ES2967696T3

ES2967696T3 - Factor de crecimiento epidérmico (EGF) y variantes del mismo para tratar o prevenir trastornos desmielinizantes inflamatorios

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Publication number: ES2967696T3
Application number: ES19167967T
Authority: ES
Inventors: Giuseppe Scalabrino; Ferdinando Nicoletti; Alois Bernhard Lang; Francois Curtin
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-04-08
Filing date: 2019-04-08
Publication date: 2024-05-03
Anticipated expiration: 2039-04-08
Also published as: EP3721896B1; EP3721896A1; EP3721896C0

Abstract

La presente invención se refiere a un (poli)péptido que tiene actividad del factor de crecimiento epidérmico (EGF) o un ácido nucleico que codifica dicho (poli)péptido para su uso en el tratamiento o prevención de un trastorno desmielinizante y/o neurodegenerativo, en el que el (poli)péptido (a) comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y/o (b) comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos, que es al menos 66 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y/o (c) comprende o consiste en un fragmento de (a) o (b); y en el que el (poli)péptido o ácido nucleico es el único agente farmacéuticamente activo que se va a administrar. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Factor de crecimiento epidérmico (EGF) y variantes del mismo para tratar o prevenir trastornos desmielinizantes inflamatorios

La presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas. En el presente documento se describe de manera general un (poli)péptido que tiene actividad de factor de crecimiento epidérmico (EGF) o un ácido nucleico que codifica para dicho (poli)péptido para su uso en el tratamiento o la prevención de un trastorno desmielinizante y/o neurodegenerativo, en el que el (poli)péptido (a) comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y/o (b) comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en al menos el 66% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y/o (c) comprende o consiste en un fragmento de (a) o (b); y en el que el (poli)péptido o ácido nucleico es el único agente farmacéuticamente activo que va a administrarse.

En esta memoria descriptiva, se citan varios documentos incluyendo solicitudes de patente y manuales de fabricante. La divulgación de estos documentos, aunque no se considera relevante para la patentabilidad de esta invención, se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad. Más específicamente, todos los documentos mencionados se incorporan como referencia en la misma medida que si se indicara de manera específica e individual que cada documento individual se incorpora como referencia.

Los trastornos desmielinizantes abarcan una amplia gama de patologías en las que la mielina, la sustancia lipídica que forma una vaina aislante alrededor de fibras nerviosas (axones), resulta dañada, se pierde o muestra un crecimiento o desarrollo alterado. Dado que la mielinización resulta crítica para la conducción rápida de impulsos nerviosos a través del sistema nervioso, la desmielinización provoca un colapso en la conducción y da como resultado diversas alteraciones funcionales. En ausencia de una vaina de mielina funcional, los impulsos nerviosos no pueden transmitirse de manera apropiada, o bien se desplazan demasiado lentamente o bien no se desplazan en absoluto. Los axones que se han desmielinizado (por ejemplo, tras la desmielinización crónica) tienden a atrofiarse y con el tiempo pueden degenerarse, conduciendo a la muerte de células nerviosas (Love S. J Clin Pathol. (2006); 59(11): 1151-9). También hay trastornos neurodegenerativos, que habitualmente se consideran distintos de los trastornos desmielinizantes clásicos, en los que en primer lugar se produce degradación axonal y la degradación de mielina es secundaria.

Los sujetos que padecen trastornos desmielinizantes y/o neurodegenerativos pueden experimentar debilidad muscular, pérdida de sensación, visión alterada, funciones intelectuales alteradas, ataxia y parálisis, entre otros síntomas. Los signos y síntomas pueden oscilar desde relativamente leves hasta profundos, produciendo graves reducciones de la calidad de vida y posiblemente la muerte. Las normas actuales para tratar determinados trastornos desmielinizantes y/o neurodegenerativos, tales como esclerosis múltiple (MS), se basan principalmente o bien en la supresión inmunitaria o bien en la modulación inmunitaria, afectando principalmente a la tasa de progresión de la enfermedad, y normalmente no tienen efectos directos sobre la reparación de nervios (por ejemplo, remielinización).

Por tanto, existe una necesidad de nuevos enfoques terapéuticos para el tratamiento de trastornos desmielinizantes y/o neurodegenerativos, en particular para prevenir la desmielinización o fomentar la remielinización. La presente invención aborda esta necesidad y también proporciona ventajas relacionadas.

La presente invención se define por las reivindicaciones. La presente invención se refiere en un primer aspecto a un (poli)péptido que tiene actividad de factor de crecimiento epidérmico (EGF) o a un ácido nucleico que codifica para dicho (poli)péptido para su uso en el tratamiento o la prevención de un trastorno desmielinizante inflamatorio, en el que el (poli)péptido (a) comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y/o (b) comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en al menos el 66% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y/o (c) comprende o consiste en un fragmento de (a) o (b); y en el que el (poli)péptido o ácido nucleico es el único agente farmacéuticamente activo que va a administrarse.

El término “(poli)péptido” según la presente invención describe un grupo de moléculas que comprende el grupo de péptidos, que consisten en hasta 30 aminoácidos, así como el grupo de polipéptidos, también denominados proteínas, que consisten en más de 30 aminoácidos. El término “fragmento del (poli)péptido” según la presente invención se refiere a una porción del (poli)péptido que comprende al menos los residuos de aminoácido necesarios para mantener la actividad biológica del (poli)péptido. Los (poli)péptidos pueden formar además dímeros, trímeros y oligómeros superiores, es decir, que consisten en más de una molécula de (poli)péptido. Las moléculas de (poli)péptido que forman tales dímeros, trímeros, etc., pueden ser idénticas o no idénticas. Por consiguiente, las estructuras de orden superior correspondientes se denominan homo o heterodímeros, homo o heterotrímeros, etc. Los homo o heterodímeros, etc., también se encuentran dentro de la definición del término “(poli)péptido”. Los términos “(poli)péptido” y “proteína”, usados de manera intercambiable en el presente documento, también se refieren a (poli)péptidos químicamente modificados.

Las modificaciones químicas abarcadas en el presente documento incluyen cualquier modificación covalente (es decir, incluyendo modificaciones naturales, por ejemplo, modificaciones postraduccionales) que pueden alterar, preferiblemente mejorar, las propiedades farmacológicas y/o farmacodinámicas del (poli)péptido, es decir, la modificación puede realizarse, por ejemplo, mediante glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Los (poli)péptidos que están albuminados (unión covalente de albúmina) o pegilados (es decir, unión covalente de cadenas poliméricas de polietilenglicol) también están abarcados por la presente invención. El experto conoce métodos adecuados para introducir una o más de estas modificaciones.

El término “propiedades farmacológicas y/o farmacodinámicas alteradas” tal como se usa en el presente documento se refiere, por ejemplo, pero sin limitarse a, biodisponibilidad oral alterada, farmacocinética (por ejemplo, afinidad aumentada o reducida por EGFR), distribución, capacidad de direccionamiento, semivida en suero, solubilidad, estabilidad (por ejemplo, estabilidad térmica, estabilidad proteolítica, etc.), penetración tisular y/o penetración de la barrera hematoencefálica, en comparación con el (poli)péptido sin modificar.

Por tanto, los (poli)péptidos proporcionados en el presente documento pueden contener una o más modificaciones que introducen uno o más sitios de glicosilación en comparación con el (poli)péptido sin modificar. En algunos ejemplos, los sitios de glicosilación se seleccionan de sitios de N-, O- y S-glicosilación. En un ejemplo, se introducen uno o más sitios de N-glicosilación en comparación con el (poli)péptido sin modificar.

Además, agentes peptidomiméticos de tales (poli)péptidos, en los que se han sustituido aminoácido(s) y/o enlace(s) peptídico(s) por análogos funcionales, también quedan abarcados en el presente documento. Tales análogos funcionales incluyen todos los aminoácidos conocidos distintos de los 20 aminoácidos genéticamente codificados, tales como selenocisteína y pirrolisina.

El término “ácido nucleico” tal como se usa en el presente documento de manera intercambiable con los términos “molécula de ácido nucleico” o “polinucleótido”, incluye ADN, tal como ADNc o ADN genómico, y ARN. Se entiende que el término “ARN” tal como se usa en el presente documento comprende todas las formas de ARN incluyendo ARNm.

EGF se descubrió por el Dr. Stanley Cohen hace más de medio siglo y representa el miembro prototípico de una familia de factores de crecimiento peptídicos que activan los receptores de EGF. EGF representa el prototipo de la familia de EGF del grupo I que también incluye factor de crecimiento transformante (TGF)-a, EGF de unión a heparina (HB-EGF), anfiregulina, betacelulina, epiregulina y epígeno (Zeng F y Harris RC, Semin Cell Dev Biol. (2014); 28: 2 11).

EGF se une a un receptor específico, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), también conocido como ErbB1/HER1, que pertenece a la familia de factor de crecimiento epidérmico (EGF) de tirosina cinasas receptoras (RTK) también denominado ErbB o familia de receptores de HER, que también incluye ErbB2/HER2/Neu, ErbB3/HER3 y ErbB4/HER4 (Wee P, Wang Z, Cancers (Basel) (2017); 9(5): 52; Wieduwilt MJ, Moasser MM., Cell Mol Life Sci. (2008); 65(10): 1566-84).

EGFR es una glicoproteína transmembrana de una única cadena, que comprende un ectodominio de unión a ligando extracelular, un dominio transmembrana, una sección yuxtamembrana corta, un dominio de tirosina cinasa y una cola C-terminal que contiene tirosina. La unión de EGF soluble al ectodominio de su receptor (EGFR) fomenta la formación de homodímero entre receptores EGFR. Tras la unión de EGF, EGFR también puede emparejarse con otro miembro de la familia de receptores de ErbB para formar un heterodímero. La dimerización de receptores es esencial para la activación del dominio de tirosina cinasa intracelular y la fosforilación de la cola C-terminal. Entonces los residuos de fosfotirosina activan, o bien directamente o bien a través de proteínas adaptadoras, componentes aguas abajo de rutas de señalización incluyendo las rutas de Ras/MAPK, PLCy1/PKC, PI(3)cinasa/Akt y STAT (Wieduwilt MJ, Moasser MM., Cell Mol Life Sci. (2008); 65(10): 1566-84).

Según la presente invención, el requisito especificado de que el (poli)péptido tiene “actividad de factor de crecimiento epidérmico (EGF)” debe entenderse como que el polipéptido debe mantener su capacidad para unirse a EGFR y activar su señalización. Se conocen múltiples pruebas en la técnica que pueden emplearse para evaluar la presencia o ausencia de actividad de EGF de un (poli)péptido candidato, por ejemplo, evaluando su capacidad para inducir la proliferación de líneas celulares de fibroblastos de ratón BALB/3T3, es decir, evaluando la respuesta de crecimiento de estas células en respuesta a diversas cantidades de (poli)péptido candidato (Brown KD & Holley RW, J Cell Physiol. (1979); 100(1): 139-46).

Alternativamente, pueden identificarse (poli)péptidos adecuados que tienen “actividad de factor de crecimiento epidérmico (EGF)” evaluando su capacidad para prevenir la desmielinización y/o para inducir la mejora del transcurso clínico de una enfermedad desmielinizante y/o neurodegenerativa (por ejemplo, usando modelos de animales para trastornos desmielinizantes y/o neurodegenerativos, tales como el modelo de ratón de EAE inducida por MOG tal como se describe en el presente documento, y evaluando el transcurso clínico de la enfermedad usando los criterios de evaluación tal como se describe en el presente documento (véanse los ejemplos 1 y 2)). De manera similar, también pueden identificarse (poli)péptidos adecuados que tienen “actividad de EGF” usando el modelo de animal descrito en el presente documento y detectando o evaluando el grado de inflamación o desmielinización usando análisis histológicos (histopatológicos) (véanse los ejemplos 1 y 2).

Además, se entiende que el (poli)péptido según el primer aspecto de la invención es preferiblemente soluble, es decir, no está anclado a membrana (por ejemplo, al tener un dominio transmembrana integral).

Estructuralmente, EGF es un polipéptido de una única cadena de 6,2 kDa, de 53 aminoácidos que tiene seis cisteínas conservadas que forman tres enlaces disulfuro intramoleculares, con los siguientes emparejamientos: C6-C20, C14-C31 y C33-C42 (C, cisteína; numeración según la secuencia de aminoácidos de EGF humano). EGF se sintetiza inicialmente como precursor de glicoproteína transmembrana (prepro-EGF) y después se procesa de manera proteolítica para dar proteína de EGF madura.

El (poli)péptido que tiene actividad de factor de crecimiento epidérmico (EGF) es, o se deriva de, SEQ ID NO: 1 (NSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR), que corresponde a la secuencia de aminoácidos (residuos de aminoácido 1 a 53) de EGF humano maduro, correspondiente a los residuos de aminoácido 971 a 1023 del prepro-precursor de EGF humano (numeración de prepro-EGF según la entrada en la base de datos UniProt: P01133-1; 15 de febrero de 2019 (véase https://www.uniprot.org/uniprot/P01133)).

El término “porcentaje (%) de identidad de secuencia” según la presente invención describe el número de coincidencias (“resultados positivos”) de nucleótidos/aminoácidos idénticos de dos o más secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos alineadas en comparación con el número de nucleótidos o residuos de aminoácido que constituyen la longitud global de las secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos de molde. Dicho de otro modo, usando una alineación, para dos o más secuencias o subsecuencias, puede determinarse el porcentaje de residuos de aminoácido o nucleótidos que son iguales (por ejemplo el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90% o el 95% de identidad), cuando se comparan las (sub)secuencias y se alinean para obtener una correspondencia máxima a lo largo de un intervalo de comparación, o a lo largo de una región designada tal como se mide usando un algoritmo de comparación de secuencias tal como se conoce en la técnica, o cuando se alinean mutuamente y se inspeccionan visualmente. Esta definición también se aplica al complemento de cualquier secuencia que va a alinearse.

El análisis y la alineación de secuencias de nucleótidos y de aminoácidos en relación con la presente invención se llevan preferiblemente a cabo usando el algoritmo BLAST de NCBI (Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, y David J. Lipman (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). BLAST puede usarse para secuencias de nucleótidos (BLAST de nucleótido) y secuencias de aminoácidos (BLAST de proteínas). El experto conoce programas adecuados adicionales para alinear secuencias de ácido nucleico.

Según la presente invención, un “trastorno desmielinizante” es un estado en el que la vaina de mielina que rodea las neuronas en tejido nervioso se pierde o resulta dañada, conduciendo a degeneración axonal y transducción de señales alterada en los nervios afectados. Los ejemplos de las enfermedades desmielinizantes incluyen esclerosis múltiple (MS), mielitis transversal, síndrome de Guillain-Barré (GBS), neuritis óptica, neuromielitis óptica, encefalomielitis diseminada aguda, adrenoleucodistrofia, adrenomieloneuropatía, enfermedad desmielinizante inflamatoria idiopática, mielinolisis central pontina y leucoencefalopatía multifocal progresiva.

Por “trastorno neurodegenerativo” quiere decirse cualquier enfermedad o trastorno provocado por, o asociado con, el deterioro de células o tejidos del sistema nervioso. Trastornos neurodegenerativos a modo de ejemplo son trastornos de expansión de poliglutamina (por ejemplo, HD, atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana, enfermedad de Kennedy (también denominada atrofia muscular espinobulbar) y ataxia espinocerebelar (por ejemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3 (también denominado enfermedad de Machado-Joseph), tipo 6, tipo 7 y tipo 17)), otros trastornos de expansión de repeticiones trinucleotídicas (por ejemplo, síndrome del cromosoma X frágil, retraso mental XE frágil, ataxia de Friedreich, distrofia miotónica, ataxia espinocerebelar de tipo 8 y ataxia espinocerebelar de tipo 12), enfermedad de Alexander, enfermedad de Alper, enfermedad de Alzheimer (AD), esclerosis lateral amiotrófica, ataxia telangiectasia, enfermedad de Batten (también denominada enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten), enfermedad de Canavan, síndrome de Cockayne, degeneración corticobasal, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, accidente cerebrovascular isquémico, enfermedad de Krabbe, demencia por cuerpos de Lewy, esclerosis múltiple (MS), atrofia multisistémica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, enfermedad de Pick, esclerosis lateral primaria, enfermedad de Refsum, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Schilder, lesión de la médula espinal, atrofia muscular espinal, enfermedad de Steele-Richardson-Olszewski y tabes dorsal.

El término “trastorno”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier estado o enfermedad o patología (en particular, neuropatía y/o polineuropatía) que se beneficiará del, o puede prevenirse mediante el, tratamiento según el primer aspecto de la invención. La esclerosis múltiple (MS) y muchos trastornos neurodegenerativos se diagnostican mediante evaluación clínica, pruebas neurológicas específicas que permiten la determinación de puntuaciones en escalas clínicas más obtención de imágenes por resonancia magnética (IRM) del cerebro. Para neuropatías periféricas, se necesitan signos clínicos y puntuaciones en escalas clínicas completadas mediante evaluación de laboratorio tal como conductividad nerviosa.

EGF humano comparte el 70%, el 70%, el 83% y el 66% de identidad de secuencia de aminoácidos con EGF de ratón, rata, porcino y de caballo, respectivamente. Tal como se muestra en los ejemplos de la presente invención, EGF humano recombinante (Sigma Aldrich, Milán, Italia) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 demostró ser eficaz en el modelo de animal murino experimental (véanse los ejemplos 1 y 2). Por tanto, se espera que los (poli)péptidos que tienen, o que se derivan de, la secuencia de aminoácidos de EGF murino, o de cualquier otro (poli)péptido que tiene al menos el 66% de identidad con respecto a EGF humano (SEQ ID NO: 1), también presentará la actividad de EGF beneficiosa descrita, cuando se administre a un ser humano o a otro sujeto mamífero.

Por tanto, el (poli)péptido según el punto (b) del primer aspecto de la invención comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en al menos el 66% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. El (poli)péptido según el punto (b) del primer aspecto de la presente invención puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 70%, más preferiblemente idéntica en al menos el 80%, incluso más preferiblemente idéntica en al menos el 90% y lo más preferiblemente idéntica en al menos el 95% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Sin embargo, también se prevén con preferencia creciente identidades de secuencia de al menos el 97,5%, al menos el 98,5%, al menos el 99%, al menos el 99,5%, al menos el 99,8% y el 100%.

El fragmento según el punto (c) del primer aspecto de la invención consiste, con preferencia creciente, en al menos 17, al menos 20, al menos 33 o al menos 35, e incluso más preferiblemente en al menos 40, y lo más preferiblemente en al menos 45 aminoácidos. Resulta evidente que los fragmentos abarcados por la presente invención también tienen actividad de EGF según la definición del término “actividad de EGF” proporcionada anteriormente en el presente documento. Por ejemplo, en el documento WO1992/003476, se describen diversos péptidos y análogos de péptidos que tienen actividad biológica comparable a la de EGF humano nativo y que tienen las secuencias de aminoácidos de, o similares a la de, los residuos de aminoácido 32 a 48 de EGF humano nativo (correspondientes a SEQ ID NO: 2 (NCVVGYIGERCQYRDLK)).

Se sabe que EGF y los demás miembros de la familia de EGF del grupo I (incluyendo TGF-a, HB-EGF, anfiregulina, betacelulina, epiregulina y epígeno) comprenden cada uno seis residuos de cisteína conservados, una glicina conservada y una arginina conservada en el siguiente patrón: CX7CX3-5CX10-12CXCX5GXRC (C, cisteína; G, glicina; R, arginina; X, otros aminoácidos), en los que las cisteínas forman tres enlaces disulfuro intramoleculares con los siguientes emparejamientos C1-C3, C2-C4 y C5-C6 (numerados según su orden en la secuencia) (Zeng F & Harris RC.; Semin Cell Dev Biol. (2014); 28: 2-11).

Por tanto, en determinados casos, (i) la secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 66% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y/o (ii) el fragmento que consiste en al menos 35 aminoácidos, pueden comprender seis cisteínas, una glicina y una arginina en el siguiente patrón: CX7CX3-5CX10-12CXCX5GXRC (C, cisteína; G, glicina; R, arginina; X, cualquier otro aminoácido distinto de cisteína), en los que las cisteínas participan en tres enlaces disulfuro intramoleculares con los siguientes emparejamientos: C1-C3, C2-C4 y C5-C6 (numerados según su orden en la secuencia), tal como se presenta en EGF de tipo natural (SEQ ID NO: 1).

La secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 66% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y/o el fragmento que consiste en al menos 35 aminoácidos, pueden comprender seis cisteínas, una glicina y una arginina en el siguiente patrón: CX7CX5CX10CXCX5GXRC (C, cisteína; G, glicina; R, arginina; X, cualquier otro aminoácido distinto de cisteína), en los que las cisteínas participan en tres enlaces disulfuro intramoleculares con los siguientes emparejamientos: C1-C3, C2-C4 y C5-C6 (numerados según su orden en la secuencia), tal como se presenta en EGF de tipo natural (SEQ ID NO: 1).

Mediante la especificación de que el (poli)péptido o ácido nucleico “es el único agente farmacéuticamente activo que va a administrarse”, según el primer aspecto de la presente invención, se excluye en particular que se administre uno cualquiera o más de péptido de liberación de hormona del crecimiento 6 (GHRP-6), factor de necrosis tumoral (TNF)-a, cobalamina y/o factor de inhibición de leucemia (LIF) junto con el polipéptido según la presente invención. Esta exclusión también se aplica a ácidos nucleicos que codifican para uno o más de GHRP-6, LlF y/o TNF-a.

EGFR es una tirosina cinasa que está habitualmente regulada por incremento en cánceres tales como en cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer colorrectal metastásico, glioblastoma, cáncer de cuello y cabeza, cáncer pancreático y cáncer de mama. Debido a su capacidad para inducir proliferación celular, al tiempo que se inhibe la apoptosis, el sistema de señalización de EGF/EGFR se ha identificado habitualmente como prooncogénico. Esto ha conducido al desarrollo de inhibidores específicos (tales como anticuerpos monoclonales (AcM)) o bien de EGF o bien de sus receptores, que se usan actualmente para el tratamiento de determinadas formas de cánceres tales como cáncer de mama y cáncer colorrectal.

Debido a sus efectos pleiotrópicos, EGF ha atraído atención en cuanto a la posibilidad de que una expresión desregulada de este péptido y/o su receptor también puede estar implicada en otros estados (no neoplásicos), incluyendo enfermedades inmunoinflamatorias y autoinmunitarias. Se ha entrado mucho interés en estudiar el papel de EGF en el desarrollo y la progresión de esclerosis múltiple (MS), que es una enfermedad neuroinflamatoria prototípica caracterizada por la desmielinización y con frecuencia seguida por neurodegeneración.

Por ejemplo, se sugirió que EGF era uno de varios otros factores que contribuyen al mantenimiento de mielina (Scalabrino G,et al.,(2014), Int J Biochem Cell Biol.; 55: 232-41). Además, se notificó que EGF estimula la formación de procesos de oligodendrocitos (ODC) (Chandran S,et al.,Glia. (1998); 24(4): 382-9; Pfeiffer SE,et al.,Trends Cell Biol. (1993); 3(6): 191-7), especialmente después de una lesión del CNS (Knapp PE,et al.,Exp Cell Res. (2004) 10; 296(2): 135-44) y que EGF, cuando se administra inmediatamente después de lesión cerebral de ratón recién nacido potencia la proliferación de ODC a partir de células progenitoras (Scafidi J,et al.,Nature (2014); 506(7487): 230-4). Además, se notificó que el tratamiento con EGF aumenta el número de ODC derivados a partir de células B de tipo de la zona subventricular tras una desmielinización inducida por lisolecitina de cuerpo calloso de ratón (Gonzalez-Perez O,et al.,Stem Cells. (2009); 27(8): 2032-43). En otro estudio, se identificaron polimorfismos genéticos en los genes de EGF y Tyk2 como posibles determinantes de reparación del CNS (Bieber AJ,et al.,Proc Natl Acad Sci USA (2010); 107(2): 792-7). Además, se notificó que EGF actúa como mediador de la acción mielinotrófica de cobalamina (Scalabrino G,et al.,Epidermal growth factor as a local mediator of the neurotrophic action of vitamin B(12) (cobalamin) in the rat central nervous system, FASEB J. (1999); 13(14): 2083-90); y un estudio diferente notificó que microinyecciones intracerebroventriculares (ICV) repetidas de anticuerpos anti-EGF específicos inducen lesiones de mielina de la sustancia blanca de la médula espinal en ratas normales (Scalabrino G,et al.,J Neuropathol Exp Neurol. (2000); 59(9): 808-14).

Varios otros estudios revelaron que EGF junto con una variedad de otros factores se expresa de manera aberrante en estados patológicos desmielinizantes. Por ejemplo, un estudio notificó que los niveles de ARNm de EGF y varios otros factores de crecimiento están aumentados en el CNS de ratones durante la remielinización tras desmielinización inducida por cuprizona (Gudi V,et al.PLoS One. 2011; 6(7):e22623). Un estudio adicional notificó niveles reducidos de EGF y de factor de necrosis tumoral (TNF)-a y niveles aumentados de cobalamina (Cbl) en líquido cefalorraquídeo (CSF) (pero no en suero) de pacientes con M<s>(Scalabrino G,et al.;Brain Res. 28 de mayo de 2010; 1333: 64-71). Un estudio posterior notificó niveles reducidos de EGF, Cbl y priones celulares normales (PrP(C)) en muestras de médula espinal (SC) a partir de pacientes con MS (Scalabrino G.,et al.,Neuroscience (2015), 298: 293-301). Un estudio más reciente notificó que los niveles en sangre de EGF (y de la p-quimiocina MIP-1p/CCL4) están significativamente reducidos en pacientes con MS progresiva secundaria (SP) con respecto a pacientes con MS recurrente-remitente (RR), y sugirió EGF junto con MIP-1p/CCL4 como factores protectores para formas clínicas progresivas en desarrollo de MS (Tejera-Alhambra M,et al.,PLoS One (2015); 10(6):e0128952).

Como conclusión de estos informes anteriores, generalmente se consideraba que EGF era únicamente un factor dentro de una intricada red de otros múltiples factores implicados de manera colectiva y que orquestan los procesos subyacentes de mielinización y desregulados en enfermedades desmielinizantes. Sin embargo, ninguno de estos estudios consideró la posibilidad, o ni siquiera demostró, que EGF ya pudiera ser eficaz en prevenir la desmielinización y fomentar la remielinización cuando se administra solo.

De hecho, varios estudios preclínicos cuestionaron o contradijeron un posible papel neuroprotector de EGF. Lo más sorprendentemente, en un estudio, el transcurso de EAE inducida por MOG mejoró tras el tratamiento con un anticuerpo (Ac) anti-EGF específico (Amir-Levy Y,et al.,Mult Scler Int. (2014); 2014: 926134). En otro estudio, EGF administrado de manera exógena sólo pudo mejorar el transcurso de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) en rata de Lewis cuando se administró en un tratamiento combinado con péptido de liberación de hormona del crecimiento 6 (GHRP-6) (del Barco DG,et al.,J. Restor Neurol Neurosci. (2011); 29(4): 243-52; y documento EP1870106A2). Esta dependencia se explicó por los solicitantes del documento EP1870106A2 mediante un efecto sinérgico entre EGF y GHRP-6 (véase el párrafo [0019] en el documento EP1870106A2). De manera notable, tras la administración de cualquiera de EGF o GHRP-6 solo, no se observó ningún efecto en comparación con el tratamiento con placebo (véase el párrafo [0029] y la tabla 1 del documento EP1870106A2). Sin embargo, debe observarse que la validez de EAE de rata de Lewis como modelo preclínico de MS de seres humanos se ha cuestionado debido a la falta de desmielinización que se observa en el homólogo de enfermedad humana y el transcurso monofásico y transcurso que remite por sí solo de la enfermedad que contrasta con la progresividad crónica característica de MS en seres humanos (Shin T,et al.,Mechanism of experimental autoimmune encephalomyelitis in Lewis rats: recent insights from macrophages. Anat Cell Biol. (2012); 45(3): 141-8). En contraste con estos informes anteriores (del Barco DG,et al.y documento EP1870106A2), los presentes inventores encontraron de manera sorprendente e inesperada que EGF también (y ya) proporciona estos efectos neuroprotectores cuando se administra solo. La ausencia de un efecto neuroprotector cuando se administra EGF solo (tal como se notifica por del Barco DG,et al.y el documento EP1870106A2) puede explicarse, sin limitarse a ninguna teoría, por una neutralización (al menos parcial) de EGF humano recombinante administrado mediante anticuerpos anti-fármacos (ADA) provocados en el modelo de animal de roedor en respuesta a la proteína recombinante humana extraña.

Los presentes inventores se propusieron evaluar la viabilidad del tratamiento con EGF exógeno para contrarrestar lesiones desmielinizantes y en última instancia fomentar la remielinización. Se llevó a cabo un análisis de determinación de la dosis de EGF humano recombinante en un modelo muy conocido de EAE de ratón inducida por inmunización con glicoproteína de oligodendrocito asociado a mielina (MOG). EAE inducida por MOG está caracterizada por un transcurso progresivo de la enfermedad que se sabe que está histológicamente asociado con infiltrados inflamatorios de la médula espinal y el cerebro junto con zonas marcadas de desmielinización (Mangano K,et al.,J Cell Physiol. (2014); 229(12): 1918-25; Eugster HP,et al.,Eur J Immunol. (1999); 29(2): 626-32). Los presentes hallazgos demuestran por primera vez que el tratamientoin vivocon EGF mejoró los signos clínicos e histológicos de EAE inducida por MOG. Tal como resulta evidente a partir de los datos experimentales adjuntos, EGF, cuando se administró solo, pudo revertir un proceso de desmielinización autorreactivo en curso activo que había conducido al desarrollo agresivo de EAE y signos histológicos prototípicos asociados que incluyen infiltración inflamatoria de las médulas espinales y desmielinización.

Tomados en conjunto, los datos dados a conocer en el presente documento proporcionan una clara prueba de conceptoin vivopara un papel beneficioso de EGF administrado de manera exógena en un modelo de animal establecido de enfermedad desmielinizante. El hallazgo combinado de desarrollo clínico mejorado de la enfermedad con desmielinización ausente sugiere que el tratamiento con EGF, administrado como único agente farmacéuticamente activo, representa un enfoque novedoso para el tratamiento de trastornos desmielinizantes y/o neurodegenerativos, tales como esclerosis múltiple, en particular, con el objetivo de prevenir la desmielinización y/o fomentar la remielinización.

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, el fragmento según el punto (c) comprende o consiste en SEQ ID NO: 2 (Nc VVGYIGERCQYRDLK), correspondiente a los residuos de aminoácido 32 a 48 de EGF humano nativo (SEQ ID n O: 1). Este péptido particular de s Eq ID NO: 2 se describe en el documento WO1992/003476 que tiene actividad biológica comparable a la de EGF humano nativo. El fragmento puede ser cíclico (debido a la formación de puentes disulfuro de las dos cisteínas internas).

El (poli)péptido de la invención puede formularse para su administración según la invención como parte de una composición farmacéutica. Debe entenderse que la composición farmacéutica en el contexto de la presente invención no comprende ningún agente farmacéuticamente activo adicional además del (poli)péptido de la presente invención.

Para la administración parenteral, la composición farmacéutica se formula generalmente mezclando el (poli)péptido de la invención al grado de pureza deseado, en una forma inyectable de dosificación unitaria (disolución, suspensión o emulsión), con un portador farmacéuticamente aceptable, es decir, uno que no es tóxico para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas y es compatible con otros componentes de la formulación.

Generalmente, las formulaciones se preparan poniendo en contacto los componentes de la composición farmacéutica de manera uniforme e íntima con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos. Después, si es necesario, el producto se conforma en la formulación deseada. Preferiblemente, el portador es un portador parenteral, más preferiblemente una disolución que es isotónica con la sangre del receptor. Los ejemplos de tales vehículos portadores incluyen agua, solución salina, disolución de Ringer y disolución de dextrosa. Los vehículos no acuosos tales como aceites fijos y oleato de etilo también son útiles en el presente documento, así como liposomas. El portador contiene de manera adecuada cantidades minoritarias de aditivos tales como sustancias que potencian la isotonicidad y la estabilidad química. Tales materiales no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, succinato, ácido acético y otros ácidos orgánicos o sus sales; antioxidantes tales como ácido ascórbico; (poli)péptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente diez residuos), por ejemplo, poliarginina o tripéptidos; albúmina sérica, gelatina; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico, o arginina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como polisorbatos, poloxámeros o PEG.

Los componentes de la composición farmacéutica que va a usarse para la administración terapéutica deben ser estériles. La esterilidad se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles (por ejemplo, membranas de 0,2 micrómetros). Los componentes terapéuticos de la composición farmacéutica se colocan generalmente en un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de disolución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica.

Los componentes de la composición farmacéutica se almacenarán habitualmente en recipientes de dosis unitaria o múltiple, por ejemplo, ampollas selladas o viales, como disolución acuosa o como formulación liofilizada para su reconstitución. Como un ejemplo de una formulación liofilizada, se llenan viales de 10 ml con 5 ml de disolución acuosa al 1% (p/v) esterilizada por filtración y se liofiliza la mezcla resultante. La disolución de infusión se prepara reconstituyendo el/los compuesto(s) liofilizado(s) usando agua para inyección bacteriostática.

El (poli)péptido de la invención puede administrarse junto con un portador o en condiciones que potencian el paso del (poli)péptido a través de la barrera hematoencefálica (BBB). Por ejemplo, puede usarse un agente de permeabilización de la barrera hematoencefálica. En la técnica se conocen agentes de permeabilización de la barrera hematoencefálica e incluyen, a modo de ejemplo, bradiquinina y los agonistas de bradiquinina descritos en las patentes estadounidenses n.os 5.686.416; 5.506.206 y 5.268.164 (tales como NH2-arginina-prolina-hidroxiproxiprolina-glicina-tienilalanina-serinaprolina-4-Me-t¡ros¡nay(CH2NH)-arg¡n¡na-COOH). Alternativamente, las moléculas que van a administrarse pueden conjugarse con vectores de transporte incluyendo, por ejemplo, los anticuerpos de receptor de transferrina (tal como se describe en las patentes estadounidenses n.os 6.329.508; 6.015.555; 5.833.988 o 5.527.527), albúmina cationizada, insulina, factores de crecimiento similares a insulina (IGF-I, IGF-II), angiotensina II, péptido natriurético auricular y cerebral (ANP, BNP), interleucina I (IL-I), transferrina, LDL cationizado, albúmina o peroxidasa del rábano acoplada polilisina, albúmina cationizada, inmunoglobulina cationizada, oligopéptidos básicos pequeños (por ejemplo, análogo de dinorfina E-2078 o el análogo de ACTH ebiratida), restos de hexosa (por ejemplo, glucosa), ácidos monocarboxílicos (por ejemplo, ácido láctico). El (poli)péptido también puede administrarse como una proteína de fusión que comprende la molécula y un ligando que es reactivo con un receptor de células endoteliales capilar cerebral, tal como el receptor de transferrina (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.977.307). Los “portadores”, “vectores de transporte” anteriormente especificados no se encuentran dentro del término “agente farmacéuticamente activo” tal como se usa en el presente documento, y, por tanto, no se excluyen de administrarse conjuntamente con el (poli)péptido según el primer aspecto de la invención.

El (poli)péptido según la invención puede administrarse de manera sistémica (por ejemplo, por vía oral, rectal, parenteral (por ejemplo, intravenosa), intramuscular, intraperitoneal, transdérmica (por ejemplo, mediante un parche), tópica (como polvos, pomadas, gotas o parche transdérmico), bucal, o como una pulverización oral o nasal, mediante inhalación, por vía subcutánea o similares), mediante administración en el sistema nervioso central (por ejemplo, en el cerebro (por ejemplo, por vía intracerebral, intraventricular o intracerebroventricular) o en la médula espinal o en el líquido cefalorraquídeo), o cualquier combinación de los mismos.

El (poli)péptido puede administrarse en una o más administraciones de dosis, al menos una vez al día, durante uno o más días (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 días; 2, 3, 4 semanas; 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses; 2 años, 3 años, 4 años o más). Sin embargo, el experto entiende que la duración de la administración, según la presente invención, puede mantenerse opcionalmente durante el resto de la vida del sujeto. El (poli)péptido puede administrarse diariamente o con menor frecuencia, por ejemplo, cada dos día, dos veces por semana, semanalmente, cada dos semanas, dos veces al mes, mensualmente, cada dos meses, etc.

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, tiene que administrarse una cantidad eficaz del (poli)péptido a un sujeto que lo necesita de una vez cada 36 horas a una vez cada 60 horas, más preferiblemente de una vez cada 44 horas a una vez cada 52 horas, y lo más preferiblemente una vez cada aproximadamente 48 horas. En relación con la presente invención, se encontró que el tratamiento de ratones con EAE inducida por MOG (un modelo de animal de enfermedades desmielinizantes/neurodegenerativas, en particular MS) con EGF fue particularmente eficaz en la mejora del transcurso clínico de la enfermedad y la prevención de los signos histológicos de desmielinización cuando se administró cada dos días (EOD), tal como se detalla en el ejemplo 2.

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, el (poli)péptido tiene que administrarse durante un periodo de al menos 20 días, preferiblemente al menos 30 días, más preferiblemente al menos 40 días. Tal como resulta evidente a partir de los datos experimentales dados a conocer en el presente documento del modelo de EAE de ratón, ya se observó una mejora de signos clínicos debido al tratamiento de EGF (se administró EGF a partir del día 7 tras la inmunización con antígeno de MOG) a partir del primer día (día 9 tras la inmunización con MOG) en el que habitualmente pueden observarse síntomas de enfermedad clínica en este modelo de EAE (y tal como se observaron en el grupo de control tratado con vehículo) hasta el final del estudio (día 46 tras la inmunización con MOG); véase el ejemplo 2. El (poli)péptido de la invención puede administrarse al sujeto a una dosis adecuada y/o a una cantidad terapéuticamente eficaz. Esto se comentará adicionalmente a continuación en el presente documento.

La dosificación del (poli)péptido de la invención requerida variará en cierta medida de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, edad, peso y estado general del sujeto, el agente activo particular y el portador farmacéutico usado, el modo de administración y similares. Por ejemplo, la dosis del (poli)péptido cuando se administra por vía parenteral puede estar en el intervalo de aproximadamente 1 pg de (poli)péptido/kg a 10 mg (poli)péptido/kg de peso corporal del paciente (PC), aunque, tal como se indicó anteriormente, esto estará sujeto al criterio terapéutico. Más preferiblemente, esta dosis es de al menos 0,01 mg de (poli)péptido/kg/día, y lo más preferiblemente para seres humanos entre aproximadamente 0,01 y 5 mg de (poli)péptido/kg/día. Si se administra de manera continua, la composición farmacéutica se administra normalmente a una tasa de dosis de aproximadamente 1 pg/kg/hora a aproximadamente 50 pg/kg/hora, o bien mediante 1-4 inyecciones al día o bien mediante infusiones subcutáneas continuas, por ejemplo, usando una minibomba. También puede emplearse una disolución de bolsa intravenosa. La longitud de tratamiento necesaria para observar cambios y el intervalo tras el tratamiento para que se produzcan respuestas parecen variar dependiendo del efecto deseado. Las cantidades particulares pueden determinarse mediante pruebas convencionales que conoce bien el experto en la técnica.

La dosificación del (poli)péptido de la invención requerida variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, edad, peso y estado general del sujeto, el agente activo particular usado, su modo de administración y similares. Por ejemplo, pueden usarse modelos de animales para trastornos desmielinizantes/neurodegenerativos (por ejemplo, el modelo de ratón de EAE, modelo de desmielinización inducida por cuprizona y modelo de lisolecitina) para monitorizar niveles de respuesta. Pueden monitorizarse signos clínicos y pueden determinarse análisis histopatológicos de criterios de valoración de inflamación, desmielinización y/o alteración axonal en sujetos con, o en modelos de animales de, trastornos desmielinizantes y/o neurodegenerativos tal como se describe en los ejemplos dados a conocer en el presente documento. Pueden usarse pruebas histológicas para detectar, por ejemplo, mielina, OPC o números de oligodendrocitos, remielinización, niveles de citocina, número de linfocitos. Puede realizarse clasificación celular para identificar números de linfocitos en muestras de tejido. Puede usarse obtención de imágenes (por ejemplo, obtención de imágenes por resonancia magnética (IRM)) y mediciones funcionales (supervivencia o síntomas clínicos) para monitorizar la respuesta de un sujeto a la terapia. Además, pueden disociarse muestras de cerebro humano resecadas (por ejemplo, muestras derivadas como medios para tratar un trastorno de lo contrario intratable) y cultivarse como neuroesferas para estudiar el efecto de dosis del (poli)péptido de la invención. Pueden usarse estudios de electrofisiología (por ejemplo, potenciales evocados y conducción nerviosa) para monitorizar el progreso. Para ejemplos de exploraciones neuropatológicas, véase, por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense n.° 2007/023711; Schellenberget al.(2007) Magnetic resonance imaging of blood-spinal cord barrier disruption in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis, Magn. Reson. Med. 58: 298-305; y Larsenet al.(2003) Matrix metalloproteinase-9 facilitates remyelination in part by processing the inhibitory NG2 proteoglycan, J. Neuroscience 23: 11127-35; Brundulaet al.,Brain 125: 1297, (2002); Giulianiet al.,J Neuroimmunol 165: 83, (2005).

Como regla general, los intervalos de dosificación para la administración de las composiciones son aquellos suficientemente grandes como para producir el efecto deseado en el que los síntomas de la enfermedad se ven afectados. Por ejemplo, la mejora funcional, mejora histológica, expresión génica y similares pueden verse afectados y monitorizarse para determinar el desenlace deseado. La dosificación no debe ser tan grande que provoque efectos secundarios adversos, tales como reacciones cruzadas no deseadas y reacciones inflamatorias no deseadas. La dosificación puede variar dependiendo de la vía de administración usada.

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, el (poli)péptido tiene que administrarse a una dosis de entre 100 pg/kg de peso corporal y 2000 pg/kg de peso corporal. En el contexto de la presente invención, se encontró que el tratamiento del modelo de EAE de ratón con EGF era eficaz a todas las dosificaciones sometidas a prueba de 2,5 ug/ratón y 10 ug/ratón, tal como se detalla en los ejemplos 1 y 2. Con un peso corporal (PC) de ratón promedio de aproximadamente 20 g, estas dosificaciones corresponden a aproximadamente 125 ug/kg de PC y aproximadamente 500 ug/kg de PC. Por tanto, se espera que generalmente dosificaciones en el intervalo tal como se indicó en la realización preferida anterior pueden ser terapéuticamente eficaces en sujetos mamíferos, en particular en sujetos humanos.

Los ejemplos adicionales de dosis del (poli)péptido incluyen aproximadamente 50-5000 pg/kg de PC, aproximadamente 75-4000 pg/kg de PC, aproximadamente 100-3000 pg/kg de PC y más particularmente aproximadamente 100-1000 pg/kg de PC (o cualquier cantidad en las mismas), o cualquier dosis que logre un nivel en sangre en el intervalo del medido en sujetos sanos, es decir de aproximadamente 30 pg/ml. En un informe reciente, se encontró que 15 sujetos sanos tenían niveles medios de EGF de 32,66 (79,82) pg/ml en suero y de 1371,64 (1205,48) pg/ml en saliva (Bochowiak KJ,et al.,Adv Clin Exp Med. (2018), abril; 27(4): 455-461).

Pueden administrarse ácidos nucleicos que codifican para el (poli)péptido de la invención usando métodos de terapia génica. Los vectores de retrovirus y vectores de virus adenoasociado (AAV) son vectores preferidos según la invención para transferir ácidos nucleicos que codifican para los (poli)péptidos de la invención al interior de célulasin vivo,particularmente al interior de células humanas. Estos vectores proporcionan una administración eficiente de genes al interior de células, y los ácidos nucleicos transferidos se integran de manera estable en el ADN cromosómico del huésped. Se prefiere el desarrollo de líneas celulares especializadas (“células de empaquetamiento”) que producen retrovirus defectuosos para la replicación para aplicaciones de terapia génica (véase, por ejemplo, Miller, A. D. Blood 76: 271 (1990)). Pueden construirse retrovirus recombinantes en los que parte de la secuencia codificante retroviral (gag, pol, env) se ha sustituido por ácido nucleico que codifica para uno de los receptores del sujeto haciendo que el retrovirus sea defectuoso para la replicación. Después se empaqueta el retrovirus defectuoso para la replicación en viriones que pueden usarse para infectar una célula diana mediante el uso de un virus cooperador mediante técnicas convencionales. Pueden encontrarse protocolos para producir retrovirus recombinantes y para infectar célulasin vitrooin vivocon tales virus, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M.et al.(eds.) Greene Publishing Associates, (1989), secciones 9.10-9.14 y otros manuales de laboratorio convencionales. Los ejemplos representativos de retrovirus incluyen pLJ, pZIP, pWE y pEM que conocen bien los expertos en la técnica. Los ejemplos representativos de líneas de virus de empaquetamiento para preparar sistemas retrovirales tanto ecotrópicos como anfotrópicos incluyen psi.Crip, psi.Cre, psi 2 y psi.Am. Los retrovirus se han usado ampliamente para introducir una variedad de genes en muchos tipos de células diferentesin vitroy/oin vivo.Además, resulta útil limitar el espectro de infección de los retrovirus y los vectores basados en retrovirus modificando las proteínas de empaquetamiento virales sobre la superficie de la partícula viral (véanse, por ejemplo las publicaciones de PCT WO93/25234 y WO94/06920; Rouxet al.PNAS 86: 9079-9083 (1989); Julanet al.J. Gen Virol 73: 3251-3255 (1992); y Goudet al.Virology 163: 251-254 (1983); Nedaet al.J. Biol Chem 266: 14143-14146 (1991)). Los trastornos desmielinizantes pueden clasificarse según si la desmielinización se debe a procesos inflamatorios. Trastornos desmielinizantes inflamatorios a modo de ejemplo son, sin limitación, esclerosis múltiple (MS), encefalomielitis diseminada aguda (ADEM) y leucoencefalitis hemorrágica aguda (AHL).

Según el primer aspecto de la invención, el trastorno desmielinizante es un trastorno desmielinizante inflamatorio: el modelo de ratón de EAE usado en el presente documento (véanse los ejemplos 1 y 2) está caracterizado por desmielinización inflamatoria que puede mejorarse mediante administración de EGF. En una realización alternativa que no forma parte de la invención reivindicada, el trastorno desmielinizante y/o neurodegenerativo es un trastorno no inflamatorio.

Los trastornos desmielinizantes también pueden clasificarse dependiendo del motivo subyacente para la desmielinización en enfermedades mielinoclásticas y leucodistróficas. En las enfermedades mielinoclásticas desmielinizantes, una mielina normal y sana se destruye por una sustancia tóxica, química o autoinmunitaria. En las enfermedades leucodistróficas desmielinizantes (también conocidas como enfermedades dismielinizantes), la mielina es anómala y se degenera. Enfermedades mielinoclásticas desmielinizantes a modo de ejemplo son, sin limitación, esclerosis múltiple (MS), enfermedad de Schilder (esclerosis difusa mielinoclástica), enfermedad de Devic, enfermedad de Balo y otras, y otros trastornos con implicación del sistema inmunitario. Enfermedades leucodistróficas desmielinizantes a modo de ejemplo son, sin limitación, neuropatías del CNS tales como las producidas por deficiencia de vitamina B12, mielinolisis central pontina, tabes dorsal (mielopatía sifilítica), leucoencefalopatías (tales como leucoencefalopatía multifocal progresiva) y leucodistrofias.

Según otra realización preferida del primer aspecto de la invención, el trastorno desmielinizante inflamatorio es un trastorno mielinoclástico: el modelo de ratón de EAE inducida por MOG tal como se usa en el presente documento (ejemplos 1 y 2) está caracterizado por desmielinización mielinoclástica que puede mejorarse mediante administración de EGF. En otros casos, el trastorno desmielinizante inflamatorio es un trastorno leucodistrófico.

Los trastornos (o enfermedades) desmielinizantes también pueden dividirse en los que afectan al sistema nervioso central (CNS) y los que afectan al sistema nervioso periférico (PNS), que presentan diferentes condiciones de desmielinización. Las enfermedades desmielinizantes del CNS incluyen, sin limitación, trastornos mielinoclásticos, tales como esclerosis múltiple (MS), enfermedad de Devic y otros trastornos con implicación del sistema inmunitario denominados enfermedades desmielinizantes inflamatorias, trastornos leucodistróficos en los que no se produce mielina de manera apropiada tales como neuropatías del CNS tales como las producidas por deficiencia de vitamina B12, mielinolisis central pontina, mielopatías tales como tabes dorsal (mielopatía sifilítica), leucoencefalopatías (tales como leucoencefalopatía multifocal progresiva) y leucodistrofias. Con frecuencia, estos trastornos están asociados con los estados de neuritis óptica y mielitis transversal, que son estados inflamatorios, porque con frecuencia la inflamación y la desmielinización están asociadas. Algunos de los mismos son idiopáticos (surgen de manera espontánea, sin causa conocida) y para otros se ha encontrado la causa, como algunos casos de neuromielitis óptica. Las enfermedades desmielinizantes del PNS incluyen, sin limitación, síndrome de Guillain-Barré (GBS) y su homólogo crónico, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), neuropatía periférica anti-MAG, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (y su homólogo neuropatía hereditaria con predisposición a parálisis por presión), estados asociados con deficiencia de cobre (por ejemplo, neuropatía periférica, mielopatía, neuropatía óptica poco frecuente, etc.), y neuropatía inflamatoria progresiva. Aunque la esclerosis múltiple (MS) se limita habitualmente al CNS, hay casos poco frecuentes en los que el PNS también se ve afectado.

Según otra realización preferida del primer aspecto de la invención, el trastorno desmielinizante inflamatorio es un trastorno del sistema nervioso central (CNS): el modelo de ratón de EAE inducida por MOG tal como se usa en el presente documento (ejemplos 1 y 2) está caracterizado por desmielinización y neurodegeneración del CNS que puede mejorarse/prevenirse mediante el tratamiento con EGF. Sin embargo, se espera que el tratamiento con EGF también sea eficaz en mejorar/prevenir trastornos desmielinizantes y/o neurodegenerativos que implican el sistema nervioso periférico (PNS). Por tanto, en otros casos, el trastorno desmielinizante inflamatorio es un trastorno del sistema nervioso periférico (PNS).

Según otra realización preferida del primer aspecto de la invención, el trastorno desmielinizante inflamatorio es una enfermedad inmunitaria, preferiblemente una enfermedad autoinmunitaria. En una realización más preferida del primer aspecto de la invención, la enfermedad inmunitaria es (a) esclerosis múltiple (MS), (b) síndrome de Guillain-Barré (GBS); o (c) polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP).

MS es una enfermedad inmunitaria (principalmente autoinmunitaria) desmielinizante inflamatoria crónica del CNS (y que con poca frecuencia también afecta al PNS) de etiología desconocida y transcurso y síntomas clínicos heterogéneos. Dependiendo de la presentación clínica y el transcurso, MS se clasifica como recurrente-remitente (RR), progresiva primaria (PP) o progresiva secundaria (SP). Aproximadamente el 85% de los pacientes con MS muestran inicialmente un transcurso de RR, caracterizado por ataques agudos (recurrencia) seguidos por recuperación parcial o completa (remisión), que se producen a intervalos variables. De estos pacientes con RR-MS, aproximadamente dos terceras partes de los pacientes sin tratar pasan a la fase progresiva secundaria momento en el cual la discapacidad neurológica se acumula en ausencia de ataques. Aproximadamente el 15% de los pacientes con MS tienen un transcurso progresivo primario manifestado mediante empeoramiento clínico progresivo desde la aparición sin ataques clínicos (Mayo L,et al.,Immunol Rev. (2012); 248(1): 170-87). Tal como se usa en el presente documento, el síndrome clínico aislado (CIS) se refiere a: 1) un único ataque clínico que sugiere MS y 2) al menos una lesión que sugiere MS. Como ejemplo, el paciente tiene al menos 1 lesión cerebral detectable mediante una exploración de IRM y que sugiere esclerosis múltiple. Como ejemplo adicional, la lesión está asociada con inflamación del tejido cerebral, daño de la vaina de mielina o daño axonal. Como otro ejemplo, la lesión es una lesión de sustancia blanca desmielinizante visible en IRM de cerebro. El término “ataque clínico individual” se usa como sinónimo de “primer episodio clínico”, “primer ataque clínico” y “primer acontecimiento clínico” que, por ejemplo, se presenta como un episodio clínico de neuritis óptica, visión borrosa, diplopia (visión doble), movimiento ocular rápido involuntario, ceguera, pérdida de equilibrio, temblores, ataxia, vértigo, torpeza de una extremidad, falta de coordinación, debilidad de una o más extremidades, tono muscular alterado, rigidez muscular, espasmos, hormigueo, parestesia, sensaciones de ardor, dolores musculares, dolor facial, neuralgia trigeminal, dolores punzantes, dolor de tipo escozor, ralentización del habla, mascullar las palabras, cambios en el ritmo del habla, disfagia, fatiga, problemas de vejiga (incluyendo urgencia, frecuencia, vaciado incompleto e incontinencia), problemas intestinales (incluyendo estreñimiento y pérdida de control intestinal), impotencia, reducción de la excitación sexual, pérdida de sensación, sensibilidad al calor, pérdida de memoria a corto plazo, pérdida de concentración, o pérdida de criterio o razonamiento. Tal como se usa en el presente documento, los criterios, tal como se definen por Poseret al.Neurology, (1983), 13 (3): 227-230, usados para determinar si un sujeto cumple el estado compatible con esclerosis múltiple clínicamente evidente (CDMS) son: (i) dos ataques y evidencias clínicas de dos lesiones independientes; o (ii) dos ataques; evidencias clínicas de una lesión y evidencias paraclínicas de otra lesión independiente. Un ataque (también denominado exacerbación, empeoramiento o recurrencia) se define clínicamente como la aparición repentina o el empeoramiento de un síntoma o síntomas de disfunción neurológica, con o sin confirmación objetiva. Generalmente se considera que los pacientes con CIS que experimentan un segundo ataque clínico tienen esclerosis múltiple clínicamente evidente (CDMS). Más del 80 por ciento de los pacientes con una lesión de CIS y IRM llegan a desarrollar MS, mientras que aproximadamente el 20 por ciento tienen un proceso limitado (Brexet al.,N Engl J Med. (2002), 346(3): 158-64; Frohman,et al.,Neurology. (2003), 61(5): 602-11).

El síndrome de Guillain-Barré (GBS) es un trastorno mediado por el sistema inmunitario del PNS caracterizado por debilidad neuromuscular y con frecuencia acompañado por parálisis flácida y puede conducir ocasionalmente a la muerte. Se clasifica como una polineuropatía desmielinizante inflamatoria aguda con una forma variante designada como neuropatía axonal motora aguda (Hughes y Cornblath, 2005. Lancet 366: 1653-1666). Se han propuesto anticuerpos anti-gangliósido como agentes contribuyentes a la patogénesis de GBS (Kaidaet al.,2009. J. Neuroimmunol. 182: 212-218; Ariga y Yu, 2005. J. Neurosci. Res. 80: 1-17). Los gangliósidos se expresan de manera abundante en nervios humanos (Yuet al.,2004. J. Lipid Res. 45: 783-793) y se cree generalmente que tienen papeles importantes como mediadores de adhesión celular y moduladores de la transducción de señales (Regina Todeschini y Hakomori 2008. Biochim. Biophys. Acta 1780: 421-433). La etiología de GBS es compleja y no se conoce completamente. Sin embargo, cada vez más evidencias indican que respuestas inmunitarias aberrantes activadas por un agente infeccioso o vacunación permiten el desarrollo de la enfermedad y son mecanismos patogénicos subyacentes (Langmuiret al.,1984. Am J Epidemiol 119: 841-879; Kuwabara, 2004. Drugs 64: 597-610; Souayahet al.,2007. Vaccine 25: 5253-5255). Los agentes microbianos más habitualmente identificados sonCampylobacter jejuni (C. jejuni), Haemophilus influenzae,citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr yMycoplasma pneumoniae(Hugheset al.,1999. J Neuroimmunol 100: 74-97; Haddenet al.,2001. Neurology 56: 758-765; Sivadon-Tardyet al.,2006. Emerg Infect Dis 12: 990-993; Sivadon-Tardyet al.,2009. Clin Infect Dis 48: 48-56). Un acontecimiento infeccioso anterior y factores de huésped relacionados con el paciente también parecen estar relacionados con determinados subtipos de GBS y pueden afectar a la intensidad de la enfermedad (Geleijnset al.,2005. Neurology 64: 44-49; Caporaleet al.,2006. J Neuroimmunol 177: 112-118; Yuki, 2007. Muscle Nerve 35: 691-711). La infección porC. jejuniinduce con frecuencia anticuerpos anti-gangliósido en el suero del paciente (Yukiet al.,1990. Neurology 40: 1900 1902; Usukiet al.,2006. J Neurosci Res 83: 274-284). Por tanto, a pesar de la posibilidad de otros mecanismos patogénicos, un proceso mediado por anticuerpos es uno de los principales ataques al nervio, provocando tanto bloqueo de la conducción como pérdida de velocidad y los consiguientes síntomas clínicos (Rinaldi y Willison, 2008. Curr Opin Neurol 21: 540-546; van Doornet al.,2008. Lancet Neural 7: 939-950; Kaidaet al.,2009. Glycobiology 19: 676-692).

La polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP) es un trastorno inflamatorio mediado por el sistema inmunitario adquirido del PNS. Algunas veces el trastorno se denomina polineuropatía recurrente crónica (CRP) o polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (porque implica las raíces de los nervios) (Kissel JT,et al.,Seminars in Neurology (2003), 23(2): 169-80). CIDP está estrechamente relacionada con el síndrome de Guillain-Barré y se considera que es el homólogo crónico de esa enfermedad aguda. Se han notificado varias variantes. Una variante asimétrica de CIDP se conoce como síndrome de Lewis-Sumner. También hay una variante con implicación del CNS denominada desmielinización central y periférica combinada (CCPD). En algunos casos, la CIDP es neuropatía sensorial y motora desmielinizante adquirida multifocal. En algunos ejemplos, la CIDP está inducida por infección por VIH.

Según otra realización preferida del primer aspecto de la invención, la MS es del fenotipo (a) síndrome clínico aislado (CIS), (b) MS progresiva primaria (pPmS), (c) MS progresiva secundaria (SPMS), (d) mS recurrente-remitente (RRSS), o (e) una forma intermedia de cualquier combinación de (a) a (d).

Según otra realización preferida del primer aspecto de la invención, el trastorno desmielinizante inflamatorio está asociado con una escasez o deficiencia de (a) factor de crecimiento epidérmico (EGF); y/o (b) cobalamina (Cbl) (vitamina B12). Con “escasez” de EGF o cobalamina, tal como se usa en el presente documento, quiere decirse una reducción de al menos el 50%, preferiblemente de al menos el 75%, del nivel de estas sustancias en comparación con su(s) nivel(es) determinado(s) en una o más muestras (por ejemplo, en líquido corporal, preferiblemente líquido cefalorraquídeo) de uno o más sujetos sanos. En la técnica se conocen métodos para determinar los niveles de EGF y/o cobalamina, por ejemplo, radioinmunoensayos, y se describen, por ejemplo, en Scalabrino G,et al.;Brain Res. (2010); 1333: 64-71, y están comercialmente disponibles (kits de radioinmunoensayo para la determinación de los niveles de vitamina B12 (Diagnostic Products Corporation, EE.UU.) y los niveles de Eg F (Penisula Laboratories, San Carlos, CA)).

La invención se describe en el presente documento, únicamente a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos con fines de ilustrar las realizaciones preferidas de la presente invención.

Las figuras muestran

Figura 1. Efectos del tratamiento profiláctico tardío con EGF sobre la variación de peso corporal (PC) en EAE inducida por MOG. Las diferencias estadísticas entre grupos se evaluaron usando la prueba de la T.

Figura 2. Efectos del tratamiento profiláctico tardío con EGF sobre la duración de enfermedad en EAE inducida por MOG. Las diferencias estadísticas entre grupos se evaluaron usando análisis a posteriori de Kruskal-Wallis y Dunn.

Figura 3. Efectos del tratamiento con EGF sobre la aparición de la enfermedad en EAE inducida por MOG hasta el día 46 tras la inmunización. Las diferencias estadísticas entre grupos se evaluaron usando análisis a posteriori de Kruskal-Wallis y Dunn.

Figura 4. Efectos del tratamiento profiláctico tardío con EGF sobre la puntuación clínica en EAE inducida por MOG [se muestra en valor medio por día]. Las diferencias estadísticas entre grupos se evaluaron usando análisis a posteriori de Kruskal-Wallis y Dunn.

Figura 5. Efectos del tratamiento profiláctico tardío con EGF sobre la puntuación acumulativa en EAE inducida por MOG. Las diferencias estadísticas entre grupos se evaluaron usando análisis a posteriori de Kruskal-Wallis y Dunn.

Figura 6. Efectos del tratamiento profiláctico tardío sobre la puntuación histológica (puntuación de daño) en un modelo de ratón de EAE inducida por MOG.

Figura 7. Imágenes representativas de secciones teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) de médula espinal (SC). El tratamiento con EGF ha mejorado la infiltración de células inflamatorias provocada por la EAE. La intensidad del daño se evaluó 50 días tras la inducción de EAE mediante tinción con hematoxilina y eosina. Los ratones simulados no mostraron cambios histológicos en tejidos de médula espinal. Se observó un daño significativo en ratones con EAE, tal como se demuestra mediante la presencia de numerosos focos inflamatorios en la sustancia blanca de la médula espinal. En particular, se observó una reducción completa de infiltración de células inflamatorias, tales como linfocitos T y monocitos, en muestras tomadas de ratones con EAE tratados con la dosis más eficaz (o “preferida”) de EGF de 2,5 ug/ratón EOD. Aumento: 10X; barra de escala: 50 pm. Los valores se expresan como medias ± EEM y se calculan en 20 secciones de médula espinal por ratón.

Figura 8. Efectos del tratamiento profiláctico tardío con EGF sobre la puntuación de desmielinización en EAE inducida por MOG.

Figura 9. Imágenes representativas de secciones teñidas con azul rápido de Luxol (LFB) de médula espinal (SC). EGF atenuó la degradación de mielina provocada por la EAE. Las secciones de la SC extraídas al final del tratamiento en el día del sacrificio se analizaron con tinción con LFB para detectar la desmielinización. En grupos de control simulado y de DEX, no muestran placas de desmielinización. La tinción con LFB muestra que se produjo la formación de placas de desmielinización en el grupo de EAE. La degradación de mielina se atenuó completamente en ratones con EAE tratados con EGF. Aumento: 10X; barra de escala: 50 pm.

Los ejemplos ilustran la invención:

Ejemplo 1: materiales y métodos

Estudio con animales

Aclimatación, alojamiento y alimentación

Se mantuvieron ratones C57BL/6 hembra de seis a 7 semanas de edad que pesaban entre 16 y 18 gramos y adquiridos de Envigo (San Pietro al Natisone, Udine, Italia) en la instalación para animales del Departamento de Ciencias Biomédicas y Biotecnológicas, Universidad de Catania, en las condiciones de laboratorio convencionales (libre de patógenos no específicos) con acceso libre a comida y agua y se dejó que se adaptaran durante al menos una semana a su entorno antes de comenzar el estudio.

Se alojaron los animales dentro de una instalación para roedores de acceso limitado en condiciones microbianas controladas, que excluyeron patógenos murinos, y se mantendrán en grupos de, como máximo, 5 ratones, en jaulas de policarbonato (Tecniplast, Varese, Italia), según la legislación italiana (cada ratón debe disponer de una superficie de 180 cm2 con una altura mínima de 12 cm). Este régimen no excluye diversas especies deHelicobacter.Se esterilizan las jaulas y se llenan con virutas de madera como material de lecho. Se establecen condiciones ambientales controladas de manera automática para mantener la temperatura a 20 - 24°C con una humedad relativa (HR) del 30 -70%, 10-30 cambios de aire/h y un ciclo de oscuridad:luz natural.

La protección de animales usados en el experimento es según la directiva 2010/63/UE, impuesta por la D. Lgs 26/2014 de Italia. Las instalaciones físicas y los equipos para el alojamiento y cuidado de animales son según las disposiciones de la directiva del consejo de la CEE 86/609.

Inducción de EAE inducida por MOG

Se inmunizaron los ratones mediante inyección s.c. de una emulsión compuesta por 200 pg de péptido MOG35-55 (Genemed Synthesis, San Francisco, CA) en adyuvante completo de Freund (CFA, Difco, Detroit, EE.UU.) que contenía 0,5 mg (por inyección) deMycobacterium tuberculosis.Cada ratón recibió inyecciones subcutáneas de 200 ul de emulsión divididas entre dos sitios, costado izquierdo y derecho (50%/50%), drenando al interior de los ganglios linfáticos axilares. Se usó toxinapertussis(Calbiochem, Nottingham, R.U.) como coadyuvante y se administró por vía i.p. a la dosis de 200 ng/ratón en el día 0 y 200 ng/ratón en el día 2 tras la inmunización (Donia M, Mangano K, Quattrocchi C, Fagone P, Signorelli S, Magro G, Sfacteria A, Bendtzen K, Nicoletti F. Specific and strain-independent effects of dexamethasone in the prevention and treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis in rodents. Scand J Immunol. Noviembre de 2010; 72(5): 396-407).

Diseño del estudio

Se trataron seis grupos de 10-12 animales cada uno (los ratones que faltan murieron debido a la anestesia o a toxicidad de toxinapertussis)con un régimen profiláctico tardío desde 7 días tras la inmunización hasta el día 50, tal como se describe en la tabla 1 a continuación:

Tabla 1:

Se consideraron cinco ratones adicionales como simulados. Estos ratones, en el día de la inducción de EAE, se anestesiaron como los demás ratones, pero sólo se les inyectó adyuvante de Freund sinMycobacterium tuberculosisy sin MOG. Estos ratones sin tratar se consideraron ratones sanos. El número de animales por grupo es el mínimo que permite una evaluación precisa de efectos farmacológicos observados.

Se adquirió dexametasona (Soldesan, Dex) de una farmacia local y se usó como fármaco de control positivo tal como se describió anteriormente (Donia M, Mangano K, Quattrocchi C, Fagone P, Signorelli S, Magro G, Sfacteria A, Bendtzen K, Nicoletti F. Specific and strain-independent effects of dexamethasone in the prevention and treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis in rodents. Scand J Immunol. Noviembre de 2010; 72(5): 396-407).

EGF humano recombinante con CE50: se disolvieron 0,08-0,8 ng/ml tal como se evalúa sobre el crecimiento sobre líneas celulares de fibroblastos de ratón, BALB/3T3) (Sigma Aldrich, Milán, Italia) en agua para inyección y se administraron mediante inyección i.p. tal como se describió en la tabla 1 anteriormente.

Experimentos proporcionados anteriores demostraron que EGF es activo sobre el CNS de rata aunque se administre por vía i.p., conllevando por tanto que atraviesa la barrera BB (Scalabrino G., Lorenzini E.C., Monzio-Compagnoni B., Colombi R.P., Chiodini E., Buccellato F.R. Subacute combined degeneration in the spinal cord of totally gastrectomized rats. Ornithine decarboxylase induction, cobalamin status, and astroglial reaction. Lab. Invest. 72, (1995), págs.114-123).

Criterios de valoración

Evaluación clínica

Empezando a partir del día 7 tras la inmunización, se examinaron los animales individualmente para determinar la presencia de parálisis según la siguiente puntuación: 0 = ningún signo de enfermedad; 0,5 = parálisis parcial de la cola; 1 = parálisis de la cola; 1,5 = parálisis de la cola parálisis parcial de extremidad trasera unilateral; 2 = parálisis de la cola debilidad de extremidades traseras o parálisis parcial de extremidades traseras; 2,5 = parálisis de la cola parálisis parcial de extremidades traseras (pelvis bajada); 3 = parálisis de la cola parálisis completa de extremidades traseras; 3,5 = parálisis de la cola parálisis completa de extremidades traseras incontinencia; 4 = parálisis de la cola parálisis de extremidades traseras debilidad o parálisis parcial de extremidades delanteras; 5 = moribundo o muerto (Donia M, Mangano K, Quattrocchi C, Fagone P, Signorelli S, Magro G, Sfacteria A, Bendtzen K, Nicoletti F. Specific and strain-independent effects of dexamethasone in the prevention and treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis in rodents. Scand J Immunol. Noviembre de 2010; 72(5): 396-407). Se monitorizaron diariamente los signos clínicos y se monitorizó el peso corporal tres veces por semana. Los ratones que alcanzaron una puntuación de 4 y/o perdieron más del 20% de su peso corporal se monitorizaron diariamente por el veterinario y se trataron por vía subcutánea con solución salina y, si era necesario, se sacrificaron de manera ética. Las lecturas clínicas para este estudio incluyen la puntuación clínica, puntuación acumulativa, incidencia, duración y aparición de la enfermedad y variación del peso corporal a lo largo de todo el periodo del estudio.

Análisis histológico

Se sacrificaron los ratones y se resecaron el cerebro y las médulas espinales y se almacenaron en formaldehído al 4% (Sigma, Milán, Italia) a 4°C durante 24 h. Para evaluar la inflamación, se tiñeron secciones transversales de 5 pm en serie con hematoxilina y eosina (H&E) (Mangano K, Fagone P, Bendtzen K, Meroni PL, Quattrocchi C, Mammana S, Di Rosa M, Malaguarnera L, Coco M, Magro G, Di Marco R, Nicoletti F. Hypomethylating agent 5-aza-2'-deoxycytidine (DAC) ameliorates multiple sclerosis in mouse models. J Cell Physiol. Diciembre de 2014; 229(12): 1918 25). Se realizó una evaluación histológica semicuantitativa usando las siguientes puntuaciones basándose en la intensidad de la inflamación: 0, sin inflamación; 1, pocas células; 2, moderada, manguitos perivasculares; 3, infiltrados celulares inflamatorios densos, necrosis parenquimal (Mangano K, Fagone P, Bendtzen K, Meroni PL, Quattrocchi C, Mammana S, Di Rosa M, Malaguarnera L, Coco M, Magro G, Di Marco R, Nicoletti F. Hypomethylating agent 5-aza-2'-deoxycytidine (DAC) ameliorates multiple sclerosis in mouse models. J Cell Physiol. Diciembre de 2014; 229(12): 1918-25). Para evaluar la intensidad y el alcance de la desmielinización, se observó la estructura de mielina mediante tinción con azul rápido de Luxol (Lfb) (Bio-Optica) y se puntuó usando un sistema de clasificación semicuantiativo: 0 = normal; 1 = fibras desmielinizadas a menos del 25%; 2 = fibras desmielinizadas al 25-50%; 3 = fibras desmielinizadas al 50-75%; 4 = fibras desmielinizadas a más del 75% (Furlan R, Poliani PL, Galbiati F, Bergami A, Grimaldi LM, Comi G, Adorini L, Martino G. Central nervous system delivery of interleukin 4 by a non replicative herpes simplex type 1 viral vector ameliorates autoimmune demyelination. Hum Gene Ther. 20 de noviembre de 1998; 9 (1): 2605-17). Se analizaron secciones transversales de médula espinal usando un microscopio óptico (LEICA DM 2000 combinado con una cámara LEICA ICC50 HD). Se adquirieron imágenes (n = 20 imágenes de cada grupo) para la evaluación del porcentaje de desmielinización usando el software Leica Application Suite V4.2.0. Sólo se realizaron análisis histológicos en ratones sometidos a tratamiento simulado, y los grupos de ratones tratados con vehículo, EGF eod (cada dos días) a 2,5 ug/ratón y Dex.

Análisis estadístico

Los resultados se presentaron como media ± DE. Durante el estudio, se llevó a cabo una evaluación estadística inicial mediante la prueba de la T de Student. Al final del estudio, se llevó a cabo un análisis estadístico más selectivo. Se evaluaron las diferencias estadísticas en la incidencia de la enfermedad entre grupos usando la prueba exacta de Fisher para la comparación de cada grupo. Se sometieron los datos a una prueba de normalidad para la evaluación de su distribución gaussiana. Se usaron las pruebas de omnibus de Shapiro Wilk, Kolmogorov Smirnov y D'Agostino Pearson. Basándose en la distribución de los datos, se realizó o bien la prueba de la T (para datos paramétricos) o bien la prueba de Kruskal-Wallis, seguida por la prueba de comparaciones múltiples de Dunn (para datos no paramétricos). Se consideró un valor de p<0,05 para la significación estadística. Todos los análisis se realizaron usando el software Prism GraphPad v5 o Microsoft Excel.

Ejemplo 2: estudio con animales

Aunque, al comienzo del tratamiento, no se observó ningún signo clínico de EAE, tanto los datos de la bibliografía de los presentes inventores y de otros (Mangano K,et al.J Cell Physiol. (2014); 229(12): 1918-25; Donia M,et al.,Scand J Immunol. (2010); 72(5): 396-407; Eugster HP,et al.,Eur J Immunol. (1999); 29(2): 626-32), como la observación inicial de aparición de EAE en ratones de control ya a partir del 9° día tras la inmunización, indicaron que los acontecimientos encefalitogénicos inmunoinflamatorios estaban completamente en curso en el momento de iniciarse el tratamiento con EGF.

El modelo de EAE funcionó bien, aunque el transcurso clínico fue más agresivo en comparación con estudios anteriores (Mangano K,et al.,J Cell Physiol. (2014); 229(12): 1918-25; Donia M,et al.,Scand J Immunol. (2010); 72(5): 396-407) y esto debe tenerse en consideración al examinar los efectos de EGF sobre el transcurso de la enfermedad.

El tratamiento con EGF administrado cada dos días (EOD) a partir del día 7 tras la inmunización a la dosis de 10 ug/ratón, y principalmente a la dosis inferior de 2,5 ug/ratón, indujo una mejora del transcurso clínico de la enfermedad, tal como se detalla a continuación. Los ratones tratados con Dex también mostraron una fuerte mejora de las lecturas clínicas. Los ratones simulados, a los que sólo se les inyectó adyuvante de Freund sin MOG, tal como se esperaba, no desarrollaron enfermedad.

Toxicidad

El tratamiento i.p. con compuestos de prueba pareció tolerarse bien a lo largo de todo el estudio, tal como se evalúa mediante el estado clínico de los ratones y mediante la variación del peso corporal (PC) (figura 1).

Incidencia de la enfermedad

Se determinó la incidencia de la enfermedad sumando el número de animales por grupo que llegaron a mostrar una puntuación >0,5 a lo largo de todo el experimento. Las incidencias determinadas mostraron que el modelo de MOG-EAE funcionó bien. No se observó ningún efecto significativo en la incidencia de la enfermedad en grupos de ratones tratados con ambas dosis y ambos regímenes de EGF y con el fármaco de control positivo dexametasona (Dex), en comparación con ratones tratados con vehículo.

Duración de la enfermedad

La duración de la enfermedad se calculó para cada animal contando el número de días en los que el animal mostró una puntuación clínica superior a 0. Finalmente, se calculó la media para cada grupo de tratamiento. El tratamiento con EGF a la dosis de 2,5 ug/ratón administrado tanto diariamente como cada dos días (EOD) redujo significativamente la duración de la enfermedad. El tratamiento con el fármaco de control positivo dexametasona (Dex) también mostró una reducción estadísticamente significativa de la duración de la enfermedad en comparación con los ratones de control tratados con vehículo (véase la figura 2).

Aparición de la enfermedad

La aparición de la enfermedad se determinó como el primer día en el que un animal mostró una puntuación clínica >0,5. Para animales que nunca mostraron síntomas, se consideró que la aparición fue el último día de observación. La aparición de la enfermedad se retrasó significativamente en el grupo de ratones tratados con EGF 2,5 ug/ratón EOD y con el fármaco de control positivo dexametasona (Dex) en comparación con los ratones tratados con vehículo (véase la figura 3).

Puntuación clínica

Comenzaron a aparecer signos clásicos de EAE en los animales de control tratados con vehículo 9 días tras la inmunización (véase la figura 4). El tratamiento diario con EGF a la dosis de 2,5 ug redujo significativamente la puntuación clínica únicamente al comienzo de la enfermedad entre el día 14 y 16 y, a la dosis de 10 ug, desde el día 14 hasta el 16 y a los 24 y 25 días tras la inmunización. Se observaron efectos más fuertes cuando EGF se administró cada dos días, en particular, la dosis de 2,5 ug redujo significativamente la puntuación clínica desde el día 9 hasta el 11 y desde el día 21 hasta el final del estudio y la dosis superior de 10 ug redujo significativamente la puntuación clínica desde el día 9 hasta el 11 y desde el día 34 hasta el final del estudio (figura 4 y tabla 2). Dex mostró una puntuación clínica inferior significativa a lo largo de todo el periodo de tratamiento mediante análisis de Kruskal-Wallis (figura 4 y tabla 2) en comparación con ratones tratados con vehículo.

Tabla 2: análisis de Kruskal-Wallis de puntuación diaria de ratones tratados con régimen profiláctico tardío

Puntuación acumulativa

Se calculó la puntuación clínica acumulativa para cada ratón añadiendo las puntuaciones diarias desde el día de aparición (puntuación de enfermedad >0,5) hasta el final del tratamiento. El tratamiento profiláctico tardío con EGF a la dosis de 2,5 y 10 ug/ratón administrado cada dos días así como con Dex mostró una reducción de la puntuación acumulativa en comparación con el vehículo, que fue estadísticamente significativa mediante la prueba de Kruskal-Wallis (figura 5). No se observó ningún efecto significativo tras el tratamiento diario con EGF a ambas dosis.

Histología

La inflamación y la puntuación de desmielinización para cada ratón es la media redondeada de la puntuación de tres secciones del ratón respectivo. No se encontró ningún infiltrado celular en los cerebros de ratones de ninguno de los grupos experimentales. Las secciones con H&E de la médula espinal mostraron que los ratones tratados con el vehículo experimentaron infiltración de linfocitos en la sustancia blanca de SC. En cambio, las puntuaciones histológicas del daño se redujeron significativamente en ratones tratados con EGF 2,5 ug/ratón en comparación con vehículo. El tratamiento con EGF indujo una reducción significativa en la infiltración de leucocitos SC de manera similar al fármaco de control positivo dexametasona (Dex). Los ratones tratados con EGF, en comparación con el grupo tratado con Dex, también mostraron una reducción mayor del edema de la puntuación de sustancia blanca (figuras 6 y 7). Se observó la estructura de mielina mediante tinción con azul rápido de Luxol (Lfb) (Bio-Optica) y seguida por puntuación para analizar el grado de desmielinización. Se detectó desmielinización intensa en el grupo tratado con el vehículo (figuras 8 y 9). La administración de EGF y Dex redujo significativamente el grado de desmielinización en comparación con el grupo tratado con el vehículo.

La cita de las patentes, solicitudes de patente, publicaciones y documentos anteriores no es una admisión de que ninguno de los anteriores constituyan técnica anterior pertinente, ni constituye ninguna admisión en cuanto al contenido o la fecha de estas publicaciones o documentos. Su cita no es una indicación de una búsqueda de divulgaciones relevantes. Todas las afirmaciones referentes a la(s) fecha(s) o contenido de los documentos se basan en información disponible y no constituyen una admisión en cuanto a su precisión o exactitud.

El término “un” o “una” puede referirse a uno o una pluralidad de los elementos que modifica (por ejemplo, “un portador” puede significar uno o más portadores) a menos que quede claro por el contexto que se describe o bien uno de los elementos o bien más de uno de los elementos. El término “aproximadamente” tal como se usa en el presente documento se refiere a un valor dentro del 10% del parámetro subyacente (es decir, más o menos el 10%), y el uso del término “aproximadamente” al comienzo de una cadena de valores modifica a cada uno de los valores (es decir, “aproximadamente 1,2 y 3” se refiere a aproximadamente 1, aproximadamente 2 y aproximadamente 3). Por ejemplo, un peso de “aproximadamente 100 gramos” puede incluir pesos entre 90 gramos y 110 gramos. Además, cuando se describe una lista de valores en el presente documento (por ejemplo, aproximadamente el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 85% o el 86%) la lista incluye todos los valores intermedios y fraccionales de los mismos (por ejemplo, el 54%, el 85,4%).

En la(s) siguiente(s) reivindicación/reivindicaciones se exponen determinadas realizaciones de la tecnología.

Claims

REIVINDICACIONES

i.(Poli)péptido que tiene actividad de factor de crecimiento epidérmico (EGF) o ácido nucleico que codifica para dicho (poli)péptido para su uso en el tratamiento o la prevención de un trastorno desmielinizante inflamatorio, en el que el (poli)péptido

(a) comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y/o

(b) comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en al menos el 66% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y/o

(c) comprende o consiste en un fragmento de (a) o (b); y

en el que el (poli)péptido o ácido nucleico es el único agente farmacéuticamente activo que va a administrarse.
2. (Poli)péptido o ácido nucleico para su uso según la reivindicación 1, en el que el fragmento de (a) comprende o consiste en SEQ ID NO: 2.
3. (Poli)péptido o ácido nucleico para su uso según la reivindicación 1 o 2, en el que tiene que administrarse una cantidad eficaz del (poli)péptido a un sujeto que lo necesita de una vez cada 36 horas a una vez cada 60 horas.
4. (Poli)péptido para su uso según la reivindicación 1 o 2, en el que el (poli)péptido tiene que administrarse de una vez cada 44 horas a una vez cada 52 horas.
5. (Poli)péptido para su uso según la reivindicación 1 o 2, en el que el (poli)péptido tiene que administrarse una vez cada aproximadamente 48 horas.
6. (Poli)péptido para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el (poli)péptido tiene que administrase durante un periodo de al menos 20 días, preferiblemente al menos 30 días, más preferiblemente al menos 40 días.
7. (Poli)péptido para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el (poli)péptido tiene que administrarse a una dosis de entre 100 pg/kg de peso corporal y 2000 pg/kg de peso corporal.
8. (Poli)péptido para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el trastorno desmielinizante inflamatorio es un trastorno mielinoclástico.
9. (Poli)péptido para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el trastorno desmielinizante inflamatorio es un trastorno del sistema nervioso central (CNS).
10. (Poli)péptido para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el trastorno desmielinizante inflamatorio es una enfermedad inmunitaria, preferiblemente una enfermedad autoinmunitaria.
11. (Poli)péptido para su uso según la reivindicación 10, en el que la enfermedad inmunitaria es

(a) esclerosis múltiple (MS);

(b) síndrome de Guillain-Barré (GBS); o

(c) polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP).
12. (Poli)péptido para su uso según la reivindicación 11, en el que la MS es del fenotipo

(a) síndrome clínico aislado (CIS);

(b) MS progresiva primaria (PPMS);

(c) MS progresiva secundaria (SPMS);

(d) MS recurrente-remitente (RRSS); o

(e) una forma intermedia de cualquier combinación de (a) a (d).
13.(Poli)péptido para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y 9, en el que el trastorno desmielinizante inflamatorio está asociado con una escasez o deficiencia de

(a) factor de crecimiento epidérmico (EGF); y/o

(b) cobalamina (vitamina B12).