MXPA05005950A - Dispositivos de ensayo de flujo directo autocalibrados. - Google Patents

Abstract

Es proporcionado un sistema autocalibrado interno para dispositivos de ensayo de flujo continuo. En particular, la invencion emplea el uso de una zona de calibracion/deteccion unica definida por una membrana porosa del ensayo. Se ha descubierto que el sistema autocalibrado interno proporciona un metodo exacto, barato y facilmente controlable para determinar la presencia de un analito en una muestra de prueba.

Description

DISPOSITIVOS DE ENSAYO DE FLUJO DIRECTO AUTOCALIBRADOS Antecedentes de la Invención Varios procedimientos y dispositivos analíticos son comúnmente empleados en ensayos a través de flujo para determinar la presencia y/o la concentración de analitos que pueden estar presentes en una muestra de prueba. Por ejemplo, los inmuno ensayos utilizan mecanismos de los sistemas inmunes, en donde los anticuerpos son producidos en respuesta a la presencia de antígenos que son patógenos o extraños a los organismos. Estos . anticuerpos y antigenos, por ejemplo, inmuno-reactivos son capaces de aglutinar uno con otro, por tanto causando un mecanismo de reacción altamente específico que puede usarse para determinar la presencia o la concentración de ese particular antígeno en una muestra biológica.

Hay varios bien conocidos métodos inmuno-ensayos que usan inmuno-reactivos etiquetados con un componente capaz de detectarse de tal forma que el analito puede ser detectado de manera analítica. Por ejemplo, los ensayos "del tipo intercalado" típicamente involucran el mezclar la muestra de prueba con sondas detectables, tales como látex teñido o un radioisótopo, los cuales son conjugados con un específico miembro aglutinante para el analito. Las sondas conjugadas forman complejos con el analito. Estos complejos entonces alcanzan una zona de anticuerpos inmovilizados donde ocurre el aglutinado entre los anticuerpos y el analito para formar los "complejos intercalados" ternarios. Los complejos intercalados son localizados en la zona para detección del analito. Esta técnica puede usarse para obtener resultados cuantitativos o semi-cuantitativos . Algunos ejemplos de tales ensayos del tipo intercalado son descritos en las patentes de los Estados Unidos de América números 4,168,146 otorgada a Grubb y otros, y 4,366,241 otorgada a Tom y otros.

Una técnica alternativa es el ensayo "del tipo competitivo" . En un ensayo del "tipo competitivo" , la etiqueta es típicamente un analito etiquetado o analito análogo que compite por aglutinar un anticuerpo con cualquier analito sin etiquetar presente en la muestra. Los ensayos competitivos son típicamente usados .para la detección de analitos tales como haptenos, cada hapteno siendo monovalente y capaz de aglutinar solamente una molécula de anticuerpo. Ejemplos de dispositivos de inmuno-ensayo competitivo son descritos en las patentes de los Estados Unidos de América números 4,235,601 otorgada a Deutsch y otros; 4,442,204 otorgada a Liotta; y 5,208,535 otorgada a Buechler y otros .

Muchos de estos ensayos confían en la calibración para proporcionar resultados válidos y significativos, particularmente para detecciones semi-cuantitativas y cuantitativas. Específicamente, ya sea sistemas de calibración externa o interna pueden generalmente emplearse. En un sistema de calibración externa, una curva estándar puede obtenerse de muestras estándar que contienen una serie de una conocida cantidad de analito, y los resultados obtenidos de las muestras son entonces comparados con la curva estándar para extraer la presencia y/o la cantidad del analito en la muestra. El método de calibración externa es relativamente fácil de diseñar y es simple de implementar. Sin embargo, es con frecuencia sujeto a interferencia de variaciones ambientales y de lote a lote, y es por tanto no confiable.

Convencionales sistemas de calibración interna, por otro lado, típicamente utilizan una membrana que tiene una zona de calibración y una zona de detección sobre la cual el reactivo de captura específico para el analito es inmovilizado. Desafortunadamente, la capacidad de la zona de calibración de proporcionar una comparación confiable y exacta a la zona de detección es con frecuencia limitada. Además, las zonas de calibración más internas son relativamente caras, por tanto haciéndolas imprácticas para ciertas aplicaciones.

Como tal, existe actualmente una necesidad por un exacto sistema de calibración para ensayos a través de flujo que es exacto y barato.

Síntesis de la Invención De conformidad con una incorporación de la presente invención, un dispositivo de ensayo a través de flujo (por ejemplo, intercalado, competitivo, etc.) es descrito que es capaz de detectar la presencia o cantidad de un analito que reside en una muestra de prueba. El dispositivo de ensayo comprende de una membrana porosa que está en comunicación con las sondas de detección y las sondas de calibración que son capaces de generar una señal de detección y una señal de calibración, respectivamente. Por ejemplo, en algunas incorporaciones, las sondas son seleccionadas del grupo que consiste de cromógenos, catalizadores, compuestos fluorescentes, compuestos quimo-luminiscentes , compuestos fosforescentes, compuestos radioactivos, etiquetas visuales directas, liposomas, y combinaciones de los mismos. En una incorporación particular, las sondas contienen una micropartícula de látex.

La membrana porosa define una zona de detección y calibración dentro de la cual un reactivo de captura de poli-electrolito es inmovilizado que está configurado para directamente o indirectamente aglutinar a las sondas de detección, las sondas de calibración, o las combinaciones de las mismas . Un segundo reactivo de captura que es un específico miembro de aglutinar para el analito puede utilizarse. La zona de detección y calibración es capaz de generar una señal de calibración de tal forma que la cantidad del analito es capaz de determinación de la señal de detección conforme es calibrada por la señal de calibración.

De conformidad con otra incorporación de la presente invención, es descrito un método para detectar la presencia o cantidad de un analito que reside en una muestra de prueba. El método comprende el proporcionar un dispositivo de ensayo a través de flujo. Una muestra de prueba que contiene al analito es contactada con las sondas de detección y las sondas de calibración presentes con el dispositivo. En una zona de detección y calibración, la intensidad de la señal de detección y la señal de calibración son medidas . La cantidad del analito dentro de la muestra de prueba es proporcional a la intensidad de la señal de detección calibrada por la intensidad de la señal de calibración.

Otras características y aspectos de la presente invención son descritos en mayor detalle abajo.

Breve Descripción de los Dibujos Una completa y autorizada descripción de la presente invención, incluyendo el mejor modo de la misma, dirigida a uno con habilidad en el arte, es señalada más particularmente en el resto de la especificación, que hace referencia a las figuras adjuntas en donde: La Figura 1 es una vista en perspectiva de una incorporación de un dispositivo de ensayo a través de flujo de la presente invención; La Figura 2 es una ilustración gráfica de una incorporación por conjugado de forma covalente de un anticuerpo a nanopartlculas carboxilatadas ; La Figura 3 es una ilustración esquemática de una incorporación de un dispositivo de ensayo a través de flujo de la presente invención; La Figura 4 es una ilustración esquemática de otra incorporación de un dispositivo de ensayo a través de flujo de la presente invención; La Figura 5 es una ilustración esquemática de aún otra incorporación de un dispositivo de ensayo a través de flujo de la presente invención; y La Figura 6 es una ilustración esquemática de otra incorporación de un dispositivo de ensayo a través de flujo de la presente invención.

El repetido uso de los caracteres de referencia en la presente especificación y los dibujos son intencionados para representar las mismas o análogas características o elementos de la invención.

Descripción Detallada de las Incorporaciones Representativas Definiciones Como se usa aquí, el término "analito" generalmente se refiere a una sustancia a detectarse. Por ejemplo, analitos pueden incluir sustancias antigénicas, haptenos , anticuerpos , y combinaciones de los mismos . Los analitos incluyen, pero no están limitados a, toxinas, compuestos orgánicos, proteínas, péptidos, microorganismos, amino ácidos, ácidos nucleicos, hormonas, esteroides, vitaminas, drogas (incluyendo aquellas administradas con propósitos terapéuticos así como aquellas administradas por propósitos ilícitos) , drogas intermedias o productos derivados, bacterias, partículas de virus, y metabólicos de o anticuerpos a cualquiera de las anteriores sustancias. Específicos ejemplos de algunos analitos incluyen a ferritina; creatinina quinasa MIB (CK- B) , digoxina; fenitoina; fenobarbital ; carbamazepina; vancomicina; gentamicina; teofilina ácido valproico,- quinidina; hormona leutinizante (LH) ; hormona estimulante del folículo (FSH) , estradiol; progesterona; proteína reactiva C; lipocalina; anticuerpos IgE; vitamina B2 micro-globulina; hemoglobina glicatada (Gly.Hb) ; cortisona; digitoxina,- N-acetilprocainamida (NAPA) ; procainamida; anticuerpos para rubéola, tal como rubéola-IgG y rubéola IgM; anticuerpos al toxoplasmosis, tales como toxoplasmosis IgG (Toxo-IgG) y toxoplasmosis IgM (Toxo-IgM) ; testosterona; salicilatos; acetaminofen; antigeno de superficie de virus de hepatitis B (HBsAG) ; anticuerpos al antígeno de núcleo de hepatitis B, tales como antígeno de núcleo anti-hepatitis B IgG y el IgM (Anti-HBC) ; virus de inmunodeficiencia humana 1 y 2 (HIV 1 y 2) ; virus de leucemia humana de célula T 1 y 2 (HTLV) ; antígeno e de hepatitis B (HBeAg) ; anticuerpos de antígeno e de hepatitis B (Anti-HBe) ; hormona estimulante de tiroides (TSH) ; tiroxina (T4) ; triiodotironina total (Total T3); triiodotironina libre (Libre T3) ; antígeno carcinoembriónico (CEA) ; y proteína alfa fetal (AFP) . Las drogas de abuso y las sustancias controladas incluyen, pero no están limitadas a, anfetaminas ; meta-anfetaminas; barbitúricos, tales como amobarbital, secobarbital, pentobarbital, fenobarbital, y barbital; benzodiacepinas , tales como librium y valium; canabinoides , tales como hashish y mariguana; cocaína; fentanil; LSD; meta-acualone; opiáceos, tales como heroína, morfina, codeína, hidromorfona, hidrocodona, metadona, oxicodona, oximorfona, y opio; fenciclidina; y propoxiheno. Otros analitos potenciales pueden describirse en las patentes de los Estados Unidos de América números 5,436,651 otorgada a Everhart y otros y 4,366,241 otorgada a Tomm y otros.

Como se usa aquí, el término "muestra de prueba" generalmente se refiere a un material que se sospecha contiene el analito. La muestra de prueba puede usarse directamente como es obtenida de la fuente o siguiendo un previo tratamiento para modificar el carácter de la muestra. La muestra de prueba puede derivarse de cualquier fuente biológica, tal como un fluido fisiológico, incluyendo, sangre, fluido intersticial, saliva, fluido de lente ocular, fluido espinal cerebral, sudor, orina, leche, fluido ascético, ronco, fluido sinovial, fluido peritoneo, fluido vaginal, fluido amniótico, o similares. La muestra de prueba puede ser previamente tratada antes de usar, tal como la preparación de plasma de la sangre, el diluir fluidos viscosos, y similares. Los métodos de tratamiento pueden involucrar la filtración, la precipitación, la dilución, destilación, concentración, el inactivado de los componentes que interfieren, y la adición de reactivos . Además de los fluidos fisiológicos, otras muestras de liquido pueden ser usadas tales como agua, productos alimenticios y similares para el desempeño de los ensayos de producción de alimentos y ambientales. Además, un material sólido que se sospecha que contiene el analito puede usarse como la muestra de prueba. En algunas instancias puede ser benéfico el modificar una muestra de prueba sólida para formar un medio liquido o para liberar el analito.

Descripción Detallada Se hará ahora referencia en detalle a varias incorporaciones de la invención, uno o más ejemplos de los cuales son señalados abajo. Cada ejemplo es proporcionado a modo de explicación de la invención, no de limitación de la invención. De hecho, será aparente para aquellos con habilidad en el arte que varias modificaciones y variaciones pueden hacerse en la presente invención sin apartarse del alcance o del espíritu de la invención. Por ejemplo, las características ilustradas o descritas como parte de una incorporación pueden usarse en otra incorporación para producir aún otra incorporación. Por tanto, se intenta que la presente invención cubra tales modificaciones y variaciones como vienen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas y sus equivalencias.

En general, la presente invención está dirigida a un sistema de ensayo auto calibrado interno para los dispositivos de ensayo a través de flujo. En particular, la presente invención emplea el uso de una sola zona de detección y calibración definida por una membrana porosa del ensayo. El conducir la detección de la señal y la calibración interna al mismo tiempo puede grandemente aumentar la conflabilidad de la detección y la capacidad de reproducción por eliminación de influencias dé factores ambientales, tales como temperatura, pH, e inestabilidad instrumental de la señal de detección.

Con referencia a la Figura 1, por ejemplo, una incorporación de un dispositivo de ensayo por medio de flujo 20 puede formarse de conformidad con la presente invención, será ahora descrito en mayor detalle. Como se muestra, el dispositivo 20 contiene una membrana porosa 23 opcionalmente soportada por un material rígido 21. En general, la membrana porosa 23 puede hacerse de cualquiera de una variedad de materiales a través de los cuales la muestra de prueba es capaz de pasar. Por ejemplo, los materiales usados para formar la membrana porosa 23 pueden incluir, pero no están limitados a, materiales naturales, sintéticos, o que ocurren naturalmente que son sintéticamente modificados, tales como polisacáridos (por ejemplo, materiales de celulosa tales como papel y derivados de celulosa, tales como acetato de celulosa y nitrocelulosa) ; poliéter sulfona; membranas de nylon; silicio, materiales inorgánicos, tales como alúmina desactivada, tierra diatomácea, gS04, u otro material dividido finamente inorgánico uniformemente dispersado en una matriz de polímero poroso, con polímeros tales como cloruro de vinil, copolímero vinil cloruro-propileno, y copolímero acetato cloruro de vinil-vinil; tela tanto naturalmente ocurrente (por ejemplo, algodón) y sintética (por ejemplo, nylon o rayón) ; geles porosos, tales como geles de silicio, agarosa, dextran, y gelatina; películas poliméricas, tales como poliacrilamida; y similares. En una particular incorporación, la membrana porosa 23 está formada de materiales de nitrocelulosa y/o de poliéster sulfona. Deberá entenderse que el término "nitrocelulosa" se refiere a ésteres de ácido nítrico de celulosa, que pueden ser de nitrocelulosa sola, o un éster mezclado de ácido nítrico y otros ácidos, tales como ácidos carboxílieos alifáticos que tienen desde 1 a 7 átomos de carbono.

El dispositivo 20 también puede contener una almohadilla de transmisión 28. La almohadilla de transmisión 28 generalmente recibe fluido que ha migrado a través de toda la membrana porosa 23. Como es bien conocido en el arte, la almohadilla de transmisión 28 puede asistir en promover acción capilar y el flujo de fluido a través de la membrana 23.

Para iniciar la detección de un analito dentro de la muestra de prueba, un usuario puede directamente aplicar la muestra de prueba a una parte de la membrana porosa 23 a través de la cual puede desplazarse. Alternativamente, la muestra de prueba puede primero aplicarse a una almohadilla de muestreo (no mostrada) que está en comunicación de fluido con la membrana porosa 23. Algunos adecuados materiales que pueden usarse para formar la almohadilla de muestreo incluyen, pero no están limitados a, nitrocelulosa, celulosa, almohadillas de polietileno poroso, y papel de filtro de fibra de vidrio. Si se desea, la almohadilla de muestreo puede también contener uno o más reactivos de previo tratamiento de ensayo, ya sea acoplados difusos o no difusos a la misma.

En una incorporación ilustrada, la muestra de prueba se desplaza desde la almohadilla de muestreo (no mostrada) a una almohadilla conjugada 22 que está colocada en comunicación con un extremo de la almohadilla de muestreo. La almohadilla conjugada 22 está formada de un material a través del cual la muestra de prueba es capaz de pasar. Por ejemplo, en una incorporación, la almohadilla conjugada 22 está formada de fibras de vidrio. Aún cuando solamente la almohadilla conjugada 22 es mostrada, deberá entenderse que las otras almohadillas conjugadas también pueden usarse en la presente invención.

Para facilitar la adecuada detección de la presencia o la ausencia de un analito dentro de la muestra de prueba, las etiquetas son aplicadas en varias ubicaciones del dispositivo 20. Como será descrito en mayor detalle abajo, las sondas son usadas para ambas la detección del analito y para la calibración. Cualquier sustancia generalmente capaz de generar una señal que es detectable visualmente o por un dispositivo instrumental puede usarse como sonda. Varias adecuadas sustancias pueden incluir a cromógenos; catalizadores, compuestos fluorescentes; quimo-luminiscentes; compuestos fosforescentes; compuestos radioactivos; etiquetas visuales directas, incluyendo partículas metálicas coloidales (por ejemplo, oro) y no metálicas, partículas de tinte, enzimas o sustratos, o partículas de látex de polímero orgánico; liposomas u otras vesículas que contienen sustancias que producen señal; y similares. Por ejemplo, algunas enzimas adecuadas para usar como sondas son descritas en la patente de los Estados Unidos de América número 4,275,149 otorgada a Litman y otros, la cual es incorporada aquí en su totalidad por referencia a la misma para todos los propósitos. Un ejemplo de un sistema de sustrato y enzima es la enzima alcalina fosfatasa y el sustrato nitro azul tetrazolio-5-bromo-4-cloro-3-indolilo fosfato, o derivados o análogos del mismo, o el sustrato 4-metillumberliferilo-fosfato. Otras adecuadas sondas pueden ser descritas en las patentes de los Estados Unidos de América números 5,670,381 otorgada a Jou y otros; y 5,252,459 otorgada a Tarcha y otros, las cuales son incorporadas aquí en su totalidad por referencia a la misma para todos los propósitos.

En algunas incorporaciones, las sondas pueden contener un compuesto fluorescente que produce una señal detectable. Los compuestos fluorescentes pueden ser moléculas fluorescentes, polímeros, dendrímeros, partículas, y similares. Algunos ejemplos de adecuadas moléculas fluorescentes, por ejemplo, incluyen, pero no están limitadas a, fluoresceína, quelatos europio, ficobiliproteína, rodamina y sus derivados y análogos. Un compuesto coloreado, detectable visualmente también puede usarse como una sonda, por tanto proporcionando una lectura coloreada directa de la presencia o concentración del analito en la muestra sin la necesidad por ulteriores reactivos productores de señal.

Las sondas, tales como son descritas arriba, pueden usarse solas o en conjunto con una micropartícula (algunas veces referidas como "gotas" o "micro-gotas") . Por ejemplo, las micropartículas que ocurren naturalmente, tales como núcleos, micoplasma, plásmidos, plástidos, células mamarias (por ejemplo, fantasmas eritrocitos) , microorganismos unicelulares (por ejemplo, bacterias) , polisacáridos (por ejemplo, agarosa) , silicio, vidrio, partículas con base de celulosa, y similares. Además, las micropartículas sintéticas también pueden utilizarse. Por ejemplo, en una incorporación, son utilizadas las micropartículas de látex que están etiquetadas con un tinte fluorescente o coloreado . Aún cuando cualquier micropartícula de látex puede usarse en la presente invención, las micropartículas de látex son típicamente formadas de poliestireno, estírenos butadieno, terpolímero estirenoacrílico-vinil, polimetilmetacrilato, polietilmetacrilato, copolímero estireno maléico anhídrido, polivinil acetato, polivinil pirridina, polidivinilbenceno, polibutileno tereftalato, acrilonitrilo, nonilcloruro-acrilatos, y similares, o un aldehido, carboxilo, amino, hidroxil, o derivados hidracida de los mismos. Otras micropartículas adecuadas pueden describirse en las patentes de los Estados Unidos de América números 5,670,381 otorgada a Jou y otros, y la 5,252,459 otorgada a Tarcha y otros, las cuales son aquí incorporadas en su totalidad por referencia a la misma para todos los propósitos. Algunos ejemplos comercialmente disponibles de adecuadas partículas fluorescentes incluyen a microesferas fluorescentes carboxilatadas vendidas por Molecular Probes, Inc., bajo los nombres de marca de "FluoSphere" (Roja 580/605) y "TransíluoSphere" (543/620) , así como "Texas rojo" y 5- y 6-carboxitetrametilrodamina, las cuales son vendidas por Molecular Probes, Inc. Ejemplos comercialmente disponibles de adecuadas micropartículas de látex coloradas, incluyen a gotas de látex carboxilatado vendidas por Bang's Laboratory, Inc.

Cuando las sondas son partículas, tal como se describió arriba, el diámetro medio de las partículas puede generalmente variar como se desee dependiendo de factores tales como el tipo de partícula escogida, el tamaño del poro de la membrana, y la composición de la membrana. Por ejemplo, en algunas incorporaciones, el diámetro medio de las etiquetas de la partícula puede estar en el rango desde alrededor de 0.01 mieras a alrededor de 1,000 mieras, en algunas incorporaciones desde alrededor de 0.01 mieras a alrededor de 100 mieras, y en algunas incorporaciones, desde alrededor de 0.01 mieras a alrededor de 10 mieras. En una particular incorporación, las partículas tienen un diámetro medio desde alrededor de 0.1 a alrededor de 2 mieras. Generalmente, las partículas son sustancialmente esféricas en forma, aún cuando otras formas incluyen, pero no están limitadas a, placas, barras, varillas, formas irregulares, etc., y son adecuadas para uso en la presente invención. Como será apreciado por aquellos con habilidad en el arte, la composición, forma, tamaño, y/o densidad de las partículas pueden variar ampliamente.

En algunas instancias, se desea modificar las sondas de alguna manera de tal forma que son más prontamente capaces de unir al analito. En tales instancias, las sondas pueden modificarse con ciertos miembros específicos de unión que son adheridos a los mismos para formar sondas conjugadas. Específicos miembros de unión se refieren a un miembro de un específico par de unión, por ejemplo, dos diferentes moléculas donde una de las moléculas une químicamente y/o físicamente a la segunda molécula. Por ejemplo, los miembros de unión específicos inmuno-reactivos pueden incluir a antígenos, haptenos, aptámeros, anticuerpos, y complejos de los mismos, incluyendo aquellos formados por métodos recombxnantes de ADN o de síntesis de péptido. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal, una proteína recombinante o una mezcla o fragmento de los mismos, así como una mezcla de un anticuerpo y de otros miembros específicos de unión. Los detalles de la preparación de tales anticuerpos y de su compatibilidad para usar como miembros específicos de unión, es bien conocida para aquellos con habilidad en el arte. Otros pares de unión comunes específicos incluyen pero no están limitados a, biotin y avidin, biotin y estreptavidin, proteínas de unión de anticuerpo (tales como proteína A ó G) y anticuerpos, carbohidratos y lectinas, secuencias complementarias nucleótidos (incluyendo secuencias de ácido nucleico de etiqueta y de captura usadas en ensayos de hibridización del ADN para detectar una secuencia de ácido nucleico objetivo), secuencias de péptido complementario incluyendo aquellas formadas por métodos recombinantes, moléculas de efecto y receptoras, hormona y proteína de unión de hormona, cofactores de enzima y enzimas, inhibidores de enzima y enzimas, y similares. Además, específicos pares de unión pueden incluir a miembros que son análogos del original miembro específico de unión. Por ejemplo, un derivado o fragmento del analito, por ejemplo, un analito análogo, puede usarse en tanto que tiene al menos un epítope en común con el analito.

Los específicos miembros de unión pueden generalmente acoplarse a las sondas usando cualquier variedad de técnicas bien conocidas. Por ejemplo, acoplamiento covalente de los miembros específicos de unión a las sondas (por ejemplo, microparticulas etiquetadas) puede ser utilizado el carboxilico, amino, aldehido, bromoacetilo, yodoacetilo, tiol, epoxi y otros reactores o grupos funcionales de enlace, así como radicales libres residuales y cationes radicales, a través de los cuales puede lograrse una reacción de acoplamiento de proteína. Un grupo funcional de superficie puede también incorporarse como un comonómero funcional debido a que la superficie de la micropartícula puede contener una concentración de superficie relativamente alta de grupos polares. Además, aún cuando las etiquetas de la micropartícula son con frecuencia funcionales después de la síntesis, en ciertos casos, tales como poli (tiofenol) , las microparticulas son capaces de enlazado covalente directo con una proteína sin la necesidad por ulterior modificación. Por ejemplo, con referencia a la Figura 2, es ilustrada una incorporación de la presente invención para conjugar covalente una sonda. Como se muestra, el primer paso de la conjugación es la activación de los grupos carboxílicos sobre la superficie de la sonda usando carbodimida. En el segundo paso, los activados grupos de ácido carboxilico son reactivados con un grupo amino de un anticuerpo para formar cualquier unión amida. La activación y/o el acoplado de anticuerpo puede ocurrir en un amortiguador, tal como salino amortiguado con fosfato (PBS) (por ejemplo, pH de 7.2) o 2- (N-morfolino) ácido sulfónico etano (MES) (por ejemplo, pH de 5.3). Como se muestra, las sondas resultantes pueden entonces bloquearse con etanolamina, por ejemplo, para formar la sonda conjugada. Además de la unión covalente, otras técnicas de acoplamiento, tales como adsorción física, también pueden utilizarse en la presente invención.

Con referencia de nuevo a la Figura 1, el dispositivo 20 también contiene la zona de detección y calibración 31. La zona de detección y calibración 31 generalmente proporciona una sola distinta región de detección y calibración (por ejemplo, línea, punto, etc.) de tal forma que el usuario puede determinar exactamente la concentración de un particular analito dentro de la muestra de prueba en una ubicación a lo largo del dispositivo. Por ejemplo, en la incorporación ilustrada, es utilizada una sola línea.

Además, la línea puede disponerse en una dirección que es sustancialmente perpendicular al flujo de la muestra de prueba a través del dispositivo 20. Igualmente, en algunas incorporaciones, la línea puede disponerse en una dirección que es sustancialmente paralela al flujo de la muestra de prueba a través del dispositivo 20.

La zona de detección y calibración 31 puede contener uno o más reactivos de captura inmovilizados que son generalmente capaces de formar una unión química o física con las sondas, ya sea directamente o indirectamente (por ejemplo, a un específico miembro aglutinante conjugado a la sonda, a un analito complejo con la sonda, etc.). En algunas incorporaciones, un primer reactivo de captura inmovilizado es configurado para aglutinar a las sondas de detección, mientras que un segundo reactivo de captura es configurado para aglutinar a las ondas de calibración. El primero y segundo reactivos de captura inmovilizados pueden ser el mismo o diferente .

Hablando generalmente, varios tipos de reactivos de captura pueden inmovilizarse dentro de la zona de detección y calibración 31. Por ejemplo, en una incorporación, el reactivo de captura puede ser idéntico a o formado de la misma clase o categoría de materiales (por ejemplo, anticuerpos, antígenos, análogos de los mismos, y similares) como los específicos miembros aglutinantes usados para formar conjugados de las sondas. Por tanto, en esta incorporación, el reactivo de captura puede actuar como un sitio aglutinante estacionario para las sondas cuando aglutinan a un analito. Específicamente, el analito, tal como un anticuerpo, antígeno, etc., puede tener dos sitios aglutinantes . Con el alcanzado de la zona de detección y calibración 31 y el pasado a través de una almohadilla conjugada 22, uno de estos sitios de aglutinar es ocupado por el específico miembro de aglutinar conjugado a la sonda. Sin embargo, el sitio libre de aglutinado del analito puede aglutinar al reactivo de captura inmovilizado.

En otra incorporación, el reactivo de captura inmovilizado puede ser un poli-electrolito que puede aglutinar a las sondas, ya sea directamente o indirectamente, a través de interacción iónica. Por ejemplo, el poli-electrolito puede tener una red de carga positiva o negativa, así como una carga de red que es generalmente neutral. Algunos adecuados ejemplos de poli-electrolitos que tienen una carga de red positiva incluyen, pero no están limitados a, polilisina (comercialmente disponible de Sigma-Aldrich Chemical Co. Inc., de St. Louis, Missouri) , polietilenimina; epiclorohidrina-poliaminas funcionales y/o poliamidoaminas , tales como poli (dimetilamina-co-epiclorohidrina) ; polidialildimetil-amonio cloruro; derivados de celulosa catiónica, tal como copolímeros de celulosa o derivados de celulosa injertada con un monómero soluble en agua de amonio cuaternario y similares . En una particular incorporación, pueden utilizarse, CelQuat® SC-230M ó H-100 (disponible de Nacional Starch & Chemical Inc.), que son derivados de celulosa que contienen un monómero soluble en agua de amonio cuaternario. Además, algunos adecuados ejemplos de poli-electrolitos que tienen una carga de red negativa incluyen, pero no están limitados a ácidos poliacrílicos , tales como poli (etileno-co-ácido metacrílico, sal de sodio) y similares . Deberá también entenderse que otros poli-electrolitos pueden también utilizarse en la presente invención, tales como poli-electrolitos anfifilicos (por ejemplo, que tienen partes polares y no polares) . Por ejemplo, algunos ejemplos de adecuados poli-electrolitos anfifilicos incluyen, pero no están limitados a, poli (estirilo-b-N-metil 2-vinil piridinio yoduro) y poli (estirilo-b-ácido acrílico) , ambos de los cuales están disponibles de Polymer Source, Inc., de Dorval, Canadá.

Aún cuando cualquier poli-electrolito puede generalmente usarse, el poli-electrolito seleccionado para una particular aplicación puede variar dependiendo de la naturaleza de las sondas, específicos miembros aglutinantes, el analito de interés, el tipo de membrana porosa, y similares. En particular, la carga distribuida de un poli-electrolito le permite aglutinar a sustancias que tienen una carga opuesta. Por tanto, por ejemplo, los poli-electrolitos que tienen una carga de red positiva son con frecuencia mejor equipados para aglutinar con las sondas que son cargadas negativas, mientras que los poli-electrolitos que tienen una carga de red negativa son con frecuencia mejor equipados para aglutinar las sondas que son cargadas positivas. Por tanto, en tales instancias, la interacción iónica entre estas moléculas permite el requerido aglutinado que ocurra dentro de la zona de detección y calibración 31. No obstante, aún cuando la interacción iónica es principalmente utilizada para lograr el deseado aglutinado, los poli-electrolitos también pueden aglutinar con las sondas que tienen una similar carga.

Debido a que el poli-electrolito está diseñado para aglutinar a las sondas, es típicamente deseado que el poli-electrolito sea. sus_tancialmente inmovilizado no difuso sobre la superficie de la membrana porosa 23. Por tanto, los poli-electrolitos pueden aplicarse a la membrana porosa 23 de tal manera que los poli-electrolitos no sustancraímente se diseminan en la matriz de la membrana porosa 23. En particular, los poli-electrolitos típicamente forman una unión iónica y/o covalente con funcionales grupos presentes sobre la superficie de la membrana porosa 23 de tal forma que permanecen inmovilizados en ella. Aún cuando no se requiere, la formación de uniones covalentes entre el poli-electrolito y la membrana porosa 23 puede ser deseado más permanentemente inmovilizar al poli-electrolito en ellas.

Por ejemplo, en una incorporación, los monómeros usados para formar al poli-electrolito son primero formados en una solución y entonces aplicados directamente a la membrana porosa 23. Varios solventes (por ejemplo, solventes orgánicos, agua, etc.) pueden utilizarse para formar la solución. Una ves aplicada, la polimerización de los monómeros es iniciada usando calor, radiación por rayo de electrón, polimerización radical libre, y similares. En algunas instancias, conforme los monómeros se polimerizan, forman uniones covalentes con ciertos grupos funcionales de la membrana porosa 23, por ende inmovilizando al poli-electrolito resultante en ellas. Por ejemplo, en una incorporación, un monómero etileno imina puede formar una unión covalente con un grupo carboxilo presente en la superficie de algunas membranas porosas (por ejemplo, nitro-celulosa) .

En otra incorporación, el poli-electrolito puede formarse antes de la aplicación a la membrana porosa 23. Si se desea, el poli-electrolito puede primero ser formado en una solución usando solventes orgánicos, agua, y similares. Después de ello, la solución de poli-electrolito es aplicada a la membrana porosa 23 y entonces secada. Con el secado, el poli-electrolito puede, como se describió arriba, formar una unión iónica con ciertos grupos funcionales presentes en la superficie de la membrana porosa 23 que tiene una carga opuesta al poli-electrolito. Por ejemplo, en una incorporación, la polietileno imina cargada positiva puede formar una unión iónica con los grupos carboxilo cargados negativos presentes en la superficie de algunas membranas porosas (por ejemplo, nitro-celulosa) .

Además, el poli-electrolito también puede enlazarse en forma cruzada a la membrana porosa 23 usando varias bien conocidas técnicas. Por ejemplo, en algunas instancias, las poliaminas funcionarizadas de epiclorohidrina y/o las poliamidoaminas pueden usarse como un poli-electrolito cargado positivo, capaz de enlazarse en forma cruzada. Ejemplos de estos materiales son descritos en las patentes de los Estados Unidos de América números 3,700,623 otorgada a Keim; 3,772,076 otorgada a Keim; y 4,537,657 otorgada a Keim, las cuales son incorporadas aguí en su totalidad por referencia a la misma para todos los propósitos y se cree son vendidas por Hercules, Inc., de Wilmington, Delaware, bajo la designación de marca KYMENE™. Por ejemplo, Kymene™ 450 y 2064 son compuestos de poliamina funcionalizada de epiclorohidrina y/o poliamidoamina que contienen anillos epóxido y de grupos amonio cuaternario que pueden formar uniones covalentes con grupos carboxilo presentes en ciertos tipos de membranas porosas (por ejemplo, nitro-celulosa) y enlazados en forma cruzada con la columna de polímero de la membrana porosa cuando se cura. En algunas incorporaciones , la temperatura de enlazado en forma cruzada puede estar en el rango desde alrededor de 50 grados centígrados a alrededor de 120 grados centígrados y el tiempo de enlazado en forma cruzada puede estar en el rango desde alrededor de 10 a alrededor de 600 segundos.

Aún cuando varias técnicas para inmovilizar no difusas a poli-electrolitos sobre la membrana porosa 23 han sido descritas arriba, deberá entenderse que cualquier otra técnica para inmovilizar no difusa a compuestos de poli-electrolito pueden usarse en la presente invención. De hecho, los métodos antes mencionados, son solamente intencionados para ser ejemplares de las técnicas que pueden usarse en la presente invención. Por ejemplo, en algunas incorporaciones, ciertos componentes pueden añadirse a la solución de poli-electrolito que puede sustancialmente inhibir la difusión de tales poli-electrolitos en la matriz de la membrana porosa 23.

En general, una variedad de dispositivos de ensayo a través de flujo puede construirse de conformidad con la presente invención. A este respecto, varias incorporaciones de la presente invención serán ahora descritas en mayor detalle. Deberá entenderse, sin embargo, que las incorporaciones descritas abajo son solamente ejemplares, y que otras incorporaciones son también contempladas por la presente invención. Por ejemplo, con referencia a la Figura 3, es mostrada una particular incorporación en la cual las sondas 41 son usadas para la detección y las sondas 43 son usadas para la calibración. En esta incorporación, las sondas de detección 41 son aplicadas a la almohadilla conjugada 22 y son por tanto capaces de fluir a través del dispositivo 20 (como se indicó por la flecha de dirección L) cuando se colocan en comunicación con la muestra de prueba. Las sondas de detección 41 son conjugadas con un específico miembro aglutinante 90 para un analito A de tal forma, que con el contacto con el analito A, las sondas 41 aglutinan a las mismas para formar complejos de analito y sonda 49. Los complejos de analito y sonda 49 pueden entonces fluir a través del dispositivo 20 hasta que alcanzan la zona de detección y calibración 31.

Dentro de la zona de detección y calibración 31, el reactivo de captura de poli-electrolito es inmovilizado (no mostrado) para aglutinar a las sondas de calibración 43 a través de interacción iónica. En esta incorporación, las sondas de calibración 43 son inmovilizadas sobre el poli-electrolito antes de que sea aplicada la muestra de prueba. Las sondas de calibración 43 pueden incluir, por ejemplo, micropartículas de látex conjugadas con un específico miembro aglutinante 91 (por ejemplo, anticuerpo, antígeno, etc.) . En la zona de detección y calibración 31, los complejos de analito y sonda 49 pueden aglutinar al específico miembro aglutinante 91 de las sondas de calibración 43 para formar un complejo intercalado 50. Cualesquiera sondas no aglutinadas 41 fluirán a través de la zona de detección y calibración 31. Si se desea, la cantidad del reactivo de captura de poli-electrolito puede predeterminarse de tal forma que la señal de calibración dentro de la zona de detección y calibración 31 alcanza su potencial completo y predeterminado para la intensidad de la señal. Esto es, la cantidad de sondas 43 que son depositadas es predeterminada porque la cantidad de poli-electrolito empleado es fijada a un nivel predeterminado y conocido.

Una vez dejado para completamente desarrollar, el nivel de intensidad de las sondas 43 puede ser usado para calibrar el nivel de intensidad de las sondas 41 a la zona de detección y calibración 31 para determinar la cantidad de analito presente en la muestra de prueba. Este paso de calibración puede ocurrir visualmente, con la ayuda del dispositivo de lectura, o usando otras técnicas. Por ejemplo, en una incorporación, las sondas 41 y 43 pueden ser etiquetadas con compuestos que producen fluorescencia de tal forma que la intensidad de la señal de las sondas 41 y 43 puede medirse usando convencionales técnicas. Por ejemplo, en una incorporación, las sondas 41 y 43 pueden excitarse con la misma fuente externa. En esta incorporación, la fuente suministra radiación a una longitud de onda de excitación, por tanto causando que las sondas 41 emitan luz a una longitud de onda que es diferente que la longitud de onda emitida por las sondas 43. Esto permite la presencia de las sondas 41 y 43 para ser separadamente medidas. Alternativamente, las sondas 41 y 43 también pueden medirse separadamente usando separadas fuentes externas .

Hablando generalmente, la fluorescencia es el resultado de un proceso de tres etapas que ocurre en ciertos compuestos fluorescentes. En la primera etapa, la energía es suministrada por una fuente externa, tal como una lámpara incandescente o un láser y absorbida por el compuesto fluorescente, creando un estado excitado electrónico único. En la segunda etapa, el estado excitado existe por un tiempo finito durante el cual el compuesto fluorescente experimenta cambios de conformación y también es sometido a una multitud de posibles interacciones con su ambiente molecular. Durante este tiempo, la energía del estado excitado es parcialmente disipada, produciendo un estado relajado desde el cual origina la emisión fluorescente. La tercera etapa es la etapa de emisión fluorescente en donde le energía es emitida, regresando al compuesto fluorescente a su estado establecido. La energía emitida es más baja que su energía de excitación (luz o láser) y por tanto de una más larga longitud de onda. Este cambio o diferencia en la energía o longitud de onda permite la emisión de energía para detectarse y aislar de la energía de excitación.

La detección fluorescente generalmente utiliza longitudes de onda que filtran para aislar la emisión de fotones de los fotones de excitación, y un detector que registra la emisión de fotones y produce una salida regístrable, usualmente como una señal eléctrica o una imagen fotográfica. Hay generalmente cuatro tipos reconocibles de detectores: lectores de micro-placa y espectro-fluorómetros; microscopios fluorescentes; escáneres fluorescentes; y citómetros de flujo. Un adecuado detector fluorescente para uso con la presente invención es un Espectro-fluorómetro FluoroLog III, el cual es vendido por SPEX Industries, Inc., de Edison, Nueva Jersey.

Aún cuando no se requiere, los criterios de selección de particularmente deseados pares de sondas de detección y de calibración incluyen: 1) poco o ningún traslapado espectral para tanto los espectros de absorción o los espectros de fluorescencia de tal forma que las intensidades de emisión pueden ser medidas separadamente; 2) ninguna significativa energía fluorescente transfiere entre las sondas de detección y de calibración cuando se acercan próximas de tal forma que emiten independientemente; y, 3) relativamente larga emisión de longitudes de onda (por ejemplo, mayor de alrededor de 600 nanómetros) de tal forma que la auto-fluorescencia de fluidos biológicos tiene un efecto mínimo sobre la medición de fluorescencia.

Además, si se desea, una técnica conocida como "detección de fluorescencia resuelta en el tiempo" también puede utilizarse en la presente invención. La detección de fluorescencia resuelta en el tiempo es diseñada para reducir las señales de fondo desde la fuente de emisión o desde los procesos de diseminación (resultando de diseminar la radiación de excitación) por tomar ventaja de las características de fluorescencia de ciertos materiales fluorescentes, tales como quelatos lantánidos de europio (Eu(III))y terbio (Tb(III)). Tales quelatos pueden exhibir fuertemente cambio rojo, banda angosta, emisión de larga vida después de la excitación del quelato a sustancialmente más cortas longitudes de onda. Típicamente, el quelato posee una fuerte banda de absorción ultravioleta debido a un cromóforo localizado cerca del lantánido en la molécula. Subsiguiente a la absorción de luz por el cromóforo, la energía de excitación puede transferirse del cromóforo excitado al lantánido. Esto es seguido por una característica de emisión de fluorescencia del lantánido. El uso de excitación pulsada y la detección en tiempo de compuerta, combinada con filtros de emisión de banda angosta, permite por específica detección de la fluorescencia del quelato lantánido solamente, rechazando la emisión de otras especies presentes en la muestra que son típicamente de más corta vida o tienen más corta emisión de longitud de onda. Otras técnicas resueltas en tiempo para medir la fluorescencia son descritas en las patentes de los Estados Unidos de América números 5,585,279 otorgada a Davidson y la 5,637,509 otorgada a Hemmila y otros , las cuales son incorporadas aquí en su totalidad por referencia a la misma para todos los propósitos.

Sin importar la técnica usada para medir la sola intensidad de las sondas 41 y 43, ha sido descubierto que el uso de una sola zona de detección y calibración 31 puede permitir a las sondas de detección y calibración 41 y 43 el medirse en una misma ubicación del dispositivo 20. Este enfoque de una "sola ubicación de medición" proporciona un simple y atractivo enfoque para los usuarios del dispositivo de ensayo, particularmente aquellos, que son objetivo para aplicaciones en el hogar y en el punto de cuidado.

En la zona de detección y calibración 31, la cantidad de analito puede ser determinada de la intensidad de la señal de las sondas de detección 41 como son calibradas por la intensidad de la señal de las sondas de calibración 43.

Específicamente, la cantidad total de las sondas 43 es predeterminada y conocida y por tanto puede usarse para propósitos de calibración. Por tanto, la cantidad de analito en la muestra de prueba es directamente proporcional a Is (intensidad de la señal de las sondas 41) , mientras que la intensidad de la señal de las sondas 43, Ic, debe permanecer relativamente constante sin importar de la presencia del analito. Con base en el rango de intensidad en el cual ese valor calibrado falla, el rango de concentración general del analito puede determinarse. Como resultado, la calibración y el probado de la muestra pueden conducirse bajo aproximadamente las mismas condiciones al mismo tiempo, por tanto proporcionando resultados confiables cuantitativos o semi-cuantitativos , con aumentada sensibilidad.

Si se desea, la proporción de Is a Ic puede ser delineada en contra de la concentración del analito, para un rango de conocidas concentraciones de analito para generar una curva de calibración. Para determinar la cantidad de analito en una desconocida muestra de prueba, la proporción de señal puede entonces convertirse a concentración de analito de conformidad con la curva de calibración. Deberá notarse que alternativas relaciones matemáticas entre Is y Ic pueden delinearse en contra de la concentración del analito para generar la curva de calibración. Por ejemplo, en una incorporación, el valor de IS/(IS + Ic) puede delinearse en contra de la concentración de analito para generar la curva de calibración.

Con referencia a la Figura , es mostrada otra incorporación en la cual las sondas 41 son usadas para detección y las sondas 43 son usadas para calibración. Las sondas de detección 41 son aplicadas a la almohadilla conjugada 22 y son por tanto capaces de fluir a través del dispositivo 20 (como se indica por la flecha de dirección L) cuando se coloca en comunicación con la muestra de prueba. Las sondas de detección 41 son conjugadas con un miembro aglutinante específico 90 para un analito A de tal forma que, con el contacto con el analito A, las sondas 41 aglutinan a las mismas para formar complejos de analito y sonda 49. Los complejos de analito y sonda 49 pueden entonces fluir a través del dispositivo 20 hasta que alcanzan la zona de detección y calibración 31. Las sondas de calibración 43 son inmovilizadas dentro de la zona de detección y calibración 31 por vía de un reactivo de captura poli-electrolito. Por ejemplo, las sondas de calibración 43 pueden incluir micropartículas etiquetadas, polímeros, o moléculas que aglutinan al poli-electrolito a través de interacción iónica. Además, un específico miembro de aglutinar 91 (por ejemplo, anticuerpo, antígeno, etc.) es también separadamente inmovilizado dentro de la zona de detección y calibración 31. Con base en la naturaleza de las sondas de detección 41, ninguno de los complejos 49, ni las sondas no aglutinadas 41, aglutinan al reactivo de captura de poli-electrolito. En vez, los complejos de analito y sonda 49 aglutinan al específico miembro de aglutinar 91 para formar complejos 50 y cualesquiera sondas sin aglutinar 41 que fluyen a través de la zona de detección y calibración 31. Una vez dejada completamente desarrollar, la señal de intensidad Is de las sondas 41 en la zona de detección y calibración 31 puede determinarse para calcular la cantidad de analito presente en la muestra de prueba. En esta incorporación, la cantidad de analito en la muestra de prueba es directamente proporcional a Is. Además, la señal de intensidad Ic de las sondas de calibración 43 puede también usarse para calibrar Is. Por ejemplo, la proporción de Is a Ic puede delinearse en contra de la concentración de analito para un rango de conocidas concentraciones de analito para generar una curva de calibración.

Con referencia a la Figura 5, aún otra incorporación en la cual son mostradas las sondas 41 que son usadas para detección y las sondas 43 que son usadas para calibración. Las sondas de detección 41 y las sondas de calibración 43 son aplicadas a la almohadilla conjugada 22 y son por tanto capaces de fluir a través del dispositivo 20 (como se indica por la flecha de dirección L) cuando se colocan en comunicación con la muestra de prueba. Las sondas de detección 41 son conjugadas con un miembro aglutinante específico 90 para un analito A de tal forma que, con el contacto con el analito A, las sondas 41 aglutinan a las mismas para formar complejos de analito y sonda 49. Los complejos de analito y sonda 49 pueden entonces fluir a través del dispositivo 20 hasta que alcanzan la zona captura 33. Un poli-electrolito es inmovilizado dentro de la zona de detección y calibración 31 para selectivo aglutinado con las sondas de calibración 43 (por ejemplo, mic'ropartículas etiquetadas, polímeros, o moléculas) a través de interacción iónica. Específicamente, las sondas 43 pueden ser más pequeñas en tamaño que las sondas 41 de tal forma que llegan a la zona de detección y calibración 31 antes que las sondas 41 y ocupan todos los sitios de aglutinar proporcionados por el poli-electrolito. Alternativamente, las cargas de las sondas 41 y 43 pueden ser tales que solamente las sondas 43 aglutinan al poli-electrolito. En cualquier evento, un específico miembro de aglutinar 91' (por ejemplo, anticuerpo, antígeno, etc.) es también separadamente inmovilizado dentro de la zona de detección y calibración 31. En la zona de detección y calibración 31 los complejos de analito y sonda 49 aglutinan al específico miembro de aglutinar 91 para formar complejos 50. Cualesquiera sondas sin aglutinar 41 fluirán a través de la zona de detección y calibración 31. Una vez dejada completamente desarrollar, la señal de intensidad Is de las sondas 41 en la zona de detección y calibración 31 puede determinarse para calcular la cantidad de analito presente en la muestra de prueba. En esta incorporación, la cantidad de analito en la muestra de prueba es directamente proporcional a Is. Además, la señal de intensidad Ic de las sondas de calibración 43 puede también usarse para calibrar Is. Por ejemplo, la proporción de Is a Ic puede delinearse en contra de la concentración de analito para un rango de conocidas concentraciones de analito para generar una curva de calibración.

En algunas incorporaciones, el dispositivo 20 puede contener adicionales zonas que facilitan la detección del analito de interés. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 6, el dispositivo 20 puede contener una zona de captura 33 que es colocada hacia arriba de la zona de detección y calibración 31. La zona de captura 33 contiene un primer reactivo de captura que es especifico a cualquiera de las sondas de detección o de calibración. Por ejemplo, en la incorporación ilustrada, · las sondas de detección 41 son aplicadas a la almohadilla conjugada 22 y son por tanto capaces de fluir a través del dispositivo 20 cuando se colocan en comunicación con la muestra de prueba. Las sondas de detección 41 pueden ser conjugadas con un específico miembro de aglutinar 90 por un analito A de tal forma, que con el contacto con el analito A, las sondas 41 aglutinan a las mismas para formar complejos de analito y sonda 49. Los complejos de analito y sonda 49 pueden entonces fluir a través del dispositivo 20 hasta que alcanzan la zona de captura 33. Específicos miembros de aglutinar 91 tales como un anticuerpo o antígeno que corresponde al analito A, son inmovilizados dentro de la zona de captura 33. Por tanto, en la zona de captura 33, los complejos de analito y sonda 49 pueden aglutinar a los específicos miembros de aglutinar 91 inmovilizados en la misma para formar complejos 50.

Cualesquiera sondas sin aglutinar 41 fluirán entonces a la zona de detección y calibración 31. En esta incorporación, un segundo reactivo de captura (por ejemplo, poli-electrolito) es también inmovilizado dentro de la zona de detección y calibración 31 que es capaz de aglutinar a cualesquiera sondas sin aglutinar 41 a través de la interacción iónica. Además, las sondas de calibración 43 también pueden inmovilizarse sobre el segundo reactivo de captura dentro de la zona de detección y calibración 31. Por ejemplo, las sondas de calibración 43 pueden incluir micropartículas de látex que también aglutinan al poli-electrolito a través de la interacción iónica.

Una vez dejada completamente desarrollar, la señal de intensidad Is de las sondas 41 en la zona de detección y calibración 31 puede determinarse para calcular la cantidad de analito presente en la muestra de prueba. En esta incorporación, la cantidad de analito en la muestra de prueba es inversamente proporcional a Is. Además, la señal de intensidad Ic de las sondas de calibración 43 puede también usarse para calibrar Is. Por ejemplo, la proporción de Is a Ic puede delinearse en contra de la concentración de analito para un rango de conocidas concentraciones de analito para generar una curva de calibración. Para determinar la cantidad del analito en una desconocida muestra de prueba, la proporción de señal puede entonces convertirse a concentración de analito de conformidad con la curva de calibración. Deberá notarse que alternativas relaciones matemáticas entre Ic y Is pueden delinearse en contra de la concentración de analito para generar la curva de calibración.

Aún cuando varias incorporaciones de las configuraciones de ensayo han sido descritas arriba, deberá entenderse que un ensayo de la presente invención puede generalmente tener cualquier configuración deseada, y no necesita contener todos los componentes descritos antes. Además, otros bien conocidos componentes de los ensayos que específicamente no se refieren aquí también pueden utilizarse en la presente invención. Por ejemplo, varias configuraciones de ensayos son descritas en las patentes de los Estados Unidos de América números 5,395,754 otorgada a Lambotte y otros; 5,670,381 otorgada a Jou y otros; y 6,194,220 otorgada a Malick y otros , las cuales son aquí incorporadas en su totalidad por referencia a la misma para todos los propósitos. Además, también deberá entenderse que los ensayos competitivos pueden también formarse de conformidad con la presente invención. Las técnicas y configuraciones de los ensayos competitivos son bien conocidas para aquellos con habilidad en el arte .

Como un ejemplo, el dispositivo a través de flujo 20 descrito arriba e ilustrado en la Figura 3 puede ser fácilmente modificado para formar un ensayo competitivo. En esta incorporación, las sondas de detección 41 pueden ser un analito o analito análogo, mientras que las sondas de calibración 43 pueden incluir, por ejemplo, a micropartículas de látex conjugadas con un específico miembro aglutinante para el analito de interés . Cuando la muestra de prueba es aplicada, las sondas de detección 41 se desplazan a través de la membrana porosa 23 hasta que alcanza la zona de detección y calibración 31. En la zona 31, las sondas de detección 41 y cualquier analito A dentro de la muestra de prueba compiten por los miembros específicos de aglutinar 91 (por ejemplo, anticuerpo, antígeno, etc.) . Cualesquiera sondas sin aglutinar 41 fluirán a través de la zona de detección y calibración 31, En esta incorporación, la cantidad de analito en la muestra de prueba es contrariamente proporcional a Is (intensidad de la señal de las sondas 41) . Si se desea, la proporción de Is a Ic (intensidad de la señal de las sondas 43) puede delinearse en contra de la concentración de analito por un rango de conocidas concentraciones de analito para generar una curva de calibración.

La presente invención puede ser mejor entendida con referencia a los siguientes ejemplos.

EJEMPLO 1 La capacidad de una zona de detección interna/calibración de la presente invención para calibrar un ensayo de emparedado fue demostrada. Inicialmente, las muestras de membrana porosa HF 120 fueron laminadas sobre las tarjetas de soporte correspondientes teniendo una longitud de aproximadamente de 30 centímetros. Las cuentas fluorescentes (sondas de calibración) fueron obtenidas de Molecular Probes, Inc . , que tienen un tamaño de partícula de 0.2 micrómetros y longitudes de onda de emisión/excitación de 505/515 nanómetros. Las cuentas fueron lavadas y almacenadas en un amortiguador de almacenado a 0.28% por peso de porcentaje. 40 microlitros de la solución de cuenta de fluorescente fueron mezclados con 10 microlitros de una solución de polilisina y se deslavaron en la membrana para formar un forro de calibración /detección. El anticuerpo monoclonal CRP Mab 5804 teniendo una concentración de 2.36 miligramos por litro (obtenida de Biogenisis, Inc.) fue inmovilizado sobre las muestras de membrana porosa para formar una línea de captura. Las muestras de membrana fueron entonces secadas por 1 hora a una temperatura de 37° C. Una almohadilla de transmisión de fibra celulósica (Millipore Company) fue unida a un extremo de la membrana y se cortó en tiras de 4 milímetros .

Las muestras fueron puestas en varios micro-pozos en los cuales estaban contenidas las mezclas de cuentas fluorescentes (sondas de detección) y diferentes concentraciones de antígeno CRP. La cantidad de cuentas fluorescentes fue la misma para cada mezcla, por ejemplo 4 microgramos . Las cuentas de detección fluorescentes fueron formadas como sigue. Inicialmente , las cuentas de poliestireno teniendo grupos de carboxilo funcionales (obtenidas de Molecular Probes, Inc.) fueron proporcionadas. Las cuentas tuvieron un tamaño de partícula de 0.5 micrometros y longitudes de onda de excitación/emisión de 580/605 nanómetros . 100 microlitros de las cuentas de poliestireno (concentración de 2%) fueron lavadas dos veces con el amortiguador MES y se separaron con un centrífugo. Las cuentas paletizadas fueron suspendidas de nuevo en 100 microlitros del amortiguador MES y se mezclaron con 50 microlitros del amortiguador MES conteniendo 4 miligramos de carbodiimida (de Polysciences, Inc.) . La mezcla fue reaccionada a la temperatura ambiente por 20 minutos sobre un agitador. Las cuentas activadas fueron entonces lavadas dos veces con un amortiguador de borato. Las cuentas activadas fueron re-suspendidas en 200 microlitros de amortiguador de borato y mezcladas con 15 microlitros de anticuerpo monoclonal de proteínas C-reactiva (CRP Mab 5811 de Biogenisis, Inc.) teniendo una concentración de 6.4 miligramos por mililitro. La reacción se dejó ocurrir durante la noche sobre un agitador a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción resultante fue entonces mezclada con 100 microlitros de etanolamina por 15 minutos con un agitador . La solución supernadante fue descartada y las cuentas fueron lavadas dos veces con un amortiguador PBS y se almacenaron a 4o C en un amortiguador de almacenado que contuvo 0.1 PBS molar, 0.15 molar de NaCl, 1% de BSA, 5% de glicerol y 0.1% de NaN3, para resultar en cuentas conjugadas de una concentración de 4 mg/ml.

La intensidad fluorescente fue entonces medida en la linea de detección/calibración usando un dispositivo Fluorolog III Spectrofluoremeter (de SPEX Industries, Inc., de Edison, New Jersey) con un modo de ángulo recto. Los resultados están mostrados en la Tabla 1 dada abajo, en donde ls representa la intensidad de señal de las sondas de detección en la línea de detección/calibración y lc representa la intensidad de señal de las sondas de calibración en la línea de detección/calibración .

Tabla 1: Resultados de Intensidad de Señal Como se evidencia de los resultados anteriores, cuando ningún analito estuvo presente en la muestra, las sondas de detección se movieron más allá de la línea de captura y fueron capturadas sobre la línea de detección/calibración.

Cuando el analxto estaba presente en la muestra, las sondas de detección se complejaron con el analito y fueron capturadas en la línea de captura, con cualquier sondas de detección restantes siendo capturadas en la línea de detección/calibración. Por tanto, la intensidad de las sondas de detección (ls) sobre la línea de detección/calibración fue inversamente proporcional a la concentración de analito, mientras que la intensidad (lc) de las sondas de calibración en la línea de detección/calibración fue mantenida relativamente constante para diferentes concentraciones de analito, por ejemplo, ~444 + 27. Las variaciones de lc se cree que se deben al ambiente variado, a las condiciones de ensayo y a la inestabilidad instrumental. Sin embrago, la variación se hubiera esperado que tuviera un efecto similar sobre ls. Por tanto ls/lc se cree que ha proporcionado un resultado más exacto en éste caso.

EJEMPLO 2 La habilidad de la zona de detección interna/calibración de la presente invención para calibrar un ensayo de emparedado fue demostrada. Inicialmente, las muestras de membrana porosa HF 120 fueron laminadas en las tarjetas de soporte correspondientes teniendo una longitud de aproximadamente de 30 centímetros. Los polímeros fluorescentes (sondas de calibración) fueron entonces formados como sigue.

Inicialraente, 0.5 gramos de ácido poliacrllico (peso molecular = 450,000, D.P. = 6250) fueron disueltos en 20 mililitros de metanol . 3.8 miligramos de diciclohexilcarbodiimida (DDC) en 1 milímetro de metanol fueron agregados a la solución para activar el polímero de ácido poliacrílico . La solución resultante fue agitada por 30 minutos. Una solución de tinte fluorescente fue hecha mediante el disolver 10 miligramos de 5- (y-6) - ( (N- (5-aminopentil) amino) -carbonilo) tetrametilrodamina (longitudes de onda de excitación/emisión de 544/590 nanómetros, de Molecular Probes, Inc.) en 1 mililitro de una solución de metanol. La solución de tinte fue agregada a la solución de ácido poliacrílico activado y se agitó. La reacción fue continuada por 24 horas a la temperatura ambiente con hoja de aluminio envuelta alrededor de la solución. Después de que la reacción fue detenida, el dietiléter fue agregado para formar un precipitado. El precipitado fue centrifugado y empapado en etanol para remover cualquier tinte fluorescente no reaccionado. Después de remover la solución de etanol, el gel rojo residual fue secado en aire.

Los polímeros fluorescentes (sondas de calibración) descritas anteriormente fueron entonces disueltas en agua y se mezclaron con CelQuat® 100-H (un derivado polielectrolítico disponible de Nacional Starch & Chemical, Inc.) . Esta mezcla fue desvestida sobre la membrana para formar una línea de detección/calibración. El anticuerpo monoclonal CRP Mab 5811 teniendo una concentración de 6.4 miligramos por mililitro (obtenida de Biogenisis, Inc.) fue inmovilizado en las muestras de membrana porosa para formar una linea de captura. Las muestras de membrana fueron entonces secadas por 1 hora a una temperatura de 37° C. Una almohadilla de transmisión de fibra celulósica (Millipore Company) fue sujetada a un extremo de la membrana y se cortó en tiras de 4 milímetros .

Las muestras de pegado medio fueron puestas en varios micro-pozos en los cuales estaban contenidas las cuentas fluorescentes (sondas de detección) y diferentes concentraciones de antígeno CRP. La cantidad de cuentas fluorescentes (sondas de detección) fue la misma para cada mezcla, por ejemplo 4 microgramos . Las cuentas fluorescentes (sondas de detección fueron formadas como sigue. Inicialmente, las cuentas de poliestireno teniendo grupos de carboxilo funcionales (obtenidas de Molecular Probes, Inc.) fueron proporcionadas . Las cuentas tuvieron un tamaño de partícula de 0.2 micrómetros y longitudes de onda de excitación/emisión de 505/515 nanómetros. 100 microlitros de las cuentas de poliestireno (concentración de 2%) fueron lavadas dos veces con amortiguador MES y se separaron con microcentrifugado . Las cuentas paletizadas fueron entonces suspendidas de nuevo en 200 microlitros de amortiguador MES y se mezclaron con 20 microlitros de amortiguador MES conteniendo 4.8 miligramos de carbodiimida (de Polysciences, Inc.). La mezcla fue reaccionada a la temperatura ambiente por 20 minutos sobre un agitador. Las cuentas activadas fueron entonces lavadas dos veces con un amortiguador de borato. Las cuentas activadas fueron resuspendidas en 200 microlitros de amortiguador de borato y se mezclaron con 90 microlitros de anticuerpo monoclonal de una proteína C-reactivo (CRP Mab 5804 de Biogenisis, Inc.) teniendo una concentración de 2.36 miligramos por mililitro. La reacción se dejó ocurrir durante la noche sobre un agitador a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción resultante fue entonces combinada con 100 microlitros de etanolamina por 15 minutos con un agitador. La solución supernadante fue descartada y las cuentas fueron lavadas dos veces con un amortiguador PBS y se almacenaron a 4o C en un amortiguador de almacenamiento que contuvo 0.1 PBS molar, 0.15 molar de NaCl, 1% de BSA, 5% de glicerol y 0.1% de NaN3, para resultar en cuentas conjugadas de una concentración de 4 mg/ml.

La intensidad fluorescente fue entonces medida en la linea de detección/calibración usando un dispositivo Fluorolog III Spectrofluoremeter (de SPEX Industries, Inc., de Edison, New Jersey) con un modo de ángulo recto. Los resultados están mostrados en la Tabla 2 dada abajo, en donde ls representa la intensidad de señal de las sondas de detección en la linea de detección/calibración y lc representa la intensidad de señal de las sondas de calibración en la línea de detección/calibración.

Tabla 2 : Resultados de Intensidad de Señal Como se evidencia de los resultados anteriores, cuando no estuvo presente el analxto en la muestra, las sondas de detección se movieron pasando la línea de captura y fueron capturadas en la línea de detección/calibración. . Cuando el analxto estuvo presente en la muestra, las sondas de detección se complejaron con el analxto y fueron capturadas en la línea de captura, con cualquier sondas de detección restantes siendo capturadas en la línea de detección/calibración. Por tanto, la intensidad de las sondas de detección (ls) sobre la línea de detección/calibración fue inversamente proporcional a la concentración de analxto, con la intensidad (lc) de las sondas de calibración en la línea de detección/calibración permaneciendo relativamente constante para diferentes concentraciones de analito, por ejemplo, ~36 + 6. Las variaciones de lc se cree que se deben al ambiente variado, a las condiciones de ensayo y a la inestabilidad instrumental. Sin embrago, la variación se espera que tenga un efecto similar sobre ls . Por tanto ls/lc se cree que ha proporcionado un resultado más exacto en éste caso.

Aún cuando la invención se ha descrito en detalle con respecto a incorporaciones específicas de la misma, se apreciará por aquellos expertos en el arte al obtener un entendimiento de lo anterior, que pueden concebirse fácilmente alteraciones, variaciones y equivalentes de éstas incorporaciones. Por tanto, el alcance de la presente invención debe evaluarse como aquel de las cláusulas anexas y cualquier equivalente de las mismas .

Claims (40)

R E I V I N D I C A C I O N E S

1. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo capaz de detector la presencia o cuantificar un analito que reside en una muestra de prueba, dicho dispositivo de ensayo de flujo continuo comprende una membrana porosa, dicha membrana porosa está en comunicación con las sondas de detección capaces de generar una señal de detección y las sondas de calibración capaces de generar una señal de calibración, dicha membrana porosa define una zona de detección/calibración dentro de la cual un reactivo de captura de polielectrolito es inmovilizado el cual está configurado para aglutinar directamente o indirectamente a dichas sondas de detección, dichas sondas de calibración, o combinaciones de los mismos, en donde las sondas de detección son capaces de generar una señal de detección y dichas sondas de calibración son capaces de generar una señal de calibración mientras que están dentro de la zona de detección/calibración, en donde la cantidad de analito es capaz de determinación desde dicha señal de detección como se calibra por dicha señal de calibración.

2. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dichas sondas de detección y dichas sondas de calibración son seleccionadas del grupo que consiste de cromógenos, catalizadores, compuestos fluorescentes, compuestos quimoiluminiscentes , compuestos fluorescentes, compuestos reactivos, etiquetas visuales directas, liposomas o combinaciones de las mismas.

3. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 2, caracterizado porque dichas sondas de detección y dichas sondas de calibración son compuestos fluorescentes .

4. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque - las sondas de detección, dichas sondas de calibración o combinación de las mismas contienen micropartículas .

5. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dichas sondas de detección, dichas sondas de calibración o las combinaciones de las mismas están conjugadas con un miembro de aglutinamiento especifico para el analito.

6. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 5, caracterizado porque un segundo reactivo de captura está inmovilizado sobre dicha membrana porosa dentro de dicha zona de detección/calibración que es un miembro de aglutinamiento específico para el analito.

7. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 6, caracterizado porque dicho segundo reactivo de captura está configurado para aglutinar directamente o indirectamente a dichas sondas de detección cuando se hace contacto con las mismas.

8. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porgue dicho polielectrolito tiene una carga positiva neta.

9. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 8, caracterizado porque dicho polielectrolito es seleccionado del grupo que consiste de polilisina, polietilenimina, poliaminas o poliamidoaminas funcionarizadas con epiclorohidrina, cloruro de polidialildimetil amonio, derivados de celulosa catiónica y combinaciones de los mismos.

10. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicho polielectrolito tiene una carga negativa neta.

11. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 10, caracterizado porque dicho polielectrolito es anfifilico

12. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicho reactivo de captura de polielectrolito está configurado para aglutinar directa o indirectamente a dichas sondas de calibración.

13. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicho reactivo de captura de polielectrolito está configurado para aglutinar directa o indirectamente a dichas sondas de detección.

14. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque dicha membrana porosa además define una zona de captura localizada hacia arriba de dicha zona de detección/calibración dentro de la cual uno o más reactivos de captura están inmovilizados que son configurados para aglutinar directa o indirectamente a dichas sondas de detección.

15. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 14, caracterizado porque dicho reactivo de captura de dicha zona de captura es un miembro de aglutinamiento específico para el analito.

16. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque la cantidad de analito dentro de la muestra de prueba es proporcional a la intensidad de la señal de detección dividida por la intensidad de la señal de calibración.

17. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el dispositivo es un dispositivo de ensayo de tipo de emparedado .

18. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizado porque el dispositivo es un dispositivo de ensayo de tipo competitivo.

19. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo capaz de detectar la presencia o la cantidad de un analito que reside en una muestra de prueba, dicho dispositivo de ensayo de flujo continuo comprende una membrana porosa, dicha membrana porosa estando en comunicación con las sondas de detección capaces de generar una señal de detección y sondas de calibración capaces de generar una señal de calibración, dichas sondas de detección son conjugadas con un miembro de aglutinamiento específico para el analito, dicha membrana porosa define una zona de detección/calibración dentro de la cual un reactivo de captura de polielectrolito está no difusamente inmovilizado que está configurado para aglutinar directa o indirectamente a dichas sondas de calibración, dichas sondas de detección o combinaciones de los mismos, en donde dichas sondas de detección son capaces de generar una señal de detección y dichas sondas de calibración son capaces de generar una señal de calibración mientras que está dentro de dicha zona de detección/calibración, en donde la cantidad del analito es capaz de la determinación desde dicha señal de detección al calibrarse por la señal de calibración.

20. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 19, caracterizado porque dichas sondas de detección y dichas sondas de calibración sin seleccionadas del grupo que consiste de cromógenos, catalizadores, compuestos fluorescentes, compuestos quimoiluminiscentes, compuestos fosforescentes, compuestos radioactivos, etiquetas visuales directas, liposomas y combinaciones de los mismos .

21. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 19, caracterizado porque dichas sondas de detección y las sondas de calibración son compuestos fluorescentes.

22. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 19, caracterizado porque las sondas de detección, dichas sondas de calibración o las combinaciones de las mismas contienen micropartículas .

23. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 19, caracterizado porque dichas sondas de calibración son conjugadas con un miembro aglutinante específico para el analxto.

24. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 19, caracterizado porque un reactivo de captura adicional es inmovilizado sobre dicha membrana porosa dentro de dicha zona de detección/calibración que es un miembro aglutinante específico para el analito.

25. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 24, caracterizado porque dicho reactivo de captura adicional está configurado para aglutinar directamente o indirectamente a dichas sondas de detección cuando se pone en contacto con las mismas.

26. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 19, caracterizado porque dicha membrana porosa además define una zona de captura localizada hacia arriba de dicha zona de detección/calibración dentro de la cual uno o más reactivos de captura están inmovilizados que están configurados para aglutinar directa o indirectamente a dichas sondas de detección.

27. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 26, caracterizado porque dicho reactivo de captura de dicha zona de captura es un miembro aglutinante específico para el analito.

Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 19 , caracterizado porque el dispositivo es un dispositivo de ensayo de tipo de emparedado.

29. Un dispositivo de ensayo de flujo continuo tal y como se reivindica en la cláusula 19, caracterizado porque el dispositivo es un dispositivo de ensayo de tipo competitivo.

30. Un método para detectar la presencia o cantidad de un analito que reside en una muestra de prueba, dicho método comprende : i) proporcionar un dispositivo de ensayo de flujo continuo que comprende una membrana porosa, dicha membrana porosa está en combinación con las sondas de detección capaces de generar una señal de detección y sondas de calibración capaces de generar una señal de calibración, dicha membrana porosa define una zona de detección/calibración dentro de la cual está inmovilizado un reactivo de captura de polielectrolito que está configurado para aglutinar directa o indirectamente a dichas sondas de detección, dichas sondas de calibración o combinaciones de las mismas, en donde dichas sondas de detección son capaces de generar una señal de detección y dichas sondas de calibración son capaces de generar una señal de calibración mientras que están dentro de la zona de detección/calibración; ii) poner en contacto una muestra de prueba que contiene el analito con dichas sondas de detección y dichas sondas de calibración; iii) medir la intensidad de la señal de detección y la intensidad de la señal de calibración generada dentro de la zona de detección/calibración; y iv) calibrar la intensidad de la señal de detección con la señal de calibración, en donde la cantidad del analito dentro de la muestra de prueba es determinada de la señal de detección al ser calibrada por la señal de calibración.

31. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 30, caracterizado porque dichas sondas de detección y las sondas de calibración son seleccionadas del grupo que consiste de cromógenos, catalizadores, compuestos fluorescentes, compuestos quimoiluminiscentes , compuestos fosforescentes, compuestos radioactivos, etiquetas visuales directas, liposomas y combinaciones de los mismos.

32. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 31, caracterizado porque dichas sondas de detección y las sondas de calibración son compuestos fluorescentes .

33. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 32, caracterizado además porque comprende excitar dichas sondas de detección y dichas sondas de calibración dentro de dicha zona de detección/calibración en donde la excitación hace que las sondas de detección emitan la señal de detección y las sondas de calibración emitan la señal de calibración.

34. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 30, caracterizado porque las sondas de detección, dichas sondas de calibración o combinaciones de las mismas son conjugadas con un miembro aglutinante específico para el analito .

35. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 34, caracterizado porque el segundo reactivo de captura es inmovilizado dentro de la zona de detección/calibración que es un miembro aglutinante específico para el analito.

36. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 35, caracterizado porque dicho segundo reactivo de captura está configurado para aglutinar directamente o indirectamente a dichas sondas de detección cuando se pone en contacto con las mismas .

37. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 30, caracterizado porque dicho reactivo de captura de de polielectrolito está configurado para aglutinar directamente o indirectamente a dichas sondas de calibración.

38. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 30, caracterizado porque el reactivo de captura de polielectrolito está configurado para aglutinar directa o indirectamente a dichas sondas de detección.

39. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 30, caracterizado porque dicha membrana porosa además define una zona de captura localizada hacia arriba de la zona de detección/calibración dentro de la cual uno o más reactivos de captura están inmovilizados y están configurados para aglutinar directa o indirectamente a dichas sondas de detección.

40. Un método tal y como se reivindica en la cláusula 30, caracterizado además porque comprende el generar una curva de calibración mediante el dibujar la intensidad de la señal de detección calibrada por la intensidad de la señal de calibración para una pluralidad de concentraciones de analito predeterminadas . R E S U M E N Es proporcionado un sistema autocalibrado interno para dispositivos de ensayo de flujo continuo. En particular, la invención emplea el uso de una zona de calibración/detección única definida por una membrana porosa del ensayo. Se ha descubierto que el sistema autocalibrado interno proporciona un método exacto, barato y fácilmente controlable para determinar la presencia de un analito en una muestra de prueba.-