CN110179824A - 一种通过免疫调控治疗ii型糖尿病的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种通过免疫调控治疗II型糖尿病的新方法。具体地，本发明提供了一种物质或化合物的用途，所述物质或化合物被用于制备一药物组合物或制剂，所述药物组合物或制剂用于：(i)增强机体对胰岛素的敏感性；(ii)抑制炎症；(iii)上调机体内巨噬细胞中M2/M1型巨噬细胞的比例；和/或(iv)抑制机体的T细胞免疫反应；其中，所述物质或化合物选自下组：(a)高表达CD73的调节性T细胞；(b)腺苷；(c)腺苷受体A_2A激动剂；或其组合。本发明还提供了一种增强机体对胰岛素的敏感性、抑制机体炎症、上调机体内巨噬细胞M2/M1的比例，和/或抑制机体的免疫反应的方法。使用本发明的方法，可显著缓解炎症和/或增强细胞对胰岛素的敏感性。

Description

一种通过免疫调控治疗II型糖尿病的新方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种通过免疫调控治疗II型糖尿病的新方法。

背景技术

糖尿病是一组以糖代谢异常为特征的由不同病理生理改变组成的综合征，不同患者之间具有较大的异质性，而其主要的两种病理生理改变为胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗。

现在约有九千两百万成年人患有II型糖尿病。虽然营养状况和生活方式的改变、肥胖发病率的增加等是导致II型糖尿病发病率增加的重要因素，遗传因素同样有着不可或缺的作用。在过去几十年里，中国的II型糖尿病发病率显著升高。研究表明，包括中国汉族人群在内的东亚人群，其II型糖尿病的遗传易感性高于西方人群。

糖尿病的传统治疗方法有一系列的负面作用，包括：增加体重、低血糖症、促进炎症、骨折、胃肠道症状、生殖系统感染等。

目前，对II型糖尿病的治疗手段和相应的负面作用如下：

1).钠离子依耐型葡萄糖共转运体抑制剂类药物(Sodium-dependent glucoseco-transporter inhibitors)，负面作用：生殖系统感染等；

2).噻唑烷二酮类药物(Thiazolidinediones)，负面作用：体重增加和骨折等；

3).磺脲类药物(Sulphonylureas)，负面作用：低血糖症和体重增加等；

4).二甲双胍(Metformin)给药，负面作用：胃肠道症状等；

5).胰岛素(Insulin)给药，负面作用：低血糖症、体重增加和炎症反应等。

当下针对II型糖尿病的临床实验主要通过靶向巨噬细胞相关促炎因子及其受体，包括IL-1β、IL1R、TNF-α等，II型糖尿病的免疫治疗获得了不错的疗效。但基于调节性T细胞的II型糖尿病免疫治疗方法，目前仍缺少概念验证研究。

因此，本领域迫切需要开发一种治疗II型糖尿病的靶点明确、高效的免疫治疗方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种治疗II型糖尿病的靶点明确、高效的免疫治疗方法。

本发明提供了一种利用高表达CD73的调节性T(Treg)细胞并联合腺苷或腺苷受体A_2A激动剂治疗糖尿病的方法。具体地，本发明提供了利用高表达CD73的调节性T细胞治疗糖尿病的新方法，包括抑制组织中炎症反应及炎症引发的组织损伤、增强胰岛素敏感性、上调体内组织中M2/M1型巨噬细胞的比例、抑制T细胞免疫反应。同时，免疫抑制型天然小分子代谢产物腺苷及腺苷A_2A型受体激动剂可作为细胞治疗的辅助性药物，在糖尿病治疗中协助抑制炎症反应。

在本发明的第一方面，提供了一种物质或化合物的用途，所述物质或化合物被用于制备一药物组合物或制剂，所述药物组合物或制剂用于：(i)增强机体对胰岛素的敏感性；(ii)抑制炎症；(iii)上调机体内巨噬细胞中M2/M1型巨噬细胞的比例；和/或(iv)抑制机体的T细胞免疫反应；

其中，所述物质或化合物选自下组：(a)高表达CD73的调节性T细胞；(b)腺苷；(c)腺苷受体A_2A激动剂；或其组合。

在另一优选例中，所述机体包括哺乳动物。

在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括：啮齿动物(如大鼠、小鼠)、灵长动物(如猴)。

在另一优选例中，所述抑制炎症包括抑制炎症细胞因子、抑制促炎分子或抑制趋化因子。

在另一优选例中，所述炎症包括选自下组的组织中的炎症：脂肪组织、肝脏组织、肌肉组织、皮肤组织、胰腺组织、肺组织、血管、心脏、骨骼、大脑、脊髓、视网膜、胃肠道组织、生殖系统，或其组合。

在另一优选例中，所述炎症为脂肪组织中的炎症或糖尿病其余病变组织中的炎症。。

在另一优选例中，所述炎症细胞因子、促炎分子或趋化因子选自下组：IL-2、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IL-1α、IL-3、IL-17F、IL-19、IL-22、IL-23、IL-24、IL-26、IL-31、IL-32、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、LIF、LT-α、LT-β、41BBL、CD40L、CD27L、CD30L、IL-6、IL-7、IL-12、IL-21、MCP-1、脂联素(Adiponectin)、瘦素(Leptin)、MMP家族、胰岛素(Insulin)、GM-CSF、ADAMTS-4、ADAMTS-5、穿孔蛋白(Perforin)、颗粒酶B(Granzyme B)、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、内脂素(Visfatin)、抵抗素(Resistin)、PAI-1、G-CSF、CCL-2，或其组合。

在另一优选例中，所述巨噬细胞为选自下组的组织的巨噬细胞：脂肪组织、肝脏组织、肌肉组织、皮肤组织、胰腺组织、肺组织、血管、心脏、骨骼、大脑、脊髓、视网膜、胃肠道组织、生殖系统，或其组合。

在另一优选例中，所述上调机体内巨噬细胞M2/M1的比例包括上调脂肪组织中M2/M1的比例。

在另一优选例中，所述抑制机体的免疫反应包括分泌更多的免疫抑制性细胞因子或代谢调控分子。

在另一优选例中，所述免疫抑制性细胞因子或代谢调控分子包括：IL-10、IL-1RA、IL-20、IL17E、IL-33、IL-35、IL-37、TSLP、、IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、TGF-β、IL-18、Methionine-enkephalin(MetEnk)、GDF-15，或其组合。

在另一优选例中，所述抑制机体的免疫反应包括抑制选自下组的T细胞的数量：类似I型辅助性T细胞(Th1)、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、NK细胞、NKT细胞、M1巨噬细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、B细胞、γδT细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、ILC-1细胞、ILC-3细胞、朗格汉斯细胞、肥大细胞，或其组合。

在另一优选例中，所述CD73来源于人。

在另一优选例中，所述“高表达CD73”是指，所述调节性T细胞中CD73表达量(或表达水平)E1与正常T细胞CD73表达量(或表达水平)E0的比值，即E1/E0≥1.5，较佳地E1/E0≥2，更佳地≥2.5，更佳地≥3，更佳地≥4。

在另一优选例中，所述“高表达CD73”是指与正常T细胞相比，本发明所述调节性T细胞的CD73表达量或表达水平至少提高了50％，较佳地，至少提高了100％，更佳至少提高了150％、200％、250％或300％。

在另一优选例中，所述正常T细胞包括未经过改造的正常T细胞。

在另一优选例中，所述“正常T细胞CD73表达量(或表达水平)E0”为未经过CD73表达改造的T细胞的CD73表达量(或表达水平)。

在另一优选例中，所述“高表达CD73”是指所述调节性T细胞在导入外源性CD73基因或蛋白、和/或调节内源CD73基因表达后，总CD73的表达水平较导入或调节前提高了50％以上，较佳地≥100％，更佳地≥200％。

在另一优选例中，所述调节性T细胞被导入外源性CD73基因或蛋白、被上调表达内源性CD73基因、或其组合。

在另一优选例中，所述上调表达内源性CD73基因包括上调CD73基因的转录水平和/或翻译水平。

在另一优选例中，所述“调节性T细胞高表达CD73”可通过以下方法之一或组合实现：在所述调节性T细胞中表达CD73基因，和/或增加所述调节性T细胞中CD73基因的拷贝数，和/或改造CD73基因的调控序列(如启动子)以增强转录速度(如转录启动速度)，和/或修改携带有CD73基因的信使RNA的翻译调控区以增强翻译强度，和/或修改CD73基因本身以增强mRNA稳定性、蛋白质稳定性、解除蛋白质的反馈抑制，和/或添加外源物质以增强CD73基因的转录速度(如转录启动速度)和/或翻译强度。

在另一优选例中，所述调节性T细胞高表达CD73是通过提高内源性CD73基因的增强子和/或启动子的活性来实现的。

在另一优选例中，所述调节性T细胞高表达CD73是通过导入外源性CD73来实现的。

在另一优选例中，所述调节性T细胞高表达的CD73是外源性CD73。

在另一优选例中，所述CD73的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

在另一优选例中，所述编码CD73的核苷酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4所示。

在另一优选例中，所述调节性T细胞可以是所述机体的自体细胞或是所述机体的异体细胞。

在另一优选例中，所述腺苷受体A_2A激动剂包括：小分子化合物、多肽、单克隆抗体、双或多靶点特异性抗体、代谢产物、核酸分子及其修饰物、脂类分子及其蛋白修饰物、糖类分子及其蛋白修饰物，或其组合。

在另一优选例中，所述腺苷受体A_2A激动剂为如式I所示的化合物：

式中，

R1、R2和R3各自独立地为选自下组的基团：H、卤素、-OH、-NH₂、取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的C6-C10芳基、取代或未取代的5-12元杂芳基、取代或未取代的5-8元杂环基、取代或未取代的-C1-C10亚烷基-C6-C10芳基、取代或未取代的-C1-C10亚烷基-5-12元杂芳基；

除非特别说明，所述的“取代”指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代(优选1-3个氢原子被取代)：卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C3-C6环烷基、苯基、苄基、C1-C4烷氧基、-OH、-NH₂。

在另一优选例中，所述的腺苷受体A_2A激动剂为如式II所示的化合物：

在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：

(i)第一活性成分，所述第一活性成分包括(a)高表达CD73的调节性T细胞；

(ii)任选的第二活性成分，所述第二活性成分选自下组：(b)腺苷；(c)腺苷受体A_2A激动剂；

(iii)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一优选例中，所述第一活性成分占所述药物组合物总重量的0.1-99.9wt％,较佳地10-99.9wt％，更佳地70％-99.9wt％。

在另一优选例中，所述第二活性成分占所述药物组合物总重量的0.1-99.9wt％,较佳地10-99.9wt％，更佳地70％-99.9wt％。

在另一优选例中，所述第一活性成分和第二活性成分的重量比为1:100至100：1，较佳地为1:10至10：1。

在另一优选例中，所述产品组合中，所述组分(i)和组分(ii)占所述产品组合总重的0.01-99.99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。

在另一优选例中，所述药物组合物是液态剂型。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为口服剂型或注射剂，优选地为注射剂。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：输液剂载体和/或注射剂载体，较佳地，所述的载体是选自下组的一种或多种载体：生理盐水、葡萄糖盐水、或其组合。

在另一优选例中，所述制剂中所述高表达CD73的调节性T细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，较佳地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在本发明的第三方面，提供了一种赋予或提高调节性T细胞抑制免疫反应能力的方法，包括步骤：

(a)提供一待改造的调节性T细胞；和

(b)对所述调节性T细胞进行改造或进一步分选富集，从而使得所述调节性T细胞高表达CD73。

在另一优选例中，步骤(a)包括分选并扩增所述调节性T细胞。

在另一优选例中，步骤(b)包括上调所述调节性T细胞的CD73表达。

在另一优选例中，所述“高表达CD73”或“上调CD73表达”是指，所述调节性T细胞中CD73表达量(或表达水平)E1与正常T细胞CD73表达量(或表达水平)E0的比值，即E1/E0≥1.5，较佳地E1/E0≥2，更佳地≥2.5，更佳地≥3，更佳地≥4。

在另一优选例中，所述“高表达CD73”或“上调CD73表达”是指，与正常T细胞相比，所述调节性T细胞的CD73表达量或表达水平至少提高了50％，较佳地，至少提高了100％，更佳至少提高了150％、200％、250％或300％。

在另一优选例中，所述“赋予”或“提高”调节性T细胞抑制免疫反应能力指的是经过改造后，原先不具备抑制免疫反应的调节性T细胞具有了抑制免疫反应能力，和/或原先抑制免疫反应能力较差的调节性T细胞具有了增强的抑制免疫反应能力。

在另一优选例中，使得所述调节性T细胞高表达CD73包括：

(1)在所述调节性T细胞中导入外源性CD73基因；和/或

(2)上调表达所述调节性T细胞中内源性CD73基因。

在另一优选例中，所述上调表达内源性CD73基因包括上调CD73基因的转录水平和/或翻译水平。

在另一优选例中，所述步骤(b)可通过以下方法之一或组合实现：在所述调节性T细胞中表达CD73基因，和/或增加所述调节性T细胞中CD73基因的拷贝数，和/或改造CD73基因的调控序列(如启动子)以增强转录速度(如转录启动速度)，和/或修改携带有CD73基因的信使RNA的翻译调控区以增强翻译强度，和/或修改CD73基因本身以增强mRNA稳定性、蛋白质稳定性、解除蛋白质的反馈抑制，和/或添加外源物质以增强CD73基因的转录速度(如转录启动速度)和/或翻译强度。

在另一优选例中，所述方法为体外方法。

在另一优选例中，所述步骤(b)包括提高内源CD73基因的增强子和/或启动子的活性。

在另一优选例中，所述步骤(b)包括添加外源物质(如信号通路调控分子或CRISPR/dCas9介导的基因活化分子)以增强内源CD73基因的增强子和/或启动子的活性。

在另一优选例中，所述步骤(b)包括导入外源性CD73和/或表达外源性CD73。

在另一优选例中，所述调节性T细胞高表达的CD73是外源性CD73。

在另一优选例中，所述步骤(b)包括：

(b1)提供携带外源性CD73基因的表达载体；

(b2)将所述的表达载体转入所述调节性T细胞中，得到重组细胞株；和

(b3)培养所述的重组细胞株。

在另一优选例中，所述步骤(b)包括：将调节性T细胞与含有外源性CD73基因的载体、或促进内源CD73基因表达的物质接触，从而使调节性T细胞中的CD73表达上调，较佳地是CD73表达提高至少50％，更佳地提高至少100％，更佳地提高至少200％。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

(c)检测步骤(b)中得到的调节性T细胞的CD73基因和蛋白表达水平；和/或

(d)检测步骤(b)中得到的调节性T细胞对免疫反应的抑制能力。

在另一优选例中，所述步骤(d)包括检测免疫抑制性细胞因子或代谢调控因子的表达水平。

在另一优选例中，所述免疫抑制性细胞因子或代谢调控因子包括：IL-10、IL-1RA、IL-20、IL17E、IL-33、IL-35、IL-37、TSLP、、IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、TGF-β、IL-18、蛋氨酸-脑啡肽(MetEnk)或GDF-15。

在本发明的第四方面，提供了一种增强机体对胰岛素的敏感性、抑制机体炎症、上调机体内巨噬细胞M2/M1的比例，和/或抑制机体的免疫反应的方法，包括向需要的对象施用如本发明第三方面所述的药物组合物。

在本发明的第五方面，提供了一种调节性T细胞中CD73的检测试剂的用途，用于制备一试剂盒，所述试剂盒用于诊断或预后II性糖尿病。

在另一优选例中，所述的调节性T细胞中CD73的检测试剂包括：CD73的蛋白检测试剂和核酸检测试剂。

在另一优选例中，所述CD73的蛋白检测试剂包括特异性抗体。

在另一优选例中，所述CD73的核酸检测试剂包括：核酸探针、核酸引物、DNA聚合酶、逆转录酶，或其组合。

在另一优选例中，所述诊断包括检测调节性T细胞中的CD73的蛋白和/或核酸的表达量。

在另一优选例中，所述诊断包括血液检测、血清检测或组织检测。

在另一优选例中，所述的诊断包括辅助诊断、早期诊断、或其组合。

在另一优选例中，所述节性T细胞中的CD73的表达量低于正常值50％时，可作为II性糖尿病的辅助指标。

在另一优选例中，所述CD73在调节性T细胞中的表达量低于正常值70％时，可诊断为II性糖尿病。

在另一优选例中，在所述的试剂盒中，含有正常CD73表达量的调节性T细胞作为阳性标准品。

在另一优选例中，所述“正常CD73表达量的调节性T细胞”是指来自未患病机体的未经过CD73表达改造的调节性T细胞。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了胰岛素诱导累积CD73^low脂肪调节性T细胞。SAT：皮下脂肪；VAT：内脏脂肪；MFI：平均荧光强度。

其中，a显示了野生型小鼠每天接受腹腔注射PBS或者胰岛素(0.5U/Kg)，持续两个月后，CD4⁺Foxp3⁺T细胞分别在PBS处理组野生型小鼠(n＝6)和胰岛素处理组野生型(n＝6)小鼠中皮下脂肪组织(SAT)和内脏脂肪组织(VAT)占比的代表图。

b显示了CD73和CD39分别在PBS处理组野生型小鼠(n＝6)和胰岛素处理组野生型(n＝6)小鼠中皮下脂肪组织(SAT)和内脏脂肪组织(VAT)来源的调节性T细胞中表达量的代表柱状图。

c显示了图b中CD73和CD39于FOXP3⁺调节性T细胞的平均荧光强度。

d显示了PBS处理组野生型小鼠(n＝6)和胰岛素处理组野生型(n＝6)小鼠的葡萄糖(上)和胰岛素(下)耐量试验的结果。

小水平线代表均值(±标准差).*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001,通过t检验计算得。ns,无显著差异。

图2显示了CD73^hi脂肪调节性T细胞对于胰岛素抵抗的保护作用。

其中，a和b中，脂肪CD4⁺CD25-YFP-Teff细胞分选自野生型小鼠，标记CellTraceViolet染料。如上标记的应答T细胞与自野生型小鼠分选的CD4⁺CD25^hiYFP⁺CD73^hi脂肪调节性T细胞或CD4⁺CD25^hiYFP⁺CD73^low脂肪调节性T细胞共培养。细胞混合体系使用anti-CD3/CD28抗体偶联磁珠刺激，应答细胞的增殖于三天后测定。后进一步测定增殖的应答Teff细胞比例。

c和d显示了IFN-γ⁺细胞在野生型小鼠(n＝6)皮下脂肪组织(SAT)和内脏脂肪组织(VAT)来源的CD73^hi和CD73^low CD4⁺Foxp3⁺调节性T细胞中所占比代表图。

e和f中，Rag1^-/-小鼠接受过继性输入10⁵脂肪CD4⁺T细胞或者合并2×10⁴CD73^hi或CD73^low脂肪调节性T细胞治疗。小鼠每两周接受过继性输入脂肪调节性T细胞治疗，持续6周。8周后，小鼠进行葡萄糖(e)和胰岛素(f)耐量试验，图e和f显示了测试结果。

小水平线代表均值(±标准差).*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001,通过t检验计算得。ns,无显著差异。

图3显示了腺苷或者腺苷受体A_2A receptor激动剂CGS21680直接抑制Th1细胞和M1型巨噬细胞的免疫反应。

其中，a、b和c中显示了腺苷(10μM)或者腺苷受体A_2A receptor激动剂(1μM)处理Th1细胞后，炎性细胞因子IL-2和IFN-γ的表达情况和所占比例。

d和e显示了腺苷(10μM)或者腺苷受体A_2A receptor激动剂(1μM)处理M0型巨噬细胞后，CD206分子的表达量。

f和g显示了腺苷或者腺苷受体A_2A receptor激动剂处理M0型巨噬细胞后，细胞上清中细胞因子IL-1β和IL-10的表达量。

小水平线代表均值(±标准差).*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001,通过t检验计算得。ns,无显著差异。

图4显示了腺苷或者腺苷受体A_2A receptor激动剂CGS21680显著抑制脂肪组织CD4⁺效应性T细胞和巨噬细胞介导的炎症反应。

其中，a、b和c显示了腺苷或者腺苷受体A_2A receptor激动剂处理小鼠后，脂肪组织CD4⁺Teff细胞中炎性细胞因子IL-2，IFN-γ，IL-4和IL-17A的表达情况和所占比例。

d和e显示了腺苷或者腺苷受体A_2A receptor激动剂处理小鼠后，脂肪组织M1型和M2型巨噬细胞所占比例。

f和g显示了腺苷或者腺苷受体A_2A receptor激动剂处理小鼠后，脂肪组织巨噬细胞中CD206的表达量。

h和i显示了腺苷或者腺苷受体A_2A receptor激动剂处理小鼠后，进行葡萄糖(左)和胰岛素(右)耐量试验。

小水平线代表均值(±标准差).*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001,通过t检验计算得。ns,无显著差异。

图5显示了针对糖尿病的高表达CD73的调节性T细胞的一种可行的细胞治疗方案。从糖尿病患者外周血中分选获得调节性T细胞，并在体外扩增调节性T细胞。从扩增的调节性T细胞中，进一步分选富集出高表达CD73的调节性T细胞亚群，并回输糖尿病患者体内。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次意外地开发了一种通过免疫调控治疗II型糖尿病的方法。实验证明，将脂肪组织CD4⁺T细胞共同与CD73^hi脂肪调节性T细胞过继性输入Rag1^-/-小鼠体内，进行持续6周的治疗；结果表明，8周后，Rag1^-/-小鼠对胰岛素的敏感性显著提高。并且，本发明人向8周龄的野生型小鼠腹腔注射腺苷或者腺苷受体A_2A receptor激动剂CGS21680(1mg/kg)，60天后收集小鼠的皮下脂肪组织和内脏脂肪组织，分析效应性T细胞和巨噬细胞的炎症反应；结果表明，体内注射腺苷或者腺苷受体A_2Areceptor激动剂CGS21680，能显著抑制脂肪组织CD4⁺Teff细胞和巨噬细胞的免疫反应，并且小鼠血液中葡萄糖波动水平明显降低，并且小鼠展现出更强的胰岛素敏感性。在此基础上完成了本发明。

在具体的实施方式中，具体机制如下：高表达CD73的调节性T(Treg)细胞通过催化水解促进炎症的三磷酸腺苷(ATP)分子成为腺苷(Adenosine)，靶向作用于表达腺苷A_2A型受体的免疫细胞，激活腺苷A_2A型受体下游信号通路，从而抑制免疫细胞的激活，达到抑制长期慢性炎症或自身免疫反应的效果。

实验证明，使用本发明的方法不仅能抑制II型糖尿病相关的慢性炎症反应，对于I型糖尿病中的过度激活的自身免疫反应也具有潜在抑制效果，也具有潜在保护作用。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。

术语“给予”或“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。

如本文所用，术语“高表达CD73的调节性T细胞”、“CD73^hi Treg细胞”、“CD73^hi脂肪调节性T细胞”和“高表达Cd73的Treg细胞”可互换使用，是指本发明所述的CD73高表达的调节性T细胞。

如本文所用，术语“低表达CD73的调节性T细胞”、“CD73^low Treg细胞”、“CD73^low脂肪调节性T细胞”和“低表达Cd73的调节性T细胞”可互换使用，是指本发明所述的CD73低表达的调节性T细胞。

调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)

T细胞参与细胞免疫，是淋巴细胞的主要组分，它具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等，是身体中为抵御疾病感染、肿瘤而形成的英勇斗士。T细胞产生的免疫应答是细胞免疫，细胞免疫的效应形式主要有两种：与靶细胞特异性结合，破坏靶细胞膜，直接杀伤靶细胞；另一种是释放淋巴因子，最终使免疫效应扩大和增强。

T细胞按照功能和表面标志可以分成很多种类，目前，接受较为广泛的T细胞分类如下：

细胞毒T细胞(cytotoxic T cell)：消灭受感染的细胞。这些细胞的功能就像一个“杀手”或细胞毒素，因为它们可以对产生特殊抗原反应的目标细胞进行杀灭。细胞毒T细胞的主要表面标志是CD8，也被称为杀手T细胞(NK细胞)。CD8⁺T细胞，其表面表达CD8，可以通过MHCI与抗原直接结合参与免疫应答。

辅助T细胞(helper T cell)在免疫反应中扮演中间过程的角色：它可以增生扩散来激活其它类型的产生直接免疫反应的免疫细胞。辅助T细胞的主要表面标志是CD4。T细胞调控或“辅助”其它淋巴细胞发挥功能。它们是已知的HIV的目标细胞，在艾滋病发病时会急剧减少。CD4⁺T细胞，在表面表达CD4(cluster of differentiation 4)，通过与MHCⅡ(主要组织相容性复合体，majorhistocompatibility complex)递呈的多肽抗原反应被激活。一旦激活，可以分泌细胞因子，调节或者协助免疫反应。

调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)：负责调节机体免疫反应。通常起着维持自身耐受和避免免疫反应过度损伤机体的重要作用。调节/抑制T细胞有很多种。

记忆T细胞(memory T cell)：在再次免疫应答中起重要作用。记忆T细胞由于暂时没有非常特异的表面标志，还有很多未知之处。

调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)是一类具有独特免疫调节功能的T细胞，在肿瘤免疫、抗感染免疫、免疫病理、移植物耐受、阻止自身免疫反应和维持机体免疫平衡等方面具有重要意义。

Treg细胞在体内外具有调节功能，根据其表面标记、产生的细胞因子和作用机制的不同，Treg细胞可分为CD4⁺Th3、CD4⁺Tr1、CD4⁺CD25⁺Treg、CD4-CD8⁺Ts和NKT(自然杀伤性T细胞)等多种亚型。在这些种类繁多的调节性T细胞中，CD4⁺CD25⁺Treg细胞处于极为重要的地位。CD4⁺CD25⁺Treg细胞具有免疫无能性和免疫抑制性两大功能特征，其免疫无能性表现在对高浓度IL-2的单独刺激、固相包被或可溶性抗CD3单抗或抗CD3和抗CD28单抗的联合作用呈无应答状态，也不分泌IL-2，也就是说CD4⁺CD25⁺Treg细胞对所有传统的T细胞受体(T-cell receptor，TCR)介导的实验性刺激因素均表现为无能性。而免疫抑制性则表现在活化后能够强有力地抑制CD4⁺和CD8⁺效应T淋巴细胞的活化、增殖及功能，这种免疫抑制不具有MHC限制性。

机体肿瘤状态时Treg细胞往往呈升高趋势，Treg是具有能识别靶细胞MHC分子所提呈的TCR自身抗原肽，并能发挥一定的免疫抑制功能的T细胞。它作为一种专职的Treg细胞亚群，主要发挥免疫抑制功能，通过下调机体对外来抗原或自身抗原的免疫应答水平，来维持自身耐受。

Treg细胞发挥抑制作用的分子基础主要由：

(1)通过CTLA4依赖的直接细胞接触抑制方式来抑制效应细胞的功能；

(2)分泌抑制性细胞因子如TGF-β或IL-10来抑制CD4⁺T细胞的活化和增殖，或者CD8⁺效应细胞及前体；

(3)作用APC增加色氨酸新陈代谢来抑制CD4⁺T细胞的活化和增殖；

(4)Treg细胞形成使效应细胞转变成免疫抑制细胞的微环境，使一些CD4⁺CD25T细胞能被CD4⁺CD25⁺Treg诱导并分泌TGF-β或IL-10。

Treg细胞可能还依赖这种局部微环境干扰CD8+T细胞的增殖、细胞因子的分泌和细胞毒作用的能力。同时，Treg细胞的增加可以促进肿瘤的生长，抑制肿瘤免疫效应。Treg细胞介导的免疫抑制干预了免疫应答的各个阶段。

本发明物质或化合物的用途

在本发明的一个方面，提供了一种物质或化合物的用途，所述物质或化合物被用于制备一药物组合物或制剂，所述药物组合物或制剂用于：(i)增强机体对胰岛素的敏感性；(ii)抑制炎症；(iii)上调机体内巨噬细胞中M2/M1型巨噬细胞的比例；和/或(iv)抑制机体的T细胞免疫反应；其中，所述物质或化合物选自下组：(a)高表达CD73的调节性T细胞；(b)腺苷；(c)腺苷受体A_2A激动剂；或其组合。

高表达CD73的调节性T(Treg)细胞通过催化水解促进炎症的三磷酸腺苷(ATP)分子成为腺苷(Adenosine)，靶向作用于表达腺苷A_2A型受体的免疫细胞，激活腺苷A_2A型受体下游信号通路，从而抑制免疫细胞的激活，达到抑制长期慢性炎症或自身免疫反应的效果。

其中，所述机体包括哺乳动物。在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人或非人哺乳动物。在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括：啮齿动物(如大鼠、小鼠)、灵长动物(如猴)。

在本发明的一个实施方式中，所述抑制炎症包括抑制炎症细胞因子、抑制促炎分子或抑制趋化因子。所述炎症包括选自下组的组织中的炎症：脂肪组织、肝脏组织、肌肉组织、皮肤组织、胰腺组织、肺组织、血管、心脏、骨骼、大脑、脊髓、视网膜、胃肠道组织、生殖系统，或其组合。在一个优选的实施方式中，所述炎症为脂肪组织中的炎症。

优选地，所述炎症细胞因子、促炎分子或趋化因子选自下组：IL-2、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IL-1α、IL-3、IL-17F、IL-19、IL-22、IL-23、IL-24、IL-26、IL-31、IL-32、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、LIF、LT-α、LT-β、41BBL、CD40L、CD27L、CD30L、IL-6、IL-7、IL-12、IL-21、MCP-1、脂联素(Adiponectin)、瘦素(Leptin)、MMP家族、胰岛素(Insulin)、GM-CSF、ADAMTS-4、ADAMTS-5、穿孔蛋白(Perforin)、颗粒酶B(GranzymeB)、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、内脂素(Visfatin)、抵抗素(Resistin)、PAI-1、G-CSF、CCL-2，或其组合。

在本发明的一个实施方式中，所述巨噬细胞为选自下组的组织的巨噬细胞：脂肪组织、肝脏组织、肌肉组织、皮肤组织、胰腺组织、肺组织、血管、心脏、骨骼、大脑、脊髓、视网膜、胃肠道组织、生殖系统，或其组合。优选地，所述上调机体内巨噬细胞M2/M1的比例包括上调脂肪组织中M2/M1的比例。

在本发明的一个实施方式中，所述抑制机体的免疫反应包括分泌更多的免疫抑制性细胞因子或代谢调控分子。优选地，所述免疫抑制性细胞因子或代谢调控分子包括：IL-10、IL-1RA、IL-20、IL17E、IL-33、IL-35、IL-37、TSLP、、IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、TGF-β、IL-18、Methionine-enkephalin(MetEnk)、GDF-15，或其组合。

优选地，所述抑制机体的免疫反应包括抑制选自下组的T细胞的数量：类似I型辅助性T细胞(Th1)、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、NK细胞、NKT细胞、M1巨噬细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、B细胞、γδT细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、ILC-1细胞、ILC-3细胞、朗格汉斯细胞、肥大细胞，或其组合。

在一个优选的实施方式中，所述CD73来源于人。

优选地，所述“高表达CD73”是指，所述调节性T细胞中CD73表达量(或表达水平)E1与正常T细胞CD73表达量(或表达水平)E0的比值，即E1/E0≥1.5，较佳地E1/E0≥2，更佳地≥2.5，更佳地≥3，更佳地≥4。所述“高表达CD73”是指与正常T细胞相比，本发明所述调节性T细胞的CD73表达量或表达水平至少提高了50％，较佳地，至少提高了100％，更佳至少提高了150％、200％、250％或300％。

在本发明中，所述正常T细胞包括未经过改造的正常T细胞。优选地，所述“正常T细胞CD73表达量(或表达水平)E0”为未经过CD73表达改造的T细胞的CD73表达量(或表达水平)。

在本发明的一个实施方式中，所述“高表达CD73”是指所述调节性T细胞在导入外源性CD73基因或蛋白、和/或调节内源CD73基因表达后，总CD73的表达水平较导入或调节前提高了50％以上，较佳地≥100％，更佳地≥200％。

在另一优选例中，所述调节性T细胞被导入外源性CD73基因或蛋白、被上调表达内源性CD73基因、或其组合。

在另一优选例中，所述上调表达内源性CD73基因包括上调CD73基因的转录水平和/或翻译水平。

在本发明的一个实施方式中，所述“调节性T细胞高表达CD73”可通过以下方法之一或组合实现：在所述调节性T细胞中表达CD73基因，和/或增加所述调节性T细胞中CD73基因的拷贝数，和/或改造CD73基因的调控序列(如启动子)以增强转录速度(如转录启动速度)，和/或修改携带有CD73基因的信使RNA的翻译调控区以增强翻译强度，和/或修改CD73基因本身以增强mRNA稳定性、蛋白质稳定性、解除蛋白质的反馈抑制，和/或添加外源物质以增强CD73基因的转录速度(如转录启动速度)和/或翻译强度。

在一个优选的实施方式中，所述调节性T细胞高表达CD73是通过提高内源性CD73基因的增强子和/或启动子的活性来实现的。在另一个优选的实施方式中，所述调节性T细胞高表达CD73是通过导入外源性CD73来实现的。

优选地，所述调节性T细胞高表达的CD73是外源性CD73。所述调节性T细胞可以是所述机体的自体细胞或是所述机体的异体细胞。

优选地，所述外源性CD73的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

智人胞外5’-核苷酸酶(NT5E)，蛋白质变体1：

MCPRAARAPATLLLALGAVLWPAAGAWELTILHTNDVHSRLEQTSEDSSKCVNASRCMGGVARLFTKVQQIRRAEPNVLLLDAGDQYQGTIWFTVYKGAEVAHFMNALRYDAMALGNHEFDNGVEGLIEPLLKEAKFPILSANIKAKGPLASQISGLYLPYKVLPVGDEVVGIVGYTSKETPFLSNPGTNLVFEDEITALQPEVDKLKTLNVNKIIALGHSGFEMDKLIAQKVRGVDVVVGGHSNTFLYTGNPPSKEVPAGKYPFIVTSDDGRKVPVVQAYAFGKYLGYLKIEFDERGNVISSHGNPILLNSSIPEDPSIKADINKWRIKLDNYSTQELGKTIVYLDGSSQSCRFRECNMGNLICDAMINNNLRHTDEMFWNHVSMCILNGGGIRSPIDERNNGTITWENLAAVLPFGGTFDLVQLKGSTLKKAFEHSVHRYGQSTGEFLQVGGIHVVYDLSRKPGDRVVKLDVLCTKCRVPSYDPLKMDEVYKVILPNFLANGGDGFQMIKDELLRHDSGDQDINVVSTYISKMKVIYPAVEGRIKFSTGSHCHGSFSLIFLSLWAVIFVLYQ(SEQ ID NO:1)

智人胞外5’-核苷酸酶(NT5E)，蛋白质变体2：

MCPRAARAPATLLLALGAVLWPAAGAWELTILHTNDVHSRLEQTSEDSSKCVNASRCMGGVARLFTKVQQIRRAEPNVLLLDAGDQYQGTIWFTVYKGAEVAHFMNALRYDAMALGNHEFDNGVEGLIEPLLKEAKFPILSANIKAKGPLASQISGLYLPYKVLPVGDEVVGIVGYTSKETPFLSNPGTNLVFEDEITALQPEVDKLKTLNVNKIIALGHSGFEMDKLIAQKVRGVDVVVGGHSNTFLYTGNPPSKEVPAGKYPFIVTSDDGRKVPVVQAYAFGKYLGYLKIEFDERGNVISSHGNPILLNSSIPEDPSIKADINKWRIKLDNYSTQELGKTIVYLDGSSQSCRFRECNMGNLICDAMINNNLRHTDEMFWNHVSMCILNGGGIRSPIDERNNGIHVVYDLSRKPGDRVVKLDVLCTKCRVPSYDPLKMDEVYKVILPNFLANGGDGFQMIKDELLRHDSGDQDINVVSTYISKMKVIYPAVEGRIKFSTGSHCHGSFSLIFLSLWAVIFVLYQ(SEQ ID NO:2)

优选地，所述外源性CD73的核苷酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。

智人胞外5’-核苷酸酶(NT5E)，转录变体1，核酸编码序列(CDS)如下：

5’-atgtgtccccgagccgcgcgggcgcccgcgacgctactcctcgccctgggcgcggtgctgtggcctgcggctggcgcctgggagcttacgattttgcacaccaacgacgtgcacagccggctggagcagaccagcgaggactccagcaagtgcgtcaacgccagccgctgcatgggtggcgtggctcggctcttcaccaaggttcagcagatccgccgcgccgaacccaacgtgctgctgctggacgccggcgaccagtaccagggcactatctggttcaccgtgtacaagggcgccgaggtggcgcacttcatgaacgccctgcgctacgatgccatggcactgggaaatcatgaatttgataatggtgtggaaggactgatcgagccactcctcaaagaggccaaatttccaattctgagtgcaaacattaaagcaaaggggccactagcatctcaaatatcaggactttatttgccatataaagttcttcctgttggtgatgaagttgtgggaatcgttggatacacttccaaagaaaccccttttctctcaaatccagggacaaatttagtgtttgaagatgaaatcactgcattacaacctgaagtagataagttaaaaactctaaatgtgaacaaaattattgcactgggacattcgggttttgaaatggataaactcatcgctcagaaagtgaggggtgtggacgtcgtggtgggaggacactccaacacatttctttacacaggcaatccaccttccaaagaggtgcctgctgggaagtacccattcatagtcacttctgatgatgggcggaaggttcctgtagtccaggcctatgcttttggcaaatacctaggctatctgaagatcgagtttgatgaaagaggaaacgtcatctcttcccatggaaatcccattcttctaaacagcagcattcctgaagatccaagcataaaagcagacattaacaaatggaggataaaattggataattattctacccaggaattagggaaaacaattgtctatctggatggctcctctcaatcatgccgctttagagaatgcaacatgggcaacctgatttgtgatgcaatgattaacaacaacctgagacacacggatgaaatgttctggaaccacgtatccatgtgcattttaaatggaggtggtatccggtcgcccattgatgaacgcaacaatggcacaattacctgggagaacctggctgctgtattgccctttggaggcacatttgacctagtccagttaaaaggttccaccctgaagaaggcctttgagcatagcgtgcaccgctacggccagtccactggagagttcctgcaggtgggcggaatccatgtggtgtatgatctttcccgaaaacctggagacagagtagtcaaattagatgttctttgcaccaagtgtcgagtgcccagttatgaccctctcaaaatggacgaggtatataaggtgatcctcccaaacttcctggccaatggtggagatgggttccagatgataaaagatgaattattaagacatgactctggtgaccaagatatcaacgtggtttctacatatatctccaaaatgaaagtaatttatccagcagttgaaggtcggatcaagttttccacaggaagtcactgccatggaagcttttctttaatatttctttcactttgggcagtgatctttgttttataccaatag-3’(SEQ IDNO:3)

智人胞外5’-核苷酸酶(NT5E)，转录变体1，核酸编码序列(CDS)如下：

5’-atgtgtccccgagccgcgcgggcgcccgcgacgctactcctcgccctgggcgcggtgctgtggcctgcggctggcgcctgggagcttacgattttgcacaccaacgacgtgcacagccggctggagcagaccagcgaggactccagcaagtgcgtcaacgccagccgctgcatgggtggcgtggctcggctcttcaccaaggttcagcagatccgccgcgccgaacccaacgtgctgctgctggacgccggcgaccagtaccagggcactatctggttcaccgtgtacaagggcgccgaggtggcgcacttcatgaacgccctgcgctacgatgccatggcactgggaaatcatgaatttgataatggtgtggaaggactgatcgagccactcctcaaagaggccaaatttccaattctgagtgcaaacattaaagcaaaggggccactagcatctcaaatatcaggactttatttgccatataaagttcttcctgttggtgatgaagttgtgggaatcgttggatacacttccaaagaaaccccttttctctcaaatccagggacaaatttagtgtttgaagatgaaatcactgcattacaacctgaagtagataagttaaaaactctaaatgtgaacaaaattattgcactgggacattcgggttttgaaatggataaactcatcgctcagaaagtgaggggtgtggacgtcgtggtgggaggacactccaacacatttctttacacaggcaatccaccttccaaagaggtgcctgctgggaagtacccattcatagtcacttctgatgatgggcggaaggttcctgtagtccaggcctatgcttttggcaaatacctaggctatctgaagatcgagtttgatgaaagaggaaacgtcatctcttcccatggaaatcccattcttctaaacagcagcattcctgaagatccaagcataaaagcagacattaacaaatggaggataaaattggataattattctacccaggaattagggaaaacaattgtctatctggatggctcctctcaatcatgccgctttagagaatgcaacatgggcaacctgatttgtgatgcaatgattaacaacaacctgagacacacggatgaaatgttctggaaccacgtatccatgtgcattttaaatggaggtggtatccggtcgcccattgatgaacgcaacaatggaatccatgtggtgtatgatctttcccgaaaacctggagacagagtagtcaaattagatgttctttgcaccaagtgtcgagtgcccagttatgaccctctcaaaatggacgaggtatataaggtgatcctcccaaacttcctggccaatggtggagatgggttccagatgataaaagatgaattattaagacatgactctggtgaccaagatatcaacgtggtttctacatatatctccaaaatgaaagtaatttatccagcagttgaaggtcggatcaagttttccacaggaagtcactgccatggaagcttttctttaatatttctttcactttgggcagtgatctttgttttataccaatag-3’(SEQ IDNO:4)

在本发明的另一个实施方式中，所述腺苷受体A_2A激动剂包括：小分子化合物、多肽、单克隆抗体、双或多靶点特异性抗体、代谢产物、核酸分子及其修饰物、脂类分子及其蛋白修饰物、糖类分子及其蛋白修饰物，或其组合。

在一个优选的实施方式中，所述腺苷受体A_2A激动剂为如式I所示的化合物：

式中，

R1、R2和R3各自独立地为选自下组的基团：H、卤素、-OH、-NH₂、取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的C6-C10芳基、取代或未取代的5-12元杂芳基、取代或未取代的5-8元杂环基、取代或未取代的-C1-C10亚烷基-C6-C10芳基、取代或未取代的-C1-C10亚烷基-5-12元杂芳基；

除非特别说明，所述的“取代”指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代(优选1-3个氢原子被取代)：卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C3-C6环烷基、苯基、苄基、C1-C4烷氧基、-OH、-NH₂。

更优选地，所述的腺苷受体A_2A激动剂为如式II所示的化合物：

药物组合物和施用方法

另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量的本发明活性成分；(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明的高表达CD73的T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞(自体或异体的)，ii)将编码CD73的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。

离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞(自体或异体的)从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CD73进行基因修饰(即，体外转导或转染)。高表达CD73的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和高表达CD73的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。

本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度—尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×10⁶个至1×10¹⁰个本发明经修饰的T细胞(如高表达CD73的T细胞)，通过例如静脉输注的方式，施用于患者。

此外，在本发明的高表达CD73的T细胞的施用中，任选地还可包括将腺苷和/或腺苷受体A_2A受体激动剂作为细胞治疗的辅助性药物，在所述细胞治疗方法中协助抑制炎症反应。

本发明的主要优点包括：

1)基于高表达CD73的调节性T细胞的II型糖尿病细胞治疗方法，从抑制慢性炎症的角度改善胰岛素敏感性，并能改善糖尿病疾病中炎症引发的并发症，毒副作用少。

2)腺苷辅助干预II型糖尿病，腺苷是免疫抑制性小分子天然代谢产物，负面作用少。

3)腺苷受体A_2A激动剂通过激活免疫细胞腺苷受体A_2A，抑制免疫反应，靶点明确，可用于辅助干预II型糖尿病。

4)基于高表达CD73的调节性T细胞的细胞治疗方法，以及腺苷或腺苷受体A_2A激动剂辅助干预，也能潜在应用于I型糖尿病的治疗，能抑制过度激活的自身免疫反应，并能改善糖尿病疾病中炎症引发的并发症，毒副作用少。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHarbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

如无特别说明，实施例所用的材料和试剂均为市售产品。

实施例1：长期注射胰岛素对小鼠胰岛素敏感性的影响

在本实施例中，对野生型小鼠每天接受腹腔注射PBS或者胰岛素(0.5U/Kg)，持续两个月。

结果如图1所示，体内注射胰岛素能诱导产生大量CD73^low脂肪调节性T细胞。CD73表达在注射胰岛素的小鼠脂肪调节性T细胞中被极大地抑制，但是CD39水平基本维持不变(图.1a-c)。

进一步地，对小鼠进行了葡萄糖耐量试验(GTT)和胰岛素耐量试验(ITT)，以研究CD73^low脂肪调节性T细胞和胰岛素敏感性之间的关系。结果显示胰岛素治疗的小鼠血糖波动更大，并且胰岛素敏感性受损(图.1d)。因此，这些数据提示长期注射胰岛素会诱导积累CD73^low脂肪调节性T细胞并引起胰岛素抵抗。

实施例2：CD73^low和CD73^hi脂肪调节性T细胞的抑制能力的比较

从野生型小鼠中分选CD4⁺CD25-YFP-Teff细胞，标记CellTrace Violet染料。并将其与自野生型小鼠分选的CD4⁺CD25^hiYFP⁺CD73^hi脂肪调节性T细胞或CD4⁺CD25^hiYFP⁺CD73^low脂肪调节性T细胞共培养。细胞混合体系使用anti-CD3/CD28抗体偶联磁珠刺激，应答细胞的增殖于三天后测定。后进一步测定增殖的应答Teff细胞比例。

结果如图2a-d所示，体外试验提示CD73^hi脂肪调节性T细胞抑制能力更强(图.2a,b),说明其对于脂肪炎症反应的保护作用。另外，CD73^low脂肪调节性产生大量炎症因子IFN-γ，表现出类似I型辅助性T(Th1)细胞的表型(图.2c,d)。

更进一步地，在本实施例中，将10⁵脂肪组织CD4⁺ T细胞单独或共同与2×10⁴CD73^hi或CD73^low脂肪调节性T细胞移植入Rag1^-/-小鼠，以更加深入研究CD73^hi脂肪调节性T细胞的体内功能。小鼠每两周接受过继性输入脂肪调节性T细胞治疗，持续6周。8周后，小鼠进行葡萄糖和胰岛素耐量试验。

结果如图2e和f所示，CD73^hi脂肪调节性T细胞显著提高了Rag1^-/-小鼠的胰岛素敏感性，但CD73^low脂肪调节性T细胞则不然(图.2e,f)。

综上所述，CD73^hi脂肪调节性T细胞具有更强的免疫抑制功能，抑制炎症反应并改善胰岛素敏感性。这些结果证明了CD73^hi脂肪调节性T细胞在脂肪炎症中的保护作用，且为相关代谢综合征提供了潜在的免疫治疗策略。

实施例3：腺苷或者腺苷受体A_2A receptor激动剂对细胞的作用研究

在本实施例中，用腺苷或者腺苷受体A_2A receptor激动剂直接处理Th1细胞和未分化的M0型巨噬细胞，测试这两种小分子对细胞的直接作用。

结果如图3所示，腺苷(10μM)或者腺苷受体A_2A receptor激动剂(1μM)直接处理Th1细胞后，细胞分泌更少的炎性细胞因子IL-2和IFN-γ(图3a-c)，提示这种抑制效应是直接作用于Th1型细胞上。

并且，腺苷或者腺苷受体A_2A receptor激动剂直接处理M0型巨噬细胞后，细胞上调M2型巨噬细胞的标志性分子CD206(图3d和e)，同时巨噬细胞分泌更少的促炎性细胞因子IL-1β(图3f)，分泌更多的免疫抑制性细胞因子IL-10(图3g)。

实施例4：腺苷或者腺苷受体A_2A receptor激动剂在体内的作用研究

在本实施例中，进一步在小鼠体内注射腺苷或者腺苷受体A_2A receptor激动剂CGS21680，测试脂肪组织T细胞和巨噬细胞炎症反应，并检测药物对葡萄糖耐受和胰岛素敏感性的影响。

具体地，选取8周龄的野生型小鼠，腹腔注射腺苷(10mg/kg)或者腺苷受体A_2Areceptor激动剂CGS21680(1mg/kg)，60天后收集小鼠的皮下脂肪组织和内脏脂肪组织，分析效应性T细胞和巨噬细胞的炎症反应。

结果如图4a-c所示，腺苷或者腺苷受体A_2A receptor激动剂处理小鼠后，脂肪组织CD4⁺Teff细胞表达更少的炎性细胞因子IL-2和IFN-γ。脂肪组织中，分泌炎性细胞因子IL-4和IL-17A的CD4⁺Teff细胞比例并不高，提示脂肪组织中的炎症主要以I型辅助性T(Th1)细胞为主。

炎性细胞因子IFN-γ能诱导更多的促炎性I型巨噬细胞(M1)，抑制II型巨噬细胞(M2)的分化，从而加剧脂肪组织的炎症。因此，在本实施例中进一步分析了M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的比例。

结果如图4所示，腺苷或者腺苷受体A_2A receptor激动剂处理组，脂肪组织M2型巨噬细胞比例显著提高，M1型巨噬细胞比例显著下降(图4d和e)。同时，巨噬细胞整体上调M2型巨噬细胞的标志性分子CD206(图4f和g)。

因此得出结论，体内注射腺苷或者腺苷受体A_2A receptor激动剂CGS21680，能显著抑制脂肪组织CD4⁺Teff细胞和巨噬细胞的免疫反应。

此外，在本实施例中，进一步用葡萄糖耐受和胰岛素耐受实验，分析腺苷或者腺苷受体A_2A receptor激动剂对小鼠个体水平的葡萄糖耐受和胰岛素敏感性的影响。

结果表明，脂肪组织CD4⁺Teff细胞和巨噬细胞的炎症反应，与小鼠个体水平的葡萄糖耐受和胰岛素敏感性负相关。腺苷或者腺苷受体A_2A receptor激动剂处理小鼠后，小鼠血液中葡萄糖波动水平明显降低(图4h)，并且小鼠展现出更强的胰岛素敏感性(图4i)。

讨论

在本发明的实施例中得出结论，腺苷或者腺苷受体A_2A receptor激动剂CGS21680能抑制脂肪组织效应性T细胞和巨噬细胞介导的炎症反应，改善葡萄糖耐受情况，并提高胰岛素敏感性。腺苷或者腺苷受体A_2A receptor激动剂CGS21680可以作为相关代谢综合征的干预候选小分子，提供了潜在的免疫相关治疗策略。同时，针对性的输入免疫抑制功能更强的CD73^hi Treg细胞也可以削弱炎症反应，并提高胰岛素敏感性。

综上所述，本发明提出一种针对糖尿病的新型细胞治疗方法。将来源于病人外周血的Treg细胞体外扩增，从扩增的Treg细胞中进一步分选获得CD73^hiTreg细胞并回输入糖尿病患者体内，通过抑制炎症反应达到改善胰岛素敏感性的目的。而腺苷和腺苷受体A_2Areceptor激动剂CGS21680可作为细胞治疗的辅助性药物，在CD73^hi Treg细胞治疗方法中协助抑制炎症反应。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 普米斯生物技术（珠海）有限公司

<120> 一种通过免疫调控治疗II型糖尿病的新方法

<130> P2018-2120

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 574

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Met Cys Pro Arg Ala Ala Arg Ala Pro Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu

1 5 10 15

Gly Ala Val Leu Trp Pro Ala Ala Gly Ala Trp Glu Leu Thr Ile Leu

20 25 30

His Thr Asn Asp Val His Ser Arg Leu Glu Gln Thr Ser Glu Asp Ser

35 40 45

Ser Lys Cys Val Asn Ala Ser Arg Cys Met Gly Gly Val Ala Arg Leu

50 55 60

Phe Thr Lys Val Gln Gln Ile Arg Arg Ala Glu Pro Asn Val Leu Leu

65 70 75 80

Leu Asp Ala Gly Asp Gln Tyr Gln Gly Thr Ile Trp Phe Thr Val Tyr

85 90 95

Lys Gly Ala Glu Val Ala His Phe Met Asn Ala Leu Arg Tyr Asp Ala

100 105 110

Met Ala Leu Gly Asn His Glu Phe Asp Asn Gly Val Glu Gly Leu Ile

115 120 125

Glu Pro Leu Leu Lys Glu Ala Lys Phe Pro Ile Leu Ser Ala Asn Ile

130 135 140

Lys Ala Lys Gly Pro Leu Ala Ser Gln Ile Ser Gly Leu Tyr Leu Pro

145 150 155 160

Tyr Lys Val Leu Pro Val Gly Asp Glu Val Val Gly Ile Val Gly Tyr

165 170 175

Thr Ser Lys Glu Thr Pro Phe Leu Ser Asn Pro Gly Thr Asn Leu Val

180 185 190

Phe Glu Asp Glu Ile Thr Ala Leu Gln Pro Glu Val Asp Lys Leu Lys

195 200 205

Thr Leu Asn Val Asn Lys Ile Ile Ala Leu Gly His Ser Gly Phe Glu

210 215 220

Met Asp Lys Leu Ile Ala Gln Lys Val Arg Gly Val Asp Val Val Val

225 230 235 240

Gly Gly His Ser Asn Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Pro Ser Lys

245 250 255

Glu Val Pro Ala Gly Lys Tyr Pro Phe Ile Val Thr Ser Asp Asp Gly

260 265 270

Arg Lys Val Pro Val Val Gln Ala Tyr Ala Phe Gly Lys Tyr Leu Gly

275 280 285

Tyr Leu Lys Ile Glu Phe Asp Glu Arg Gly Asn Val Ile Ser Ser His

290 295 300

Gly Asn Pro Ile Leu Leu Asn Ser Ser Ile Pro Glu Asp Pro Ser Ile

305 310 315 320

Lys Ala Asp Ile Asn Lys Trp Arg Ile Lys Leu Asp Asn Tyr Ser Thr

325 330 335

Gln Glu Leu Gly Lys Thr Ile Val Tyr Leu Asp Gly Ser Ser Gln Ser

340 345 350

Cys Arg Phe Arg Glu Cys Asn Met Gly Asn Leu Ile Cys Asp Ala Met

355 360 365

Ile Asn Asn Asn Leu Arg His Thr Asp Glu Met Phe Trp Asn His Val

370 375 380

Ser Met Cys Ile Leu Asn Gly Gly Gly Ile Arg Ser Pro Ile Asp Glu

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420 425 430

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450 455 460

Pro Gly Asp Arg Val Val Lys Leu Asp Val Leu Cys Thr Lys Cys Arg

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<210> 2

<211> 524

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Met Cys Pro Arg Ala Ala Arg Ala Pro Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu

1 5 10 15

Gly Ala Val Leu Trp Pro Ala Ala Gly Ala Trp Glu Leu Thr Ile Leu

20 25 30

His Thr Asn Asp Val His Ser Arg Leu Glu Gln Thr Ser Glu Asp Ser

35 40 45

Ser Lys Cys Val Asn Ala Ser Arg Cys Met Gly Gly Val Ala Arg Leu

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Lys Gly Ala Glu Val Ala His Phe Met Asn Ala Leu Arg Tyr Asp Ala

100 105 110

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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210 215 220

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325 330 335

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340 345 350

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<210> 3

<211> 1725

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

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tggcctgcgg ctggcgcctg ggagcttacg attttgcaca ccaacgacgt gcacagccgg 120

ctggagcaga ccagcgagga ctccagcaag tgcgtcaacg ccagccgctg catgggtggc 180

gtggctcggc tcttcaccaa ggttcagcag atccgccgcg ccgaacccaa cgtgctgctg 240

ctggacgccg gcgaccagta ccagggcact atctggttca ccgtgtacaa gggcgccgag 300

gtggcgcact tcatgaacgc cctgcgctac gatgccatgg cactgggaaa tcatgaattt 360

gataatggtg tggaaggact gatcgagcca ctcctcaaag aggccaaatt tccaattctg 420

agtgcaaaca ttaaagcaaa ggggccacta gcatctcaaa tatcaggact ttatttgcca 480

tataaagttc ttcctgttgg tgatgaagtt gtgggaatcg ttggatacac ttccaaagaa 540

accccttttc tctcaaatcc agggacaaat ttagtgtttg aagatgaaat cactgcatta 600

caacctgaag tagataagtt aaaaactcta aatgtgaaca aaattattgc actgggacat 660

tcgggttttg aaatggataa actcatcgct cagaaagtga ggggtgtgga cgtcgtggtg 720

ggaggacact ccaacacatt tctttacaca ggcaatccac cttccaaaga ggtgcctgct 780

gggaagtacc cattcatagt cacttctgat gatgggcgga aggttcctgt agtccaggcc 840

tatgcttttg gcaaatacct aggctatctg aagatcgagt ttgatgaaag aggaaacgtc 900

atctcttccc atggaaatcc cattcttcta aacagcagca ttcctgaaga tccaagcata 960

aaagcagaca ttaacaaatg gaggataaaa ttggataatt attctaccca ggaattaggg 1020

aaaacaattg tctatctgga tggctcctct caatcatgcc gctttagaga atgcaacatg 1080

ggcaacctga tttgtgatgc aatgattaac aacaacctga gacacacgga tgaaatgttc 1140

tggaaccacg tatccatgtg cattttaaat ggaggtggta tccggtcgcc cattgatgaa 1200

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<210> 4

<211> 1575

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

atgtgtcccc gagccgcgcg ggcgcccgcg acgctactcc tcgccctggg cgcggtgctg 60

tggcctgcgg ctggcgcctg ggagcttacg attttgcaca ccaacgacgt gcacagccgg 120

ctggagcaga ccagcgagga ctccagcaag tgcgtcaacg ccagccgctg catgggtggc 180

gtggctcggc tcttcaccaa ggttcagcag atccgccgcg ccgaacccaa cgtgctgctg 240

ctggacgccg gcgaccagta ccagggcact atctggttca ccgtgtacaa gggcgccgag 300

gtggcgcact tcatgaacgc cctgcgctac gatgccatgg cactgggaaa tcatgaattt 360

gataatggtg tggaaggact gatcgagcca ctcctcaaag aggccaaatt tccaattctg 420

agtgcaaaca ttaaagcaaa ggggccacta gcatctcaaa tatcaggact ttatttgcca 480

tataaagttc ttcctgttgg tgatgaagtt gtgggaatcg ttggatacac ttccaaagaa 540

accccttttc tctcaaatcc agggacaaat ttagtgtttg aagatgaaat cactgcatta 600

caacctgaag tagataagtt aaaaactcta aatgtgaaca aaattattgc actgggacat 660

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ggaggacact ccaacacatt tctttacaca ggcaatccac cttccaaaga ggtgcctgct 780

gggaagtacc cattcatagt cacttctgat gatgggcgga aggttcctgt agtccaggcc 840

tatgcttttg gcaaatacct aggctatctg aagatcgagt ttgatgaaag aggaaacgtc 900

atctcttccc atggaaatcc cattcttcta aacagcagca ttcctgaaga tccaagcata 960

aaagcagaca ttaacaaatg gaggataaaa ttggataatt attctaccca ggaattaggg 1020

aaaacaattg tctatctgga tggctcctct caatcatgcc gctttagaga atgcaacatg 1080

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tggaaccacg tatccatgtg cattttaaat ggaggtggta tccggtcgcc cattgatgaa 1200

cgcaacaatg gaatccatgt ggtgtatgat ctttcccgaa aacctggaga cagagtagtc 1260

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gaggtatata aggtgatcct cccaaacttc ctggccaatg gtggagatgg gttccagatg 1380

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tatatctcca aaatgaaagt aatttatcca gcagttgaag gtcggatcaa gttttccaca 1500

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gttttatacc aatag 1575

Claims (10)

1.一种物质或化合物的用途，其特征在于，所述物质或化合物被用于制备一药物组合物或制剂，所述药物组合物或制剂用于：(i)增强机体对胰岛素的敏感性；(ii)抑制炎症；(iii)上调机体内巨噬细胞中M2/M1型巨噬细胞的比例；和/或(iv)抑制机体的T细胞免疫反应；

其中，所述物质或化合物选自下组：(a)高表达CD73的调节性T细胞；(b)腺苷；(c)腺苷受体A_2A激动剂；或其组合。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述炎症为脂肪组织中的炎症或糖尿病其余病变组织中的炎症。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的腺苷受体A_2A激动剂为如式II所示的化合物：

4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括：

(i)第一活性成分，所述第一活性成分包括(a)高表达CD73的调节性T细胞；

(ii)任选的第二活性成分，所述第二活性成分选自下组：(b)腺苷；(c)腺苷受体A_2A激动剂；

(iii)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为注射剂。

6.一种赋予或提高调节性T细胞抑制免疫反应能力的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供一待改造的调节性T细胞；和

(b)对所述调节性T细胞进行改造或进一步分选富集，从而使得所述调节性T细胞高表达CD73。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，使得所述调节性T细胞高表达CD73包括：

(1)在所述调节性T细胞中导入外源性CD73基因；和/或

(2)上调表达所述调节性T细胞中内源性CD73基因。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法为体外方法。

9.一种增强机体对胰岛素的敏感性、抑制机体炎症、上调机体内巨噬细胞M2/M1的比例，和/或抑制机体的免疫反应的方法，其特征在于，包括向需要的对象施用如权利要求4所述的药物组合物。

10.一种调节性T细胞中CD73的检测试剂的用途，其特征在于，用于制备一试剂盒，所述试剂盒用于诊断或预后II性糖尿病。