ES2614826T3

ES2614826T3 - Modulación de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica

Info

Publication number: ES2614826T3
Application number: ES09720014.1T
Authority: ES
Inventors: Margaret S. Bynoe
Original assignee: Cornell University
Current assignee: Cornell University
Priority date: 2008-02-26
Filing date: 2009-03-10
Publication date: 2017-06-02
Anticipated expiration: 2029-03-10
Also published as: US20090212245A1; US8047503B2

Abstract

Un agonista del receptor A2A de adenosina y/o a un antagonista del receptor A1 de adenosina para su uso en el aumento de la permeabilidad de la barrera hematoencefalica en un sujeto, en donde el sujeto es aquel que se beneficiaria de un incremento de la permeabilidad de la barrera hematoencefalica y en donde el sujeto no esta sometido a un tratamiento que aumente el nivel de adenosina.

Description

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DESCRIPCION

Modulacion de la permeabilidad de la barrera hematoencefalica Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a la modulacion de la permeabilidad de la barrera hematoencefalica.

Antecedentes de la invencion

Las barreras a la entrada de sangre en el sistema nervioso central ("SNC") se denominan de forma conjunta en el presente documento barrera hematoencefalica ("BHE"). La BHE es una capa muy tejida de celulas endoteliales que recubre 643 kilometros de capilares y vasos sanguineos en el cerebro (Ransohoff et al., "Three or More Routes for Leukocyte Migration Into the Central Nervous System," Nature Rev. Immun. 3:569-581 (2003)). Las uniones casi impermeables entre las celulas de la BHE se forman mediante la interdigitacion de aproximadamente de 20 tipos diferentes de proteinas. Las moleculas deben entrar en una celula de la BHE a traves de los transportadores de proteinas embebidos en la membrana o deslizandose directamente a traves de su membrana externa cerosa. Una vez dentro, los compuestos extranos deben evitar una alta concentracion de enzimas metabolicas y diversas bombas de proteinas cebadas para eliminar sustancias extranas. Habiendo evitado estos obstaculos, las moleculas extranas deben pasar a traves de la membrana interna de una celula de la BHE para finalmente llegar al cerebro. Estas elaboradas defensas permiten a la BHE secuestrar al cerebro de posibles danos, pero la BHE tambien obstruye la liberacion farmacos neurologicos en un sitio de enfermedad en el cerebro. Los investigadores en el mundo academico y las industrias biotecnologicas y farmaceuticas estan aprendiendo a evitar la BHE o dejar que permita la entrada de posibles farmacos en el cerebro. Estan disenando farmacos pequenos que pueden difundirse de forma pasiva a traves de la BHE o viajar en transportadores de nutrientes para entrar en el cerebro. Otros estan uniendo potenciales sustancias terapeuticas disenadas para que el cerebro los absorba sin querer.

Los capilares que suministran sangre a los tejidos del cerebro constituyen la barrera hematoencefalica (Goldstein et al., "The Blood-Brain Barrier," Scientific American 255:74-83(1986); Pardridge, "Receptor-Mediated Peptide Transport Through the Blood-Brain Barrier," Endocrin. Rev. 7:314-330(1986)). Las celulas endoteliales que forman los capilares cerebrales son diferentes de las encontradas en otros tejidos del cuerpo. Las celulas endoteliales capilares cerebrales se unen entre si mediante estrechas uniones intercelulares que forman una pared continua contra la difusion pasiva de moleculas desde la sangre al cerebro y otras partes del SNC. Estas celulas tambien son diferentes en el sentido de que tienen pocas vesiculas pinociticas, que, en otros tejidos, permiten un transporte algo no selectivo a traves de la pared capilar. Tambien carecen de huecos o canales continuos que funcionan entre las celulas, lo que permitiria el paso sin restricciones.

La barrera hematoencefalica funciona para asegurar que el ambiente del cerebro esta constantemente controlado. Los niveles de varias sustancias en la sangre, tales como hormonas, aminoacidos e iones, experimentan pequenas fluctuaciones frecuentes que pueden ser provocadas por actividades tales como comer y hacer ejercicio (Goldstein et al., "The Blood-Brain Barrier," Scientific American 255:74-83(1986); Pardridge, "Receptor-Mediated Peptide Transport Through the Blood-Brain Barrier," Endocrin. Rev. 7:314-330(1986)). Si el cerebro no estuviera protegido por la barrera hematoencefalica frente a estas variaciones en la composition del suero, el resultado podria ser una actividad neural descontrolada.

El aislamiento del cerebro de la circulation sanguinea no es completo. Si este fuera el caso, el cerebro seria incapaz de funcionar correctamente debido a la falta de nutrientes y debido a la necesidad de intercambiar productos quimicos con el resto del cuerpo. La presencia de sistemas de transporte especificos dentro de las celulas endoteliales capilares asegura que el cerebro recibe, de manera controlada, todos los compuestos necesarios para el crecimiento y la funcion normales. En muchos casos, estos sistemas de transporte consisten en proteinas asociadas a la membrana, que se unen selectivamente y transportan ciertas moleculas a traves de las membranas de barrera. Estas proteinas transportadoras se conocen como transportadores portadores de soluto.

Aunque se cree que la BHE cumple una funcion protectora en condiciones normales protegiendo el SNC de la exposition a compuestos potencialmente toxicos, en la enfermedad del SNC, la BHE puede frustrar los esfuerzos terapeuticos al obstaculizar la entrada de compuestos terapeuticos en el SNC. Por ejemplo, aunque muchas infecciones bacterianas y fungicas pueden tratarse facilmente cuando el sitio de la infection esta fuera del SNC, tales infecciones en el SNC son a menudo muy peligrosas y muy dificiles de tratar debido a la incapacidad de administrar dosis eficaces de farmacos en el sitio de la infeccion. De manera similar, la action de la BHE hace que el tratamiento del cancer del cerebro sea mas dificil que el tratamiento de los canceres situados fuera del SNC. Incluso cuando puede ser posible administrar una dosis efectiva de farmaco en el SNC administrando cantidades muy grandes de farmaco fuera del SNC, los niveles de farmaco fuera del SNC (tal como en la sangre) suelen ser tan altos que llegan a niveles toxicos perjudiciales para los rinones, el higado y otros organos vitales. Por consiguiente, en la tecnica se necesitan metodos para mejorar la liberacion de compuestos en el SNC.

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Ademas, los pacientes que sufren edema, traumatismos cerebrales, ictus y esclerosis multiple exhiben degradacion de la BHE cerca del sitio de las agresiones principales. El nivel de degradacion puede tener efectos profundos sobre el resultado clinico de estas enfermedades. Por ejemplo, el grado de degradacion de la BHE en pacientes que sufren esclerosis multiple ("EM") se correlaciona con la gravedad de la enfermedad. Mediante resonancia magnetica (“MRI”) se ha demostrado que, cuando una persona esta sufriendo una "crisis" de EM, la barrera hematoencefalica se ha roto en una seccion del cerebro o de la medula espinal, permitiendo que los globulos blancos llamados linfocitos T atraviesen y destruyan la mielina.

A pesar de la importancia de esta barrera, se sabe muy poco sobre los mecanismos moleculares que controlan la integridad y/o la permeabilidad de la BHE. Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad considerable de composiciones y metodos que faciliten dicha investigation y, especialmente, de aplicaciones de diagnostico y/o terapeuticas.

La presente invention se refiere a la superacion de estas y otras deficiencias en la tecnica.

Sumario de la invencion

La invencion se define en las reivindicaciones.

La presente invencion se refiere a un agonista del receptor de la adenosina y/o a un antagonista del receptor A1 de la adenosina para su uso en el aumento de la permeabilidad de la barrera hematoencefalica en un sujeto, en donde el sujeto es aquel que se beneficiaria de un incremento de la permeabilidad de la barrera hematoencefalica y en el que el sujeto no esta sometido a un tratamiento que aumente el nivel de adenosina. El agonista del receptor de adenosina y/o un antagonista del receptor A1 de la adenosina modulan los receptores de adenosina en condiciones eficaces para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefalica en el sujeto.

La presente invencion tambien se refiere a un antagonista de los receptores A2A de adenosina para su uso en la disminucion de la permeabilidad de la barrera hematoencefalica en un sujeto, en donde el sujeto es uno que se beneficiaria de la disminucion de la permeabilidad de la barrera hematoencefalica. El antagonista de los receptores A2A de adenosina modula los receptores de adenosina en condiciones eficaces para disminuir la permeabilidad de la barrera hematoencefalica en el sujeto.

Tambien se divulga un metodo de tratamiento de un sujeto por un trastorno o afeccion del sistema nervioso central. Este metodo implica seleccionar un sujeto con el trastorno o afeccion del sistema nervioso central y proporcionar una terapeutica eficaz para tratar el trastorno o afeccion del sistema nervioso central. Se proporciona un agente permeabilizante de la barrera hematoencefalica, en el que el agente aumenta el nivel y/o la biodisponibilidad de adenosina, modula los receptores de adenosina y/o aumenta el nivel y/o la actividad de CD73. La sustancia terapeutica y el agente permeabilizante de la barrera hematoencefalica se administran al sujeto seleccionado en condiciones eficaces para que la sustancia terapeutica pase a traves de la barrera hematoencefalica y trate el trastorno o afeccion.

Tambien se divulga un metodo de selection de compuestos eficaces para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefalica. Este metodo implica proporcionar a un animal modificado con niveles de expresion de CD73 reducidos, niveles de expresion de adenosina reducidos y/o actividad modulada del receptor de adenosina en comparacion con un animal no modificado. Tambien se proporcionan uno o mas compuestos candidatos y se administran los uno o mas compuestos candidatos al animal modificado. A continuation se evalua si el uno o mas compuestos candidatos aumentan el nivel y/o la biodisponibilidad de adenosina, modula los receptores de adenosina y/o aumenta el nivel y/o la actividad de CD73. A continuacion se identifican los compuestos candidatos que aumentan el nivel o la biodisponibilidad de adenosina, modulan los receptores de adenosina y/o aumentan el nivel y/o la actividad de CD73 en el animal modificado como potencialmente eficaces para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefalica.

Tambien se divulga un agente farmaceutico. Este agente farmaceutico tiene un efecto terapeutico eficaz para tratar el trastorno o afeccion del sistema nervioso central y un agente permeabilizante de la barrera hematoencefalica. Este agente aumenta el nivel y/o la biodisponibilidad de adenosina, modula los receptores de adenosina y/o aumenta el nivel y/o la actividad de CD73.

Los agentes de la presente invencion proporcionan un tratamiento mejorado de sujetos con trastornos que afectan a la barrera hematoencefalica. Ademas, la presente invencion proporciona agentes para su uso en metodos mejorados de control de la barrera hematoencefalica para potenciar el tratamiento terapeutico de dichos pacientes.

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1 muestra un grafico que demuestra que los ratones cd73-/- son resistentes a la encefalomielitis autoinmune experimental ("EAE"). Se indujo EAE, se monitorizo diariamente la actividad de la enfermedad y se calculo la puntuacion media de EAE para ratones cd73-/- (diamantes abiertos, n = 11) y de tipo salvaje (cd73+/+)

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cuadrados cerrados, n = 13). Los resultados mostrados son representativos de 11 experimentos separados.

Las Figuras 2A-D muestran que las celulas T cd73-/- producen niveles elevados de IL-1p e IL-17 y median en la susceptibilidad a EAE cuando se transfieren a ratones cd73+/+tcra-/-. La Figura 2A muestra la expresion de CD4 y FoxP3 medida en esplenocitos de ratones cd73-/- no tratados previamente y de tipo salvaje 13 dias despues de la EAE inducida. La Figura 2B muestra esplenocitos de ratones de tipo salvaje inmunizados 13 dias despues de la inmunizacion con MOG y no tratados, que se analizaron para determinar la expresion en la superficie celular de CD4 y CD73 mediante citometria de flujo. La Figura 2C muestra celulas seleccionadas de ratones cd73~/- o salvajes inmunizados que se cultivaron con 1 x 104 esplenocitos irradiados y peptido MOG 0 o 10 |jM. Los sobrenadantes se tomaron a las 18 horas y se sometieron a un ensayo Bio-plex de citocinas. Los resultados representan el cambio de los niveles de citocinas entre los grupos de peptidos MOG de 0 y 10 jM. Se agruparon muestras de 4 ratones y son representativas de uno de cada tres experimentos similares. La Figura 2D muestra celulas T CD4+ del bazo y ganglios linfaticos de ratones cd73~/- inmunizados con MOG (rombos abiertos, n = 5) o de tipo salvaje (cuadrados cerrados, n = 5) que se transfirieron de forma adoptiva en ratones cd73+/+tcror/- deficientes en celulas T. Se indujo EAE y la progresion de la enfermedad se controlo diariamente. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes.

La Figura 3A-L muestra ratones cd73-/- que muestran poca o ninguna infiltracion de linfocitos en el SNC despues de la induction de EAE; las celulas T cd73-/- donantes infiltran el SNC de los ratones receptores cd73+/+tcror/- despues de la induccion de EAE. Las secciones de tejido congelado de ratones salvajes (Figuras 3A-C) y cd73~/- (Figuras 3D-F) a los 13 dias de la induccion de EAE se marcaron con anticuerpo CD4. Las Figuras 3G muestran el numero medio de linfocitos infiltrantes CD4+ en el cerebro y la medula espinal cuantificado por campo en secciones de tejido congelado de ratonescd73~/- y de tipo salvaje a los 13 dias de la induccion de EAE. Se analizaron ocho campos anatomicamente similares por cerebro y 4 campos por medula espinal por raton a un aumento de 10x (n = 5 ratones/grupo). Las barras de error representan el error estandar de la media. Las Figuras 3H-L muestran secciones de tejido congelado del hipocampo (Figura 3H, 3I y 3K) y el cerebelo (Figura 3J y 3L) marcadas con un anticuerpo CD4 de ratones tcra-/- inducidos por EAE que recibieron celulas CD4+ de ratones de tipo salvaje (Fig. 3H-J) o cd73-/- (Fig. 3K-L) a los 12 (Fig. 3K), 18 (Fig. 3H y 3L) o 22 (Fig. 3I y 3J) de la induccion de EAE. Se detecto inmunorreactividad Ig anti-rata con HRP mas AEC (rojo) contra un fondo nuclear marcado con hematoxilina (azul). Las flechas indican sitios de infiltracion de linfocitos. Las barras de escala representan 500 jm.

Las Figuras 4A-K muestra ratones cd73~/- que muestran poca o ninguna infiltracion de linfocitos en el SNC despues de la induccion de EAE; las celulas T cd73~/- infiltran el SNC despues de la transferencia a ratones cd73+/+tcror/- e induccion de EAE. Las secciones de tejido congelado de ratones salvajes (Figuras 4A-C) y cd73~ /- (Figuras 4D-F) a los 13 dias de la induccion de EAE se marcaron con anticuerpo CD45. Las secciones de tejido helado del hipocampo (Fig. 4G, 4H y 4J) y del cerebelo (Figura 4I y 4K) marcadas con un anticuerpo CD45 de ratones tcror/- con EAE inducida que recibieron celulas CD4+ de ratones de tipo salvaje (Fig. 4G-I) or cd73~/- (Fig. 4J-K) el dia 12 (Fig. 4J), el dia 18 (Figura 4G y 4K) o el dia 22 (Fig. 4H y 4I) despues de la induccion de EAE. Se detecto inmunorreactividad Ig anti-rata con HRP mas AEC (rojo) contra un fondo nuclear marcado con hematoxilina (azul). Las flechas indican sitios de infiltracion de linfocitos. Las barras de escala representan 500 mm.

La Figura 5A-C muestra que las celulas T especificas de mielina no entran de forma eficaz en el cerebro de ratones cd73~/- despues de la induccion de EAE. Se aislaron celulas T Vp11 + de ratones 2d2 transgenicos inmunizados con MOG35-55 que expresan TCR especificos de MOG35-55 del bazo y los ganglios linfaticos y se transfirieron de forma adoptiva a ratones de tipo salvaje o cd73~/- con induccion concomitante de EAE. En los dias 1, 3, 8 y 15 despues de la transferencia y la induccion de EAE, se extirparon los bazos (figura 5A), los ganglios linfaticos (figura 5B) y los cerebros (figura 5C) y se recogieron las celulas. Las celulas se analizaron para determinar la expresion de CD45 y Vp11 mediante citometria de flujo. Los datos representan el cambio relativo (RFC) en el porcentaje de celulas Vp11+ en la poblacion de CD45+ para cada organo en cada dia dado. Los valores se normalizaron respecto al porcentaje de celulas encontradas en cada organo el dia 1 despues de la transferencia/induccion de EAE, con 1,0 equivalente al valor basal.

La Figura 6A-D muestran que las celulas T CD73+ transferidas de forma adoptiva de ratones de tipo salvaje pueden conferir a los ratones cd73~/- susceptibilidad a EAE. La Figura 6A muestra que las celulas T CD4+ del bazo y los ganglios linfaticos de ratones de tipo salvaje inmunizados con MOG se enriquecieron y se transfirieron de forma adoptiva a ratones de tipo salvaje (cuadrados cerrados, n = 5) o cd73-/- (rombos abiertos, n = 5), seguido de induccion concomitante de EAE. Se muestran resultados de uno de dos experimentos independientes. La Figura 6B muestra celulas T procedentes del bazo y los ganglios linfaticos de ratones de tipo salvaje y cd73-/- previamente inmunizados clasificados basandose en la expresion de CD4 y CD73 y se transfirieron de forma adoptiva a ratones cd73-/-, seguido de induccion concomitante de EAE (n = 5/cada grupo). Los cuadrados cerrados representan celulas donantes de ratones de tipo salvaje que expresan CD73; los cuadrados abiertos representan celulas donantes de ratones de tipo salvaje que carecen de expresion de CD73; los rombos abiertos representan celulas donantes de ratones cd73-/-. La Figura 6C-D muestra secciones de tejido congelado del plexo coroideo del SNC de ratones de tipo salvaje no intactos (Figura 6C, izquierda) y cd73~ /- (Figura 6C, derecha y ratones de tipo salvaje 12 dias despues de la induccion de EAE (Figura 6D) se tineron con un anticuerpo especifico de CD73 (Figura 6C) o CD45 (Figura 6D). Se detecto inmunorreactividad Ig anti- rata con HRP mas AEC (rojo) contra un fondo nuclear marcado con hematoxilina (azul). Las llaves indican tincion de CD73. Las flechas indican tincion de linfocitos CD45. Las barras de escala representan 500 jm.

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La Figura 7A-D muestra que el bloqueo de los receptores de adenosina protege a los ratones del desarrollo de EAE. La Figura 7A muestra las puntuaciones medias de EAE en las que se indujo EAE, se monitorizo diariamente la actividad de la enfermedad y se calculo la puntuacion media de EAE en ratones de tipo salvaje (cuadrados) y cd73-/- (rombos) a los que se administro agua de bebida (forma cerrada) solo o agua de bebida suplementada con 0,6 g/ml del antagonista del receptor de adenosina de amplio espectro cafeina (forma abierta). Los resultados proceden de un experimento (n = 5 ratones por grupo). La Figura 7B muestra los niveles de expresion de ARNm del receptor de adenosina en relacion con el gen constitutivo de GAPDH en la linea celular del plexo coroideo murino Z310. Las muestras se realizaron por triplicado; las barras de error representan el error estandar de la media. La Figura 7C muestra los resultados despues de tratar a los ratones con el antagonista del receptor de adenosina A2a SCH58261 a 2 mg/kg (1 mg/kg s.c. y 1 mg/kg i.p.) en DMSO al 45 % (cuadrados cerrados, n = 4 ratones/grupo) o DMSO al 45 % solo (cuadrados abiertos, n = 5 ratones/grupo) 1 dia antes y diariamente hasta el dia 30 despues de la induction de EAE. Estos resultados son representativos de dos experimentos. Las Figuras 7D muestran el numero medio de linfocitos infiltrantes CD4+ en el cerebro y la medula espinal cuantificado por campo en secciones de tejido congelado desde el dia 15 despues de la induccion de EAE en ratones tratados con SCH58261 y DMSO. Se analizaron ocho campos anatomicamente similares por cerebro y 4 campos por medula espinal por raton a un aumento de 10x (n = 4 ratones). Las barras de error representan el error estandar de la media.

La Figura 8 muestra el antagonista del receptor de adenosina A2a SCH58261 evita la regulation por aumento de ICAM-1 en el plexo coroideo despues de la induccion de EAE. Se trato a los ratones con el antagonista del receptor de adenosina A2a SCH58261 a 2 mg/kg (1 mg/kg s.c. y 1 mg/kg i.p.) en DMSO (n = 4 ratones/grupo) o DMSO solo (n = 5 ratones/grupo) 1 dia antes y diariamente hasta el dia 30 despues de la induccion de eAe. Estos resultados proceden de un experimento. Se examinaron secciones de tejido congelado a partir del dia 15 despues de la induccion de EAE en ratones tratados con SCH58261 y con DMSO para determinar la expresion de ICAM-1 en el plexo coroideo. Los ratones SV tratados con DMSO (izquierda) o SCH58261 (derecha) y tenidos para ICAM-1 (tincion roja, flechas blancas) y DAPI (azul, nucleos) con un aumento de 40x. Las imagenes son de 4 ratones distintos.

La Figura 9A-B demuestra que los ratones CD73/-, que carecen de adenosina extracelular y, por lo tanto, no pueden senalar adecuadamente a traves de los receptores de adenosina, se trataron con NECA, dando lugar a un aumento de casi cinco veces de la migration del colorante frente al PBS control (Fig. 9A). Los ratones SV tratados con NECA tambien muestran un aumento con respecto a los ratones control (Figura 9B). Se uso Pertussis como control positivo, ya que se sabe que induce permeabilidad de la barrera hematoencefalica en el modelo de EAE de raton.

La Figura 10 muestra la expresion del receptor de adenosina en la linea de celulas endoteliales humanas hCMEC/D3.

La Figura 11 muestra los resultados despues de sembrar celulas hCMEC/D3 sobre membranas Transwell y se dejo que crecieran hasta confluencia; se anadieron 2 x 106 celulas Jurkat a la camara superior con o sin NECA (agonista general del receptor de adenosina [ARCCPA (agonista A1AR), CGS 21680 (agonista de A2AAR) o vehiculo DMSO; y las celulas migradas se contaron despues de 24 horas.

La Figura 12 muestra los resultados despues de sembrar celulas Z310sobre membranas Transwell y se dejo que crecieran hasta confluencia; se anadieron 2 x 106 celulas Jurkat a la camara superior con o sin NECA (n= 1, agonista general de AR), CCPA (n= 1, agonista de A1AR), CGS 21680 (n= 1, agonista de A2AAR) o vehiculo DMSO (n= 1); y las celulas migradas se contaron despues de 24 horas.

La Figura 13 muestra los resultados despues de cultivar las celulas hCMEC/D3 hasta confluencia en placas de 24 pocillos; las celulas se trataron con o sin diversas concentraciones de NECA (agonista general de AR), CCPA (agonista A1AR), CGS 21680 (agonista de A1AR), vehiculo DMSO o forscolina (induce AMPc); se anadio tampon de lisis tras 15 minutos y las celulas se congelaron a -80 °C para detener la reaction; y los niveles de AMPc se analizaron usando un kit de detection de AMPC (Applied Biosystems, Foster City, CA).

La Figura 14 muestra los resultados de ratones hembra defectivos en el receptor de adenosina A1 (A1ARKO, n = 5) y de tipo salvaje (SV, n = 5) inmunizados con CFA/MOG35-55 + PTX el 12/02/08 y se puntuaron diariamente durante 41 dias.

La Figura 15A-B muestra cerebros de ratones de tipo salvaje alimentados con cafeina y cerebros de ratones CD73/- alimentados con cafeina, medidos mediante Extravasation de dextrano-FITC a traves del endotelio cerebral.

La Figura 16 muestra los resultados en forma de grafico de la extravasacion de dextrano-FITC a traves de la barrera hematoencefalica de ratones de tipo salvaje tratados con agonista de receptor de adenosina, NECA, mientras que SCH58261 inhibe la extravasacion de dextrano-FITC.

La Figura 17 muestra los resultados de la extravasacion de colorante Evans Blue a traves de la barrera hematoencefalica, medida mediante un espectrofotometro BioTex a 620 nm, despues de tratar a los ratones con agonista de receptor de adenosina NECA.

Descripcion detallada de la invencion

La invencion proporciona un metodo para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefalica en un sujeto. Este metodo implica seleccionar un sujeto que se beneficiara de la permeabilidad aumentada de la barrera hematoencefalica y someter al sujeto seleccionado a un tratamiento. Este tratamiento incrementa el nivel y/o la biodisponibilidad de adenosina, modula los receptores de adenosina y/o aumenta el nivel y/o la actividad de CD73

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en condiciones eficaces para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefalica en el sujeto.

La invencion se refiere a un agonista del receptor A2A de la adenosina y/o a un antagonista del receptor A1 de la adenosina para su uso en el aumento de la permeabilidad de la barrera hematoencefalica en un sujeto, en el que el sujeto es aquel que se beneficiaria de un incremento de la permeabilidad de la barrera hematoencefalica y en el que el sujeto no esta sometido a un tratamiento que aumente el nivel de adenosina.

La adenosina es una senal celular de estres metabolico que se produce en condiciones de hipoxia, isquemia o inflamacion. Su principal objetivo es reducir la lesion tisular y estimular la reparacion mediante diferentes mecanismos mediados por receptores, incluyendo el aumento de la relacion suministro/demanda de oxigeno, el preacondicionamiento, los efectos antiinflamatorios y la estimulacion de la angiogenesis (Jacobson et al., "Adenosine Receptors as Therapeutic Targets," Nat. Rev. Drug Discov. 5:247-264(2006)). Los efectos biologicos de la adenosina son dictados, en ultima instancia, por el patron diferente de distribucion de receptores y/o la afinidad de los cuatro subtipos conocidos del receptor de adenosina (“AR”) en tipos de celulas especificos.

CD73 (ecto-5'-nucleotidasa) es una molecula de superficie celular anclada a glicosilo, fosfatidilo, inositol de 70 kDa con actividad ecto-enzimatica. Se expresa abundantemente en muchos tipos de celulas incluyendo subpoblaciones de linfocito (Yamashita et al., "CD73 Expression and Fyn-Dependent Signaling on Murine Lymphocytes," Eur. J. Immunol. 28:2981-2990 (1998)), celulas endoteliales (Yamashita et al., "CD73 Expression and Fyn-Dependent Signaling on Murine Lymphocytes," Eur. J. Immunol. 28:2981-2990 (1998)) y celulas epiteliales (Strohmeier et al., "Surface Expression, Polarization, and Functional Significance of CD73 in Human Intestinal Epithelia," J. Clin. Invest. 99:2588-2601 (1997)). Es parte de la via de salvamento de purinas a traves de la degradacion de nucleosido-5'- monofosfatos (AMP e IMP) en nucleotidos como adenosina e inosina.

Los metodos adecuados de control de CD73 divulgados en el presente documento incluyen la administracion de una proteina CD73 recombinante o una citocina u otro factor capaz de inducir la expresion de CD73 endotelial o mediante una combinacion de ambas terapias, como se describe en la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos de Jalkanen. Mas especificamente, los agentes adecuados descritos divulgados en el presente documento incluyen citocinas u otros factores que regulan por aumento directamente o indirectamente la transcripcion del gen CD73. Una citocina adecuada es, normalmente, un interferon o una interleucina, pero tambien pueden usarse otros agentes. En el caso de que la citocina sea un interferon, el interferon puede ser alfa, beta, gamma, omega o cualquier otro interferon y puede ser cualquier subtipo de los interferones mencionados anteriormente. Se cree que, en particular, los interferones alfa y beta son adecuados para tal uso. Cualquier interleucina capaz de inducir la expresion de CD73 endotelial es tambien adecuada para su uso en este metodo. Ejemplos de dichas interleucinas incluyen IL-4, IL-10, IL-13 e IL-20.

En una divulgacion, la administracion de proteina CD73 recombinante o una citocina o ambas se combina con una administracion de adenosina monofosfato ("AMP") con el fin de salvaguardar la fuente de adenosina que se va a producir como resultado del nivel elevado de CD73, obtenido mediante expresion elevada o mediante la administracion directa de la proteina CD73 recombinante.

La administracion de proteina CD73 recombinante o una citocina o ambas puede ser con una administracion de un inhibidor de adenilato quinasa, que evita que el AMP se convierta en adenosina difosfato (“ADP”) o adenosina trifosfato (“ATP”).

Como alternativa, la administracion de proteina CD73 recombinante o una citocina o ambas puede combinarse con la administracion de un inhibidor de adenosina desaminasa que evita la descomposicion de la adenosina. Esto tambien podria combinarse con la administracion de AMP y, opcionalmente, tambien con un inhibidor de la adenilato quinasa, que evita que el AMP se convierta en adenosina difosfato (ADP) o adenosina trifosfato (ATP).

La adenosina extracelular (que puede generarse por CD73, como se ha descrito anteriormente) regula la entrada de celulas inmunes en el sistema nervioso central. Por consiguiente, la permeabilidad de la BHE esta mediada por la concentracion local de adenosina junto con la actividad de los receptores de adenosina: el receptor A1 se activa a baja concentracion de adenosina (alta afinidad) y el A2a se activa a concentraciones altas de adenosina (baja afinidad). Por lo tanto, al aumentar la disponibilidad de adenosina se aumentara la permeabilidad de la BHE. Por el contrario, la disminucion de la disponibilidad de adenosina disminuira la permeabilidad de la BHE. Ademas, el aumento del nivel o actividad de CD73 producira adenosina local adicional, como se ha descrito con detalle anteriormente, aumentando con ello la permeabilidad de la BHE.

La adenosina, un producto nucleosidico purinico de la actividad enzimatica de CD73, se une a receptores especificos en la superficie celular. Se ha informado que la adenosina desempena un papel en muchos acontecimientos fisiologicos y patologicos. La adenosina se encuentra en todas las celulas vivas y puede liberarse en condiciones apropiadas, tales como isquemia o anoxia 20, donde puede actuar sobre los receptores de adenosina para producir diversos efectos fisiologicos.

Actualmente se sabe que los receptores de adenosina son proteinas de membrana integrales que se unen a la adenosina extracelular, iniciando de este modo una senal transmembrana a traves de proteinas de union a

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nucleotidos de guanina espedficas conocidas como protemas G para modular diversos sistemas de segundo mensajero, incluyendo adenililciclasa, canales de potasio, canales de calcio y Fosfolipasa C. Vease Stiles, "Adenosine Receptors and Beyond: Molecular Mechanisms of Physiological Regulation," Clin. Res. 38(1): 10—18 (1990); Stiles, "Adenosine Receptors," J. Biol Chem. 267: 6451-6454 (1992).

La activacion del receptor de adenosina A2A aumentara la permeabilidad de la BHE. Los activadores adecuados del receptor A2A de la adenosina son agonistas A2a, que son bien conocidos en la tecnica (Press et al., "Therapeutic Potential of Adenosine Receptor Antagonists and Agonists," Expert Opin. Ther. Patents 17(8):1-16(2007)). Otros agonistas de receptores A2a de adenosina incluyen los descritos en la patente de Estados Unidos N.° 6.232.297 y en la Solicitud de Patente Publicada de Estados Unidos 2003/0186926 a1 de Lindin et al., el documento 2005/0054605 A1 de Zablocki et al., y en las solicitudes de patente publicada de Estados Unidos n.° 2006/0040888 A1, 2006/0040889 A1,2006/0100169 A1 y 2008/0064653 A1 to Li et al. Estos compuestos se pueden sintetizar como se describe en: las patentes de Estados Unidos numeros 5.140.015 y 5.278.150 to Olsson et al.; la patente de Estados Unidos numero 5.593.975 de Cristalli; la patente de Estados Unidos numero 4.956.345 Miyasaka et al.; Hutchinson et al., "CGS 21680C, an A2 Selective Adenosine Receptor Agonist with Preferential Hypotensive Activity," J. Pharmacol. Exp. Ther., 251: 47-55 (1989); Olsson et al, "N6-Substituted N-alkyladenosine-5'-uronamides: Bifunctional Ligands Having Recognition Groups for A1 and A2 Adenosine Receptors," J. Med. Chem., 29: 16831689 (1986); Bridges et al., "N6-[2-(3,5-dimethoxyphenyl)-2-(2-methylphenyl)ethyl]adenosine and its Uronamide Derivatives: Novel Adenosine Agonists With Both High Affinity and High Selectivity for the Adenosine A2 Receptor," J. Med. Chem. 31: 1282 (1988); Hutchinson et al., J. Med. Chem., 33:1919 (1990); Ukeeda et al., "2- Alkoxyadenosines: Potent and Selective Agonists at the Coronary Artery A2 Adenosine Receptor," J. Med. Chem. 34: 1334 (1991); Francis et al., "Highly Selective Adenosine A2 Receptor Agonists in a Series of N-alkylated 2- aminoadenosines," J. Med. Chem. 34: 2570-2579 (1991); Yoneyama et al, "Vasodepressor Mechanisms of 2-(1- octynyl)-adenosine (YT-146), a Selective Adenosine A2 Receptor Agonist, Involve the Opening of Glibenclamide- sensitive K+ Channels," Eur. J. Pharmacol. 213(2):199-204 (1992); Peet et al., "Conformationally Restrained, Chiral (phenylisopropyl)amino-substituted pyrazolo[3,4-d]pyrimidines and Purines with Selectivity for Adenosine A1 and A2 Receptors," J. Med. Chem., 35: 3263-3269 (1992); y Cristalli et al.,"2-Alkynyl Derivatives of Adenosine and Adenosine-5'-N-ethyluronamide as Selective Agonists at A2 Adenosine Receptors, " J. Med. Chem. 35(13): 23632368 (1992). Estos agonistas del receptor A2A de adenosina pretenden ser ilustrativos y no limitantes.

El bloqueo o desactivacion del receptor A1 de adenosina tambien aumentara la permeabilidad de la BHE. Los desactivadores adecuados del receptor A1 de la adenosina son antagonistas A1 de adenosina, que son bien conocidos en la tecnica (Press et al., "Therapeutic Potential of Adenosine Receptor Antagonists and Agonists," Expect Opin. Ther. Patents 17(8):1-16(2007)). Los antagonistas adecuados del receptor A1 de adenosina incluyen, pero sin limitaciones, los descritos en la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2008/0027082 A1 de Hocher et al., las patentes de Estados Unidos n.° 5.446.046 y 5.668.139 de Belardinelli et al., la patente de Estados Unidos n.° 6.117.998 de Neely, y la patente de Estados Unidos n.° 7.247.639 de Wilson et al.

Al aumentar la permeabilidad de la BHE, el sujeto seleccionado puede tener un trastorno del sistema nervioso central (“SNC”).

Entre los trastornos del SNC (que abarcan enfermedades o trastornos psiquiatricos/de comportamiento) se pueden incluir, pero sin limitaciones, afasia epileptiforme adquirida, encefalomielitis aguda diseminada, adrenoleucodistrofia, agenesia del cuerpo calloso, agnosia, sindrome de aicardi, enfermedad de Alexander, enfermedad de Alpers, hemiplejia alterna, enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrofica, anencefalia, sindrome de Angelman, angiomatosis, anoxia, afasia, apraxia, quistes aracnoides, aracnoiditis, malformacion de Arnold-chiari, malformacion arteriovenosa, sindrome de Asperger, ataxia telangiectasia, trastorno de hiperactividad con deficit de atencion, autismo, trastorno de procesamiento auditivo, disfuncion autonomica, dolor de espalda, enfermedad de Batten, enfermedad de Behcet, paralisis de Bell, blefaroespasmo esencial benigno, amiotrofia focal benigna, hipertension intracraneal benigna, polimicrogiria frontoparietal bilateral, enfermedad de Binswanger, blefaroespasmo, sindrome de Bloch-Sulzberger, lesion del plexo braquial, absceso cerebral, dano cerebral, lesion cerebral, tumor cerebral, tumor espinal, sindrome de Brown-Sequard, enfermedad de Canavan, sindrome del tunel carpiano (STC), causalgia, sindrome de dolor central, mielinolisis pontina central, miopatia centronuclear, trastorno cefalico, aneurisma cerebral, arteriosclerosis cerebral, atrofia cerebral, gigantismo cerebral, paralisis cerebral, enfermedad de los dientes de Charcot-Marie, malformacion de Chiari, corea, polineuropatia desmielinizante inflamatoria cronica (“PDIC”), dolor cronico, sindrome de dolor regional cronico, sindrome de Coffin Lowry, coma (incluido el estado vegetativo persistente), diplejia facial congenita, degeneracion corticobasal, arteritis craneal, craniosinostosis, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, trastornos de traumatismo acumulativo, sindrome de Cushing, enfermedad de cuerpos de inclusion citomegalicos (“ECIC”), infeccion por citomegalovirus, sindrome de Dandy Walter, sindrome de De Morsier, paralisis de Dejerine-Klumpke, enfermedad de Dejerine-Sottas, sindrome de fase retardada del sueno, demencia, dermatomiositis, dispraxia del desarrollo, neuropatia diabetica, esclerosis difusa, disautonomia, discalculia, disgrafia, dislexia, distoma, encefalopatia epileptica infantil temprana, sindrome de la silla vacia, encefalitis, encefalocele, angiomatosis encefalotrigeminal, encopresis, epilepsia, paralisis de Erb, eritromelalgia, temblor esencial, enfermedad de Fabry, sindrome de Fahr, desmayo, paralisis espastica familiar, convulsiones febriles, sindrome de Fisher, ataxia de Friedreich, enfermedad de Gaucher, sindrome de Gerstmann, arteritis de celulas gigantes, enfermedad de inclusion de celulas gigantes, leucodistrofia de celulas globulares, heterotopia de la materia gris, sindrome de

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Guillain-Barre, mielopatia asociada a HTLV-1, enfermedad de Hallervorden-Spatz, traumatismo craneal, cefalea, espasmo hemifacial, paraplejia espastica hereditaria, polineuritiforme atactica heterodopatoa, herpes zoster oticus, herpes zoster, smdrome de Hirayama, holoprosencefalia, enfermedad de Huntington, hidronencefalia, hidrocefalia, hipercortisolismo, hipoxia, encefalomielitis inmunomediada, miositis por cuerpos de inclusion, incontinencia pigmentaria, enfermedad de almacenamiento de acido fitanitico infantil, enfermedad de Refsum infantil, espasmos infantiles, miopatia inflamatoria, quiste intracreaneal hipertension intracraneal, sindrome de Joubert, smdrome de Kearns-sayre, enfermedad de Kennedy, sindrome de Kinsbourne, sindrome de Klippel Feil, enfermedad de Krabbe, enfermedad de Kugelberg-Welander, kuru, enfermedad de lafora, sindrome miastenico de Lambert-Eaton, sindrome de Landau-Kleffner, sindrome lateral medular (Wallenberg), dificultades de aprendizaje, enfermedad de Leigh, sindrome de Lennox-Gastaut, sindrome de Lesch-Nyhan, leucodistrofia, demencia con cuerpos de Lewy, lisencefalia, sindrome de enclaustramiento, enfermedad de Lou Gehrig, enfermedad del el disco lumbar, secuelas neurologicas de la enfermedad de Lyme, enfermedad de Machado-Joseph (ataxia espinocerebelosa de tipo 3), macroencefalia, megalencefalia, sindrome de Melkersson-Rosenthal, enfermedad de Meniere, meningitis, enfermedad de Menkes, leucodistrofia metacromatica, microcefalia, migrana, sindrome de Miller Fisher, mini-ictus, miopatias mitocondriales, sindrome de Moebius, amiotrofia monomelica, enfermedad de las neuronas motoras, enfermedad de las capacidades motoras, enfermedad de moyamoya, mucopolisacaridosis, demencia multiinfarto, neuropatia motora multifocal, esclerosis multiple, atrofia de multiples sistemas con hipotension postural, distrofia muscular, encefalomielitis mialgica, miastenia gravis, esclerosis difusa mielinoclastica, encefalopatia mioclonica de lactantes, mioclonia, miopatia, miopatia miotubular, miotonia congenita, narcolepsia, neurolibromatosis, sindrome neuroleptico maligno, manifestaciones neurologicas del SIDA, secuelas neurologicas del lupus, neuromiotonia, lipofuscinosis ceroidal neuronal, trastornos de la migracion neuronal, enfermedad de Niemann-Pick, sindrome del despertar, sin sueno de 24 horas, trastorno del aprendizaje no verbal, sindrome de O'sullivan-Mcleod, neuralgia occipital, secuencia de disrafia espinal oculta, sindrome de Ohtahara, atrofia olivopontocerebelosa, sindrome de mioclonos opsoclonos, neuritis optica, hipotension ortostatica, sindrome de sobreuso, palinopsia, parestesia, enfermedad de Parkinson, paramiotonia congenita, enfermedades paraneoplasicas, ataques paroxismicos, sindrome de Parry-Romberg (tambien conocido como sindrome de romberg), enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, paralisis periodica, neuropatia periferica, estado vegetativo persistente, trastornos generalizados del desarrollo, reflejos estornudos foticos, enfermedad de almacenamiento de acido fitanico, enfermedad de Pick, nervios pinzados, tumores pituitarios, pmg, polio, polimicrogiria, polimiositis, porencefalia, sindrome pospolio, neuralgia postherpetica (“NPH”), encefalomielitis postinfecciosa, hipotension postural, sindrome de Prader-willi, esclerosis lateral primaria, enfermedades prionicas, atrofia hemifacial progresiva (tambien conocido como sindrome de Romberg), leucoencefalopatia multifocal progresiva, poliodistrofia esclerosante progresiva, paralisis supranuclear progresiva, seudotumor cerebral, sindrome de caza de Ramsay (tipo I y tipo II), encefalitis de Rasmussen, sindrome de distrofia simpatica refleja, enfermedad de Refsum, trastornos del movimiento repetitivo, lesion por esfuerzo repetitivo, sindrome de las piernas inquietas, mielopatia asociada con retrovirus, sindrome de Rett, sindrome de Reye, sindrome de Romberg, rabia, baile de San Vito, enfermedad de Sandhoff, esquizofrenia, enfermedad de Schilder, esquizencefalia, disfuncion de la integracion sensorial, displasia septo-optica, sindrome del nino sacudido, culebrillas, sindrome de Shy-dragar sindrome de Sjogren, apnea del sueno, enfermedad del sueno, estornudos incontrolados, sindrome de Sotos, espasticidad, espina bifida, lesion de la medula espinal, tumores de la medula espinal, atrofia muscular espinal, estenosis espinal, sindrome de Steele-Richardson-Olszewski, vease paralisis supranuclear progresiva, ataxia espinocerebelosa, sindrome del hombre rigido, ictus, sindrome de Sturge-weber, panencefalitis esclerosante subaguda, encefalopatia arteriosclerotica subcortical, siderosis superficial, corea de Sydenham, sincope, sinestesia, siringomielia, discinesia tardia, enfermedad de Tay-Sachs, arteritis temporal, tetanos, sindrome de la medula espinal atada, enfermedad de Thomsen, sindrome de salida toracica, tic doloroso, paralisis de Todd, sindrome de Tourette, ataque isquemico transitorio, encefalopatias espongiformes transmisibles, mielitis transversa, lesion cerebral traumatica, temblor, neuralgia del trigemino, paraparesia espastica tropical, tripanosomiasis, esclerosis tuberosa, vasculitis incluyendo arteritis temporal, enfermedad de Von Hippel-lindau (VHL), encefalomielitis de Viliuisk (VE), sindrome de Wallenberg, enfermedad de Werdnig-Hoffman, sindrome de West, latigazo cervical, sindrome de Williams, enfermedad de Wilson y sindrome de Zellweger. Por tanto, se puede apreciar que todos los estados y trastornos relacionados con el SNC pueden tratarse a traves de la via de la BHE de liberacion del farmaco.

Los compuestos de la presente invencion pueden administrarse por via oral, por via parenteralmente, por ejemplo, por via subcutanea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, mediante instilacion intranasal o mediante aplicacion a las membranas mucosas, tales como de la nariz, la garganta y los tubos bronquiales. Pueden administrarse solos o con vehiculos farmaceuticos adecuados y pueden estar en forma solida o liquida, tales como comprimidos, capsulas, polvos, soluciones, suspensiones o emulsiones.

Los compuestos activos de la presente invencion se pueden administrar por via oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un vehiculo comestible asimilable o se pueden encerrar en capsulas de gelatina de cubierta dura o blanda, o comprimirse en comprimidos o se pueden incorporar directamente con el alimento de la dieta. Para el fin de la administration terapeutica oral, estos compuestos activos pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, capsulas, elixires, suspensiones, jarabes y similares. Tales composiciones y preparaciones deben contener al menos 0,1 % de compuesto activo. El porcentaje del compuesto en estas composiciones puede, por supuesto, variarse y puede estar, de forma conveniente, entre aproximadamente 2 % a aproximadamente un 60 % del peso de la unidad. La cantidad de compuesto activo en tales composiciones terapeuticamente utiles es tal que

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se obtendra una dosificacion adecuada. Las composiciones preferidas de acuerdo con la presente invencion se preparan de modo que una unidad de dosificacion oral contenga entre aproximadamente 1 y 250 mg de compuesto activo.

Los comprimidos, capsulas y similares tambien pueden contener un aglutinante tal como goma de tragacanto, goma arabiga, almidon de maiz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicalcico; un agente disgregante tal como almidon de maiz, almidon de patata, acido alginico; un lubricante tal como estearato de magnesio; y un agente edulcorante tal como sacarosa, lactosa o sacarina. Cuando la forma unitaria de dosificacion es una capsula, puede contener, ademas de materiales del tipo anterior, un vehiculo liquido tal como un aceite graso.

Puede haber presentes otros diversos materiales como revestimientos o para modificar la forma fisica de la unidad de dosificacion. Por ejemplo, los comprimidos pueden estar recubiertos con goma shellac, azucar o ambos. Un jarabe puede contener, ademas del ingrediente activo, sacarosa como agente edulcorante, metilo y propilparabenes como conservantes, un colorante y un aromatizante, tal como sabor a cereza o a naranja.

Estos compuestos activos tambien pueden administrarse por via parenteral. Las soluciones o suspensiones de estos compuestos activos se pueden preparar en agua adecuadamente mezclada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones tambien se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles liquidos y sus mezclas en aceites. Aceites ilustrativos son los de origen de petroleo, animal, vegetal o sintetico, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de soja o aceite mineral. En general, son vehiculos liquidos preferidos, en particular para soluciones inyectables, agua, solucion salina, dextrosa acuosa y soluciones de azucar relacionadas, y glicoles, tales como propilenglicol o polietilenglicol. En condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. En todos los casos, la forma debe ser esteril y debe ser fluida de modo que se pueda introducir con facilidad en las jeringuillas. Debe ser estable en las condiciones de la fabricacion y almacenamiento y debe conservarse frente a la accion contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehiculo puede ser un disolvente o medio de dispersion que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol liquido), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales.

Los compuestos de la presente invencion tambien se pueden administrar directamente en las vias respiratorias en forma de un aerosol. Para su uso como aerosoles, los compuestos de la presente invencion en solucion o suspension pueden envasarse en un recipiente de aerosol presurizado junto con propelentes adecuados, por ejemplo propelentes de hidrocarburos como propano, butano o isobutano con adyuvantes convencionales. Los materiales de la presente invencion tambien se pueden administrar en una forma no presurizada, tal como en un nebulizador o atomizador.

Tambien se proporciona un metodo para disminuir la permeabilidad de la barrera hematoencefalica en un sujeto. Este metodo implica seleccionar un sujeto que se beneficiara de la permeabilidad disminuida de la barrera hematoencefalica y someter al sujeto seleccionado a un tratamiento. Este tratamiento disminuye el nivel y/o la biodisponibilidad de adenosina, modula los receptores de adenosina y/o disminuye el nivel y/o la actividad de CD73 en condiciones eficaces para disminuir la permeabilidad de la barrera hematoencefalica en el sujeto.

La invencion proporciona un antagonista de receptor A2A de adenosina para su uso en la disminucion de la permeabilidad de la barrera hematoencefalica en un sujeto, en la que el sujeto es aquel que se beneficiaria de una permeabilidad disminuida de la barrera hematoencefalica.

Este aspecto de la presente invencion puede llevarse a cabo utilizando las formulaciones farmaceuticas y los metodos de administracion descritos anteriormente.

Como se ha descrito con detalle anteriormente, la permeabilidad de la BHE esta controlada por los niveles locales de adenosina, CD73 y la actividad del receptor de adenosina. La alteracion de la actividad de los receptores de adenosina se puede conseguir proporcionando antagonistas y/o agonistas de los receptores de adenosina, que son bien conocidos en la tecnica (Press et al., "Therapeutic Potential of Adenosine Receptor Antagonists and Agonists," Expect Opin. Ther. Patents 17(8):1-16(2007)).

La alteracion de la actividad del receptor de adenosina en un sujeto para disminuir la permeabilidad de la barrera sanguinea puede lograrse mediante, aunque sin limitaciones, la administracion al sujeto un antagonista del receptor A2A de adenosina y/o un agonista del receptor A1 de adenosina.

Un numero de antagonistas del receptor A2A de la adenosina son conocidos por los expertos en la tecnica y pueden usarse individualmente o conjuntamente en los metodos descritos en el presente documento. Tales antagonistas incluyen, pero sin limitaciones, (-)-R,S)-mefloquina el enantiomero activo de la mezcla racemica comercializada como Mefloquine™), 3,7-dimetil-1-propargilxantina (DMPX), 3-(3-hidroxipropil)-7-metil-8-(m-metoxistiril)-1- propargilxantina (MX2), sal disodica de fosfato de 3-(3-hidroxipropil)-8-(3-metoxistiril)-7-metil-1-propargilxantina

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(MSX-3, un profarmaco de fosfato de MSX-2), derivados de 7-metil-8-stirilxantina, SCH 58261, KW-6002, aminofuriltriazolo-tri-azinilaminoetilfenol (ZM 241385) y 8-clorostiril cafema, KF17837, VR2006, istradefillina, los farmacos VERNALIS, tales como VER 6489, VER 6623, VER 6947, VER 7130, VER 7146, VER 7448, VER 7835, VER 8177VER-11135, VER-6409, VER 6440, VER 6489, VER 6623, VER 6947, VER 7130, VER 7146, VER 7448, VER 7835, VER 8177, pirazolo [4,3-e]1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidinas y 5-amino-imidazolo-[4,3-e]-1,2,4- triazolo[1,5-c]pirimidina, y similares (publication de la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2006/0128708 de Li et al.), pirazolo[4,3-e]-[1,2,4]-triazolo[1,5-c]pirimidinas (vease, por ejemplo, el documento WO 01/92264 de Kase et al.), 2,7-disustituido-5-amino-[1,2,4]triazolo[1,5-c]pirimidinas (vease, por ejemplo, el documento WO 03/048163 to Kase et al.), 2,5-disustituido- 7-amino-[1,2,4]triazolo[1,5-a][1,3,5]triazinas (vease, por ejemplo, Vu et al., "Piperazine Derivatives of [1,2,4]Triazolo[1,5-a][1,3,5]triazine as Potent and Selective Adenosine A2a Receptor Antagonists," J. Med. Chem. 47(17):4291-4299 (2004)), 9-sustituido-2-(sustituido-etin-1-yl)-adeninas (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 7.217.702 de Beauglehole et al.), derivados de 7-metil-8-stirilxantina, pirazolo[4,3-e)1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidinas y 5-amino-imidazolo-[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1,5-c]pirimidinas (vease, por ejemplo, la publicacion de la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2006/0128708 to Li et al.). Estos antagonistas del receptor A2A de adenosina pretenden ser ilustrativos y no limitantes.

Los agonistas de receptores A1 de adenosina adecuados, divulgados pero no reivindicados, incluyen los descritos en la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2005/0054605 A1 de Zablocki et al.

Al disminuir la permeabilidad de la BHE, el sujeto seleccionado puede tener una enfermedad inflamatoria. Tales enfermedades inflamatorias incluyen aquellas en las que los mediadores de la inflamacion atraviesan la barrera hematoencefalica. Tales enfermedades inflamatorias incluyen, pero no se limitan a, la inflamacion causada por infection bacteriana, infection virica o enfermedad autoinmune. Mas especificamente, tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a las mismas, meningitis, esclerosis multiple, neuromielitis optica, encefalitis por el virus de la inmunodeficiencia humana ("VIH") 1, encefalitis por el virus del herpes simple (VHS), encefalitis por Toxoplasma gondii y leucoencefalopatia multifocal progresiva.

Cuando la permeabilidad de la BHE disminuye, el sujeto seleccionado tambien puede tener una afeccion mediada por la entrada de linfocitos en el cerebro. Otras afecciones que se pueden tratar de esta manera incluyen encefalitis del cerebro, enfermedad de Parkinson, epilepsia, manifestaciones neurologicas del VIH-SIDA, secuelas neurologicas del lupus y enfermedad de Huntington, meningitis, esclerosis multiple, neuromielitis optica, encefalitis por el VHS y leucoencefalopatia multifocal progresiva.

Este metodo puede llevarse a cabo utilizando los agentes farmaceuticos y los metodos de administration descritos anteriormente.

Un agente terapeutico puede incluir cualquier agente terapeutico util en el tratamiento de una enfermedad o afeccion del SNC. Tales otros compuestos pueden ser de cualquier clase de farmaco o agente farmaceutico, incluyendo, pero sin limitaciones, antibioticos, agentes antiparasitarios, agentes antifungicos, agentes antivirales y agentes antitumorales. Cuando se administran con agentes antiparasitarios, antibacterianos, antifungicos, antitumorales, antivirales y similares, los compuestos del permeabilizantes de la barrera hematoencefalica pueden administrarse por cualquier metodo y via de administracion adecuados para el tratamiento de la enfermedad, normalmente como composiciones farmaceuticas.

Los agentes terapeuticos pueden administrarse como agente terapeutico o profilactico (por ejemplo, inhibiendo o previniendo el inicio de enfermedades neurodegenerativas). Una terapeutica causa la erradicacion o mejora de la enfermedad subyacente que esta siendo tratada. Un profilactico se administra a un paciente en riesgo de desarrollar una enfermedad o a un paciente que comunica uno o mas de los sintomas fisiologicos de tal enfermedad, incluso aunque no se haya podido establecer todavia un diagnostico. Como alternativa, se puede aplicar la administracion profilactica para evitar el inicio de los sintomas fisiologicos del trastorno subyacente, particularmente si el sintoma se manifiesta ciclicamente. En esta ultima divulgation, la terapia es profilactica con respecto a los sintomas fisiologicos asociados en lugar de la indication subyacente. La cantidad efectiva real para una aplicacion particular dependera, entre otras cosas, de la afeccion que se este tratando y de la via de administracion.

Los agentes terapeuticos pueden ser inmunosupresores, antiinflamatorios, antiproliferativos, agentes antimigratorios, agentes antifibroticos, proapoptoticos, bloqueantes de los canales de calcio, antineoplasicos, anticuerpos, agentes antitromboticos, agentes antiplaquetarios, agentes de Ilblllla, agentes antivirales, agentes anticancerosos, agentes

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quimioterapeuticos, tromboliticos, vasodilatadores, antimicrobianos o antibioticos, antimitoticos, antagonistas del factor de crecimiento, secuestrantes de los radicales libres, agentes biologicos, agentes radioterapeuticos, agentes radiopacos, agentes radiomarcados, anticoagulantes (por ejemplo, heparina y sus derivados), farmacos antiangiogenesis (por ejemplo, talidomida), farmacos angiangiogenicos, inhibidores del PDGF-B y/o EGF, antiinflamatorios (por ejemplo, farmacos para la psoriasis), riboflavina, tiazofurina, zafurina, agentes antiagregantes plaquetarios (por ejemplo, inhibidores de la ciclooxigenasa (por ejemplo, acido acetilsalicilico), inhibidores del ADP (tales como clopidogrel y ticlopdipina), inhibidores de la fosfodiesterasa III (tales como cilostazol), agentes de la licoproteina Il/IIIIa (tales como abciximab), eptifibatida e inhibidores de la recaptacion de adenosina (tales como dipiridmoles, agentes curativos y/o promotores (por ejemplo, antioxidantes y donantes de oxido de nitrogeno), antiemeticos, antinauseas, tripiterolida, diterpenos, triterpenos, epoxidos diterpenicos, epoxido diterpenoide, triepoxidos o tripterygium wifordii hook F (TWHF), SDZ-RAD, RAD, RAD666 o 40-0-(2-hidroxi)etil-rapamicina, derivados, sales farmaceuticas y combinaciones de los mismos.

En una divulgacion, el agente capaz terapeutico es una proteina o peptido bioactivo. Ejemplos de dicha proteina o peptidos bioactivos incluyen un peptido modulador de celulas, un peptido quimiotactico, un peptido anticoagulante, un peptido antitrombotico, un peptido antitumoral, un peptido antiinfeccioso, un peptido potenciador del crecimiento y un peptido antiinflamatorio. Ejemplos de proteinas incluyen anticuerpos, enzimas, esteroides, hormona del crecimiento y hormona liberadora de la hormona del crecimiento, hormona liberadora de gonadotropina y sus analogos agonistas y antagonistas, somatostatina y sus analogos, gonadotropinas, peptido T, tirocicotonina, hormona paratiroidea, glucagon, vasopresina, oxitocina, angiotensina I y II, bradiquinina, kalidina, hormona adrenocorticotropa, hormona estimulante tiroidea, insulina, glucagon y los numerosos analogos y congeneres de las moleculas anteriores. En algunos aspectos de la invencion, la permeabilidad de la BHE se modula mediante uno o mas de los agentes reivindicados para administrar un antibiotico o un agente capaz terapeutico anti-infeccioso. Tales agentes antiinfecciosos reducen la actividad de un microorganismo o lo destruyen.

En ciertas divulgaciones, el agente permeabilizante terapeutico y el agente permeabilizante de la barrera hematoencefalica se formulan como una unica formulacion de "compuesto". Esto puede conseguirse mediante cualquiera de una serie de metodos conocidos. Por ejemplo, el agente terapeutico y permeabilizante de la barrera hematoencefalica puede combinarse en un solo excipiente farmaceuticamente aceptable. En otro enfoque, el agente terapeutico y permeabilizante de la barrera hematoencefalica puede formularse en excipientes separados que se microencapsulan y luego se combinan, o que forman laminas separadas en una sola pastilla, y asi sucesivamente.

En una divulgacion, el agente terapeutico y permeabilizante de la barrera hematoencefalica estan unidos. En ciertas divulgaciones, el agente terapeutico y permeabilizante de la barrera hematoencefalica estan unidos directamente entre si o se unen entre si mediante un "conector" o "enlazador" para formar un compuesto unico. Sin estar ligado a una teoria alguna en particular, se cree que tales compuestos unidos proporcionan una especificidad/selectividad mejorada.

Los expertos en la tecnica conocen bien una serie de quimicas para unir moleculas directamente o a traves de un enlazador/conector. La quimica especifica empleada para unir el agente o agentes terapeuticos y el agente permeabilizante de la barrera hematoencefalica para formar un compuesto bifuncional depende de la naturaleza quimica del agente o agentes terapeuticos y la separacion “entre ligandos” deseada. Diversos agentes terapeuticos y agentes permeabilizantes de la barrera hematoencefalica normalmente contienen diversos grupos funcionales (por ejemplo, acido carboxilico (COOH), amina libre (-NEE), y similares), que estan disponibles para la reaccion con un grupo funcional adecuado en un enlazador o en el componente opuesto (es decir, el agente terapeutico o permeabilizante de la barrera hematoencefalica) para unir los componentes juntos.

Como alternativa, los componentes pueden derivarse para exponer o fijar grupos funcionales reactivos adicionales. La derivatizacion puede implicar la union de cualquiera de una serie de moleculas enlazadoras, tales como las disponibles en Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.

Un "enlazador" o "conector", tal como se usa en el presente documento, es una molecula que se usa para unir dos o mas ligandos (Por ejemplo, agente o agentes terapeuticos o agente permeabilizante de la barrera hematoencefalica) para formar un compuesto bifuncional o polifuncional. El enlazador se elige normalmente de modo que sea capaz de formar enlaces covalentes con todos los demas componentes que comprenden el resto bifuncional o polifuncional. Los enlazadores adecuados son bien conocidos por los expertos en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a los mismos, enlazadores de carbono de cadena lineal o ramificada, enlazadores de carbono heterociclicos, aminoacidos, acidos nucleicos, dendrimeros, polimeros sinteticos, enlazadores peptidicos, analogos de peptidos de acidos nucleicos, carbohidratos, polietilenglicol y similares. Cuando uno o mas de los componentes son polipeptidos, el enlazador puede unirse a los aminoacidos constituyentes a traves de sus grupos laterales (por ejemplo, a traves de un enlace disulfuro a cisteina) o a traves de los grupos amino o carboxilo del carbono alfa de los aminoacidos terminales.

En ciertas divulgaciones se puede usar un enlazador bifuncional que tiene un grupo funcional reactivo con un grupo en el primer grupo terapeutico y otro grupo reactivo con un grupo funcional en el agente permeabilizante de la barrera hematoencefalica para formar un compuesto bifuncional. Como alternativa, la derivatizacion puede implicar

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tratamiento quimico del componente o componentes (por ejemplo, escision de glicol del resto de azucar de una glicoprotema, un carbohidrato o un acido nucleico, etc.) con peryodato para generar grupos aldehido libres. Los grupos aldehido libres pueden hacerse reaccionar con grupos amina o hidrazina libres en un enlazador para unir el enlazador al compuesto (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 4.671.958 de Rodwell et al.). Tambien se conocen procedimientos para la generacion de grupos sulfhidrilo libres en el polipeptido, tales como anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (vease la Patente de Estados Unidos N.° 4.659.839 de Nicolotti et al.)

Donde el agente terapeutico y permeabilizante de la barrera hematoencefalica son ambos peptidos, un compuesto bifuncional puede sintetizarse quimicamente o expresarse de forma recombinante como una proteina de fusion que comprende ambos componentes unidos directamente entre si o unidos a traves de un enlazador peptidico.

En ciertas divulgaciones se usan enlazadores basados en lisina, acido glutamico y polietilenglicol (PEG) de longitud diferente para acoplar los componentes. Los expertos en la tecnica conocen bien la quimica para la conjugacion de moleculas a PEG (vease, por ejemplo, Veronese, "Peptide and Protein PEGylation: a Review of Problems and Solutions," Biomaterials 22: 405-417 (2001); Zalipsky et al., "Attachment of Drugs to Polyethylene Glycols," Eur. Plym. J. 19(12):1177-1183 (1983); Olson et al., "Preparation and Characterization of Poly(ethylene glycol)ylated Human Growth Hormone Antagonist," Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, DC (1997); Delgado et al., "The Uses and Properties of PEG-Linked Proteins," Grit. Rev. Therap. Drug Carrier Sys. 9: 249-304(1992); Pedley et al., "The Potential for Enhanced Tumour Localisation by Poly(ethylene glycol) Modification of anti-CEA Antibody," Brit. J. Cancer 70:1126-1130 (1994); Eyre & Farver, Textbook of Clinical Oncology 377-390 (Holleb et al. eds. 1991); Lee et al., "Prolonged Circulating Lives of Single-chain of Fv Proteins Conjugated with Polyethylene Glycol: a Comparison of Conjugation Chemistries and Compounds," Bioconjug. Chem. 10: 973-981(1999); Nucci et al., "The Therapeutic Value of Poly(Ethytene Glycol- Modified Proteins," Adv. Drug Deliv. Rev.6: 133-151(1991); Francis et al., "Polyethylene Glycol Modification: Relevance of Improved Methodology to Tumour Targeting," J. Drug Targeting 3: 321-340(1996)).

En ciertas divulgaciones, la conjugacion del agente terapeutico y permeabilizante de la barrera hematoencefalica puede lograrse mediante el uso de reactivos de union tales como glutaraldehido, EDCI, cloruro de tereftaloilo, bromuro de cianogeno y similares, o por aminacion reductora. En ciertas divulgaciones, los componentes pueden estar unidos a traves de un enlazador de hidroxiacido del tipo divulgado en el documento WO-A-9317713. Los enlazadores de PEG tambien pueden usarse para la preparacion de diversos farmacos unidos a PEG (vease, por ejemplo, Lee et al., "Reduction of Azides to Primary Amines in Substrates Bearing Labile Ester Functionality: Synthesis of a PEG-Solubilized, "Y"-Shaped Iminodiacetic Acid Reagent for Preparation of Folate-Tethered Drugs," Organic Lett., 1: 179-181(1999)).

Tambien se proporciona un metodo de seleccion de compuestos eficaces para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefalica. Este metodo implica proporcionar a un animal modificado con niveles de expresion de CD73 reducidos, niveles de expresion de adenosina reducidos y/o actividad modulada del receptor de adenosina en comparacion con un animal no modificado. Tambien se proporcionan uno o mas compuestos candidatos y se administran los uno o mas compuestos candidatos al animal modificado. A continuation se evalua si el uno o mas compuestos candidatos aumentan el nivel y/o la biodisponibilidad de adenosina, modula los receptores de adenosina y/o aumenta el nivel y/o la actividad de CD73. A continuacion se identifican los compuestos candidatos que aumentan el nivel o la biodisponibilidad de adenosina, modulan los receptores de adenosina y/o aumentan el nivel y/o la actividad de CD73 en el animal modificado como potencialmente eficaces para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefalica.

En ciertas divulgaciones, el metodo objeto tambien se puede poner en practica con el uso de un animal transgenico. Los animales transgenicos pueden clasificarse ampliamente en dos tipos: "con inserciones inactivadoras" y "con inserciones activadoras". Un transgenico “con inserciones inactivadoras" tiene una alteration en el gen diana producida al introducirse secuencias transgenicas que dan lugar a una disminucion de la funcion del gen diana, preferentemente de modo que la expresion del gen diana sea insignificante o indetectable. Un animal transgenico “con inserciones activadoras” tiene una alteracion en el genoma de la celula huesped que da lugar a una expresion aumentada de un gen diana, por ejemplo mediante la introduction de una copia adicional del gen diana o mediante la insertion operativa de una secuencia reguladora que proporciona expresion aumentada de una copia endogena del gen diana. Los animales transgenicos con inserciones activadoras o inserciones inactivadoras pueden ser heterocigoticos u homocigoticos con respecto a los genes diana. Los animales transgenicos de esta divulgation se pueden clasificar ampliamente como con inserciones inactivadoras o con inserciones activadoras, que pueden sobreexpresar o subexpresar CD73, adenosina y/o receptores de adenosina

En ciertas divulgaciones, los animales transgenicos estan disenados para proporcionar un sistema modelo para determinar, identificar y/o cuantificar la modulacion de la permeabilidad de la BHE. Tales determinaciones pueden producirse en cualquier momento durante la vida del animal, incluyendo antes o despues de la alteracion o modificacion de la permeabilidad de la BHE. El sistema del modelo transgenico puede usarse tambien para el desarrollo de agentes biologicamente activos que promueven o aumentan la permeabilidad de la BHE. Ademas, el sistema modelo puede utilizarse para analizar si un agente de ensayo restablece la barrera o disminuye la permeabilidad (por ejemplo, despues de la “apertura” de la BHE (es decir, aumenta la permeabilidad), tal como, la

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apertura de la BHE causada por un traumatismo o enfermedad). Ademas, las celulas se pueden aislar de los animales transgenicos para su posterior estudio o ensayos llevados a cabo en el contexto de cultivo a base de celulas o cultivo celular, incluyendo tecnicas ex vivo.

En ciertas divulgaciones, los modelos animales abarcan cualquier vertebrado no humano que sea susceptible a procedimientos que producen una afeccion de permeabilidad modificada de la BHE en el sistema nervioso del animal. Los organismos modelo preferidos incluyen, pero no se limitan a los mismos, mamiferos, primates no humanos y roedores. Ejemplos no limitantes de los modelos preferidos son ratas, ratones, cobayas, gatos, perros, conejos, cerdos, chimpances y monos. Los animales de ensayo pueden ser de tipo salvaje o transgenicos.

Los avances en las tecnologias para la micromanipulacion de embriones permiten ahora la introduccion de ADN heterologo tambien en ovulos de mamifero fertilizados. Por ejemplo, se pueden transformar celulas madre totipotenciales o pluripotenciales mediante microinyeccion, precipitacion mediada por fosfato de calcio, fusion de liposomas, infeccion retroviral u otros medios. A continuacion, las celulas transformadas se introducen entonces en el embrion y, despues, el embrion se convertira en un animal transgenico. En una divulgacion, los embriones en desarrollo se infectan con un vector viral que contiene un transgen deseado de manera que los animales transgenicos que expresan el transgen se pueden producir a partir del embrion infectado. En otra divulgacion, se coinyecta un transgen deseado en el pronucleo o citoplasma del embrion, preferiblemente en la etapa de una sola celula y se deja que el embrion se desarrolle en un animal transgenico maduro. Estos y otros metodos variantes para generar animales transgenicos estan bien establecidos en la tecnica y, por lo tanto, no se detallan en el presente documento. Veanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.° 5.175.385 y 5.175.384.

La permeabilidad de la BHE se puede probar utilizando diversos indicadores conocidos en la tecnica. Por ejemplo, se impide el paso de colorantes, indicadores o marcadores de un peso molecular mayor que 180 Da a traves de una BHE intacta. El ensayo puede realizarse en animales de experimentacion, incluyendo, sin limitaciones, ratones, ratas, perros, cerdos o monos. Entre los indicadores adecuados se incluyen cualquier colorante, marcador o indicador conocido en la tecnica que se utiliza para determinar, visualizar, medir, identificar o cuantificar la permeabilidad de la barrera hematoencefalica. Entre los ejemplos no limitantes se incluyen, Evans Blue y fluoresceina sodica.

Otra divulgacion adicional se refiere a un agente farmaceutico. Este agente farmaceutico tiene un efecto terapeutico eficaz para tratar el trastorno o afeccion del sistema nervioso central y un agente permeabilizante de la barrera hematoencefalica, en el que el agente aumenta el nivel y/o la biodisponibilidad de adenosina, modula los receptores de adenosina y/o aumenta el nivel y/o la actividad de CD73.

El producto farmaceutico puede formularse y administrarse sustancialmente de la misma manera que se ha descrito anteriormente.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Ratones

Los ratones CD73/- se han descrito anteriormente (Thompson et al., "Crucial Role for Ecto-5'-Nucleotidase (CD73) in Vascular Leakage During Hypoxia," J. Exp. Med. 200:1395-1405 (2004)) y se han retrocruzado con C57BL/6 para 14 generaciones. Los ratones Cd73-/- no tienen una susceptibilidad manifiesta a la infeccion y parecen normales basandose en el tamano y la composicion celular de sus organos linfoides y sus respuestas de celulas T y B en ensayos in vivo e in vitro (Thompson et al., "Crucial Role for Ecto-5'-Nucleotidase (CD73) in Vascular Leakage During Hypoxia," J. Exp. Med. 200:1395-1405 (2004)). Los ratones C57BL/6 y tcrar/- en el fondo C57BL/6 se adquirieron de The Jackson Laboratories. Los ratones se criaron y alojaron en condiciones especificas libres de patogenos en la Universidad de Cornell o la Universidad de Turku. Para los experimentos de bloqueo de receptores de adenosina, se proporciono a los ratones agua de bebida suplementada con 0,6 g/l de cafeina (Sigma) o 2 mg/kg de SCH58261 (1 mg/kg s.c. y 1 mg/kg i.p.) en DMSO (45 % en volumen en PBS) o DMSO al 45 % solo, comenzando 1 dia antes de la induccion de EAE y continuando durante todo el experimento. Todos los procedimientos realizados en ratones fueron aprobados por el comite de revision de animales correspondiente.

Ejemplo 2 - Induccion y puntuacion de EAE

La EAE se indujo sometiendo a ratones al regimen de induccion de EAE por la glicoprotema de los oligodendrocitos de mielina (MOG) como se describe en Swanborg, "Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Rodents as a Model for Human Demyelinating Disease," Clin. Immunol. Immunopathol. 77:4-13 (1995) y Bynoe et al., "Epicutaneous Immunization with Autoantigenic Peptides Induces T Suppressor Cells that Prevent Experimental Allergic Encephalomyelitis," Immunity 19:317-328 (2003). En pocas palabras, se inyecto, por via subcutanea (50 |jl) una emulsion 1:1 del peptido MOG35-55 (3 mg/ml en PBS) (Invitrogen) y adyuvante completo de Freund (CFA, Sigma) en cada flanco. La toxina pertussis (PTX, 20 ng) (Biological Laboratories Inc.) se administro por via intravenosa (200 |jl en PBS) en el momento de la inmunizacion y, de nuevo, 2 dias despues. Se puntuo a los ratones diariamente para la EAE basandose en la gravedad de los sintomas de la enfermedad; 0 = ausencia de enfermedad,

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0,5 - 1 = cola debil/flacida, 2 = cola flacida y paralisis parcial de las patas traseras, 3 = paralisis total de las patas traseras, 4 = paralisis de las patas delanteras y traseras, 5 = muerte. Se sacrifico a los ratones con una puntuacion de 4.

Ejemplo 3 - Preparaciones de celulas T y transferencia adoptiva

Se sensibilizo a los ratones con el peptido MOG35-55 en CFA sin PTX. Despues de una semana, se recogieron los linfocitos del bazo y de los ganglios linfaticos y se incubaron con tampon ACK (NH4Cl, 0,15 M, KHCO3, 1 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,3) para lisar los globulos rojos. Las celulas se incubaron con anticuerpos frente a CD8 (TIB-105), IAM,v,pAr (212.A1), FcR (2,4-G2), B220 (TIB-164), NK1,1 (HB191) y, despues, IgG antiraton de cabra BioMag, IgM e IgG anti-rata de cabra (Qiagen). Despues del enriquecimiento magnetico negativo, las celulas CD4+ se usaron directamente o se clasificaron en subpoblaciones especificas. Para la clasificacion, las celulas se tineron con anticuerpos contra CD4 (RM4-5) y CD73 (TY/23) y, en algunos experimentos, CD25 (PC61), y, despues, se aislaron utilizando un FACSAria (BD Biosciences). La pureza tras la clasificacion fue, de forma rutinaria, >99 %. Para la transferencia adoptiva, las celulas T CD4+ totales o clasificadas se lavaron y resuspendieron en PBS esteril. Los ratones receptores recibieron < 2,5 x 106 celulas i.v. en 200 |jl de PBS esteril.

Ejemplo 4 - Citometria de flujo

Las suspensiones celulares se tineron con anticuerpos conjugados con fluorocromo para CD4 (RM4-5), CD73 (TY/23), o FoxP3 (FJK-16s). La tincion de FoxP3 intracelular se llevo a cabo de acuerdo a las instrucciones del fabricante (eBioscience). Las celulas tenidas se adquirieron en un FACSCalibur (BD Biosciences). Los datos se analizaron con el software FlowJo (Tree Star).

Ejemplo 5 - Ensayo de citocinas de celulas T

Se cultivaron celulas T clasificadas de ratones inmunizados con MOG en presencia de esplenocitos C57BL/6 irradiados con peptido MOG 0 o 10 |jM. Los sobrenadantes se recogieron a las 18 horas y se analizaron utilizando el ensayo de citocina Bio-plex (Biorad) para IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17, IL-1p y TNFa.

Ejemplo 6 - Inmunohistoquimica ("IHC")

Los ratones anestesiados fueron perfundidos con PBS, y los cerebros, bazos y medulas espinales se aislaron y ultracongelaron en medio tisular Tek-OCT. Secciones cinco jM (cerebros en una orientacion sagital) a los portaobjetos Supefrost/Plus (Fisher) se fijaron en portaobjetos Supefrost/Plus (Fisher), se fijaron en acetona y se almacenaron a -80 °C. Para la inmunotincion, los portaobjetos se descongelaron y se trataron con 0,03 % de H2O2 en PBS para bloquear la peroxidasa endogena, se bloquearon con caseina (Vector) in suero de cabra normal (Zymed), y luego se incubaron con anti-CD45 (YW62,3), anti-CD4 (RM4-5) o anti-ICAM-1 (3E2). Los portaobjetos se incubaron con Ig de cabra anti-rata biotinilada (Jackson ImmunoResearch) y estreptavidina-HRP (Zymed) y se desarrollaron con un kit de sustrato AEC (Red) (Zymed) y una contratincion de hematoxilina. Los cubreobjetos se montaron con Fluoromount-G y se fotografiaron bajo luz (Zeiss).

Ejemplo 7 - PCR-c en tiempo real

Usando Trizol (Invitrogen), se aislo el ARN de la linea celular del plexo coroideo Z310 (Zheng et al., "Establishment and Characterization of an Immortalized Z310 Choroidal Epithelial Cell Line from Murine Choroid Plexus," Brain Res. 958:371-380 (2002)). El ADNc se sintetizo usando un kit Reverse-iT (ABGene). Se utilizaron cebadores (disponibles a peticion) especificos para los AR para determinar los niveles de expresion genica y se estandarizaron a los niveles de genes constitutivos de GAPDH usando un kit de verde SYBR (ABGene) ejecutado en un sistema de PCR en tiempo real ABI 7500. Se realizaron analisis de la curva de fusion para medir la especificidad de cada producto de PCRc.

Ejemplo 8 - Evaluacion del papel de CD73 en la EAE

Debido a las propiedades inmunomoduladoras e inmunosupresoras de la adenosina, se evaluo el papel de CD73 en EAE. Basandose en un informe de EAE exacerbada en ratones con deficiencia del receptor A1 de adenosina (AR) (Tsutsui et al., "A1 Adenosine Receptor Upregulation and Activation Attenuates Neuroinflammation and Demyelination in a Model of Multiple Sclerosis," J. Neurosci. 24:1521-1529 (2004)), se espera que los ratonescd73-/- que son incapaces de catalizar la produccion de adenosina extracelular experimenten EAE grave. Sorprendentemente, los ratones cd73-/- eran altamente resistentes a la induccion de EAE. Sin embargo, las celulas T CD4+ de ratones cd73-1- poseen la capacidad para generar una respuesta inmune frente a antigenos del SNC y causan EAE severa cuando se transfiere de forma adoptiva a ratones deficientes en celulas T cd73+l+. Las celulas T CD73+CD4+ de ratones de tipo salvaje tambien causaron enfermedad cuando se transfirieron a receptores cd73-1-, lo que sugiere que la expresion de CD73, ya sea en linfocitos o en el SNC, es necesaria para la entrada de los linfocitos en el cerebro durante la EAE. Dado que los ratones cd73+l+ estaban protegidos contra la induccion de EAE por el antagonista de AR de espectro amplio cafeina y el antagonista A2aespecifico de AR SCH58261, estos datos

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sugieren que la adenosina extracelular generada por CD73, y no por el propio CD73, regula la entrada de linfocitos en el SNC durante la EAE. Estos resultados son los primeros en demostrar un papel de CD73 y la adenosina en la regulacion del desarrollo de EAE.

Ejemplo 9 - Los ratones Cd73~-~ son resistentes a la induccion de EAE

Para determinar si CD73 desempena un papel en el control de la inflamacion durante la progresion de la EAE, los ratones cd73-/- y de tipo salvaje (cd73+/+) fueron sometidos al regimen de induccion de eAe por la glicoprotema de los oligodendrocitos de mielina (MOG) como se describe en Swanborg, "Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Rodents as a Model for Human Demyelinating Disease," Clin. Immunol. Immunopathol. 77:4-13 (1995) y Bynoe et al., "Epicutaneous Immunization with Autoantigenic Peptides Induces T Suppressor Cells that Prevent Experimental Allergic Encephalomyelitis," Immunity 19:317-328 (2003)). El control diario del desarrollo de la EAE revelo que los ratones cd73-/- mostraban consistentemente una gravedad de la enfermedad drasticamente reducida en comparacion con sus homologos de tipo salvaje (Figura 1). A las tres semanas de la induccion de la enfermedad, los ratones cd73~/- tenian una puntuacion promedio de EAE de solo 0,5 (cola debil) comparada con 2,0 (cola flacida y paralisis parcial de las patas traseras) para ratones de tipo salvaje (Figura 1).

Ejemplo 10 - Celulas T CD4+ de ratones cd73-l~ responden a la inmunizacion de MOG

A continuation se pregunto si la resistencia de los ratones cd73-/- a la induccion de EAE podria explicarse por una mayor capacidad de los linfocitos cd73-/- para suprimir una respuesta inmune o una incapacidad de estos linfocitos para responder a la estimulacion MOG. Las celulas CD4+CD25+FoxP3+ de origen natural, o Tregs, pueden regular la EAE inducida de forma activa (Kohm et al., "Cutting Edge: CD4+CD25+ Regulatory T Cells Suppress Antigen- Specific Autoreactive Immune Responses and Central Nervous System Inflammation During Active Experimental Autoimmune Encephalomyelitis," J. Immunol. 169:4712-4716 (2002)). Dado que recientemente se ha demostrado que las Treg expresan CD73 y algunos informes sugieren que la actividad enzimatica de CD73 es necesaria para la funcion de las Treg (Kobie et al., "T Regulatory and Primed Uncommitted CD4 T Cells Express CD73, Which Suppresses Effector CD4 T Cells by Converting 5'-Adenosine Monophosphate to Adenosine," J. Immunol. 177:6780-6786); Deaglio et al., "Adenosine Generation Catalyzed by CD39 and CD73 Expressed on Regulatory T Cells Mediates Immune Suppression," J. Exp. Med. 204:1257-1265 (2007)), se pregunto si el numero y la actividad supresora de Treg eran normales en los ratones cd73~/-. Como se muestra en la Fig. 2A, no hubo diferencias significativas en las frecuencias de Tregs CD4+FoxP3+ en ratones de tipo salvaje y cd73-/-, antes o despues de la induccion de EAE. De manera similar, el porcentaje de celulas T CD4+ que expresaban CD73 solo cambio modestamente despues de la induccion de EAE en ratones de tipo salvaje (Figura 2B). Ademas, no se observaron diferencias significativas en la capacidad de supresion de las Treg de tipo salvaje y cd73-/- para inhibir la proliferation de celulas T efectoras CD4+ especificas de antigeno MOG. Para determinar si las celulas T cd73-/- pueden responder cuando se estimulan con el peptido MOG, se evaluo la capacidad de estas celulas para proliferar y producir citocinas. Las celulas T CD4+ de ratones cd73~/- inmunizados con MOG y de tipo salvaje mostraron grados similares de proliferacion in vitro en respuesta a concentraciones variables del peptido MOG. Sin embargo, las celulas T CD4+ de ratones cd73-/- inmunizados con MOG secretaron niveles mas altos de IL-17 e IL-1p despues de la estimulacion in vitro de MOG, en comparacion con las de celulas T salvajes CD73+CD4+ o CD73CD4+ (Figura 2C). Los niveles elevados de IL-17 estan asociados con EM (Matusevicius et al., "Interleukin-17 mRNA Expression in Blood and CSF Mononuclear Cells is Augmented in Multiple Sclerosis," Mult. Scler. 5:101-104 (1999)) y desarrollo de EAE (Komiyama et al., "IL-17 Plays an Important Role in the Development of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis," J. Immunol. 177:566-573 (2006)), mientras que los niveles altos de la citocina proinflamatoria IL-1p son un factor de riesgo de EM (de Jong et al., "Production of IL-1beta and IL-1Ra as Risk Factors for Susceptibility and Progression of Relapse-Onset Multiple Sclerosis," J. Neuroimmunol. 126:172-179 (2002)) y un potenciador de la production de IL-17 (Sutton et al., "A Crucial Role for Interleukin (IL)-1 in the Induction of IL-17- Producing T Cells That Mediate Autoimmune Encephalomyelitis," J. Exp. Med. 203:1685-1691 (2006)). No se observaron diferencias en la secretion de IL-2, IL—4, IL-5, iL-10, IL-13, INF-y y TNF-a entre las celulas T de tipo salvaje y cd73-/- tras la estimulacion con MOG (Figura 2C). En general, los resultados de estos ensayos sugieren que las celulas T cd73-/- pueden responder bien a la inmunizacion con MOG.

A continuacion, se determino si las celulas T de ratones cd73-/- poseen la capacidad de causar EAE. Para probar esto, las celulas T CD4+ del bazo y los ganglios linfaticos de ratones cd73-/- inmunizados con MOG se evaluaron para determinar su capacidad para inducir EAE despues de la transferencia a ratones receptores tcrcr/- (cd73+/+). Los ratones Tcror1- carecen de celulas T endogenas y no pueden desarrollar EAE por si mismos (Elliott et al., "Mice Lacking Alpha Beta + T Cells are Resistant to the Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis," J. Neuroimmunol. 70:139-144 (1996)). Los ratones receptores Cd73+/+tcrorl- que recibieron linfocitos T CD4+ de donantes cd73-/- desarrollaron una enfermedad marcadamente mas grave en comparacion con los que recibieron celulas T CD4+ de tipo salvaje (Figura 2D). Las celulas T CD4+ donantes de tipo salvaje y cd73-/- presentaron iguales grados de expansion tras la transferencia a ratones receptores cd73+/+tcra/-. Por lo tanto, las celulas T CD4+ de ratones cd73-/- no solo son capaces de inducir EAE, sino que causan EAE mas severa que las derivadas de ratones de tipo salvaje cuando se transfieren a ratones cd73+/+tcror/-. Estos resultados son consistentes con los ensayos in vitro en los que las celulas T cd73-/- CD4+ secretaban niveles elevados de IL-17 e IL-1p (que se sabe que exacerban la EAE) en respuesta a la estimulacion con MOG (Figura 2C) y sugieren que los ratones cd73-/- son

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resistentes a la EAE inducida por MOG debido a una falta de expresion de CD73 en celulas no hematopoyeticas (muy probablemente la falta de expresion en el SNC).

Ejemplo 11 - Los ratones Cd73~-~ exhiben poca/ninguna infiltracion de linfocitos en el SNC tras la induccion de EAE

La EAE es, principalmente, una enfermedad mediada por celulas T CD4+ (Montero et al., "Regulation of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis by CD4+, CD25+ and CD8+ T Cells: Analysis Using Depleting Antibodies," J. Autoimmun. 23:1-7 (2004)) y durante la progresion de la EAE, los linfocitos deben primero tener acceso al SNC para montar su respuesta inflamatoria frente a los antigenos del SNC, dando como resultado desmielinizacion axonal y paralisis (Brown et al., "Time Course and Distribution of Inflammatory and Neurodegenerative Events Suggest Structural Bases for the Pathogenesis of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis," J. Comp. Neurol. 502:236-260 (2007)). Para determinar si la infiltracion de linfocitos del SNC se observa despues de la induccion de EAE en ratones cd73-/-, se examinaron secciones de cerebro y de la medula espinal para determinar la presencia de celulas T CD4+ y celulas CD45+ mediante inmunohistoquimica. Los ratones cD73/- mostraron una frecuencia dramaticamente inferior de linfocitos CD4+ (Figuras 3D-G) y linfocitos CD45+ (Fig. 4) el cerebro y la medula espinal en comparacion con los ratones de tipo salvaje (Figuras 3A-C, G) a los 13 de la inmunizacion con MOG. Ademas, en los experimentos de rastreo de linfocitos en los que celulas T especificas de MOG de ratones transgenicos TCR 2d2 (Bettelli et al., "Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein-Specific T Cell Receptor Transgenic Mice Develop Spontaneous Autoimmune Optic Neuritis," J. Exp. Med. 197:1073-1081 (2003)) se transfirieron a ratones de tipo salvaje o cd73-/- con induccion concomitante de eAe, el porcentaje de celulas 2d2 en el SNC aumento varias veces con el tiempo en ratones receptores de tipo salvaje, pero no en todos los receptores cd73-/- (Figura 5). En general, estos resultados sugieren que la proteccion observada frente a la induccion de EAE en ratones cd73-/- se asocia con una infiltracion de linfocitos del SNC considerablemente reducida. Sin embargo, las celulas T CD4+ de ratones cd73-/- inmunizados con MOG tuvieron la capacidad de acceder al SNC cuando se transfirieron a ratones cd73+/+tcror/- que se indujeron de forma concomitante para desarrollar EAE (Figuras 3K y 3L). De hecho, se observo una infiltracion mas temprana y mas extensa de linfocitos CD4+ en el SNC en ratones ccd73+/+tcror/- que recibieron celulas T cd73-/- CD4+ (Figuras 3K,L) que en los que recibieron celulas T CD4+ de tipo salvaje (Figuras 3H-J). Por lo tanto, estos resultados demuestran que las celulas T donantes de ratones cd73-/- tienen la capacidad de infiltrar el SNC de ratones receptores cd73+/+.

Ejemplo 12 - CD73 debe expresarse bien en linfocitos o en el SNC para un desarrollo eficiente de EAE.

A continuacion, se pregunto si la expresion de CD73 en celulas T CD4+ puede compensar la falta de expresion de CD73 en el SNC y permitir el desarrollo de EAE. Por lo tanto, las celulas T CD4+ se transfirieron de forma adoptiva de ratones de tipo salvaje inmunizados con MOG a receptores cd73~'-, indujeron de forma concomitante EAE y compararon la actividad de la enfermedad con la de receptores de tipo salvaje tratados de un modo similar (Figura 6A). Mientras que los receptores de tipo salvaje desarrollaron enfermedad despues de la induccion de EAE, como se esperaba, los receptores cd73-/- tambien desarrollaron EAE prominente con una puntuacion promedio de enfermedad de 1,5 a las tres semanas de la induccion de la enfermedad. Esto fue mucho mas alto que la puntuacion promedio 0,5 que los ratones cd73-/- normalmente mostraron en este mismo punto de tiempo (Figura 1). Para definir adicionalmente la asociacion de la expresion de CD73 en las celulas T CD4+ con susceptibilidad a EAE, celulas T CD73+CD4+ y CD73CD4+ clasificadas de ratones de tipo salvaje inmunizados o celulas T CD4+ (CD73-) de ratones cd73-/- inmunizados, se transfirieron a receptores cd73-/- con induccion de EAE concomitante (Figura 6B). Los ratones cd73-/- que recibieron celulas T CD73+CD4+ de ratones de tipo salvaje desarrollaron EAE con una puntuacion promedio de aproximadamente 1,5 a las tres semanas de la induccion. Por el contrario, los ratones cd73- 1- que recibieron celulas T CD73CD4+ derivadas de tipo salvaje no desarrollaron EAE significativa. Ademas, las celulas CD4+ ratones donantes cd73-/-, que tienen la capacidad de causar EAE grave en ratones tcror/- que expresan CD73 (Figura 2D), eran tambien incapaces de potenciar la EAE en ratones receptores cd73-/- (Figura 6B). Por lo tanto, aunque la expresion de CD73 en celulas T puede compensar parcialmente la falta de expresion de CD73 en celulas no hematopoyeticas, la EAE se induce mas eficazmente cuando se expresa CD73 en ambos compartimentos.

La identidad de las celulas no hematopoyeticas que expresan CD73 que promueven el desarrollo de EAE no se conoce. Las celulas endoteliales vasculares en la BHE se consideraron candidatos probables, ya que muchos tipos de celulas endoteliales expresan CD73 (Yamashita et al., "CD73 Expression and Fyn-Dependent Signaling on Murine Lymphocytes," Eur. J. Immunol. 28:2981-2990 (1998)). Sin embargo, la inmunohistoquimica revelo que las celulas endoteliales del cerebro del raton son CD73-. Durante estos experimentos, se observo que el CD73 esta, sin embargo, altamente expresado en el cerebro en el plexo coroideo (Figura 6C), que es un punto de entrada al SNC para los linfocitos durante la progresion de la EAE ((Brown et al., "Time Course and Distribution of Inflammatory and Neurodegenerative Events Suggest Structural Bases for the Pathogenesis of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis," J. Comp. Neurol. 502:236-260 (2007)). La Figura 4D muestra linfocitos infiltrantes en asociacion con el plexo coroideo de ratones de tipo salvaje 12 dias despues de la induccion de EAE. Tambien se observo una tincion minima de CD73 en las regiones submeningeas de la medula espinal. En conjunto, estos resultados sugieren que la expresion de CD73, ya sea en celulas T o en el SNC (quizas en el plexo coroideo), es necesaria para un desarrollo eficaz de la EAE.

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Ejemplo 13 - Los antagonistas de los receptores de adenosina protegen a los ratones contra la induccion de EAE.

Dado que CD73 cataliza la degradacion del AMP en adenosina y AR se expresan en el SNC (Tsutsui et al., "A1 Adenosine Receptor Upregulation and Activation Attenuates Neuroinflammation and Demyelination in a Model of Multiple Sclerosis," J. Neurosci. 24:1521-1529 (2004)); Rosi et al., The Influence of Brain Inflammation Upon Neuronal Adenosine A2B Receptors," J. Neurochem. 86:220-227 (2003)), a continuacion se determino si la senalizacion de AR es importante durante la progresion de EAE. Los ratones de tipo salvaje y cd73-/- se trataron con el antagonista de AR de amplio espectro cafeina (Dall'Igna et al., "Caffeine as a Neuroprotective Adenosine Receptor Antagonist," Ann. Pharmacother. 38:717-718 (2004)) a 0,6 g/l en su agua de bebida, que corresponde a una dosis aproximada de 4,0 mg/raton de cafeina al dia Johansson et al., "A1 and A2A Adenosine Receptors and A1 mRNA in Mouse Brain: Effect of Long-Term Caffeine Treatment," Brain Res. 762:153-164 (1997)), 1 dia antes y durante la duracion del experimento de EAE (Figura 7A). Los ratones de tipo salvaje que recibieron cafeina estaban protegidos dramaticamente contra el desarrollo de EAE (Figura 7A), comparable a los resultados publicados anteriormente (Tsutsui et al., "A1 Adenosine Receptor Upregulation and Activation Attenuates Neuroinflammation and Demyelination in a Model of Multiple Sclerosis," J. Neurosci. 24:1521-1529 (2004)). Como era de esperar, los ratones cd73-/- que recibieron cafeina no desarrollaron EAE (Figura 7A). Debido a que CD73 se expresa considerablemente en el plexo coroideo (Figura 6C), se determino a continuacion si los AR tambien se expresaban en el plexo coroideo. Usando la linea celular del plexo coroideo murino Z310 (Zheng et al., "Establishment and Characterization of an Immortalized Z310 Choroidal Epithelial Cell Line from Murine Choroid Plexus," Brain Res. 958:371-380 (2002)), solo el ARNm para los subtipos de receptores de adenosina Ai and A2a se detecto mediante PCRc (Figura 7B). Como se ha demostrado anteriormente que los ratones AiAK-- desarrollan EAE grave despues de la induccion de la enfermedad (Tsutsui et al., "A1 Adenosine Receptor Upregulation and Activation Attenuates Neuroinflammation and Demyelination in a Model of Multiple Sclerosis," J. Neurosci. 24:1521-1529 (2004)), se pregunto si el tratamiento de ratones de tipo salvaje con SCH58261 (Melani et al., "The Selective A2A Receptor Antagonist SCH 58261 Protects From Neurological Deficit, Brain Damage and Activation of p38 MAPK in Rat Focal Cerebral Ischemia," Brain Res. 1073-1074:470-480 (2006)), un antagonista de AR especifico del subtipo A2a podria proteger contra el desarrollo de EAE. Se administro a los ratones de tipo salvaje 1 mg/kg de SCH58261 en DMSO o DMSO solo tanto i.p. como s.c. (para un total de 2 mg/kg) 1 dia antes de la induccion de EAE y diariamente durante 30 dias a lo largo del curso del experimento (Figura 7C). Los ratones de tipo salvaje que recibieron SCH58261 fueron protegidos dramaticamente contra el desarrollo de EAE en comparacion con los ratones de tipo salvaje que recibieron DMSO solo (Figura 7C). Ademas, los ratones de tipo salvaje que recibieron SCH58261 mostraron una frecuencia significativamente menor de los linfocitos CD4+ en el cerebro y la medula espinal en comparacion con los ratones de tipo salvaje tratados con DMSO al dia 15 despues de la induccion de EAE (Figura 7D). Como los estudios han demostrado que las moleculas de adhesion (tales como ICAM-1, VCAM-1 y MadCAM-1) en el plexo coroideo desempenan un papel en la patogenia de la EAE (Engelhardt et al., "Involvement of the Choroid Plexus in Central Nervous System Inflammation," Microsc. Res. Tech. 52:112-129 (2001)), se determino si el tratamiento con SCH58261 afectaba a la expresion de la molecula de adhesion en el plexo coroideo despues de la induccion de EAE. La comparacion del plexo coroideo de los ratones de tipo salvaje tratados con DMSO and SCH58261 muestra que el bloqueo de los AR A2a impedian la regulacion por aumento de ICAM-1 que normalmente se produce durante la progresion de EAE (Figura 8).

Basado en estos resultados, se concluyo que la incapacidad de los ratones cd73-/- para catalizar la generacion de adenosina extracelular explica su fracaso para desarrollar eficientemente EAE despues de la inmunizacion con MOG y que la expresion de CD73 y la senalizacion de los AR A2aen el plexo coroideo son requisitos para la progresion de EAE.

El objetivo de este estudio fue evaluar el papel de CD73 en la EAE, un modelo animal de EM. Dado que CD73 cataliza la formacion de adenosina extracelular que habitualmente es inmunosupresora (Bours et al., "Adenosine 5'- Triphosphate and Adenosine as Endogenous Signaling Molecules in Immunity and Inflammation," Pharmacol. Ther. 112:358-404 (2006)) y los ratones AiAR-/- exhiben EAE grave (Tsutsui et al., "A1 Adenosine Receptor Upregulation and Activation Attenuates Neuroinflammation and Demyelination in a Model of Multiple Sclerosis," J. Neurosci. 24:1521-1529 (2004)), los solicitantes predijeron que los ratones cd73-/- tambien desarrollarian EAE grave. Sin embargo, los ratones cd73-/- fueron muy resistentes a la induccion de EAE, un hallazgo sorprendente considerando la pletora de estudios que demuestran que los ratones cd73-/- son mas propensos a la inflamacion. Por ejemplo, los ratones cd73-/- son mas susceptibles a la lesion pulmonar inducida por bleomicina (Volmer et al., "Ecto-5'- Nucleotidase (CD73)-Mediated Adenosine Production is Tissue Protective in a Model of Bleomycin-Induced Lung Injury," J. Immunol. 176:4449-4458 (2006)) y son mas propensos a la inflamacion vascular ya la formacion de la neointima (Zernecke et al., "CD73/ecto-5'-Nucleotidase Protects Against Vascular Inflammation and Neointima Formation," Circulation 113:2120-2127 (2006)). En consonancia con estos informes, los solicitantes mostraron que las celulas T cd73-/- produjeron mayores niveles de citocinas proinflamatorias IL-1p e IL-17 asociadas con la EAE despues de la estimulacion con MOG. Ademas, la transferencia adoptiva de las celulas T cd73-/- a ratones tcrcr/-, que carecen de celulas T pero expresan CD73 en toda su periferia, da como resultado una inflamacion grave del SNC despues de la inmunizacion con MOG, consistente con un papel de la adenosina como mediador antiinflamatorio. Es interesante observar que se ha demostrado que el tratamiento con IFN-p, una de las terapias mas eficaces para la EM, regula por aumento la expresion de CD73 en celulas endoteliales tanto in vitro como in

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vivo Airas et al., "Mechanism of Action of IFN-Beta in the Treatment of Multiple Sclerosis: A Special Reference to CD73 and Adenosine," Ann. N. Y. Acad. Sci. 1110:641-648 (2007)). Por lo tanto, aunque el mecanismo mediante el cual el IFN-p beneficia a los pacientes con EM no se entiende completamente, el aumento de la produccion de adenosina acompanado de sus conocidos efectos antiinflamatorios y neuroprotectores podria ser un factor.

Conforme a su resistencia a la induccion de EAE, los ratones cd73-/- tenian una menor frecuencia de celulas que infiltran el SNC durante la EAE en comparacion con ratones de tipo salvaje. Esto tambien fue un hallazgo inesperado, ya que previamente se ha demostrado que la adenosina generada por CD73 restringe la migracion de neutrofilos a traves del endotelio vascular durante la hipoxia y de los linfocitos a traves de venulas endoteliales altas de los ganglios linfaticos drenantes (Thompson et al., "Crucial Role for Ecto-5'-Nucleotidase (CD73) in Vascular Leakage During Hypoxia," J. Exp. Med. 200:1395-1405 (2004)). Los datos de los solicitantes, en contraste, sugieren que CD73 y la adenosina extracelular generada por CD73, son necesarios para el paso eficiente de celulas T patogenas en el SNC. Por lo tanto, el papel que CD73 y la adenosina desempenan en la infiltracion de linfocitos del SNC durante la EAE es mas profundo que su papel en la modulacion de la neuroinflamacion.

Es importante saber donde debe expresarse CD73 para la migracion de celulas T en el SNC. CD73 se encuentra en subpoblaciones de celulas T (Yamashita et al., "CD73 Expression and Fyn-Dependent Signaling on Murine Lymphocytes," Eur. J. Immunol. 28:2981-2990 (1998)), asi como en algunas celulas epiteliales Strohmeier et al., "Surface Expression, Polarization, and Functional Significance of CD73 in Human Intestinal Epithelia," J. Clin. Invest. 99:2588-2601 (1997) y endoteliales (Yamashita et al., "CD73 Expression and Fyn-Dependent Signaling on Murine Lymphocytes," Eur. J. Immunol. 28:2981-2990 (1998)). Los datos presentados aqui demuestran claramente que aunque las celulas T cd73-/- responden bien a la inmunizacion por MOG, no pueden entrar en el SNC a menos que CD73 se exprese en tejidos no hematopoyeticos (es decir, ratones cd73+/+tcrorl- que desarrollan EAE despues de la transferencia adoptiva de celulas T cD4+ de ratones cd73-/). Una falta de CD73 en celulas no hematopoyeticas tambien puede compensarse, en parte, por la expresion de CD73 en celulas T (es decir, los ratones cd73-/- se vuelven susceptibles a la EAE cuando se transfieren adoptivamente celulas T CD73+, pero no CD73-, CD4+). Mientras que se consideraron las celulas endoteliales de la BHE como una fuente relevante de CD73 en el SNC, porque CD73 se expresa en las celulas endoteliales del cerebro humano (Airas et al., "Mechanism of Action of IFN- Beta in the Treatment of Multiple Sclerosis: A Special Reference to CD73 and Adenosine," Ann. N. Y. Acad. Sci. 1110:641-648 (2007)), la inmunohistoquimica revelo que las celulas endoteliales de cerebro de raton son CD73-. Sin embargo, se encontro que CD73 se expresaba altamente en las celulas epiteliales del plexo coroideo, que forman la barrera entre la sangre y el liquido cefalorraquideo (LCR) y tienen un papel en la regulacion de la inmunovigilancia de los linfocitos en el SNC (Steffen et al., "CAM-1, VCAM-1, and MAdCAM-1 are Expressed on Choroid Plexus Epithelium but Not Endothelium and Mediate Binding of Lymphocytes In Vitro," Am. J. Pathol. 148:1819-1838 (1996)). Tambien se ha sugerido que el plexo coroideo es el punto de entrada de las celulas T durante el inicio de la progresion de la EAE (Brown et al., "Time Course and Distribution of Inflammatory and Neurodegenerative Events Suggest Structural Bases for the Pathogenesis of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis," J. Comp. Neurol. 502:236-260 (2007)). Mientras que el papel de las interacciones de celulas endoteliales cerebrales-linfocitos a traves de la union VLA-4/VCAM-1 tanto en EAE como en EM esta bien documentado (Rice et al., "Anti-Alpha4 Integrin Therapy for Multiple Sclerosis: Mechanisms and Rationale," Neurology 64:1336-1342 (2005)), tal vez el trafico de linfocitos a traves de la BHE endotelial es mas importante para el mantenimiento y la progresion de la enfermedad que para la iniciacion de la enfermedad, al menos en la EAE.

La siguiente cuestion es como CD73 facilita la migracion de celulas T al SNC. Trabajos anteriores mostraron que el CD73 de los linfocitos puede estimular la union de linfocitos humanos a celulas endoteliales de una forma dependiente de LFA-1 (Airas et al., "CD73 Engagement Promotes Lymphocyte Binding to Endothelial Cells Via a Lymphocyte Function-Associated Antigen-1-dependent Mechanism," J. Immunol. 165:5411-5417 (2000)). Sin embargo, esto no parece ser funcion de CD73 en la EAE, debido a que las celulas T deficientes en CD73 pueden entrar en el SNC y causar enfermedad grave en ratones cd73+/+tcrcr/- (Figura 2D). Como alternativa, CD73 puede funcionar como una enzima para producir adenosina extracelular, un ligando para los AR de superficie celular. Es esta ultima funcion que es relevante para el trabajo actual dado que el bloqueo AR con cafeina o SCH58261 puede proteger a los ratones de la EAE. Mientras que el antagonista de AR de amplio espectro cafeina tambien inhibe ciertas fosfodiesterasas (Choi et al., "Caffeine and Theophylline Analogues: Correlation of Behavioral Effects With Activity as Adenosine Receptor Antagonists and as Phosphodiesterase Inhibitors," Life Sci. 43:387-398 (1988)), su modulacion de la progresion de la EAE es mas probable a traves de su efecto sobre la senalizacion de AR (Tsutsui et al., "A1 Adenosine Receptor Upregulation and Activation Attenuates Neuroinflammation and Demyelination in a Model of Multiple Sclerosis," J. Neurosci. 24:1521-1529 (2004)). Esta idea esta respaldada por el hecho de que SCH58261 tambien previene la progresion de EAE inhibiendo especificamente la senalizacion de AR A2a. Dado que CD73 y los subtipos de AR, Ai y A2a, se expresan en el plexo coroideo, la adenosina extracelular producida por CD73 en el plexo coroideo puede senalar de forma autocrina.

Puesto que los AR A1 y A2a son funcionalmente antagonistas entre si y tienen diferentes afinidades para la adenosina (Quarta et al., "Opposite Modulatory Roles for Adenosine A1 and A2A Receptors on Glutamate and Dopamine Release in the Shell of the Nucleus Accumbens. Effects of Chronic Caffeine Exposure," J. Neurochem. 88:1151-1158 (2004)), la concentration extracelular de adenosina determina como respondera una celula que expresa los receptores Ai y A2a; creando de este modo un interruptor mecanico por el cual las concentraciones bajas

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de adenosina activan el subtipo Ai y concentraciones mas altas estimulan el subtipo A2a (Ciruela et al., "Presynaptic Control of Striatal Glutamatergic Neurotransmission by Adenosine A1-A2A Receptor Heteromers," J. Neurosci. 26:2080-2087 (2006)). En el SNC, hay evidencias que sugieren que esta interaccion A1/A2a es importante para mediar la neuroinflamacion, donde la senalizacion de Ai es protectora mientras que la senalizacion de A2a promueve la inflamacion. Por ejemplo, los ratones que carecen del receptor de adenosina Ai desarrollan EAE grave despues de la induccion de la enfermedad (Tsutsui et al., "A1 Adenosine Receptor Upregulation and Activation Attenuates Neuroinflammation and Demyelination in a Model of Multiple Sclerosis," J. Neurosci. 24:1521-1529 (2004)), mientras que los ratones que reciben un antagonista de A2a estan completamente protegidos contra la EAE (Figura 5C). Ademas, los ratones que carecen del receptor A2a estan protegidos de lesiones cerebrales inducidas por isquemia focal transitoria (Chen et al., "A(2A) Adenosine Receptor Deficiency Attenuates Brain Injury Induced by Transient Focal Ischemia in Mice," J. Neurosci. 19:9192-9200 (1999)). Por lo tanto, la senalizacion de adenosina generada por CD73 en el plexo coroideo parece desempenar un papel muy importante en la modulacion de la inflamacion en el SNC.

Esta senalizacion de adenosina regula muy probablemente la expresion de las moleculas de adhesion en el plexo coroideo. Los estudios han demostrado que la regulacion por aumento de las moleculas de adhesion ICAM-1, VCAM-1 y MadCAM-1 en el plexo coroideo esta asociada con la progresion de la EAE (Engelhardt et al., Involvement of the Choroid Plexus in Central Nervous System Inflammation," Microsc. Res. Tech. 52:112-129 (2001)). Como los ratones tratados con el antagonista de AR A2a SCH58261 no experimentan una expresion aumentada de ICAM-1 en el plexo coroideo (Figura 8), como normalmente se produce despues de la induccion de EAE (Engelhardt et al., "Involvement of the Choroid Plexus in Central Nervous System Inflammation," Microsc. Res. Tech. 52:112-129 (2001)), los presentes resultados sugieren que la senalizacion del AR A2a AR aumenta la ICAM-1 durante la progresion de EAE.

En resumen, estos datos demuestran que CD73 desempena un papel critico en la progresion de la EAE. Los ratones que carecen de CD73 estan protegidos de los sintomas degenerativos y la inflamacion del SNC que se asocian con la induccion de EAE. Este es el primer estudio que demuestra un requisito de la expresion CD73 y la senalizacion de AR para la entrada eficiente de linfocitos en el SNC durante la EAE. Los datos presentados aqui pueden marcar las primeras etapas de un viaje que conducira a nuevas terapias para la EM y otras enfermedades neuroinflamatorias.

Ejemplo 14 - La BHE puede modularse a traves de la activacion de los receptores de adenosina

El objetivo de este experimento fue determinar si la barrera hematoencefalica podia modularse mediante la activacion de los receptores de adenosina. NECA es un agonista del receptor de adenosina no selectivo, con afinidades similares por los receptores de adenosina A1, A2a y A3, y una afinidad baja por el receptor de adenosina A2b. Con el fin de determinar si la activacion de los receptores de adenosina inducirian extravasacion del colorante Evans Blue a traves de la barrera hematoencefalica (BHE), los ratones se trataron con: NECA, un agonista no selectivo del receptor de adenosina (n = 5, 100 |jl, 0,01 nM); SCH58261, un antagonista especifico del receptor A2a de adenosina (n = 5,1 mg/kg); toxina pertussis, un agente que se sabe que induce la filtracion de la BHE y como tal se usa como control positivo (n = 7, 200 jl); y PBS como control del vehiculo (n = 5, 100 jl). Los ratones CD73/- que carecen de la capacidad para producir adenosina extracelular, tambien fueron tratados con NECA (n = 4, 100 jl 0,01 nM). Los tratamientos se administraron como una sola Inyeccion i.v. una hora antes de la Inyeccion i.v. de 200 jl de colorante Evans Blue al 1 % (2 jg de colorante total inyectado). Cuatro horas despues de la administracion de Evans Blue, se anestesio a los ratones con una mezcla de ketamina/xilazina y se perfundieron a traves del ventriculo izquierdo con PBS enfriado con hielo. Los cerebros se cosecharon y se homogeneizaron en N, N-dimetilformamida (DMF) a 5 |Jl/mg (v: p). El tejido se incubo durante 72 horas a temperatura ambiente en DMF para extraer el colorante. Despues de la extraccion, la mezcla de tejido/disolvente se centrifugo a 500 xg durante 30 minutos y se leyeron 100 jl de sobrenadante en un espectrofotometro BioTex a 620 nm. Los datos se expresan como jg de Evans Blue/ml de DMF.

El tratamiento de los ratones con el agonista general de receptores de adenosina NECA puede inducir la migracion del colorante a traves de la barrera hematoencefalica. Esto sugiere que esta barrera puede modularse a traves de la activacion de los receptores de adenosina. En la Figura 9A, los ratones CD73/-, que carecen de adenosina extracelular y, por banyo, pueden senalar adecuadamente a traves de los receptores de adenosina, se trataron con NECA, dando lugar a un aumento de casi cinco veces de la migracion del colorante frente al PBS control. Se uso SCH58261 como control negativo, ya que los solicitantes han demostrado que el bloqueo del receptor de adenosina A2a usando este antagonista puede impedir la entrada de linfocitos en el cerebro (Mills et al., "CD73 is Required for Efficient Entry of Lymphocytes into the Central Nervous System During Experimental Autoimmune Encephalomyelitis," Proc. Natl. Acad. Sci. 105(27):9325-9330 (2008)). En la figura 9B, los ratones SV tratados con NECA tambien muestran un aumento con respecto a los ratones control. Se usa Pertussis como control positivo, ya que se sabe que induce permeabilidad de la barrera hematoencefalica en el modelo de EAE de raton.

Ejemplo 15 - Los receptores de adenosina A2a y A2b se expresan en la lmea celular endotelial humana hCMEC/D3

Con el fin de establecer una barrera hematoencefalica in vitro (BHE), se obtuvo la linea celular endotelial de cerebro

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humano hCMEC (Weksler et al., "Blood-brain Barrier-specific Properties of a Human Adult Brain Endothelial Cell Line," J. Neurochem. 19(13):1872-4 (2005); Poller et al., "The Human Brain Endothelial Cell Line hCMEC/D3 as a Human Blood-brain Barrier Model for Drug Transport Studies," J. Neurochem. 107(5):1358-1368 (2008)), que previamente se ha descrito que tienen propiedades de BHE. Aqui, se establecio el patron de expresion de los receptores de adenosina en estas celulas

Las celulas hCMEC/D3 se hicieron crecer hasta confluencia, se cosecharon y se extrajo el ARN utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc se sintetizo usando un kit de ADNc Verso (Thermo Scientific, Waltham, MA), y se realizo PCR en tiempo real usando Power SYBR Green (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Como se muestra en la Figura 10, se descubrio que los receptores de adenosina A2a y A2b se expresaban en la linea de celulas endoteliales humanas hCMEC/D3.

Ejemplo 16 - La estimulacion del receptor de adenosina de celulas endoteliales cerebrales promueve la migracion de linfocitos a traves de la BHE

La barrera hematoencefalica (BHE) esta compuesta por celulas endoteliales. Durante las etapas tardias de la EAE, se sabe que los linfocitos atraviesan la BHE. Con el fin de determinar si la estimulacion del receptor de adenosina de las celulas endoteliales cerebrales podria promover la migracion de linfocitos a traves de la BHE, se establecio una BHE in vitro. La linea celular endotelial de cerebro humano hCMEC/D3 (Weksler et al., "Blood-brain Barrier-specific Properties of a Human Adult Brain Endothelial Cell Line," J. Neurochem. 19(13):1872-4 (2005); Poller et al., "The Human Brain Endothelial Cell Line hCMEC/D3 as a Human Blood-brain Barrier Model for Drug Transport Studies," J. Neurochem. 107(5):1358-1368 (2008)), se obtuvo, que previamente se ha descrito que tienen propiedades de BHE.

Las celulas hCMEC/D3 se sembraron en Transwell y se dejaron crecer hasta confluencia. Se anadieron 2 x 106 celulas Jurkat a la camara superior con o sin NECA (agonista general del receptor de adenosina [AR]), CCPA (agonista de A1AR), CGS 21680 (agonista de A2AAR) o vehiculo DMSO. Despues de 24 horas, se contaron las celulas migradas en la camara inferior. Los valores son relativos al numero de celulas que migran a traves de transwells no sembrados con HCMECD3.

Como se muestra en la Figura 11, NECA, un agonista del receptor de adenosina de amplio espectro, indujo una cierta migracion. CGS, el agonista del receptor A2a de adenosina promovio la migracion de linfocitos a traves de la BHE in vitro cuando se uso a una concentracion menor. La CCPA, el agonista de A1, indujo la migracion de linfocitos a niveles altos posiblemente debido a la activacion del receptor de adenosina A2a, que tiene una afinidad mas baja para CCPA y, por lo tanto, solo se activa a niveles mas altos de CCPA.

Ejemplo 17 - La activacion del receptor de adenosina A2a promueve la migracion de linfocitos a traves de CP

El plexo coroideo ("CP") controla la migracion de linfocitos hacia el SNC. El CP expresa los receptores de adenosina A1 y A2a. La EAE se evita en ratones cuando la actividad del receptor de adenosina A2a se bloquea. La EAE se potencia cuando falta el receptor de adenosina A1. Se planteo la hipotesis de que la activacion del receptor de adenosina A2a promueve la migracion de linfocitos a traves del CP. Las celulas Z310 son una linea celular de plexo coroideo murino.

Para probar la hipotesis, las membranas de Transwell se sembraron con celulas Z310 y se dejaron crecer hasta confluencia. Se anadieron 2 x 106 celulas Jurkat a la camara superior con o sin NECA (n = 1, agonista general de AR), CCPA (agonista de A1AR), CGS 21680 (n = 1, agonista de A2AAR) o vehiculo DMSO (n = 1). Despues de 24 horas, se contaron las celulas migradas en la camara inferior. Los valores son relativos al numero de celulas que migran a traves de transwells sin sembrar con Z310 y los resultados se muestran en la Figura 12.

Como se muestra en la Figura 12, NECA, un agonista del receptor de adenosina de amplio espectro, indujo migracion. CGS, el agonista del receptor A2a de adenosina, indujo la migracion de linfocitos a traves del CP. CCPA, el agonista de A1 indujo la migracion de los linfocitos a niveles altos posiblemente debido a la activacion del receptor A2a de adenosina, que tiene una afinidad mas baja para CCPA y, como tal, solo se activa a altos niveles de CCPA.

Ejemplo 18 - Las celulas endoteliales de cerebro humano son sensibles a la regulacion del AMPc inducida por receptores de adenosina

La activacion del receptor de adenosina regula los niveles de AMPc en las celulas. Con el fin de determinar la sensibilidad de las celulas endoteliales del cerebro humano a la regulacion de AMPc inducida por el receptor de adenosina, se cultivaron celulas endoteliales de cerebro humano con agonistas del receptor de adenosina a diversas concentraciones, seguido del analisis de los niveles de AMPc, como se muestra en la Figura 13.

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Las celulas HCMECD3 se cultivaron hasta confluencia en placas de 24 pocillos. Puesto que se sabe que la estimulacion del receptor de adenosina (AR) influye sobre niveles de AMPc, las celulas se trataron con o sin diversas concentraciones de NECA (agonista general de AR), CCPA (agonista A1AR), CGS 21680 (agonista A2AAR), vehiculo DMSO o forscolina (induce AMPc). Despues de 15 minutos, se anadio tampon de lisis y las celulas se congelaron a -80 °C para detener la reaccion. Se utilizaron muestras duplicadas para cada afeccion. Los niveles de AMPc se ensayaron usando un kit de deteccion de AMPc (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Como se muestra en la Figura 13, el agonista del receptor de adenosina de amplio espectro NECA aumento los niveles de AMPc, de modo que se verifico que estas celulas pueden responder a la senalizacion del receptor de adenosina. Los niveles altos de CCPA, el agonista A1 del receptor de adenosina, aumentaron los niveles de AMPc, quiza debido a la activacion del receptor A2a de adenosina, que tiene una afinidad mas baja por CCPA y, como tal, solo se activa a niveles altos de CCPA. CGS, el agonista A2a del receptor de adenosina, aumento ligeramente los niveles de AMPc en la linea de celulas endoteliales de cerebro humano.

Ejemplo 19 - Los ratones hembra con inserciones inactivadoras del receptor A1 de adenosina desarrollan EAE mas severos que los de tipo salvaje

Los receptores de adenosina A1 and A2a se expresan en el plexo coroideo. Los antagonistas de los receptores A2a de adenosina protegen a los ratones de la EAE. ^Son los ratones que carecen del receptor A1 de adenosina son propensos al desarrollo de EAE mas grave que los controles de tipo salvaje? Para responder a esta pregunta, se compararon los perfiles de la enfermedad de ratones de tipo salvaje y ratones defectivos para el receptor A1 de adenosina.

Se inmunizo a ratones hembra defectivos en el receptor A1 de adenosina (A1ARKO, n = 5) y de tipo salvaje (SV, n = 5) con CFA/MOG35-55 + PTX el 12/02/08 y se puntuaron diariamente durante 41 dias. Como muestran los resultados en la Figura 14, los ratones A1ARKO desarrollan EAE mas grave que los SV y tambien desarrollan la enfermedad con mayor velocidad que los SV.

Ejemplo 20 - Cerebros procedentes de ratones de tipo salvaje alimentados con un antagonista de los receptores de adenosina tienen niveles mas altos de FITC-Dextrano que los cerebros de ratones CD73/- alimentados con un antagonista de los receptores de adenosina

Para examinar los efectos de la cafeina, un antagonista general de los receptores de adenosina, sobre la permeabilidad de la barrera hematoencefalica, se alimento a los ratones con cafeina durante varios dias y despues se les inyecto dextrano-FITC, usado habitualmente para evaluar la permeabilidad endotelial.

Mas particularmente, se alimento a los ratones con 0,6 g/l de cafeina (Sigma, St. Louis, MO) en agua o agua normal a demanda durante cinco dias. Se inyecto a los ratones i.p. dextrano-FITC (PM 10.000, Molecular Probes, Eugene, OR) y, despues de 30 minutos se prefundio a los ratones PBS enfriado con hielo a traves del ventriculo izquierdo. Se extirparon los cerebros y seultracongelaron en OCT (Tissue Tek, Torrance, CA) y se almacenaron a -80 °C hasta seccionar. Las secciones de tejido (5 |jM) se tineron con hematoxilina para microscopia optica y con DAPI para una contratincion fluorescente. Los resultados se muestran en la figura 15.

Como se muestra en la Figura 15A, la visualizacion de secciones cerebrales de ratones CD73-/- alimentados con cafeina mostro un color verde mucho menos intenso que los ratones de tipo salvaje, lo que indica menos extravasacion de dextrano-FITC a traves de la barrera hematoencefalica. Las secciones cerebrales de ratones de tipo salvaje mostraron un fondo intensamente verde (Figura 15B), que es indicativo de mas extravasacion de dextrano-FlTC a traves de la barrera hematoencefalica. La Figura 16 muestra los resultados para ratones de tipo salvaje de forma grafica.

Ejemplo 21 El agonista de los receptores de adenosina NECA aumenta la extravasacion del colorante Evans Blue a traves de la barrera hematoencefalica

El objetivo de este experimento fue determinar si la barrera hematoencefalica podia modularse mediante la activacion de los receptores de adenosina. NECA es un agonista del receptor de adenosina no selectivo, con afinidades similares por los receptores de adenosina A1, A2a y A3, y una afinidad baja por el receptor de adenosina A2b.

Para determinar si la activacion de los receptores de adenosina induciria extravasacion del colorante Evans Blue a traves de la barrera hematoencefalica (BHE), se trato a los ratones primero el primer uno con NECA, un agonista no selectivo del receptor de adenosina (n = 2, 100 |jl, 0,01 nM); y PBS como control del vehiculo (n = 2, 100 |jl). El dia 2, los ratones se inmunizaron con CFA-MOG35-55 y pertussis para inducir EAE. A continuacion, se administro NECA o PBS cada dos dias en los dias 3, 5, 7 y 9. El dia 10, se inyecto a los ratones por via intravenosa 200 jl de colorante Evans Blue al 1 % (2 jg de colorante en total inyectado). Seis horas despues de la administracion de Evans Blue, se anestesio a los ratones con una mezcla de ketamina/xilazina y se perfundieron a traves del ventriculo izquierdo con PBS enfriado con hielo. Los cerebros se cosecharon y se homogeneizaron en N, N-dimetilformamida

(DMF) a 5 |jl/mg (v: p). El tejido se incubo durante 72 horas a temperatura ambiente en DMF para extraer el colorante. Despues de la extraccion, la mezcla de tejido/disolvente se centrifugo a 500 xg durante 30 minutos y se leyeron 100 jl de sobrenadante en un espectrofotometro BioTex a 620 nm. Los datos se expresan como pg de Evans Blue/ml de DMF y se muestran en la Figura 17.

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Este experimento demuestra que el tratamiento de ratones con el agonista general de los receptores de adenosina NECA induce la migracion de colorante Evans Blue al SNC en ratones inmunizados para EAE. Esto sugiere que la barrera hematoencefalica en el modelo de EAE puede modularse a traves de la activacion de los receptores de adenosina. Los ratones SV con EAE tratados con NECA muestran un aumento de la permeabilidad de la BHE sobre 10 los ratones de EAE control con PBS.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un agonista del receptor A2A de adenosina y/o a un antagonista del receptor A1 de adenosina para su uso en el

aumento de la permeabilidad de la barrera hematoencefalica en un sujeto, en donde el sujeto es aquel que se

5 beneficiaria de un incremento de la permeabilidad de la barrera hematoencefalica y en donde el sujeto no esta

sometido a un tratamiento que aumente el nivel de adenosina.
2. El agente de la reivindicacion 1, en donde el agente es un agonista del receptor A2A de adenosina.

10 3. El agente de la reivindicacion 1, en donde el agente es un antagonista del receptor A1 de adenosina.
4. Un antagonista del receptor A2A de adenosina para su uso en la disminucion de la permeabilidad de la barrera hematoencefalica en un sujeto, en donde el sujeto es aquel que se beneficiaria de una permeabilidad disminuida de la barrera hematoencefalica.

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5. El agente de la reivindicacion 4, en donde el sujeto tiene una enfermedad inflamatoria o en donde el sujeto tiene una afeccion mediada por la entrada de linfocitos en el cerebro.
6. El agente de la reivindicacion 4, en donde el sujeto tiene la afeccion de esclerosis multiple.

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7. Uso de un agonista del receptor A2A de adenosina y/o de un antagonista del receptor A1 de adenosina en la fabrication de un medicamento para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefalica en un sujeto, en donde el sujeto es aquel que se beneficiaria de un incremento de la permeabilidad de la barrera hematoencefalica y en donde el sujeto no esta sometido a un tratamiento que aumente el nivel de adenosina.

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8. Uso de un antagonista del receptor A2A de adenosina en la fabricacion de un medicamento para disminuir la permeabilidad de la barrera hematoencefalica en un sujeto, en donde el sujeto es aquel que se beneficiaria de una permeabilidad disminuida de la barrera hematoencefalica.