免疫学的方法において述べられた欠点をなくし 非常に簡単で信頼性のある方法を利用できろようにするという目的に基づいてい る。 本発明は測定すべき分析物または分析物に特異な結合成分で被覆された磁性粒 子と分析物に特異な結合成分または測定すべき分析物で被覆された直接検出可能 な非磁性粒子を用い、あるいは間接的に検出可能な非磁性物質を用い、反応混合 物の培養を行って検体中の分析物を免疫学的に測定する方法において、次に磁性 試験片を用いて磁性粒子を反応混合物から分離し、分析物濃度を直接測定するこ とを特徴とする方法に関する。 分析物の濃度は直接試験片で目視によりまたは反射率計を用いて (reflectometrically)測定することが好ましい。この測定はまた間接的に試験片 上 で呈色反応の展開によりまたは電気化学的に行うこともできる。 分析物は特に体液の診断上問題とされる成分、すなわちハプテンまたは抗原を 意味すると理解される。また分析物に特異な結合成分は単クローン性および多ク ローン性の抗体を意味すると理解される。 本発明の磁性試験片はフロッピーディスク、オーディオまたはビデオテープと 同様に例えば適当な磁化性顔料からつくることができる。非常に平らな永久磁石 が好ましく適している。希土類金属の合金を用いると、特に高い残留磁気をもつ 永久磁石をつくることができる。最も単純な場合、本発明の方法では、白い平滑 なカードで完全に被覆され端をプラスチックの接着性小片で密封された平らな永 久磁石を用いることが可能である。この磁性試験片は試験を行った後磁性粒子を 平滑な表面からぬぐい取ることによって多数回使用することができる。 試験片の表面に一般に行われているように抗体を直接結合させる方法と比べる と、この磁性試験片技術の大きな利点は分析物との反応が最初は均質または準均 質に進むという点にあると思われる。試験片と分析物の不均質反応において下位 検出範囲(lower detection range)を制限する拡散の問題は均質の媒体（medium ）の中では事実上何の役割も果たさない。 逆に、しばしば拡散が制限因子である不均質反応において、反応表面と分析物 溶液との間の物質交換(substance exchange)を改善するためにいろいろな処置が とられる（試験片表面を通る分析物の濾過）。しかしこれらの処置によって得ら れる利点は分析物と高い表面積をもつ小さな懸濁粒子との間の準均質反応の利点 を埋め合わせることはできない（孔拡散(pore diffusion)の結果起こる問題、目 づまり作用）。 原則として用いられる粒子は全て市販の磁性および非磁性粒子で、着色もでき るが、３０nmから８００μｍの大きさをもつ。適当な粒子は無機および有機粒子 、例えば鉄、ニッケル、コバルト、マンガンの磁性粒子、ネオジム、エルビウム などのランタニド系の元素、アルミニウム、ニッケル、コバルトおよび銅の合金 のような磁性合金粒子、Fe₃O₄、CrO₂、CoO、NiO₂、Mn₂O₃などの酸化物、フェラ イトとポリスチレンのような有機ポリマーなどの複合材料である。 本発明の方法は特定の結合成分が存在する分析物の検出に特に適している。検 出は例えば既知のサンドウィッチ免疫検定法または競合免疫検定法(competitive immenoassay)によって行われる。培養のあとで、磁性粒子は磁性試験片を用い て除去されるが、直接検出可能な非磁性粒子と間接的に検出可能な非磁性物質は それらが磁性粒子と結合しない限り、反応混合物中に残る。検出は試験片の表面 で直接的には、例えば異なった色に着色した非磁性粒子が存在するか否かを、あ るいは間接的には、例えば非磁性物質が酵素である場合、試験片上での呈色反応 の展開を(by the development of a color reaction)、目視して行われる。もし 非磁性物質が酵素である場合、検出を磁性試験片上で電気化学的に行うこともで きる。この場合試験片は磁性電極である。 着色した非磁性粒子を用いる分析物のサンドウィッチ法による直接免疫学的測 定は、例えば、単試薬(monoreagent)を検体溶液と一緒に培養するようにして行 われる。単試薬は分析物に特異な、好ましくは単クローン性の抗体で被覆された 磁性粒子と、好ましくは単クローン性の抗体で被覆された異なった色に着色した 非磁性粒子とよりなり、後者の抗体は分析物の他のエピトープ（抗原決定基）を 指向している(directed against)。これら粒子は適当な緩衝液の中で懸濁してい る。もし分析物が検体溶液中に存在するならば、異なった色に着色した非磁性粒 子は磁性粒子に結合することができる。十分な反応時間が過ぎた後、磁性粒子は 磁性試験片を用いて反応混合物から分離される。試験片の表面に結合した磁性粒 子は直接色目盛り(color scale)によって、あるいは反射率計(reflectometer)を 用いて目視で評価される。試験片上の変色(color change)は結合した非磁性の異 なった色の着色した粒子の数に直接基づくもので、また分析物の濃度に比例する 。二つの波長測定をすると磁性粒子と試験片の結合(attachment)における異質性 (in homogeneity)をさらに補うことができる。 競合検定法による免疫学的測定は、例えば二試薬(bireagent)を用い行われる 。試薬１は分析物に特異な（単クローン性または多クローン性）抗体で被覆され た磁性粒子を適当な緩衝液中に含有する。試薬２は測定すべき分析物で被覆され た、異なった色に着色した非磁性粒子を同じ緩衝液中に含有する。検体溶液をま ず、試薬１を用いて培養する。分析物が検体溶液中に存在する場合、磁性粒子上 の分析物に、特異な抗体の結合部位(binding sites)は検体中の分析物の濃度に 応じて 飽和される。適当な培養時間の後、試薬２を反応混合物に加える。もし抗体の結 合部位が既に分析物によって塞がれているのでなければ、分析物で被覆された異 なった色に着色した非磁性粒子は磁性粒子と結合することができる。一定の反応 時間を経た後、磁性粒子は本発明の磁性試験片を用いて反応混合物から取り除か れる。試験片の表面に結合した磁性粒子は直接色目盛りによってあるいは反射率 計を用いて目視で評価される。試験片上の変色は、結合した非磁性の異なった色 の着色した粒子の数に直接に基づくもので、また分析物濃度に逆比例する。二つ の波長測定をすると磁性粒子と試験片の結合における異質性をさらに捕うことが できる。二試薬はまた磁性粒子を分析物で被覆し、非磁性粒子を抗体で被覆する というように構成することもできる。検出の原理は変わらない。 サンドウィッチ法による非磁性物質、例えば酵素を用いる分析物の間接的免疫 学的測定は次のように行われる。分析物に特異な、好ましくは単クローン性抗体 で被覆された磁性粒子を緩衝液中に含み、かつ好ましくは単クローン性抗体に結 合しているが、磁性粒子状の抗体以外の分析物のエピトープを指向する抗体を含 有する非磁性物質、好ましくは酵素を含む単試薬を検体溶液と共に培養する。も し分析物が検体中に存在するならば非磁性物質は磁性粒子に結合する。一定の反 応時間が過ぎた後で、磁性粒子は磁性試験片を用いて反応混合物から除かれる。 次に非磁性物質の検出のための化学反応が試験片上で行われる。もし非磁性物質 が酵素であるならば、例えば試験片上で固定化されたロイコ染料を酵素によって 染料を変えることが可能である。試験片上の変色は色目盛りにより、または反射 率計を用いて、直接目視で評価することができる。変色は分析物濃度に比例する 。 緩衝液としては例えばりん酸塩緩衝液、トリス、ほう酸塩、HEPESやPIPESの緩 衝液のような５ないし９のpH範囲を維持できるものが適している。 実施例１ 競合検定法(competitive assay)によるコルチゾールの測定 試薬１： 抗コルチゾール抗体で被覆された懸濁磁性粒子を含有する５０mMり ん酸塩緩衝液 試薬２： アルカリ性ホスファターゼに結合したコルチゾールを含有する５０ mMりん酸緩衝液 ３０μｌの検体溶液（血清）を１５０μｌの試薬１と共に３分間予備培養し、 次にさらに３分間１５０μｌの試薬２で培養する。磁性試験片を反応溶液に短時 間浸すと（１分間）、懸濁磁性粒子は試験片の表面に結合する。次に試験片を１ 分間基質溶液（りん酸パラニトロフェニル溶液）に浸漬する。約５分間の反応時 間の後、分析物濃度を基準（対照）試験片と色を比較して定性的に測定する。 反応において、置換競合(displacement competition)が血清の全コルチゾール とアルカリ性ホスファターゼで標識されたコルチゾールとの間で起こる。粒子に 結合した標識コルチゾールの量が高いほど、血清中のコルチゾールの量は低い。 試験片の変色は分析物の濃度に逆比例する。 実施例２ フェリチンの定量 試薬１： 抗フェリチン抗体で被覆された懸濁磁性粒子を含有する０.２Ｍト リス緩衝液 試薬２： アルカリ性ホスファターゼに結合したフェリチンを含有する０.２ Ｍトリス緩衝液 測定は基質溶液としてりん酸パラニトロフェニルを用い実施例１と同様に行わ れる。４分間の反応時間の後に、フェリチンの濃度は磁性試験片を基準（対照） 試験片と色を比較して定性的に測定する。 実施例３ 水性検体中のTNT（トロボニンＴ）の測定 TNT試薬は抗TNT抗体（IgG1、ロット：SDIから１０３７２６)で被覆された懸濁 磁性粒子（１００μg／ml）を含有するpH7.4の５０mMりん酸塩緩衝液（試薬１） と緩衝競合溶液（TNT−アルカリ性ホスファターゼ抱合体、ロット：１０３８８ １、SDI、５０mMトリス緩衝液中１：８０に稀釈、pH8.0、0.15M NaCl、１mM MgC l₂・6H₂O、0.1mM ZnCl₂、2.5％BSA、５％スクローズ、0.1％ NaN₃）（試薬２） よりなる。 １００μｌの検体（４０mM HEPES緩衝液中TNT溶液）を１５０μｌの試薬１で ２分間予備培養し次にさらに２分間１５０μｌの試薬２で培養する。磁性試験片 を反応溶液中に浸すと（１分間）、懸濁磁性粒子は試験片の表面に結合す る。次に試験片を１分間基質溶液（硫酸パラニトロフェニル溶液）中に浸漬する 。さらに４分の反応時間の後、分析濃度を基準（対照）試験片と色を比較して定 性的に測定する。全分析時間は約１０分である。 反応において、置換競合が水性検体のTNTとAP―標識のTNTの間でおこる。粒子 に結合した標識TNTの量が高いほど水性検体のTNT含量は低い。反応の後、磁性粒 子は試験片に結合し基質溶液中で培養される。試験片の変色は分析物濃度に逆比 例する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．測定すべき分析物または分析物に特異な結合成分で被覆された磁性粒子と分 析物に特異な結合成分または測定すべき分析物で被覆された直接検出可能な非磁 性粒子を用い、あるいは間接的に検出可能な非磁性物質を用い、反応混合物の培 養を行って検体中の分析物を免疫学的に測定する方法において、次に磁性試験片 を用いて磁性粒子を反応混合物から分離し分析物濃度を直接測定することを特徴 とする方法。 ２．分析物濃度を直接磁性試験片で測定することを特徴とする、請求項１による 分析物を免疫学的に測定する方法。 ３．分析物濃度のを間接的に呈色反応の展開によりあるいは電気化学的に測定す ることを特徴とする、請求項１および２による分析物を免疫学的に測定する方法 。