MX2007007119A - Inmunoensayo de flujo lateral eficiente de muestra. - Google Patents
Inmunoensayo de flujo lateral eficiente de muestra.Info
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Abstract
Se proporciona un dispositivo de ensayo de flujo lateral para detectar la presencia o cantidad de un analito que reside en una muestra de prueba en donde el dispositivo en un ensayo de flujo lateral tiene una membrana porosa en comunicacion con una almohadilla conjugada y una almohadilla de transmision. La membrana porosa tiene una zona de deteccion la cual tiene un primer reactivo de captura inmovilizado configurado por aglutinar a por lo menos una parte del analito y complejos conjugados-analito para generar una senal de deteccion. Una zona de control puede estar localizada hacia abajo de la zona de deteccion sobre la membrana porosa y tiene un segundo reactivo de captura inmovilizado dentro de la zona de control. La almohadilla conjugada esta localizada hacia arriba de la zona de deteccion, y tiene una sondas de deteccion con miembros aglutinantes especificos para el analito. La muestra es depositada entre las zonas de control y deteccion. Una zona de liberacion de amortiguadores esta localizado hacia arriba de la almohadilla conjugada y proporciona adicion de amortiguador al dispositivo, el amortiguador sirve para mover las zonas de deteccion a la zonas de deteccion y de control.
Description
INMUNOENSAYO DE FLUJO LATERAL EFICIENTE DE MUESTRA
Antecedentes de la invención
Hay varios métodos de inmunoensayos muy conocidos que emplean inmunoreactivos etiquetados, con un componente que puede ser detectado de manera de que el analito puede ser detectado analíticamente. Por ejemplo, los ensayos de tipo "emparedado" típicamente involucran el mezclar la muestra de prueba con sondas que pueden ser detectadas, tal como el látex teñido o un radioisótopo, los cuales son conjugados con un miembro aglutinante específico para el analito. Las sondas conjugadas forman complejos con el analito. Estos complejos entonces alcanzan una zona de anticuerpos inmovilizados en donde ocurre el aglutinamiento entre los anticuerpos y el analito para forma los "complejos de emparedado" ternarios. Los complejos de emparedado están localizados en la zona para la detección del analito. Esa técnica puede ser usada para obtener resultados cuantitativos ó semicuantitativos . Una técnica alterna es el ensayo "de tipo competitivo" . En un ensayo de "tipo competitivo" , la etiqueta es típicamente un analito etiquetado ó un análogo-monolito que compite para el aglutinado de un anticuerpo con cualquier analito no etiquetado presente en la muestra. Los ensayos competitivos son típicamente usados para la detección de analitos tal como haptenos, cada hapteno siendo monovalente capaz de aglutinar solo a una molécula de anticuerpo .
Otro tipo de ensayo es el ensayo de inhibición/ sobre flujo en donde un analito es desvestido sobre una primera línea con mayor anticuerpo que es especifico para el anticuerpo sobre las partículas conjugadas (por ejemplo, anti-ratón de Cabra ó "GAM" ) es desvestida enseguida. En este ensayo, cualquier analito que esta presente aglutinará al as partículas conjugadas teniendo un anticuerpo (ú otro aglutinante) que es especifico al analito. A los niveles debajo de una cierta cantidad de umbral de analito, las partículas no serán completamente cubiertas, por ejemplo no se inhibirán completamente por el analito, y por tanto aun serán capaces de formar un complejo en la primera línea desvestida con analito. Esta línea de inhibiciones esencialmente actúa para remover/aglutinar el conjugado cuando el analito esta debajo de un nivel de umbral. La siguiente línea, la cual consiste de un anticuerpo que reconoce al anticuerpo sobre las partículas conjugadas, actuará como una línea de "sobre flujo". Esta aglutina partículas (haciendo por tanto que se forme una línea coloreada) solo en caso de los niveles de analito arriba del nivel de umbral. Además, una línea de control positivo puede ser usada, tal como una línea de anti-conejo cabra ("GAR") desvestida para capturar una población diferente de partículas conjugadas (por ejemplo aquellas teniendo anticuerpo de conejo sobre estas, por ejemplo) . Esta línea debe siempre formase tan pronto como la prueba sea viable y se haya llevado acabo adecuadamente .
Los ensayos de flujo lateral ó de flujo continuo se han hecho muy comunes para mucho analitos pero muchos requieren un tamaño de muestra relativamente grande a fin de permitir el flujo de la muestra y de las partículas de conjugado etiqueta que es característico del ensayo de flujo lateral. Más particularmente, los ensayos de flujo lateral actualmente disponibles se emplean conjugados que están localizados hacia debajo de un punto de deposito de muestra y hacia arriba de una zona de detección. La muestra misma esta basada sobre el de suspender los conjugados y llevarlos a la zona de detección. Alternativamente, el diluente adicional puede ser agregado con la muestra para llevar la muestra a la almohadilla de conjugado, ayudar a volver a suspender las partículas de conjugado y después alcanzar la zona de detección. En cualquier caso, la dicción de muestra es típicamente aplicada hacia arriba de las partículas de conjugado para ayudar en la resuspensión de las partículas. No te que "hacia arriba" "hacia abajo" se refiere a la posición de un articulo en relación a la dirección de flujos de una muestra de dispositivo de ensayo.
A pesar de los beneficios logrados de estos dispositivos, estos no siempre producen la intensidad de señal (línea) deseada. Esto limita las circunstancias en las cuales estos pueden ser usados ya que la señal puede no ser visible a los niveles bajos de analito. Los ensayos convencional también
pueden hacerse menos confiables debido al color rojo intenso de la muestra (sangre) o debido a la viscosidad de la muestra la cual puede provocar problemas con el flujo de la muestra. Existen la necesidad por tanto de una técnica mejorada de ensayar que puede dar intensidad de señal (líneas) más fuertes, así como resultados confiables sin requerir un volumen de muestra grande.
Síntesis de la invención
De acuerdo con una incorporación de la presente invención, esta descrito en un dispositivo de ensayo para detectar la presencia o cantidad de un analito que reside en una muestra de prueba. El dispositivo de ensayo comprende una almohadilla de conjugado que esta en comunicación de líquido con una membrana porosa que también esta en comunicación con una almohadilla de transmisión. Deberá notarse que es posible que la almohadilla de conjugado, la membrana porosa y la almohadilla de conjugado, la membrana porosa y la almohadilla de transmisión pueden ser un material único teniendo la función de todas estas tres áreas.
La membrana porosa puede hacerse de cualquiera de una variedad de materiales a través de los cuales las sondas de detección son capaces de pasar, por ejemplo como la nitrocelulosa . La membrana porosa tiene una zona de detección en donde el primer reactivo de captura es inmovilizado. El
primer reactivo de captura esta configurado para aglutinar a por lo menos una parte de la analito y el conjugado-analito compleja para generar una señal de detección. El primer reactivo de captura puede ser seleccionado al grupo que consiste de antígenos, haptenos, proteína A o G, neutravidina, avidina, estreptavidina, captavidina, anticuerpos primarios y secundarios, y complejos de los mismos. El primer reactivo de captura puede como por ejemplo, aglutinar a complejos formados entre el analito y las sondas de detección conjugadas.
La zona de control esta localizada sobre la membrana porosa hacia debajo de la zona de detección. Un segundo reactivo de captura es inmovilizado dentro de la zona de control que esta configurada para aglutinar al conjugado, al complejo de analito-conjugado ó a la s sondas puras, para indicar que el ensayo se llevo acabo adecuadamente. En una incorporación el segundo reactivo de captura y seleccionado del grupo que consiste de antígenos, haptenos, polielectrolitos, proteína A ó G, neutravidina, avidina, estreptavidina, captavidina, anticuerpos primarios ó secundarios y complejos de los mismos.
La almohadilla conjugada contiene sondas de detección que señala la presencia del analito. La almohadilla de conjugado también puede influir otras poblaciones de sonda diferentes incluyendo sondas para la indicación en la zona de control. Si se desea, las sondas de detección pueden comprender
una sustancia seleccionada del grupo que consiste de cromógenos, catalizadores, compuesto luminiscentes (por ejemplos fluorescentes, fosforescentes, etcétera), compuestos radioactivos, etiquetas visuales, partículas (por ejemplo teñidas, de oro, de plata, de otros materiales óptimamente densos) liposomas y combinaciones de los mismos. El miembro aglutinante especifico puede ser seleccionado del grupo que consiste de antígenos, haptenos, aptámeros, anticuerpos primarios ó secundarios, biotina y combinaciones de los mismos.
En la comunicación del líquido con el extremo de la almohadilla conjugada hacia fuera de la membrana hay una zona de liberación de amortiguador. Después de que la muestra sea depositado sobre el dispositivo entre las zonas conjugadas y detección, un amortiguador es liberado de arriba en la zona de liberación de amortiguador. El amortiguador lava las sondas desde la almohadilla de conjugado hacia la zona de detección en donde las sondas serán capturadas en la zona de detección por el analito si esta presente, y darán un resultado positivo. Si la muestra no contiene analito, la línea de detección será negativa. La mezcla de amortiguador, aun conteniendo algunas sondas (las cuales pueden incluir sondas diferentes de las sondas de detección) , continua a la zona de control en donde un reactivo captura las sondas de conjugado, de complejo de analito-conjugado ó puras para indicar que el ensayo esta funcionando adecuadamente.
La almohadilla de transmisión esta en comunicación de liquido con la membrana y proporciona una fuerza de impulsión para le movimiento del liquido.
El método involucra agregar la muestra hacia debajo de las partículas, más bien que en la ubicación convencional la cual esta hacia arriba desde las partículas. Después del deposito de la muestra, el diluente es liberado a en un punto sobre la tira de prueba hacia arriba de las partículas. El diluente entonces proporciona el fluido requerido para volver a suspender las partículas de manera que estas pueden fluir hacia debajo de la tira de prueba. Depuse de hacer contacto con las partículas, la mezcla de partícula-diluente fluye hacia abajo hasta el punto de hacer contacto con la muestra (por ejemplo sangre) para le resto del ensayo. Se ha encontrado que este método aumenta la intensidad de señal de línea en algunos casos.
De acuerdo con otra incorporación de la presente invención, un método para detectar la presencia o cantidad de un analito que reside en una muestra de prueba esta descrita. El método incluye los pasos de:
i) proporcionar un dispositivo de ensayo de flujo lateral que tiene una membrana porosa en comunicación de liquido con un almohadilla de conjugado y una almohadilla de transmisión, la almohadilla teniendo sondas de detección
conjugadas con un miembro aglutinante especifico para el analito, la membrana porosa define una zona de detección en la cual un primer reactivo de captura esta inmovilizado y una zona de control dentro de la cual un segundo reactivo de captura esta inmovilizado, en donde la zona de control esta localizada hacia abajo de la zona de detección,, la almohadilla de conjugado esta localizada hacia arriba de la membrana porosa y la zona de liberación de amortiguadores esta hacia arriba de la almohadilla de conjugado;
ii) Poner en contacto a la muestra de prueba conteniendo el analito con el dispositivo hacia abajo de la almohadilla de conjugado;
iii) liberar un amortiguador en la zona de liberación de amortiguador de manera que el amortiguador llevará las sondas de detección al área de aplicación de muestra, y entonces a las zonas de detección y control;
iv) detectar la señal de detección.
Otras características de aspectos de la presente invención están discutidas en mayor detalle abajo.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una vista en perspectiva de una incorporación de un dispositivo de ensayo de flujo lateral de la presente invención.
Descripción Detallada
Como se usó aquí el término "analito" generalmente se refiere a una sustancia que va ser detectada. Por ejemplo, los analitos pueden incluir sustancias antigénicas, haptenos, anticuerpos y combinaciones de los mismos. Los analitos incluyen, pero no se limitan a toxinas, compuestos orgánicos, proteínas, péptidos, microorganismos, aminoácidos, ácidos nucleicos, hormonas, esteroides, vitaminas, drogas (incluyendo aquellas administradas para propósitos terapéuticos así como aquellas administradas para propósitos ilícitos), intermediarios de droga ó subproductos, bacterias, partículas de virus, hongos, intermediarios de droga o subproductos, bacterias, partículas de virus, hongos, levaduras, protozoos y metabolitos de ó anticuerpos para cualquiera de las sustancias anteriores. Los ejemplos específicos de algunos analitos incluyen ferritina; creatinina quinasa MB (CK-MB) ; digoxina; fenitoina; fenobarbitol ; carbamazepina, vanco icina, gentamicina; teofilina; ácido valpróico; quinidina; hormona luteinizante (LH) ,- hormona estimuladora de folículo (FSH) ; estradiol, progesterona;
proteína C-reactiva; lipocalinas; anticuerpo IgE; citoquinas micro-globulina B2 ; hemoglobina alicatada (Gly-Hb) ; cortisol; digitoxina N-acetilprocainamida (NAPA) ; procainamida; anticuerpos para rubéola tal como rubéola IgG y rubéola IgM; anticuerpos para toxoplasmósis tal como toxoplasmósis IgG (Toxo-IgG) y toxoplasmósis IgM (Toxo-IgM) ,- testosterona; salicilatos; acetaminofen; antígeno de superficie de virus de hepatitis B (HBsAg) ; anticuerpos para antígenos de núcleo de hepatitis B tal como antígeno de núcleo anti-hepatitis B IgG e IgM (Anti-HBC) ;virus de inmunodeficiencia humana 1 y 2 (VIH 1 y 2) ; virus de leucemia de célula T-humana virus 1 y 2 (HTLV) ; Hepatitis Be antígeno (HBeAg) ; anticuerpos para la hepatitis B e antígeno (Anti-HBe) ; virus de Influenza; hormona estimuladora de la tiroides (TSH) ; tiroxina (T4); triyodotironina total (total T3) ; triyodotironina libre (T3 libre) ; antígeno carcinoembrióico (CEA); lipoproteínas, colesterol; y triglicéridos; y fetoproteina alpha (AFP) . Las drogas y abuso y sustancias controladas incluyen, pero no se intenta que estén limitadas a anfetaminas; meto anfetaminas; barbitúricos, tal como amobarbital, secobarbital, pentobarbital; fenobarbital; y barbital; benzodiazepinas, tal como librium y valium; cannabinoides, tal como hashish y marihuana; cocaína; fentanil; LSD; metacualona, narcóticos, tal como heroína, morfina, codeína; hidromorfona, hidrocodona, metadona, oxicodona, oximorfona, y opio; feniciclidina, y propoxieno. Otros analitos potenciales pueden estar descritos en la patente de los Estados Unidos de América numero. 4,436,651.
Como se uso aquí, el termino "muestra de prueba" generalmente se refiere a un material que se sospecha de contener el analito. La muestra de prueba puede como por ejemplo incluir materiales obtenido directamente de una fuente, así como materiales tratados previamente usando técnicas, tal como, pero no limitándose a la filtración, precipitación, dilución; destilación, mezclado, concentración y inactivación, de componentes en interferencia, la adición de reactivos, lisina y otros. La muestra de prueba puede ser derivada de una fuente biológica tal como fluido fisiológico, incluyendo sangre, fluido de intersticio, saliva, fluido de lente ocular, fluido cerebro espinal, sudor, orina, leche, fluido ascitos, mucosa fluido sinovial, fluido peritoneal, fluido vaginal, fluido amniótico, o similar. Además de los fluido fisiológicos, pueden ser usados otras muestra de liquido tal como agua, productos de alimentos y otros, además, un material sólido sospecha de contener el analito también puede ser usado como la muestra de prueba.
En general, la presente invención esta dirigida a un dispositivo de ensayo de flujo lateral para detectar la presencia o cantidad de un analito que reside en una muestra de prueba .
En los métodos de flujo lateral convencionales, la muestra es típicamente aplicada hacia arriba de la ubicación
de las partículas conjugadas inmovilizadas, de manera que la muestra puede ayudar a resuspender las partículas para permitir que proceda la prueba. En contraste, sin embargo, la presente invención describe un método y /o una ubicación novedosa para aplicar la muestra a fin de reducir o eliminar los problemas asociados con las muestras de bajo volumen, tal, como por ejemplo, en los ensayos a base de sangre. En este caso la aplicación especializadas, en donde el volumen de muestra puede ser más limitado (por ejemplo, basado en sangre y/aplicaciones a base de hisopo) , un diluente puede ser usado para mezclar con la muestra para por tanto disminuir la cantidad de fluido del cuerpo requerida. En estos casos, el diluente mismo puede provocar una re suspensión de la s partículas inmovilizadas.
Los ensayos conocidos requieren que el analito de objetivo en una muestra de un punto de depósito a un punto en donde puede ser detectado. Los ensayos conocidos mueven la muestra a través de un área que contiene partículas conjugadas y después a una zona de detección. Algunos de estos ensayos conocidos usan un diluente líquido ó (amortiguador) para mover la muestra a las partículas conjugadas y sobre la zona de detección.
En contraste a los ensayos conocidos, el dispositivo presente permite la muestra el ser depositada hacia debajo de las partículas conjugadas. Un diluente (por ejemplo un amortiguador) es después liberado y mueve las partículas
inicialmente localizadas sobre una almohadilla conjugada, a la muestra localizada entre las partículas y la zona de detección.
Los inventores han descubierto que permitiendo que las partículas de detección al moverse con el diluente a la muestra la cual se agregado hacia abajo de las partículas, se permite el uso de muestras de un volumen muy pequeño. El diluente sirve para resuspender muy eficientemente las sondas de detección de manera que esta puedan moverse además hacia abajo de la almohadilla conjugada y alo largo de la membrana para proporcionar un resultado de prueba. Este método es contra-intuitivo ya que la muestra de líquido en los dispositivos de flujo lateral convencionales es usada para volver a suspender las partículas conjugadas. Además, es convencionalmente deseado que la muestra de las partículas esté en contacto a fin de que ocurra el inmunoensayo y aglutinamiento. Se ha encontrado sorprendentemente, sin embargo, que el método presente en donde la muestra es aplicada hacia abajo de la partículas de las partículas, y después "casado" por las partículas conjugadas resuspendidas en el diluente, puede actualmente aumentar la intensidad de señal en algunos casos .
El dispositivo utiliza una membrana porosa que tiene una almohadilla conjugada, una zona de aplicación de muestra y una zona de detección. La zona de detección tiene reactivos de captura inmovilizados . La zona de detección de
muestra puede estar localizada sobre el material de almohadilla conjugada que esta hacia abajo desde las partículas inmovilizadas como esta puede ser una u icación frontal sobre la membrana (hacia arriba de la zona de detección) o esta puede ser un material separado que esta localizado entre la almohadilla conjugada y la membrana con la zona de detección. El dispositivo de que más se usa una zona de liberación de diluente sobre el extremo hacia arriba del dispositivo antes de la zona de aplicación de muestra y una almohadilla de conjugado localizada entre la zona de libración del diluente y la muestra. Una almohadilla de transmisión esta en comunicación del liquido con en extremo opuesto de la membrana porosa sobre el extremo hacia abajo del dispositivo. En el uso, la muestra es aplicada en la zona de aplicación de muestra y después de un periodo de tiempo, el diluente es liberado. El diluente vuelve a suspender y lleva las partículas conjugadas a la muestra y a un adicionalmente hacia abajo de la zona de la zona de detección, resultando en una indicación de la presencia del analito.
Los ejemplos de los analitos adecuados que pueden ser detectados usando al invención incluyen, pero no se limitan a toxinas, compuestos orgánicos, proteínas, péptidos, microorganismos, aminoácidos, ácidos nucleicos, hormonas, esteroides, vitaminas, drogas (incluyendo aquellas administradas para propósitos terapéuticos así como aquellas administradas para propósitos ilícitos) , intermediarios ó
subproductos de droga, bacterias, partículas de virus, levaduras, hongos, protozoos y metabolitos de ó anticuerpos para cualquiera de las sustancias anteriores. Los ejemplos específicos de algunos analitos se í incluyen ferritina, creatinina quinasa MB(CK-MB); digoxina; fenitoina; fenobarbitol; carbamazepina, vancom.icina, gentamicina; teofilina; ácido valpróico; quinidina; hormona luteinizante (LH) ; hormona estimuladora de folículo (FSH) ; estradiol, progesterona; proteína C-reactiva; lipocalinas ; anticuerpo IgE citosinas micro-globulina B2 ; hemoglobina alicatada (Gly-Hb) cortisol; digitoxina N-acetilprocainamida (NAPA); procainamida anticuerpos para rubéola tal como rubéola IgG y rubéola IgM anticuerpos para toxoplasmósis tal como toxoplasmósis IgG (Toxo- IgG) y toxoplasmósis IgM (Toxo-IgM) ; testosterona; salicilatos; acetaminofen,- antígeno de superficie de virus de hepatitis B (HBsAg) ; anticuerpos para antígenos de núcleo de hepatitis B tal como antígeno de núcleo anti-hepatitis B IgG e IgM (Anti-HBC) ; virus de inmunodeficiencia humana 1 y 2 (VIH 1 y 2) ; virus de leucemia de célula T-humana virus 1 y 2 (HTLV) ; Hepatitis Be antígeno (HBeAg) ; anticuerpos para la hepatitis B e antígeno (Anti-HBe) ; virus de Influenza; hormona estimuladora de la tiroides (TSH) ; tiroxina (T4); triyodotironina total (total T3); triyodotironina libre (T3 libre); antígeno carcinoembrióico (CEA); lipoproteínas, colesterol; y triglicéridos; y fetoproteina alpha (AFP). Las drogas y abuso y sustancias controladas incluyen, pero no se intenta que estén limitadas a anfetaminas; metoanfetaminas ; barbitúricos, tal
como amobarbital, secobarbital, pentobarbital; fenobarbital; y barbital; benzodiazepinas, tal como librium y valium; cannabinoides, tal como hashish y marihuana; cocaína; fentanil; LSD; metacualona, narcóticos, tal como heroína, morfina, codeína; hidromorfona, hidrocodona, metadona, oxicodona, oximorfona, y opio; fenciclidina, y propoxieno. Otros analitos potenciales pueden estar descritos en la patente de los Estados Unidos de América numero. 6,436,651.
Refiriéndose a la figura 1, una incorporación de un dispositivo de ensayo de flujo lateral 20 que puede ser formado se describirá en mayor detalle. Deberá notarse que el termino entre "flujo lateral" se quiere que sea descriptivo y no limitante, ya que el dispositivo puede ser configurado en otras maneras con el mismo efecto. Los dispositivos de flujo radial ó vertical pueden fácilmente ser previstos, por ejemplo, empleando el mismo principio que la presente invención sin departir del espíritu de la invención. Como se mostró, el dispositivo 20 contiene una membrana porosa 22 opcionalmente soportada por un material rígido 24. La membrana porosa 22 tiene una zona de detección (en línea) 30. La membrana porosa 22 también tiene una zona de control (ó línea) 32.
En general, la membrana porosa 22 puede hacerse de cualquiera de una variedad de materiales a través de los cuales son capaces de pasar las sondas de detección. Por ejemplo, los materiales usados para formar la membrana porosa
22 pueden incluir, pero no se limitan a materiales naturales, sintéticos lo que ocurre naturalment , que son modificados sintéticamente tal, como polisacáridos (por ejemplo, materiales de celulosa tal como papel y derivados de celulosa, tal como acetato de celulosa y nitrocelulosa) ; sulfona poliéter; polietileno, nylon; fluoruro de polivinilideno (PVDF) ; poliéster; polipropileno sílice; materiales inorgánicos, tal como alúmina desactivada, tierra diatomácea, MgS04, u otro material finamente dividido inorgánico dispersado uniformemente en una matriz de polímero poroso con polímeros tal como cloruro de vinilo, copolímero de propileno-cloruro vinilo, y copolímero de acetato de vinilo-cloro de vinilo; paño, ambos ocurriendo naturalmente (algodón) y sintético (por ejemplo nylon ó rayón) ; geles porosos, tal como gel de sílice, agarosa, dextran y gelatina; películas poliméricas tal como poliacrilamida; y similares. En un incorporación particular, la membrana porosa 22 esta formada de nitrocelulosa y/ o de materiales de sulfota poliéter. Deberá entenderse que el termino "nitrocelulosa" se refiere a este ácido nítrico de celulosa, los cuales pueden ser nitrocelulosa sola, ó una mezcla de éster de ácido nítrico y otros ácidos, tal como ácidos carboxílicos o linfáticos teniendo de desde una 7 tomas de carbono. Las membranas adecuadas incluyen membrana de nitrocelulosa HF075 y HF120 de Millipore Corporation de Billerica, Massachussets, Estados Unidos de América.
El dispositivo 20 también puede contener una almohadilla de transmisión 26. La almohadilla de transmisión 26 recibe fluido que ha negado a través de la membrana porosa completa 22. Como se conoce bien en el arte, la almohadilla de transmisión 26 puede ayudar a promover la acción capilar y el flujo de fluido a través de la membrana "¿2 .
El dispositivo 20 tiene una zona de liberación diluente 34. En una incorporación, la zona de liberación diluente 34 tiene un deposito diluente 36 dentro del cual puede ser almacenado el diluente 38. El diluente 38 puede alternativamente ser suministrado por un depósito separado. El diluente 28 puede ser cualquier liquido que llevará hacia fuera las sondas de detección usadas en la invención. Los ejemplos de los diluentes adecuados incluyen solución de agua salada amortiguada con fosfato (PBS) (pH 7.2), solución de agua salada tris-amortiguada (TBS) (pH de 8.2) o 2- (N morfolino) ácido sulfónico etano (MES) (ph de 5.3). Esto puede contener otros aditivos para ayudar al desempeño del ensayo, tal como los surfactantes, polímeros solubles en agua, proteínas, bloqueadora para evitar un aglutinamiento no específico, y preservativos .
Una almohadilla conjugada 40 está en comunicación de liquido con la zona de liberación de diluente 34 y esta localizada entre la zona de liberación de diluente 34 y la zona de membrana porosa 22 de manera que al moverse el diluente 38
desde la zona de liberación de diluente 34 este abravecerá la zona conjugada 40 y llevará las partículas de conjugado a la zona de detección 30 y a la zona de control 32 sobre la membrana poroso 22. La mayoría del conjugado 40 esta formada de material a través de cual es capas de pasar el diluente. La almohadilla de conjugada 40 puede ser formada de fibras de vidrio, por ejemplo, cuando solo es demostrada una almohadilla conjugada 40, deberá entenderse que otras almohadillas conjugadas pueden también ser usada en la presente invención.
Para iniciar la detección de un analito dentro de la muestra de prueba, un usuario puede aplicar directamente, poner en contacto depositar la muestra de prueba en una zona de aplicación 42 entre la almohadilla conjugada 40 y una parte de zona de detección 30 de la membrana porosa 22. Una ves que la muestra ha hecho contacto con la zona de aplicación 42 el diluente 38 es liberado en la zona de liberación de diluente 34. El diluente 38 puede ser aplicado por medio de un depósito integral, o por medio de una fuente separada tal como mediante una pipeta ó cualesquier otros medios efectivos conocidos por aquellos expertos en el arte. El diluente 38 se desplaza a través de la almohadilla conjugada 40 de manera que esta en comunicación de líquido con la membrana porosa 22 a la zona de aplicación 42, a la zona de detección 30 y a la zona de control 32.
Una cantidad predeterminada de por lo menos un tipo de partículas conjugadas es aplicada sobre la almohadilla conjugada a fin de facilitar una detección exacta de la presencia ó ausencia de un analito dentro de la muestra de prueba. Cualquier sustancia generalmente capaz de generar una señal que es detectable visualmente ó mediante un dispositivo instrumental puede usarse como sondas de detección. Varias sustancias adecuadas pueden incluir cromógenos; catalizadores; compuestos luminiscentes (por ejemplo fluorescentes, fosforescentes, etcétera); compuestos radioactivos; etiquetas visuales; incluyendo partículas metálicas (oro) y no metálicas coloidales, partículas entintadas, enzimas ó sustratos, ó partículas de látex de polímero orgánico; liposomas ó otras vesículas conteniendo sustancias que producen señales y otros. Algunas enzimas adecuadas para usarse como sondas de detección están descritas en la patente de los Estados Unidos de América numero 4,275,149. Un ejemplo de un de un sistema de enzima / sustrato es la enzima alcalina fosfatasa y el sustrato nitro azul tetrazolio-5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato, ó un derivado de ó análogo del mismo, ó el sustrato 4-metil lumbeliferil-fosfato. Otras partículas conjugados adecuados pueden esta descritas en las patente de los Estados Unidos de América numero 5,670,381 y 5,252,459. En algunas incorporaciones, las partículas conjugadas pueden contener un compuesto fluorescente que produce una señal detectable. El compuesto fluorescente puede ser una molécula fluorescente, polímero, dendrímero, partícula y otros. Algunos ejemplos de
las moléculas fluorescentes adecuadas, por ejemplo, incluyen, pero no se limitan a fluoresceína, quelatos de europio, ficobiliproteína, rodamina, y sus derivados y análogos.
Las partículas conjugadas, tal como se describe arriba pueden ser usadas solas ó en conjugación con micro partículas (algunas veces llamadas como "cuentas" ó "micro cuentas"). Por ejemplo, las micropartículas que ocurren naturalmente, tal como los núcleos, microplasma, plásmidos, plástidos, células de mamífero (por ejemplo, eritrocito fantasma) , microorganismo unicelulares (por ejemplo bacterias) , polisacáridos (por ejemplo agarosa) y otros pueden ser usados. Además, también pueden ser utilizadas las micropartículas sintéticas. Por ejemplo en una incorporación, las micropartículas de látex que están etiquetas con un tinte fluorescente ó coloreado son utilizadas. Aun cuando cualquier micro partícula de látex puede ser usada en la presente invención, las micro partículas de látex son típicamente formadas de poliestireno, butadieno estireno, terpolímero de vinilo-estirenoacrílico, polimetil metacrilato, polietil metacrilato, copolímero de anhídrido maléico-estireno, acetato de polivinilo, polivinil piridina, polidivinil benceno, polibutileno tereftalato, acrilonitrilo, vinilcloruro-acrilatos y otros o una aldehido, carboxilo, amino, hidroxilo ó derivado hidrazida de los mismos. Otras micropartículas adecuadas pueden ser descritas en las patentes de los estados Unidos de América números 5,670,381 y 5,252,459. Los ejemplos comercialmente
disponibles de las partículas fluorescentes adecuadas incluyen las micro esferas carboxilatadas fluorescentes vendidas por Molecular Probes, Inc. Bajo las nombres de comercio "FluoSphere" (rojo 580/605) y "TransíluoSphere" (543/620) así como "Rojo Texas" y 5- y 6-carboxiltetrametilrodamina, los cuales son vendidos por Molecular Probes, Inc. Además, los ejemplos disponibles comercialmente de micro partículas de látex coloreadas adecuadamente incluyen las perlas de látex carboxilatadas vendidas por Bang's Laboratory, Inc.
Cuando se utilizaron, la forma de las partículas puede generalmente variar. En una incorporación particular, como por ejemplo, las partículas son de forma esférica. Sin embargo, deberán entenderse que otras formas también están contempladas por la presente invención, tal como placas, varillas, discos, barras, tubos, forma irregulares, etc. Además, el tamaño de las partículas también puede variar. Por ejemplo, el tamaño de promedio (diámetro) de las partículas puede variar de desde alrededor de 0.1 nanómetros a alrededor de 1,000 mieras, en alguna incorporaciones, de desde alrededor de 1 nanómetro a alrededor de 100 mieras, y el algunas incorporaciones de desde alrededor de 10 nanómetros a alrededor de 10 mieras. Por ejemplo, son frecuentemente deseadas las partículas de escala de micro. Cuando se utilizaron, tal es partículas de escala de micro" pueden tener un tamaño promedio de desde alrededor de una mica a alrededor de 1000 mieras, en algunas incorporaciones de desde alrededor de 1 miera alrededor
10 mieras. En forma similar, las partículas "escala nano" también pueden ser utilizadas. Tales partículas de "escala nano" pueden tener un tamaño promedio de desde alrededor de 0.1 alrededor de 80 nanómetros, en algunas incorporaciones de desde alrededor de 0.1 alrededor de 5 nanómetros y en algunas incorporaciones de desde alrededor de 1 alrededor de 20 nanómetros .
En algunos casos, se desean modificar las partículas en alguna manera de maneras que estas puedan ser fácilmente disponibles para aglutinar al analito. En tales casos, las partículas pueden ser modificadas con ciertos miembros aglutinantes específicos que son adheridos a los mismos para formar partículas conjugadas. Los miembros aglutinantes específicos generalmente se refieren a un miembro de un par aglutinante especifico, por ejemplo, dos moléculas diferentes en donde una de las moléculas aglutina químicamente y/ físicamente a la segunda molécula. Por ejemplo, los miembros aglutinantes específicos inmunoreactivos pueden incluir antígenos, haptenos, aptámeros, anticuerpos (primarios y secundarios) , y complejos de los mismos, incluyendo aquellos formados por métodos ADN recombinante ó síntesis de péptido. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal ó policlonal, una proteína recombinante ó una mezcla ó mezclas ó fragmento ó fragmentos de los mismos así como una mezcla de un anticuerpo y otros miembros aglutinantes específicos. Los detalles de la preparación de tales anticuerpos y su adecuación para usarse
co o miembros aglutinantes específicos son muy conocidos por aquellos expertos en el arte. Otros" pares aglutinantes específicos comunes incluyen pero no se limitan a biotina y avidina (o derivados de los mismos) , biotina y estreptavidina, carbohidratos y lectinas, secuencias de nucleótido complementarias (incluyendo secuencias de ácido nucleico de captura y sonda en usados en ensayos de hibridación ADN para detectar una secuencia de ácido nucleico de objetivo) , secuencias de péptido complementario incluyéndose aquellas formadas por métodos recombinantes, moléculas receptoras, hormonas y proteína aglutinante de hormona, cofactores de enzimas y encimas, inhibidores de enzima y encimas, y otros. Además, los pares aglutinantes específicos pueden incluir miembros que son análogos del miembro aglutinante específico original. Por ejemplo para un derivado ó fragmento del analito, por ejemplo un analito y un análogo, puede ser usado siempre que este tenga por lo menos un epitome en común con el analito.
Los miembros aglutinantes específicos pueden generalmente ser sujetados a las partículas usando cualquier de una variedad de técnicas muy conocidas. Por ejemplo, una sujeción covalente de los miembros aglutinantes específicos para las zonas de detección (por ejemplo partículas) puede ser lograda usando reactivos carboxílicos, amino, aldehido, bromacetilo, yodoacetilo, tiol, epoxi y otros grupos funcionales de enlace o reactivos así como radicales libre
residuales y cationes radicales, a través de los cuales puede ser lograda una reacción de acoplamiento de proteína. Un grupo funcional de superficie también puede ser incorporado como un comonómero funcionarizado debido a que la superficie de la partícula puede contener una concentración de superficie relativamente alta de grupos polares. Además, aun cuando las partículas conjugadas son frecuentemente funcionarizadas después de la síntesis, en ciertos casos, tal como el poli
(tiofenol) , las micro partículas son capaces de dirigir el enlace covalente con proteína sin la necesidad de una modificación adicional.
Refiriéndonos de nuevo a la figura 1, el dispositivo de ensayo 20 contiene una zona de detección 30 dentro la cual esta inmovilizado un primer reactivo de captura que es capaz de aglutinar al analito o al complejo de partículas-analito conjugado. El aglutinamiento del analito resulta en una indicación detectable de que el analito esta presente y de que tal indicación puede ser visual o a través de otros medios tal como varios detectores o lectores (por ejemplo lectores de fluorescencias ) discutidos abajo. Los lectores también pueden ser diseñados para determinar las cantidades relativas de analito en el sitio de detección, en base a la intensidad de la señal de la zona de detección.
En algunas incorporaciones, el primer reactivo de captura puede ser un reactivo de captura biológico. Tales
reactivos de captura biológicos son muy conocidos en el arte y puede incluir, pero no limitarse a antígenos, haptenos, proteína A ó G, neutravidina, avidina, estreptavidina, captavidina, anticuerpos primarios ó secundarios (policlonales, monoclonales etcétera) y complejos de los mismos. Muchos casos, se desea que estos reactivos de captura biológicos sean capaces de aglutinar a un miembro aglutinante especifico por ejemplo un anticuerpo) presentes sobre las partículas de conjugado.
También puede ser deseable el utilizar varios materiales no biológicos para el reactivo de captura. Por ejemplo, en algunas incorporaciones, el reactivo puede incluir un polielectrolito. Los polielectrolitos pueden tener una carga positiva neta ó una carga negativa o una carga neta que es generalmente neutral. Algunos ejemplos adecuados de los polielectrolitos teniendo una carga positiva neta incluyen, pero no se limitan a la polilisina (comercialmente disponible Sigma-Aldrich Chemical Co., Inc., de St . Louis, Missouri) polietilenimina; poliaminas funcionarizadas con epiclorohidrina y/ ó poliamidoaminas , tal como (dimetilamina-co-epiclorohidrinas) ; cloruro de polidialildimetil-amonio; derivados de celulosa catiónica, tal como copolímeros de celulosa ó derivados de celulosa injertados con monómero soluble en agua de amonio cuaternario y otros . En una incorporación particular, el CELQUAT® SC-230M ó H-100 (disponible de Nacional Starch & Chemical, Inc.) los cuales son derivados celulosos conteniendo un monómero soluble en agua de
amonio cuaternario pueden ser utilizados. Algunos ejemplos adecuados de los polielectrolitos teniendo una carga negativa neta incluyen, pero no se limitan a, ácidos poli acrílicos tal como poli (etileno-co-ácido metacrílico, 'Sal de sodio) y otros. Deberá entenderse que pueden ser usados otros polielectrolitos. Algunos de estos tal como los polielectrolitos anfifílicos (por ejemplo teniendo partes polares y no polares) pueden tener una carga neta que es generalmente neutral. Por ejemplo, algunos ejemplos de polielectrolitos anfifílicos adecuados incluyen pero no se limitan a poli (estiril-b—N-metil 2-vinil piridino ioduro)y poli (estiril-b-ácido acrílico), ambos de los cuales están disponibles de Polymer Source, Inc., de Dorval, Canadá.
El primer reactivo de captura sirve con un sitio aglutinante estacionario para complejos formados entre un analito y las partículas conjugadas, específicamente, los analitos tal y como los anticuerpos, antígenos, etcétera, típicamente tienen dos ó más sitios aglutinantes (por ejemplo epitopes) . Al alcanzar la zona de detección 30, uno de esto sitios de aglutinamiento es ocupado por el miembro aglutinante especifico de la sonda; sin embrago, el sitio de aglutinamiento libre del analito puede aglutinar al reactivo de captura inmovilizado. Al ser unido al reactivo de captura inmovilizado, las sondas acomplejadas forman un nuevo complejo de emparedado ternario.
La zona de detección 30 puede generalmente proporcionar cualquier número de regiones de detección distintas de manera que un usuario pueda determinar mejor la concertación de un analito particular de tro de una muestra de prueba. Cada región puede contener los' mismos reactivos de captura o puede contener reactivos de captura diferentes para capturar analitos múltiples. Por ejemplo, la zona de detección 30 puede incluir dos ó más regiones de detección distintas (por ejemplo, línea, puntos etcétera) . Las regiones de detección pueden estar colocadas en la forma de líneas en una dirección que es esencialmente perpendicular al flujo de la muestra de prueba a través del dispositivo de ensayo 20. En forma similar, en algunas incorporaciones, las regiones de detección pueden estar colocadas en la forma de líneas en una dirección que es esencialmente paralela al flujo de la muestra de prueba a través del dispositivo de ensayo.
En los dispositivos de emparedado de flujo lateral convencional, el analito no acomplejado se completara con el analito acomplejado para el reactivo de captura localizado en la zona de detección, provocando una caída en la indicación de la presencia del analito. En una representación gráfica de la resistencia de señales en contra del tiempo, esta caída parece un gancho, por lo que este fenómeno es conocido como el "efecto de gancho" . Depositando la muestra hacia abajo de las partículas de conjugado resulta en algún acomplejamiento de analito con el reactivo de captura antes del contacto con
las partículas conjugadas. Esto generalmente resulta en que todos ó esencialmente todos los sitios de captura y en reactivos son ocupados por el analito. Las partículas de conjugado subsecuentemente forman el nuevo complejo de emparedado ternario con su llegada a la zona de detección. Esta secuencia ayuda a eliminar el "efecto de gancho" encontrado en los ensayos previos debido a que el analito se aglutina a virtualmente todo el reactivo de captura (siempre que haya suficiente analito) en exceso de sondas de detección asegura que virtualmente todos los sitio de reactivo de captura contiene analito acomplejado.
Refiriéndonos de nuevo a la 1, la membrana porosa 22 también puede contener una zona de control 32 colocada hacia abajo de la zona de detección 30. La zona de control 32 generalmente proporciona una región distinta única (por ejemplo, línea, puntos, etc.), aun cuando están ciertamente contempladas las regiones múltiples por la presente invención. Por ejemplo, en la incorporación ilustrada, es utilizada una línea única. La zona de control 32 puede ser colocada en una dirección que es esencialmente perpendicular al flujo del amortiguador y de las sondas de detección a través del dispositivo 20. En forma similar, en algunas incorporaciones, la zona 32 puede estar colocada en una dirección que es esencialmente paralela al flujo a través del dispositivo 20. Sin importar su configuración, un segundo reactivo de captura puede ser inmovilizado sobre la membrana porosa 22 dentro de la
zona de control 32. El segundo reactivo de captura sirve, como un sitio aglutinante estacionario para cualesquier complejos de partícula conjugada/analito y/o partículas conjugadas que no glutinan con el primer reactivo de captura en la zona de detección 30. Debido a que es deseado que el segundo reactivo de captura aglutine a ambas partículas conjugadas co plejadas y no complejadas, el segundo reactivo de captura es normalmente diferente del primer reactivo de captura. En una incorporación, el segundo reactivo de captura es un reactivo de captura biológico (por ejemplo, antígenos, haptenos, proteína A o G, neutravidina, avidina, estreptavidina, anticuerpos primario y secundarios (por ejemplo policlonal, monoclonal etc.) y complejos de los mismos) que es diferente del primer reactivo de captura. Por ejemplo, el primer reactivo de captura puede ser un anticuerpo monoclonal (por ejemplo CRP Mabl) , mientras que el segundo reactivo de captura puede ser avidina (una glicoproteína de 66,000 daltons altamente catiónica), estreptavidina (una proteína de 52,800 daltons no glicosilatada) , neutravidina ( por ejemplo un derivado de avidina desglisolado) y/o captavidina (un derivado de avidina nitratado) . En esta incorporación, el segundo reactivo de captura puede aglutinar a la biotina, la cual es biotinilatada ó contenida en las sondas de detección conjugadas con un anticuerpo monoclonal diferente del anticuerpo monoclonal diferente del anticuerpo monoclonal del primer reactivo de captura (pro ejemplo CRP Mab2) .
Además, también puede ser deseado el utilizar varios materiales no biológicos para el segundo reactivo de captura de la sonda de control 32. Muchos casos, tales reactivos de captura no biológicos pueden ser particularmente deseados para asegurar mejor que todas las sondas de detección conjugadas restantes y/o la sonda conjugada/analito acomplej en. Un ejemplo es un material de polielectrolito. La detección de fluorescencia puede ser usada para detectar la presencia del analito en las sondas de detección y de control y generalmente utiliza un filtrado de longitud de onda para aislar los fotones de misión de los fotones de excitación, y un detector que registra los fotones de emisión y produce una salida registrable, usualmente como una señal eléctrica ó una imagen fotográfica. Los ejemplo de los tipos de detectores se incluyen espectrofluorómetros y lectores de micro placa; microscopios de fluorescencia; exploradores de fluorescencia; y citómetros de flujo. Un detector de fluorescencia adecuado para usarse con la presente invención es un espectrofluorómetro fluorolog III, el cual se vende por SPEX industries, Inc., de Edison, New Jersey.
Si se desea, una técnica conocida como "detección de fluorescencia resulta con el tiempo" puede ser utilizada en la presente invención. La detección de fluorescencia resulta con el tiempo esta diseñada para reducir las señales de fondo de la fuente de emisión ó de procesos de esparcimiento
(resultando del esparcimiento de la radiación de excitación) mediante el tomar ventaja de las características de
fluorescencia de ciertos materiales fluorescentes, tal como los quelatos de lantanida de europio (Eu (III) ) y terbio (Tb (III) ) . Tales quelatos pueden exhibir una banda estrecha cambiada de rojo fuertemente, una emisión de vida larga después de la excitación del quelato a longitudes de onda esencialmente cortas. Típicamente, el quelato posee una banda de absorción ultravioleta fuerte debido al cromóforo localizado cerca de la lantanida en la molécula. Subsecuentemente a la absorción de luz por el cromóforo, la energía de excitación puede transferida desde el cromóforo excitado a la lantanida. Esto es seguido por la característica de emisión de fluorescencia de la lantanida. El uso de excitación pulsada y de detección de compuerta - tiempo, combinado con filtros de emisión de banda estrecha, permite una detección especifica de la fluorescencia desde el quelato de lantanida solo, rechazando la emisión de otros especies presentes en la muestra que son típicamente de vida más corta ó que tienen una emisión de longitud de onda más corta.
Ejemplo
Esta idea fue probada con la siguiente colocación experimental :
El anticuerpo de cabra anti-ratón ( "GAM" ) fue diluido en agua salada amortiguada con fosfato (PBS) (ph de 1 . 2 ) a 0.1 mg/ml y se desvestida sobre membranas HF120 de
nitrocelulosa de Millipore usando una maquina de recubrimientos Kinematic 1600 a una tasa de surtido de 1 uL/cm y una velocidad de cama de 5cm/s. la proteína reactiva Scipac C(CRP) de (Sittingbourne, Kent, Reino Unido) fue diluida en agua para dar una concentración final de 2.6 mg/ml y fue desvestida debajo de la línea de prueba de GAM a una tasa de surtido de 1 ul/cm. Las tarjetas se dejaron secar a 37° C por 1 hora.
El material de almohadilla conjugado VF2 (de Whatman Corp., Clifton, New Jersey and GF33 (fibra de vidrio)
(de Millipore Corp., de Billerica, Massachussets) se cortó en bandas de 30 mm por 34 mm usando un cortador de guillotina operado a mano. El anticuerpo monoclonal para el conjugado fue
Mabl (catalogo numero 10-C07, de Fitzgerald Industries International, Inc., de Concord, Massachussets 01742-3049 EUA).
Este anticuerpo se CRP fue conjugado a partículas de oro de 20 nm de diámetro. El conjugado resultante fue mezclado 1:1 con partículas de oro conjugado de cabra anti-conejo (GAR)
(diámetro de 40 nm) . El conjugado de suministro anti-CRP esta a una densidad óptica (OD)de 32 de manera que cuando es mezclado con GAR en una proporción de 1:1 este reduce a OD 16. Este además fue diluido en 2 mM Bórax (pH 7.2) y 50% de sucrosa (sucrosa final 10%) para dar una densidad óptica final de 10. el Bórax es uno de los pocos tipo de amortiguador que son efectivos y la sucrosa ú otros materiales hidrofílicos ayudan en la resuspensión de las partículas secadas debido a su alta solubilidad en agua) .
El conjugado fue rociado a 5ul/cm, 5CM/s usando la maquina de recubrimiento Kinematic 1600 sobre las bandas VF2, 10 nm hacia fuera de la orilla de la banda y 3 mm hacia afuera de la orilla opuesta para las bandas de control. Estas se dejaron secar durante la noche a menos de 20% de humedad relativa y a la temperatura ambiente. Las bandas conjugadas y el material de transmisión (CF6 de Whatman) fueron cortados a bandas de 20 mm de ancho fueron dominadas sobre la membrana HF120 desvestida. Las bandas laminadas fueron entonces cortadas en tiras de 4 mm de ancho usando el Kinematic 2360 para hacer varillas indicadoras.
Cualesquier sueros calibrados o de sangre completa tratada con EDTA (estándares de Kamaya de Seattle,
Washington) fueron usados para estos experimentos. El Scipac
CRP fue azuzado adentro de sangre completa para las concentraciones finales de 2.5 , 10, 20, 40, 80 y 160 ug/ml. Los sueros de Standard Kamaya fueron usados para los experimentos GF33. La sangre completa en una cantidad de 1 ul fue agregada aproximadamente 13 mm del fondo de la almohadilla VF2 en una línea usando una pipeta de desplazamiento positivo para las tiras de prueba de control, mientras que 1 ul de sangre fue agregado inmediatamente después de la banda conjugada rociada (-13 mm del extremo de banda) para el ensayo inventivo. El PBS con 2% de surfactante TWEEN® 20 (de Sigma-Aldrich Chemical Co) fue entonces agregado al depósito amortiguador en el extremo
opuesto de la tira de transmisión y la tapa de la caja fue agarrada en el lugar. Las tiras de prueba se dejaron correr por 30 minutos antes de leer los resultados visualmente.
El ensayo inventivo resulto en señales mucho más fuertes en la línea de prueba. Por ejemplo para este caso especifico de un ensayo de "inhibición /sobre flujo", la línea GAM la cual actúa como la línea de señal ya que la intensidad aumenta con lo niveles en aumento con analito (CRP en este caso) tuvo señales mucho más fuertes cuando este método fue usado .
En adición a aplicar la muestra de sangre a 13 mm de la base de la tira de prueba como se indico anteriormente, otras posiciones para la muestra de sangre fueron evaluadas. Estas variaron de desde 5 mm a 29 mm, como se midió desde la base de la tira de prueba. Todas estas posiciones pueden afectar el resultado de la señal de prueba (por ejemplo la intensidad o calidad de línea. Específicamente se encontró que entre más cerca una muestra (por ejemplo de sangre) es aplicada a la base, más claro se hace el fondo mejorando por tanto la señal en la línea de prueba. Esta mejora de señal en la línea de prueba. Esta mejora de señal estuvo ya sea en la forma de una línea más intensa y fuerte; una calidad de línea mejor; ó una señal de fondo más baja sobre las otras áreas de la tira de prueb .
Aun cuando la invención se ha descrito en detalle con respecto a las incorporaciones especificas de la misma, se apreciará por aquellos expertos en el arte, al lograr un entendimiento de lo anterior, que pueden concebirse fácilmente alteraciones, variaciones y equivalentes de estas incorporaciones. Por tanto, el alcance de- la presente invención debe ser evaluado como aquel de las reivindicaciones anexas de cualquier equivalente de las mismas.
Claims (20)
1. Un dispositivo de ensayo, de flujo lateral para detectar la presencia o la cantidad de un analito que reside en una muestra, dicho dispositivo de ensayo de flujo lateral comprende una membrana porosa, dicha membrana porosa estando en comunicación con una almohadilla conjugada y una almohadilla de transmisión, dicha membrana porosa define: una zona de detección dentro de la cual está inmovilizado un primer reactivo de captura, dicho primer reactivo de captura, estando configurado para aglutinar a por lo menos una parte de dicho analito y dicho conjugado-analito compleja para generar una señal de detección teniendo una intensidad; dicha almohadilla conjugada localizada hacia arriba de dicha zona de detección, dicha almohadilla conjugada teniendo partículas de detección con miembros aglutinantes específicos para el analito y; una zona de liberación de amortiguador localizada hacia arriba de la almohadilla conjugada y que proporciona la adicción de amortiguador a dicho dispositivo, dicho amortiguador sirve para mover dichas sondas de detección a dichas zona de detección; y dicha muestra estando depositada entre dicha almohadilla conjugada y dicha zona de detección.
2. Un dispositivo de ensayo de flujo lateral tal y como se reivindica en la cláusula 1 caracterizado porque dichas partículas de detección conjugadas comprenden una sustancia seleccionada del grupo que consiste de cromógenos, catalizadores, compuestos luminiscentes, compuestos radioactivos, etiquetas visuales, liposomas y combinaciones de los mismos.
3. Un dispositivo de ensayo de flujo lateral tal y como se reivindica en la cláusula 1 caracterizado porque dichas partículas de detección conjugada comprenden un compuesto luminiscente.
4. Un dispositivo de ensayo de flujo lateral tal y como se reivindica en la cláusula 1 caracterizado porque dichas partículas de detección conjugadas comprenden una etiqueta visual.
5. Un dispositivo de ensayo de flujo lateral tal y como se reivindica en la cláusula 1 caracterizado porque dicho miembro aglutinante especifico es seleccionado del grupo que consiste de antígenos, haptenos, aptámeros, anticuerpos primarios ó secundarios, biotina y combinaciones de los mismos.
6. Un dispositivo de ensayo de flujo lateral tal y como se reivindica en la cláusula 1 caracterizado porque dicho primer reactivo de captura es seleccionado al grupo que consiste de antígenos, haptenos, proteína, neutravidina A o G, avidina, estreptavidina, captavidina, anticuerpos primarios y secundarios y complejos de los mismos.
7. Un dispositivo de ensayo de flujo lateral tal y como se reivindica en la cláusula 1 caracterizado porque dicho segundo reactivo de captura es seleccionado del grupo que consiste de antígenos, haptenos, proteína A o G, neutravidina, avidina; estreptavidina; captavidina, anticuerpos primarios y secundarios y complejos de los mismos.
8. Un dispositivo de ensayo de flujo lateral tal y como se reivindica en la cláusula 1 caracterizado porque dicho analito es un patógeno grande seleccionado del grupo que consiste de especies de Salmonella , grupos de Neisseria eningi tides, Streptococcus pneumoniae, Candida albicans, Candida tropicalis , aspergillua, influenza haemophilus, VIH Tricomonas y Plasmodium.
9. Un dispositivo de ensayo de flujo lateral tal y como se reivindica en la cláusula 1 caracterizado porque dicho analito es seleccionado al grupo que consiste de toxinas, compuestos orgánicos, proteínas, péptidos, microorganismos, aminoácidos, ácidos nucleicos, hormonas, esteroides, vitaminas, droga, y subproductos o intermediarios de drogas, bacterias, partículas de virus, y metabolitos ó anticuerpo de cualquiera de las sustancias anteriores.
10 Un dispositivo de ensayo' de flujo lateral tal y como se reivindica en la cláusula 1 caracterizado porque dicha membrana porosa, la almohadilla conjugada y la almohadilla de transmisión están hechas de un material único.
11. Un método para detectar la presencia ó cantidad de un analito que reside en un analito de prueba, dicho método comprende: i) proporcionar un dispositivo de ensayo de flujo lateral que comprende una membrana porosa, en comunicación de liquido con una almohadilla conjugada y una almohadilla de transmisión, dicha almohadilla conjugada teniendo partículas de detección conjugadas con un miembro aglutinante especifico para analito, dicha membrana porosa define una zona de detección en la cual un primer reactivo de captura esta inmovilizado, y una zona de control dentro de la cual un segundo reactivo de captura esta inmovilizado, en donde dicha zona de control esta localizado hacia abajo de dicha zona de detección, dicha almohadilla conjugada esta localizada hacia arriba de dicha membrana porosa y dicha zona de liberación de amortiguadores esta hacia arriba de dicha almohadilla conjugada. ii) poner en contacto a dicha muestra de prueba conteniendo el analito entre dicho almohadilla conjugada y dicha zona de detección. iii) liberar un amortiguador en dicho zona de liberación de amortiguador de manera que dicho amortiguador llevará dichas partículas de detección a dichas zonas de detección y de control; iv) detectar una señal de detección.
12. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 11 caracterizado porque dichas partículas de detección conjugadas comprenden una sustancia seleccionada al grupo que consiste de cromógenos, catalizadores, compuestos luminiscentes, compuesto radioactivos, etiquetas visuales, liposomas y combinaciones de los mismos.
13. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 11 caracterizado porque dichas partículas de detección conjugada comprenden una etiqueta visual.
14. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 11 caracterizado porque dicho miembro aglutinante especifico es seleccionado al grupo que consiste de antígenos, haptenos, aptámeros, anticuerpos primarios y secundarios, biotina y combinaciones de los mismos.
15. Un método tal y como, se reivindica en la cláusula 11 caracterizado porque dicho primer reactivo de captura es seleccionado del grupo que consiste de antígenos, haptenos, proteína A o G, neutravidina, avidina, estreptavidina, captavidina, anticuerpos primarios y secundarios y complejos de los mismos.
16. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 11 caracterizado porque dicho segundo reactivo de captura es seleccionado del grupo que consiste de antígenos, haptenos, proteína A o G, neutravidina, avidina, estreptavidina, captavidina, anticuerpos primarios y secundarios y complejos de los mismos.
17. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 11 caracterizado porque dicho segundo reactivo de captura comprende un polielectrolito .
18. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 11 caracterizado porque dicho analito es un patógeno grande seleccionado del grupo que consiste de especies Salmonella, grupos de Neisseria meningi tides , Streptococcus pneumoniae, Candida albicans , Candida tropicalis, aspergillua, influenza haemophilus, VIH; tricomonas y Plasmodium.
19. Un método tal y como- se reivindica en la cláusula 11 caracterizado porque dicho analito es seleccionado del grupo que consiste de toxinas, grupos orgánicos, proteínas, péptLdos, microorganismos, aminoácidos, ácidos nucleicos, hormonas, esteroides, vitaminas, drogas, intermediarios y subproductos de drogas, bacterias, partículas de virus, y metabolitos y anticuerpos para cualquiera de esas sustancias.
20. Un dispositivo de ensayo de flujo lateral para detectar la presencia de un analito que reside en una muestra de prueba, en donde las partículas de detección, inicialmente localizadas sobre una almohadilla conjugada son movidas a un patógeno localizado en una zona de detección teniendo un reactivo de captura.
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