JP4040666B2 - 新規可溶性ｃｄ１４抗原 - Google Patents

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Description

本発明は、敗血症の診断マーカーとなり得る、生体内の新規な抗原に関する。また、該抗原を測定することを特徴とする敗血症の診断方法、特定の抗体を用いた該抗原の測定キット及びその測定方法に関する。さらに、該測定キットの標準物質として有用な組換え型可溶性フラグメント、該フラグメントに結合する抗体、該フラグメントの生産法、及び該フラグメントを用いた抗体のスクリーニング方法に関する。
ＣＤ１４分子は単核球細胞の膜表面上に発現している糖蛋白質を認識する一群の抗体により同定される蛋白質として１９８６年に第３回Leukocyte Typing Conferenceにて、命名された。１９９０年、WrightらはこのＣＤ１４分子が、エンドトキシンであるＬＰＳのレセプターであることを明らかにした（「サイエンス（Science）」（米国）、1990年、第249巻、p.1431−1433）。このＣＤ１４分子は分子量５３〜５５ｋＤａの糖蛋白質で、ｍＲＮＡは約１．４ｋｂのサイズで３５６個のアミノ酸からなることがｃＤＮＡの解析から明らかにされた（「ヌクレイック アシッド リサーチ（Nucleic Acids Research）」（英国）、1988年、第16巻、p.4173）。
ヒトＣＤ１４分子には、膜結合型ＣＤ１４のほかに可溶型ＣＤ１４があり、血中には分子量の異なる複数の可溶型ＣＤ１４が存在することが報告された（「ヨーロピアン ジャーナル オブ イムノロジー（European Journal of Immunology）」（独国）、1993年、第23巻、p.2144−2151）。また、Landmannらは、敗血症患者血清の可溶型ＣＤ１４のウエスタンブロット分析を行い、約５５ｋＤａの可溶型ＣＤ１４が敗血症死亡例や発作性夜行性ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）患者で高値であり、正常人血清中にはこの分子が認められず、正常人には分子量の少し小さい４９ｋＤａの可溶型ＣＤ１４が検出されたことを報告した（「ザ ジャーナル オブ インフェクショウス ディジーズ（The Journal of Infectious Disease）」（米国）、1995年、第171巻、p.639−644）。
この分子量の異なるサブタイプについては、糖鎖の違いが関与していること、またＮおよびＯ結合型糖鎖を除去してもなお２種の異なる分子量の可溶型ＣＤ１４が血中に存在することをStelterらが報告している（「ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリー（European Journal of Biochemistry）」（独国）、1996年、第236巻、p.457−464）。また、Buflerらは可溶型ＣＤ１４のＣ末端分析を行い可溶型ＣＤ１４の３２７位のセリン残基にＧＰＩ基が結合すること、約５６ｋＤａの分子量を持つ可溶型ＣＤ１４はＧＰＩアンカリングされない分子種であることを報告した（「ヨーロピアン ジャーナル オブ イムノロジー（European Journal of Immunology）」（独国）、1995年、第25巻、p.604−610）。
組換え型可溶性ＣＤ１４全長及びそのフラグメントについて、Juanらは、ヒトＣＤ１４のＮ末端１位〜１５２位からなるフラグメントが、ＬＰＳシグナルを細胞に伝達する機能を有することを報告している（「ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）」（米国）、１９９５年、第２７８巻、ｐ．１３８２−１３８７）が、Ｎ末端１位〜１２４位からなるフラグメント及びＮ末端１位〜９８位からなるフラグメントの発現には成功していない。また、Majerleらは、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）領域を３単位有するヒトＣＤ１４のＮ末端１位〜１５２位からなるフラグメントはｒｅｆｏｌｄｉｎｇされ、ＬＲＲ領域を２単位しか有さないヒトＣＤ１４のＮ末端１位〜１３４位からなるフラグメントはｒｅｆｏｌｄｉｎｇされないこと、Ｎ末端１位〜６９位からなるフラグメントの発現には成功していないを報告している（「プフリュゲルズ アルチ−ヨーロピアン ジャーナル オブ フィジオロジー（Pflugers Arch-European Journal of Physiology）」（独国）、２０００年、第４３９巻［Ｓｕｐｐｌ］、ｐ．Ｒ１０９−Ｒ１１０）が、本報告では、Ｎ末端１位〜６９位からなるフラグメントの発現には成功していない。
ＣＤ１４分子に対する抗体は、Bazilらの作製したＭＥＭ−１８（「ヨーロピアン ジャーナル オブ イムノロジー（European Journal of Immunology）」（独国）、1986年、第16巻、p.1583−1589）、Shuttらの作製したＲｏＭｏ−１（「アレルギー ウント イムノロジー（Allergie und Immunologie）」（独国）、1988年、第34巻、p.17−26）、Steinmanらの作製した３Ｃ１０（「ジャーナル オブ イクスペリメンタル メディスン（Journal of Experimental Medicine）」（米国）、1983年、第158巻、p.126−145）をはじめ、多くの抗ＣＤ１４抗体が作製され、ＣＤ１４蛋白質の同定に使用されている。
また、これら抗体を用いた可溶型ＣＤ１４の測定系が、Shuttら（西独国特許公開第２８６８７６号）、Bazilら（「モレキュラー イムノロジー（Molecular Immunology）」（英国）、1989年、第26巻、p.657−662頁；Grunwaldら（「ジャーナル オブ イムノロジカル メソッズ（Jounal of Immnological Methods）」（蘭国）、1992年、第155巻、p.225−232）により報告され、ヒト体液中の可溶型ＣＤ１４が測定されるようになった。
さらに、可溶型ＣＤ１４−ＥＬＩＳＡキットがＩＢＬ-Hamburg、Medgenix、Ｒ＆Ｄ Systemsより発売され、敗血症をはじめとして多くの疾患で可溶型ＣＤ１４の測定が行われている（「クリニカル イムノロジー アンド イムノパソロジー（Clinical Immunology And Immunopathology）」（米国）、1996年 第80巻、p.307−310；「臨床検査」、1994年、第38巻、p.341−344）。
しかし敗血症以外の疾患でも疾患の進行度に伴って前述の約５５ｋＤａ，４９ｋＤａを含む可溶型ＣＤ１４（報告により、その分子量は異なるため、約５５ｋＤａ、４９ｋａに限定されるわけではない、以下同）濃度が上昇し、可溶型ＣＤ１４は敗血症特異的なマーカーではないことが明らかになった（「インフェクション アンド イムニティー（Infection and Immunity)」（米国）、1999年、第67巻、p.417−420；「クリニカル アンド イクスペリメンタル イムノロジー（Clinical and Experimental Immunology）」（英国）、2000年、第120巻、p.483−487；「クリニカル アンド イクスペリメンタル イムノロジー（Clinical Experimental Immunology）」（英国）、1994年、第96巻、p.15−19）。また、可溶型ＣＤ１４は敗血症の重症化のマーカーとして期待されていたが、敗血症性ショックとの相関が見られないこと（「ペディアトリック アレルギー アンド イムノロジー（Pediatric allergy and immunology）」（デンマーク）、1997年、第8巻、p.194−199）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）との相関が認められないことから（「ヨーロピアン ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション（European Journal of Clinical Investigation）」（英国）、1998年 第28巻、p.672−678）、敗血症の診断薬としてなり得なかった。
また、Landmannらが報告した上記約５５ｋＤａと４９ｋＤａの２種等の可溶型ＣＤ１４（高分子量ＣＤ１４（報告により、その分子量は異なるため、約５５ｋＤａ、４９ｋａに限定されるわけではない、以下同））とは別に、約３６ｋＤａの可溶型低分子量ＣＤ１４が血中に存在すること、該低分子量ＣＤ１４は、正常人では少なく、敗血症患者において増加することを見出し、可溶型低分子量ＣＤ１４の測定が臨床上有用であることが確認された。該可溶型低分子量ＣＤ１４の測定法として、血中可溶型ＣＤ１４総量から、血中高分子量ＣＤ１４量を差し引いて、血中低分子量ＣＤ１４量を間接的に求めることが提案されている（国際公開第ＷＯ０１／２２０８５号）。
かかる状況下において、簡便に検出可能な敗血症の診断マーカーとなり得る、生体内の新規な抗原が望まれている。また特定の抗体を用いた該抗原の測定キット及びその測定方法が望まれている。さらに該抗原の測定に有用な抗体をスクリーニングする方法が望まれている。さらにまた、該抗原と免疫的な機能が類似する組換え型可溶性フラグメント及びそのフラグメントの生産方法が望まれている。
発明者等は鋭意研究の結果、ヒト血中に存在するＣＤ１４の配列を有する新規な抗原を発明した。さらに該抗原を測定することによる、敗血症を診断方法若しくは敗血症を検出する方法を発明した。
また、該抗原と免疫学的に類似した性質を有する組換え型可溶性フラグメント及びそのフラグメントの生産方法を発明し、さらに該フラグメントに特異的に結合する抗体を発明した。
また、「ヒト全長可溶型ＣＤ１４の特定のアミノ酸配列からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは該抗体の断片、「ヒト全長可溶型ＣＤ１４の特定のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として作製される抗体」若しくは該抗体の断片、または「該フラグメントに特異的に結合する抗体」若しくは該抗体の断片を構成要素として含む、該抗原を測定することができるキット及び測定方法を発明した。
さらに、該抗原の測定に有用な抗体をスクリーニングする方法を発明した。
なお、本明細書において、「可溶性ＣＤ１４抗原」は「可溶性ＣＤ１４蛋白質」ということができる。また、「組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント」は「組換え型可溶性ＣＤ１４蛋白質」ということができるが、ヒト全長可溶型ＣＤ１４の部分配列を有するという意味で、「フラグメント」という語を使用している。「フラグメント」は、一般的な技術用語として解釈できる。本発明においても、対象となる蛋白質のアミノ酸配列の部分配列からなる蛋白質の一部であり、その蛋白質の立体構造や、糖鎖もしくは脂質等の付加について、対象となる蛋白質との違いは特に問うものではない。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１３）を提供する。
（１）下記１）〜３）の性質を有する可溶性ＣＤ１４抗原、
１）非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、分子量１３±２ｋＤａ、
２）Ｎ末端配列に配列番号１のアミノ酸配列を有する、及び
３）配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製した抗体に特異的に結合する。
（２）下記<1>〜<3>の工程により得られる下記１）〜３）の性質を有する組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント、
<1>所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列が置換若しくは挿入されている配列番号３に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメント若しくは該部分配列を有するフラグメントの配列番号３の５３位〜６８位以外の領域に１〜１０個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントを作製する工程、
<2><1>で作製した組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを該所定の蛋白分解酵素により切断する工程、及び
<3><2>で切断したフラグメントのＮ末側のフラグメントを回収する工程、
１）非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、分子量１３±２ｋＤａ、
２）３Ｃ１０及びＭＥＭ−１８とは特異的な結合はしない、及び
３）配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製した抗体に特異的に結合する。
（３）下記１）〜３）の性質を有する組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント、
１）非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、分子量１３±２ｋＤａ、
２）３Ｃ１０及びＭＥＭ−１８とは特異的な結合はしない、及び
３）配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製した抗体に特異的に結合する。
（４）上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原を測定することを特徴とする敗血症の診断若しくは検出方法。
（５）少なくとも一つの上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片を含む、検体に含まれる上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原を測定するための可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（６）少なくとも一つの上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片を、上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合させることを特徴とする、上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原の免疫学的な測定方法。
（７）上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合する抗体。
（８）上記（２）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントに特異的に結合する抗体。
（９）上記（３）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントに特異的に結合する抗体。
（１０）下記の工程を含む、上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原の測定に有用な抗体のスクリーニング方法、
１）配列番号３に記載のアミノ酸配列から選択される連続した６〜２０アミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体をスクリーニング対象検体として用意する工程、
２）ＣＤ１４を含む測定対象液を用意する工程、
３）１）で用意した抗体若しくは、２）で用意した測定対象液を用いて、免疫測定系を構成する工程、
４）３）で構成した免疫測定系により、測定対象液を測定する工程、及び
５）４）で得た測定結果により、上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原の測定に有用な抗体を評価し、選択する工程。
（１１）下記の工程を含む、上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原の測定に有用な抗体のスクリーニング方法、
１）抗体をスクリーニング対象検体として用意する工程、
２）上記（２）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを用意する工程、
３）１）で用意した抗体を２）で用意したフラグメントと反応させ、１）で用意した抗体と２）で用意したフラグメントの特異的な結合を評価する工程、及び、
４）３）において、２）で用意したフラグメントに特異的に結合した抗体を、上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原の測定に有用な抗体として、選択する工程。
（１２）下記の工程を含む、上記（２）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントの生産方法、
<1>下記の１）〜４）の配列を有する組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを作製する工程、
１）配列番号３に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである、または該部分配列を有するフラグメントの配列番号３の５３位〜６８位以外の領域に１〜１０個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントである、
２）Ｎ末端が配列番号３の１位〜１７位のいずれかである、
３）Ｃ末端が配列番号３の１３４位〜３５６位のいずれかである、
４）所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列が、配列番号３の５９位〜７０位の後ろに置換若しくは挿入付加されている。
<2><1>で作製した組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを該所定の蛋白分解酵素により切断する工程、及び
<3><2>で切断したフラグメントのＮ末側のフラグメントを回収する工程。
以下に、本発明の上記の（１）〜（１３）を詳細に記載する。
すなわち、本発明は、以下の新規な可溶性ＣＤ１４抗原、組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント及び新規敗血症の診断方法若しくは検出方法を提供する。
（１）下記（１−１）または（１−２）に示す新規可溶性ＣＤ１４抗原。
（１−１）下記１）〜３）の性質を有する可溶性ＣＤ１４抗原、
１）非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、分子量１３±２ｋＤａ、
２）Ｎ末端配列に配列番号１のアミノ酸配列を有する、及び
３）配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製した抗体に特異的に結合する。
（１−２） ４）ヒト血漿中より得られうる（１−１）の可溶性ＣＤ１４抗原。
（２）下記（２−１）〜（２−１８）のいずれかに示す組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント。
（２−１）下記<1>〜<3>の工程により得られる下記１）〜３）の性質を有する組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント、
<1>所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列が置換若しくは挿入されている配列番号３に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメント若しくは該部分配列を有するフラグメントの配列番号３の５３位〜６８位以外の領域に１〜１０個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントを作製する工程、
<2><1>で作製した組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを該所定の蛋白分解酵素により切断する工程、及び
<3><2>で切断したフラグメントのＮ末側のフラグメントを回収する工程、
１）非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、分子量１３±２ｋＤａ、
２）３Ｃ１０及びＭＥＭ−１８とは特異的な結合はしない、及び
３）配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製した抗体に特異的に結合する。
（２−２）前記（２−１）、<1>の工程において、下記の４）〜７）の配列を有する組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを作製する、
４）配列番号３に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである、または該部分配列を有するフラグメントの配列番号３の５３位〜６８位以外の領域に１〜１０個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントである、
５）Ｎ末端が配列番号３の１位〜１７位のいずれかである
６）Ｃ末端が配列番号３の１３４位〜３５６位のいずれかである、及び
７）所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列が、配列番号３の５９位〜９０位のいずれかの位置の後ろに置換若しくは挿入されている、
（２−１）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント。
（２−３）<1>の工程の７）において所定の蛋白分解酵素がＰｒｏＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅであり、切断部位の配列がＬｅｕ，Ｇｌｕ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｐｈｅ，Ｇｌｎ，Ｇｌｙ，Ｐｒｏである（２−２）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント。
（２−４）<1>の工程の７）において所定の蛋白分解酵素がＴｈｒｏｍｂｉｎであり、切断部位の配列がＬｅｕ，Ｖａｌ，Ｐｒｏ，Ａｒｇ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒである（２−２）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント。
（２−５）<1>の工程の５）においてＮ末端が配列番号３の１位〜６位のいずれかである（２−２）〜（２−４）のいずれかの組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント。
（２−６）<1>の工程の５）においてＮ末端が配列番号３の１位である（２−２）〜（２−４）のいずれかの組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント。
（２−７）<1>の工程の７）において所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列が、配列番号３の５９位〜８０位のいずれかの位置の後ろに置換若しくは挿入されている（２−２）〜（２−６）のいずれかの組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント。
（２−８）<1>の工程の７）において所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列が、配列番号３の６４位〜７５位のいずれかの位置の後ろに置換若しくは挿入されている（２−２）〜（２−６）のいずれかの組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント。
（２−９）<1>の工程の７）において所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列が、配列番号３の６４位の後ろに置換若しくは挿入されている（２−２）〜（２−６）のいずれかの組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント。
（２−１０）<1>の工程の５）においてＮ末端が配列番号３の１位であり、７）において所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列が、配列番号３の６４位の後ろに置換若しくは挿入されている（２−２）〜（２−４）のいずれかの組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント。
（２−１１）下記の８）〜１０）の配列を有する（２−１）若しくは（２−１０）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント、
８）配列番号３に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである、若しくは該部分配列を有するフラグメントの配列番号３の５３位〜６８位以外の領域に１〜１０個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントである、
９）Ｎ末端が配列番号３の１位〜１７位のいずれかである、及び、
１０）Ｃ末端が配列番号３の５９位〜９０位のいずれかである。
（２−１２）９）においてＮ末端が配列番号３の１位〜６位のいずれかである（２−１１）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント。
（２−１３）９）においてＮ末端が配列番号３の１位である（２−１１）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント。
（２−１４）１０）においてＣ末端が配列番号３の５９位〜８０位のいずれかである（２−１１）〜（２−１３）のいずれかの組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント。
（２−１５）１０）においてＣ末端が配列番号３の６４位〜７５位のいずれかである（２−１１）〜（２−１３）のいずれかの組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント。
（２−１６）１０）においてＣ末端が配列番号３の６４位である（２−１１）〜（２−１３）のいずれかの組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント。
（２−１７）９）においてＮ末端が配列番号３の１位であり、１０）においてＣ末端が配列番号３の６４位である（２−１１）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント。
（２−１８）さらに下記１１）の性質を有する（２−１）〜（２−１８）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント、
１１）ＬＰＳに結合しない。
（３）下記（３−１）〜（３−９）のいずれかに示す組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント。
（３−１）下記１）〜３）の性質を有する組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント、
１）非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、分子量１３±２ｋＤａ、
２）３Ｃ１０及びＭＥＭ−１８とは特異的な結合はしない、及び
３）配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製した抗体に特異的に結合する。
（３−２）さらに下記４）の性質を有する（３−１）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント、
４）ＬＰＳに結合しない、
（３−３）下記の５）〜７）の配列を有する（３−１）若しくは（３−２）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント、
５）配列番号３に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである、若しくは該部分配列を有するフラグメントの配列番号３の５３位〜６８位以外の領域に１〜１０個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントである、
６）Ｎ末端が配列番号３の１位〜１７位のいずれかである、及び、
７）Ｃ末端が配列番号３の５９位〜９０位のいずれかである。
（３−４）６）においてＮ末端が配列番号３の１位〜６位のいずれかである（３−３）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント。
（３−５）６）においてＮ末端が配列番号３の１位である（３−３）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント。
（３−６）７）においてＣ末端が配列番号３の５９位〜８０位のいずれかである（３−３）〜（３−５）のいずれかの組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント。
（３−７）７）においてＣ末端が配列番号３の６４位〜７５位のいずれかである（３−３）〜（３−５）のいずれかの組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント。
（３−８）６）においてＮ末端が配列番号３の１位であり、７）においてＣ末端が配列番号３の６４位〜７５位のいずれかである（３−３）〜（３−５）のいずれかの組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント。
（３−９）配列番号３に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである（３−３）〜（３−８）のいずれかの組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント。
（４）下記（４−１）〜（４−４）のいずれかに示す敗血症の診断方法。
（４−１）上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原を測定することを特徴とする敗血症の診断若しくは検出方法。
（４−２）下記の工程を含むことを特徴とする（２−１）の敗血症の診断若しくは検出方法。
１）被験者から採取した血液中に含まれる上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原を測定する、
２）測定した値を正常人の標準値と比較する、及び
３）被験者が、敗血症であるかどうかを評価する。
（４−３）上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原を測定する工程が、免疫学的に測定することを特徴とする（２−２）の敗血症の診断若しくは検出方法。
（４−４）上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原を測定する工程が、サンドイッチ免疫測定法により測定することを特徴とする（２−２）の敗血症の診断若しくは検出方法。
また、以下の新規な可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット及び測定方法を提供する。
（５）下記（５−１）〜（５−８）のいずれかに示す上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−１）少なくとも一つの上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片を含む、検体に含まれる上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原を測定するための可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−２）上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片として、以下のａ）〜ｄ）のいずれかの抗体または該抗体の断片を含むことを特徴とする（５−１）の可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット、
ａ）配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列から選択される連続した８〜１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体、
ｃ）配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体、
ｄ）上記（２）若しくは（３）に記載の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントと特異的に結合する抗体。
（５−３）上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片として、ｄ）上記（２）若しくは（３）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントと特異的に結合する抗体または該抗体の断片である（５−１）若しくは（５−２）の可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−４）上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片として、上記（２）若しくは（３）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製した抗体若しくは該抗体の断片である（５−１）〜（５−３）のいずれかの可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−５）上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片として、上記（２）若しくは（３）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体若しくは該抗体の断片である（５−１）〜（５−４）のいずれかの可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−６）下記（５−６−１）〜（５−６−１９）のいずれかに示す、サンドイッチ免疫測定法により上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原を測定する、（５−１）〜（５−４）の可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−６−１）サンドイッチ免疫測定法により上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原を測定する、（５−１）〜（５−４）のいずれかの可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−６−２）上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合する第二の結合物質をさらに含む（５−６−１）の可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−６−３）上記第二の結合物質が、上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片である（５−６−２）の可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−６−４）上記第二の結合物質が、上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体である（５−６−２）の可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−６−５）上記第二の結合物質が、配列番号３に記載のヒト全長可溶型ＣＤ１４蛋白質の１位〜５２位のアミノ酸残基のいずれかの領域に特異的に結合する抗体または該抗体の断片、あるいは配列番号３に記載のヒト全長可溶型ＣＤ１４蛋白質の１位〜５２位のアミノ酸残基のいずれかの領域に特異的に結合する抗体と競合する若しくは交差反応性を示す抗体、または該抗体の断片である（５−６−２）の可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−６−６）配列番号３に記載のヒト全長可溶型ＣＤ１４蛋白質の１７位〜２６位のアミノ酸残基のいずれかの領域に特異的に結合する抗体または該抗体の断片、あるいは配列番号３に記載のヒト全長可溶型ＣＤ１４蛋白質の１７位〜２６位のアミノ酸残基のいずれかの領域に特異的に結合する抗体と競合する若しくは交差反応性を示す抗体、または該抗体の断片である（５−６−２）の可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−６−７）上記ａ）〜ｄ）のいずれかの抗体または該抗体の断片が不溶性担体に結合している（５−６−１）〜（５−６−６）のいずれかの可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−６−８）上記第二の結合物質が不溶性担体に結合している（５−６−２）〜（５−６−６）のいずれかの可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−６−９）上記ａ）〜ｄ）のいずれかの抗体または該抗体の断片が標識されている（５−６−１）〜（５−６−６）若しくは（５−６−８）のいずれかの可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−６−１０）上記第二の結合物質が標識されている（５−６−１）〜（５−６−７）のいずれかの可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−６−１１）さらに第二の特異結合を形成する第二の特異結合物質を含む（５−６−２）〜（５−６−１０）のいずれかの可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−６−１２）第二の特異結合物質に結合するパートナーが、上記ａ）〜ｃ）のいずれかの抗体若しくは該抗体の断片、または上記第二の結合物質である（５−６−１１）の可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−６−１３）さらに第二の特異結合物質に結合する第二の特異結合物質のパートナーを含む（５−６−１１）の可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−６−１４）第二の特異結合を形成する第二の特異結合物質若しくは第二の特異結合物質のパートナーが不溶性担体に結合している（５−６−１１）〜（５−６−１３）のいずれかの可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−６−１５）第二の特異結合を形成する第二の特異結合物質若しくは第二の特異結合物質のパートナーが標識されている（５−６−１１）〜（５−６−１３）のいずれかの可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−６−１６）競合法によるサンドイッチ免疫測定法により測定する、標識した上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原若しくは標識した上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原の類似物質を含む（５−６−１）〜（５−６−８）若しくは（５−６−１１）〜（５−６−１４）のいずれかの可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−６−１７）標識が、酵素、色素、金コロイド、着色ラテックス、化学発光物質、蛍光物質またはアイソトープの少なくとも一つによる標識である（５−６−９）、（５−６−１０）、（５−６−１５）若しくは（５−６−１６）のいずれかの可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−６−１８）標識した上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原の類似物質が、標識した上記（２）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントである（５−６−１６）の可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−６−１９）上記ａ）〜ｃ）のいずれかの抗体または該抗体の断片が不溶性担体に結合しており、上記第二の結合物質が、上記ｄ）の抗体または該抗体の断片である（５−６−２）の可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−７）凝集法、直接固相法若しくは競合法により測定する、（５−１）〜（５−６）のいずれかの可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（５−８）上記（２）若しくは（３）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを標準物質としてさらに含む（５−１）〜（５−７）の可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット。
（６）下記（６−１）〜（６−３）のいずれかに示す上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原の測定方法。
（６−１）少なくとも一つの上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片を、上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合させることを特徴とする、上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原の免疫学的な測定方法。
（６−２）上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片として、以下のａ）〜ｄ）のいずれかの抗体または該抗体の断片を用いることを特徴とする（６−１）の可溶性ＣＤ１４抗原の免疫学的な測定方法、
ａ）配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列から選択される連続した８〜１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体、
ｃ）配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体。
ｄ）上記（２）若しくは（３）に記載の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントと特異的に結合する抗体。
（６−３）上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原に結合する第二の結合物質を用いて、上記ａ）〜ｃ）のいずれかの抗体若しくは該抗体の断片と該第二の結合物質とのサンドイッチ免疫測定法により、上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原を測定することを特徴とする、（６−２）の可溶性ＣＤ１４抗原の免疫学的な測定方法。
さらに以下の新規な抗体及び上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原の測定に有用な抗体のスクリーニング方法を提供する。
（７）下記（７−１）〜（７〜４）のいずれかに示す、上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合する抗体。
（７−１）上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合する抗体。
（７−２）ヒト血中の全長可溶型ＣＤ１４蛋白質に実質的に結合せず、上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合する（７−１）の抗体。
（７−３）上記（２）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製されたことを特徴とする（７−１）若しくは（７−２）の抗体。
（７−４）モノクローナル抗体である（７−１）〜（７−３）のいずれかの抗体。
（８）下記（８−１）〜（８−５）のいずれかに示す、上記（２）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントに特異的に結合する抗体。
（８−１）上記（２）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントに特異的に結合する抗体。
（８−２）ヒト血中の全長可溶型ＣＤ１４蛋白質に実質的に結合せず、上記（２）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントに対して結合する（８−１）の抗体。
（８−３）上記（２）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製されたことを特徴とする（８−１）若しくは（８−２）の抗体。
（８−４）モノクローナル抗体である（８−１）〜（８−３）のいずれかの抗体。
（８−５）Ｆ１２３７−３−４抗体である（８−４）の抗体。
（９）下記（９−１）〜（９−４）のいずれかに示す、上記（３）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントに特異的に結合する抗体。
（９−１）上記（３）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントに特異的に結合する抗体。
（９−２）ヒト血中の全長可溶型ＣＤ１４蛋白質に実質的に結合せず、上記（３）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントに対して結合する（９−１）の抗体。
（９−３）上記（３）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製されたことを特徴とする（９−１）若しくは（９−２）の抗体。
（９−４）モノクローナル抗体である（９−１）〜（９−３）のいずれかの抗体。
（１０）下記（１０−１）〜（１０−１３）のいずれかに示す、上記(１)の可溶性ＣＤ１４抗原の測定に有用な抗体のスクリーニング方法。
（１０−１）下記の工程を含む、上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原の測定に有用な抗体のスクリーニング方法、
１）配列番号３に記載のアミノ酸配列から選択される連続した６〜２０アミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体をスクリーニング対象検体として用意する工程、
２）ＣＤ１４を含む測定対象液を用意する工程、
３）１）で用意した抗体若しくは、２）で用意した測定対象液を用いて、免疫測定系を構成する工程、
４）３）で構成した免疫測定系により、測定対象液を測定する工程、及び
５）４）で得た測定結果により、上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原の測定に有用な抗体を評価し、選択する工程。
（１０−２）上記１）の工程で用意する抗体が、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうちＮ末端が１位から３１４位までのアミノ酸配列から選択される連続した６〜２０アミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体であることを特徴とする（１０−１）のスクリーニング方法。
（１０−３）上記１）の工程で用意する抗体が、配列番号３に記載のアミノ酸配列から選択される連続した８〜３０アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体であることを特徴とする（１０−１）のスクリーニング方法。
（１０−４）上記１）の工程で用意する抗体が、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうちＮ末端が１位から３１４位までのアミノ酸配列から選択される連続した８〜３０アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体であることを特徴とする（１０−２）のスクリーニング方法。
（１０−５）上記２）の工程で用意する測定対象液が、正常人の体液若しくはヒト高分子量ＣＤ１４の標品であることを特徴とする（１０−１）のスクリーニング方法。
（１０−６）上記３）の工程で構成する免疫測定系が、抗原固相化法であることを特徴とする（１０−１）〜（１０−５）のいずれかのスクリーニング方法。
（１０−７）１）で用意した抗体に対する標識抗体をさらに用意し、上記３）の工程で構成する抗原固相化法は、２）で測定対象液を不溶性担体に結合させて構成し、４）の工程は、３）で構成した抗原固相化法による測定系に１）で用意した抗体と該標識抗体を順に反応させることを特徴とする（１０−６）のスクリーニング方法。
（１０−８）上記５）の評価し、選択する工程が、１）で用意した抗体が高分子量ＣＤ１４と特異的には結合しないことを評価して、選択することを特徴とする（１０−６）若しくは（１０−７）のスクリーニング方法。
（１０−９）さらに下記の工程を含む、以下の特徴を有する（１０−１）〜（１０−４）のいずれかのスクリーニング方法、
１）−（２）もう一つの配列番号３に記載のアミノ酸配列から選択される連続した６〜２０アミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体若しくは抗ＣＤ１４抗体を用意する工程、
上記２）の工程で用意する測定対象液が、正常人の体液と敗血症患者の体液である、
上記３）の工程で構成する免疫測定系が、１）と１）−（２）で用意した２つの抗体を用いた、サンドイッチ測定法である、
上記５）の抗体を評価し、選択する工程が、正常人の体液の測定結果と、敗血症患者の体液の測定結果を比較し、比較した測定結果の違いにより敗血症の診断に有用なサンドイッチ免疫測定法に用いるための抗体を評価して、選択する工程である。
（１０−１０）本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原の測定に有用なサンドイッチ免疫測定法に用いるための抗体の組み合わせをスクリーニングする方法であることを特徴とする（１０−９）のスクリーニング方法。
（１０−１１）上記２）の工程で用意する正常人及び敗血症患者の体液が、血液サンプルであることを特徴とする（１０−９）若しくは（１０−１０）のスクリーニング方法。
（１０−１２）上記３）の工程で構成するサンドイッチ免疫系において、１）若しくは１）−（２）で用意した抗体を、不溶性担体に結合させて、構成することを特徴とする（１０−９）若しくは（１０−１０）のスクリーニング方法。
（１０−１３）上記３）の工程で構成するサンドイッチ免疫系において、１）若しくは１）−（２）で用意した抗体を、標識させて、構成することを特徴とする（１０−９）若しくは（１０−１０）のスクリーニング方法。
（１１）下記（１１−１）〜（１１−５）のいずれかに示す、上記(１)の可溶性ＣＤ１４抗原の測定に有用な抗体のスクリーニング方法。
（１１−１）下記の工程を含む、上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原の測定に有用な抗体のスクリーニング方法、
１）抗体をスクリーニング対象検体として用意する工程、
２）上記（２）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを用意する工程、
３）１）で用意した抗体を２）で用意したフラグメントと反応させ、１）で用意した抗体と２）で用意したフラグメントの特異的な結合を評価する工程、及び、
４）３）において、２）で用意したフラグメントに特異的に結合した抗体を、上記（１）の可溶性ＣＤ１４抗原の測定に有用な抗体として、選択する工程。
（１１−２）１）の工程で、用意する抗体が、配列番号３に記載のアミノ酸配列から選択される連続した６〜３５６のいずれかの個数のアミノ酸残基からなる蛋白質と特異的に結合する抗体であることを特徴とする（１１−１）のスクリーニング方法。
（１１−３）１）の工程で、用意する抗体が、配列番号３に記載の５３位〜６８位から選択される連続した少なくとも７個のアミノ酸残基を含む蛋白質と特異的に結合する抗体であることを特徴とする（１１−１）のスクリーニング方法。
（１１−４）３）の工程で反応させ、特異的な結合を評価する系が、抗原固相化法であることを特徴とする（１１−１）〜（１１−３）のいずれかのスクリーニング方法。
（１１−５）３）の工程で反応させ、特異的な結合を評価する系が、サンドイッチ免疫測定法であることを特徴とする（１１−１）〜（１１−３）のいずれかのスクリーニング方法。
（１１−６）３）の工程で反応させ、特異的な結合を評価する系が、生体分子間相互作用解析法であることを特徴とする（１１−１）〜（１１−３）のいずれかのスクリーニング方法。
さらにまた、以下の特定の上記（２）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントの生産方法を提供する。
（１２）下記（１２−１）〜（１２−３）のいずれかに示す、上記（２）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントの生産方法。
（１２−１）下記の工程を含む、上記（２−３）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントの生産方法、
<1>下記の１）〜４）の配列を有する組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを作製する工程、
１）配列番号３に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである、または該部分配列を有するフラグメントの配列番号３の５３位〜６８位以外の領域に１〜１０個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントである、
２）Ｎ末端が配列番号３の１位〜１７位のいずれかである、
３）Ｃ末端が配列番号３の１３４位〜３５６位のいずれかである、
４）所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列が、配列番号３の５９位〜７０位の後ろに置換若しくは挿入されている。
<2><1>で作製した組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを該所定の蛋白分解酵素により切断する工程、及び
<3><2>で切断したフラグメントのＮ末側のフラグメントを回収する工程。
（１２−２）<1>の工程の４）において所定の蛋白分解酵素がＰｒｏＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅであり、切断部位の配列がＬｅｕ，Ｇｌｕ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｐｈｅ，Ｇｌｎ，Ｇｌｙ，Ｐｒｏである（１２−１）の上記（２−３）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントの生産方法。
（１２−３）<1>の工程の４）において所定の蛋白分解酵素がＴｈｒｏｍｂｉｎであり、切断部位の配列がＬｅｕ，Ｖａｌ，Ｐｒｏ，Ａｒｇ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒである（１２−１）の上記（２−３）の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントの生産方法。
本発明の新規可溶性ＣＤ１４抗原は、敗血症患者の診断のマーカーとして有用である。また、該可溶性ＣＤ１４抗原は、該可溶性ＣＤ１４抗原の測定に用いる標準物質若しくは競合物質となり得る。
また、本発明の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、該可溶性ＣＤ１４抗原と免疫学的に類似した性質を有するため、該可溶性ＣＤ１４抗原の測定に用いる標準物質若しくは競合物質となり得、さらに該可溶性ＣＤ１４抗原の測定に用いることができる抗体のスクリーニングに用いることができる。
該可溶性ＣＤ１４抗原と免疫学的に類似した性質とは、公知のＣＤ１４抗体との結合性及び該可溶性ＣＤ１４抗原と結合する抗体との結合性が、本発明の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、該可溶性ＣＤ１４抗原と本発明の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントとほぼ一致していることを示す。
また、本発明の該可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット及び測定方法は、該可溶性ＣＤ１４抗原を高感度、簡便かつ特異的に定性又は定量でき、敗血症患者の診断に有用である。
さらに、本発明のスクリーニング方法は、該新規可溶性ＣＤ１４抗原の測定に用いるための抗体の探索に有用である。
さらにまた、本発明の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントの生産方法は、今まで原核細胞や真核細胞、特に酵母細胞において発現することができなかった組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントの生産を可能する。
図１は、Ｓ６８ペプチドポリクローナル抗体と本発明の可溶性ＣＤ１４抗原の結合をＳ６８ペプチドのみが阻止する結果を示した図である。（Ａ）は、正常人血清中で結合していない状態を示し、（Ｂ）は、敗血症患者血清中でのＳ６８ペプチドの結合阻害を示す。 図２は、ｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ蛋白質を用いた実施例７−（１）のＥＩＡキットの標準曲線を示した図である。 図３は、ｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ蛋白質を用いて実施例７−（１）のＥＩＡキットの測定値に正常人血清由来可溶性ＣＤ１４抗原が影響しないことを示した図である。 図４は、ゲル濾過クロマトグラフィーにより敗血症患者血中の実施例７−（１）のＥＩＡキットで検出される可溶性ＣＤ１４抗原及び高分子量ＣＤ１４蛋白質をそれぞれ実施例７−（１）のＥＩＡキット及び市販ＣＤ１４−ＥＩＡキット（ＩＢＬ-Hamburg）により解析した結果を示した図である。 図５は、ゲル濾過クロマトグラフィーにより敗血症患者血清中の実施例７−（１）のＥＩＡキットで検出される可溶性ＣＤ１４抗原及び高分子量ＣＤ１４蛋白質をそれぞれ実施例７−（１）のＥＩＡキット及び市販ＣＤ１４−ＥＩＡキット（ＩＢＬ-Hamburg）により解析した結果を示した図である。上方の黒矢印は、キャリブレーションに用いたマーカーの位置を示す。左からＢＳＡ、オブアルブミン、キモトリプシノーゲンＡ、リボヌクレアーゼＡである。 図６は、敗血症患者血清をＦ１０２４−１−３−ＳｅｐｈａｒｏｓＴＭ４ＢをプレカラムとしたＳ６８−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ４ＦＦ抗体カラムに通した後の画分をゲル濾過クロマトグラフィーにて分画した画分を、実施例７−（１）のＥＩＡキットで検出される可溶性ＣＤ１４抗原及び高分子量ＣＤ１４蛋白質をそれぞれ実施例７−（１）のＥＩＡキット及び市販ＣＤ１４−ＥＩＡキット（ＩＢＬ-Hamburg）により解析した結果を示した図である。上方の黒矢印は、図５と同様である。 図７は、図６に記載したゲル濾過クロマトグラフィー分画フラクション１０−１６を個別に凍結乾燥に供し、ウェスタンブロッティングに供した結果を示した図である。 図８は、正常ヒト血清をＦ１０２４−１−３−ＳｅｐｈａｒｏｓＴＭ４ＢをプレカラムとしたＳ６８−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ４ＦＦ抗体カラムに通した後の画分をゲル濾過クロマトグラフィーにて分画したフラクション１０−１６を個別に凍結乾燥に供し、ウェスタンブロッティングに供した結果を示した図である。 図９は、精製したｒｓＣＤ１４−ＳＴ（２ＳＴ６４）及び（ＰＳＰ６４）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動後、銀染色法により染色した像を示した図である。 図１０は、ｓＣＤ１４−ＳＴ及びＰＳＰ６４をＳ６８抗体で染色したウエスタンブロティング像を示した図である。 図１１は、ｒｓＣＤ１４―ＳＴ（２ＳＴ６４）を用いた実施例１６のＥＩＡキットの標準曲線を示した図である。 図１２は、ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（ＰＳＰ６４）を投与したウサギの抗血清の抗体価を正常ウサギ血清と比較した図である。 図１３は、ｒｓＣＤ１４―ＳＴ（２ＳＴ６４）を用いた実施例１９のＥＩＡ測定系の標準曲線を示した図である。
以下に、より詳細に本発明を説明する。
ヒト血中に存在する主要な可溶型ＣＤ１４蛋白質には、先行技術の欄に記載したLandmannらの報告に記載される約５５ｋＤａ及び約４９ｋＤａの可溶型ＣＤ１４蛋白質がある。これらは、ヒト全長可溶型ＣＤ１４蛋白質及びヒト全長可溶型ＣＤ１４蛋白質からＣ末端が４１アミノ酸以下しか欠失していない蛋白質（以降、「ヒト」を省略し、高分子量ＣＤ１４と記載することがある）である。ＷＯ０１／２２０８５号公報では、これらの高分子量ＣＤ１４は、Ｆ１０２５−３−１抗体と特異的に結合することが確認されている。
また、上記の高分子量ＣＤ１４の他に、低分子量のＣＤ１４として分子量３６ｋＤａの蛋白質の記載もある。
本発明者らは、上記の高分子量ＣＤ１４及びＷＯ０１／２２０８５号に記載されている分子量３６ｋＤａのＣＤ１４とは異なる、正常人と比較して敗血症患者の血中に多く存在する新規可溶型ＣＤ１４蛋白質を見出した。
なお、本明細書に記載する「可溶型ＣＤ１４蛋白質」とは、ヒト血漿中（若しくはヒト血清中）に存在している蛋白質のことであり、「可溶性ＣＤ１４蛋白質」ともいうことができる。特に、細胞膜に結合しヒト血漿中には存在しない「膜結合型ＣＤ１４蛋白質」と対比する意味で用いる場合、「可溶型ＣＤ１４蛋白質」と記載している。
本発明で記載する「ペプチド若しくはフラグメント等を「抗原として作製される抗体」」若しくは「「ペプチド若しくはフラグメント等を抗原として作製した抗体」」とは、「抗原」とするペプチド若しくはフラグメントを各種動物に免疫して、作製される若しくは作製した抗体である。該抗体は「抗原」とするペプチド若しくはフラグメントをエピトープ若しくはエピトープの一部分とする。また、該抗体は「抗原」とするペプチド若しくはフラグメントに特異的に結合する。
「抗原として作製される抗体」若しくは「抗原として作製した抗体」には、「抗原」とするペプチドに免疫原性を有させるためにキャリア若しくはキャリア蛋白を付加させたり、他のアミノ酸残基を付加させたりしたペプチドを免疫原として作製した抗体であっても、上記の性質を示せば「抗原として作製される抗体」若しくは「抗原として作製した抗体」に含まれる。
また、「特異的に結合する抗体」とは、特異的に結合する対象と免疫学的に結合する抗体、若しくは特異的に結合する対象と通常の抗原抗体反応を示す抗体である。例えば、抗原抗体反応を示すことは、凝集法、サンドイッチ法、固相直接法または固相結合法、競合法等で確認できる。また、「特異的に結合する抗体」と特異的に結合する対象との結合を親和性として表した場合、通常、解離定数（ＫＤ）は、１０−７Ｍ未満である。結合試験上、解離定数測定が得られない場合に実質的に結合しないと記載する。また、「特異的に結合する」場合と比べて、その結合能が１０倍以下、好ましくは１００倍以下、より好ましくは１，０００倍以下である場合等の非特異的結合しか確認できない場合にも実質的に結合しないと記載する。
「ＬＰＳと結合しない」とは、該組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントとＬＰＳとの結合能がない、若しくはほとんどないことである。生体内全長ＣＤ１４若しくは配列番号３に記載のヒト全長可溶型ＣＤ１４蛋白質は、生体内若しくは血清中ではＬＰＳとの結合能を有し、その複合体は細胞を活性化する。「ＬＰＳと結合しない」該組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、生体内全長ＣＤ１４若しくは配列番号３に記載のヒト全長可溶型ＣＤ１４蛋白質とＬＰＳとの結合能よりも多くとも１／１００以下であることである。
本発明の第一の態様は、下記１）〜３）の性質を有する可溶性ＣＤ１４抗原である。
１）非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、分子量１３±２ｋＤａ、
２）Ｎ末端配列に配列番号１のアミノ酸配列を有する、及び
３）配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製した抗体に特異的に結合する。
本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原は、上記１）の性質を有する。すなわち、非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分子量１３±２ｋＤａの位置に本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原由来のバンドが検出される。
特に非還元条件下の１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｐｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎＴＭ ｄｕａｌ ｃｏｌｏｒ ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて分子量を算出すると、分子量１３±２ｋＤａの位置にバンドが検出される。
本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原は、上記２）の性質を有する。配列番号１に記載ののアミノ酸配列は、配列番号３に記載のヒトＣＤ１４のＮ末端のアミノ酸配列と一致する。このことから、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原は、ヒトＣＤ１４の一種であることが確認される。
本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原は、上記３）の性質を有する。上記３）の特徴に記載される配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドは、配列番号３に記載のヒトＣＤ１４の５３位から６８位までの１６アミノ酸残基に該当する。現在ヒト蛋白質において配列番号２の配列を含む他の蛋白質はヒトＣＤ１４以外には知られておらず、該配列はヒトＣＤ１４に特異的に含まれる配列であるといえる。このことからも、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原は、ヒトＣＤ１４の一種であることが確認される。
また、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原は、下記４）の性質によりさらに特徴付けられることが好ましい。
４）ヒト血漿中より得られうる（１−１）の可溶性ＣＤ１４抗原。
上記４）の性質により特徴付けられる本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原は、ヒト血漿中に存在する蛋白質である。後述する精製方法により、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原は高純度で得られる。また、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原は、敗血症患者では高濃度となっている。このことにより、敗血症の診断若しくは検出方法のマーカーとなり得る。
また、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原は、敗血症の診断若しくは検出に有用な本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を測定するためのキットに用いる標準物質若しくは競合物質となり得る。
本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を精製する方法について記載する。
本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原は、ヒト血漿若しくはヒト血清から、ヒトＣＤ１４関連の抗体アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの組み合わせにより、精製することができる。後述する本発明の第五の態様の、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原の測定キットを用いることにより、カラムクロマトグラフィーの溶出画分の本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原の検出が、効率よくできる。
ヒトＣＤ１４関連の抗体とは、抗ヒトＣＤ１４抗体、またはヒトＣＤ１４のアミノ酸配列に由来するペプチドに対する抗体である。例えば、抗ヒトＣＤ１４抗体としてＦ１０２５−３−１抗体若しくはＦ１０２４−１−３抗体のアフィニティークロマトグラフィーを用いることにより、高分子量ＣＤ１４と分離することができる。このとき高分子量ＣＤ１４は抗体に吸着し、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原は、初流に分画される。さらに、配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体のアフィニティークロマトグラフィーを用いることにより、血清中の他の蛋白と分離することができる。
本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原は、抗体に吸着され、溶媒を酸性にすることにより溶出される。なお、Ｆ１０２５−３−１抗体は及びＦ１０２４−１−３抗体を産生するハイブリドーマはそれぞれ、ＷＯ０１／２２０８５号及びＷＯ０１／７２９９３号に記載の通り、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７２９６及び受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７５１１として、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に国際寄託されている。
また、抗ヒトＣＤ１４ポリクローナル抗体のアフィニティークロマトグラフィーにより血清中の可溶性ＣＤ１４抗原と他の蛋白とを分離することができる。その後上記の抗ヒトＣＤ１４モノクローナル抗体のアフィニティークロマトグラフィーにより高分子量ＣＤ１４と分離することができる。
また、ヒト血清若しくは上記のアフィニティークロマトグラフィーにより部分精製した画分のゲルろ過クロマトグラフィーにより、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を、さらに精製ができる。このとき上記の通り、本発明の第五の態様の測定キットを用いて、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を検出される画分を収集してもよい。また分子量マーカーを用いることにより、分子量３５±１０ｋＤａの画分を収集してもよい。
また、上記の通り部分精製した画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、１３±２ｋＤａの位置を収集することにより、さらに精製できる。収集した画分は、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原が、メインの蛋白質として、純度高く精製されている。
さらに陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点電気泳動等により精製することにより、より高い純度を求めることができる。例えば、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原は、ｐＨ８．５における陰イオン交換カラムクロマトグラフィーでは０．３Ｍ付近のイオン強度に溶出される。
本発明の第二の態様は、下記１）〜３）の性質を有する組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントである。
１）非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、分子量１３±２ｋＤａ、
２）３Ｃ１０及びＭＥＭ−１８とは特異的な結合はしない、及び
３）配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製した抗体に特異的に結合する。
本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、下記の５）〜７）の配列を有する組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントが例示される。
５）配列番号３に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである、若しくは該部分配列を有するフラグメントの配列番号３の５３位〜６８位以外の領域に１〜１０個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントである。
６）Ｎ末端が配列番号３の１位〜１７位のいずれかである。
７）Ｃ末端が配列番号３の５９位〜９０位のいずれかである。
この例示した中でも、６）においてＮ末端が配列番号３の１位〜６位のいずれかである組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントが好ましく、Ｎ末端が配列番号３の１位である組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントがより好ましい。
また、７）においてＣ末端が配列番号３の５９位〜８０位のいずれかである組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントが好ましく、Ｃ末端が配列番号３の６４位〜７５位のいずれかである組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントがより好ましく、Ｃ末端が配列番号３の６４位である組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントがさらに好ましい。
特に、６）においてＮ末端が配列番号３の１位であり、７）においてＣ末端が配列番号３の６４位である（２−３）〜（２−５）のいずれかの組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントが好ましい。
また、５）において配列番号３に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントが好ましい。
本発明の第二の態様の組換え型可溶性フラグメントを遺伝子工学的に生産する方法を以下に説明するが、特に限定されず、常法を用いることができる。
一般に、アミノ酸をコードする遺伝子のＤＮＡのトリプレット（コドン）は、アミノ酸の種類によって１種類から６種類まで存在することが知られているので、本発明のフラグメントのアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡの塩基配列は１種類には限定されない。従って、本発明のフラグメントをコードする塩基配列を含有する遺伝子である限り、いかなる塩基配列からなるものであってもよい。該遺伝子はｃＤＮＡ、染色体ＤＮＡおよびそれらの組合せならびに適当にスプライシングされうるイントロンを含むｃＤＮＡであってもよく、遺伝子工学的な取扱いの容易さから、ｃＤＮＡであることが好ましい。
該遺伝子は、いかなる方法で得られたものであってもよい。例えば、化学合成されたものであってもよく、適当なＤＮＡライブラリーから得たものであっても、ＣＤ１４の全長または部分をコードする遺伝子のＤＮＡを含むＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法で得たものであってもよい。また、これらの方法で得た遺伝子またはその断片を必要に応じてアニーリング、ライゲーションして作製することもできる。
該遺伝子のＤＮＡは、以下のようにして化学合成をすることができる。具体的には、該遺伝子のＤＮＡを約２０−３０塩基からなる断片に分けて、ＤＮＡ化学合成機（例えば、３９４型、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、複数の断片として合成し、その後、必要に応じて各断片の５' 末端をリン酸化して各断片をアニーリングし、ライゲーションして目的のＤＮＡを得る。
また該遺伝子は、ゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリー等を鋳型とするＰＣＲ法によっても得ることができる。ＰＣＲ法を用いる場合、公知の塩基配列および本発明のフラグメント若しくは蛋白分解酵素の切断部位を挿入若しくは置換されたフラグメント（以下、本発明のフラグメント等と記載することがある）をコードする遺伝子のＤＮＡ等の塩基配列をもとに、また必要に応じて制限酵素認識配列等組み合わせて設計した、センスプライマー及びアンチセンスプライマーを作製し、任意のＤＮＡライブラリー等に対して公知の方法（Ｍｉｃｈａｅｌ ＡＩ．等編、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９０、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、参照）に準拠して行うことによって得ることができる。 上述したＤＮＡライブラリーは、該遺伝子のＤＮＡまたはその一部を含むものであればよく、特に限定されない。したがって、市販のＤＮＡライブラリーを使用してもよく、ヒトの末梢血などから得たリンパ球、ヒトの株化細胞、またはハイブリドーマなどといった適当な細胞を、必要があれば適当な活性化剤で活性化し、サムブルック Ｊ．らの方法に準拠してｃＤＮＡを作製して使用してもよい。 一般に、アミノ酸をコードする遺伝子のＤＮＡのトリプレット（コドン）は、アミノ酸の種類によって１種類から６種類まで存在することが知られているので、本発明のフラグメント等のアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡの塩基配列は１種類には限定されない。従って、本発明のフラグメント等をコードする塩基配列を含有する遺伝子である限り、いかなる塩基配列からなるものであってもよい。
組換えベクターは、環状または直鎖状等、１本鎖または２本鎖ならびにその複合した鎖等、いかなる形態のものであってもよく、目的に応じて適宜選択しうるが、取り扱いの容易さや宿主中への組み込みの容易さからは、環状であることが好ましく、安定性等からは２本鎖であることが好ましい。
「組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント」は、配列番号３に記載のヒト全長ＣＤ１４蛋白質の部分的なアミノ酸配列を有する遺伝子組換えにより作製した可溶性のフラグメントである。
本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、上記１）の性質を有する。すなわち、非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分子量１３±２ｋＤａの位置に本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント由来のバンドが検出される。
特に非還元条件下の１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｐｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎＴＭ ｄｕａｌ ｃｏｌｏｒ ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて分子量を算出すると、分子量１３±２ｋＤａの位置にバンドが検出される。
本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、上記２）の性質を有する。すなわち、３Ｃ１０及びＭＥＭ−１８とは特異的な結合はしない。
「３Ｃ１０及びＭＥＭ−１８とは特異的に結合はしない」とは、３Ｃ１０及びＭＥＭ−１８の両抗体とは、該組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントが免疫学的に結合しないこと、若しくは通常の抗原抗体反応を示さないことである。「３Ｃ１０及びＭＥＭ−１８とは特異的に結合はしない」本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、生体内全長ＣＤ１４若しくは配列番号３に記載のヒト全長組換え型可溶型ＣＤ１４蛋白質と比較すると、３Ｃ１０及びＭＥＭ−１８とのそれぞれの結合能が、１／１００以下である。好ましくは１／１，０００以下である。
本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、上記３）の性質を有する。特にポリクローナル抗体と特異的に結合する。上記３）の特徴に記載される配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドは、配列番号３に記載のヒトＣＤ１４の５３位から６８位までの１６アミノ酸残基に該当する。そして、該ポリクローナル抗体は７アミノ酸以上の長さの配列を認識する（後述する実施例４参照）ことより、第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、配列番号３に記載のヒトＣＤ１４の５３位から６８位までのいずれかの連続した７アミノ酸以上の長さの配列は、少なくとも有している。
３Ｃ１０及びＭＥＭ−１８は、非常に有名な抗ＣＤ１４抗体であり、ＣＤ１４上のエピトープはそれぞれ７位〜１４位及び５７位〜６４位にあると認識されている。そして、従来のヒトＣＤ１４由来の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、その配列が上記のエピトープ部分の領域を有する限り、３Ｃ１０若しくはＭＥＭ−１８に結合すると認識されている。
本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、上記１）〜３）の性質を有しており、そのことにより、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原と物性及び免疫学的に類似した性質を有する。特に免疫学的な性質が類似しているということは、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原とエピトープとなり得るアミノ酸残基の配列の立体構造が類似しているということが推定できる。そのため、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を測定するときの標準物質として、特に有用となる。本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を測定するときの一般的な標準物質としては、ヒトＣＤ１４のＮ末端１位〜３０７位のアミノ酸を有しかつ２８６位のセリンをシステインに置換した組換えポリペプチド（以下、ｒｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃと記載）が使用可能であるが、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、分子量が近似していることにより、免疫学的な反応を物質量に換算するときに都合がよい。また、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、溶媒の状態が変化しても、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原と反応性が類似する。例えば、クエン酸加血とＥＤＴＡ加血から検体では、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原とｒｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃとの本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原との免疫学的な反応性は異なるが、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原と本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、免疫学的な反応性は一致している。同様に、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を競合法等で測定するときの類似物質としても有用である。
さらに、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原と免疫学的に類似した性質を有するため、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を測定するための抗体をスクリーニングする時に特異的結合の対象として用いることができる。本来本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を特異的結合の対象として用いればよいが、生体内においてごく微量にしか存在しないため、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、代用品として特に有用となる。
上記の通り、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、種々の有用性を有するが、これは上記１）〜３）の性質を有するためである。すなわち、上記１）〜３）の性質を有する本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、配列により表されるものではなく、ＣＤ１４フラグメントの物性及び免疫学的な性質という機能で表現されるものである。
さらに、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、上記４）ＬＰＳに結合しない、という性質を有する。国際公開第ＷＯ９６／２０９５６号には、具体的なペプチドの記載はないが、ヒトＣＤ１４の５７位〜６４位を含む８〜６０個のアミノ酸を有し、ＬＰＳに結合するペプチドが開示されている。該ペプチドと本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、一致するものではないが、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、特に上記４）の性質を有することにより、明らかに異なることが理解できる。
本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、下記の５）〜７）の配列を有する組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントが例示される。
５）配列番号３に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである、若しくは該部分配列を有するフラグメントの配列番号３の５３位〜６８位以外の領域に１〜１０個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントである。
６）Ｎ末端が配列番号３の１位〜１７位のいずれかである。
７）Ｃ末端が配列番号３の５９位〜９０位のいずれかである。
この例示した中でも、６）においてＮ末端が配列番号３の１位〜６位のいずれかである組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントが好ましく、Ｎ末端が配列番号３の１位である組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントがより好ましい。
また、７）においてＣ末端が配列番号３の５９位〜８０位のいずれかである組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントが好ましく、Ｃ末端が配列番号３の６４位〜７５位のいずれかである組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントがより好ましく、Ｃ末端が配列番号３の６４位である組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントがさらに好ましい。
特に、６）においてＮ末端が配列番号３の１位であり、７）においてＣ末端が配列番号３の６４位である（２−３）〜（２−５）のいずれかの組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントが好ましい。
また、５）において配列番号３に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントが好ましい。
本発明のフラグメントを遺伝子工学的に生産する方法を以下に説明するが、特に限定されず、常法を用いることができる。
一般に、アミノ酸をコードする遺伝子のＤＮＡのトリプレット（コドン）は、アミノ酸の種類によって１種類から６種類まで存在することが知られているので、本発明のフラグメントのアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡの塩基配列は１種類には限定されない。従って、本発明のフラグメントをコードする塩基配列を含有する遺伝子である限り、いかなる塩基配列からなるものであってもよい。該遺伝子はｃＤＮＡ、染色体ＤＮＡおよびそれらの組合せならびに適当にスプライシングされうるイントロンを含むｃＤＮＡであってもよく、遺伝子工学的な取扱いの容易さから、ｃＤＮＡであることが好ましい。
該遺伝子は、いかなる方法で得られたものであってもよい。例えば、化学合成されたものであってもよく、適当なＤＮＡライブラリーから得たものであっても、ＣＤ１４の全長または部分をコードする遺伝子のＤＮＡを含むＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法で得たものであってもよい。また、これらの方法で得た遺伝子またはその断片を必要に応じてアニーリング、ライゲーションして作製することもできる。
該遺伝子のＤＮＡは、以下のようにして化学合成をすることができる。具体的には、該遺伝子のＤＮＡを約２０−３０塩基からなる断片に分けて、ＤＮＡ化学合成機（例えば、３９４型、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、複数の断片として合成し、その後、必要に応じて各断片の５' 末端をリン酸化して各断片をアニーリングし、ライゲーションして目的のＤＮＡを得る。
また該遺伝子は、ゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリー等を鋳型とするＰＣＲ法によっても得ることができる。ＰＣＲ法を用いる場合、公知の塩基配列および本発明のフラグメント若しくは蛋白分解酵素の切断部位を挿入若しくは置換されたフラグメント（以下、本発明のフラグメント等と記載することがある）をコードする遺伝子のＤＮＡ等の塩基配列をもとに、また必要に応じて制限酵素認識配列等組み合わせて設計した、センスプライマー及びアンチセンスプライマーを作製し、任意のＤＮＡライブラリー等に対して公知の方法（Ｍｉｃｈａｅｌ ＡＩ．等編、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９０、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、参照）に準拠して行うことによって得ることができる。 上述したＤＮＡライブラリーは、該遺伝子のＤＮＡまたはその一部を含むものであればよく、特に限定されない。したがって、市販のＤＮＡライブラリーを使用してもよく、ヒトの末梢血などから得たリンパ球、ヒトの株化細胞、またはハイブリドーマなどといった適当な細胞を、必要があれば適当な活性化剤で活性化し、サムブルック Ｊ．らの方法に準拠してｃＤＮＡを作製して使用してもよい。 一般に、アミノ酸をコードする遺伝子のＤＮＡのトリプレット（コドン）は、アミノ酸の種類によって１種類から６種類まで存在することが知られているので、本発明のフラグメント等のアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡの塩基配列は１種類には限定されない。従って、本発明のフラグメント等をコードする塩基配列を含有する遺伝子である限り、いかなる塩基配列からなるものであってもよい。
組換えベクターは、環状または直鎖状等、１本鎖または２本鎖ならびにその複合した鎖等、いかなる形態のものであってもよく、目的に応じて適宜選択しうるが、取り扱いの容易さや宿主中への組み込みの容易さからは、環状であることが好ましく、安定性等からは２本鎖であることが好ましい。
接続するシグナル配列は、適宜選択することが可能であるが、ヒトＣＤ１４のＭｅｔ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｌａの配列のシグナルペプチドをコードするシグナル配列（Ｇｏｙｅｒら、Ｎｕｃｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１６巻、４１７３頁、１９８８年）が好ましい。
また大腸菌を宿主とした封入体として発現させる場合には、メチオニンもしくはメチオニンをＮ末端に含むペプチドを付加することが好ましい。
該組換えベクターの好ましい例は、宿主の観点からすると、本発明のフラグメント等を発現するように動物細胞または酵母等の真核細胞を形質転換させるものである。従って、該組換えベクターは、少なくとも、翻訳開始コドン、終止コドン、選択マーカー遺伝子に加えてポリＡ付加配列を、さらに動物細胞で機能するＳＶ４０のプロモーター、ＥＦ１αのプロモーター、ＳＲαのプロモーターまたは、酵母で機能するＡＯＸ１のプロモーターならびに、ＳＶ４０の複製開始点等を有するものが該組換えベクターの好適な例として挙げられる。
該組換えベクターは、該遺伝子のＤＮＡを任意の塩基配列を有する他のＤＮＡ断片とライゲーションする方法、または任意のベクターに導入する方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９、参照）等で得ることができる。
形質転換体は、該組換えベクターを、宿主となる細胞や微生物に導入する事によって得ることができる。
該形質転換体は、好ましくは、本発明のフラグメント等を発現する形質転換体がよく、特に好ましくは、本発明のフラグメント等を発現し、培養上清中に分泌するものがよい。このような形質転換体を使用すれば、本発明のフラグメント等を大量に生産することが容易になるからである。
該形質転換体を培養し、必要に応じて遺伝子の増幅や発現誘導を行う。次いで培養混合物を回収し、必要に応じて濃縮、可溶化、透析、各種のクロマトグラフィー等の操作を適宜組み合わせて、本発明のフラグメント等の精製を行う。
「培養混合物」とは、形質転換体、形質転換体を含む培地、もしくは培養上清または細胞のライセートを意味する。
当該生産方法で使用する形質転換体は、本発明のフラグメント等を発現する形質転換体であれば、限定されないが、好ましくは、ＣＯＳ細胞および、ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞もしくは酵母、もしくは大腸菌のいずれかより選択される細胞を宿主とした形質転換体であることが好ましい。
以下に、形質転換体として大腸菌、ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属酵母を使用した場合の培養および発現誘導の例を示す。
ｔｒｐプロモーターを有する組換えＤＮＡ分子で形質転換された大腸菌では、Ｌ−ブロース（Ｌ−Ｂｒｏｔｈ）で菌体を前培養し、それをＭ９−ＣＡの培地に対して１／５０量となるように植え込み、３７℃で培養を行う。培養開始数時間後に培地のＯＤ５５０値が１〜４（すなわち対数増殖期）に達した時点で３β−インドールアクリル酸を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加し発現誘導を行う。さらに約１〜２日の培養を行うことにより、目的蛋白質を含む培養混合物を得ることができる。
ＡＯＸ１プロモーターを有する組換えベクターで形質転換されたピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属の酵母を用いる場合には、ＢＭＧＹ培地で約２日間前培養し、培地交換後、メタノールを加えて発現誘導する。さらに、３０℃で約１〜２日間の培養を行い、目的蛋白質を含む培養混合物を得ることができる。
ＥＦ１αのプロモーターを有する組換えベクターでＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞を形質転換して得られた形質転換体は、１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地で培養する。細胞は、約１〜１０×１０4 細胞／ｍｌの濃度で植え込み、３７℃、５％炭酸ガス／９５％空気の条件で培養を行う。通常、２〜３日後にコンフルエントな状態になるので、その時点で培地を、血清不含のＤ−ＭＥＭに交換する。さらに引き続き、２〜３日間の培養を行うことにより目的蛋白質を含む培養混合物を得ることができる。なお、目的蛋白質の産生量が少ない場合には前述したようにメトトレキセートにより遺伝子を増幅し、産生量を増加させることも可能である。
上述の培養混合物から本発明のフラグメント等を精製する方法としては、通常フラグメント、蛋白質若しくはポリペプチドの精製に使用されている方法のなかから適当な方法を適宜選択して行う。具体的には、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等、通常使用される方法の中から適切な方法を適宜選択し組み合わせ、必要によりＨＰＬＣシステム等を用いて精製を行えば良い。
当該生産方法において、本発明のフラグメント等は、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼや、他のポリペプチドとの融合蛋白質として発現させてもよいが、この場合には、精製工程のいずれかのステップにおいて、融合蛋白質をブロムシアンまたはヒドロキシルアミン等の化学物質やプロテアーゼ等の酵素で処理して当該蛋白質を切り出す操作が必要になる。
また、使用する形質転換体が大腸菌であった場合に、本発明のフラグメント等を不溶化蛋白質であるインクルージョンボディーとして産生させた場合には、精製の際に、インクルージョンボディーを可溶化し、デネイチャーし、リフォールディングするという操作を精製の適当なステップで行えばよい（Ｔｈｏｍａｓ Ｅ等，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，８７，５６３−５７７，１９７４）。
具体的には、まず、菌体を破砕し、遠心分離してペレットを回収する。次に、尿素もしくはグアニジン塩酸、界面活性剤、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオンを適量含む可溶化バッファー（たとえば、５Ｍグアニジン塩酸、０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ還元型グルタチオン、０．０２ｍＭ酸化型グルタチオンを含む緩衝液）をペレットに加え、２−メルカプトエタノールを加えてデネイチャーし、上記可溶化バッファーからグアニジン塩酸を取り除いた溶液に対して透析してリフォールディングする。融合蛋白質として発現させている場合には、これらの操作の後で、ブロムシアン等の化学物質もしくはプロテアーゼ等の酵素で不要な蛋白質部分を切断し、その後、適当なクロマトグラフィーを行う。
また、本発明のフラグメントは、一般的な方法により化学合成することもでき、化学合成により作成したフラグメントも本発明のフラグメントに含まれる。例えば、市販のペプチド合成機により作成できる。また、本は詰めのフラグメントの断片をペプチド合成機により合成し、それを化学的に結合させて作成することもできる。
本発明の第三の態様は、下記<1>〜<3>の工程により得られる下記１）〜３）の性質を有する組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントである。
<1>所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列が置換若しくは挿入されている配列番号３に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメント若しくは該部分配列を有するフラグメントの配列番号３の５３位〜６８位以外の領域に１〜１０個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントを作製する工程、
<2><1>で作製した組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを該所定の蛋白分解酵素により切断する工程、及び
<3><2>で切断したフラグメントのＮ末側のフラグメントを回収する工程、
１）非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、分子量１３±２ｋＤａ、
２）３Ｃ１０及びＭＥＭ−１８とは特異的な結合はしない、及び
３）配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製した抗体に特異的に結合する。
発明者らは、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原が血中に存在する機序を下記の通り想定して、その想定した産生過程と同様な方法を用いて本発明の第三の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを、生産することを試みた。ただし、想定した産生過程により、本発明を拘束若しくは限定されるものではない。
本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原は、後述するが敗血症時に特異的に血中に増加する。すなわち、敗血症の初期段階、特に生体がエンドトキシン等に接触した後すぐに起こり得る生体内現象により、増加することがわかる。
例えば、生体がエンドトキシン等に接触した後すぐに起こり得る生体内現象とは、好中球の活性化であり、活性化された好中球は、好中球エラスターゼ等のプロテアーゼが放出する。この時、生体内の可溶型全長ＣＤ１４、膜型ＣＤ１４（以降、全長のＣＤ１４と記載することがある）等の高分子ＣＤ１４が該エラスターゼ等により、分解され、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原が増加することが想定できる。エラスターゼによる切断は特異性が低いので、種々の断片が生じる可能性が高いが、最終的には本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原に終局されることも想定される。当然、他のプロテアーゼ等との相互作用により、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原になることも想定される。
そして、エラスターゼ等のプロテアーゼにより、全長のＣＤ１４が分解して生じた本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原は、少なくとも生体内（血清中）に検出できる程度には安定して存在している。
また、後述する通り、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原が全長のＣＤ１４と区別して、免疫学的に測定できることより、このようにして生じた本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原は、全長のＣＤ１４とは、すでに立体構造の点で異なっていることが理解される。
本発明の第三の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントであるために、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原と立体的に類似しているフラグメント、すなわち免疫学的な特異性が類似するフラグメントは、比較的大きいＣＤ１４フラグメントから、Ｃ末端をプロテアーゼにより切断する生産方法を試み、本発明の第三の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを、生産し、単離精製することに成功した。
以下に、本発明の第三の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントの作製の例示を記載する。
<1>の工程において、下記の８）〜１１）の配列を有する組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを作製する工程、
８）配列番号３に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである、または該部分配列を有するフラグメントの配列番号３の５３位〜６８位以外の領域に１〜１０個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントである、
９）Ｎ末端が配列番号３の１位〜１７のいずれか位である
１０）Ｃ末端が配列番号３の１３４位〜３５６位のいずれかである、及び
１１）所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列が、配列番号３の５９位〜９０位のいずれかの位置の後ろに置換若しくは挿入されている。
<1>の工程の１１）における所定の蛋白分解酵素とは、ＰｒｏＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ等が例示される。そして、所定の蛋白分解酵素が、ＰｒｏＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ である場合、切断部位の配列はＬｅｕ，Ｇｌｕ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｐｈｅ，Ｇｌｎ，Ｇｌｙ，Ｐｒｏであり、該８アミノ酸残基を配列番号３の５９位〜７０位のいずれかの位置の後ろに置換若しくは挿入することが例示される。また、所定の蛋白分解酵素が、Ｔｈｒｏｍｂｉｎである場合、切断部位の配列はＬｅｕ，Ｖａｌ，Ｐｒｏ，Ａｒｇ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒであり、該６アミノ酸残基を配列番号３の５９位〜７０位のいずれかの位置の後ろに置換若しくは挿入することが例示される。さらに、所定の蛋白分解酵素が、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａである場合、切断部位の配列はＩｌｅ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ａｒｇであり、該４アミノ酸残基を配列番号３の５９位〜７０位のいずれかの位置の後ろに置換若しくは挿入することが例示される。
また、<1>の工程で、９）においてＮ末端が配列番号３の１位〜６位のいずれかであるフラグメントを作成して、生産した組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントが好ましい。さらにＮ末端が配列番号３の１位であるフラグメントを作成して、生産した組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントがより好ましい。
また、<1>の工程で、１１）において所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列が、配列番号３の５９位〜６８位のいずれかの後ろに置換若しくは挿入されているフグメントを作成して、生産した組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントが好ましい。
さらに所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列が、配列番号３の６４位の後ろに置換若しくは挿入されているフグメントを作成して、生産した組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントが好ましい。
特に、Ｎ末端が配列番号３の１位〜６位のいずれかであり、所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列が、配列番号３の６４位の後ろに置換若しくは挿入されているフグメントを作成して、生産した組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントがさらに好ましい。
<1>の工程は、例えば上記の通り、配列を決定すれば、本発明の第二の態様の項に記載した通り、組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを作製できる。
<2>の所定の蛋白分解酵素の切断部位を挿入若しくは置換されたフラグメントを該所定の蛋白分解酵素により切断する工程は、該所定の蛋白分解酵素の至適条件を適用して、通常の反応を行えばよい。例えば、所定の蛋白分解酵素がＰｒｏＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅの場合は、酵素：基質比＝０．００１〜１０：１（Ｕ：μｇ）となるように、４℃一晩切断反応を行えばよい。また、所定の蛋白分解酵素がＴｈｒｏｍｂｉｎの場合は、酵素：基質比＝０．００１〜１０：１（Ｕ：μｇ）となるように２２℃、一晩静置しトロンビンによる切断反応を行えばよい。所定の蛋白分解酵素がＦａｃｔｏｒ Ｘａの場合は、酵素：基質比＝０．０００８〜８：１（Ｕ：μｇ）となるように、添加し、一晩切断反応を行えばよい。
<3>の切断したフラグメントのＮ末側のフラグメントを回収する工程は、上記した本発明のフラグメント等を精製する方法と同様に行えばよい。
当該生産方法によれば、本発明のフラグメント等を均一にかつ高効率で工業的に大量生産することができる。
また、本発明の第三の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントの具体的な配列は、上記の通りの工程により、理解できる。好ましいフラグメントは本発明の第二の態様の項に記載したフラグメントの配列と同様である。また、本発明の第三の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントのＣ末端には、所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列の一部が付加されたている場合もある。
本発明の第三の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、特に、好ましい理由として、血中の高分子ＣＤ１４は検出せず本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原のみを検出するキットに反応し、ウェスタンブロッティングによる検出も、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原と同等の反応性を示すことが確認されており（後述する実施例１４―（２）参照）、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原と実質的に立体構造が同等と推定できるからである。
以下、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント及び本発明の第三の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを共通して説明する。（両者を共通して本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント若しくは本発明の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントと記載する場合がある。）
「組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント」は、配列番号３に記載のヒト全長ＣＤ１４蛋白質の部分的なアミノ酸配列を有する遺伝子組換えにより作製した可溶性のフラグメントである。
本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、上記１）の性質を有する。すなわち、非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分子量１３±２ｋＤａの位置に本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント由来のバンドが検出される。
特に非還元条件下の１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｐｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎＴＭ ｄｕａｌ ｃｏｌｏｒ ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて分子量を算出すると、分子量１３±２ｋＤａの位置にバンドが検出される。
本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、上記２）の性質を有する。すなわち、３Ｃ１０及びＭＥＭ−１８とは特異的な結合はしない。
「３Ｃ１０及びＭＥＭ−１８とは特異的に結合はしない」とは、３Ｃ１０及びＭＥＭ−１８の両抗体とは、該組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントが免疫学的に結合しないこと、若しくは通常の抗原抗体反応を示さないことである。「３Ｃ１０及びＭＥＭ−１８とは特異的に結合はしない」本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、生体内全長ＣＤ１４若しくは配列番号３に記載のヒト全長組換え型可溶型ＣＤ１４蛋白質と比較すると、３Ｃ１０及びＭＥＭ−１８とのそれぞれの結合能が、１／１００以下である。好ましくは１／１，０００以下である。
本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、上記３）の性質を有する。特にポリクローナル抗体と特異的に結合する。上記３）の特徴に記載される配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドは、配列番号３に記載のヒトＣＤ１４の５３位から６８位までの１６アミノ酸残基に該当する。そして、該ポリクローナル抗体は７アミノ酸以上の長さの配列を認識する（後述する実施例４参照）ことより、第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、配列番号３に記載のヒトＣＤ１４の５３位から６８位までのいずれかの連続した７アミノ酸以上の長さの配列は、少なくとも有している。
３Ｃ１０及びＭＥＭ−１８は、非常に有名な抗ＣＤ１４抗体であり、ＣＤ１４上のエピトープはそれぞれ７位〜１４位及び５７位〜６４位にあると認識されている。そして、従来のヒトＣＤ１４由来の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、その配列が上記のエピトープ部分の領域を有する限り、３Ｃ１０若しくはＭＥＭ−１８に結合すると認識されている。
本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、上記１）〜３）の性質を有しており、そのことにより、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原と物性及び免疫学的に類似した性質を有する。特に免疫学的な性質が類似しているということは、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原とエピトープとなり得るアミノ酸残基の配列の立体構造が類似しているということが推定できる。そのため、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を測定するときの標準物質として、特に有用となる。本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を測定するときの一般的な標準物質としては、ヒトＣＤ１４のＮ末端１位〜３０７位のアミノ酸を有しかつ２８６位のセリンをシステインに置換した組換えポリペプチド（以下、ｒｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃと記載）が使用可能であるが、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、分子量が近似していることにより、免疫学的な反応を物質量に換算するときに都合がよい。また、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、溶媒の状態が変化しても、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原と反応性が類似する。例えば、クエン酸加血とＥＤＴＡ加血から検体では、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原とｒｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃとの本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原との免疫学的な反応性は異なるが、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原と本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、免疫学的な反応性は一致している。同様に、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を競合法等で測定するときの類似物質としても有用である。
さらに、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原と免疫学的に類似した性質を有するため、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を測定するための抗体をスクリーニングする時に特異的結合の対象として用いることができる。本来本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を特異的結合の対象として用いればよいが、生体内においてごく微量にしか存在しないため、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、代用品として特に有用となる。
上記の通り、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、種々の有用性を有するが、これは上記１）〜３）の性質を有するためである。すなわち、上記１）〜３）の性質を有する本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、配列により表されるものではなく、ＣＤ１４フラグメントの物性及び免疫学的な性質という機能で表現されるものである。
さらに、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、上記４）ＬＰＳに結合しない、という性質を有する。国際公開第ＷＯ９６／２０９５６号には、具体的なペプチドの記載はないが、ヒトＣＤ１４の５７位〜６４位を含む８〜６０個のアミノ酸を有し、ＬＰＳに結合するペプチドが開示されている。該ペプチドと本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、一致するものではないが、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、特に上記４）の性質を有することにより、明らかに異なることが理解できる。
所定の蛋白分解酵素の切断部位を挿入若しくは置換されたフラグメントを該所定の蛋白分解酵素により切断する工程は、該所定の蛋白分解酵素の至適条件を適用して、通常の反応を行えばよい。例えば、所定の蛋白分解酵素がＰｒｏＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅの場合は、酵素：基質比＝０．００１〜１０：１（Ｕ：μｇ）となるように、４℃一晩切断反応を行えばよい。また、所定の蛋白分解酵素がＴｈｒｏｍｂｉｎの場合は、酵素：基質比＝０．００１〜１０：１（Ｕ：μｇ）となるように２２℃、一晩静置しトロンビンによる切断反応を行えばよい。所定の蛋白分解酵素がＦａｃｔｏｒ Ｘａの場合は、酵素：基質比＝０．０００８〜８：１（Ｕ：μｇ）となるように、添加し、一晩切断反応を行えばよい。
切断したフラグメントのＮ末側のフラグメントを回収する工程は、上記した本発明のフラグメント等を精製する方法と同様に行えばよい。
当該生産方法によれば、本発明のフラグメント等を均一にかつ高効率で工業的に大量生産することができる。
また、本発明のフラグメントは、一般的な方法により化学合成することもでき、化学合成により作成したフラグメントも本発明のフラグメントに含まれる。例えば、市販のペプチド合成機により作成できる。また、本は詰めのフラグメントの断片をペプチド合成機により合成し、それを化学的に結合させて作成することもできる。
本発明の第四の態様は、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を測定することを特徴とする敗血症の診断若しくは検出方法である。本発明の第四の態様の敗血症の診断若しくは検出方法を用いることにより、被験者に対して、敗血症の診断若しくは検出ができる。
好ましくは、下記１）〜３）の工程を含むことを特徴とする。
１）被験者から採取した血液中に含まれる本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を測定する工程、
２）測定した値を正常人の標準値と比較する工程、及び
３）被験者が、敗血症であるかどうかを評価する工程。
１）の工程において、被験者から採取した血液とは、被験者から採取した血液、すなわち全血を用いてもよく、また被験者から採取した血液を血漿または血清に調製してもよい。好ましくは血漿または血清に調製して本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を測定する工程である。「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を測定する」とは、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原の量を測定することであるが、特に問わず、単位溶液中の量、すなわち濃度を測定してもよい。２）の工程において比較する標準値に合わせた単位で測定結果が得られればよい。
また、１）の工程において、サンドイッチ免疫測定法により測定することが、簡便にできて好ましい。例えば、後述する本発明の第六の態様の測定方法により行うことができる。さらに本発明の第五の態様の測定キットを用いることにより行うことができる。ただし、１）の工程は、この測定法により限定されるわけではない。例えば、被験者から採取した血液、血漿若しくは血清中の本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を、電気泳動により分離し、検出されるバンドの濃さ若しくは幅等をデンシトメトリーにより測定する方法が挙げられる。この方法の好ましい例としては、特に非還元下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、本発明の第五の態様の測定キットに使用している抗体を用いるＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔによりバンドを検出することである。これらの他に、測定方法としてマススペクトル、ＨＰＬＣ、Ｇａｓクロマトグラフフィー若しくはＴＬＣ等による分離及び検出等の方法を用いても良い。
２）の工程は、予め複数の正常人の測定結果を求めておき、その測定結果の平均値若しくは範囲をとる等により標準化した正常人の値または正常人の値の範囲を、正常人の標準値として、１）の工程で測定した値と比較する工程である。例えば、正常人の平均値＋２ＳＤまたは３ＳＤをカットオフ値として正常人の標準値を求めればよい。また、２）の工程では、予め敗血症患者の基準値を求めておいて、１）の工程で測定した値と比較する工程を行ってもよい。この工程を２）の正常人の標準値と比較する工程の代わりに行ってもよい。
３）の工程は、２）の工程で比較した結果に基づいて、被験者が敗血症である（陽性）か、若しくは敗血症でないか（陰性）を評価する工程である。また陽性、陰性の他に偽陽性としての評価若しくは予測的診断を行っても良い。例えば、正常人の標準の幅を０〜０．１μｇ／ｍＬとし、敗血症患者の値を０．２μｇ／ｍＬ以上として測定値と比較する場合、被験者の値が０〜０．１μｇ／ｍＬの場合、陰性として、０．１〜０．２μｇ／ｍＬの場合、擬陽性として、０．２μｇ／ｍＬ以上の場合、陽性として評価する、若しくは例えば２４時間以内に敗血症を発症する蓋然性が高い等の診断をする等である。
臨床現場において検体中の本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原の安定性が重要な要因となる場合もある。例えば凍結融解を繰り返したり、長時間室温で放置した場合に、血清中の本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原が分解し、測定できなくなる場合もあり、また、血清中の高分子量ＣＤ１４が、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原若しくはそれに近い構造に分解され、測定結果を誤る場合も想定される。
そのため、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原及び高分子量ＣＤ１４の安定性を担保する目的で、血清中に各種添加剤を加えてもよい。例えば、採血時に添加する添加剤として、血漿の採血に使用されるｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）、ｈｅｐａｒｉｎ、クエン酸があげられる。また、血清中に安定化剤としてａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎIII、α１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ、ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、α２−ｍａｃｒｏｇｌｏｂｌｉｎ、ｐｅｐｓｔａｔｉｎ、ａｎｔｉｐａｉｎ、ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、ａｍａｓｔａｔｉｎ、ｔｒｉｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、ＥＧＴＡ、Ｅ−６４、ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４−ｆｌｕｏｒｏ―（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）等の各種プロテアーゼ阻害剤を添加することにより蛋白の分解を抑制できる。さらに、ｌａｃｔｏｃｅ、ｓｕｃｒｏｓｅ、ｔｏｒｅｈａｒｏｓｅ等の糖やＰＥＧ等の合成高分子等を添加することにより液中での本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原及び高分子量ＣＤ１４の安定性を向上させることもできる。
本発明の第五の態様は、少なくとも一つの本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片を含む、検体に含まれる本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を測定するための可溶性ＣＤ１４抗原の測定キットである。
本発明のキットは、少なくとも一つの本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片を含み、検体に含まれる本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を測定する。また、目的である本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を検出するため、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を直接測定することができる。また、目的である本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原のみを検出し、ヒト高分子量可溶性ＣＤ１４抗原及び３６ｋＤａ 可溶型ＣＤ１４蛋白質を検出しないキットが好ましい。実際に、本発明の測定キットは、ヒト血清を特別な処理をせずにそのまま検体として測定すればヒト高分子量可溶型ＣＤ１４蛋白質及び３６ｋＤａ 可溶型ＣＤ１４蛋白質を検出しない。特別な処理とは、ヒト血清に蛋白を添加する、若しくはヒト血清中の蛋白を変性する等の処理である。該抗体の断片とは、該抗体のＦab、Ｆab' 、若しくはＦ（ab' ）２ である。
本発明の測定キットは、少なくとも一つの本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片を含み、検体に含まれる本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を測定することができる限り、特に限定されない。好ましくは、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片として、以下のａ）〜ｄ）のいずれかの抗体または該抗体の断片を含む可溶性ＣＤ１４抗原の測定キットである。
ａ）配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体。
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列から選択される連続した８〜１６個のいずれかの個数のアミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体。若しくは、
ｃ）配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体。
ｄ）本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント若しくは本発明の第三の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントと特異的に結合する抗体。
より好ましくは、上記ａ）、ｃ）若しくはｄ）の抗体若しくは該抗体の断片を含む測定キットである。さらに好ましくは、ｄ）の抗体若しくは該抗体の断片を含む測定キットである。特に好ましくは、ｄ）本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントに結合する抗体若しくは該抗体の断片を含む測定キットである。
ｄ）の抗体、すなわち、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント若しくは本発明の第三の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント（以下、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント若しくは本発明の第三の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを合わせて、本発明の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントと記載することがある）は、ａ）配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体、ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列から選択される連続した８〜１６個のいずれかの個数のアミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体、若しくはｃ）配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体と、同様な性質を有する抗体も含まれ、一部重複する。このため、ｄ）の抗体は、上記ａ）〜ｃ）の抗体の一部を含んでいてもよい。また、ｄ）の抗体と上記ａ）〜ｃ）の抗体と明確に区別するためには、ｄ）の抗体から、上記ａ）〜ｃ）の抗体を除けばよい。
また、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片として、特にｄ)の抗体として、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント若しくは本発明の第三の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製した抗体若しくは該抗体の断片が好ましい。また、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を抗原として作製した抗体若しくは該抗体の断片も好ましい。本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製した抗体若しくは該抗体の断片がより好ましい。また、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体若しくは該抗体の断片が好ましい。また特に、ヒト高分子量ＣＤ１４若しくはヒトＣＤ１４のＮ末端１位〜３５６位のアミノ酸を有する可溶性ポリペプチド（以下、ｒｓＣＤ１４（１−３５６）と記載）等の組換え型高分子量ＣＤ１４とは実質的に結合しない抗体が好ましい。
また、測定する原理も該抗体若しくは該抗体の断片を使用して免疫学的に本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を測定する方法であれば特に限定されない。
測定する原理の一例として、ａ）の抗体すなわち「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」を使用して、サンドイッチ免疫測定法により本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を測定する測定キット（以下、サンドイッチ免疫測定系キットと記載することがある）について下記に具体的に記載する。
サンドイッチ免疫測定法は公知の技術を利用することができる。測定法の原理、応用及び改良法については、例えば、「超高感度酵素免疫測定法」石川栄治著、学会出版センター（1993年）、「免疫測定法の新しい活用事例と診断試薬・治療薬開発への応用」免疫測定法開発研究会、経営教育出版、酵素免疫測定法（第３版）石川栄治等編、医学書院（1987年）に記載されている。
また、本発明のサンドイッチ免疫測定系キットは配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体を含む。該配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体の特徴、及び作製法等は本発明の第一の態様に記載した通りである。該抗体は、ポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体でもよく、特に限定されない。
サンドイッチ免疫測定法は、通常測定する蛋白質を認識する部位の異なる２種類以上の抗体を用いて抗体−抗原−抗体複合体を形成させることにより測定する方法である。
まず、第一の抗体が結合した不溶性担体を用意し、固相若しくは反応場所とする。検体を固相の該不溶性担体に添加し、反応させる。一定時間反応させた後、洗浄して固相に特異的に結合しなかった物質を除去する。続いて標識した第二の抗体を添加する。一定時間反応させた後、洗浄して複合体を形成しなかった標識抗体を除去し、標識物に基づいて固相に特異的に結合した複合体の量を特異的に定性または定量する。サンドイッチ法は上記のように２段階で行う方法（２ステップ法）と抗原及び標識抗体を同時に加える１段階法（１ステップ法）のどちらを使用することもできる。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットにおいては、「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」−「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」−「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合する第二の結合物質」複合体を形成させることにより測定する。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットの構成としては、「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」が結合した不溶性担体、及び「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」に結合する標識した第二の結合物質（以下、単に、第二の結合物質と記載することがある）を含むこと、
あるいは、第二の結合物質が結合した不溶性担体、及び「配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する標識した抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製した標識したモノクローナル抗体」を含む。
第二の結合物質の例示としては、「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」に特異的に結合する抗体が挙げられる。「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」に特異的に結合する該抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、特に限定されないが、配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体を用いるサンドイッチ免疫測定法における相性の点では、モノクローナル抗体が好ましい。また、該モノクローナル抗体の断片であってもよい。抗体の断片とは、該モノクローナル抗体のＦab、Ｆab' 、若しくはＦ（ab' ）2 である。
本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合する抗体（以下、第二の抗体と記載することもある）は、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原と特異的に結合する抗体でも、高分子量ＣＤ１４とも特異的に結合する抗体でもよく、特に限定されない。好ましくは、「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」と「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」に特異的に結合する領域が異なる抗体である。より好ましくは、上記第二の結合物質がヒト高分子量ＣＤ１４の１位〜５２位のアミノ酸残基のいずれかの領域に特異的に結合する抗体または該抗体の断片、あるいはヒト高分子量ＣＤ１４の１位〜５２位のアミノ酸残基のいずれかの領域に特異的に結合する抗体と競合する若しくは交差反応性を示す抗体、または該抗体の断片である。特に好ましくは、上記第二の結合物質が「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」の１７位〜２６位のアミノ酸残基のいずれかに特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片、または「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」の１７位〜２６位のアミノ酸残基のいずれかに特異的に結合する抗体と競合する（交差反応性を示す）抗体若しくは該抗体の断片である。
作製法は、例えば高分子量ＣＤ１４、「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」、高分子量ＣＤ１４及び「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」の混合物若しくは組換体ＣＤ１４を抗原として、本発明の第一の態様に記載の方法と同様にポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体を作製すればよい。高分子量ＣＤ１４及び「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」の混合物、及び組換体ＣＤ１４を抗原とした第二の抗体の作製法の例示を後述する実施例３に示した。
また、実際の測定をする前に予備的に、後述する実施例３と同様に、配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体と第二の抗体の候補の抗体とサンドイッチ法の系を構成し、測定感度を確認して、第二の抗体を選択することが好ましい。
また、抗体の断片であるＦab、Ｆab'、Ｆ（ab'）2 は公知の方法（「超高感度酵素免疫測定法」石川栄治著 25-40頁、学会出版センター、1993年）で作製できる。
上記にはサンドイッチ免疫測定法において不溶性担体に抗体を結合させるサンドイッチ免疫測定法を詳細に記載したが、不溶性担体を用いずに、溶液中で行うことができる。例えば、抗原と標識抗体及び第二の標識した第二の結合物質を液相中で反応させ、該標識と該第二の標識との相互作用を測定する方法である。
サンドイッチ免疫測定法において、上記の別法として競合法により測定することもできる。抗体−抗原−抗体複合体を形成させる中で、検体中の抗原と標識した抗原若しくは標識した抗原類似物質を競合させることにより測定する方法である。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットにおいては、「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」−標識した「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」（若しくはその類似物質）−「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原に結合する第二の結合物質」複合体を形成させることにより測定する。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットの競合法の構成としては、「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」が結合した不溶性担体、第二の結合物質、及び標識した「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」若しくは標識した「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」の類似物質を含むこと、あるいは、「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」、第二の結合物質が結合した不溶性担体、及び標識した「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」若しくは標識した「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」の類似物質を含む。
「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」の類似物質とは、例えば、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント、ヒトＣＤ１４のＮ末端１位〜２８５位のアミノ酸を有する可溶性ポリペプチド（以下、ｒｓＣＤ１４（１−２８５）と記載）及びｒｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃが例示される。特に、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントが好ましく例示される。しかし、測定系において検体中の本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原と競合可能な物質である限り、特に限定されない。ｒｓＣＤ１４（１−２８５）及びｒｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃの調製法は、ＷＯ０１／７２９９３号公報に記載されている。
また、サンドイッチ免疫測定法において、さらに別法として第二の特異結合を利用して測定することもできる。抗体−抗原−抗体−第二の特異結合物質の複合体若しくは抗体−抗原−抗体−第二の特異結合物質−第二の特異結合物質の特異結合パートナー（以下、第二の特異結合パートナーと記載することがある）の複合体を形成させて測定する方法である。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットにおいては、「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」−「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」−「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原に結合する第二の結合物質」−第二の特異結合物質の複合体を形成させること、「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」−「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」−「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原に結合する第二の結合物質」−第二の特異結合物質−第二の特異結合パートナーの複合体を形成させること、若しくは、「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原に結合する第二の結合物質」−「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」−「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」−第二の特異結合物質−第二の特異結合パートナーの複合体を形成させることにより測定する。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットの第二の特異結合を利用した構成としては、例えば、第二の特異結合物質のパートナーが、「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」または「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原に結合する第二の結合物質」である場合、標識した第二の特異結合物質を、さらに含むことである。第二の特異結合物質としては、上記の第二の特異結合物質のパートナーに対する抗体が挙げられる。
また、第二の特異結合物質のパートナーが、第二の特異結合パートナーである場合、「第二の特異結合物質が結合した配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「第二の特異結合物質が結合した本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原に結合する標識した第二の結合物質、及び第二の特異結合パートナーが結合した不溶性担体を含むこと、あるいは、配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する標識した抗体若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製した標識したモノクローナル抗体」、「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」に結合する第二の特異結合物質が結合した第二の結合物質、及び第二の特異結合パートナーが結合した不溶性担体を含む。
第二の特異結合物質−第二の特異結合パートナーの組み合わせとしては、抗原とその抗体、リガンドとそのレセプター、糖鎖含有物質とレクチン、ビオチンとアビジン若しくはストレプトアビジン等が挙げられる。
さらに、上記を含めて、サンドイッチ免疫測定法において、抗体に対する抗体、すなわち、抗イムノグロブリン抗体を利用して、抗体−抗原−抗体−抗イムノグロブリン抗体の複合体を形成させて測定する方法、また、抗イムノグロブリン抗体及び第二の特異結合を利用して、抗イムノグロブリン抗体−抗体−抗原−抗体−第二の特異結合物質−第二の特異結合パートナー等を形成させて測定する方法が例示される。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットにおいては、「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」−「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」−「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原に結合する第二の結合物質」−抗イムノグロブリン抗体の複合体を形成させること、「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」−「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」−「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原に結合する第二の結合物質」−抗イムノグロブリン抗体の複合体を形成させること、若しくは抗イムノグロブリン抗体−「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」−「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」−「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原に結合する第二の結合物質」−第二の特異結合物質−第二の特異結合パートナーを形成させること、若しくは抗イムノグロブリン抗体−「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原に結合する第二の結合物質」−「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」−「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」−第二の特異結合物質−第二の特異結合パートナーを形成させること等により測定する。
いずれのサンドイッチ免疫測定法にしても、「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」−「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」−「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原に結合する第二の結合物質」を含む複合体を形成させることにより測定する測定法であれば、第二の特異結合を利用して、固相、標識物質等を作製しても、本発明の測定法に含まれる。
すなわち、いずれのサンドイッチ免疫測定法にしても、サンドイッチ免疫測定系のキットとして、「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」を含む限り、本発明のキットに含まれる。同様に、上記ａ）〜ｄ）のいずれかの抗体を含む限り、本発明のキットに含まれる。（以下、「「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」を含む限り、」との記載も同様である。）
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットに用いる不溶性担体は、ビーズ、ラテックス粒子、磁性粒子、プレート、チューブまたはメンブレン等を用いればよい。ビーズ、プレートまたはチューブは、その材料としてポリスチレン、ナイロン、ガラス、シリコンラバー、ステンレス、プラスチック等が挙げられる。メンブレンは、セルロース、セルロース誘導体、ニトロセルロース、多孔性合成ポリマー、グラスファイバー、布、不織布、濾紙等が挙げられる。形状としては、ビーズ、ラテックス粒子または磁性粒子等は球形として用いることができる。保存時のスペースの確保の点で有利である。プレートまたはチューブはウエル形として用いることができる。市販の自動化測定器、プレートリーダー等に対応可能な点で有利である。また、メンブレンは後述するイムノクロマト法、フロースルー法に用いることができる。
配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体、第二の結合物質、第二の特異結合物質若しくはそのパートナー、または抗イムノグロブリン抗体の不溶性担体への結合は熱吸着法、化学結合法等により行うことができる。
また、不溶性担体に上記物質が結合していない非吸着面に対して、測定系に影響しない物質でブロッキング処理することが好ましい。測定系の特異性若しくは感度をあげることができるからである。測定系に影響しない物質とはＢＳＡ、カゼイン等の蛋白質及びTween２０、ＮＰ-４０等の界面活性剤等が例示される。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットに用いる標識は、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、オキシダーゼ及びウリカーゼ等の酵素、アクリジニウム若しくはその誘導体、またはエクオリン若しくはその改変体等の化学発光物質、ＦＩＴＣまたはユウロピウム（Ｅｕ）若しくはサマリウム（Ｓｍ）等のランタノイド等の蛍光物質、色素、金コロイド、着色ラテックス、あるいはアイソトープを用いればよい。
例えば酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合は、発色基質として３，３’，５，５’−テトラベンジジンまたは１，２−フェニレンジアミン等が、アルカリフォスファターゼを用いる場合は、発色基質として４−ニトロフェニルフォスフェート等が、β-D-ガラクトシダーゼを用いる場合は、発色基質として２−ニトロフェニル・β-D-ガラクトシド等が例示される。
配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体、第二の結合物質、第二の特異結合物質若しくはそのパートナー、または抗イムノグロブリン抗体への酵素標識は、二段階グルタルアルデヒド法、過ヨーソ酸法、マレイミド法、ピリジル・ジスルフィド法等により行うことができる。
酵素以外の標識についても熱吸着法、化学結合法等の公知の技術を利用して行うことができる。
酵素標識は、上記に例示される様な発色基質を用いれば、通常の吸光度測定系を用いて測定でき、また感度も比較的高く好ましい。
化学発光物質、蛍光物質、着色標識若しくはアイソトープを標識として用いる場合は、その標識に応じた測定機器により測定できる。また、Ｅｕ、例えばクリプテート（Ｅｕ３＋ クリプテート）等の蛍光物質を用いる場合は、第二の標識としてＸＬ６６５等のアロフィコシアニン誘導体を用いて、蛍光共鳴エネルギー転移を測定することもできる。
また、簡易な測定キット、例えば後述するイムノクロマト法、フロースルー法を利用したキットに用いる標識は、色素、金コロイド若しくは着色ラテックスが視覚的にも観察可能であるので好ましい。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットは、サンドイッチ免疫測定法により測定することを特徴とし、配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体を含むものである。サンドイッチ免疫測定法は上記した通り公知の技術を利用することができ、上記の具体的な説明の他、サンドイッチ免疫測定法を特徴としたキットであれば、「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」を含む限り、本発明のサンドイッチ免疫測定系キットに含まれ、特に限定されない。すなわち、「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」及びサンドイッチ免疫測定法に必要な試薬が含まれていれば良く、また測定原理に基づく測定結果を阻害しない限り、含まれるのは限定されない。
例えば、任意の構成要素として、検体若しくは標識抗体等の緩衝液若しくは希釈剤、標識抗体に酵素が使われる場合の酵素に適した発色基質（上記参照）、ブロッキング剤、反応停止剤または洗浄剤等が例示される。希釈剤は、特に限定はないが、検体に含まれる物質を含む希釈剤が好ましい。検体が血清であり、その血清を入手するための採血をＥＤＴＡやクエン酸存在下で行われた場合、希釈剤としても同量のＥＤＴＡやクエン酸が存在することが好ましい。例えば、希釈剤中にＥＤＴＡを０．２〜１ｍｇ／ｍｌ含むことが好ましい。
また標準物質も例示される。標準物質は「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」、「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」の類似物質が挙げられる。特に標準物質として、本発明の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントが好ましい。
また、本発明のサンドイッチ免疫測定系キットは、サンドイッチ免疫測定法を測定原理とするイムノクロマト法またはフロースルー法を利用したキットも含まれる。さらに、本発明のサンドイッチ免疫測定系キットは、標識の信号を電気化学的に測定するＭＥＤＩＡ法（特開平５−２６４５５２）による測定、マイクロチップを使用したイムノアッセイ法（「バイオサイエンスとインダストリー」第61巻 449−454頁2003年）、時間分解蛍光免疫測定法「アナリティカル バイオケミストリー（Analytical biochemistry）」（米国）、1984年、第137巻、p.335-343）及びホモジーニアス免疫測定法による測定にも利用可能である。まこれらの原理を用いた測定キットも、サンドイッチ免疫測定法により測定することを特徴とし、「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」を含む限り、本発明のサンドイッチ免疫測定系キットに含まれる。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットは、「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」を含むことを特徴としており、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を特異的に測定できる。本発明のサンドイッチ免疫測定系キットに使用する検体は、水性の検体が好ましい。特に血液、血清若しくは血漿等の血液成分、尿、その他の体液、細胞培養上清、またはカラム溶出液等が好ましく、これらに含まれる本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原の測定に有用である。しかし、ヒトの血液成分以外からの検体、例えばヒト尿若しくはその他の体液、ヒト以外の種からの血液成分、尿若しくはその他の体液、細胞培養上清、またはカラム溶出液等の検体では、「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」だけではなく、「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」類似の蛋白質、ポリペプチド等も測定することが可能である。「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」を含む限り、上記の「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」類似の蛋白質、ポリペプチド等を測定するためのキットも、本発明のサンドイッチ免疫測定系キットに含まれる。
また、以上の説明において、「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」の代わりに「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体の断片であるＦab、Ｆab' 、若しくは（Ｆab' ）２」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体の断片であるＦab、Ｆab' 、若しくは（Ｆab' ）２」を用いてもよい。
上記には、サンドイッチ免疫測定系キットの一例として、ａ）の「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」を使用した例を具体的に示したが、ｂ）の「配列番号２に記載のアミノ酸配列から選択される連続した８〜１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体」、ｃ）の「配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体」若しくはｄ）若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製した抗体」、またはこれらの抗体の断片であるＦab、Ｆab' 、若しくは（Ｆab'）２を用いることもできる。
また、測定する原理の例として、サンドイッチ免疫測定法の他にも、凝集法、固相結合法及び溶液反応法が挙げられ、少なくとも一つの「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片を、好ましくは、本発明の抗体若しくは該抗体の断片を含むこれらの方法に応じたそれぞれのキットを構成することができる。特に第二の結合物質を用いず、単独の抗体を用いてキットを構成する場合は、「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片として、ヒト血中の全長可溶型ＣＤ１４蛋白質（以下、ヒト高分子量ＣＤ１４と記載することがある）若しくはヒトＣＤ１４のＮ末端１位〜３５６位のアミノ酸を有する可溶性ポリペプチド（以下、ｒｓＣＤ１４（１−３５６）と記載）等の組換え型高分子量ＣＤ１４とは実質的に結合しない抗体を用いることが好ましい。
凝集法は、抗体を粒子の表面に結合させて、抗原が存在することにより粒子の凝集を生じさせて、該粒子の凝集の程度を指標として抗原を特異的に定性または定量する。
本発明の凝集法免疫測定系キットにおいては、例えば「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」−「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」を形成させ、凝集させることにより測定する。
本発明の凝集系免疫測定系キットの構成としては、本発明の抗体がその表面に結合した粒子を含む。
粒子としては、ラテックス、赤血球（例えば羊赤血球）、ゼラチン、マイクロビーズまたはカーボン粒子等、一般に用いられている粒子を使用することができる。
固相結合法は、固相上で抗体と抗原の複合体を形成することにより測定する方法である。抗原を含む検体を不溶性担体（すなわち固相、以下同）に吸着させる。次に標識抗体を添加し、反応させ、標識物に基づいて固相に結合した複合体の量を特異的に定性または定量する。
また、競合法として、抗原類似物質を不溶性担体に吸着させて、標識抗体と検体中の抗原との反応を競合させることにより、抗原類似物質と特異的に結合した標識抗体の量を測定する方法がある。さらに競合法の別法として、抗体を不溶性担体に吸着させて、検体中の抗原との反応を、標識抗原類似物質により競合させ、抗体と特異的に結合した標識抗原類似物質の量を測定する方法がある。
本発明の固相結合法免疫測定系キットにおいては、「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」−「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」の複合体、「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」−標識した「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」（若しくはその類似物質）複合体または「標識した配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製した標識したモノクローナル抗体」−「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」（若しくはその類似物質）複合体を形成させることにより測定する。
不溶性担体、「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」の類似物質、標識及び吸着させる試薬については、サンドイッチ免疫測定系キットの説明に記載した通りである。
溶液反応法は、抗原と標識抗体を液相中で反応させ、その後抗体を用いた凝集沈降法若しくは物理化学的な手法によって、抗原、抗体と抗原抗体複合体とを分離し、「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」を特異的に定性または定量する方法である。
また、以上の説明において、「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」の代わりに、「配列番号２に記載のアミノ酸配列から選択される連続した８〜１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体」、「配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体」、「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を抗原として作製した抗体」若しくは「本発明の第三の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製した抗体」あるいは「これらの抗体の断片であるＦab、Ｆab' 、若しくは（Ｆab' ）２」を用いてもよい。
以上、本発明の測定キットの例を測定する原理に基づいて記載したが、本発明のキットはこれらの原理に限定されない。少なくとも一つの「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片を含み、検体に含まれる「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」を直接測定することができる限り、本発明の測定キットに含まれる。免疫測定法の原理については、公知の技術を利用することができる。上記した「超高感度酵素免疫測定法」石川栄治著、学会出版センター（1993年）、「免疫測定法の新しい活用事例と診断試薬・治療薬開発への応用」免疫測定法開発研究会、経営教育出版、酵素免疫測定法（第３版）石川栄治等編、医学書院（1987年）も参考にできる。
本発明のキットで特異的に測定できる「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」は、敗血症患者において増加する。このため、「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」を測定することは敗血症の診断の指標となり、本発明のキットは、敗血症の診断に有用である。
「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」若しくは「本発明の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製したモノクローナル抗体」は、該ペプチド若しくは「本発明の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント」に対する親和性として表した場合の解離定数（ＫＤ）は、１０-7Ｍ未満が好ましい。より好ましくは、１０-8Ｍ以下、さらに好ましくは１０-9Ｍ以下である抗体である。
「配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」の作製において、抗原とするペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸残基の連続した８個以上のアミノ酸を含むペプチドであり、好ましくは、連続した１０個以上、より好ましくは連続した１２個以上、特に好ましくは連続した１６個のアミノ酸を含むペプチドである。さらに、ペプチドは配列番号２のいずれかに記載のアミノ酸残基の連続した８個以上のアミノ酸を含めば、その他のアミノ酸配列に限定はないが、好ましくはペプチドすべてのアミノ酸配列が配列番号２のいずれかに記載のアミノ酸配列由来であることである。
好ましくは配列番号２に記載のアミノ酸残基の連続した８個以上のアミノ酸を含むペプチドを抗原として作製した抗体である。好ましくは連続した１０個以上、より好ましくは連続した１２個以上、特に好ましくは連続した１６個のアミノ酸を含むペプチドを抗原として作製した抗体である。
「配列番号２に記載のアミノ酸配列から選択される連続した８〜１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体」の作製において、抗原とするペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列から選択される連続した８〜１６アミノ酸残基からなるペプチドであれば、アミノ酸残基数は特に限定されない。好ましくは、連続した１０個以上、より好ましくは連続した１２個以上、特に好ましくは連続した１６個のアミノ酸からなるペプチドを抗原として作製される抗体である。すなわち好ましくは、「配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体」である。
また「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」は、高分子量ＣＤ１４と分子量が異なり、高分子量ＣＤ１４よりもアミノ酸配列が短い。このため、血液中での「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」の構造が、高分子量ＣＤ１４と異なり、抗体に対する反応性が異なると考えられ、本発明の第五の態様の測定キットに含まれる「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」に特異的に結合する抗体の好適例である上記ａ）〜ｄ）の抗体（以降、単に、「上記ａ）〜ｄ）の抗体」と記載することがある）は「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」により強く結合すること、すなわち親和性が高いことが考えられる。
上記ａ）〜ｄ）の抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。本発明の抗体が由来する動物種は特に限定されない。抗体作製の容易さの面では、ウサギ、ヤギ等が好ましい。また分子種は特に限定されない。いずれのクラス、サブクラス及びアイソタイプに分類される免疫グロブリンであってもよい。
免疫原とするペプチドの作製方法は、一般的に使用されるペプチド合成機（ペプチドシンセサイザー４３３Ａ型、パーキンーエルマージャパン）等を用いた方法、遺伝子組換え法（東京大学医科学研究所 制癌研究部編、新細胞工学実験プロトコール、秀潤社）等が挙げられる。
例えば、配列番号２に記載のアミノ酸残基の連続した８個以上のアミノ酸からなるペプチドは４３３Ａ型ペプチド合成機を用いてＦｍｏｃ法により合成でき、ＴＦＡによる脱保護、樹脂からの切断の後、Ｃ１８ ＨＰＬＣカラム（Capcell−pak、資生堂）を用いて精製し、目的のペプチドを調製することができる。
抗原が蛋白質である場合は、そのまま免疫原とすることができるが、８〜３０アミノ酸残基以下のペプチドの場合は分子量が小さいため、通常免疫原性を持たないことがある。この場合、キャリアと結合させて若しくはMultiple Antigen Peptide（ＭＡＰ）法を用いてＭＡＰペプチドを調製して、免疫原性を有する分子量を有させ、免疫原とすればよい。
上記ペプチドと結合させるキャリアは、キャリア蛋白、ポリマーが挙げられる。キャリア蛋白は牛血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、サイログロブリンまたはオボアルブミン等の異種蛋白を用いればよい。これらキャリア蛋白は、ペプチド若しくはキャリア蛋白のアミノ酸に含まれる側鎖の官能基を利用して、またはマレイミド基、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）基若しくはアルデヒド基を導入して、上記ペプチドと結合させればよい。ポリマーはマンナン若しくはキトサン等の糖類、ポリビニルピロリドン（ＰＶＡ）が挙げられる。これらポリマーは上記ペプチドと、吸着若しくは上記のような化学結合により結合させればよい。
また抗原とする本発明の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント作製方法は、本発明の第二の態様及び第三の態様の説明に記載した通りである。該フラグメントを抗原とする場合は、そのまま免疫原としてもよいし、上記同様キャリア等と結合させて免疫原としてもよい。
本発明の抗体は公知技術を用いることにより作製できる（例えば、免疫実験操作法、日本免疫学会編、日本免疫学会発行、参照）。例えばポリクローナル抗体は下記の方法で作製できる。
上記のとおり調製した免疫原２０〜１０００μｇをフロインド完全アジュバント、ＲＩＢＩアジュバント、ＡＬＵＭ等のアジュバントと混合し、各種動物に免疫することができる。各種動物としては馬、羊、ヤギ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス等が使用可能である。免疫方法としては筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、リンパ節投与等の方法が使用可能であり、初回投与後１〜４週間間隔でフロインド不完全アジュバント、ＲＩＢＩアジュバント、ＡＬＵＭ等のアジュバントと混合した免疫原を同様に投与することにより、あるいは免疫原を直接静脈内に投与することにより追加免疫を行うことができる。抗血清は、免疫した動物から通常の採血方法、例えば頚動脈、耳静脈、心臓、足の静脈等より血液を採取し、遠心等により血清を分離することにより調製することができる。得られた抗血清は硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等を添加する塩析法によりγグロブリン分画を沈殿させ、適当な緩衝液に透析後、プロテインＡ、プロテインＧ等のγグロブリンを特異的に精製することができるアフィニティーマトリクスを用いて目的のペプチドに対するＩｇＧ画分の精製ポリクローナル抗体を調製することができる。また、上記抗原と特異的に結合する抗体を選択することにより、特異精製することができる。
また、モノクローナル抗体は下記の方法で作製できる。
免疫した哺乳動物の免疫細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマの中から、上記ペプチドと特異的に結合する抗体を産生するクローンを選択することにより、本発明の抗体を作製することができる。好ましくは、５３位から６８位までのアミノ酸残基の連続した１０個以上からなるペプチドを免疫原とすることである。より好ましくは連続した１２個以上、特に好ましくは連続した１６個のアミノ酸からなるペプチドを免疫原とすることである。
免疫する哺乳動物は、特に限定されないが、細胞融合に使用するミエローマ細胞との適合性を考慮して選択することが好ましく、マウス、ラットまたはハムスター等が好ましい。ミエローマ細胞は、公知の種々の細胞が使用可能である。これにはＰ３、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／Ｏ、ＮＳ−１、ＹＢ２／０及びＹ３−Ａｇ１，２，３等の骨髄種細胞が含まれる。
免疫は公知の方法により行うことができる。例えば、抗原を腹腔内、皮下、静脈内またはフットパッド内に投与して行う。この抗原の投与はアジュバントを併用してもよく、また複数回投与することが好ましい。免疫細胞は抗原の最終投与の数日後、例えば３日後に、摘出した脾細胞またはリンパ節由来の細胞が好ましい。免疫細胞とミエローマ細胞との融合は、Milsteinなどの方法（Methods in Enzymol., 73巻 3頁）等の公知の方法を用いて行うことができる。例えば、融合剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用する方法または電気融合法等が挙げられる。
免疫細胞とミエローマ細胞との混合比は、それらが融合できる比率であれば限定されないが、免疫細胞に対し、ミエローマ細胞を１／１０量ないし等量を使用することが好ましい。ＰＥＧ（平均分子量１，０００〜４，０００）を使用して細胞融合を行う方法ではＰＥＧ濃度は特に限定されないが５０％で行うことが好ましい。また、融合効率促進剤としてジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）等の補助剤を添加してもよい。融合は３７℃に加温したＰＥＧ溶液を混合した細胞に添加することにより開始し、１〜５分間反応後、培地を添加することにより終了する。この融合により形成されたハイブリドーマをヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを含む培地（ＨＡＴ培地）等の選択培地で１日〜７日間培養し、未融合細胞と分離する。
得られたハイブリドーマをその産生する抗体により更に選択する。選択したハイブリドーマを公知の限界希釈法に従って単一クローン化し、単一クローン性抗体産生ハイブリドーマとして樹立する。ハイブリドーマの産生する抗体の活性を検出する方法は公知の方法を使用することができる。例えばＥＬＩＳＡ法、凝集反応法、ラジオイムノアッセイ法が挙げられる。樹立したハイブリドーマを公知の方法で培養し、その培養上清よりモノクローナル抗体を得ることができる。また、ハイブリドーマをこれと適合性を有する哺乳動物に投与して増殖し、その腹水より得ることができる。抗体の精製は、塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマト法またはアフィニティークロマト法等の公知の精製手段を用いて行うことができる。
また、本発明の第四の態様の診断方法の項に記載した通り、本発明の可溶性ＣＤ１４抗原及び高分子量ＣＤ１４の安定性が影響し、測定値が変動することが想定される。キットの性能を高めるため、可溶性ＣＤ１４抗原に特異性が高く、保存中に変化し測定値が変動する要因となる物質との反応性の低い抗体が使用することがより好ましい。このような変動を生じないキットを構成するための抗体をスクリーニングして得ることができる。
本発明の第六の態様は、少なくとも一つの「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」に特異的に結合する抗体若しくは該抗体の断片を、上記「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」に特異的に結合させることを特徴とする、上記「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」の免疫学的な測定方法である。
本発明の第六の態様の測定方法は、ヒト高分子量ＣＤ１４を検出せず、「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」を測定するために、少なくとも一つの「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」に特異的に結合する抗体を使用し、検体に含まれる「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」を直接測定する「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」の免疫学的な測定方法である。好ましくは、以下のａ）〜ｄ）のいずれかの抗体または該抗体の断片を用いることを特徴とする測定方法である。
ａ）配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列から選択される連続した８〜１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体、若しくは、
ｃ）配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体。若しくは、
ｄ）本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント若しくは本発明の第三の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントと特異的に結合する抗体。
より好ましくは、上記ａ）、ｃ）若しくはｄ）の抗体または該抗体の断片を用いることを特徴とする測定方法である。さらに好ましくは、ｄ）の抗体若しくは該抗体の断片を含む測定キットである。また、以上の説明において、抗体の断片とは、該モノクローナル抗体のＦab、Ｆab' 、若しくはＦ（ab' ）2 である。
また、好ましくは、「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」に結合する第二の結合物質を用いて、上記ａ）〜ｄ）のいずれかの抗体若しくは該抗体の断片と該第二の結合物質とのサンドイッチ免疫測定法により、「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」を測定する「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」の測定方法である。
上記ａ）〜ｄ）のいずれかの抗体を固相抗体、若しくは標識抗体等として使用することができる。また、第二の特異結合、抗イムノグロブリン抗体を利用した測定方法も含まれる。この場合、上記ａ）〜ｄ）のいずれかの抗体は遊離の抗体、第二の特異結合物質若しくは第二の特異結合パートナーに結合した抗体等としても使用することができる。
本発明の測定方法は、サンドイッチ免疫測定法の非競合法、または競合法が可能であり、またイムノクロマト法、またはフロースルー法での測定も含まれる。
また、本発明の測定方法の原理は、サンドイッチ免疫測定法に限定されず、その他の例としては凝集法、固相結合法及び溶液反応法等が挙げられる。
詳細な測定方法は、好ましい例は、本発明の第五の態様のキットの項に記載した通りである。
本発明の第七の態様は、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合する抗体である。ただし、本願優先権主張日後の公開である国際公開ＷＯ２００４／４４００５号の実施例に記載の下記ａ）〜ｄ）の抗体も含まれ、一部重複する。このため、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントに特異的に結合する抗体は、下記ａ）〜ｄ）の抗体の一部を含んでいてもよい。また、本発明の第二の態様の抗体と下記ａ）〜ｄ）の抗体と明確に区別するためには、本発明の第二の態様の抗体から、下記ａ）〜ｄ）の抗体を除けばよい。
ａ）配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体。
ｂ）配列番号４若しくは配列番号５に記載のアミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製されるポリクローナル抗体。
ｃ）Ｆ１０３１−８−３抗体。及び、
ｄ）Ｆ１１０６−１３−３抗体。
なお、国際公開ＷＯ２００４／４４００５号には、配列番号２、配列番号４若しくは配列番号５に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体、配列番号６に記載のアミノ酸配列から選択される連続した８〜３０アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体も説明されており、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントに特異的に結合する抗体は、これらの抗体の一部を含んでいてもよく、明確に区別するためには、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントに特異的に結合する抗体から、これらの抗体を除けばよい。
本発明の第七の態様の「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原に特異的に結合する抗体」は、ヒト血中の全長可溶型ＣＤ１４蛋白質若しくはｒｓＣＤ１４（１−３５６）に実質的に結合せず、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントに対して特異的に結合する抗体であることが好ましい。また、モノクローナル抗体である抗体が好ましい。
また、本発明の抗体は、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を抗原として作製することができる。
本発明の第七の態様の抗体を用いて、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を測定することができ、本発明の第五の態様の「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット」を構成することができる。
本発明の第八の態様は、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントに特異的に結合する抗体である。ただし、本願優先権主張日後の公開である国際公開ＷＯ２００４／４４００５号の実施例に記載の下記ａ）〜ｄ）の抗体も含まれ、一部重複する。このため、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントに特異的に結合する抗体は、下記ａ）〜ｄ）の抗体の一部を含んでいてもよい。また、本発明の第二の態様の抗体と下記ａ）〜ｄ）の抗体と明確に区別するためには、本発明の第二の態様の抗体から、下記ａ）〜ｄ）の抗体を除けばよい。
ａ）配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体。
ｂ）配列番号４若しくは配列番号５に記載のアミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製されるポリクローナル抗体。
ｃ）Ｆ１０３１−８−３抗体。及び、
ｄ）Ｆ１１０６−１３−３抗体。
なお、国際公開ＷＯ２００４／４４００５号には、配列番号２、配列番号４若しくは配列番号５に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体、配列番号６に記載のアミノ酸配列から選択される連続した８〜３０アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体も説明されており、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントに特異的に結合する抗体は、これらの抗体の一部を含んでいてもよく、明確に区別するためには、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントに特異的に結合する抗体から、これらの抗体を除けばよい。
本発明の第八の態様の「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントに特異的に結合する抗体」は、ヒト血中の全長可溶型ＣＤ１４蛋白質若しくはｒｓＣＤ１４（１−３５６）に実質的に結合せず、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントに対して特異的に結合する抗体であることが好ましい。また、モノクローナル抗体である抗体が好ましい。
また、本発明の抗体は、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製することができる。
特に好ましい抗体は、Ｆ１２３７−３−４抗体である。Ｆ１２３７−３−４抗体を産生するハイブリドーマは、平成１７年４月２７日付（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０３３０）で日本国茨城県つくば市東1-1-1 中央第6 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに国際寄託した。
本発明の第八の態様の抗体を用いて、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を測定することができ、本発明の第五の態様の「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット」を構成することができる。
本発明の第五の態様の「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット」は、高分子量ＣＤ１４を測定しない。このことが、ヒト血中の全長可溶型ＣＤ１４蛋白質に実質的に結合しない抗体が好ましい理由である。また、測定キットに用いることが、モノクローナル抗体が好ましい理由である。さらに、ヒト血中の全長可溶型ＣＤ１４蛋白質若しくはｒｓＣＤ１４（１−３５６）とは実質的に結合しない抗体は、サンドイッチ免疫測定法ではなく、第二の結合物質を用いず、単独の抗体を用いることができ、特に有用である。
上記した通り、国際公開ＷＯ２００４／４４００５号には、配列番号２、配列番号４若しくは配列番号５に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体、配列番号６に記載のアミノ酸配列から選択される連続した８〜３０アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体、並びに抗ＣＤ１４抗体であるＦ１０３１−８−３抗体及びＦ１１０６−１３−３抗体が、説明されている。これらの有用性は、敗血症の診断に有用な低分子量ＣＤ１４測定キットに使用できることである。ただし、国際公開ＷＯ２００４／４４００５号に記載の抗体は、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原との直接的な関係は証明されておらず、当該ペプチド若しくはＣＤ１４を抗原として作成したところ、敗血症の診断に有用な低分子量ＣＤ１４測定キットに有用であったとの発明である。
一方、本発明の抗体は、本発明の第五の態様の「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット」に使用することができる。また、「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント」は、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原に免疫学的性質が類似しており、該フラグメントに結合する抗体（すなわち本発明の抗体）でなければ、「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」の測定キットに使用することができない。
今までに、公知である抗体で、「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」の測定キットに使用可能である抗体は、国際公開ＷＯ２００４／４４００５号に記載の上記の抗体のみであり、また、「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント」に結合する抗体も上記の抗体のみであり、種々の抗ＣＤ１４抗体は「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント」に結合しないことも明らかとなっている。
すなわち、本発明の抗体は、「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原の測定キット」に使用できる抗体を網羅的に発明し、開示することになる。さらに、「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント」を抗原として作成した抗体は、「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」とは免疫学的な反応性が高く、特に有用であると考えられる。
本発明の第九の態様は、本発明の第三の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントに特異的に結合する抗体である。
本発明の第九の態様の抗体は、本発明の第三の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを抗原として作製することができる。
また、本発明の第九の態様の抗体の好ましい例示は、本発明の第八の態様の項の記載と同じであり、有用性、その他の記載も同様である。
本発明の第十の態様は、下記の工程を含む、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原の測定に有用な抗体のスクリーニング方法である。
１）配列番号３に記載のアミノ酸配列から選択される連続した６〜２０個のいずれかの個数のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体を用意する工程、
２）ＣＤ１４を含む測定対象液を用意する工程、
３）１）で用意した抗体、若しくは、２）で用意した測定対象液を用いて、免疫測定系を構成する工程、
４）３）で構成した免疫測定系により、測定対象液中の１）で用意した抗体と特異的に結合する物質を測定する工程、及び
５）４）で得た測定結果により本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原の測定に有用な抗体を評価し、選択する工程。
本発明の第十の態様のスクリーニング方法は、敗血症の診断に有用なマーカーとなり得る本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原の測定に有用な抗体のスクリーニング方法である。すなわち、敗血症の診断に有用なマーカーとなり得る本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原の測定に有用な抗体を選別する方法である。また、本発明の第五の態様のキットに使用可能な抗体を選別する方法である。
本発明の第十の態様のスクリーニング方法は、上記１）の工程で用意する「配列番号３に記載のアミノ酸配列から選択される連続した６〜２０個のいずれかの個数のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」をスクリーニング対象検体とすることを特に特徴とする。用意するスクリーニング対象検体は「配列番号３に記載のアミノ酸配列から選択される連続した６〜２０個のいずれかの個数のアミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」であれば特に特に限定されない。また、抗原との間で抗原抗体反応を生じること機能を有していれば、該抗体のフラグメントをスクリーニング対象検体としてもよい。（以下の抗体に関する説明には、抗体のフラグメントに関する説明も含む。）
２）の測定対象液は、ＣＤ１４を含む液であれば特に限定されない。好ましくは高分子量ＣＤ１４を少なくとも含む液である。
３）で構成する免疫測定系は、スクリーニング対象検体である抗体が、測定対象液に含まれるＣＤ１４と特異的に反応するかどうかを測定することができればよい。例えば抗原固相化法、サンドイッチ法若しくは生体分子間相互作用解析法等が挙げられる。ただし、本発明の第五の態様若しくは第六の態様で説明した免疫学的測定法の系のいずれでもよく、特に限定されない。
４）の工程は、３）の工程で構成した免疫測定法に準じ、測定対象液を対象として、１）で用意した抗体と特異的に結合する物質を測定すればよい。
５）の工程は、４）の工程で測定した結果により、スクリーニング対象検体である抗体が、敗血症の診断に有用な免疫測定法に用いるために有用であるかどうかを評価し、有用であれば該抗体を選択する工程である。特に指標は限定されるものではない。
上記の通り、本発明の第六の態様のスクリーニング方法は、上記１）の工程で用意する「配列番号３に記載のアミノ酸配列から選択される連続した６〜２０アミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」をスクリーニング対象検体とすることを特に特徴とする方法であり、その他の工程について必要以上に限定されるものではない。
上記１）の工程で用意する抗体は、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうちＮ末端１位から３１４位までのアミノ酸配列から選択される連続した６〜２０アミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体、配列番号３に記載のアミノ酸配列から選択される連続した８〜３０アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体、若しくは配列番号３に記載のアミノ酸配列のうちＮ末端１位から３１４位までのアミノ酸配列から選択される連続した８〜３０アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体であることが好ましい。
なお、上記１）の工程において「配列番号３に記載のアミノ酸配列から選択される連続した６〜２０アミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体」を用意する代わりに、以下の、<1>〜<4>の抗体を用意して用いても良い。<1>ＣＤ１４全長配列に基づき定法によりペプチドを合成し、免疫抗原を調製して抗体を作製する。<2>血清中の精製可溶性ＣＤ１４を精製し、これを免疫原として抗体を作製する。<3>ＣＯＳ細胞や大腸菌を用いて組換えＣＤ１４蛋白質を調製し、これを免疫原として抗体を作製する。<4>調製した各種ＣＤ１４抗原を熱変性やＤＮＰ化等により処理し、これを免疫原として抗体を作製する。
本発明の３）で構成する免疫測定法が抗原固相化法である場合の例についてさらに説明する。
この場合、上記１）の工程で用意した抗体に対する標識抗体、例えば標識抗イムノグロブリン抗体、をさらに用意する
上記２）の工程では、用意する測定対象液は検体が正常人の体液若しくはヒト高分子量ＣＤ１４の標品が好ましい。ヒト高分子量ＣＤ１４の標品は、例えば正常人の体液の３Ｃ１０抗体アフィニティーカラム吸着画分等を用意すればよい。
そして、不溶性担体上に、例えば「測定対象液中の高分子量ＣＤ１４」−「１）の工程で用意した抗体」−「標識抗イムノグロブリン抗体」の複合体を形成させるように免疫測定系を構成すればよく、「１）の工程で用意した抗体」の「測定対象液中の高分子量ＣＤ１４」に対する特異的な結合性を標識を通して測定する。例えば、３）の工程において、測定対象液を不溶性担体に結合させて構成し、４）の工程において、３）で構成したドットブロッティング法による測定系に１）で用意した抗体と上記「標識抗イムノグロブリン抗体」を順に反応させればよい。その後標識の強度により、上記複合体の形成度合い、すなわち測定対象液中の１）で用意した抗体と特異的に結合する物質を測定すればよい。
５）の工程においては、例えば、標識の強度が弱い若しくは強度を示さない１）で用意した抗体は、正常人の体液若しくはヒト高分子量ＣＤ１４の標品中の高分子量ＣＤ１４と特異的な結合性が弱い若しくはないと評価し、敗血症の診断に有用な免疫測定法に用いるためには有用である抗体と選択すればよい。例えば血中の高分子量ＣＤ１４と特異的な結合性が強いと評価できる抗体を用いて、ヒト体液中の該抗体と特異的に結合する物質を測定する場合に測定される主な蛋白質は高分子量ＣＤ１４となる。この場合は、高分子量ＣＤ１４よりも微量の蛋白質である本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原を測定する場合には、高分子量ＣＤ１４と特異的には結合しない抗体を選択すればよいことになる。
抗原固相化法において、特に酵素で標識する場合を、抗原固相ＥＩＡ法となり、上記不溶性担体に、メンブレンを使用する場合、ドットブロッティング法となる。
本発明の３）で構成する免疫測定法がサンドイッチ測定法である場合の例についてさらに説明する。
サンドイッチ免疫測定法の説明については、本発明の第五の態様のキット若しくは本発明の第五の測定法の項に記載した通りである。
この場合、もう一つの配列番号３に記載のアミノ酸配列から選択される連続した６〜２０アミノ酸残基からなるペプチドと特異的に結合する抗体若しくは抗ＣＤ１４抗体（第二の抗体と記載することがある）を用意する。
上記２）の工程で用意する測定対象液は、正常人の体液と敗血症患者の体液が好ましい。ここで、両体液の由来は同じであることがより好ましい。すなわち、例えば正常人の血液サンプルと敗血症患者の血液サンプルであること、若しくは正常人の尿サンプルと敗血症患者の尿サンプルであること、の様に両体液の由来は同じであることがより好ましい。さらには血液サンプルであることが好ましい。特に血清であることが好ましい。
そして、不溶性担体上に、例えば「１）の工程で用意した抗体」−「本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」−「第二の抗体」の複合体を形成させるようにサンドイッチ免疫系を構成すればよい。
例えば、３）の工程において、「１）の工程で用意した抗体」若しくは「第二の抗体」の一方を不溶性担体に結合させて、もう一方を標識して、サンドイッチ免疫系を構成する。
４）の工程において、３）で構成したサンドイッチ免疫系に測定対象液、標識した抗体を順に反応させて、測定すればよい。
５）の工程において、正常人の体液の測定結果と、敗血症患者の体液の測定結果を比較し、比較した測定結果の違いにより、敗血症の診断に有用な、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原の測定に有用な抗体を評価し、選択すればよい。
また３）で構成する免疫測定法がサンドイッチ測定法である場合は、選択する抗体は、１）で用意した抗体及び「第二の抗体」の抗体の組み合わせを選択することが好ましい。すなわち、敗血症の診断に有用なマーカーとなり得る血中蛋白質を測定するために用いる、敗血症の診断に有用なサンドイッチ免疫測定法に用いるための抗体の組み合わせをスクリーニングする方法であることが好ましい。
なお、本発明のスクリーニング方法に用いる抗体の作製は本発明の第五の態様の測定キットの説明の項に記載に準じ行うことができる。また、材料等の説明についても、該説明の項に記載した通りである。
生体分子間相互作用解析法は、特に限定されないが、表面プラズモン共鳴法が例示される。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ装置（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）を用いれば行うことができる。
本発明の第十一の態様は、下記の工程を含む、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原の測定に有用な抗体のスクリーニング方法である。
１）抗体をスクリーニング対象検体として用意する工程。
２）本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを用意する工程。
３）１）で用意した抗体を２）で用意したフラグメントと反応させ、１）で用意した抗体と２）で用意したフラグメントの特異的な結合を評価する工程。及び、
４）３）において、２）で用意したフラグメントに特異的に結合した抗体を、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原の測定に有用な抗体として、選択する工程。
本発明の第十一の態様のスクリーニング方法は、敗血症の診断に有用なマーカーとなり得る本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原の測定に有用な抗体のスクリーニング方法である。すなわち、敗血症の診断に有用なマーカーとなり得る本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原の測定に有用な抗体を選別する方法である。また、本発明の第五の態様のキットに使用可能な抗体を選別する方法である。
本発明の第十一の態様のスクリーニング方法は、特にスクリーニング対象検体である抗体を、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントに反応させて、両者が特異的な結合、すなわち抗原抗体反応を示すかどうかを評価することを特徴とする。本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、本発明の第二の態様の説明の項に記載の通り、３Ｃ１０及びＭＥＭ−１８に特異的な結合せず、配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製した抗体に特異的に結合する。これは、本発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原と同じ免疫学的な性質である。このことにより、スクリーニング対象検体である抗体と、本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントとの反応を評価することが、発明の第一の態様の可溶性ＣＤ１４抗原の測定に有用な抗体を選別することになる。
１）の工程において、用意するスクリーニング対象検体は抗体であれば特に特に限定されない。また、抗原との間で抗原抗体反応を生じること機能を有していれば、抗体のフラグメントをスクリーニング対象検体としてもよい。（以下の抗体に関する説明には、抗体のフラグメントに関する説明も含む。）
特にスクリーニングの効率を上げるためには、スクリーニング対象検体として、「配列番号３に記載のアミノ酸配列から選択される連続した６〜３５６個のいずれかの個数のアミノ酸残基からなる蛋白質と特異的に結合する抗体」を用意することが好ましい。また「配列番号３に記載の５３位〜６８位から選択される連続した少なくとも７個のアミノ酸残基を含む蛋白質と特異的に結合する抗体」を用意することがより好ましい。
２）の工程において、用意する本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントは、本発明の第二の態様の説明の項に記載した組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントであれば特に限定されない。
３）の工程において、１）で用意した抗体を２）で用意したフラグメントと反応させ、１）で用意した抗体と２）で用意したフラグメントの特異的な結合を評価する方法は、両者が特異的な結合、すなわち抗原抗体反応を示すかどうかを評価できる方法であれば、特に限定されない。抗原固相化法、サンドイッチ測定法若しくは生体分子間相互作用解析法が例示される。これらの方法については、本発明の第十の態様の説明の項に記載した通りである。第二の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法により、特異的な結合を評価すれば、サンドイッチ測定法による抗体の組み合わせを評価することができることになる。
本発明の第十二の態様は、下記の<1>〜<3>の工程
<1>下記の１）〜４）の配列を有する組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを作製する工程、
１）配列番号３に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである、または該部分配列を有するフラグメントの配列番号３の５３位〜６８位以外の領域に１〜１０個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントである、
２）Ｎ末端が配列番号３の１位〜１７位のいずれかである
３）Ｃ末端が配列番号３の１３４位〜３５６位のいずれかである、
４）所定の蛋白分解酵素の切断部位の配列が、配列番号３の５９位〜７０位の後ろに置換若しくは挿入されている
<2><1>で作製した組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを該所定の蛋白分解酵素により切断する工程、及び、
<3><2>で切断したフラグメントのＮ末側のフラグメントを回収する工程。
を含む、下記の５）〜７）の配列を有する本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントの生産方法である。
５）配列番号３に記載のアミノ酸配列の部分配列を有するフラグメントである、若しくは該部分配列を有するフラグメントの配列番号３の５３位〜６８位以外の領域に１〜１０個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換したフラグメントである、
６）Ｎ末端が配列番号３の１位〜１７位のいずれかである、及び、
７）Ｃ末端が配列番号３の５９位〜７０位のいずれかである。
本発明の第十二の態様の「本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントの生産方法」によれば、所定のアミノ酸配列を有する本発明の第二の態様の組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントを生産することができる。詳細な生産方法は、本発明の第二の態様の説明の項に記載した通りである。
例えば、所定の蛋白分解酵素がＰｒｏＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅである場合、<1>の工程の４）において切断部位の配列がＬｅｕ，Ｇｌｕ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｐｈｅ，Ｇｌｎ，Ｇｌｙ，Ｐｒｏであることが挙げられる。
また所定の蛋白分解酵素がＴｈｒｏｍｂｉｎである場合、<1>の工程の４）において切断部位の配列がＬｅｕ，Ｖａｌ，Ｐｒｏ，Ａｒｇ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒであることが挙げられる。
以下に、実施例をもって本発明を一層具体的に説明するが、これらは一例として示すものであり、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。また、以下の記載において用いる略号は当該分野において慣例として用いられる略号に基づくものである。
なお、以下の実施例に使用した正常人血清及び敗血症患者血清はProMedDx社製、Samplex社製及びSera Care Life Science社製を購入して、使用した。
（実施例１）合成ペプチドを抗原としたポリクローナル抗体の作製
１−（１）抗原とするペプチドの調製
配列番号２に記載の配列（配列番号３に記載の５３位から６８位の配列に該当）を有するペプチド（以下、Ｓ６８ペプチドと記載）を、Ｎ末端でＳＨ基を介してキャリア蛋白質と結合させるため、Ｎ末端にシステインを挿入して合成した。すなわち、ペプチド合成機ＡＢＩ４３３Ａ（アプライド）を用いて、アミノ酸配列に従ってアミノ酸カラムを並べ、Ｎ末端にシステイン用のアミノ酸カラムを設置し自動合成を行った。合成したペプチドは定法により樹脂より切り出し、エーテルで沈殿させ回収後、再度蒸留水で溶解し凍結乾燥した。得られた粗精製ペプチドは溶解後、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ（CAPCELL−ＰＡＫ、資生堂）を用いて５〜７０％のアセトニトリル濃度の直線グラジエントで溶出し、目的のペプチドを含む分画を回収した。回収した分画は凍結乾燥し、精製ペプチドとして２〜３ｍｇを得た。
１−（２）合成ペプチドを用いたペプチドキャリア抗原の調製
１−（１）で調製したペプチドを蒸留水で１０ｍｇ／ｍＬに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのマレイミド化キーホールリンペットヘモシアニン（Imject Maleimed Activated keyhole Limpet Hemocyanin（ＫＬＨ）（ＰＩＥＲＣＥ）と等量混合した。室温で２時間反応後、生理食塩水で平衡化したＮＡＰ−１０カラム（アマシャム バイオサイエンス）で脱塩し、Ｓ６８ペプチドキャリア抗原（以下、Ｓ６８ペプチド−ＫＬＨと記載）を１ｍｇ得た。以下の実施例に記載の蛋白質濃度は使用したＫＬＨ量を液量で割ったものを使用した。
１−（３）合成ペプチドを抗原としたポリクローナル抗体の作製
１−（２）で調製したＳ６８ペプチド−ＫＬＨに対するポリクローナル抗体を作製するため、Ｓ６８ペプチド−ＫＬＨを用いてウサギに免疫を行った。すなわち、Ｓ６８ペプチド−ＫＬＨ各１００μｇを５００μＬの生理食塩水に希釈し、５００μＬのフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合後、ニュージーランド白色ウサギ（北山ラベス）メス２．１―２．２ｋｇの背部皮下に投与した。その２週間後、Ｓ６８ペプチド−ＫＬＨ各１００μｇを５００μＬの生理食塩水に希釈し、５００μＬのフロインド不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合後、背部皮下に投与した。さらにその２週間後、Ｓ６８ペプチド−ＫＬＨ１００μｇを１ｍＬの生理食塩水に希釈し耳静脈内に投与した。
投与終了１週間後、耳静脈より採血し、定法にしたがい抗血清を分離し、抗体を精製した。まず抗血清に最終飽和濃度３３％となるように硫酸アンモニウムを添加し、４℃で１時間攪拌後、析出した沈殿を遠心分離した。次に沈殿を７６ｍＭリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳ（ｐＨ６．４）と記載）で溶解し、一夜透析した。透析液を濾過後、プロテインＡカラム（プロセップＡ、ミリポア）にアプライし、結合したＩｇＧ画分を０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）により溶出し、精製抗体を得た。ＰＢＳ（ｐＨ６．４）で透析後、２８０ｎｍの吸光度より蛋白濃度を算出した（換算値：０．５３３ｍｇ／ｍＬ）。以降、得られた抗体をＳ６８ペプチドポリクローナル抗体と記載する。
１−（４）特異精製ポリクローナル抗体の調製
Ｓ６８ペプチドポリクローナル抗体よりＳ６８ペプチドに対する抗体のみを精製するため、以下の方法により特異精製を行った。まず、システインを挿入したＳ６８ペプチド（以下、Ｃ−Ｓ６８ペプチドと記載）をＳＨ基を介して担体に結合させるため、マニュアルに従ってSulfoLink Coupling Gel（PIERCE）１ｍＬあたりＣ−Ｓ６８ペプチド２００μｇを混合し反応した。反応終了後残った活性基をブロッキングし、Ｓ６８ペプチド結合アフィニティーカラムを調製した。次に、１−（３）に記載の精製ＩｇＧ画分７．９２ｍｇをアプライし、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（ダルベッコ、以下、Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と記載）でカラムを洗浄し、次に０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で結合した抗Ｓ６８ペプチド抗体を溶出した。溶出後ｐＨを中性に戻しＰＢＳで透析後、蛋白質濃度を２８０ｎｍの吸光度より算出した（換算値：０．５３３ｍｇ／ｍＬ）ところ、０．５２ｍｇの抗Ｓ６８ペプチド抗体（以下、Ｓ６８抗体と記載）が得られた。
（実施例２）合成ペプチドを抗原としたモノクローナル抗体の作製
実施例１−（２）で調製したＳ６８ペプチド−ＫＬＨ２０μｇを１００μＬの生食に溶解し、フロインド完全アジュバント（DIFCO）と等量混合し、Wistarラット８週齢メスの各後足フットパッドに１００μＬずつ投与した。２週間後、腸骨リンパ節を摘出し細胞融合を行った。細胞融合は安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」８３ページ、１９９１年（講談社）にしたがって行った。すなわち、リンパ節よりセルストレイナー（ファルコン）を用いてリンパ球を分離し、ミエローマ細胞（Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４）と５：１で混合し、ポリエチレングリコールを用いて細胞融合を行った。融合した細胞をＨＡＴ培地に懸濁し、ハイブリドーマを選別後、目的の抗体を産生しているハイブリドーマをスクリーニングした。
スクリーニングはｒｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃを直接プレートに固相化するＥＬＩＳＡ法を用いた。すなわち、イムノプレート（Maxisorb, NUNC）に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１μｇ／ｍＬに希釈したｒｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃを各ウエルに５０μＬ添加し、３７℃で１時間静置した。次にプレートをイオン交換水で５回洗浄後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ６．４）を各ウエルに１００μＬ添加し、室温で１時間静置してブロッキングを行った。得られたハイブリドーマからサンプリングした培養上清を各ウエルに添加し３７℃で１時間反応させた後、０．０５％Tween２０を含む生理食塩水で３回洗浄した。
次にペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を１０％ウサギ血清を含むＰＢＳで１０００倍に希釈した溶液を各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で１時間反応後、同様に５回洗浄しテトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ、BioFix）を各ウエルに添加した。室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止した。４５０ｎｍの吸光度をプレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で測定し、ｒｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃと結合する抗体を産生するハイブリドーマを含むウエルを選択した。
次に、選択したウエルより安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」83頁、1991年（講談社）にしたがって限界希釈法によりクローニングを行った。１０日後、同様にｒｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃに対する反応性を指標としてスクリーニングを行い、６種類のハイブリドーマを選択した。選択したハイブリドーマを１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地（Sigma）で培養後、Hybridoma−ＳＦＭ培地（Invitrogen）で培養し抗体を産生させ、プロテインＧカラム（Prosep−Ｇ、ミリポア）を用いて抗体を精製した。精製したＦ１１４６−１７−２抗体のサブタイプをラットタイピングキット（ＺＹＭＥＤ）を用いて決定したところサブタイプはラットＩｇＧ２ｂ・κであった。
なお、ｒｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃは、ＷＯ０１／７２９９３号に実施例９として記載された方法を用いて調製した。
（実施例３）サンドイッチＥＩＡ法測定系の検討
実施例１及び実施例２に記載の抗体を用いて、サンドイッチＥＩＡ法による測定系を検討した。
３−（１）組換えヒトＣＤ１４の調製
まず、サンドイッチＥＬＩＳＡ法の第二の抗体とするｒｓＣＤ１４（１−２８５）に対するモノクローナル抗体を作製するため、その免疫原であるｒｓＣＤ１４（１−２８５）を大腸菌で調製した。ｒｓＣＤ１４（１−２８５）を大腸菌で発現させるために、以下の方法で発現プラスミドｐＴｒｐ１６５９を構築した。
まず、オリゴマー８, linkＳ（５'−agc tta gga att t−３'）（配列番号７）及びオリゴマー８, linkＡ（５'−cta gaa att cct a−３'）（配列番号８）を合成した。
これらのオリゴマーを等量混合し、９９℃で１分間加温した後に、室温まで徐々に冷却してアニーリングを行った。さらにＴ４ Polynucleotide Kinaseで５末端をリン酸化してリンカーを作製した。
次にセンスプライマーA（５'−aca tct aga tga cca cgc cag aac ct−３'）（配列番号９）及びアンチセンスプライマー（５'−ttt gga tcc tta cta gag atc gag cac tct−３'）A（配列番号１０）を合成し、ＷＯ０１／７２９９３号公報の実施例８に記載のプラスミドｐＭ１６５９を鋳型にPyrobest ＤＮＡ polymeraseを用いてＰＣＲを行った。
反応液を９０℃で２分間加温した後に、９８℃ １０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ １分のサイクルを３０回繰り返して行った。
得られた約９００ｂｐの増幅物を、XbaIとBamHIとでdouble digestionして、ＤＮＡ断片を回収した。特開平０６−０２５２８９号公報の実施例１０に記載のベクターｐＭ７１０を、HindIII とBamHIとでdouble digestionした後に、アガロースゲル電気泳動を行い、回収した。前述したリン酸化済みリンカー、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片／XbaI＋BamHI消化断片、そしてベクター／HindIII ＋BamHI断片の３種をligationした後に（three−way ligation）、大腸菌コンピテントセル（JM109（TOYOBO））にtransformationを行い、目的のプラスミドを含むクローンを得た。プラスミドＤＮＡは定法により調製した。
次にｒｓＣＤ１４（１−２８５）を生産するためのJE7924形質転換株をエレクトロポレーション法により調製した。
まず、大腸菌JE7924（J. Bacteriol 173 4799頁（1991））をグリセロールストックより回復し、ＬＢ培地にて３７℃ 一晩培養した。さらに５０ｍＬのＬＢ培地に植菌し直し、６００ｎｍの吸光度が０．５〜０．６になるまで培養を続けた後に、培養フラスコごと３０分間氷冷した。次に大腸菌を集菌し、氷冷した滅菌蒸留水にて２回、氷冷した１０％グリセロール溶液で１回洗浄した後に、氷冷した１０％のグリセロール溶液１００μＬに懸濁した。５０μＬずつ２本のチューブに分注して、液体窒素で急速凍結し、コンピテントセル（JE7924）を調製し、使用時まで−８０℃で保存した。
次に、JE7924コンピテントセル５０μＬに、ｐＴｒｐ１６５９約３０ｎｇをエレクトロポレーション法で導入した。機器はＢＩＯ−ＲＡＤ社のGene Pulserを使用した。また、その時の設定は、Voltage２．５ｋＶ、Resistor ２００Ω、Capasitor ２５μＦで行った。その後、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢアガープレートで一晩培養することで、ｐＴｒｐ１６５９が導入された形質転換株を得た。このクローンをＬＢ培地にて３７℃で一晩培養した後に、新しい培地に再度植菌し直し、さらに５時間培養した。６００ｎｍの吸光度が２〜３であることを確認し、３β―INDOLEACRYLIC ACID（Sigma社）を終濃度１００μｇ／ｍＬの濃度で添加し、３７℃で４時間培養を行い、ｒｓＣＤ１４（１−２８５）を誘導発現させた。次に、大腸菌を回収し、Bug Buster Protein Extraction Reagent（Novagen社）を用いてInclusion bodyを調製した。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用バッファーにて溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗ＣＤ１４抗体によるWestern lottingでｒｓＣＤ１４（１−２８５）の発現を確認した。
免疫原用ｒｓＣＤ１４（１−２８５）は同様にJE7924形質転換株を１ＬのＬＢ培地で培養し調製した。まず培養液を遠心分離し、大腸菌を集菌後、菌体をＤ−ＰＢＳで洗浄し、集めた菌体に５０ｍＬのBug Buster Protein Extraction Reagent（Novagen、以下Bug Busterと記載）を加えて懸濁し、室温で３０分間放置した。菌体溶解後、１０分間ソニケーション（ＵＳ−３、井内盛栄堂）処理し、１００００×ｇ、４℃にて２０分間遠心分離し、上清を除去した。再度同様にソニケーション処理し、得られた沈殿を５０ｍＬのBug Busterに懸濁した。懸濁液に１ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（生化学工業）を加えて緩やかに攪拌後、室温で１０分間放置し、続けて２００ｍＬの１０分の１量の高濃度Bug Busterを加えて攪拌後、同様に遠心分離し、上清を除去した。得られた沈殿に、２００ｍＬの１／１０濃度のBug Busterを加えて懸濁し、同様に遠心分離し、この操作を数回繰り返した。最終的に得られた沈殿に１００ｍＬのＤ−ＰＢＳを加え、封入体を得た。
ｒｓＣＤ１４（１−２８５）の調製は、まず封入体を１％のTritonＸ１００を含むＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０、ニッポンジーン）に溶解し、凍結融解を３回行い、遠心し沈殿を回収した。再度１％のTritonＸ１００を含むＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０、ニッポンジーン）に溶解し、氷冷後２５０μＡで１０秒間隔で１２分間超音波処理を行い、遠心後沈殿を回収した。沈殿を１％のTritonＸ１００、０．２Ｍ ＮａＯＨを含むＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０、ニッポンジーン）に溶解し、３７℃で１０分間処理、遠心、再溶解を３回行った後、沈殿を回収した。得られた沈殿を６Ｍのグアニジン塩酸を含む水溶液に溶解し、精製ｒｓＣＤ１４（１−２８５）を調製した。濃度はＢＳＡを標準品としてブラッドフォードのタンパクアッセイ法により算出した。
３−（２）抗ＣＤ１４モノクローナル抗体の作製
［１］ Ｆ１１０６−１３−３抗体の作製
上記に記載の大腸菌由来ｒｓＣＤ１４（１−２８５）を投与抗原として、モノクローナル抗体を作製した。まず、ｄｄｙマウス６週齢メスの腹腔に精製ｒｓＣＤ１４（１−２８５）２０μｇをフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合して２００μＬ投与した。２週間後、精製ｒｓＣＤ１４（１−２８５）２０μｇをフロインド不完全アジュバント（DIFCO）と等量混合し、腹腔内に２００μＬ投与した。細胞融合３日前にマウスの腹腔に抗原５０μｇを投与した。３日後、無菌的に脾臓を摘出し、脾臓よりリンパ球を分離し、安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」83ページ、1991年（講談社）にしたがってミエローマ細胞（Ｐ３×６３−Ａｇ．８．Ｕ・１）と１０：１で混合し、ポリエチレングリコールを用いて細胞融合を行った。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選別後、ｒｓＣＤ１４（１−２８５）と結合する抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングをＥＬＩＳＡ法で行った。
まず、ｒｓＣＤ１４（１−２８５）をＰＢＳ（ｐＨ６．４）で０．４μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Maxisorb, NUNC）の各ウエルに５０μＬ添加した。４℃で一晩反応後、イオン交換水で５回洗浄し、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ６．４）を各ウエルに１００μＬ添加し、ブロッキングを行った。サンプリングした培養上清を各ウエルに添加し３７℃で１時間反応させた後、０．０５％Tween２０を含む生理食塩水で３回洗浄した。次にペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（DAKO）を１０％ウサギ血清を含むＰＢＳで１０００倍に希釈した溶液を各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で１時間反応後、同様に５回洗浄しテトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ．BioFix）を各ウエルに添加した。室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止した。４５０ｎｍの吸光度をプレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で測定し、ｒｓＣＤ１４（１−２８５）と結合する抗体を産生するハイブリドーマを含むウエルを選択した。次に選択したウエルより安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」83ページ、1991年（講談社）にしたがって限界希釈法によりクローニングした。１０日後、同様にｒｓＣＤ１４（１−２８５）に対する反応性を指標としてスクリーニングを行い、ハイブリドーマを選択したところ１２種類の抗ｒｓＣＤ１４（１−２８５）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマが得られた。
選択したハイブリドーマを１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地（Sigma）で培養後、Hybridoma−ＳＦＭ培地（Invitrogen）で培養し抗体を産生させ、プロテインＡ（Prosep−Ａ、ミリポア）を用いて抗体を精製した。
特に反応性の高い抗体であるＦ１１０６−１３−３抗体のサブタイプをIsoStrip Mouse Monoclonal antibody Isotyping Kit（Roche）を用いて決定したところサブタイプはＩｇＧ２ｂ・κであった。
［２］Ｆ１０３１−８−３抗体の作製
Ｆ１０３１−８−３抗体はＷＯ０１／２２０８５号公報の実施例７に記載の方法を用いて作製した。簡単に記載すれば、ヒト血中のＣＤ１４蛋白質２０μｇを生食に溶解し、フロインド完全アジュバンド（DIFCO）と等量混合し、初回及び２週間後に２回目をマウスに腹腔内投与をした１週間後、血清中の抗体価の上昇を、ＷＯ０１／２２０８５号公報の実施例５と同様に組換えヒトＣＤ１４蛋白質との反応性をＥＬＩＳＡ法により確認した。マウスの腹腔に抗原１００μｇを投与し最終投与を行い、３日後、脾臓を摘出した。脾臓よりリンパ球を分離し、ミエローマ細胞（Ｐ３×６３−Ａｇ．８．Ｕ．１）と１０：１で混合しポリエチレングリコールを用いて細胞融合を行った。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後目的に抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングを上記記載のＥＬＩＳＡ法により行った。固相化した可溶性ＣＤ１４抗原と反応したハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングし、１０日後同様にスクリーニングを行い、抗ＣＤ１４蛋白質モノクロナール抗体を得た。代表的な抗体として、IsoStrip Mouse Monoclonal antibody Isotyping Kit（Roche）を用いて決定したサブタイプがＩｇＧ２ｂ・κであるＦ１０３１−８−３抗体を得た。
３−（３）サンドイッチＥＩＡ系の検討
敗血症患者に多く存在する蛋白質を特異的に検出可能な系を作製するため、実施例１、２、３−（２）に記載の抗体を用いてサンドイッチＥＩＡ系を作製した。
［１］ ペルオキシダーゼ標識抗体の調製
ペルオキシダーゼ標識抗体は中根らの方法（J. Histochem. Cytochem., 22巻、p.1084、1974年）に従い４ｍｇのペルオキシダーゼ（東洋紡）を蒸留水に溶解し、１００ｍＭの過ヨウ素酸を添加し２５℃で２０分間反応した。反応終了後、１．５％エチレングリコールを添加し２５℃で１０分間反応させ１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．４）に対して透析した。精製したＦ１０３１−８−３抗体及びＦ１１０６−１３−３抗体それぞれを１０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で透析し、４ｍｇに対して０．２Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）を７０μＬ添加して活性化した４ｍｇのペルオキシダーゼを抗体と等量に混合し２５℃で２時間反応した。次に４ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素ナトリウムを添加し、さらに２時間４℃で反応した。反応液をＰＢＳに透析し、ペルオキシダーゼ標識Ｆ１０３１−８−３抗体（以下、Ｆ１０３１−８−３−ＨＲＰと記載する場合がある）及びペルオキシダーゼ標識Ｆ１１０６−１３−３抗体（以下、Ｆ１１０６−１３−３−ＨＲＰと記載する場合がある）を得た。液量を測定し使用した抗体量より抗体濃度を算出した。
［２］サンドイッチＥＩＡ系の作製
固相抗体として実施例１で作製したＳ６８抗体を使用し、標識抗体として実施例３−（２）［１］及び［２］で作製した抗体を使用する２ステップサンドイッチＥＩＡ系を作製した。すなわちＳ６８抗体をＤ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Maxisorb, NUNC）の各ウエルに５０μＬ添加した。４℃で一晩反応後、イオン交換水で５回洗浄し、０．１％StabilGuard（SurModics, Inc）と０．１％Tween２０を含むＤ−ＰＢＳを各ウエルに１００μＬ添加しブロッキングした。次に１％の正常人血清（３Ｃ１０を用いて可溶性ＣＤ１４抗原を除去した血清、以下、ＣＤ１４吸収血清と記載、３Ｃ１０はＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手したＡＴＣＣ２２８−ＴＩＢハイブリドーマより調製した）、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を希釈液として、ヒト正常人血清及びヒト敗血症患者血清を２０倍に希釈した希釈検体を調製した。希釈検体をウエル当たり５０μＬ添加し、３７℃で２時間反応させた。
反応終了後、０．０５％Tween２０を含む生理食塩水で３回洗浄し、５％ラット血清、１％マウス血清、０．１％Tween２０を含む７６ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ８．０）で０．６μｇ／ｍＬに希釈したＦ１０３１−８−３−ＨＲＰまたはＦ１１０６−１３−３−ＨＲＰを各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で２時間反応後、同様に５回洗浄し、テトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ、BioFix）を各ウエルに添加した。室温で２０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、表１に示すようにＳ６８ペプチド由来抗体を組み合わせた系では正常人では上昇せず、敗血症患者特異的に上昇する、血中可溶型蛋白質、が測定できた。
［３］サンドイッチＥＩＡ系の作製 <２>
固相抗体として実施例２で作製したＦ１１４６−１７−２抗体を使用し、標識抗体として実施例３−（２）［２］で作製した抗体を使用する２ステップサンドイッチＥＩＡ系を作製した。Ｆ１１４６−１７−２抗体をＰＢＳ（ｐＨ６．４）で１２０μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Maxisorb, NUNC）の各ウエルに５０μＬ添加した。５６℃で３０分反応後、イオン交換水で５回洗浄し、０．１％StabilGuard（SurModics, Inc）と０．１％Tween２０（和光純薬）を含むＰＢＳを各ウエルに１００μＬ添加しブロッキングした。次に１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ６．４）を希釈液としてヒト正常人血清及びヒト敗血症患者血清を１０倍に希釈した希釈検体を調製した。希釈検体をウエル当たり５０μＬ添加し、２５℃で２時間反応した。
反応終了後、０．０５％Tween２０を含む生理食塩水で３回洗浄し、５％ラット血清、１％マウス血清、０．１％Tween２０を含む７６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で０．５μｇ／ｍＬに希釈したペルオキシダーゼ標識Ｆ１０３１−８−３抗体を各ウエルに５０μＬ添加した。２５℃で２時間反応後、同様に５回洗浄し、テトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ、BioFix）を各ウエルに添加した。室温で２０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、表１に示すようにＳ６８ペプチド特異的モノクローナル抗体はＳ６８抗体同様、正常人血清ではほとんどなく、敗血症患者血清では高値を示す血中蛋白質が測定できた。すなわち、Ｓ６８ペプチドと結合する抗体はポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体でも、サンドイッチ測定系ができることを確認できた。
表１の＋＋は４５０ｎｍの吸光度が希釈液単独の吸光度の４倍以上を示し、＋は２倍以上、−は希釈液と同等の吸光度を示す。
Figure 0004040666
（実施例４）Ｓ６８抗体の特異性
実施例１で作製したＳ６８抗体の特異性を確認するため、実施例３−（３）と同様な測定で、ペプチドにより阻止されるか検討した。すなわち、敗血症患者血清及び正常人血清の５０倍希釈溶液２５μＬにＳ６８ペプチド（アミノ酸配列５３位〜６８位）、実施例１と同様に調製した合成ペプチド（アミノ酸配列５３位〜５８位、アミノ酸配列５７位〜６２位、アミノ酸配列５９位〜６４位）またはネガティブコントロール用ペプチド（Cys Glu Gly Asn Gly Asn Asn Phe Glu Ser Arg Glu Ala Cys）を０、０．１、１、１０μｇ／ｍＬに希釈したもの２５μＬをそれぞれ添加、Ｓ６８抗体と混合し競合反応させた後、Ｓ６８抗体に阻止されずに結合した敗血症患者血清及び正常人血清中の該可溶型蛋白質量を測定した。
その結果、図１に示すように、低値を示した正常人血清、高値を示した敗血症患者血清ともにＳ６８ペプチドではＳ６８抗体と血清中の該可溶型蛋白質の結合は阻止されたが、他の部分ペプチド（各々６アミノ酸）及びネガティブコントロール用ペプチドでは阻止されなかった。以上の結果より、Ｓ６８抗体により血清中に検出されている蛋白質はＳ６８抗体が特異的に認識しているものであることが確認された。また、Ｓ６８ペプチドの部分ペプチドである３種類の合成ペプチド（アミノ酸数６個）では阻止されないことより、抗体の認識する配列は最低でも７アミノ酸以上の長さを必要とすることが確認された。
（実施例５）作製した抗体の反応速度定数
実施例１で作製したＳ６８抗体と実施例２で作製したＦ１１４６−１７−２抗体の特異性と反応速度定数をBiacore３０００（ビアコア）を用いて解析した。まず、固定化するＳ６８ペプチド−ＢＳＡを実施例１記載の方法と同様にマレイミド化ＢＳＡ（Imject Maleimed Activated ＢＳＡ、PIERCE）を用いて調製した。次に、Ｓ６８ペプチド−ＢＳＡをアミンカップリングキット（ビアコア）を用いてセンサーチップＣＭ５（ビアコア）に固定化した。測定はランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ（ビアコア）を使用し、Ｆ１１４６−１７−２抗体の希釈列（５０、１００、１５０、２００、３００ｎＭ）をフローセルにインジェクトすることで行った。データ解析はＳ６８ペプチド−ＢＳＡのフローセル測定データからリファレンスセルデータを差し引き、Biaevaluation soft wear version３．０（ビアコア）を用いて実施した。解離定数（ＫＤ）を算出した結果、Ｆ１１４６−１７−２抗体は４．８×１０-9Ｍと高い親和性を示した。なお、同様に測定した特異精製ウサギＳ６８ペプチドポリクローナル抗体のＫＤは２．２×１０-10 Ｍであった。
（実施例６）抗ＣＤ１４モノクローナル抗体の特異性
６−（１）Ｆ１１０６−１３−３抗体の解析
Ｆ１１０６−１３−３抗体の結合領域（エピトープ）を明らかにするため、ＣＤ１４のアミノ酸配列をＮ末端側から１０アミノ酸ずつ合成したペプチドライブラリーメンブレン（Custom SPOTs、Sigma Genosys）を用いて解析した。すなわち、メンブレンをマニュアルに従ってブロッキングした後、Ｆ１１０６−１３−３抗体を反応させ、洗浄後、βガラクトシダーゼ結合抗マウス抗体を反応させた。メンブレンを洗浄後、Ｘ−ｇａｌを用いて抗体が結合するペプチド配列を検出した。なお、ペプチドライブラリーメンブレンのペプチドの配列は、１位から１５４位までのアミノ酸配列をＣ末端の２アミノ酸を重ねる形で１０アミノ酸ずつ合成した１９ペプチドを解析に使用した。ペプチドは実施例１−（１）と同様に調製した。
その結果、Ｆ１１０６−１３−３抗体は高分子量ＣＤ１４のＮ末端より１７〜２６位のアミノ酸配列（ＣＮＦＳＥＰＱＰＤＷ）に相当する領域に結合することが明らかになった。
６−（２）Ｆ１０３１−８−３抗体の解析＜１＞
Ｆ１０３１−８−３抗体の特異性を確認するため、実施例３−（１）記載の大腸菌由来ｒｓＣＤ１４（１−２８５）及びＷＯ０１／７２９９３号公報の実施例８及び実施例９に記載の方法を用いてＣＯＳ細胞により調製したｒｓＣＤ１４（１−３５６）、ｒｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃを用いて結合活性を測定した。
まず、Hybond−Ｃ extra（アマシャム バイオサイエンス）にｒｓＣＤ１４（１−３５６）、ｒｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ、ｒｓＣＤ１４（１−２８５）またはＢＳＡを各２５０ｎｇ／スポットでメンブレン上に固定化し、乾燥後０．０５ｇ／ｍＬのスキムミルク（明治乳業）を含む０．０５％Tween２０、ＰＢＳ（ｐＨ６．４）でブロッキングした。室温で１時間静置後、０．５％ＢＳＡを含む０．０５％Tween２０、ＰＢＳ（ｐＨ６．４）で３μｇ／ｍＬに希釈したＦ１０３１−８−３抗体を加え、室温で１時間反応後、０．０５％Tween２０、ＰＢＳ（ｐＨ６．４）で洗浄した。
次に１０％ウサギ血清を含む０．０５％Tween２０、ＰＢＳ（ｐＨ６．４）で５００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を添加し、３７℃で３０分間反応した後、同様に洗浄しＥＣＬキット（アマシャム バイオサイエンス）で結合活性を確認した。その結果、表２に示すようにＦ１０３１−８−３抗体は大腸菌由来ｒｓＣＤ１４（１−２８５）、ｒｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ、ｒｓＣＤ１４（１−３５６）に結合したが、ＢＳＡとは結合せず、全てのタイプのＣＤ１４蛋白質を特異的に認識していることが明らかになった。表２の＋はＥＣＬによりフイルム上にスポットが検出された場合を示し、−はスポットが検出されない場合を示す。
Figure 0004040666
６−（３）Ｆ１０３１−８−３抗体の解析＜２＞
Ｆ１０３１−８−３抗体の結合領域（エピトープ）の解析を行った。すなわち、固相にＳ６８抗体を標識抗体としてＦ１０３１−８−３−ＨＲＰを用いた実施例３−（３）［２］のサンドイッチＥＩＡ系で、Ｆ１１０６−１−３抗体による阻止試験を行った。
まず、実施例３−（３）［２］と同様にＳ６８抗体固相プレートに標準品１００ｎｇ／ｍＬを添加し反応させた。プレートを洗浄後、Ｆ１０３１−８−３−ＨＲＰを添加する前に、６μｇ／ｍＬのＦ１１０６−１３−３抗体、マウスＩｇＧ抗体または抗体を含まないバッファーを２５μＬ添加し、その後Ｆ１０３１−８−３−ＨＲＰ抗体を２５μＬ添加し、実施例３−（３）［２］と同様に測定した。
表３に示すようにマウスＩｇＧ抗体添加の系では、阻止されないのに対して、Ｆ１１０６−１３−３抗体によりＦ１０３１−８−３と標準品との結合が阻止された。このことにより、Ｆ１０３１−８−３抗体が認識する領域の少なくとも一部に、Ｆ１１０６−１３−３抗体が認識する領域が存在することが考察された。なお表３の「阻害率」はバッファーのみの吸光度を１００％としたときのそれぞれの減少した吸光度より算出した。
Figure 0004040666
（実施例７）可溶型蛋白質測定キット
７−（１）サンドイッチＥＩＡ系の測定キット構成例
実施例３−（３）で敗血症患者の測定では高値を示し、正常人の測定で低値を示した固相抗体、標識抗体の組み合わせを用いた可溶型蛋白質キットの構成例を示す。
<１>固相抗体：Ｓ６８抗体を固相化したプレート
<２>標識抗体：ペルオキシダーゼ標識Ｆ１０３１−８−３抗体
<３>基質溶液（テトラメチルベンジジン溶液）
その他の付属品
プレート系構成例
<４>プレート洗浄液（０．９％ＮａＣｌ、０．０５％Tween２０溶液）
<５>試料希釈液（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液）
<６>反応停止液（０．５Ｍ Ｈ2ＳＯ4溶液）
<７>標準品（ＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ）
上記の測定キットを用いて測定する場合の測定機器＜参考例＞
<８>プレート分光光度計（例えばＥ−Ｍａｘ（モレキュラデバイス社））
７−（２）〜（１１）サンドイッチＥＩＡ系の測定キット構成例
７−（１）に加えて、さらにサンドイッチＥＩＡ系の測定キット構成例を表４に示す。<１>はプレートに固相する結合物質を示す。<２>は標識した結合物質を示す。構成要素の<３>〜<７>、及び参考例の測定機器<８>は７−（１）と同じ。<９>は第二の特異結合物質が結合した抗体を示す。「−」は記載なしを示す。
Figure 0004040666
７−（１２）サンドイッチＥＩＡ系の測定キットの標準曲線
（１）の測定キットにより、実施例３−（３）［２］と同様な方法で測定した。すなわち、Ｓ６８抗体をＤ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Maxisorb, NUNC）の各ウエルに５０μＬ添加した。４℃で一晩反応後、イオン交換水で５回洗浄し、０．１％StabilGuard（SurModics, Inc）と０．１％Tween２０を含むＤ−ＰＢＳを各ウエルに１００μＬ添加しブロッキングした。次に１％ＣＤ１４吸収血清、０．１％ＢＳＡを含む７６ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を希釈液として０、３、２５、６０、１００、１５０ｎｇ／ｍＬのＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ蛋白質標準品希釈系列を調製した。標準品希釈系列をウエル当たり５０μＬ添加し、３７℃で２時間反応させた。反応終了後、０．０５％Tween２０を含む生理食塩水で３回洗浄し、５％ラット血清、１％マウス血清、ペルオキシダーゼ標識Ｆ１０３１−８−３抗体を０．１％Tween２０を含む７６ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ８．０）で０．６μｇ／ｍＬに希釈した希釈標識抗体を各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で２時間反応後、同様に５回洗浄し、テトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ、BioFix）を各ウエルに添加した。室温で２０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。図２に作製した標準曲線を示した。測定感度０．６ｎｇ／ｍＬ（ブランク＋３ＳＤ）の高感度で簡便な測定系が実現された。
７−（１３）サンドイッチＥＩＡ系の特異性
ヒト血清中に存在する高分子量ＣＤ１４が、作製した測定系に及ぼす影響を検討するため、０〜４μｇ／ｍＬの濃度の正常人血清由来可溶性ＣＤ１４抗原をＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ標準品に添加して、（１２）と同様に測定を行った。その結果、図３に示すように正常人血清由来可溶性ＣＤ１４抗原は４μｇ／ｍＬでも測定値に影響を及ぼさなかった。この結果より、本サンドイッチＥＩＡ系において高分子量ＣＤ１４との交差反応性は０．３％以下であることがわかった。すなわち、本系はヒト血清高分子量ＣＤ１４を検出せず、敗血症患者の血清で高値を示す可溶型蛋白質特異的であることが確認された。
７−（１４）サンドイッチＥＩＡ系の測定キットの評価
（１）のキットによる測定結果の再現性を評価した。（１２）と同様に３種類の検体を用いた同時再現性の変動係数（ＣＶ）は５．８、３．６、３．５％、測定間再現性は６．２、５．２、５．１％と良好な結果であった。また、添加回収試験の回収率は８８〜１０９％と良好であり、抗凝固剤（ヘパリン、クエン酸、ＥＤＴＡ）の影響も認められなかった。以上の結果より、本キットは血中該可溶型蛋白質を測定するのに十分な性能を有していることが示された。
（実施例８）血中可溶型蛋白質の同定
８−（１）ゲルろ過クロマトグラフィー＜１＞
実施例７−（１）に記載の測定キットが検出する敗血症患者血清中の物質を解析するため、敗血症患者血清をゲル濾過クロマトグラフィーカラム Superdex ２００ＰＣ３．２／３０（アマシャム バイオサイエンス）によりSMART SYSTEM（アマシャム バイオサイエンス）でＤ−ＰＢＳを展開溶媒として用いて分画し、各分画を実施例７−（１）に記載の測定キット及び市販ＣＤ１４−ＥＩＡキット（ＩＢＬ−Hamburg）を用いて測定した。分子量の算出はＬＭＷキャリブレーションキットおよびＨＭＷキャリブレーションキット（アマシャムバイオサイエンス）のうちアルドラ−ゼ（１５８ｋＤａ）、ＢＳＡ（６７ｋＤａ）、オボアルブミン（４３ｋＤａ）、キモトリプシン（２５ｋＤａ）を用いてカラムをキャリブレートして行った。
その結果、図４に示すように市販ＣＤ１４−ＥＩＡキットでは分子量約５７ｋＤａの可溶性ＣＤ１４抗原が検出され、従来より報告のある４９〜５５ｋＤａの高分子量可溶性ＣＤ１４抗原であると判断された。一方、実施例７−（１）に記載のキットでは分子量３５〜４５ｋＤａ付近にピークが検出され、また５７ｋＤａ付近にはピークが検出されなかったことから、実施例７−（１）に記載のキットは血中に存在する該可溶型蛋白質のみを特異的に検出していることが確認された。
８−（２）ゲルろ過クロマトグラフィー＜２＞
（２）−＜１＞と同様に敗血症患者の血清５０μｌをゲル濾過クロマトグラフィーカラム Superdex ７５ １０／３００ ＧＬ（アマシャム バイオサイエンス）により展開溶媒として２００ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ ６．８）を用いて分画し、各キットを用いて測定した。分子量の算出はＬＭＷキャリブレーションキットおよびＨＭＷキャリブレーションキット（アマシャム バイオサイエンス）のうちＢＳＡ（６７ｋＤａ）、オボアルブミン（４３ｋＤａ）、キモトリプシノーゲン（２５ｋＤａ）及びリボヌクレアーゼＡ（１３．７ ｋＤａ）を用いてカラムをキャリブレートして行った。
その結果を図５に示す。実施例７−（１）に記載のキットでは分子量２５〜３５ｋＤａ付近に、該可溶型蛋白質に由来するピークが検出された。
８−（３）Ｆ１０２５−３−１抗体アフィニティーカラムクロマトグラフィー
（２）−＜２＞で得られた該可溶型蛋白質に由来するピークの画分（例えば、フラクション１２）をＦ１０２５−３−１抗体アフィニティーカラムクロマトグラフィーに供すると該可溶型蛋白質に由来するピークは、アフィニティーカラム非吸着画分に溶出される。なお、Ｆ１０２５−３−１抗体アフィニティーカラムの調整並びに実施は、ＷＯ０１／２２０８５号公報に実施例１０として記載されている方法に準じて行うことができる。
（実施例９） 敗血症患者血清からの血中可溶型蛋白質の精製
９−（１）Ｆ１０２４−１−３−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ担体の調製
ＷＯ０１／７２９９３号に実施例２として記載され、作成されたＦ１０２４−１−３抗体（上記に記載の通り、ハイブリドーマは受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７５１１として寄託されている）５５ｍｇを２０ｍｌのＥＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ(Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ)に添加し、終濃度０．１Ｍとなるように水可溶性カルボジイミド（(株)同仁化学研究所）加え、４℃一晩カップリング反応を実施した。次いで、０．１Ｍ酢酸ナトリウム(ｐＨ ５．０)にて洗浄後未反応のＦ１０２４−１−３抗体を回収した。カップリング反応前の抗体溶液と洗液の２８０ｎｍの吸光度をそれぞれ測定しカップリング効率を求めた（換算値：０．７１４ｍｇ／ｍＬ）。その結果、Ｆ１０２４−１−３抗体のカップリング効率は５５％であり、担体１ｍｌあたり１．５ｍｇのＦ１０２４−１−３抗体が結合していることが判明した。
次いで、１Ｍエタノールアミン（ｐＨ ７．４）を添加し室温にて１時間ブロッキング反応を行い、１００ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム／０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ４．０）次いで１００ｍｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ ８．０）にて担体を洗浄した。この操作をさらに２回実施し、２０ｍｌのＦ１０２４−１−３ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ担体を調製した。
９−（２）Ｓ６８−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ担体の調製
実施例１−（４）にて調製したＳ６８抗体１８ｍｇを１０ｋＤａの分子量カットオフを有する透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社）を使用し、２．５Ｌの０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ ８．３）を透析液として４℃、一晩透析した。尚、透析液は３回交換した。次いで、予め０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ ８．３）にて平衡化しておいた８ｍＬのＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を透析したＳ６８抗体溶液に添加し、４℃一晩、カップリング反応を行った。カップリング反応終了後、未反応のＳ６８抗体を０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ ８．３）で洗浄し回収した。カップリング反応前の抗体溶液とカップリング反応後の抗体溶液の２８０ｎｍの吸光度をそれぞれ測定しカップリング効率を求めた（換算値：０．７１４ｍｇ／ｍＬ）。その結果、Ｓ６８抗体のカップリング効率は、７９％であり、担体１ｍＬ当り１．８ｍｇのＳ６８抗体が結合していることが判明した。次いで、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．５Ｍ モノメタノールアミン（ｐＨ ８．３）を担体に加え、４℃一晩ブロッキング反応を行った。ブロッキング反応終了後、３００ｍＬの０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ ４）で担体を洗浄し、その後、３００ｍＬの０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ ８．３）で担体を洗浄した。この操作を更に２回繰り返し、Ｓ６８−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ８ｍＬを調製した。
９−（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは１２．５％ゲルを用い，Ｌａｅｍｍｌｉの手法（Ｌａｅｍｍｌｉ ＵＫ Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970 Aug 15;227(259):680-5.）に従い、非還元条件下実施した。すなわち、試料２容量に１容量のＴｒｉｓ−ＳＤＳ−Ｓｅｐｒａｓｏｌ（第一化学薬品（株））を添加し、１００℃、５分間加熱処理後、１２．５％のｅＰＡＧＥＬゲル（アトー株式会社）に供し，Ｌａｅｍｍｌｉの不連続バッファーシステムにより２５ｍＡ定電流、９０分間泳動した。泳動終了後、ゲルを銀染色キット２Ｄ銀染色試薬・II「第一」（第一化学薬品株式会社）を用いて染色した。分子量算出には、分子量マーカーとして、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｐｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎＴＭ ｄｕａｌ ｃｏｌｏｒ ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いた。
９−（４）ウェスタンブロッティング
予めＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルのサイズに切っておいた濾紙を５％メタノール／２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／４０ｍＭ εアミノカプロン酸溶液に浸し、白金電極セミドライトランスファーＢＥ３３０（（株）バイオクラフト）の陰極電極盤上に置き、次いで、上記（３）に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施後、ゲルを同溶液に浸し濾紙上に気泡が入らないように重ねた。その後、予め５％メタノール／２５ｍＭ Ｔｒｉｓにて平衡化したニトロセルロース膜（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ Ｔｒａｎｓｆｅｒ−Ｍｅｄｉｕｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）をゲルの上に気泡が入らないように重ねた。更に同溶液に予め浸しておいた濾紙を気泡が入らないように重ね、最後に、５％メタノール／３００ｍＭ Ｔｒｉｓに浸した濾紙を気泡が入らないように重ねた。その上に陽極電極をのせ、２ｍＡ／ｃｍ２、２時間室温にて転写を行った。転写終了後、ニトロセルロース膜をブロックエース（大日本製薬株式会社）に浸し、３７℃、一時間ブロッキング操作を行った。その後ニトロセルロース膜を１０ｍｌの６．８μｇ／ｍｌのＦ１０３１−８−３抗体と３７℃、２時間反応させ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄後、抗マウスＩｇＧ抗体−ＨＲＰコンジュゲート（ＤＡＫＯ Ａ／Ｓ）と３７℃、１時間反応させた。反応終了後、ニトロセルロース膜を０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄した。未反応のコンジュゲートを洗い流した後、蒸留水にて２倍希釈したＴＭＢ−Ｈ（Ｍｏｓｓ．Ｉｎｃ）５０ｍｌに浸し、４℃一晩暗所にて発光させた。
９−（５）敗血症患者血清からの血中可溶型蛋白質の精製
９−（１）で調製した１ｍＬのＦ１０２４−１−３−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ ＦＦを内径１ｃｍのエコノカラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ）につめ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＤ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化した。同時に実施例９−（２）で調製した１ｍｌのＳ６８−Ｓｅｐｈａｏｒｓｅ ４ＦＦを同様に内径１ｃｍエコノカラムにつめ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＤ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化した。次に、Ｓ６８−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ４ＦＦカラムの先端にＦ１０２４−１−３−ＳｅｐｈｒａｏｓｅＴＭ４Ｂカラムが配置されるように２本のカラムを直列につないだ。この直列カラムに１８ｍＬの敗血症患者血清を０．０２ｍｌ／ｍｉｎの流速で供した。カラムに吸着しない蛋白質を０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＤ−ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）にて洗浄後、Ｓ６８−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦカラムをはずし、Ｓ６８−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦカラムに吸着した蛋白質を０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭ ＨＣｌにより０．２ｍＬ／ｍｉｎの流速で溶出し、２ｍＬずつ１０本、分取した。各分画容器には予め５００ｍＭ重炭酸アンモニウム２００μＬを添加しておき、溶出液のｐＨを直ぐに中性に戻した。各分画中の実施例７−（１）のキットで検出される血中可溶型蛋白質の濃度を測定し、該蛋白質を含む分画をプール後凍結乾燥した。
凍結乾燥終了後、凍結乾燥粉末に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１５０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液０．２ｍＬを加え溶解し、３，５００×ｇ、１０分間遠心分離を行い、その上清を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ＧＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたゲルろ過に供した。展開溶液として０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１５０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液を用い、試料０．２ｍＬをカラムに供し、流速０．８ｍＬ／ｍｉｎで添加した。試料添加後、７．８分後から０．４５ｍＬずつ４０本分取した。
各分画を実施例７−（１）のキット及び市販ＣＤ１４−ＥＩＡキット（ＩＢＬ−Ｈａｍｂｕｒｇ社）にて測定した。その結果、実施例７−（１）のキットで検出される血中可溶型蛋白質はフラクション１２にピークを有するフラクション１１から１３までに認められ、敗血症患者血清１８ｍｌから１．１μｇの血中可溶型蛋白質を得た。なお、該蛋白質のピークは、２９±５ｋＤａの位置であった。分子量マーカーはＧｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ＬＭＷ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、ＢＳＡ（６７．０ｋＤａ）、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（４３．０ｋＤａ）、ＣｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎＡ（２５．０ｋＤａ）及びＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＡ（１３．７ｋＤａ）を用いた。
次いで、これらのゲルろ過のフラクションを９−（４）に示したウェスタンブロッティングに供し、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ＰｒｏｔｅｉｎＴＭ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて実施例７−（１）のキットで検出される血中可溶型蛋白質の同定及び分子量の測定を行った。その結果、上記のゲルろ過フラクションの実施例７−（１）のキットの測定結果と一致して増減し、フラクション１２にピークを有する血中可溶型蛋白質は、分子量１３±２ｋＤａのバンドが検出された。（図６、図７）
（実施例１０） 正常ヒト血清からの血中可溶型蛋白質の精製
１０−（１）正常ヒト血清からの血中可溶型蛋白質の精製
日本バイオテスト（株）より購入したヒト正常血清を実施例７−（１）のキットにより定量した結果、６１ｎｇ／ｍＬの値を得た。
そこで、実施例９−（１）で調製した２０ｍＬのＦ１０２４−１−３−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｂ担体をＸＫカラム２６／２０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）につめ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＤ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化した。また、実施例９−（２）で調製した８ｍｌのＳ６８−Ｓｅｐｈａｏｒｓｅ ４ＦＦ担体をＸＫカラム１６／２０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）につめ、同様に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＤ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にて平衡化した。
次に、Ｓ６８−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦカラムの上端にＦ１０２４−１−３−Ｓｅｐｈｒａｏｓｅ ４Ｂカラムが配置されるように２本のカラムを直列につないだ。この連結カラムに上記ヒト正常血清１．３Ｌを０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で供した。吸着しない蛋白質を０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＤ−ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）にて洗浄後、連結していたカラムをはずし、Ｓ６８−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦカラムに吸着した蛋白質を０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭ ＨＣｌにより１ｍＬ／ｍｉｎの流速で１６０分間溶出し、２０ ｍＬずつ分取した。分取する容器には予め５００ｍＭ重炭酸アンモニウム２ｍＬを添加しておき、溶出液のｐＨを直ぐに中性に戻した。各分画中の実施例７−（１）のキットで検出される血中可溶型蛋白質の濃度を測定し、該蛋白質を含む分画をプール後凍結乾燥した。
凍結乾燥粉末に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１５０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液１ｍＬを加え溶解し、孔径０．２２μｍのフィルター（Ｍｙｌｅｘ ＧＶ１３、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にてろ過後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ＧＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムを用いたゲルろ過に供した。展開溶液として０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１５０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液を用い、試料０．５ｍＬをカラムに供し、流速０．８ｍＬ／ｍｉｎでゲルろ過を実施した。試料添加７．８分後から分取を開始し、０．４５ｍＬずつ４０本分取した。このゲルろ過を２回実施した。
各分画を実施例７−（１）のキット及び市販ＣＤ１４−ＥＩＡキット（ＩＢＬ−Ｈａｍｂｕｒｇ社）にて測定した。その結果、実施例７−（１）のキットで検出される血中可溶型蛋白質はフラクション１２にピークを有するフラクション１１から１３までに認められた。実施例９−（４）と同様に求めた該蛋白質のピークは、２９±５ｋＤａの位置であった。
次いで、これらのゲルろ過のフラクションを実施例９−（４）に示したウェスタンブロッティングに供し、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ＰｒｏｔｅｉｎＴＭ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて実施例７−（１）のキットで検出される血中可溶型蛋白質の同定及び分子量の測定を行った。その結果、上記のゲルろ過フラクションの実施例７−（１）のキットの測定結果と一致して増減し、フラクション１２にピークを有する血中可溶型蛋白質は、分子量１３±２ｋＤａのバンドが検出された。（図８）
上記フラクションをプールし、凍結乾燥を行った。得られた凍結乾燥標品に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１５０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液１００μＬを加え溶解し、実施例７−（１）のキットにより該血中可溶型蛋白質の回収量を求めた。その結果、ヒト正常血清１．３Ｌから１９μｇの血中可溶型蛋白質が得られた。
１０−（２）アミノ酸配列の同定
［１］エレクトロブロッティング
実施例１０−（１）で凍結乾燥した実施例７−（１）のキットに検出される血中可溶型蛋白質を実施例９−（３）に記載したＳＤＳ−ＰＡＧＥによりアクリルアミドゲル上に展開した後、ポリビニリデンジフルオライド（以下、ＰＶＤＦ）膜へのエレクトロブロッティングを行った。すなわち、転写装置である白金電極セミドライトランスファー（株式会社バイオクラフト）の陰極の上に２０％メタノール／２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／４０ｍＭ εアミノカプロン酸溶液に浸したろ紙を置き、その上に電気泳動後のアクリルアミドゲル、さらにＰＶＤＦ膜（Ｃｌｅａｒ Ｂｌｏｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐ（アトー株式会社））を重ねて置いた。さらに２０％メタノール／２５ｍＭ Ｔｒｉｓに浸したろ紙、２０％メタノール／０．３Ｍ Ｔｒｉｓに浸したろ紙の順で重ね、最後に装置の陽極をセットした。転写はおよそ２ｍＡ／ｃｍ２の定電流で１時間行った。
［２］転写タンパク質の検出
エレクトロブロッティング後のＰＶＤＦ膜を０．１％クマシーブリリアントブルーＧ２５０／１０％酢酸／３０％アセトニトリル溶液に約５分浸した後、１０％酢酸／３０％アセトニトリル溶液で適度に脱色し、タンパク質を検出した。
［３］アミノ酸配列分析
ＰＶＤＦ膜上で検出した分子量１３±２ｋＤａのタンパク質のバンドをきれいなカッターナイフで切り出し、１．７ｍＬ マイクロ遠心チューブに移した。切り出したＰＶＤＦ膜断片を、０．１％ トリフルオロ酢酸／５０％ メタノール溶液で３回洗浄し、さらにメタノールで洗浄後、完全に乾燥させた。アミノ酸配列分析はプロテインシーケンサ Ｐｒｏｃｉｓｅ４９４ｃＬＣ（アプライドバイオシステムズジャパン）を使用した。洗浄後のＰＶＤＦ膜断片をプロテインシーケンサにセットし、必要な分析サイクルを設定後、分析した。この結果、主要配列として、Ｎ末端にThr Thr Pro Glu Pro Xaa Glu Leu Asp Asp Gluのアミノ酸配列を有するペプチドが確認できた。
なお、Xaaは、プロテインシーケンサの性質から、Cys, Asn, Ser, Thrまたはその他の修飾アミノ酸である可能性があるが、分析した蛋白質がＣＤ１４由来の蛋白質であることを考慮すると、Cysであると考えられる。また、還元アルキル化法によるアミノ酸分析で、XaaがCysであると求めることができる。
これらの結果から、ゲルろ過フラクション後の非還元下１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分子量１３±２ｋＤａのバンドを抽出したフラクションは、純度よく、実施例７−（１）のキットで検出される血中可溶型蛋白質が精製されたことがわかった。
また、実施例７−（１）のキットで検出される血中可溶型蛋白質は、Ｎ末端にＣＤ１４の１残基目からのアミノ酸配列Thr Thr Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Gluを有し、非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは分子量１３±２ｋＤａの新規な蛋白であることがわかった。また、実施例７−（１）のキットで検出されることから、配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製した抗体に特異的に結合することがわかる。
実施例９及び１０の結果から、敗血症患者血清で確認した実施例７−（１）のキットで検出された血中可溶型蛋白質は、正常ヒト血清にも存在することが明らかとなった。また該蛋白質は、敗血症患者血清ではより多い比率で回収されたことになる。
なお、実施例８〜１０で用いたＩＢＬ−キットの代わりに、標識抗体として標識した３Ｃ１０を固相抗体としてＭＥＭ−１８（Ｍｏｎｏｓａｎ社）を用いたサンドイッチ測定系を用いても、ＩＢＬ−キットと同様な結果が得られた。
標識は実施例３−（３）に記載に準じて行い、サンドイッチ測定系は実施例７−（１）に準じて構成した。
（実施例１１）各種疾患患者の測定
敗血症患者血清は分離菌が同定された１０例を使用した（表５）。また、正常人５２例（男性３１例、女性２１例）、及び各種疾患患者（２０疾患、６０例）を実施例７−（１）に記載の測定キットを用いて測定した。
Figure 0004040666
血清中の実施例７−（１）のキットで検出される可溶型蛋白質の濃度は正常人で０．００８〜０．１００μｇ／ｍＬに分布し、平均値は０．０４μｇ／ｍＬであった。敗血症患者では０．１９０〜７．２６０μｇ／ｍＬに分布し、平均値は２．０μｇ／ｍＬであった。該可溶型蛋白質濃度は敗血症患者では正常人及び各種疾患患者に比べ高値であり、各種疾患患者中には正常人と比較して高値を示す疾患は見出せなかった。
（実施例１２）市販の血中可溶型ＣＤ１４蛋白質ＥＬＩＳＡキットとの比較
１２−（１）各種疾患患者血中可溶型ＣＤ１４蛋白質の測定
実施例１１の検体を市販ＣＤ１４−ＥＩＡキット（ＩＢＬ−Hamburg）を用いて測定した。血清中の可溶型ＣＤ１４蛋白質の濃度は正常人で５．６〜１１．２μｇ／ｍＬに分布し、敗血症患者では高値例が認められた。しかしながら、各種疾患患者血清中においても可溶型ＣＤ１４蛋白質が高値を示す例が多数認められ、敗血症患者血清との間に差は認められなかった。
１２−（２）Ｓ６８抗体を用いたキットとの比較
実施例１１で測定した該可溶型蛋白質の測定値と比較検討を行った。表６に示すように市販ＣＤ１４−ＥＩＡキットでは正常、各種疾患、敗血症間に最大１．７倍程度の差しか認められないのに対して実施例７−（１）の測定キットでは正常人と各種疾患の間に差は認められないが、正常人と敗血症の間には５０倍の差が認められ、実施例７−（１）の測定キットの測定値が敗血症で特異的に上昇することが明らかになった。
Figure 0004040666
正常人の平均値＋３Ｓ．Ｄ．をカットオフ値（実施例７−（１）の測定キット：０．１３４μｇ／ｍＬ、市販ＣＤ１４−ＥＩＡ：１１．１４μｇ／ｍＬ）として陽性例（敗血症）と陰性例（正常＋各種疾患）に分けて解析した結果を表７に示す。その結果に基づき、両キットの一致率（（ＥＩＡ陽性一致数＋ＥＩＡ陰性一致数）／総数×１００）、感度（ＥＩＡ陽性一致数／陽性例×１００）、特異度（ＥＩＡ陰性一致数／陰性例×１００）を算出したところ、表８に示すように、実施例７−（１）のキットでは一致率９４．３％、感度１００．０％、特異度９３．８％とカットオフ値を設定することにより敗血症の鑑別診断に有用であることが明らかになった。一方、市販のＣＤ１４−ＥＩＡでは感度、特異度ともに敗血症を診断できるほどの特異性及び有用性は認められなかった。
Figure 0004040666
Figure 0004040666
（実施例１３）組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメントの調製
実施例１０において精製した血中可溶型蛋白質（以降、可溶性ＣＤ１４サブタイプ、若しくはその略号として、低分子ｓＣＤ１４−ＳＴと記載することがある）を組換え蛋白質として発現させる目的で、行った。
１３−（１）ＣＤ１４ Ｃ末欠失改変体発現プラスミドの構築
組換え型可溶性ＣＤ１４フラグメント（以降、組換え型可溶性ＣＤ１４サブタイプ、若しくはその略号として、ｒｓＣＤ１４−ＳＴと記載することがある）を調製するため、ＣＤ１４のＣ末を欠失した蛋白質を産生するプラスミドを構築した。
配列番号３記載のヒトＣＤ１４分子の
１）６６位からＣ末端までを欠失した分子（以降、ＣＤ１４（１−６５）と記載する、以下同様）、
２）７１位からＣ末端までを欠失した分子（ＣＤ１４（１−７０））、
３）７６位からＣ末端までを欠失した分子（ＣＤ１４（１−７５））、
４）８１位からＣ末端までを欠失した分子（ＣＤ１４（１−８０））、
５）８６位からＣ末端までを欠失した分子（ＣＤ１４（１−８５））、
６）９１位からＣ末端までを欠失した分子（ＣＤ１４（１−９０））、
７）９６位からＣ末端までを欠失した分子（ＣＤ１４（１−９５））、
８）１０１位からＣ末端までを欠失した分子（ＣＤ１４（１−１００））、
９）１０６位からＣ末端までを欠失した分子（ＣＤ１４（１−１０５））、
１０）１１１位からＣ末端までを欠失した分子（ＣＤ１４（１−１１０））、
をホニュウ細胞で発現するプラスミド、pCAG65、pCAG70、pCAG75、pCAG80、pCAG85、pCAG90、pCAG95、pCAG100、pCAG105及びpCAG110は以下の方法で構築した。
センスプライマー1（5’-TTT CCT ACA GCT CCT GGG-3’）（配列番号１１）とアンチセンスプライマー1（5’-GG GGT ACC TTA GTC AGC ATA CTG CCG CGG GTC-3’） （配列番号１２）、アンチセンスプライマー2（5’-GG GGT ACC TTA GAG AGC CTT GAC CGT GTC AGC-3’） （配列番号１３）、アンチセンスプライマー3（5’-GG GGT ACC TTA GAG CCG CCG CAC GCG GAG AGC-3’） （配列番号１４）、アンチセンスプライマー4（5’-GG GGT ACC TTA TGC GGC TCC CAC TGT GAG CCG-3’） （配列番号１５）、アンチセンスプライマー5（5’-GG GGT ACC TTA CTG AGC AGG AAC CTG TGC GGC-3’） （配列番号１６）、アンチセンスプライマー6（5’-GG GGT ACC TTA GGC GCC TAC CAG TAG CTG AGC-3’） （配列番号１７）、アンチセンスプライマー7（5’-GG GGT ACC TTA CGC TAG CAC ACG CAG GGC GCC-3’） （配列番号１８）、アンチセンスプライマー8（5’-GG GGT ACC TTA CTT GAG GCG GGA GTA CGC TAG-3’） （配列番号１９）、アンチセンスプライマー9（5’-GG GGT ACC TTA CTC GAG CGT CAG TTC CTT GAG-3’） （配列番号２０）及びアンチセンスプライマー10（5’-GG GGT ACC TTA GGT TAT CTT TAG GTC CTC GAG-3’） （配列番号２１）を設計した。次にpCAG356を鋳型にセンスプライマー1とアンチセンスプライマー１、センスプライマー1とアンチセンスプライマー2、センスプライマー1とアンチセンスプライマー3、センスプライマー1とアンチセンスプライマー4、センスプライマー1とアンチセンスプライマー5、センスプライマー1とアンチセンスプライマー6、センスプライマー1とアンチセンスプライマー7、センスプライマー1とアンチセンスプライマー8、センスプライマー1とアンチセンスプライマー9、あるいはセンスプライマー1とアンチセンスプライマー10のプライマーセットでそれぞれPCRを行った。PCRの反応条件は90℃ 2分間で熱した後、<1>98℃ 10秒、<2>50℃ 30秒、<3>72℃ 1分のサイクルを30回繰り返した。得られた産物を制限酵素EcoRＩとKpnＩとでdouble digestionし、0.4kb〜0.5kbの断片をそれぞれ回収した。これらの断片を、pCAG356を制限酵素EcoRＩ及びKpnＩによって切断することによって得られる約4.8kbの断片と接合し、E.coli JM109を定法に従い形質転換し、各発現プラスミドを得た。なお、pCAG356は、pCGAAS（GENE, vol.15 p269-277 (1989)にＷＯ９８／３９４３８に記載のプラスミドｐＵＣＨ１４Ｐ−４由来のCD14遺伝子を挿入したプラスミドである。
１３−（２）蛋白分解酵素の切断配列を挿入したＣＤ１４発現プラスミドの構築
実施例１３−（１）記載のプラスミドを用いたｒｓＣＤ１４−ＳＴの生産法では産生量が非常に低いことから、実施例１−（１）記載のプラスミドを用いたｒｓＣＤ１４−ＳＴの生産法で発現したフラグメントを標準品として純品まで精製できないと判断した。そこで、３５６の長さを有するＣＤ１４の６４位を特異的に切断する蛋白分解酵素の切断配列を挿入し、全長で発現した後に蛋白分解酵素で特異的に切断し、配列番号３の１位〜６４位までの部分と残りの部分を分離精製する方法を選択し、ｒｓＣＤ１４−ＳＴの調製を行った。蛋白分解酵素の切断配列としてはＰｒｏＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ認識配列及びＴｈｒｏｍｂｉｎ認識配列の２種類を使用した。
１３−（２）−１ ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（ＰＳＰ６４／３５６）発現プラスミドの構築
配列番号３に記載のヒトＣＤ１４の６４位のＡｌａと６５位のＡｓｐアミノ酸の間に、ＰｒｏＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ認識配列（ＬＥＶＬＦＱＧＰの８アミノ酸残基、一文字表記）を挿入したｒｓＣＤ１４（以降、ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（ＰＳＰ６４／３５６）と、記載することがある）を発現するプラスミドは以下の方法にて構築した。センスプライマー１（５’−ＴＴＴ ＣＣＴ ＡＣＡ ＧＣＴ ＣＣＴ ＧＧＧ−３’）、センスプライマー２（５’−ＧＣＴ ＣＴＧ ＧＡＡ ＧＴＴ ＣＴＧ ＴＴＣ ＣＡＧ ＧＧＧ ＣＣＣ ＧＡＣ ＡＣＧ ＧＴＣ ＡＡＧ ＧＣＴ ＣＴＣ ＣＧＣ ＧＴＧ ＣＧＧ−３’） （配列番号２２）、アンチセンスプライマー１１（５’−ＧＴＣ ＧＧＧ ＣＣＣ ＣＴＧ ＧＡＡ ＣＡＧ ＡＡＣ ＴＴＣ ＣＡＧ ＡＧＣ ＡＴＡ ＣＴＧ ＣＣＧ ＣＧＧ ＧＴＣ ＧＧＣ ＧＴＣ ＣＧＣ−３’） （配列番号２３）及びアンチセンスプライマー１２（５’−ＴＣＴ ＣＣＡ ＴＴＣ ＣＴＧ ＴＧＴ ＴＧＣ ＧＣ−３’） （配列番号２４）をそれぞれ設計・合成し、配列番号３に記載の可溶型ヒトＣＤ１４構造遺伝子配列を挿入したプラスミドｐＣＡＧ３５６を鋳型にＡ：センスプライマー１とアンチセンスプライマー１１、Ｂ：センスプライマー２とアンチセンスプライマー１２を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件はＡ：９０℃ ２分間で熱した後、<1>９８℃ １０秒、<2>５０℃ ３０秒、<3>７２℃ １分のサイクルを３０回、Ｂ：９０℃ ２分間で熱した後、<1>９８℃ １０秒、<2>４６℃ ３０秒、<3>７２℃ １分のサイクルを３０回繰り返した。得られたＰＣＲ増幅産物Ａ：約０．５ｋｂ、Ｂ：約０．５ｋｂを回収し、引き続きこれら２つの混合物を鋳型にセンスプライマー１とアンチセンスプライマー１２を用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は上記Ａと同様に行った。得られた約０．９ｋｂのＰＣＲ増幅物を回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにて切断した。この断片を、ｐＣＡＧ３５６を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにて切断することによって得られる約５．２ｋｂの断片と接合し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を定法に従い形質転換した。得られた発現プラスミドをｐＣＡＧ３５６（ＰＳＰ６４／３５６）とした。さらにｐＣＡＧ３５６を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化し、約１．３ｋｂの断片を回収した。この断片を、ヒトＥＦ−１αプロモーターを持つ哺乳細胞発現ベクターｐＴＫ−２０４３をＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化して得られる約４．４ｋｂの断片と接合し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を定法に従って形質転換することにより、ｐＴＫ３５６（ＰＳＰ６４／３５６）を得た。
１３−（２）−２ ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（２ＳＴ６４／３５６）発現プラスミドの構築
配列番号３に記載のヒトＣＤ１４の６４位のＡｌａと６５位ののＡｓｐアミノ酸の間に、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ認識配列（ＬＶＰＲＧＳの６アミノ酸残基）を挿入したｒｓＣＤ１４（以降、ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（２ＳＴ６４／３５６と、記載することがある）を発現するプラスミドは以下の方法にて構築した。センスプライマー３（５’−ＣＴＧ ＧＴＴ ＣＣＧ ＣＧＴ ＧＧＴ ＴＣＣ ＧＡＣ ＡＣＧ ＧＴＣ ＡＡＧ−３’） （配列番号２５）、アンチセンスプライマー１３（５’−ＧＡＡ ＣＣＡ ＣＧＣ ＧＧＡ ＡＣＣ ＡＧＡ ＧＣＡ ＴＡＣ ＴＧＣ ＣＧＣ−３’） （配列番号２６）、アンチセンスプライマー１４（５’−ＣＧＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＡＡ ＴＧＡ ＴＧＡ ＴＧＡ ＴＧＡ ＴＧＡ ＴＧＧ−３’） （配列番号２７）をそれぞれ設計・合成し、プラスミドｐＣＡＧ３５６の可溶型ヒトＣＤ１４のＣ末端にＨｉｓタグ（Ｈｉｓ×６個）を付加した分子の構造遺伝子配列を持つｐＣＡＧ３５６−Ｈｉｓを鋳型に、Ａ：センスプライマー１とアンチセンスプライマー１３、Ｂ：センスプライマー３とアンチセンスプライマー１４を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は９６℃で２分間熱した後、<1>９６℃ ３０秒、<2>５５℃ ３０秒、<3>７２℃ １分のサイクルを２５回繰り返した。得られたＰＣＲ増幅産物Ａ：約０．５ｋｂ、Ｂ：約０．９ｋｂを回収し、引き続きこれら２つの混合物を鋳型にセンスプライマー１とアンチセンスプライマー４を用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は上記Ａと同様に行った。得られた約１．４ｋｂのＰＣＲ増幅物を回収し、ｐＴ７−Ｂｌｕｅ（Ｔ）ベクターに挿入し、塩基配列を確認した後に、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにて切断した。得られた約１．３ｋｂの断片を、ｐＴＫ−２０４３をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化して得られる約４．４ｋｂの断片と接合し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を定法に従い形質転換することによりｐＴＫ３５６Ｈ（ＴＢ６４）を得た。
１３−（３）ｒｓＣＤ１４−ＳＴの調製
１３−（３）−１ ｒｓＣＤ１４−ＳＴの調製
（１）に記載の各プラスミドをＣＯＳ―１細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０）に、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いてトランスフェクションした。すなわち、マニュアルに従いトランスフェクション試薬１．７μＬ／ｍＬ及びプラスミド４μｇ／ｍＬを混合し、培地に添加した後、ＣＯＳ―１細胞に添加し３７℃で培養した。７２時間後、培養上清を回収した。培養上清は遠心後、０．２２μｍのフィルターでろ過した。
１３−（３）−２ ｒｓＣＤ１４の調製
（２）−１及び（２）−２に記載のｒｓＣＤ１４−ＳＴの配列をコードする遺伝子を含むプラスミド（ｐＴＫ３５６（ＰＳＰ６４／３５６）及びｐＴＫ３５６Ｈ（ＴＢ６４））をＣＯＳ―１細胞にＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いてトランスフェクションした。すなわち、マニュアルに従いトランスフェクション試薬１．７μＬ／ｍＬ及びプラスミド４μｇ／ｍＬを混合し、培地に添加した後、ＣＯＳ―１細胞に添加し３７℃で培養した。７２時間後、培養上清を回収し、新しい培地を添加して、さらに９６時間培養し、その培養上清も回収した。培養上清は遠心後、０．２２μｍのフィルターでろ過し、精製に供した。
１３−（３）−３ ｒｓＣＤ１４−ＳＴの調製（２）
（３）−２で生産した各培養上清よりｒｓＣＤ１４−ＳＴ（ＰＳＰ６４／３５６）、ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（２ＳＴ６４／３５６）を精製し、蛋白分解酵素で切断後、ｓＣＤ１４−ＳＴを精製した。
＜１＞ ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（２ＳＴ６４）の精製
以降の操作は特に記載しない限り４℃にて実施した。
Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（アマシャムバイオサイエンス）担体に、０．１Ｍ 硫酸ニッケル水溶液を等容量流し、次いで蒸留水を３容量流して未反応のニッケルを洗浄し、ニッケル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ担体を調製した。
（３）−２で得られた１０００ ｍＬのＣＯＳ−１培養上清をＰＢＳにて平衡化した４０ ｍＬのニッケル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに流速８ ｍＬ／分で添加し、非吸着蛋白質をＰＢＳにて洗浄した。次いで、２０ ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳにて非特異的に吸着した蛋白質を溶出させた後、５００ ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳにて目的蛋白質を溶出させた。この溶出液をＰＢＳに対して一晩透析した。
透析液の蛋白濃度を後述する実施例１５−（３）で示した手法に従い測定した。この結果を基に、酵素：基質＝１：５０（Ｕ：μｇ）となるようにトロンビンプロテアーゼ（アマシャムバイオサイエンス）を添加し、２２℃、一晩静置しトロンビンによる切断反応を実施した。
１／１０容量の１００ ｍＭ ベンズアミジン水溶液を添加し酵素反応を終了し、次いで、２倍容量の８ Ｍ尿素を含む５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．５）バッファーを添加した。この溶液を予め８ Ｍ尿素を含む５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．５）バッファーにて平衡化した３ ｍＬのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（アマシャムバイオサイエンス）カラムに流速３ ｍＬ／ｍｉｎで供した。非吸着蛋白質を同バッファーにて洗浄後、吸着した蛋白質を０−５００ ｍＭ ＮａＣｌの直線濃度勾配（５０分）により溶出した。溶出液を３ ｍＬずつ分取し、各フラクションのｒｓＣＤ１４−ＳＴ（２ＳＴ６４／３５６）から６５位以降を切断して得られたｒｓＣＤ１４−ＳＴ（以降、ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（２ＳＴ６４）と記載することがある）に相当する画分の含量を実施例７−（３）のキットにより測定した。
ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（２ＳＴ６４）を含むフラクションをプールし、１５０ ｍＭ 炭酸水素アンモニウム水溶液に対して一晩透析し、その後凍結乾燥した。得られた凍結乾燥標品を８ Ｍ 尿素を含むＰＢＳにて溶解し、予め同バッファーにて平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラム（アマシャムバイオサイエンス）に０．４ｍＬ／ｍｉｎの流速で供した。カラム溶液を０．４５ μＬずつ４０本分取し各フラクションのｒｓＣＤ１４−ＳＴ（２ＳＴ６４）純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認後、プールした。すなわち、各フラクションに等容量のＴｒｉｓ−ＳＤＳ−Ｓｅｐｒａｓｏｌ（第一化学薬品株式会社）を添加し、１００℃、５分間加熱処理後、５−２０％のｅ−ＰＡＧＥＬゲル（アトー株式会社）に供し，Ｌａｅｍｍｌｉの手法に従い非還元条件下により２５ｍＡ、９０分間泳動した。泳動終了後、ゲルを銀染色キット２Ｄ銀染色試薬・II「第一」（第一化学薬品株式会社）を用いて染色した。この２ＳＴ６４標品を蒸留水に対して一晩透析し、最終精製標品を得た。最終精製標品の蛋白濃度を後述する実施例１５−（３）で示した手法に従い測定した。以上の操作により、１０００ ｍＬのＣＯＳ−１培養上清から４５２μｇのｒｓＣＤ１４−ＳＴ（２ＳＴ６４）を得た。得られた精製標品の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認したところ、図９に示すように単一バンドとして検出された。
＜２＞ ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（ＰＳＰ６４）の精製
以下の操作は特に記載しない限り４℃にて行なった。
（３）−２で得られたＣＯＳ−１培養上清を予めＰＢＳにて平衡化した３Ｃ１０−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦカラムに流速９ｍＬ／ｍｉｎで供し、ＰＢＳにて非吸着蛋白質を洗浄後、１０ ｍＭ ＨＣｌにて吸着蛋白質を溶出した。溶出画分は1／10容量の５００ ｍＭ重炭酸アンモニウムを添加しｐＨを中性に戻した後、凍結乾燥した。なお、３Ｃ１０−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦカラムは次のように調製した。３Ｃ１０抗体を１０ｋＤａの分子量カットオフを有する透析膜を使用し、２．５Ｌの０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ ８．３）を透析液として４℃、一晩透析した。尚、透析液は３回交換した。次いで、予め０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ ８．３）にて平衡化しておいたＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を透析した３Ｃ１０抗体溶液に添加し、４℃一晩、カップリング反応を行った。次いで、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．５Ｍ モノメタノールアミン（ｐＨ ８．３）を担体に加え、４℃一晩ブロッキング反応を行った。ブロッキング反応終了後、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ ４）で担体を洗浄し、その後、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ ８．３）で担体を洗浄した。
得られた凍結乾燥標品を１ ｍＭ ＥＤＴＡ及び１５０ ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７）バッファーに溶解し、蛋白濃度を後述する実施例１５−（３）で示した手法に従い測定した。その後、酵素：基質比＝１：３（Ｕ：μｇ）となるようにＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（アマシャムバイオサイエンス）を添加し、４℃一晩切断反応を実施した。反応終了後、８ Ｍ 尿素を含む５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．５）バッファーを２倍容量添加し、２ ｍＬのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラムに流速１ｍＬ／ｍｉｎで供した。非吸着蛋白質を同バッファーにて洗浄後、吸着した蛋白質を０−５００ ｍＭ ＮａＣｌの直線濃度勾配（１００分）により溶出した。溶出液を３ ｍＬずつ分取し、各フラクションのｒｓＣＤ１４−ＳＴ（ＰＳＰ６４／３５６）から６５位以降を切断して得られたｒｓＣＤ１４−ＳＴ（以降、ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（ＰＳＰ６４）と記載することがある）に相当する画分の含量を実施例７−（３）のキットにより測定した。
ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（ＰＳＰ６４）を含むフラクションをプールし、１５０ ｍＭ 炭酸水素アンモニウム水溶液に対して一晩透析し、その後凍結乾燥した。得られた凍結乾燥標品を８ Ｍ 尿素を含むＰＢＳにて溶解し、予め同バッファーにて平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラム（アマシャムバイオサイエンス）に流速０．４ｍＬ／ｍｉｎで供した。０．４５ ｍＬずつ４０本分取し各フラクションのｒｓＣＤ１４−ＳＴ（ＰＳＰ６４）純度を＜１＞で示したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認後、プールした。このｒｓＣＤ１４−ＳＴ（ＰＳＰ６４）標品を蒸留水に対して一晩透析し、最終精製標品を得た。最終精製標品の蛋白濃度を後述する実施例１５−（３）で示した手法に従い測定した。以上の操作により、１３，０００ ｍＬのＣＯＳ−１培養上清から３６８μｇのＰＳＰ６４を得た。また、得られた精製標品の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認したところ、図９に示すように単一バンドとして検出された。
（実施例１４） ｒｓＣＤ１４−ＳＴの評価
１４−（１） 実施例７−（３）のキットを用いた濃度測定
実施例１３−（３）−１で調製した培養上清中にｒｓＣ１４−ＳＴが産生されているかを確認するため実施例７−（３）のキットを用いて各培養上清中のｒｓＣＤ１４−ＳＴ濃度を測定した。その結果を表９に示す。また、各培養上清を実施例９−（４）記載の方法によりウエスタンブロティングした結果全くバンドが検出されなかった。このことより、ｒｓＣＤ１４−ＳＴは産生されており高感度に検出可能なキットでは検出されるが、実際の蛋白量としては非常に少ないと判断された。
Figure 0004040666
１４−（２）ウエスタンブロティングによるｒｓＣＤ１４−ＳＴの検出
実施例１０−（１）で調製したｓＣＤ１４−ＳＴ及び実施例１３−（３）−３で調製したｒｓＣＤ１４−ＳＴ（ＰＳＰ６４）のＦ１１０６−１３−３、Ｆ１０３１−８−３抗体及びＳ６８抗体に対する反応性を確認した。すなわち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは１２．５％ゲルを用い、Ｌａｅｍｍｌｉの手法に従い非還元条件下により実施した。試料に等容量のＴｒｉｓ−ＳＤＳ−Ｓｅｐｒａｓｏｌ（第一化学薬品株式会社）を添加し、４℃、一晩ＳＤＳ処理を行なった後、１２．５％のｅ−ＰＡＧＥＬゲル（アトー株式会社）に供し、Ｌａｅｍｍｌｉの不連続バッファーシステムにより４０ｍＡ、４０分間泳動した。
予めＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルのサイズに切っておいた濾紙を５％メタノール／２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／４０ｍＭ εアミノカプロン酸溶液に浸し、白金電極セミドライトランスファーＢＥ３２０（株式会社バイオクラフト）の陰極電極盤上に置き、ゲルを同溶液に浸し濾紙上に気泡が入らないように重ねた。その後、予め５％メタノール／２５ｍＭ Ｔｒｉｓにて平衡化したニトロセルロース膜（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ Ｔｒａｎｓｆｅｒ−Ｍｅｄｉｕｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）をゲルの上に気泡が入らないように重ねた。更に同溶液に予め浸しておいた濾紙を気泡が入らないように重ね、最後に、５％メタノール／３００ｍＭ Ｔｒｉｓに浸した濾紙を気泡が入らないように重ねた。その上に陽極電極をのせ、２ｍＡ／ｃｍ２、２時間室温にて転写を行った。転写終了後、ニトロセルロース膜をブロックエース（大日本製薬株式会社）に浸し、３７℃、８０分間ブロッキング操作を行った。その後ニトロセルロース膜を６．８μｇ／ｍｌのＦ１１０６−１３−３抗体、６．８μｇ／ｍｌのＦ１０３１−８−３抗体または６．８μｇ／ｍｌのＳ６８抗体と３７℃、８０分間反応させ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄後、Ｆ１１０６−１３−３抗体及びＦ１０３１−８−３抗体と反応させたニトロセルロース膜は抗マウスＩｇｓ抗体−ＨＲＰコンジュゲート（ＤＡＫＯ）と、Ｓ６８抗体と反応させたニトロセルロース膜は抗ウサギＩｇＧ抗体−ＨＲＰコンジュゲート（ＤＡＫＯ）とそれぞれ３７℃、１時間反応させた。反応終了後、ニトロセルロース膜を０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄した。未反応のコンジュゲートを洗い流した後、ＥＣＬ（Ｐｌｕｓ）（アマシャムバイオサイエンス）４ｍＬを加え、室温，５分間反応させた後、ＨｙｐｅｒｆｉｌｍＴＭ ＥＣＬ（アマシャムバイオサイエンス）の上に重ね、９０秒間露光した。
その結果、ｓＣＤ１４−ＳＴ及びＰＳＰ６４は３種類の抗体に対してほぼ同等の反応性を示した。
（実施例１５） ｒｓＣＤ１４−ＳＴの物性解析
実施例１３−（３）−３で調製したｒｓＣＤ１４−ＳＴ（２ＳＴ６４）及びｒｓＣＤ１４−ＳＴ（ＰＳＰ６４）の物性を解析した。なお、両フラグメントは切断に使用する蛋白分解酵素が異なる以外、最終精製品に差はなく、実質的にｒｓＣＤ１４−ＳＴとしては同一の物質である。
１５−（１） Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列分析はプロテインシーケンサ Ｐｒｏｃｉｓｅ４９４ｃＬＣ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を使用した。ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（２ＳＴ６４）精製標品を分析した結果、ＣＤ１４の１残基目からのアミノ酸配列（ＴＴＰＥＰＣＥＬＤＤＧ）（配列番号１）を主要成分として確認した。ＣＤ１４以外のアミノ酸配列は確認されなかった。
１５−（２） 質量分析
ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（２ＳＴ６４）精製標品は２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液中で、Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅＦ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を添加して３７℃で４時間インキュベートし、糖鎖を除去した。得られた糖鎖除去２ＳＴ６４はＺｉｐＴｉｐＣ１８（ミリポア株式会社）で脱塩し、質量分析用の試料とした。質量分析装置はａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ ＴＯＦ（ブルカー・ダルトニクス株式会社）を使用した。マトリックス溶液はシナピン酸を０．１％トリフルオロ酢酸：アセトニトリル＝２：１混合溶液で飽和となるよう溶解して調製した。質量分析用の試料とマトリックス溶液を１：４の比率で混合し、１μＬを質量分析に使用した。質量分析の結果、ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（２ＳＴ６４）のペプチド部分の理論分子量 ７６６３．５と一致する分子量ピークがメインピークとして検出された。Ｎ末端アミノ酸配列分析の結果と併せて考えて、設計どおりの一次構造を持つ分子（ＣＤ１４の１位から６４位のアミノ酸配列からなる分子）が得られていることを確認した。
１５−（３） 蛋白濃度の測定
蛋白濃度の測定は，ＢＲＰアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いＢＳＡ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）標準品を使用して、添付のマニュアルに従って測定した。即ち、ＢＳＡ標準溶液及びＰＢＳにて種々の倍率に希釈した試料３０μＬに蒸留水にて5倍に希釈したＤｙｅ−Ｒｅａｇｅｎｔ１．５ｍＬを添加し、室温にて15分間静置後、その５９５ｎｍの吸光度を分光光度計ＤＵ−７４００（ベックマン）にて測定し、ＢＳＡの検量線から試料中の蛋白濃度を測定した。
１５−（４） 分子量の算出
実施例１３−（３）−３で調製したｒｓＣＤ１４−ＳＴと敗血症患者または正常人より精製したｓＣＤ１４−ＳＴが類似した蛋白質であることを確認するため、ウェスタンブロッティングにより分子量を比較した。
正常ヒト血清からのｓＣＤ１４−ＳＴの精製標品は、実施例１０−（１）で得られた凍結乾燥標品を１００μｌの蒸留水に溶解して用いた。
実施例１４−（２）に示したＦ１０３１−８−３抗体を用いたウエスタンブロティングによりＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて分子量を比較した。その結果、図１０に示すようにヒト血清由来ｓＣＤ１４−ＳＴは分子量１２.９ｋＤａにｒｓＣＤ１４−ＳＴ（２ＳＴ６４）は１２．６ｋＤａにｒｓＣＤ１４−ＳＴ（ＰＳＰ６４）は１２．６ｋＤａに検出された。
１５−（５） ｒｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ標準品との比活性の比較
実施例１３−（３）−３で調製したｒｓＣＤ１４−ＳＴ（２ＳＴ６４）の濃度を実施例７−（１）のキットとｒｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ標準品を用いて測定し、蛋白濃度あたりのＥＩＡ値として算出した。すなわち、ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（２ＳＴ６４）をキットの検体希釈液で１００ｐｇ／ｍＬに希釈後、さらに５０、２５ｐｇ／ｍＬを調製し、キットで測定した。その結果、ｓＣＤ１４−ＳＴ（２ＳＴ６４）１ｐｇあたりのｒｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ換算値は３５２ｐｇとなり、本キットはｒｓＣＤ１４−ＳＴ（２ＳＴ６４）に対して非常に反応性が高いことが示された。
１５−（６） ＬＰＳ結合能及びＩＬ−６産生に対する影響
ｒｓＣＤ１４−ＳＴが全長ＣＤ１４同様にＬＰＳ結合能を有しているか、
国際公開ＷＯ０１／７２９９３号記載のＩＬ−６産生抑制作用を有しているかを検討した。
１５−（６）−１ ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（ＰＳＰ６４）のＩＬ−６産生抑制活性
ｓＣＤ１４−ＳＴ（ＰＳＰ６４）のＩＬ−６産生抑制活性について調べるために、以下の実験を行った。ヒト臍帯血管内皮細胞ＨＵＶＥＣ（三光純薬）を、２％非働化ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）にて９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに２×１０4ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌで植え込み、５％ＣＯ2、３７℃で一晩培養した。翌日、２％ヒト血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（以下、２％非ＦＢＳ／ＲＰＭＩと記載）を調製し、ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（ＰＳＰ６４）あるいは抗ＣＤ１４抗体である３Ｃ１０を２％非ＦＢＳ／ＲＰＭＩで目的濃度の２倍濃度に希釈しサンプルを調製した。また、ＬＰＳ（Ｅ.Ｃｏｌｉ ０５５：Ｂ５、ＤＩＦＣＯ）を、２％非ＦＢＳ／ＲＰＭＩにて、２０ｎｇ／ｍＬに希釈した。一晩培養を行ったＨＵＶＥＣ細胞の培養上清を捨て、０．１％ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて、二度洗浄し、上記サンプル及びＬＰＳ希釈液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、さらに５％ＣＯ2、３７℃で約１８時間培養を行った。その後、培養上清中のＩＬ−６量をヒトＩＬ−６検出キット（Ｅｌｉ−ＰＡＩＲ ｈＩＬ−６；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で定量した。その結果、３Ｃ１０は約０．１μg／ｍＬでＩＬ−６産生をほぼ５０％抑制するのに対し、ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（ＰＳＰ６４）は１０μｇ／ｍＬの濃度まで添加しても、全く抑制活性は示さなかった。
１５−（６）−２ ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（ＰＳＰ６４）のＬＰＳ結合活性
ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（ＰＳＰ６４）にＬＰＳ結合能があるかを、J.B.C, Vol.270, No.3 (1995), pp.1382-1387, 「Soluble CD14 Truncated at Amino Acid 152 Binds LPS and Enables Cellular Response to LPS」を参考にエンドスペシーキット（生化学工業）を用いて検討した。すなわち、ＬＰＳ（Ｅ.Ｃｏｌｉ ０５５：Ｂ５、ＤＩＦＣＯ）を０．０１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−（以下、０．０１％ＢＳＡ／ＰＢＳと記載）で希釈し０．６ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ溶液を調製した。またｒｈＬＢＰ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を０．１％ＨＳＡを含むＰＢＳ−で１００μｇ／ｍＬに希釈し、上記ＬＰＳ溶液と混合して、ＬＰＳ／ＬＢＰ溶液（ＬＰＳ濃度が約０．６ｎｇ／ｍＬ、ＬＢＰ濃度が約０．３ｎＭ）を調製した。次に、ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（ＰＳＰ６４）あるいはｒｓＣＤ１４（１−３５６）を０．０１％ＢＳＡ／ＰＢＳで目的の濃度に希釈し、ＬＰＳ／ＬＢＰ溶液と等量混合した。３７℃で１時間反応した後に、エンドスペシーＣライセート（エンドスペシーＥＳ−２４Ｓセット；生化学工業）を添加し、室温で２０分間静置した。その後、２５％酢酸を添加して反応を停止し、４０５ｎｍにて吸光度を測定し、反応液中のＬＰＳ濃度（以下、フリーＬＰＳ濃度と記載）を算出した。尚、検量線はＬＰＳ希釈溶液のみを３７℃で１時間反応した後に、上記サンプルと同様の操作し、作成した。その結果、ｒＣＤ１４（１−３５６）では添加濃度に依存して、フリーＬＰＳ量が低下し、ｒＣＤ１４（１−３５６）とＬＰＳの結合が確認されたが、ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（ＰＳＰ６４）では１００ｎＭまで添加しても、フリーＬＰＳ量は変化せず、ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（ＰＳＰ６４）にはＬＰＳ結合能がないことが明らかになった。
（実施例１６） ｒｓＣＤ１４−ＳＴ標準品の検討
１６−（１）ｒｓＣＤ１４−ＳＴ標準品による標準曲線の作成
実施例１３−（３）−３で調製したｒｓＣＤ１４−ＳＴ（２ＳＴ６４）を用いて標準曲線を作成した。すなわち、ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（２ＳＴ６４）を実施例７−（１２）に記載の希釈液で希釈し、０．０６、０．５、１．２、２、３ｎｇ／ｍＬの濃度系列を調製し、実施例７−（１）のキットを用いて測定した。ブランクには希釈液を使用した。図１１に示すように濃度依存的に吸光度が上昇し、ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（２ＳＴ６４）がキットの標準品として使用できることが確認された。
１６−（１）ｒｓＣＤ１４−ＳＴ標準品による標準曲線の作成
実施例７−（３）で作製したキットを用いて正常人血清中のｓＣＤ１４−ＳＴ及びＥＤＴＡ加血漿中ｓＣＤ１４−ＳＴの測定を行ったところ、ＥＤＴＡ加血漿ではｓＣＤ１４−ＳＴ濃度が血清中の濃度に比較して約２倍高値であった。原因として測定系へのＥＤＴＡの影響が考えられたため、希釈液に０.２ｍｇ／ｍＬとなるようにＥＤＴＡを添加したところ、血清の測定値が上昇しＥＤＴＡ加血漿と差がない結果となった。しかしながら、ｒｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ標準品を用いて作製した標準曲線では反応性が低下し、ＥＤＴＡの有無により読み値が影響を受けることが明らかになった。一方、ｒｓＣＤ１４−ＳＴを標準品とした場合、ＥＤＴＡの添加では標準曲線は影響を受けないことより、ｒｓＣＤ１４−ＳＴが標準品としてよりよいと判断された。
（実施例１７） ｒｓＣＤ１４−ＳＴを用いた抗体の作製
１７−（１）ｒｓＣＤ１４-ＳＴ特異的ポリクローナル抗体の作製
実施例１３−（３）−３で調製したｒｓＣＤ１４-ＳＴ（ＰＳＰ６４）に対するポリクローナル抗体を作製するため、ウサギに免疫を行った。すなわち、ｒｓＣＤ１４-ＳＴ（ＰＳＰ６４）２０μｇを５００μｌの生理食塩水に希釈し、５００μｌのフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合後、ニュージーランド白色ウサギ（北山ラベス）メス２．０―２．４ｋｇの背部皮下に投与した。２週間後、ｒｓＣＤ１４-ＳＴ（ＰＳＰ６４）２０μｇを５００μｌの生理食塩水に希釈し、５００μｌのフロインド不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合後、背部皮下に投与した。２週間後、ｒｓＣＤ１４-ＳＴ（ＰＳＰ６４）２０μｇを同様に投与した。投与終了１週間後耳静脈より採血し、定法にしたがい抗血清を分離し、抗体を精製した。まず抗血清に最終飽和濃度３３％となるように硫酸アンモニウムを添加し、４℃で１時間攪拌後、析出した沈殿を遠心分離した。次に沈殿をダルベッコ−ＰＢＳ緩衝液（以下、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と記載）で溶解し、一夜透析した。透析液を濾過後、プロテインＡカラム（プロセップＡ、ミリポア）にアプライし、結合したＩｇＧ画分を０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液(ｐＨ３．０)により溶出し、精製抗体を得た。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析後、２８０ｎｍの吸光度より蛋白濃度を算出した（吸光係数：０．７１４ｍｇ／ｍＬ）。以降、得られた抗体を抗ＰＳＰ６４ポリクローナル抗体若しくは抗ＰＳＰ６４抗体と記載する。
１７−（２）ｓＣＤ１４-ＳＴ特異的モノクローナル抗体の作製
実施例１３−（３）−３で調製したｒｓＣＤ１４-ＳＴ（ＰＳＰ６４）の抗原性を高めるため、ｒｓＣＤ１４-ＳＴ（ＰＳＰ６４）に最終濃度０．１％となるようにジニトロフルオロベンゼン（和光純薬）を添加し、室温で１時間インキュベーションした後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析し、投与抗原とした（以下ＤＮＰ−ＰＳＰ６４抗原と記載することある）。ＤＮＰ−ＰＳＰ６４抗原３０μｇを１００μＬの生食に溶解し、フロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合し、Ｗｉｓｔａｒラット８週齢メスの各後足フットパッドに１００μＬずつ投与した。２週間後、腸骨リンパ節を摘出し細胞融合を行った。細胞融合は安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」８３ページ、１９９１年（講談社）にしたがって行った。すなわち、リンパ節よりセルストレイナー（ファルコン）を用いてリンパ球を分離し、ミエローマ細胞（Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４）と５：１で混合し、ポリエチレングリコールを用いて細胞融合を行った。融合した細胞をＨＡＴ培地にケンダクし、ハイブリドーマを選別後、目的の抗体を産生しているハイブリドーマをスクリーニングした。
スクリーニングはｒｓＣＤ１４-ＳＴ（ＰＳＰ６４）を直接プレートに固相化するＥＬＩＳＡ法を用いた。すなわち、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２．５μg／ｍＬに希釈したｒｓＣＤ１４-ＳＴ（ＰＳＰ６４）を各ウエルに５０μＬ添加し、４℃で一夜静置した。次にプレートをイオン交換水で５回洗浄後、２％ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を各ウエルに１００μＬ添加し、室温で１時間静置しブロッキングを行った。得られたハイブリドーマからサンプリングした培養上清を各ウエルに添加し３７℃で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄した。次にペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を１０％ウサギ血清を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０００倍に希釈した溶液を各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で１時間反応後、同様に５回洗浄しテトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ、ＢｉｏＦｉｘ）を各ウエルに添加した。室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止した。４５０ｎｍの吸光度をプレート分光光度計（マルチスキャンＪＸ、サーモエレクトロン社）で測定し、２ＳＴ６４蛋白質と結合する抗体を産生するハイブリドーマを含むウエルを選択した。次に選択したウエルより安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」９７ページ、１９９１年（講談社）にしたがって限界希釈法によりクローニングを行った。１０日後、同様に２ＳＴ６４蛋白質に対する反応性を指標としてスクリーニングを行い、６種類のハイブリドーマを選択した。選択したハイブリドーマを１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）で培養後、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養し抗体を産生させ、プロテインＧカラム（Ｐｒｏｓｅｐ−Ｇ、ミリポア）を用いて抗体を精製した。精製したＦ１２３７−３−４抗体及びＦ１２３７−４−４抗体のサブタイプをラットタイピングキット（ＺＹＭＥＤ）により決定したところサブタイプはそれぞれラットＩｇＧ２ａ・κ、ラットＩｇＧ２ｂ・κであった。
１７−（３） 高分子量ＣＤ１４には結合しないｒｓＣＤ１４−ＳＴ特異的抗ｒｓＣＤ１４−ＳＴポリクローナル抗体の作製
敗血症患者に存在するｓＣＤ１４−ＳＴに対して特異的に結合し、高分子量ＣＤ１４には結合しないポリクローナル抗体を作製するため、実施例１３−（３）−３で調製したｒｓＣＤ１４-ＳＴ（ＰＳＰ６４）をウサギに免疫する。すなわち、ｒｓＣＤ１４-ＳＴ（ＰＳＰ６４）２０μｇを５００μｌの生理食塩水に希釈し、５００μｌのフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合後、ニュージーランド白色ウサギ（北山ラベス）メス２．０―２．４ｋｇの背部皮下に投与する。２週間後、ｒｓＣＤ１４-ＳＴ（ＰＳＰ６４）２０μｇを５００μｌの生理食塩水に希釈し、５００μｌのフロインド不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合後、背部皮下に投与する。２週間後、ｒｓＣＤ１４-ＳＴ（ＰＳＰ６４）２０μｇを同様に投与し、投与終了１週間後耳静脈より採血し、定法にしたがい抗血清を分離し、抗体を精製する。まず抗血清に最終飽和濃度３３％となるように硫酸アンモニウムを添加し、４℃で１時間攪拌後、析出した沈殿を遠心分離する。次に沈殿をダルベッコ-リン酸緩衝液（以下、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と記載）で溶解し、一夜透析する。透析液を濾過後、プロテインＡカラム（プロセップＡ、ミリポア）にアプライし、結合するＩｇＧ画分を０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液(ｐＨ３．０)により溶出し、精製抗体を得る。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析後、２８０ｎｍの吸光度より蛋白濃度を算出する（吸光係数：０．７１４ｍｇ／ｍＬ）。得られる精製抗ＰＳＰ６４ポリクローナル抗体を実施例２２で調製した高分子量ＣＤ１４若しくは実施例６で調製したｒｓＣＤ１４（１−３５６）を結合した樹脂を用いて特異精製し、ｒｓＣＤ１４−ＳＴのみに結合する抗体を得る。すなわち、高分子量ＣＤ１４若しくはｒｓＣＤ１４（１−３５６）５ｍｇをＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎｓ（アマシャムバイオサイエンス）にマニュアルに従って結合し、特異精製用アフィニティーカラムを作製する。次に、プロテインＡカラムで精製した抗体を特異精製用アフィニティーカラムにアプライし、高分子量ＣＤ１４若しくはｒｓＣＤ１４（１−３５６）に結合しない抗体を回収する。得られる抗体を濃縮し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析後、２８０ｎｍの吸光度より蛋白濃度を算出する（吸光係数：０．７１４ｍｇ／ｍＬ）。
１７−（４） 高分子量ＣＤ１４には結合しないｒｓＣＤ１４−ＳＴ特異的抗ｒｓＣＤ１４−ＳＴモノクローナル抗体の作製
実施例１３−（３）−３で調製したｒｓＣＤ１４-ＳＴ（ＰＳＰ６４）の抗原性を高めるため、ｒｓＣＤ１４-ＳＴ（ＰＳＰ６４）に最終濃度０．１％となるようにジニトロフルオロベンゼン（和光純薬）を添加し、室温で１時間インキュベーションした後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析し、投与抗原とする（以下ＤＮＰ−ＰＳＰ６４抗原と記載することある）。ＤＮＰ−ＰＳＰ６４抗原３０μｇを１００μＬの生食に溶解し、フロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合し、Ｗｉｓｔａｒラット若しくはｄｄＹマウス８週齢メスの各後足フットパッドに１００μＬずつ投与する。２週間後、腸骨リンパ節を摘出し細胞融合を行う。細胞融合は安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」８３ページ、１９９１年（講談社）にしたがって行う。すなわち、リンパ節よりセルストレイナー（ファルコン）を用いてリンパ球を分離し、ミエローマ細胞（Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４）と５：１で混合し、ポリエチレングリコールを用いて細胞融合を行う。融合した細胞をＨＡＴ培地にケンダクし、ハイブリドーマを選別後、目的の抗体を産生しているハイブリドーマをスクリーニングする。
スクリーニングはｒｓＣＤ１４-ＳＴ（ＰＳＰ６４）、高分子量ＣＤ１４若しくはｒｓＣＤ１４（１−３５６）を直接プレートに固相化するＥＬＩＳＡ法を用いる。すなわち、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）にＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２．５μg／ｍＬに希釈したｒｓＣＤ１４-ＳＴ（ＰＳＰ６４）、高分子量ＣＤ１４若しくはｒｓＣＤ１４（１−３５６）を各ウエルに５０μＬ添加し、４℃で一夜静置する。次にプレートをイオン交換水で５回洗浄後、２％ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を各ウエルに１００μＬ添加し、室温で１時間静置しブロッキングを行う。得られたハイブリドーマからサンプリングした培養上清を各ウエルに添加し３７℃で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄する。次にペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）若しくはペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を１０％ウサギ血清を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０００倍に希釈した溶液を各ウエルに５０μＬ添加する。３７℃で１時間反応後、同様に５回洗浄しテトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ、ＢｉｏＦｉｘ）を各ウエルに添加する。室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止する。４５０ｎｍの吸光度をプレート分光光度計（マルチスキャンＪＸ、サーモエレクトロン社）で測定し、ｒｓＣＤ１４−ＳＴと結合し、高分子量ＣＤ１４若しくはｒｓＣＤ１４（１−３５６）とは結合しない抗体を産生するハイブリドーマを含むウエルを選択する。次に選択したウエルより安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」９７ページ、１９９１年（講談社）にしたがって限界希釈法によりクローニングを行う。１０日後、同様に２ＳＴ６４に対する反応性を指標としてスクリーニングを行い、ハイブリドーマを選択する。選択したハイブリドーマを１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）で培養後、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養し抗体を産生させ、プロテインＧカラム（Ｐｒｏｓｅｐ−Ｇ、ミリポア）又はプロテインＡカラム（Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ、ミリポア）を用いて抗体を精製する。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析後、２８０ｎｍの吸光度より蛋白濃度を算出する（吸光係数：０．７１４ｍｇ／ｍＬ）。精製した抗体のサブタイプを市販のキットを用いて行う。
１７−（５） 検体の保存方法に依存しないｓＣＤ１４−ＳＴ特異的抗ｒｓＣＤ１４−ＳＴモノクローナル抗体の選択
保存状態が測定結果に影響を及ぼさないキットのためのモノクローナル抗体を得る。すなわち、実施例１７−（４）で調製したｒｓＣＤ１４−ＳＴに対するモノクローナル抗体の中より実施例２２に記載のサンドイッチ系の標識側抗体としてｓＣＤ１４−ＳＴを測定し、敗血症患者で上昇する性能を有する抗体を選択後、検体中のｓＣＤ１４−ＳＴを測定する。凍結保存した検体と２４時間室温で保存した検体の両者を測定し、測定値に差の少ない抗体の組合せを選択する。
（実施例１８） 抗ｓＣＤ１４−ＳＴ（ＰＳＰ６４）ポリクローナル抗体の反応性
実施例１７―（１）で作製した抗ＰＳＰ６４ポリクローナル抗体の反応性を確認した。実施例１７−（２）と同様にｒｓＣＤ１４−ＳＴ（ＰＳＰ６４）を固相化した。実施例１７−（１）で調製した抗ＰＳＰ６４ポリクローナル抗体を含む抗血清及びコントロールとして正常ウサギ血清をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５００倍希釈した後、倍々希釈し３２０００倍までの希釈系列を調製した。各希釈液をブロッキング後のウエルに添加し、３７℃で1時間反応した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄した。次にペルオキシダーゼ標識抗ウサギイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を１０％ヤギ血清を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０００倍に希釈した溶液を各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で１時間反応後、同様に５回洗浄しテトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ、ＢｉｏＦｉｘ）を各ウエルに添加した。室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止した。４５０ｎｍの吸光度をプレート分光光度計（マルチスキャンＪＸ、サーモエレクトロン社）で測定し、ｒｓＣＤ１４-ＳＴ（ＰＳＰ６４）との結合を確認したところ、図１２に示すようにｒｓＣＤ１４-ＳＴ（ＰＳＰ６４）を投与したウサギでは希釈倍率依存的に吸光度が上昇するのに対して正常ウサギ血清では上昇せず、ｒｓＣＤ１４-ＳＴ（ＰＳＰ６４）蛋白質特異的な抗体の産生が確認された。
（実施例１９） 抗ｒｓＣＤ１４−ＳＴ抗体を用いたｓＣＤ１４−ＳＴ測定系の作製
Ｓ６８ペプチドポリクローナル抗体をＤ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）の各ウエルに５０μＬ添加した。４℃で一晩反応後、イオン交換水で５回洗浄し、０．１％ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ，Ｉｎｃ）と０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＤ−ＰＢＳを各ウエルに１００μＬ添加しブロッキングした。次に１％ＣＤ１４吸収血清、０．１％ＢＳＡを含む７６ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を希釈液として０、０．０３１、０．０６３、０．１２５、０．２５、０．５、１．２ｎｇ／ｍＬのｒｓＣＤ１４―ＳＴ（２ＳＴ６４）蛋白質標準品希釈系列を調製した。標準品希釈系列をウエル当たり５０μＬ添加し、３７℃で２時間反応させた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄し、Ｆ１２３７−３−４抗体を含む１％ウシ胎児血清／Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ溶液を５０μＬ添加した。３７℃で1時間反応後、同様に３回洗浄し、１０％ウサギ血清を含むＤ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０００分の１に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で１時間反応後、同様に５回洗浄し、テトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ、ＢｉｏＦｉｘ）を各ウエルに添加し、室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止した。プレート分光光度計（マルチスキャンＪＸ、サーモエレクトロン社）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。図１３に作成した標準曲線を示した。
（実施例２０） 新規ｓＣＤ１４−ＳＴ測定系による血清測定
実施例１９で作製したサンドイッチＥＩＡ系を用いて正常人５例及び敗血症患者５例の血清を測定した。その結果、表１０に示すように正常人の血清中ｓＣＤ１４−ＳＴ濃度は1ｎｇ／ｍＬであったのに対して敗血症患者では６．４７ｎｇ／ｍＬと約６倍濃度が高値であり、実施例１１と同様に敗血症患者を鑑別できることが示された。なお、実施例１１との濃度の違いは、実施例１６に示した通り、標準品の違いによるものである。
Figure 0004040666
（実施例２１） ｓＣＤ１４―ＳＴ蛋白質特異的モノクローナル抗体の評価
ｓＣＤ１４−ＳＴに対する抗体の特異性を明らかにするため、各種ＣＤ１４蛋白質に対する親和性を測定した。また、各種抗原に対する反応性を抗原固相ＥＩＡ系で測定した。
２１−（１） ＢＩＡＣＯＲＥを用いた解離定数（ＫＤ）の測定
実施例１７−（２）で作製したＦ１２３７−３−４抗体及び、抗ＣＤ１４抗体である３Ｃ１０抗体（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−２２８）と反応速度定数をＢｉａｃｏｒｅ３０００（ビアコア）を用いて解析した。まず、ｒｓＣＤ１４−ＳＴ（２ＳＴ６４）及びｒｓＣＤ１４（１−３５６）を別々にアミンカップリングキット（ビアコア）を用いてセンサーチップＣＭ５（ビアコア）に固定化した。測定はランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ（ビアコア）を使用し、各抗体の希釈列（１．２５ｎＭ〜６４０ｎＭ、抗体により濃度を変更した）をフローセルにインジェクトすることで行った。データ解析は各抗原を固定化したフローセル測定データからリファレンスセルデータを差し引き、さらにランニング緩衝液をのみのデータを差し引きし、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔ ｗｅａｒ ｖｅｒｓｉｏｎ４.１（ビアコア）を用いて実施した。Ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓを用いて解離定数（ＫＤ）を算出した結果、表１１に示すようにＦ１２３７−３−４抗体はｒｓＣＤ１４−ＳＴに高い親和性を示し、ｒｓＣＤ１４（１−３５６）とは実質的に結合しないためＫＤは算出できなかった。３Ｃ１０は、ｒｓＣＤ１４−ＳＴには実質的に結合せず、ｒｓＣＤ１４（１−３５６）に対して高い親和性を示した。
Figure 0004040666
２１−（２） 抗原固相ＥＩＡ系を用いた抗原特異性の解析
実施例１７−（２）で作製したＦ１２３７−３−４抗体及び、抗ＣＤ１４抗体である３Ｃ１０抗体の高分子量ＣＤ１４に対する反応性を抗原固相ＥＩＡ系で測定する。すなわち、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）に実施例１３−(２)と同様に調整し、Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２．５μg／ｍＬに希釈した高分子量ＣＤ１４をウエルに５０μＬ添加し、４℃で一夜静置する。次にプレートをイオン交換水で５回洗浄後、２％ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を各ウエルに１００μＬ添加し、室温で１時間静置しブロッキングを行う。Ｆ１２３７−３−４抗体、３Ｃ１０抗体を１μｇ／ｍＬにＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈し、各ウエルに添加し３７℃で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄する。次にそれぞれの抗体に対するペルオキシダーゼ標識抗イムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を１０％血清を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０００倍に希釈した溶液を各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で１時間反応後、同様に５回洗浄しテトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ、ＢｉｏＦｉｘ）を各ウエルに添加する。室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止する。４５０ｎｍの吸光度をプレート分光光度計（マルチスキャンＪＸ、サーモエレクトロン社）で測定する。その結果、３Ｃ１０は、高分子量ＣＤ１４と強く結合するのに対してＦ１２３７−３−４抗体は実質的に結合しないことが確認される。
（実施例２２） 抗ｒｓＣＤ１４−ＳＴ抗体を用いたｓＣＤ１４−ＳＴ測定系の作製（２）
２２−（１）サンドイッチＥＩＡ法
表１２に示す抗体の各種組み合わせによるサンドイッチＥＩＡ系を実施例３−（３）に記載の方法に従い、作製した。表１２に示すように実施例１７で作製したモノクローナル抗体を用いたｓＣＤ１４測定系はいずれも、正常人では上昇せず、敗血症患者特異的に上昇していた。
Figure 0004040666
２２−（２）競合ＥＩＡ法
Ｆ１２３７−３−４抗体を１０μｇ／ｍＬにＰＢＳで希釈しウエルに添加する。４℃、一晩静置し結合させ、次に２％ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でブロッキングする。敗血症患者血清及び正常人血清２５μＬをプレートに添加し、続けて０．５μｇ／ｍＬに１％ＢＳＡ、０.１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈したペルオキシダーゼ標識ｒｓＣＤ１４−ＳＴ抗原を添加し、３７℃で1時間反応後、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄する。ＴＭＢ溶液（ＢｉｏＦｉｘ）を添加し、発色させ、さらに０．５Ｍ硫酸水溶液で反応を停止し、吸光度を４５０ｎｍで測定する。吸光度は血中のｓＣＤ１４−ＳＴ濃度に依存して低下するため、測定した値は血中ｓＣＤ１４−ＳＴ量を反映し、ｓＣＤ１４−ＳＴ濃度は正常人では低く、敗血症患者では特異的に高いことが確認できる。また、標識物としては他の酵素、放射性化合物、蛍光物質、化学発光物質、金コロイド、色素やラテックス等を使用可能である。
（実施例２３）該血中可溶型蛋白質を測定するための抗体のスクリーニング方法
実施例９で精製し、同定した血中可溶型蛋白質の測定系を作製することを目的に、測定するために有用な２種類のスクリーニング方法を構築した。
２３−（１）スクリーニングの対象とする抗体の調製
スクリーニングの対象とする抗体は、実施例１の記載に準じて、配列番号３に記載のアミノ酸配列から選択される連続した６〜２０アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体を調製する。また、以下のようにも調製可能である。<1>ＣＤ１４全長配列に基づき定法によりペプチドを合成し、免疫抗原を調製して抗体を作製する。<2>血清中の精製可溶性ＣＤ１４抗原を精製し、これを免疫原として抗体を作製する。<3>ＣＯＳ細胞や大腸菌を用いて組換えＣＤ１４蛋白質を調製し、これを免疫原として抗体を作製する。<4>調製した各種ＣＤ１４抗原を熱変性やＤＮＰ化等により処理し、これを免疫原として抗体を作製する。
例えば、Ｐ００１抗体（配列番号４に記載のアミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製した抗体）、Ｐ００２抗体（配列番号５に記載のアミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製した抗体）は、実施例１に記載の方法により調製し、キャリア蛋白質と結合させた後、投与し、抗体を調製した。さらに、実施例１−（４）で作製したＳ６８抗体、実施例２で作製したＦ１１４６−１７−２抗体、実施例３−（２）［２］で作製したＦ１０３１−８−３抗体、実施例３−（２）［１］で作製したＦ１１０６−１３−３抗体、実施例１７−（２）で作製したＦ１２３７−３−４抗体及び実施例１７−（１）で作製した抗ＰＳＰ６４抗体もスクリーニング検体として用意した。以上のように、配列番号３に記載のアミノ酸配列から選択される連続した６〜２０アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体を調製した抗体を用いて、以下に手順に従い該血中可溶型蛋白質を特異的に検出する抗体をスクリーニングした。
２３−（２）抗原固相化法
正常人由来高分子量ＣＤ１４蛋白質の抗体に対する反応性の差を利用することを特徴とする該血中可溶型蛋白質を測定するための抗体のスクリーニング方法である。高分子量ＣＤ１４蛋白質に対する反応性を抗原固相化法により解析することにより、正常人血清中に存在する高分子量ＣＤ１４には結合しないが、該血中可溶型蛋白質には結合する抗体をスクリーニングする方法である。
［１］高分子量ＣＤ１４の調製
まず、高分子量ＣＤ１４蛋白質を以下のように調製した。ヒト血清（日本バイオテスト）を３Ｃ１０抗体結合樹脂カラム（５ｍＬ）に添加し、ＰＢＳで洗浄後、６Ｍ 尿素水溶液で溶出した。溶出液をＰＢＳに透析後、凍結乾燥し、続けてゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０/３００ＧＬ、アマシャムバイオサイエンス）で分画した。得られた各フラクションを市販可溶性ＣＤ１４蛋白質測定キット（ＩＢＬ-キット）で検定後、ＩＢＬ−キットに反応する高分子量ＣＤ１４分画をプールし、凍結乾燥した。凍結乾燥物を溶解し、再度ＩＢＬ−キットで測定し濃度を算出した。
［２］抗原固相ＥＩＡ法
抗原固相ＥＩＡ法は、以下のように行った。まず高分子量ＣＤ１４を２．５μｇ／ｍＬでプレートに４℃、一晩静置し結合させた。次に２％ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でブロッキングし、各抗体を１μｇ／ｍＬにＰＢＳで希釈しそれぞれの抗原が固相化されているウエルに添加した。３７℃で1時間反応後、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄し、続けて各抗体に対するペルオキシダーゼ標識抗γグロブリン抗体（ダコ）を１０％ウサギ血清、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈し、室温で１時間反応させた。同様に５回洗浄し、ＴＭＢ溶液（ＢｉｏＦｉｘ）を添加し、発色させ、さらに０．５Ｍ硫酸水溶液で反応を停止した。続けて、抗体の吸光度を４５０ｎｍで測定し、高分子量ＣＤ１４では吸光度が上昇しない抗体を選択した。上記の方法により、Ｆ１２３７−３−４抗体が選択された。
上記のプレートに結合させる抗体の代わりに、ｓＣＤ１４−ＳＴを結合させれば、ｓＣＤ１４−ＳＴに結合しない抗体が選択できる。
次にドットブロティングを以下のように行う。まずＴｒａｎｓ-ＢｌｏｔＴｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｄｉｕｍ（バイオラッド）に高分子量ＣＤ１４を約４００ｎｇ／ドットでスポットし乾燥させる。次に１００％ブロックエース（雪印乳業）を用いてブロッキングする。２種類の固定化ＣＤ１４と１０％ブロックエース、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した各種抗ＣＤ１４抗体を室温で１時間反応させる。次に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５分間５回洗浄し、続けてペルオキシダーゼ標識抗ウサギイムノグロブリン抗体（ダコ、Ｐ４４８）を１０％ブロックエース、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈し、各メンブレンを室温で１時間反応させる。同様に５回洗浄し、ＥＣＬ−ＰＬＵＳ（アマシャム）を用いて抗体の結合の有無を化学発光検出装置（ＣｏｏｌＳａｖｅｒ ＡＥ−６９５５、ＡＴＴＯ）を用いて発光として検出する。スクリーニングに使用した抗体中の高分子量ＣＤ１４ではスポットが検出されない抗体を選択する。
２３−（３）サンドイッチ免疫測定法
正常人血清と敗血症患者血清において検出される量の差を利用することを特徴とする該血中可溶型蛋白質を測定するための抗体のスクリーニング方法である。２種類の抗ＣＤ１４抗体を組み合わせてサンドイッチＥＬＩＳＡ系を作製し、正常人と敗血症患者検体を測定する方法である。
［１］ペルオキシダーゼ標識抗体の調製
１２−（１）で作成した抗体を実施例３−（３）に記載に準じて、ペルオキシダーゼ標識抗体を調製した。
［２］サンドイッチＥＩＡ系の作製
スクリーニングの対象とする各抗体をＤ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）の各ウエルに５０μＬ添加した。４℃で一晩反応後、イオン交換水で５回洗浄し、２％ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ，Ｉｎｃ）を含むＤ−ＰＢＳを各ウエルに１００μＬ添加しブロッキングした。次に０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を希釈液として０、３．１２、６．２５、１２．５、２５、５０、１００、２００ｎｇ／ｍＬのＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ蛋白質標準品希釈系列及び１０倍希釈した検体を調製した。標準品希釈系列及び希釈検体をウエル当たり５０μＬ添加し、３７℃で１時間反応させ、反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄し、２％ラット血清、1％マウス血清、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で1μｇ／ｍＬに希釈したペルオキシダーゼ標識抗体を各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で１時間反応後、同様に５回洗浄し、テトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ、ＢｉｏＦｉｘ）を各ウエルに添加した。室温で２０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。
［３］サンドイッチＥＩＡ系による抗体のスクリーニング
次に本系で標準曲線が作成できる組合せについて、該血中可溶型蛋白質を特異的に検出することが可能かスクリーニングした。敗血症患者２例及び正常人２例の血清を［１］で作成した測定系で測定を行い、正常人では低値を示し、敗血症患者では高値を示す測定系の抗体の組合せを選択することで敗血症患者を特異的に検出する抗体の組合せをスクリーニングした。その結果、実施例７−（１）〜（８）及び実施例２２に記載の抗体の組み合わせが選択された。なお、予めＩＢＬ−キットにより各血清の高分子量ＣＤ１４の測定値を求めておき、高分子量ＣＤ１４が測定されない測定系の抗体の組合せを選択することを行っても良い。
（実施例２４） ｒｓＣＤ１４−ＳＴを使用した抗体のスクリーニング方法
ｒｓＣＤ１４−ＳＴを使用して抗体をスクリーニングする方法として２種類の方法を検討した。
２４−（１）抗原固相ＥＩＡ法
ｓＣＤ１４−ＳＴを特異的に検出する抗体をスクリーニングするための方法として、実施例１７−（２）に記載の抗体のスクリーニング方法、すなわちｒｓＣＤ１４-ＳＴ（ＰＳＰ６４）を直接プレートに固相化するＥＬＩＳＡ法を用いることにより行った。
表１３に、各種抗体のスクリーニング結果を示す。なお、ＭＹ４（コールター）、ＭＥＭ１８（Ｍｏｎｏｓａｎ社）、６１Ｄ３（サザンバイオテクノロジーアソシエイト）及び、各種γグロブリンは、市販品を用いた。
Figure 0004040666
２４−（２）サンドイッチＥＩＡ法
ｓＣＤ１４−ＳＴを特異的に検出する抗体をスクリーニングするため方法として、実施例２３−（２）に記載したサンドイッチＥＩＡ系を作製した。すなわち、スクリーニング対象検体となる各種抗体をプレートに固相化し、ｒｓＣＤ１４-ＳＴ（ＰＳＰ６４）を抗原として、さらにペルオキシダーゼ標識Ｆ１１０６−１３−３抗体又はペルオキシダーゼ標識Ｆ１０３１−８−３抗体によるサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いることにより行った。
表１４に各種抗体のスクリーニング結果を示す。なお、ＡｎｔｉＨＣＧ抗体は、市販品を用いた。
Figure 0004040666
（実施例２５） ｓＣＤ１４−ＳＴの化学合成
ヒトＣＤ１４のＮ末端１位〜７０位のアミノ酸を有する可溶性ポリペプチド（以下、ｓＣＤ１４（１−７０）と記載）を化学合成した。
ペプチド合成機ＡＢＩ４３３Ａ（アプライド）を用いて、アミノ酸配列に従ってアミノ酸カラムを並べ、自動合成を行った。合成したペプチドは定法により樹脂より切り出し、エーテルで沈殿させ回収後、再度蒸留水で溶解し凍結乾燥した。得られた粗精製ペプチドは溶解後、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ（CAPCELL−ＰＡＫ、資生堂）を用いて５〜７０％のアセトニトリル濃度の直線グラジエントで溶出し、目的のペプチドを含む分画を回収した。回収した分画は凍結乾燥し、精製ペプチドとした。精製ペプチドを実施例７-（１２）記載の希釈液を用いて溶解し、実施例７−（３）に記載のキットにより測定したところ、実施例７−（３）に記載のキットとは強く反応し、化学合成により調製したｓＣＤ１４−ＳＴもまた標準品となり得ることが示された。
（実施例２６） ｅｌａｓｔａｓｅ処理ＴＨＰ−１細胞から発現するｓＣＤ１４−ＳＴの測定
ビタミンＤ３で刺激した１×１０６のＴＨＰ−１細胞を０．１％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｅｌａｓｔａｓｅ（Ｅｌａｓｔｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．）を終濃度１μＭとなるよう添加し、最終液量２００μＬの反応液を調製した。反応液を３７℃で１、３、１０、３０または６０分インキュベートした後、フェニルメチルスルフォニルフルオリドを添加し、酵素反応を停止した。各反応液の上清を回収し、実施例７−（１）のキットで上清に含まれるｓＣＤ１４−ＳＴを測定した。その結果、ｅｌａｓｔａｓｅ添加から３分でｓＣＤ１４−ＳＴ濃度が上昇し、その後は緩やかに減少した。
本発明によれば、ヒト血中に存在するＣＤ１４の配列を有する新規な抗原が提供される。さらに該抗原を測定することによる、敗血症を診断方法若しくは敗血症を検出する方法が提供される。
また、該抗原と免疫的な機能が類似する組換え型可溶性フラグメントが提供される。該組換え型可溶性フラグメントを生産する方法が提供される。さらに該フラグメントに結合する新規な抗体も提供される。
また、「ヒト全長可溶型ＣＤ１４蛋白質の特定のアミノ酸配列からなるペプチドと結合する抗体」、「ヒト全長可溶型ＣＤ１４の特定のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として作製される抗体」若しくは「該フラグメントに結合する抗体」または該抗体の断片を構成要素として含む、該抗原を測定することができるキット及び測定方法が提供される。
さらに、該蛋白質の測定に有用な抗体をスクリーニングする方法が提供される。

Claims (5)

  1. 下記の性質を有する実質的に精製された可溶性ＣＤ１４抗原、
    非還元条件下SDS-PAGEでは、分子量13±2kDaに泳動される、
    Ｎ末端配列に配列番号１のアミノ酸配列を有する、
    配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドに結合する抗体に特異的に結合する、
    配列番号３に記載のアミノ酸配列の１７位〜２６位からなるペプチドに結合する抗体に特異的に結合する、および、
    ヒト血清から得られうる。
  2. 請求項１に記載の可溶性ＣＤ１４抗原からなる敗血症マーカー。
  3. ヒト敗血症を検出するために用いられる請求項１に記載の可溶性ＣＤ１４抗原。
  4. 下記の工程を含むことを特徴とする敗血症の検出方法、
    １）被験者由来の血漿中または血清中に含まれる可溶性ＣＤ１４抗原を測定する工程、
    ２）測定した値を正常人の標準値と比較する工程、および
    ３）検体中の可溶性ＣＤ１４抗原の濃度が正常人の標準値より高値であるかどうかを判定する工程、
    ここで、可溶性ＣＤ１４抗原は、下記の性質を有する、
    非還元条件下SDS-PAGEでは、分子量13±2kDaに泳動される、
    Ｎ末端配列に配列番号１のアミノ酸配列を有する、
    配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドに結合する抗体に特異的に結合する、
    配列番号３に記載のアミノ酸配列の１７位〜２６位からなるペプチドに結合する抗体に特異的に結合する、および、
    ヒト血清から得られうる。
  5. 前記１）被験者由来の血漿中または血清中に含まれる可溶性ＣＤ１４抗原を測定する工程は、サンドイッチ免疫測定法により可溶性ＣＤ１４抗原を測定する工程であることを特徴とする請求項４に記載の敗血症の検出方法。
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