JP2013540748A - 血液脳関門の透過性を調節するためのアデノシン受容体シグナル伝達の使用法 - Google Patents

血液脳関門の透過性を調節するためのアデノシン受容体シグナル伝達の使用法 Download PDF

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Abstract

本発明は、対象において血液脳関門（「ＢＢＢ」）透過性を増加させる方法に関する。本方法は、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する１つまたは複数の作用物質を該対象に投与する段階を含む。また、対象においてＢＢＢ透過性を減少させる方法も開示する。本方法は、該対象に、Ａ２Ａアデノシン受容体シグナル伝達を阻害または遮断する作用物質を投与する段階を含む。これらに関連する組成物も開示する。

Description

本出願は、２０１０年９月１６日に出願された米国特許仮出願第６１／３８３，６２８号の利益を主張するものであり、前記出願の内容全体を参照によって本明細書に援用する。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号Ｋ２２Ａｌ０５７８５４およびＲ０１ＮＳ０６３０１１の下、合衆国政府の支援を受けてなされた。合衆国政府は、本発明に関し所定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、血液脳関門透過性の調節に関する。
発明の背景
中枢神経系（「ＣＮＳ」）に進入する血液に対する関門は、本明細書において、集合的に血液脳関門（「ＢＢＢ」）と称する。ＢＢＢは、脳内の４００マイルの毛細血管および血管を覆う内皮細胞の極めて緊密な層である（Ｒａｎｓｏｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｒｅｅ ｏｒ Ｍｏｒｅ Ｒｏｕｔｅｓ ｆｏｒ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ Ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ，"Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎ．３：５６９−５８１（２００３））。血液脳関門（ＢＢＢ）は、脳微小血管系の内腔を形成する脳内皮細胞から構成される（Ａｂｂｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，"Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ，"Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．３７：１３−２５（２０１０）を参照）。関門機能は、中枢神経系（ＣＮＳ）内外への分子および細胞の溢出を制御する内皮細胞間のタイトジャンクションによって達成される（Ａｂｂｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，"Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ，"Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．３７：１３−２５（２０１０）を参照）。ＢＢＢ細胞間のほぼ不透過性の結合は、約２０種類の異なるタンパク質が互いに鉗合して形成される。分子は、膜に埋め込まれたタンパク質輸送体を介して、またはＢＢＢ細胞の蝋状の外膜を直接滑り抜けることによってＢＢＢ細胞に進入しなければならない。外来化合物は、いったん内側に入ると、高濃度の代謝酵素、および外来物質を排除するよう準備刺激された多様な無差別なタンパク質ポンプを回避しなければならない。外来分子は、これらの障害物を回避したあと、ＢＢＢ細胞の内膜を通過して最終的に脳に到達しなければならない。これらの巧妙な防御物により、ＢＢＢは潜在的な危害から脳を隔離することができるが、ＢＢＢはまた、脳内の疾患部位への神経薬の送達も妨害する。学術研究機関ならびにバイオテクノロジー産業および医薬産業の研究者らは、ＢＢＢを回避する方法、またはＢＢＢが潜在的薬物を脳に入らせるようにする方法を学んでいる。研究者は、ＢＢＢを通って受動拡散するか、または栄養素輸送体に担持されて脳内部に到達することができる小薬物を設計している。脳が無意識に取り込むように設計された潜在的治療薬を重視している研究者もいる。
脳毛細血管を形成する内皮細胞は、身体の他の組織内に見られるものとは異なる（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ，"Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２５５：７４−８３（１９８６）、Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，"Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ，"Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｒｅｖ．７：３１４−３３０（１９８６））。脳毛細血管の内皮細胞は、血液から脳およびＣＮＳの他の部分への分子の受動拡散に対抗する連続壁を形成する緊密な細胞間結合によって結合される。また、これらの細胞は、毛細血管壁を越えるある程度非選択的な輸送を他の組織で可能にする飲作用胞をほとんど有さないという点でも異なる。また、無制限の通過を可能にする細胞間に延びている連続的な間隙またはチャネルも欠いている。
血液脳関門は、脳の環境が常に制御されることを確実にするように機能する。血液中の様々な物質、例えばホルモン、アミノ酸、およびイオンなどのレベルは、頻繁に小さな変動を生じるが、これは食事および運動などの活動によってもたらされ得る（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ，"Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２５５：７４−８３（１９８６）、Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，"Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ，"Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｒｅｖ．７：３１４−３３０（１９８６））。血液脳関門によって血清組成におけるこのような変化から脳が保護されなければ、その結果は無制御な神経活動となり得る。
血流からの脳の分離は完全ではない。もしそうであれば、脳は、栄養素の欠乏により、また身体の他の部分との化学物質の交換の必要性から、正しく機能することができないであろう。毛細血管内皮細胞の内部の特異的輸送系の存在は、脳が正常な成長および機能に必要な化合物全てを制御された形で受け取ることを確実にする。多くの場合、これらの輸送系は、特定の分子と選択的に結合し、これを関門膜を越えて輸送する膜結合タンパク質からなる。このような輸送体タンパク質は、溶質担体輸送体として知られている。
ＢＢＢは、潜在的に毒性である物質がＣＮＳに進入するのを制限する機能を果たすが、ＣＮＳ内への治療薬物の送達を著しく困難にする。サイズが５００Ｄａ未満の低分子薬物のうち９８％を超えるものがＢＢＢを通過しないと推定されている（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，"Ｂｒａｉｎ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ Ｂｒａｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，"Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ．（２００１）、およびＰａｒｄｒｉｄｇｅ，"Ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ：Ｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋ ｉｎ Ｂｒａｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，"ＮｅｕｒｏＲｘ ２：３−１４（２００５）を参照）。治療薬の進入を許すようＢＢＢを変化させることを目標とする現在のアプローチは、過度に侵襲的であるか、痛みを伴うか、永久的脳障害をもたらし得るか、あるいは薬効の損失をもたらす（Ｂｒｏａｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，"Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１７：１６４−６（１９８２）、Ｈａｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，"Ｅｔｈａｎｏｌ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ Ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓ ｉｎ Ｃｈｉｃｋｓｍ，"Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１８：７９−８２（１９７２）、Ｒａｐｏｐｏｒｔ，"Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｏｓｍｏｔｉｃ Ｏｐｅｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ ＣＮＳ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，"Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ １０：１８０９−１８（２００１）、Ｂｉｄｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｎｏｖｅｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，"Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ６：５３９−４６（２００９）、およびＨｙｎｙｎｅｎ，"ＭＲＩ−ｇｕｉｄｅｄ Ｆｏｃｕｓｅｄ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ，"Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ ５０：２２１−９（２０１０）を参照）。
ＣＮＳ薬物送達に関する現在の戦略は、ＢＢＢの化学的破壊または物理的破壊、および薬物修飾の３つの大きなカテゴリーに分けられる（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，"Ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ：Ｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋ ｉｎ Ｂｒａｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，"ＮｅｕｒｏＲｘ ２：３−１４（２００５））。ＢＢＢを化学的に破壊するための方法は様々である。高張マンニトールは浸透圧によって脳内皮細胞を収縮させ、それによりＢＢＢ透過性を増加させ、化学療法薬のＣＮＳ送達を促進する（Ｎｅｕｗｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，"Ｏｓｍｏｔｉｃ Ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ：Ａ Ｎｅｗ Ｍｅａｎｓ ｏｆ Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，"Ｔｒａｎｓ Ａｍ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ａｓｓｏｃ．１０４：２５６−２６０（１９７９））。しかしながら、この手法は、てんかん性発作を誘発する危険性を伴うことが証明されている（Ｎｅｕｗｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，"Ｏｓｍｏｔｉｃ Ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＣＴ Ｓｃａｎｎｉｎｇ ａｎｄ／ｏｒ Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ Ｂｒａｉｎ Ｓｃａｎｎｉｎｇ，"Ａｍ．Ｊ．Ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｌ．１４１：８２９−８３５（１９８３）、Ｍａｒｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，"Ｓｅｉｚｕｒｅ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ，"Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ ４８：７３２−７４２（２００７））。血管作動性ペプチドであるブラジキニンの類似体は、血液腫瘍関門の透過性を増加させること（Ｒａｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，"Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ，"Ｃａｎ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１３：２１４−２２０（１９８６））、およびＢＢＢの透過性をある程度増加させること（Ｂｏｒｌｏｎｇａｎ ＆ Ｅｍｅｒｉｃｈ，"Ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｅｎｔｒｙ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ＣＮＳ ｖｉａ Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｒｏｍ Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｇｏｎｉｓｔ，Ｃｅｒｅｐｏｒｔ，"Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．６０：２９７−３０６（２００３））が示され、またこれはラットモデルにおける特定のＣＮＳ神経膠腫への親水性であるが親油性ではない薬物の送達の増加において適度に有効であった（Ｂａｒｔｕｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ ｂｙ ｔｈｅ Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ Ａｇｏｎｉｓｔ，ＲＭＰ−７：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，Ａｕｔｏ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ，Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ，"Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３３：２７０−２７８（１９９６）、Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，"Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ＲＭＰ−７ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ｕｐｔａｋｅ ｏｆ Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ ｉｎｔｏ Ｒａｔ Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒｓ，"Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５６：３９９８−４００５（１９９６）、Ｍａｔｓｕｋａｄｏ ｅｔ ａｌ．，"Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｔｕｍｏｒ Ｕｐｔａｋｅ ｏｆ Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ ａｎｄ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ Ｇｌｉｏｍａ−Ｂ ｅａｒｉｎｇ Ｒａｔｓ ｂｙ Ｉｎｔｒａｃａｒｏｔｉｄ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ Ａｎａｌｏｇ，ＲＭＰ−７，"Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ ３９：１２５−１３３，ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ １３３−１２４（１９９６）、Ｅｍｅｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，"Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ ｉｎｔｏ Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｕｒｓ ｗｉｔｈ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ｃｅｒｅｐｏｒｔ（ＲＭＰ−７）：Ｄｒａｍａｔｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｇａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ Ｄｏｓｉｎｇ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，"Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８０：９６４−９７０（１９９９））。しかしながら、これは、ラットモデルとヒト患者との差によると考えられる理由で、臨床試験では不成功であった（Ｐｒａｄｏｓ ｅｔ ａｌ．，"Ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，Ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，Ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，Ｐｈａｓｅ ２ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ＲＭＰ−７ ｉｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｇｌｉｏｍａ，"Ｎｅｕｒｏ．Ｏｎｃｏｌ．５：９６−１０３（２００３））。
関門の物理的破壊は、最も古く最も侵襲的な機能的ＢＢＢを回避する方法である。脳内、特に脳室内への直接注射は、ＣＮＳに治療薬を送達するために長年用いられている（Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，"Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ，"Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ ２９：８３２−８４５（２００９））。近年、圧縮波を用いて治療用化合物を強制的に前進させてＢＢＢを通過させる、高密度焦点式超音波技術が開発された（Ｂｒａｄｌｅｙ，"ＭＲ−ｇｕｉｄｅｄ Ｆｏｃｕｓｅｄ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ：Ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，"Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｒａｄｉｏｌ．６：５１０−５１３（２００９））。しかし、ＢＢＢを物理的に破壊することは依然として侵襲的である。
ＢＢＢを通過しない薬物は、修飾して通過を可能にできることがある。薬物の親油性を増加させる部分の添加は、その薬物がＢＢＢを通過する可能性を高めるが、このような添加は、薬物が全ての細胞型に進入することもさらに可能にする（Ｗｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，"Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｒｕｇ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ，"Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２２：２３２９−２３４３（２００１））。化学物質の添加自体が薬物のサイズを著しく増加させることもしばしばあり、これは高い親油性プロファイルを妨げる（Ｗｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，"Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｒｕｇ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ，"Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２２：２３２９−２３４３（２００１））。別のアプローチは、受容体を介したエンドサイトーシスによってＣＮＳに進入することが知られている化合物に薬物が結合される、いわゆる「ベクターに基づく」技術に関連する。例えば、ＢＥＣで発現させた、トランスフェリン受容体に対するモノクローナル抗体との、神経細胞成長因子（ＮＧＦ）の結合は、ラット脳へのＮＧＦ送達を大きく増加させる（Ｇｒａｎｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，"ＮＧＦ ａｎｄ Ａｎｔｉ−ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：Ｓｈｏｒｔ ａｎｄ Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ Ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ Ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ Ｓｅｐｔａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ，"Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２６８：４４８−４５９（１９９４））。ベクターに基づく送達技術には、(１）ＢＢＢの輸送能力が受容体発現に限られる、および(２）エンドサイトーシスイベントがＢＢＢ内皮細胞内に限られる（その生理機能の特徴である）、という２つの大きな不利点がある。
ＢＢＢを調節して治療薬物のＣＮＳへの進入を促進することが極めて必要とされている。安全かつ効率的にこれを行う方法を特定することは、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病、多発性硬化症、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の神経症状、ＣＮＳ腫瘍、およびその他多数の非常に広範な神経疾患に影響を与え得る。これらの疾患のうちの一部を治療するために有望な治療法が利用可能であるが、それらの可能性は、ＢＢＢによって課される非常に大きな障害によって完全には実現できない。したがって、当分野において、ＣＮＳ内への化合物の送達を改善するための方法が必要とされている。
さらに、浮腫、頭部外傷、脳卒中、および多発性硬化症に罹患した患者は、一次損傷部位近傍のＢＢＢの破損を示す。破損のレベルは、これらの疾患の臨床転帰に多大な影響を与え得る。例えば、多発性硬化症（ＭＳ）に罹患した患者におけるＢＢＢ破損の程度は、この疾患の重症度と相関する。磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を用いて、人がＭＳ「発作」を起こしているとき、脳または脊髄の一区画で血液脳関門が破損し、Ｔリンパ球と称される白血球が通過して、ミエリンを破壊することが示されている。
この関門の重要性にもかかわらず、ＢＢＢの完全性および／または透過性を制御する分子機序についてはほとんどわかっていない。したがって、そのような研究を促進する、かつ特に診断および／または治療用途のための、組成物および方法が、依然として強く求められている。
本発明は、当分野におけるこれらまたは他の欠陥を克服することを目的としている。
本発明は、対象において血液脳関門透過性を増加させるための方法に関する。本方法は、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する作用物質を対象に投与する段階を含む。
また、本発明は、対象において血液脳関門透過性を増加させるための方法にも関する。本方法は、Ａ１アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２Ａアデノシン受容体アゴニストを前記対象に投与する段階を含む。
本発明は、さらに組成物にも関する。組成物は、Ａ１アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２Ａアデノシン受容体アゴニストと、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、またはビヒクルとを含む。
また、本発明は、対象の脳に高分子治療物質を送達するための方法にも関する。この方法は、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する作用物質と、高分子治療物質とを対象に投与する段階を含む。
また、本発明は、対象において、ＣＮＳの疾患、障害、または病状を治療するための方法にも関する。本方法は、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する少なくとも１つの作用物質と、治療物質とを対象に投与する段階を含む。
また、本発明は、対象において、ＣＮＳの疾患、障害、または病状を治療するための方法にも関する。本方法は、Ａ１アデノシン受容体アゴニストと、Ａ２Ａ受容体アゴニストと、治療物質とを対象に投与する段階を含む。
本発明は、さらに、対象の血液脳関門の透過性を一時的に増加させる方法にも関する。本方法は、血液脳関門の透過性の一時的増加を必要とする対象を選択する段階、Ａ１アデノシン受容体またはＡ２Ａアデノシン受容体のいずれかを活性化する作用物質を供給する段階、および選択された対象に、血液脳関門の透過性を一時的に増加させるのに効果的な条件下で、Ａ１アデノシン受容体アゴニストまたはＡ２Ａアデノシン受容体アゴニストのいずれかを投与する段階を含む。
また、本発明は、対象において血液脳関門透過性を減少させるための方法にも関する。本方法は、前記患者に、Ａ２Ａシグナル伝達を遮断または阻害する作用物質を投与する段階を含む。
また、本発明は、血液脳関門内皮細胞のアクチン細胞骨格を再構築する方法にも関する。本方法は、前記内皮細胞をＡ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する作用物質に接触させる段階を含む。
下記の実施例において示されるように、プリンヌクレオシドアデノシン受容体を介したシグナル伝達は、血液脳関門透過性の強力な内因性モジュレータとして機能することが立証されている。これらの発見は、アデノシン受容体（「ＡＲ」）シグナル伝達が、ＢＢＢ透過性を制御するための新規の内因性機序であり、既存のＣＮＳ薬物送達技術に代わり、潜在的に有用であることを示す。ＢＢＢ透過性を増加させ、デキストランなどの高分子のＣＮＳ進入を促進する、ＦＤＡに認可されたＡ２Ａ ＡＲアゴニストであるレキスキャンのような薬物は、将来のヒトにおける治療上の応用に向けた可能性のある経路となる。重要なことに、本発見は、侵襲的送達手法が要求されるという理由で神経疾患を治療する際にその用途が伝統的に制限されてきた抗体などの高分子治療薬のＣＮＳ送達に、この手法を使用できることを示している（Ｔｈａｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ Ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｒｅｄｕｃｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｍｙｌｏｉｄ Ａｎｇｉｏｐａｔｈｙ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏ−ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅｓ ｉｎ Ａｇｅｄ Ｔｇ２５７６ Ｍｉｃｅ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６：４５０１−６（２００９）（その内容全体を参照によって本明細書に援用する））。ここに記載される結果は、既存のＣＮＳ薬物送達パラダイムの新規の有望な代替物を表している。
本発明の方法および作用物質は、血液脳関門に影響を及ぼす障害を有する対象の改善された治療を提供する。さらに、本発明は、血液脳関門を制御して、かかる患者の治療処置を向上させる改善された方法を提供する。
ｃｄ７３−／−マウスが実験的自己免疫性脳脊髄炎（「ＥＡＥ」）に対して抵抗性を有することを表すグラフを示す。ＥＡＥを誘導し、疾患活動性を毎日モニターし、ｃｄ７３−／−マウス（白菱形、ｎ＝１１）および野生型マウス（ｃｄ７３＋／＋）（黒四角、ｎ＝１３）の平均ＥＡＥスコアを算出した。示される結果は、別個の１１実験を表す。 図２Ａ〜２Ｄは、ｃｄ７３−／−Ｔ細胞が、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１７レベルの上昇をもたらし、ｃｄ７３＋／＋ｔｃｒａ−／−マウスに移入したときにＥＡＥ感受性を仲介することを示す。図２Ａは、未処置およびＥＡＥ誘導１３日目のｃｄ７３−／−および野生型マウスからの脾細胞で測定したＣＤ４およびＦｏｘＰ３発現を示す。図２Ｂは、フローサイトメトリーによってＣＤ４およびＣＤ７３細胞表面発現が分析された、未処置およびＭＯＧ免疫後１３日目の野生型マウスからの脾細胞を示す。図２Ｃは、１×１０４照射脾細胞および０または１０μＭのＭＯＧペプチドとともに培養された免疫した野生型またはｃｄ７３−／−マウスからの選別した細胞を示す。１８時間後に上澄みを採取し、サイトカインＢｉｏ−ｐｌｅｘアッセイ法を行った。結果は、０μＭおよび１０μＭのＭＯＧペプチド群間のサイトカインレベルの倍率変化を表す。試料はマウス４匹からプールされ、これは３つの同様の実験を表す。図２Ｄは、Ｔ細胞欠損ｃｄ７３＋／＋ｔｃｒａ−／−マウスに養子移入された、ＭＯＧ免疫ｃｄ７３−／−マウス（白菱形、ｎ＝５）または野生型マウス（黒四角、ｎ＝５）の脾臓およびリンパ節に由来するＣＤ４＋Ｔ細胞を示す。ＥＡＥを誘導し、疾患進行を毎日モニターした。結果は、２つの別個の実験を表す。 図３Ａ〜３Ｌは、ＥＡＥ誘導後にＣＮＳリンパ球浸潤をほとんどまたは全く示さないｃｄ７３−／−マウスを示す。ドナーｃｄ７３−／−Ｔ細胞は、ＥＡＥ誘導後、ｃｄ７３＋／＋ｔｃｒａ−／−レシピエントマウスのＣＮＳに浸潤する。ＥＡＥ誘導後１３日の野生型マウス（図３Ａ〜３Ｃ）およびｃｄ７３−／−マウス（図３Ｄ〜３Ｆ）からの凍結組織切片をＣＤ４抗体で標識した。図３Ｇは、ＥＡＥ誘導後１３日の野生型マウスおよびｃｄ７３−／−マウスからの凍結組織切片において１視野当たりで定量化した、脳および脊髄のＣＤ４＋浸潤リンパ球の平均数を示す棒グラフである。マウス１匹につき、脳で８つの解剖学的に類似する視野および脊髄で４つの視野を倍率１０倍で分析した（ｎ＝５匹のマウス／群）。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。図３Ｈ〜３Ｌは、ＥＡＥ誘導後１２日目（図３Ｋ）、１８日目（図３Ｈおよび３Ｌ）、または２２日目（図３Ｉおよび３Ｊ）に野生型マウス（図３Ｈ〜Ｊ）もしくはｃｄ７３−／−マウス（図３Ｋ〜３Ｌ）からＣＤ４＋細胞を受け取った、ＥＡＥ誘導ｔｃｒａ−／−マウスからのＣＤ４抗体で標識した海馬（図３Ｈ、３Ｉ、および３Ｋ）および小脳（図３Ｊおよび３Ｌ）の凍結組織切片を示す。免疫応答性をＨＲＰ抗ラットＩｇおよびヘマトキシリンで染色した核バックグラウンド（青色）に対比するＡＥＣ（赤色）を用いて検出した。矢印は、リンパ球浸潤の部位を示す。スケールバーは、５００μｍを表す。 図４Ａ〜４Ｋは、ＥＡＥ誘導にＣＮＳリンパ球浸潤をほとんどまたは全く示さないｃｄ７３−／−マウスを示す。ｃｄ７３−／−Ｔ細胞は、ｃｄ７３＋／＋ｔｃｒａ−／−マウスへの移入およびＥＡＥ誘導後に、ＣＮＳに浸潤する。ＥＡＥ誘導後１３日の野生型マウス（図４Ａ〜４Ｃ）およびｃｄ７３−／−マウス（図４Ｄ〜４Ｆ）からの凍結組織切片をＣＤ４５抗体で標識した。ＥＡＥ誘導後１２日目（図４Ｊ）、１８日目（図４Ｇおよび４Ｋ）、または２２日目（図４Ｈおよび４Ｉ）に野生型マウス（図４Ｇ〜４Ｉ）もしくはｃｄ７３−／−マウス（図４Ｊ〜４Ｋ）からＣＤ４＋細胞を受け取った、ＥＡＥ誘導ｔｃｒａ−／−マウスからのＣＤ４５抗体で標識した海馬（図４Ｇ、４Ｈ、および４Ｊ）および小脳（図４Ｉおよび４Ｋ）の凍結組織切片。免疫応答性をＨＲＰ抗ラットＩｇおよびヘマトキシリンで染色した核バックグラウンド（青色）に対比するＡＥＣ（赤色）を用いて検出した。矢印は、リンパ球浸潤の部位を示す。スケールバーは、５００ｍｍを表す。 図５Ａ〜５Ｃは、ミエリン特異的Ｔ細胞が、ＥＡＥ誘導後に、ｃｄ７３−／−マウスの脳に効率的に進入しないことを示す。ＭＯＧ３５−５５に対して特異的なＴＣＲを発現するＭＯＧ３５−５５免疫トランスジェニック２ｄ２マウス由来のＶβ１１＋Ｔ細胞を脾臓およびリンパ節から単離し、ＥＡＥ誘導と同時に、野生型マウスまたはｃｄ７３−／−マウスに養子移入した。移入およびＥＡＥ誘導後１日目、３日目、８日目、および１５日目に、脾臓（図５Ａ）、リンパ節（図５Ｂ）、および脳（図５Ｃ）を摘出し、細胞を採取した。フローサイトメトリーにより、ＣＤ４５およびＶβ１１発現について細胞を分析した。データは、それぞれの所定日における各臓器のＣＤ４５＋集団中のＶβ１１＋細胞の百分率として、相対的倍率変化（ＲＦＣ）を表す。値は、移入／ＥＡＥ誘導後１日目に各臓器で認められた細胞の百分率に正規化し、１．０はベースライン値と等しい。 図６Ａ〜６Ｄは、野生型マウスから養子移入されたＣＤ７３＋Ｔ細胞が、ｃｄ７３−／−マウスにＥＡＥ感受性を与えることを示す。図６Ａは、ＭＯＧ免疫野生型マウスの脾臓およびリンパ節由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を富化し、野生型マウス（黒四角、ｎ＝５）またはｃｄ７３−／−マウス（白菱形、ｎ＝５）に養子移入し、その後同時ＥＡＥ誘導を行ったことを示す。結果は、２つの独立した実験のうちの１つから示す。図６Ｂは、前もって免疫した野生型マウスおよびｃｄ７３−／−マウスの脾臓およびリンパ節からのＴ細胞をＣＤ４発現およびＣＤ７３発現に基づいて選別し、ｃｄ７３−／−マウスに養子移入し、その後同時ＥＡＥ誘導を行ったことを示す（ｎ＝５／各群）。黒四角は、ＣＤ７３を発現する野生型マウス由来のドナー細胞を表し、白四角は、ＣＤ７３を発現しない野生型マウス由来のドナー細胞を表し、白菱形は、ｃｄ７３−／−マウス由来のドナー細胞を表す。図６Ｃ〜６Ｄは、未処置の野生型マウス（図６Ｃ、左）およびｃｄ７３−／−マウス（図６Ｃ、右）、ならびにＥＡＥ誘導後１２日目の野生型マウス（図６Ｄ）由来のＣＮＳ脈絡叢の凍結組織切片をＣＤ７３（図６Ｃ）特異的抗体またはＣＤ４５（図６Ｄ）特異的抗体で染色したことを示す。免疫応答性をＨＲＰ抗ラットＩｇおよびヘマトキシリンで染色した核バックグラウンド（青色）に対比するＡＥＣ（赤色）を用いて検出した。括弧は、ＣＤ７３染色を示す。矢印は、ＣＤ４５リンパ球染色を示す。スケールバーは、５００μｍを表す。 図７Ａ〜７Ｄは、アデノシン受容体遮断が、マウスのＥＡＥ発症を防止することを示す。図７Ａは、平均ＥＡＥスコアを示すが、このときＥＡＥを誘導し、疾患活動性を毎日モニターし、飲用水（黒印）のみまたは０．６ｇ／ｍｌの広域スペクトルアデノシン受容体アンタゴニストカフェインを補充した飲用水（白印）のいずれかを与えた野生型マウス（四角）およびｃｄ７３−／−マウス（菱形）において、平均ＥＡＥスコアを算出した。結果は１つの実験からのものである（１群あたりｎ＝５マウス）。図７Ｂは、Ｚ３１０マウス脈絡叢細胞株における、ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子に対するアデノシン受容体ｍＲＮＡ発現レベルを示す。試料は３回試験し、エラーバーは、平均の標準誤差を表す。図７Ｃは、ＥＡＥ誘導の１日前およびＥＡＥ誘導後３０日目まで毎日、マウスを４５％ＤＭＳＯ中の２ｍｇ／ｋｇ（１ｍｇ／ｋｇ皮下および１ｍｇ／ｋｇ腹腔内）のＡ２Ａアデノシン受容体アンタゴニストＳＣＨ５８２６１（黒四角、ｎ＝４匹のマウス／群）または４５％ＤＭＳＯのみ（白四角、ｎ＝５匹のマウス／群）で処置したあとの結果を示す。これらの結果は、２つの実験を表す。図７Ｄは、ＥＡＥ誘導後１５日目のＳＣＨ５８２６１処置マウスおよびＤＭＳＯ処置マウスからの凍結組織切片において１視野当たりで定量化した、脳および脊髄のＣＤ４＋浸潤リンパ球の平均数を示す。マウス１匹につき、脳で８つの解剖学的に類似する視野および脊髄で４つの視野を倍率１０倍で分析した（ｎ＝４マウス）。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。 Ａ２Ａアデノシン受容アンタゴニストＳＣＨ５８２６１が、ＥＡＥ誘導後に脈絡叢においてＩＣＡＭ−１上方制御を防止することを示す。ＥＡＥ誘導の１日前およびＥＡＥ誘導後３０日目まで毎日、マウスをＤＭＳＯ中２ｍｇ／ｋｇ（１ｍｇ／ｋｇ皮下投与および１ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与）のＡ２Ａアデノシン受容体アンタゴニストＳＣＨ５８２６１（ｎ＝４匹のマウス／群）またはＤＭＳＯのみ（ｎ＝５匹のマウス／群）で処置した。これらの結果は１つの実験からのものである。ＳＣＨ５８２６１処置マウスおよびＤＭＳＯ処置マウスにおけるＥＡＥ誘導後１５日目の凍結組織切片を脈絡叢におけるＩＣＡＭ−１発現について検査した。ＤＭＳＯ（左）またはＳＣＨ５８２６１（右）で処置し、ＩＣＡＭ−１（赤色染色、白矢印）およびＤＡＰＩ（青色、核）の染色を行ったＷＴ（倍率４０倍）。画像は、４匹の異なるマウスに由来する。 図９Ａ〜９Ｂは、細胞外アデノシンを欠き、そのためアデノシン受容体を介してシグナルを十分に伝達できないＣＤ７３−／−マウスをＮＥＣＡで処置し、その結果ＰＢＳ対照に対して色素の移動がほぼ５倍増加したことを示す（図９Ａ）。ＮＥＣＡで処置したＷＴマウスも対照マウスを上回る増加を示す（図９Ｂ）。マウスＥＡＥモデルにおいて血液脳関門漏出性を誘導することが知られているため、百日咳を陽性対照として使用した。 ヒト内皮細胞株ｈＣＭＥＣ／Ｄ３におけるアデノシン受容体発現を示す。 ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞をトランスウェル膜上に播種してコンフルエントまで成長させ、２×１０６のジャーカット細胞を、場合によってＮＥＣＡ（一般アデノシン受容体［ＡＲ］アゴニスト）、ＣＣＰＡ（Ａ１ ＡＲアゴニスト）、ＣＧＳ ２１８６０（Ａ２Ａ ＡＲアゴニスト）、またはＤＭＳＯビヒクルとともに、上室に添加し、遊走した細胞を２４時間後に計数したあとの結果を示す。 トランスウェル膜にＺ３１０細胞を播種してコンフルエントまで成長させ、２×１０６のジャーカット細胞を、場合によってＮＥＣＡ（ｎ＝１、一般アデノシン受容体［ＡＲ］アゴニスト）、ＣＣＰＡ（ｎ＝１、Ａ１ ＡＲアゴニスト）、ＣＧＳ ２１８６０（ｎ＝１、Ａ２Ａ ＡＲアゴニスト）、またはＤＭＳＯビヒクル（ｎ＝１）とともに、上室に添加し、遊走した細胞を２４時間後に計数したあとの結果を示す。 ２４ウェルプレート上でｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞をコンフルエントまで成長させ、細胞を場合により様々な濃度のＮＥＣＡ（一般ＡＲアゴニスト）、ＣＣＰＡ（Ａ１ ＡＲアゴニスト）、ＣＧＳ ２１８６０（Ａ２Ａ ＡＲアゴニスト）、ＤＭＳＯビヒクル、またはホルスコリン（ｃＡＭＰを誘導）を用いて処理し、１５分後に溶解緩衝液を添加し、細胞を−８０℃で凍結して反応を停止させ、かつｃＡＭＰ Ｓｃｒｅｅｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてｃＡＭＰレベルをアッセイしたあとの結果を示す。 ２００８年２月１２日にＣＦＡ／ＭＯＧ３５−５５＋ＰＴＸで免疫し、４１日間毎日スコア付けした、雌のＡ１アデノシン受容体ノックアウトマウス（Ａ１ＡＲＫＯ、ｎ＝５）および雌野生型マウス（ＷＴ、ｎ＝５）の結果を示す。 図１５Ａ〜１５Ｂは、脳内皮を介したＦＩＴＣ−デキストラン溢出によって測定した、カフェインを与えた野生型マウスの脳およびカフェインを与えたＣＤ７３−／−マウスの脳を示す。 アデノシン受容体アゴニストのＮＥＣＡで処置した野生型マウスの血液脳関門を越えるＦＩＴＣ−デキストラン溢出の結果をグラフの形式で示すが、アデノシン受容体アンタゴニストのＳＣＨ５８２６１は、ＦＩＴＣ−デキストラン溢出を阻害している。 マウスをアデノシン受容体アゴニストＮＥＣＡで処置後、ＢｉｏＴｅｘ分光光度計により６２０ｎｍで測定した、血液脳関門を越えるエバンスブルー色素溢出の結果を示す。 ペグ化アデノシンデアミナーゼ（「ＰＥＧ−ＡＤＡ」）処置が、野生型マウスにおいてＥＡＥの発症を阻害することを示す結果をグラフ形式で示す。ＥＡＥを誘導し、疾患活動性を毎日モニターし、対照ＰＢＳビヒクルのみまたは１５単位／ｋｇ体重のＰＥＧ−ＡＤＡを４日ごとに腹腔内投与した野生型マウスにおいて、平均ＥＡＥスコアを算出した。黒四角は、ＰＢＳビヒクルを投与した野生型マウス（ｎ＝３）を表し、白四角は、ＰＥＧ−ＡＤＡを投与した野生型マウス（ｎ＝３）を表す。これらの結果は１つの実験からのものである。これらの結果は、アデノシンデアミナーゼ処置およびアデノシン受容体遮断が、野生型マウスをＥＡＥ誘導から保護することを示している。 図１９Ａ〜１９Ｂは、蛍光定量法で測定した、ＮＥＣＡまたはビヒクル（ＤＭＳＯ／ＰＢＳ）の静脈内投与３時間後のＷＴマウス脳内に入る１０，０００Ｄａデキストラン（図１９Ａ）および７０，０００Ｄａデキストラン（図１９Ｂ）の用量依存的増加を示す結果の棒グラフである（１０〜１５匹の動物／群）。図１９Ａ内の挿入図は、データ点のスプライン散布図である。実験は、少なくとも２回実施した。Ｐ≦０．０５でビヒクルとの有意差（スチューデントＴ検定）が示される（＊）。データは平均値±平均値の標準誤差である。これらの結果は、静脈内投与されたＮＥＣＡが、高分子量デキストランのＢＢＢ透過性を増加させることを示している。 図２０Ａ〜２０Ｂは、ＮＥＣＡを介したＢＢＢ透過性の増加の実験結果をグラフ形式で示している。図２０Ａの左パネルは、ＮＥＣＡまたはビヒクル（ＤＭＳＯ／ＰＢＳ）と同時投与したときの１０，０００Ｄａ ＦＩＴＣ−デキストランのＷＴマウス脳内への溢出を示す。灰色バー＝ビヒクル、黒色バー＝ＮＥＣＡ。図２０Ａの右パネルは、ｘ軸に時間目盛りを付けたスプライン散布図であり、蛍光定量法によって測定した、ＮＥＣＡ（０．０８ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルと静脈内同時投与したときの１０ｋＤａ ＦＩＴＣ−デキストランのＷＴマウス脳内への溢出の経時変化を示している（１０〜１５匹の動物／群）。図２０Ｂの左パネルは、ＮＥＣＡまたはビヒクル投与後の表示される時間に注射したときの７０，０００Ｄａテキサスレッド−デキストランのＷＴマウス脳組織内への溢出の結果を示す。灰色バー＝ビヒクル、黒色バー＝ＮＥＣＡ。図２０Ｂの右パネルは、ｘ軸に時間目盛りを付けたスプライン散布図であり、蛍光定量法によって測定した、ＮＥＣＡ（０．０８ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルによる静脈内前処置後（時間＝０）、採取時間９０分前（表示するとおり）に静脈内投与した１０ｋＤａテキサスレッド−デキストランのＷＴマウス脳組織内への溢出の経時変化を示している（３〜５匹の動物／群）。実験は、少なくとも２回実施した。Ｐ≦０．０５でビヒクルとの有意差（スチューデントＴ検定）が示される（＊）。データは平均値±平均値の標準誤差である。図２０Ａおよび２０Ｂの左パネル内の挿入図は、ｘ軸に時間目盛りを付けたスプライン散布図であり、菱形＝ビヒクル、四角＝ＮＥＣＡである。これらの結果は、ＮＥＣＡ処置が、一時的な不連続かつ可逆的な形でＢＢＢ透過性を増加させることを示している。 図２１Ａ〜２１Ｊは、ＢＢＢ透過性の増加が、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の選択的活性化作用に依存することを示す結果を図解している。図２１Ａは、培養マウス脳内皮細胞（「ＢＥＣ」）（ｂＥｎｄ．３）におけるアデノシン受容体サブタイプの相対的発現を示す棒グラフである。図２１Ｂは、未処置マウスにおける脳の皮質野近傍の免疫蛍光染色の画像を示し、図２１Ｃは、未処置マウスにおける脳の皮質野近傍のＣＤ３１（内皮細胞マーカー、緑色）、ならびにＡ１ ＡＲ（左欄、赤色）およびＡ２Ａ ＡＲ（右欄、赤色）の蛍光インサイチューハイブリダイゼーションの画像を示す（スケールバー＝２０μｍ）。図２１Ｄは、未処置マウスの単離した初代ＢＥＣにおけるＡ１ ＡＲ発現（左パネル）およびＡ２Ａ ＡＲ発現（右パネル）のウエスタンブロット分析の画像を示し、ローディング対照としてβアクチン発現を示す。図２１Ｅおよび２１Ｆは、蛍光定量法によって測定した、ＮＥＣＡまたはビヒクル（ＤＭＳＯ／ＰＢＳ）の静脈内投与３時間後のＷＴマウスならびにＡ１ ＡＲノックアウトマウス（図２１Ｅ）およびＡ２Ａ ＡＲノックアウトマウス（図２１Ｆ）の脳における１０，０００Ｄａ ＦＩＴＣ−デキストランのレベルを示す棒グラフである。灰色バー＝ビヒクル、黒色バー＝ＮＥＣＡ。図２１Ｇは、蛍光定量法によって測定した、ＷＴマウスと比較した、ＮＥＣＡ（０．０８ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルの静脈内投与３時間後のＡ１およびＡ２Ａ ＡＲノックアウトマウスの脳におけるデキストランレベルの減少を示す棒グラフである。選択的Ａ２ＡアンタゴニストＳＣＨ ５８２６１で前処置したＡ１ノックアウトマウスの脳においてデキストランレベルの有意な増加は検出されなかった（５〜８匹の動物／群）。また、蛍光定量法によって測定した、特異的Ａ２Ａ ＡＲアゴニストＣＧＳ ２１８６０（図２１Ｈの棒グラフ）または特異的Ａ１ ＡＲアゴニストＣＣＰＡ（図２１Ｉの棒グラフ）の静脈内同時投与３時間後の１０，０００Ｄａ ＦＩＴＣ−デキストランのＷＴ脳組織内への用量依存的進入を示すデータも示す。図２１Ｊは、ビヒクル、ＮＥＣＡ、ＣＣＰＡ、ＣＧＳ ２１６８０、および組み合わせの静脈内同時投与３時間後のＷＴマウス脳組織内の１０，０００Ｄａ ＦＩＴＣ−デキストランのレベルを表す棒グラフを示す。ｎ＝３〜４匹のマウス／処置群。実験は、少なくとも２回繰り返した。Ｐ≦０．０５でビヒクルとの有意差（スチューデントＴ検定）が示される（＊）。データは平均値±平均値の標準誤差である。 図２２Ａ〜２２Ｆは、Ａ２Ａアゴニストのレキスキャンが１０，０００ＤａデキストランのＢＢＢ透過性を増加させることを示す結果をグラフ形式で示す。図２２Ａは、レキスキャン投与がマウスにおけるＢＢＢ透過性を増加させることを示す結果をグラフ形式で示す。軸が途切れる前の棒グラフは、３回のレキスキャン注射を受けた群を表す。軸が途切れたあとの棒グラフは、単回のレキスキャン注射を受けた群を表す。３回の注射を受けた群に関しては、初回注射１５分後に灌流を行った。単回注射を受けた群は、注射５分後に灌流した（１０〜１５匹の動物／群）。ビヒクル処置マウス（Ｖ）を注射１５分後に灌流した。図２２Ｂは、レキスキャンがラットにおいてＢＢＢ透過性を増加させることを示す。動物に５分間隔で３回のレキスキャン注射をし、初回注射１５分後に灌流した（３〜４匹の動物／群）。図２２Ｃは、１μｇのレキスキャンを同時投与したラットにおける、５分後のＢＢＢのＦＩＴＣ−デキストラン透過性の結果をグラフ形式で示す。対照基準として、動物に１回のＮＥＣＡ注射をし、注射１５分後に灌流した。ビヒクル処置マウス（Ｖ）を注射１５分後に灌流した。統計によると、ビヒクル（＊）または０．０１μｇレキスキャン（＊＊）との有意差が示される（Ｐ≦０．０５、スチューデントＴ検定）。データは平均値±平均値の標準誤差である。図２２Ｄは、マウスにおけるレキスキャン処置後のＢＢＢ透過性の経時変化を示すグラフである。レキスキャン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）が時間０に投与された（１０〜１４匹の動物／群）。図２２Ｅは、ラットにおけるレキスキャン処置後のＢＢＢ透過性の経時変化を示すグラフである。レキスキャン（０．０００５ｍｇ／ｋｇ）は、時間０に投与された（３〜４匹の動物／群）。図２２Ｆは、腹腔内投与したＳＣＨ ５８２６１が、マウスにおける１０，０００Ｄａ ＦＩＴＣ−デキストランのＢＢＢ透過性を減少させることを示す。全ての実験は、少なくとも２回繰り返した。Ｐ≦０．０５でビヒクルとの有意差（スチューデントＴ検定）が示される（＊）。データは平均値±平均値の標準誤差である。 図２３Ａ〜２３Ｈは、静脈内投与したβ−アミロイド抗体に対する抗体が、ＢＢＢを通過し、ＮＥＣＡ投与後のトランスジェニックマウス脳においてβ−アミロイドプラークを標識することを示す結果を示す。図２３Ａ〜２３Ｄは、トランスジェニックＡＤ（ＡＰＰ／ＰＳＥＮ）マウスの海馬近傍の免疫蛍光顕微鏡画像である。マウスをＮＥＣＡ（０．０８ｍｇ／ｋｇ）（図２３Ａおよび２３Ｃ）またはビヒクル（図２３Ｂおよび２３Ｄ）のいずれかで処置し、β−アミロイドに対する抗体（６Ｅ１０）を静脈内投与した（上部パネル：図２３Ａおよび２３Ｂ）。静脈内６Ｅ１０抗体を投与しなかったマウス（下部パネル：図２３Ｃおよび２３Ｄ）では、６Ｅ１０をプラークの存在についての対照に対する一次抗体として使用し、免疫染色時に体外で適用した。図２３Ａは、図２３Ａ〜２３Ｄに示すものと同じトランスジェニックＡＤ（ＡＰＰ／ＰＳＥＮ）の海馬の免疫蛍光顕微鏡画像、ならびに静脈内投与β−アミロイド抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ ６Ｅ１０）で処置したまたはしていない、および０．８μｇの静脈内ＮＥＣＡ（左パネル）またはビヒクル（右パネル）で処置したＷＴマウスのものを示す。図２３Ａ〜２３Ｅにおいて、青色＝ＤＡＰＩであり、赤色＝６Ｅ１０標識β−アミロイドプラークを標識するＣｙ５−抗体である（スケールバー＝５０μｍ）。図２３Ｆおよび２３Ｇは、トランスジェニックＡＤマウスの脳の海馬および皮質領域の免疫蛍光顕微鏡画像であり、血管に対するβ−アミロイドプラーク位置の全体像（図２３Ｆ）および拡大像（図２３Ｇ）を示している（内皮細胞＝緑色に染色されたＣＤ３１、β−アミロイドプラーク＝赤色に染色された６Ｅ１０、核＝青色に染色されたＤＡＰＩ、スケールバー＝５０μｍ）。図２３Ｈは、ＮＥＣＡまたはビヒクルのみで処置したトランスジェニックＡＤマウスにおける、マウスの脳切片当たりの６Ｅ１０標識アミロイドプラークの定量化を示す棒グラフである。 図２４Ａ〜２４Ｙは、アデノシン受容体シグナル伝達が、ＢＥＣの経細胞経路ではなく傍細胞経路の変化をもたらすことを示す結果を示す。図２４Ａは、培養マウスＢＥＣ（Ｂｅｎｄ．３）におけるアデノシン受容体サブタイプの相対的遺伝子発現を示す棒グラフである。図２４Ｂは、培養マウスＢＥＣ（Ｂｅｎｄ．３）における、Ａ１（左パネル）およびＡ２Ａ（右パネル）ＡＲ発現のウエスタンブロット分析を示す。図２４Ｃは、ＡＲ活性化がマウスＢＥＣ単層においてＴＥＥＲを減少させることを示す結果を示すグラフである。ＮＥＣＡ（１μＭ）またはレキスキャン（１μＭ）処理の追加後、経内皮電気抵抗の減少が観察された。Ｐ≦０．０５で、レキスキャン（＃）およびＮＥＣＡ（＊）のビヒクルとの有意差（スチューデントＴ検定）が示される。データは平均値±平均値の標準誤差である。図２４Ｄ〜２４Ｇは、蛍光標識したアルブミン、および培地のみ（図２４Ｄ）、ビヒクル（図２４Ｅ）、ＮＥＣＡ（１μＭ）（図２４Ｆ）、またはレキスキャン（１μＭ）（図２４Ｇ）とのいずれかとともに３０分間インキュベートしたＢｅｎｄ．３細胞の画像である。蛍光顕微鏡法によりアルブミン取り込みを可視化した（アルブミン＝赤色、ＤＡＰＩ染色された核＝青色）。スケールバー＝５０μｍ。図２４Ｈは、アルブミン取り込み結果を示す棒グラフである。アルブミン取り込みは、培地のみの対照（１００％に設定）と比較した相対値として示される。データは平均値±平均値の標準誤差である（ｎ＝５の視野／群）。図２４Ｉ〜２４Ｐは、アクトミオシンストレスファイバー形成が培養ＢＥＣにおけるＡＲ活性化と相関するという結果を示す画像である。Ｂｅｎｄ．３細胞のファロイジン染色が示され、培地（図２４Ｉおよび２４Ｊ）またはビヒクルのみ（図２４Ｋおよび２４Ｌ）と比較したときの、ＣＣＰＡ（１μＭ）（図２４Ｍおよび２４Ｎ）またはレキスキャン（１μＭ）（図２４Ｏおよび２４Ｐ）による処理後のアクトミオシンストレスファイバー形成の増加が示されている。左パネル＝３分間処理、右パネル＝３０分間処理。スケールバー＝５０μｍ。図２４Ｑ〜２４Ｙは、ＡＲ活性化が、培養ＢＥＣにおけるタイトジャンクション接着分子の変化を誘発させることを示す画像である。ＤＭＳＯ（左欄）、ＮＥＣＡ（１μＭ、中央欄）、およびレキスキャン（１μＭ、右欄）による１時間の処理後のＢｅｎｄ．３細胞のＺＯ−１（図２４Ｑ〜２４Ｓ）、クローディン５（図２４Ｔ〜２４Ｖ）、およびオクルディン（図２４Ｗ〜２４Ｙ）染色を示す。接着分子＝ピンク／赤色、ＤＡＰＩで染色された核＝青色。矢印は、発現の不連続的変化の例示する（スケールバー＝２０μｍ）。 アデノシン受容体シグナル伝達およびＢＢＢ透過性調節のモデルを示す概略図である。（ｉ）基本条件は厳重な関門を支持し、（ｉｉ）Ａ１ ＡＲまたはＡ２Ａ ＡＲの活性化はＢＢＢ透過性の増加をもたらし、（ｉｉｉ）Ａ１ ＡＲおよびＡ２Ａ ＡＲの両者の活性化は、どちらかの受容体のみの活性化後に観察されるよりもさらに高い透過性をもたらし、（ｉｖ）Ａ２Ａ受容体拮抗作用はＢＢＢ透過性を減少させる。
発明の詳細な説明
アデノシンは、低酸素状態、虚血状態、または炎症状態で生成される、代謝困難の細胞内シグナルである。その主な仕事は、酸素供給量／要求量比の増加、プレコンディショニング、抗炎症作用、および血管形成の刺激を含む様々な受容体を介した機序によって、組織傷害を軽減し、修復を促進することである（Ｊａｃｏｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，"Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔｓ，"Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．５：２４７−２６４（２００６）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。
アデノシンの生物学的作用は、特定の細胞型における異なるパターンの受容体分布および／または４つの既知のアデノシン受容体（「ＡＲ」）サブタイプの親和性によって最終的に決定される。Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、およびＡ３の４つのＡＲサブタイプが哺乳動物において発現される（Ｓｅｂａｓｔｉａｏ ｅｔ ａｌ．，"Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ，"Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４７１−５３４（２００９）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。アデノシン受容体は、細胞外アデノシンと結合し、それによってＧタンパク質として知られる特定のグアニンヌクレオチド結合タンパク質を介して経膜シグナルを生じ、アデニリルシクラーゼ、カリウムチャネル、カルシウムチャンネル、およびホスホリパーゼＣを含む様々なセカンドメッセンジャー系を調節する膜内在性タンパク質として知られている。全体が参照によって本明細書に援用される、Ｓｔｉｌｅｓ，"Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｂｅｙｏｎｄ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，"Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．３８（１）：１０−１８（１９９０）、Ｓｔｉｌｅｓ，"Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，"Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６７：６４５１−６４５４（１９９２）を参照されたい。
ＣＮＳ関門透過性におけるアデノシンの関与を示す最初の手掛かりは、ＣＤ７３（５'−エクトヌクレオチダーゼ）の触媒作用によりアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）から生成される細胞外アデノシンが、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）において、ＣＮＳ内への白血球の進入を促進することを示す最近の発見によりもたらされた（Ｍｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，"ＣＤ７３ ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｅｎｔｒｙ ｏｆ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ Ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｄｕｒｉｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５：９３２５−３０（２００８）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。これらの研究は、細胞外アデノシンを生成することができないＣＤ７３欠損マウス（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｃｒｕｃｉａｌ Ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｅｃｔｏ−５'−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ（ＣＤ７３） ｉｎ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｌｅａｋａｇｅ Ｄｕｒｉｎｇ Ｈｙｐｏｘｉａ，"Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：１３９５−４０５（２００４）（その全体を参照によって本明細書に援用する））が、ＥＡＥから保護されること、またＡ２Ａアデノシン受容体（ＡＲ）の遮断が、ＣＮＳ内へのＴ細胞の進入を遮断することを証明した（Ｍｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，"ＣＤ７３ ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｅｎｔｒｙ ｏｆ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ Ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｄｕｒｉｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５：９３２５−３０（２００８）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。さらに、パイロット実験において、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識した１０，０００Ｄａデキストランの静脈内（ｉ．ｖ．）注射後、ＣＤ７３−／−マウスは、脳内にＷＴマウスと比較してはるかに少量のＦＩＴＣ−デキストランを有し、広域スペクトルＡＲアゴニスト５'−Ｎ−エチルカルボキシアミドアデノシン（ＮＥＣＡ）による処置が、ＷＴマウスと比較して、これらのマウスにおいてＦＩＴＣ−デキストラン溢出の劇的な増加をもたらすことが観察された（データは示さず）。これらの観察は、ＢＥＣにおけるアデノシン受容体シグナル伝達の調節がＢＢＢ透過性を調節し、分子のＣＮＳ内への進入を促進するという仮説を導いた。下記の実施例において示されるように、ＡＲシグナル伝達は、新規のＢＢＢシグナル伝達の内因性モジュレータである。
驚くべきことに、ここに示すように、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の活性化は、対象のＢＢＢ透過性を増加させる。とりわけ、Ａ１受容体またはＡ２Ａ受容体を介して作用するアデノシンは、ＢＢＢ透過性を調節して分子のＣＮＳ内への進入を促進または制限することができる。このようなＢＢＢ透過性の変化は、用量依存的であり、一時的な不連続的変化である。アデノシンが約１０秒未満という比較的短い半減期を有することを考えると（Ｋｌａｂｕｎｄｅ，"Ｄｉｐｙｒｉｄａｍｏｌｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ，"Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．９３：２１−６（１９８３）（その全体を参照によって本明細書に援用する））、生理学的モジュレータとしてのその役目は、おそらくアデノシンが生成される局所環境に限られる。実際に、脳内皮細胞においてＣＤ３９およびＣＤ７３がアデノシン受容体とともに発現することは、これらの細胞が、十分に確立された損傷シグナルである細胞外ＡＴＰに応答する能力を有することを示す（Ｄａｖａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，"ＡＴＰ Ｍｅｄｉａｔｅｓ Ｒａｐｉｄ Ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｌｏｃａｌ Ｂｒａｉｎ Ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｖｉｖｏ，"Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：７５２−８（２００５） ａｎｄ Ｈａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ Ｐ２Ｙ１２ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，"Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．９：１５１２−９（２００６）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。ＢＢＢ内皮細胞におけるアデノシン受容体シグナル伝達は、関門透過性の変更を必要としうる損傷を「感知」する際の重要事象であり、ＢＢＢ透過性（Ａ１ ＡＲおよびＡ２Ａ ＡＲによって仲介される）はドアとして機能し、活性化がそのドアを開き、拮抗作用がそのドアを閉じ、局所アデノシン濃度が鍵となる。高レベルの細胞外アデノシンの不在は、厳重かつ制限的な関門を支持する。図２５に概略的に示すように、Ａ１ ＡＲまたはＡ２Ａ ＡＲのいずれかの活性化は、ＢＢＢ透過性を一時的に増加させるが、両受容体の活性化は、ＢＢＢ透過性増加の相加効果をもたらす。Ａ１ ＡＲおよびＡ２Ａ ＡＲによって仲介されるＢＢＢ透過性がドアとして機能し、活性化がそのドアを開き、局所アデノシン濃度が鍵となることが、本明細書において示される。
本発明の一態様は、対象において血液脳関門透過性を増加させる方法を対象とする。本方法は、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する作用物質を対象に投与する段階を含む。
当業者は、血液と中枢神経系との間の関門は、毛細血管の内皮細胞から構成され（血液脳関門（「ＢＢＢ」））、脈絡叢（「ＣＰ」）の上皮細胞によって、中枢神経系（「ＣＮＳ」）の脳脊髄液（「ＣＳＦ」）から血液が分離されることを理解するであろう。これらの構造体は一緒にＣＮＳ関門として機能する。
一実施形態において、ＢＢＢ透過性を増加させるための本発明の方法は、ＣＰの透過性を増加させる。別の実施形態において、ＢＢＢの透過性を増加させるための本発明の方法は、ＣＮＳ関門の透過性の透過性を増加させる。
一実施形態において、本方法は、ＢＢＢ透過性の増加を必要とする対象を選択する段階、治療薬を供給する段階、ならびに選択された該対象に、該治療薬が血液脳関門を通過するのに効果的な条件下で、該治療薬と、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する作用物質とを投与する段階をさらに含む。
本発明によるＢＢＢ透過性の増加を必要とする好適な対象には、ＣＮＳのまたはＣＮＳ内に生じる疾患、障害、もしくは病状（例えば、ＨＩＶ関連神経障害）を治療または予防するために治療薬がＢＢＢを通過する必要があるあらゆる対象が含まれる。
本発明による治療有効量の作用物質が投与されることは理解されるであろう。本明細書において使用する「有効量」および「治療有効量」という用語は、個人に投与したときに、その患者が罹患している病状の治療、予防、遅延、または該病状の重症度の軽減に有効な化合物または組み合わせの量を指す。とりわけ、本発明による治療有効量は、疾患および／または障害の治療、予防、発症遅延に、あるいはそうでなければその疾患および／または障害の治療と関連する少なくとも１つの副作用の改善に十分な量である。
本発明による好適なＡ１および／またはＡ２Ａアデノシン受容体活性化物質には、Ａ１アデノシン受容体に対して選択的なアゴニスト、Ａ２Ａアデノシン受容体に対して選択的なアゴニスト、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化するアゴニスト、広域スペクトルアデノシン活性化物質もしくはアゴニスト、およびそれらの組み合わせがある。本発明の一部の実施形態によると、Ａ１選択的アゴニスト、Ａ２Ａ選択的アゴニスト、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化するアゴニスト、および／または広域スペクトルアデノシン活性化物質もしくはアゴニストの組み合わせが投与される。これらの作用物質は、同じまたは異なる薬学的製剤として同時に、あるいは、連続的に投与してよい。連続的投与のタイミングは、当業者によって決定することができる。特定の実施形態において、アゴニストは単一単位剤形に組み合わせられる。
好適なＡ２Ａアデノシン受容体活性化物質は、当分野で周知のＡ２Ａアゴニストである（Ｐｒｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ａｎｄ Ａｇｏｎｉｓｔｓ，"Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ １７（８）：９７９−９９１（２００７）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。Ａ２Ａアデノシン受容体アゴニストの例には、米国特許第６，２３２，２９７号および米国特許出願公開第２００３／０１８６９２６ Ａ１号（Ｌｉｎｄｉｎ ｅｔ ａｌ．）、第２００５／００５４６０５ Ａ１号（Ｚａｂｌｏｃｋｉ ｅｔ ａｌ．）、ならびに米国特許出願公開第２００６／００４０８８８ Ａ１号、同第２００６／００４０８８９ Ａ１号、同第２００６／０１００１６９ Ａ１号、および同第２００８／００６４６５３ Ａ１号（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．）に記載されているものがあり、これらの文書の内容全体を参照によって本明細書に援用する。かかる化合物は、米国特許第５，１４０，０１５号および同第５，２７８，１５０号（Ｏｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ）、米国特許第５，５９３，９７５号（Ｃｒｉｓｔａｌｌｉ）、米国特許第４，９５６，３４５号（Ｍｉｙａｓａｋａ ｅｔ ａｌ）、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，"ＣＧＳ ２１６８０Ｃ，ａｎ Ａ２ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｇｏｎｉｓｔ ｗｉｔｈ Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｖｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，"Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２５１：４７−５５（１９８９）、Ｏｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｎ６−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｎ−ａｌｋｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ−５'−ｕｒｏｎａｍｉｄｅｓ：Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐｓ ｆｏｒ Ａ１ ａｎｄ Ａ２ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，"Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２９：１６８３−１６８９（１９８６）、Ｂｒｉｄｇｅｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｎ６−［２−（３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（２−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌ］ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ Ｕｒｏｎａｍｉｄｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ：Ｎｏｖｅｌ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ａｇｏｎｉｓｔｓ Ｗｉｔｈ Ｂｏｔｈ Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ａ２ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，"Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３１：１２８２（１９８８）、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３３：１９１９（１９９０）、Ｕｋｅｅｄａ ｅｔ ａｌ．，"２−Ａｌｋｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅｓ：Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｔ ｔｈｅ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ａｒｔｅｒｙ Ａ２ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，"Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３４：１３３４（１９９１）、Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ａ２ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｇｏｎｉｓｔｓ ｉｎ ａ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｎ−ａｌｋｙｌａｔｅｄ ２−ａｍｉｎｏａｄｅｎｏｓｉｎｅｓ，"Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３４：２５７０−２５７９（１９９１）、Ｙｏｎｅｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，"Ｖａｓｏｄｅｐｒｅｓｓｏｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ２−（ｌ−ｏｃｔｙｎｙｌ）−ａｄｅｎｏｓｉｎｅ（ＹＴ−１４６），ａ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ａ２ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｇｏｎｉｓｔ，Ｉｎｖｏｌｖｅ ｔｈｅ Ｏｐｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｇｌｉｂｅｎｃｌａｍｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｋ＋ Ｃｈａｎｎｅｌｓ，"Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２１３（２）：１９９−２０４（１９９２）、Ｐｅｅｔ ｅｔ ａｌ．，"Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ，Ｃｈｉｒａｌ（ｐｈｅｎｙｌｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｐｙｒａｚｏｌｏ［３，４−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ ａｎｄ Ｐｕｒｉｎｅｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ａ１ ａｎｄ Ａ２ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，"Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３５：３２６３−３２６９（１９９２）、およびＣｒｉｓｔａｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，"２−Ａｌｋｙｎｙｌ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ａｎｄ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ−５'−Ｎ−ｅｔｈｙｌｕｒｏｎａｍｉｄｅ ａｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｔ Ａ２ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，"Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５（１３）：２３６３−２３６８（１９９２）に記載されているように合成することができ、これらの文書の内容全体を参照によって本明細書に援用する。アデノシンＡ２Ａ受容体アゴニストのさらなる例は、全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００４／０８０９９１６号において開示されている。特に好適なＡ２Ａアデノシン受容体アゴニストには、４−［２−［［６−アミノ−９−（Ｎ−エチル−ｂ−Ｄ−リボフラヌロンアミドシル）−９Ｈ−プリン−２イル］アミノ］エチル］ベンゼンプロパン酸（「ＣＧＳ ２１６８０」）、およびレキスキャン、またはそれらの組み合わせがある。これらのアデノシンＡ２Ａ受容体アゴニストは、例示を目的とし、限定するものではない。
好適なＡ１アデノシン受容体活性化物質は、Ａ１アデノシン受容体アゴニストである。Ａ１アデノシン受容体アゴニストは当業者に既知であり、例えば、全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００５／００５４６０５ Ａ１号（Ｚａｂｌｏｃｋｉ ｅｔ ａｌ．）およびＰｒｅｓｓ ｅｔ ａｌ．"Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ａｎｄ Ａｇｏｎｉｓｔｓ，"Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ １７（８）：９７９−９９１（２００７）に記載されているものがある。また、好適なＡ１アデノシン受容体アゴニストには、例えば、２−クロロ−Ｎ６−シクロペンチルアデノシン（「ＣＣＰＡ」）、８−シクロペンチル−１，３−ジプロピルキサンチン（「ＤＰＣＰＸ」）、Ｒ−フェニルイソプロピル−アデノシン、Ｎ６−シクロペンチルアデノシン、およびＮ（６）−シクロヘキシルアデノシン、またはそれらの組み合わせも含まれる。
一実施形態において、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する作用物質は、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者のアゴニストである。Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する好適なアゴニストは当業者に既知であり、例えばＡＭＰ ５７９がある。またさらなる実施形態において、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者のアゴニストは、広域スペクトルアデノシン受容体アゴニストであってもよい。好適な広域スペクトルアデノシン受容体アゴニストは、当業者には既知であり、例えば、ＮＥＣＡ、アデノシン、アデノシン誘導体、またはそれらの組み合わせがある。
本発明の一実施例によると、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化することは、Ａ１アデノシン受容体またはＡ２Ａアデノシン受容体のいずれかのみを活性化した場合のＢＢＢ透過性のレベルと比較して相乗的である。このことに関連して、２つの受容体を（所定の濃度で）一緒に活性化することの効果が、それぞれの受容体を（同じ濃度で）個別に活性化した場合の効果の合計よりも大きい場合、Ａ１受容体およびＡ２Ａ受容体の両者の活性化は、相乗的であるとみなされる。
さらなる実施形態において、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者の活性化は、ＢＢＢ透過性を２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍、あるいはこれらに含まれるあらゆる範囲で増加させる。一実施形態において、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化することは、ＢＢＢ透過性を７〜９倍増加させる。
本発明の一部の実施形態によると、Ａ１受容体およびＡ２Ａ受容体の両者の活性化は相加的である。このことに関連して、２つの受容体を（所定の濃度で）一緒に活性化することの効果が、それぞれの受容体を（同じ濃度で）個別に活性化した場合の効果の合計と等しい場合、Ａ１受容体およびＡ２Ａ受容体の両者の活性化は、相加的であるとみなされる。
本発明による一実施形態において、ＢＢＢ透過性の増加は、最大１８時間持続する。さらなる実施形態において、ＢＢＢ透過性の増加は、最大約１７時間、１６時間、１５時間、１４時間、１３時間、１２時間、１１時間、１０時間、９時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、３０分間、１５分間、１０分間、または５分間持続する。
本発明の別の態様は、対象において血液脳関門透過性を増加させることに関する。本方法は、Ａ１アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２Ａアデノシン受容体アゴニストを対象に投与する段階を含む。
一実施形態において、Ａ１アデノシン受容体アゴニストおよび／またはＡ２Ａアデノシン受容体アゴニストは選択的アゴニストである。本明細書において使用する「選択的」とは、特定の受容体に対して他の受容体よりも活性化の優先度が高いこと意味し、これは受容体活性を示す全細胞、組織、または生物のアッセイ法に基づいて定量化することができる。
本発明による好適なＡ１選択的受容体アゴニストには、２−クロロ−Ｎ６−シクロペンチルアデノシン（「ＣＣＰＡ」）、Ｎ６−シクロペンチルアデノシン、Ｎ（６）−シクロヘキシルアデノシン、８−シクロペンチル−１，３−ジプロピルキサンチン（「ＤＰＣＰＸ」）、Ｒ−フェニルイソプロピル−アデノシン、またはそれらの組み合わせがある。
本発明による好適なＡ２Ａ選択的受容体アゴニストには、レキスキャン（レガデノソンとしても知られる）、ＣＧＳ ２１６８０、ＡＴＬ−１４６ｅ、ＹＴ−１４６（２−（１−オクチニル）アデノシン）、ＤＰＭＡ（Ｎ６−（２−（３，５−ジメトキシフェニル）−２−（２−メチルフェニル）エチル）アデノシン）、またはそれらの組み合わせがある。
一実施形態において、Ａ１アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２Ａアデノシン受容体アゴニストは、同時に投与してもよい。本発明による別の実施形態において、Ａ１アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２Ａアデノシン受容体アゴニストは、連続的に投与してもよい。
特定の実施形態において、Ａ１アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２Ａアデノシン受容体アゴニストは、単一単位剤形として製剤化してもよい。本発明による投与量および処方は、下記により詳細に記載する。
一実施形態において、本方法は、治療物質の投与をさらに含む。治療物質は、Ａ１アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２Ａアデノシン受容体アゴニストのうちの一方または双方とともに投与してもよく、あるいは、Ａ１アデノシン受容体アゴニストおよび／またはＡ２Ａアデノシン受容体アゴニストの投与後に投与してもよい。好適な治療物質は、下記により詳細に記載する。特定の実施形態において、アゴニストは、治療物質の５分前、１０分前、１５分前、３０分前、１時間前、２時間前、３時間前、４時間前、５時間前、６時間前、７時間前、８時間前、９時間前、１０時間前、１１時間前、１２時間前、１３時間前、１４時間前、１５時間前、１６時間前、１７時間前、または１８時間前までに投与してもよい。
本発明の別の態様は、組成物に関する。組成物には、Ａ１アデノシン受容体アゴニストと、Ａ２Ａアデノシン受容体アゴニストと、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、またはビヒクルとが含まれる。
本発明の本態様による一実施形態において、Ａ１アデノシン受容体アゴニストおよび／またはＡ２Ａアデノシン受容体アゴニストは選択的アゴニストである。
本発明の化合物、組成物、または作用物質は、局所的または全身的に投与することができる。とりわけ、本発明の化合物、組成物、または作用物質は、経口的に、非経口的に、例えば皮下に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、鼻腔内滴下によって、または鼻、喉、および気管支などの粘膜への適用によって投与することができる。これらは、単独で、または好適な薬学的担体とともに投与してもよく、また固形または液状、例えば錠剤、カプセル剤、粉末、溶液、懸濁液、または乳剤であってよい。
本発明の活性化合物または作用物質は、例えば不活性希釈剤とともに、または吸収可能な可食担体とともに経口的に投与してもよく、あるいはこれらは、ハードシェルまたはソフトシェルのカプセル剤に封入してもよく、あるいはこれらは圧縮して錠剤にしてもよく、あるいはこれらは、食事の食品に直接取り入れてもよい。経口治療投与に場合、これらの活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれて、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤などの形態で使用してもよい。かかる組成物および調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含有すべきである。これらの組成物中の化合物の割合は、当然ながら異なってもよく、好都合にその単位の重量の約２％〜約６０％であってもよい。かかる治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、好適な投与量が得られるようなものである。簡便な単一投与製剤は、それぞれ０．１ｍｇ〜１ｇ、例えば５ｍｇ〜５００ｍｇの量で活性成分を含有する。典型的な単位用量は、例えば、約０．５〜約５００ｍｇまたは約１ｍｇ〜約５００ｍｇの本発明による作用物質を含有する。
また、錠剤、カプセル剤などは、結合剤、例えばトラガントガム、アカシア、トウモロコシデンプン、またはゼラチン；賦形剤、例えばリン酸二カルシウム；崩壊剤、例えばトウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；および甘味剤、例えばショ糖、乳糖、またはサッカリンも含有してよい。単位剤形がカプセル剤である場合、これは上記の種類の材料に加えて、脂肪油などの液体担体を含有してもよい。
種々の他の材料がコーティング剤として、または剤形の物理的形態を変更するために存在してもよい。例えば、錠剤は、セラック、糖、またはその両者でコーティングすることができる。シロップ剤は、活性成分に加え、甘味剤としてのショ糖、保存剤としてのメチルパラベンおよびプロピルパラベン、色素、および香味料、例えばチェリー風味またはオレンジ風味を含有してもよい。
また、これらの活性化合物または作用物質は、非経口投与してもよい。これらの活性化合物の溶液または懸濁液は、界面活性剤、例えばヒドロキシプロピルセルロースと好適に混合して、水中で調製することができる。また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの油中混合物中に分散液を調製することもできる。例示的油は、石油、動物、植物、または合成起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、鉱物油である。一般的に、水、食塩水、水性デキストロースおよび関連糖溶液、ならびにグリコール、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールは、特に注射用溶液に好ましい液体担体である。通常の保存および使用条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための保存剤を含有する。
注射用途に好適な薬学的形態には、滅菌水性溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末がある。いずれの場合も、形態は滅菌でなければならず、容易な注射性が存在する程度に流体でなければならない。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、微生物、例えば細菌および真菌の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、それらの好適な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であってよい。
また、本発明の化合物または作用物質は、エアロゾルの形態で気道に直接投与してもよい。エアロゾルとして使用する場合、溶液または懸濁液中の本発明の化合物は、従来のアジュバントを含む好適な推進剤、例えば、プロパン、ブタン、またはイソブタンなどの炭化水素推進剤と一緒に加圧エアロゾル容器に充填してもよい。また、本発明の材料は、非加圧形態で、例えばネブライザーまたはアトマイザーなどで投与してもよい。
一実施形態において、本発明による組成物は治療物質を含む。さらなる実施形態において、該治療物質は、中枢神経系（「ＣＮＳ」）の疾患、障害、または病状を治療するのに好適である。かかる治療物質は当分野で周知であり、多くは一般的であり、典型的には関連傷害の処方薬である。かかる治療物質の投与量範囲は当業者に既知であり、しばしば添付の処方情報パンフレット（しばしば「ラベル」と称される）に記載されている。
ＣＮＳの障害（精神／行動疾患または障害を含む）は、後天性てんかん様失語症、急性散在性脳脊髄炎、副腎白質ジストロフィー、脳梁欠損、失認症、アイカルディ症候群、アレキサンダー病、アルパース病、交代性片麻痺、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、無脳症、アンジェルマン症候群、血管腫症、無酸素症、失語症、失行症、クモ膜嚢腫、クモ膜炎、アーノルド・キアリ奇形、動静脈奇形、アスペルガー症候群、毛細血管拡張性運動失調症、注意欠陥多動性障害、自閉症、聴覚処理障害、自律神経障害、背痛、バッテン病、ベーチェット病、ベル麻痺、良性本態性眼瞼痙攣、良性限局性筋萎縮、良性頭蓋内圧高進症、両側前頭頭頂多小脳回、ビンスワンガー病、眼瞼痙攣、ブロッホ−サルズバーガー症候群、腕神経叢損傷、脳膿瘍、脳傷害、脳損傷、脳腫瘍、脊髄腫瘍、ブラウン−セカール症候群、カナバン病、手根管症候群（ｃｔｓ）、灼熱痛、中枢性疼痛症候群、橋中心髄鞘崩壊症、中心核ミオパシー、頭部障害、脳動脈瘤、脳動脈硬化症、脳萎縮症、脳性巨人症、脳性麻痺、シャルコー−マリー−トゥース病、キアリ奇形、舞踏病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（「ＣＩＤＰ」）、慢性疼痛、慢性局所疼痛症候群、コフィン−ラウリー症候群、昏睡（遷延性植物状態を含む）、先天性両側顔面神経麻痺、大脳皮質基底核変性症、頭蓋動脈炎、頭蓋骨癒合症、クロイツフェルト−ヤコブ病、累積外傷性障害、クッシング症候群、巨細胞性封入体病（「ＣＩＢＤ」）、サイトメガロウイルス感染症、ダンディー−ウォーカー症候群、ドーソン病、ド・モルシェ症候群、デジュリーヌ−クルンプケ麻痺、デジュリーヌ−ソッタス病、睡眠相後退症候群、認知症、皮膚筋炎、発達性統合運動障害、糖尿病性神経障害、びまん性硬化症、自律神経障害、計算力障害、書字障害、失読症、ジストニア、早期幼児てんかん性脳症、エンプティセラ症候群、脳炎、脳ヘルニア、脳三叉神経血管腫症、遺糞症、てんかん、エルプ麻痺、先端紅痛症、本態性振戦、ファブリー病、ファール症候群、失神、家族性痙性麻痺、熱性痙攣、フィッシャー症候群、フリードライヒ運動失調症、ゴーシェ病、ゲルストマン症候群、巨細胞動脈炎、巨大細胞封入体病、グロボイド細胞白質ジストロフィー、異所性灰白質、ギラン−バレー症候群、ｈｔｌｖ−１関連ミエロパシー、ハラーホルデン・スパッツ病、頭部損傷、頭痛、片側顔面痙攣、遺伝性痙性対麻痺、遺伝性多発神経炎性運動失調症、耳帯状疱疹、帯状疱疹、ヒラヤマ症候群、全前脳症、ハンチントン病、水無脳症、水頭症、副腎皮質ホルモン過剰症、低酸素症、免疫介在性脳脊髄炎、封入体筋炎、色素失調症、乳児性フィタン酸蓄積症、乳児レフスム病、幼児痙攣、炎症性ミオパシー、頭蓋内嚢胞、頭蓋内圧亢進症、ジュベール症候群、カーンズ−セイアー症候群、ケネディ病、キンズボーン症候群、クリッペル−フェーユ症候群、クラッベ病、クーゲルベルク−ヴェランダー病、クールー、ラフォラ病、ランバート−イートン無筋力症症候群、ランダウ−クレフナー症候群、延髄外側（ワレンベルグ）症候群、学習障害、リー病、レノックス−ガストー症候群、レッシュ−ナイハン症候群、白質ジストロフィー、レビー小体認知症、滑脳症、閉じ込め症候群、ルー・ゲーリック病、腰部椎間板症、ライム病−神経学的後遺症、マシャード−ジョセフ病（脊髄小脳失調症３型）、大脳症、巨大脳髄症、メルカーソン−ローゼンタール症候群、メニエール病、髄膜炎、メンケス病、異染性白質ジストロフィー、小頭症、偏頭痛、ミラー・フィッシャー症候群、軽度の脳卒中、ミトコンドリア筋症、メビウス症候群、一側上肢筋萎縮症、運動ニューロン疾患、運動能力障害、もやもや病、ムコ多糖症、多発梗塞認知症、多巣性運動ニューロパシー、多発性硬化症、体位性低血圧を伴う多系統萎縮症、筋ジストロフィー、筋痛性脳脊髄炎、重症筋無力症、ミエリン分解性びまん性硬化症、乳児ミオクローヌス性脳症、ミオクローヌス、ミオパシー、筋細管性ミオパシー、先天性ミオトニー、ナルコレプシー、神経線維腫症、神経弛緩薬性悪性症候群、エイズの神経症状、ループスの神経学的後遺症、神経性筋強直症、神経セロイドリポフスチン症、神経細胞移動障害、ニーマン−ピック病、非２４時間睡眠覚醒症候群、非言語的学習障害、オサリヴァン−マクラウド症候群、後頭神経痛、潜在性脊椎癒合不全、大田原症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、オプソクローヌス−ミオクローヌス症候群、視神経炎、起立性低血圧症、オーバーユース症候群、反復視、感覚異常、パーキンソン病、先天性パラミオトニー、腫瘍随伴疾患、発作、パリー−ロンベルク症候群（ロンベルク症候群としても知られている）、ペリツェウス−メルツバッハー病、周期性四肢麻痺、末梢神経障害、遷延性植物状態、広汎性発達障害、光くしゃみ反射、フィタン酸蓄積症、ピック病、神経圧迫、下垂体腫瘍、ｐｍｇ、ポリオ、多小脳回、多発性筋炎、孔脳症、ポリオ後症候群、帯状疱疹後神経痛（「ＰＨＮ」）、感染後性脳脊髄炎、体位性低血圧、プラダー−ウィリー症候群、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性顔面片側萎縮（ロンベルク症候群としても知られている）、進行性多巣性白質脳症、進行性硬化性ポリオジストロフィー、進行性核上性麻痺、偽脳腫瘍、ラムゼイ・ハント症候群（Ｉ型およびＩＩ型）、ラスムッセン脳炎、反射性交感神経性ジストロフィー症候群、レフサム病、反復運動性疾患、反復性ストレス障害、下肢静止不能症候群、レトロウイルス関連脊髄症、レット症候群、ライ症候群、ロンベルク症候群、狂犬病、聖ヴィトゥス舞踏病、サンドホフ病、統合失調症、シルダー病、裂脳症、感覚統合機能不全、中隔視神経異形成症、ゆさぶられっ子症候群、帯状疱疹、シャイ−ドレーガー症候群、シェーグレン症候群、睡眠時無呼吸、睡眠病、くしゃみ症（ｓｎａｔｉａｔｉｏｎ）、ソトス症候群、痙縮、二分脊椎、脊髄損傷、脊髄腫瘍、脊髄性筋萎縮症、脊柱管狭窄、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー症候群、進行性核上麻痺を参照、脊髄小脳失調症、全身硬直症候群、脳卒中、スタージ−ウェーバー症候群、亜急性硬化性全脳炎、皮質下動脈硬化性脳症、表在性鉄沈着症、シドナム舞踏病、失神、共感覚、脊髄空洞症、遅発性ジスキネジー、テイ−サックス病、側頭動脈炎、破傷風、脊髄係留症候群、トムゼン病、胸郭出口症候群、疼痛性チック、トッド麻痺、トゥレット症候群、一過性脳虚血発作、伝染性海綿状脳症、横断性脊髄炎、外傷性脳損傷、振戦、三叉神経痛、熱帯性痙性不全対麻痺症、トリパノソーマ症、結節性硬化症、側頭動脈炎を含む脈管炎、フォン・ヒッペル−リンダウ病（「ＶＨＬ」）、ビリウスク脳脊髄炎（「ＶＥ」）、ワレンベルグ症候群、ウェルドニッヒ−ホフマン病、ウェスト症候群、むち打ち症、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、および、ツェルウェガー症候群を含むが、これらに限定されない。したがって、全てのＣＮＳに関連する状態および障害が、ＢＢＢ経路の薬物送達によって治療できることは理解される。
本発明の実施形態によるＣＮＳの疾患、障害、または病状は、代謝疾患、行動障害、人格障害、認知症、癌、神経変性障害、疼痛、ウイルス感染症、睡眠障害、発作性障害、酸性リパーゼ疾患、ファブリー病、ウェルニッケ・コルサコフ症候群、ＡＤＨＤ、不安障害、境界性人格障害、双極性障害、うつ病、摂食障害、強迫性障害、統合失調症、アルツハイマー病、バース症候群およびトゥレット症候群、カナバン病、ハラーホルデン・スパッツ病、ハンチントン病、レビー小体病、ルー・ゲーリック病、マシャド・ジョセフ病、パーキンソン病、または下肢静止不能症候群から選択することができる。
一実施形態において、ＣＮＳの疾患、障害、または病状は、疼痛であり、これは神経因性疼痛、中枢性疼痛症候群、体性疼痛、内臓痛、および／または頭痛から選択される。
本発明による好適なＣＮＳ治療薬には低分子治療物質が含まれる。ＣＮＳの疾患、障害、または病状を治療するための好適な低分子治療薬には、アセトアミノフェン、アセチルサリチル酸、アシルトランスフェラーゼ、アルプラゾラム、アマンタジン、アミスルプリド、アミトリプチリン、アンフェタミン−デキストロアンフェタミン、アムサクリン、抗精神病薬、抗ウイルス薬、アポモルヒネ、アリモクロモル、アリピプラゾール、アセナピン、アスパルトアシラーゼ酵素、アトモキセチン、非定型抗精神病薬、アザチオプリン、バクロフェン、ベクラミド、ベンセラジド、ベンセラジド−レボドパ、ベンゾジアゼピン、ベンズトロピン、ベバシズマブ、ブレオマイシン、ブリバラセタム、ブロモクリプチン、ブプレノルフィン、ブプロピオン、カベルゴリン、カルバマゼピン、カルバトロール、カルビドパ、カルビドパ−レボドパ、カルボプラチン、クロラムブシル、クロルプロマジン、クロルプロチキセン、シスプラチン、シタロプラム、クロバザム、クロミプラミン、クロナゼパム、クロザピン、コデイン、ＣＯＸ−２阻害剤、シクロホスファミド、ダクチノマイシン、デクスメチルフェニデート、デキストロアンフェタミン、ジアモルヒネ、ダイアスタット、ジアゼパム、ジクロフェナク、ドネペジル、ドキソルビシン、ドロペリドール、エンタカポン、エピルビシン、エスシタロプラム、エトスクシミド、エトポシド、フェルバメート、フルオキセチン、フルペンチキソール、フルフェナジン、ホスフェニトイン、ガバペンチン、ガランタミン、γヒドロキシブチラート、ゲフィチニブ、ハロペリドール、ヒダントイン、ヒドロコドン、ヒドロキシジン、イブプロフェン、イホスファミド、ＩＧＦ−１、イロペリドン、イマチニブ、イミプラミン、インターフェロン、イリノテカン、ＫＮＳ−７６０７０４、ラコサミド、ラモトリジン、レベチラセタム、レボドパ、レボメプロマジン、リスデキサンフェタミン、リスリド、炭酸リチウム、脂肪分解酵素、メクロレタミン、ｍＧｌｕＲ２アゴニスト、メマンチン、メペリジン、メルカプトプリン、メソリダジン、メスクシミド、メタンフェタミン、メチルフェニデート、ミノサイクリン、モダフィニル、モルヒネ、Ｎ−アセチルシステイン、ナプロキセン、ネルフィナビル、ニューロトリン（ｎｅｕｒｏｔｒｉｎ）、ニトラゼパム、ＮＳＡＩＤ、オランザピン、オピエート、オセルタミビル、オキサプラチン、パリペリドン、パントテン酸キナーゼ２、パーキン、パロキセチン、ペルゴリド、ペリシアジン、ペルフェナジン、フェナセミド、フェネルジン、フェノバルビタール、フェネトライド、フェニトイン、ピモジド、Ｐｉｎｋ１、ピリベジル、ポドフィロトキシン、プラミペキソール、プレガバリン、プリミドン、プロクロルペラジン、プロマジン、プロメタジン、プロトリプチリン、ピリミジンジオン、クエチアピン、ラサギリン、レマセミド、リルゾール、リスペリドン、リトナビル、リツキシマブ、リバスティグミン、ロピニロール、ロチゴチン、ルフィナマイド、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、セレギン、セレギリン、セルチンドール、セルトラリン、バルプロ酸ナトリウム、スチリペントール、タキサン、テマゼパム、テモゾロマイド、テノホビル、テトラベナジン、チアミン、チオリダジン、チオチキセン、チアガビン、トルカポン、トピラマート、トポテカン、トラマドール、トラニルシプロミン、トラスツズマブ、三環系抗うつ薬、トリフルオペラジン、トリフルプロマジン、トリヘキシフェニジル、トリレプタル、バラシクロビル、バルノクタミド、バルプロミド、バルプロ酸、ベンラファクシン、水疱性口内炎ウイルス、ビガバトリン、ビンカアルカロイド、ザナミビル、ジプラシドン、ゾニサミド、ゾテピン、ズクロペンチキソール、またはそれらの組み合わせがある。
別の実施形態において、本発明による組成物は、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）の治療に好適な治療物質を含んでもよい。該物質は、ヌクレオシドＨＩＶ逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシドＨＩＶ逆転写酵素阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤、ＨＩＶ融合阻害剤、免疫モジュレータ、ＣＣＲ５アンタゴニスト、および抗感染薬から選ばれる。
病原体、例えばＨＩＶはＣＮＳ内に避難し、宿主の生存する間そこに留まることができる。世界中の３千万を超える人々が、現在ＨＩＶに感染し、この数は増加傾向にある（全体を参照によって本明細書に援用する、Ｕｎｉｔｅｄ Ｎａｔｉｏｎｓ：Ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ Ｔｈｅ Ｇｌｏｂａｌ ＡＩＤＳ Ｅｐｉｄｅｍｉｃ（２００８）を参照）。ウイルスを標的とするために抗ＨＩＶ薬をＣＮＳ内に届ける効果的な方法をなくしては、ＨＩＶの根絶は考えられない。
本発明によって投与することができる他の治療物質または治療化合物は、ＢＢＢを通過することが望ましいいかなる種類の薬物または薬学的物質であってもよい。かかる治療薬には、抗生物質、抗寄生虫剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、および抗腫瘍剤が含まれるが、これらに限定されない。抗寄生虫剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤などとともに投与する場合、本発明による化合物は、典型的には薬学的組成物として、その疾患の治療に好適な任意の投与方法および投与経路で投与してもよい。
治療物質は、治療薬として、または予防薬として（例えば、神経変性疾患の発症を阻害または防止する）、送達することができる。治療薬は、治療すべき基礎障害の根絶または改善をもたらす。予防薬は、疾患を発症する危険性がある患者、またはまだ診断はなされていなかったとしても、そのような疾患の１つまたは複数の生理学的症状を訴える患者に投与される。あるいは、予防薬の投与は、基礎障害の生理学的症状の発症を避けるために、特に症状が周期的に現れる場合に適用してもよい。この後者の実施形態において、療法は、基礎をなす適応症ではなく、関連する生理学的症状に対して予防的である。個々の適応に効果的な実際の量は、とりわけ治療を受ける病状および投与経路に依存する。
前記治療物質は、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗増殖剤、抗遊走剤、線維化抑制剤、アポトーシス促進剤、カルシウムチャンネル遮断剤、抗腫瘍剤、抗体、抗血栓剤、抗血小板薬、Ｉｌｂｌｌｌｌａ剤、抗ウイルス剤、抗癌剤、化学療法薬剤、血栓溶解剤、血管拡張剤、抗菌剤または抗生物質、有糸分裂阻害薬、成長因子アンタゴニスト、フリーラジカル捕捉剤、生物学的薬剤、放射線治療薬、放射線不透過剤、放射標識薬剤、抗凝固剤（例えば、ヘパリンおよびその誘導体）、抗血管形成薬（例えば、サリドマイド）、血管形成薬、ＰＤＧＦ−Ｂおよび／またはＥＧＦ阻害剤、抗炎症剤（例えば、乾癬薬）、リボフラビン、チアゾフリン、ザフリン（ｚａｆｕｒｉｎ）、抗血小板薬（例えば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えば、アセチルサリチル酸））、ＡＤＰ阻害剤（例えばクロピドグレルおよびチクロピジン）、ホスホジエステラーゼＩＩＩ阻害剤（シロスタゾールなど）、糖タンパク質ＩＩ／ＩＩＩＩａ剤（アブシキシマブなど）、エプチフィバチド、およびアデノシン再取り込み阻害剤（例えばジピリダモール、治癒剤および／または促進剤（例えば、抗酸化剤および酸化窒素ドナー））、制吐剤、制嘔吐剤、トリプジオリド、ジテルペン、トリテルペン、ジテルペンエポキシド、ジテルペノイドエポキシド、トリエポキシド、またはトリプテリジウム・ウィルフォルディ・フックＦ（ＴＷＨＦ）、ＳＤＺ−ＲＡＤ、ＲＡＤ、ＲＡＤ６６６、あるいは４０−０−（２−ヒドロキシ）エチル−ラパマイシン、それらの誘導体、薬学的塩、および組み合わせからなる群から選択することができる。
特定の実施形態において、前記治療物質およびアデノシン受容体活性化物質（または下記にさらに詳しく記載するようなアデノシン受容体遮断剤もしくは阻害剤）および／または治療薬は、単一「化合物」製剤として製剤化される。これは多数の既知の方法のいずれによって達成してもよい。例えば、該治療物質および該活性化物質は、単一の薬学的に許容可能な賦形剤に組み合わせることができる。別のアプローチでは、該治療物質および該アデノシン受容体活性化物質（またはアデノシン受容体遮断剤もしくは阻害剤）は、別個の賦形剤中に製剤化して、マイクロカプセル化してから組み合わせるかまたは単一のピル内に別個の薄層を形成するなどしてもよい。
一実施形態において、前記治療物質およびアデノシン受容体活性化物質を結合させる。特定の実施形態において、該治療物質および該アデノシン受容体活性化物質（またはアデノシン受容体遮断剤もしくは阻害剤）は、直接または「テザー」もしくは「リンカー」によって結合し、単一化合物を形成する。特定の理論に縛られるものではないが、そのような結合した化合物は、改善された特異性／選択性を提供する。
分子を直接またはリンカー／テザーによって結合するための多数の化学が、当業者に周知である。二官能性化合物を形成するために前記治療物質と前記アデノシン受容体活性化物質（またはアデノシン受容体遮断剤もしくは阻害剤）とを結合するために使用する特定の化学は、該治療物質の化学的性質と所望の「リガンド間」の間隔とに依存する。様々な治療薬およびアデノシン受容体活性化物質は、典型的には、様々な官能基（例えば、カルボン酸（ＣＯＯＨ）、遊離アミン（-ＮＥＥ）など）を含み、それらはリンカー上または対立する成分（すなわち、該治療物質またはアデノシン受容体活性化物質のいずれか）上の好適な官能基と反応して、それらの成分を結合させることが可能である。
あるいは、それらの成分を誘導体化して、付加的な反応性官能基を露出または結合させることもできる。この誘導体化は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ Ｉｌｌ）から入手可能なものなどのなど、多数のリンカー分子のいずれの結合も含み得る。
本明細書において使用する「リンカー」または「テザー」は、２つ以上のリガンド（例えば、治療薬またはアデノシン受容体活性化物質）を結合して、二官能性または多官能性化合物を形成するために使用される分子である。リンカーは、典型的には、二官能性部分または多官能性部分を含む全ての成分と共有結合を形成することができるように選定する。好適なリンカーは当業者に周知であり、直鎖または分枝鎖の炭素リンカー、複素環炭素リンカー、アミノ酸、核酸、デンドリマー、合成ポリマー、ペプチドリンカー、ペプチドおよび核酸類似体、炭水化物、ポリエチレングリコールなどが含まれるが、これらに限定されない。成分のうちの１つまたは複数がポリペプチドである場合、リンカーは、構成アミノ酸に、それらの側基により（例えば、システインへのジスルフィド結合により）、または、末端アミノ酸のα炭素アミノ基またはカルボキシル基により結合され得る。
特定の実施形態において、第１の治療薬上の基と反応する１つの官能基と、アデノシン受容体活性化物質上の官能基と反応する別の基を有する二官能性リンカーを用いて、二官能性化合物を形成することができる。あるいは、誘導体化は、遊離アルデヒド基を生成するための過ヨウ素酸塩による成分の化学的処理（例えば、糖タンパク質、炭水化物、または核酸などの糖部分のグリコール開裂）を含んでもよい。遊離アルデヒド基は、リンカー上の遊離アミンまたはヒドラジン基と反応させて、リンカーを化合物と結合させることができる（例えば、全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第４，６７１，９５８号（Ｒｏｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）を参照）。また、抗体または抗体フラグメントなどのポリペプチド上の遊離スルフヒドリル基を生成するための手順も知られている（全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第４，６５９，８３９号（Ｎｉｃｏｌｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．）を参照）。
治療物質およびアデノシン受容体活性化物質がどちらもペプチドである場合、二官能性化合物は化学的に合成されるか、あるいは互いに直接結合された、またはペプチドリンカーにより結合された両成分を含む融合タンパク質として組換えにより発現されてよい。
特定の実施形態では、リジン、グルタミン酸、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に基づく異なる長さのリンカーを用いて、成分を結合させる。分子のＰＥＧとの結合のための化学は当業者に周知である（例えば、全体を参照によって本明細書に援用する、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，"Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ：ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，"Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２２：４０５−４１７（２００１）、Ｚａｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，"Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ｔｏ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌｓ，"Ｅｕｒ．Ｐｌｙｍ．Ｊ．１９（１２）：１１７７−１１８３（１９８３）、Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ，"Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １７０−１８１，Ｈａｒｒｉｓ ＆ Ｚａｌｉｐｓｋｙ Ｅｄｓ．，ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９９７）、Ｄｅｌｇａｄｏ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ Ｕｓｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＰＥＧ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，"Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）、Ｐｅｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｔｕｍｏｕｒ Ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ ｂｙ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ−ＣＥＡ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，"Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７０：１１２６−１１３０（１９９４）、Ｅｙｒｅ ＆ Ｆａｒｖｅｒ，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３７７−３９０（Ｈｏｌｌｅｂ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９９１）、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，"Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｌｉｖｅｓ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｏｆ Ｆｖ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ：ａ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，"Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：９７３−９８１（１９９９）、Ｎｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｔｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ）−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，"Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６：１３３−１５１（１９９１）、Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｔｏ Ｔｕｍｏｕｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，"Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ３：３２１−３４０（１９９６）を参照）。
特定の実施形態において、前記治療物質と前記アデノシン受容体活性化物質（またはアデノシン受容体遮断剤もしくは阻害剤）との結合は、結合試薬、例えばグルタルアルデヒド、ＥＤＣＩ、塩化テレフタロイル、臭化シアンの使用により、または還元的アミノ化により達成することができる。特定の実施形態において、ＷＯ−Ａ−９３１７７１３に開示される種類のヒドロキシ酸リンカーを介して、成分を結合することができる。また、様々なＰＥＧテザー薬物の調製のために、ＰＥＧリンカーを利用してもよい（例えば、全体を参照によって本明細書に援用する、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，"Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｚｉｄｅｓ ｔｏ Ｐｒｉｍａｒｙ Ａｍｉｎｅｓ ｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ Ｂｅａｒｉｎｇ Ｌａｂｉｌｅ Ｅｓｔｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ ＰＥＧ−Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｄ，"Ｙ"−Ｓｈａｐｅｄ Ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｌａｔｅ−Ｔｅｔｈｅｒｅｄ Ｄｒｕｇｓ，"Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔ．，１：１７９−１８１（１９９９）を参照）。他の実施形態において、該アデノシン受容体活性化物質（またはアデノシン受容体遮断剤もしくは阻害剤）はペグ化されていてもよい（例えば、ペグ化アデノシンデアミナーゼ）。
本発明の別の態様は、対象の脳に高分子治療物質を送達する方法に関する。本方法は、対象に、（ａ）Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する作用物質と、（ｂ）高分子治療物質とを投与する段階を含む。
特定の実施形態において、高分子治療物質は、生物活性タンパク質作用物質またはペプチド作用物質であってもよい。かかる生物活性タンパク質作用物質またはペプチド作用物質の例には、細胞調節ペプチド、走化性ペプチド、抗凝固ペプチド、抗血栓ペプチド、抗腫瘍ペプチド、抗感染ペプチド、成長促進ペプチド、および抗炎症ペプチドがある。タンパク質の例には、抗体、酵素、ステロイド、成長ホルモンおよび成長ホルモン放出ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモンならびにそのアゴニストおよびアンタゴニスト類似体、ソマトスタチンおよびその類似体、ゴナドトロピン、ペプチドＴ、サイロカルシトニン、副甲状腺ホルモン、グルカゴン、バソプレシン、オキシトシン、アンジオテンシンＩおよびＩＩ、ブラジキニン、カリジン、副腎皮質刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、インスリン、グルカゴン、さらに前述の分子の数々の類似体および同族体がある。本発明の一部の態様では、ＢＢＢ透過性を本明細書で上述した１つまたはそれ以上の方法によって調節して、抗生物質または抗感染治療可能剤を送達する。かかる抗感染剤は、微生物の活性を減少させるか、または死滅させる。
ペプチド作用物質の性質は、アミノ酸残基を含むこと以外は限定されない。ペプチド作用物質は、合成または天然ペプチドであってよく、天然ペプチドの変異体または誘導体を含む。ペプチドは、直鎖ペプチド、環状ペプチド、拘束ペプチド、またはペプチド模倣体であってもよい。環状ペプチドを作製するための方法は当分野で周知である。例えば、環化は、頭−尾の形で、側鎖−Ｎ−またはＣ−末端残基で、ならびにリンカーを用いた環化で達成することができる。環状ペプチドの選択性および活性度は、その三次元構造を制御する、環状ペプチドの環全体のサイズに依存する。したがって、環化は、疾患状態の進行を調べるため、また特定の病的タンパク質の自己凝集状態を標的とするための強力な手段を提供する。
一部の実施形態において、ペプチド作用物質は、神経学的病状に関連する標的タンパク質または構造体と特異的に結合する。これらの実施形態によると、本発明は、診断または治療のための、神経学的病状に関連する標的タンパク質または構造体の選択的標的化に有用な作用物質を提供する。本発明による有用なペプチド作用物質は、例えば、米国特許出願公開第２００９／０２３８７５４号（Ｗｅｇｒｚｙｎ ｅｔ ａｌ．）に記載されており、前記特許出願は参照によりその全体が本明細書に援用される。
他の実施形態において、ペプチド作用物質は、神経学的病状、例えば、脳卒中、脳血管疾患、てんかん、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）；アルツハイマー病（ＡＤ）のアミロイドプラーク中のＡβ−ペプチド、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、および脳血管病変（ＣＶＤ）；パーキンソン病のレビー小体中のα−シヌクレイン沈着、前頭側頭型認知症およびピック病における神経原線維変化中のタウ；筋萎縮性側索硬化症におけるスーパーオキシドジスムターゼ；さらにハンチントン病ならびに良性および癌性脳腫瘍、例えば神経膠芽腫、下垂体腫瘍、または髄膜腫におけるハンチンチンに関連する標的タンパク質または他の構造体と特異的に結合する。
一部の実施形態において、ペプチド作用物質に、上述のアルファらせんからベータシートへの変化以外の立体配座変化、例えばベータシートからアルファらせんへの変化、不定形からベータシートへの変化などが生じる。かかるペプチド作用物質は、神経学的病状に関連する標的ペプチドまたは構造体との相互作用時に、かかる立体配座変化を生じ得る。
他の実施形態において、ペプチド作用物質は、神経学的病状と関連する標的タンパク質または構造体、例えばアミロイド形成疾患に関連する標的タンパク質または構造体（例えば、特定の立体配座または自己凝集状態）と特異的に結合する抗体、例えば抗アミロイド抗体６Ｅ１０およびＮＧ８である。他の抗アミロイド抗体は、他の神経学的病状と関連するタンパク質または構造体と特異的に結合する抗体と同様に当分野で既知である。
特定の実施形態において、高分子治療物質はモノクローナル抗体である。好適なモノクローナル抗体には、６Ｅ１０、ＰＦ−０４３６０３６５、１３１Ｉ−ｃｈＴＮＴ−１／Ｂ ＭＡｂ、１３１Ｉ−Ｌ１９ＳＩＰ、１７７Ｌｕ−Ｊ５９１、ＡＢＴ−８７４、ＡＩＮ４５７、アレムツズマブ、抗ＰＤＧＦＲαモノクローナル抗体ＩＭＣ−３Ｇ３、アスタチンＡｔ２１１モノクローナル抗体８１Ｃ６、バピネオズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、シクスツムマブ、ダクリズマブ、Ｈｕ ＭｉＫ−β−１、ＨｕＭａｘ−ＥＧＦｒ、ヨウ素Ｉ−１３１モノクローナル抗体３Ｆ８、ヨウ素Ｉ−１３１モノクローナル抗体８１Ｃ６、ヨウ素Ｉ−１３１モノクローナル抗体８Ｈ９、ヨウ素Ｉ−１３１モノクローナル抗体ＴＮＴ−１／Ｂ、ＬＭＢ−７免疫毒素、ＭＡｂ−４２５、ＭＧＡＷＮ１、Ｍｅｌ−１４ Ｆ（ａｂ'）２、Ｍ−Ｔ４１２、ナタリズマブ、ノイラジアブ（Ｎｅｕｒａｄｉａｂ）、ニモツズマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ＳＤＺ ＭＳＬ−１０９、ソラネズマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、ザルツムマブ、タネズマブ、アフリベルセプト、ＭＥＤＩ−５７８、ＲＥＧＮ４７５、ムロモナブ−ＣＤ３、アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、アダリムマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、トシツモマブ−Ｉ１３１、エファリズマブ、アブシキシマブ、セルトリズマブペゴル、エクリズマブ、ＡＭＧ−１６２、ザノリムマブ、ＭＤＸ−０１０、抗０ＭＲＳＡ ｍＡｂ、パキセリズマブ、メポリズマブ、エプラツズマブ、抗ＲＳＶ ｍＡｂ、アフェリモマブ、カツマキソマブ、ＷＸ−Ｇ２５０、またはそれらの組み合わせがある。
特定の実施形態において、高分子治療物質は、ペプチド検出剤である。例えば、ペプチド検出剤には、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ストレプトアビジン、酵素、酵素基質、および当分野で既知の他のペプチド検出剤がある。
他の実施形態において、高分子治療物質は、ペプチド高分子および小ペプチドを含む。例えば、神経栄養タンパク質は、本明細書に記載の方法に関して、ペプチド作用物質として有用である。神経栄養タンパク質には、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、ニューロトロフィン−５（ＮＴ−５）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、グリア由来ネキシン（ＧＤＮ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、インターロイキン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、およびＳ１００βタンパク質、ならびにそれらの生物活性誘導体および類似体がある。
神経活性ペプチドには、視床下部放出ホルモン、脳下垂体ホルモン、下垂体ペプチド、無脊椎動物ペプチド、胃腸ペプチド、心臓で認められるペプチド、例えば心房性ナトリウム利尿（ｎａｔｕｒｅｔｉｃ）ペプチド、および他の神経活性ペプチドのサブクラスも含まれる。視床下部放出ホルモンには、例えば、チロトロピン放出ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、ソマトスタチン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、および成長ホルモン放出ホルモンがある。脳下垂体ホルモンには、例えば、バソプレシン、オキシトシン、およびニューロフィジンなどの化合物がある。下垂体ペプチドには、例えば、副腎皮質刺激ホルモン、β−エンドルフィン、α−メラニン細胞刺激ホルモン、プロラクチン、黄体形成ホルモン、成長ホルモン、およびチロトロピンがある。好適な無脊椎動物ペプチドには、例えば、ＦＭＲＦアミド、ヒドラヘッド（ｈｙｄｒａ ｈｅａｄ）活性化物質、プロクトリン、小心臓ペプチド、ミオモジュリン、ブッカリン、産卵ホルモン、および嚢細胞ペプチドがある。胃腸ペプチドには、例えば、血管作動性腸管ペプチド、コレシストキニン、ガストリン、ニューロテンシン、メチオニンエンケファリン、ロイシンエンケファリン、インスリンおよびインスリン様成長因子ＩおよびＩＩ、グルカゴン、ペプチドヒスチジンイソロイシンアミド、ボンベシン、モチリン、およびセクレチンが含まれる。他の神経活性ペプチドの例には、アンジオテンシンＩＩ、ブラジキニン、ダイノルフィン、オピオコルチン、睡眠ペプチド、カルシトニン、ＣＧＲＰ（カルシトニン遺伝子関連ペプチド）、神経ペプチドＹ、神経ペプチドＹｙ、ガラニン、サブスタンスＫ（ニューロキニン）、フィサレミン、カッシニン、ウペロレイン、エレドイシン、および心房性ナトリウム利尿（ｎａｔｕｒｅｔｉｃ）ペプチドがある。
またさらなる実施形態において、高分子治療物質は、シナプス小胞膜と関連するタンパク質、例えばカルシウム結合タンパク質および他のシナプス小胞タンパク質である。カルシウム結合タンパク質のサブクラスには、細胞骨格関連タンパク質、例えば、カルデスモン、アネキシン、カレレクトリン（哺乳動物）、カレレクトリン（シビレエイ）、カルパクチンＩ、カルパクチン複合体、カルパクチンＩＩ、エンドネキシンＩ、エンドネキシンＩＩ、タンパク質ＩＩ、シネキシンＩ；および酵素モジュレータ、例えばｐ６５が含まれる。他のシナプス小胞タンパク質には、移行阻害剤（例えば、シナプシンＩａ、ｂおよびシナプシンＩＩａ、ｂ）、可能な融合タンパク質、例えばシナプトフィジン、および未知の機能を有するタンパク質、例えばｐ２９、ＶＡＭＰ−１、２（シナプトブレビン）、ＶＡＴ１、ｒａｂ ３Ａ、およびｒａｂ ３Ｂがある。
また、高分子治療物質は、α−、β−、およびγ−インターフェロン、エポエチン、フィルグラスチム、サルグラモスチム、ＣＳＦ−ＧＭ、ヒト−ＩＬ、ＴＮＦ、ならびに他のバイオ技術薬も含む。
また、高分子治療物質は、組換えバイオ技術法を用いて得られたペプチド、タンパク質、および抗体も含む。
また、高分子治療物質は、直接または間接的にタンパク質が凝集する、および／またはアミロイドプラークもしくは沈着を形成するのを阻害する、および／またはアミロイドプラークもしくは沈着の脱凝集もしくは減少を促進する、「抗アミロイド剤」または「抗アミロイド形成剤」も含む。また、抗アミロイド剤は、「アミロイド破壊物」または「プラーク破壊物」と当分野で一般に称される作用物質も含む。これらには、ペプチド模倣体であり、アミロイド線維と相互作用してゆっくりとそれらを溶解する薬物を含む。「ペプチド模倣体」とは、生物分子が、別の生物活性ペプチド分子の活性を模倣することを意味する。また、「アミロイド破壊物」または「プラーク破壊物」は、アミロイド線維が安定を保つために必要な補因子を吸収する作用物質も含む。
抗アミロイド剤には、参照によりその内容全体が本明細書に援用される、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１６７３８号（ＷＯ２００８／０１３８５９）および米国特許出願第１１／８２８，９５３号に記載されているような抗体およびペプチドプローブも含まれる。その中に記載されるように、所定の標的タンパク質に対するペプチドプローブはそのタンパク質に特異的に結合し、その標的タンパク質の特定の構造形態に優先的に結合することができる。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ペプチドプローブによる標的タンパク質の結合は標的タンパク質の高次集合体の形成を阻止し、それによって標的タンパク質に関連する疾患を予防もしくは治療する、および／または疾患のさらなる進行を防止すると考えられる。例えば、ペプチドプローブの標的タンパク質のモノマーとの結合は、標的タンパク質の自己凝集を阻止するであろう。同様に、ペプチドプローブの可溶性オリゴマーまたは不溶性凝集体との結合は、さらなる凝集並びに前原線維および線維形成を阻止し、一方ペプチドプローブの前原線維または線維との結合は、その構造のさらなる拡大を阻止するであろう。さらなる凝集を遮断することに加え、この結合はまた、平衡をシフトさせて可溶性モノマーにより有利な状態に戻し、疾患の進行をさらに食い止め、疾患症状を軽減することができる。
一実施形態において、高分子治療物質は、１つまたは複数のアミノ酸置換、付加、または欠失、例えば１つまたは複数の保存的アミノ酸置換、付加、または欠失、および／またはＢＢＢを越える抱合体の透過性をさらに向上させる１つまたは複数のアミノ酸置換、付加、または欠失を含む、上述のペプチド作用物質の変異体である。例えば、より疎水性のアミノ酸配列をもたらすアミノ酸置換、付加、または欠失は、ＢＢＢを越える抱合体の透過性をさらに向上させ得る。
別の実施形態において、高分子治療物質は、サイズ約１５０ｋＤａである。さらに別の実施形態において、該治療物質は、サイズ最大約１０，０００Ｄａ、サイズ最大約７０，０００Ｄａ、またはサイズ最大約１５０ｋＤａである。またさらなる実施形態において、該治療物質は、サイズが約１０，０００〜約７０，０００Ｄａ、約７０，０００Ｄａ〜１５０ｋＤａ、または約１０，０００Ｄａ〜約１５０ｋＤａである。
一実施形態において、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する作用物質は、治療用高分子よりも前に投与される。さらなる実施形態において、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する作用物質は、高分子治療物質の５分前、１０分前、１５分前、３０分前、１時間前、２時間前、３時間前、４時間前、５時間前、６時間前、７時間前、８時間前、９時間前、１０時間前、１１時間前、１２時間前、１３時間前、１４時間前、１５時間前、１６時間前、１７時間前、または１８時間前までに投与してよい。
別の実施形態において、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する１つまたは複数の作用物質は、治療用高分子と同時に投与される。
本発明の別の態様は、対象において、ＣＮＳの疾患、障害、または病状を治療するための方法に関する。本方法は、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する少なくとも１つの作用物質と、治療物質とを対象に投与する段階を含む。
好適な治療物質は上記に記載され、これは低分子治療物質、高分子治療物質、またはそれらの組み合わせを含み得る。
一実施形態において、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する作用物質は、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者のアゴニストである。さらなる実施形態において、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者のアゴニストは、広域スペクトルアデノシン受容体アゴニスト、例えばＮＥＣＡ、アデノシン、アデノシン誘導体、またはそれらの組み合わせである。
本発明の別の態様は、対象において、ＣＮＳの疾患、障害、または病状を治療する方法に関する。本方法は、対象に、（ａ）アデノシン受容体アゴニストと、（ｂ）Ａ２Ａ受容体アゴニストと、（ｃ）治療物質とを投与する段階を含む。
本発明の本態様による一実施形態において、Ａ１アデノシン受容体アゴニストおよび／またはＡ２Ａアデノシン受容体アゴニストは選択的アゴニストである。
好適なＡ１選択的アデノシン受容体アゴニスト、Ａ２Ａ選択的アデノシン受容体アゴニスト、および治療物質（ならびにそれらの調製および投与）は上記に記載される。
さらなる実施形態において、本方法は、ＣＮＳの疾患、障害、または病状の治療または予防を必要とする対象を選択する段階、治療物質を供給する段階、および選択された該対象に、該治療物質が血液脳関門を通過して、ＣＮＳの疾患、障害、または病状を治療または予防するのに効果的な条件下で、該治療物質と、Ａ１アデノシン受容体アゴニストと、Ａ２Ａ受容体アゴニストとを投与する段階をさらに含む。
一実施形態において、Ａ１アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２Ａアデノシン受容体アゴニストは、単一単位剤形として製剤化される。
別の実施形態において、Ａ１アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２Ａアデノシン受容体アゴニストは、同時に投与される。
またさらなる実施形態において、Ａ１アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２Ａアデノシン受容体アゴニストは、連続的に投与される。
別のさらなる実施形態において、方法は、Ａ１アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２Ａアデノシン受容体アゴニストと、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、またはビヒクルとを含む組成物を投与する段階をさらに含む。
本発明の別の態様は、対象の血液脳関門の透過性を一時的に増加させる方法に関する。本方法は、血液脳関門の透過性の一時的増加を必要とする対象を選択する段階、Ａ１アデノシン受容体またはＡ２Ａアデノシン受容体のいずれかを活性化する作用物質を供給する段階、ならびに選択された対象に、血液脳関門の透過性を一時的に増加させるのに効果的な条件下で、Ａ１アデノシン受容体活性化物質またはＡ２Ａアデノシン受容体活性化物質のいずれかを投与する段階を含む。
一実施形態において、Ａ１活性化物質またはＡ２Ａ活性化物質は、Ａ１アゴニストまたはＡ２Ａアゴニストである。さらなる実施形態において、Ａ１アデノシン受容体活性化物質またはＡ２Ａアデノシン受容体活性化物質は、Ａ１選択的アデノシン受容体アゴニストまたはＡ２選択的アデノシン受容体アゴニストである。好適なＡ１アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２Ａアデノシン受容体アゴニストは当業者に既知であり、上記に詳細に記載される。
本発明の本態様のさらなる実施形態において、方法は、治療物質を対象に投与する段階をさらに含む。好適な治療物質は、上記に詳細に記載される。
一実施形態において、Ａ１アデノシン受容体またはＡ２Ａアデノシン受容体を活性化する作用物質は、治療物質の前に投与される。さらなる実施形態において、Ａ１アデノシン受容体またはＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する作用物質は、治療物質の５分前、１０分前、１５分前、３０分前、１時間前、２時間前、３時間前、４時間前、５時間前、６時間前、７時間前、８時間前、９時間前、１０時間前、１１時間前、１２時間前、１３時間前、１４時間前、１５時間前、１６時間前、１７時間前、または１８時間前までに投与してよい。
別の実施形態において、Ａ１アデノシン受容体またはＡ２Ａアデノシン受容体を活性化する作用物質と、治療物質とを、同時に投与する。
本発明の別の態様は、対象において、ＢＢＢ透過性を減少させる方法を対象とする。本方法は、対象または患者に、Ａ２Ａアデノシン受容体シグナル伝達を遮断もしくは阻害する作用物質を投与する段階を含む。
ＢＢＢ透過性を減少させる際、選択される対象は、炎症性疾患を有してもよい。かかる炎症性疾患には、炎症のメディエータが血液脳関門を通過するものが含まれる。かかる炎症性疾患には、細菌感染、ウイルス感染症、または自己免疫疾患に起因する炎症が含まれるが、これらに限定されない。より具体的には、かかる疾患には、髄膜炎、多発性硬化症、視神経脊髄炎、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）−１脳炎、単純ヘルペスウイルス（「ＨＳＶ」）脳炎、トキソプラズマ原虫脳炎、および進行性多巣性白質脳症が含まれるが、これらに限定されない。
ＢＢＢ透過性を減少させる場合、選択される対象は、リンパ球の脳内への進入によって仲介される病状を有してもよい。このような形で治療可能な他の病状には、脳の脳炎、パーキンソン病、てんかん、ＨＩＶ−ＡＩＤＳの神経症状、狼瘡の神経学的後遺症、およびハンチントン病、髄膜炎、多発性硬化症、視神経脊髄炎、ＨＳＶ脳炎、ならびに進行性多巣性白質脳症がある。
本発明の本態様は、上述の薬学的製剤化方法および投与方法を用いて実施することができる。
対象においてアデノシン受容体活性を変化させて血液関門透過性を減少させることは、Ａ２Ａアデノシン受容体の不活性化または遮断によって達成することができるが、これらに限定されない。
多くのアデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニストが当業者に既知であり、本明細書において記載する方法において、個別に使用しても、または併用してもよい。かかるアンタゴニストには、（−）−Ｒ，Ｓ）−メフロキン（Ｍｅｆｌｏｑｕｉｎｅ（商標）として販売されるラセミ混合物の活性エナンチオマー）、３，７−ジメチル−１−プロパルギルキサンチン（ＤＭＰＸ）、３−（３−ヒドロキシプロピル）−７−メチル−８−（ｍ−メトキシスチリル）−１−プロパルギルキサンチン（ＭＸ２）、３−（３−ヒドロキシプロピル）−８−（３−メトキシスチリル）−７−メチル−１−プロパルギルキサンチンホスフェートジナトリウム塩（ＭＳＸ−３、ＭＳＸ−２のホスフェートプロドラッグ）、７−メチル−８−スチリルキサンチン誘導体、ＳＣＨ ５８２６１、ＫＷ−６００２、アミノフリルトリアゾロ−トリアジニルアミノエチルフェノール（ＺＭ ２４１３８５）、および８−クロロスチリル−カフェイン、ＫＦ１７８３７、ＶＲ２００６、イストラデフィリン、ＶＥＲＮＡＬＩＳ薬物、例えばＶＥＲ ６４８９、ＶＥＲ ６６２３、ＶＥＲ ６９４７、ＶＥＲ ７１３０、ＶＥＲ ７１４６、ＶＥＲ ７４４８、ＶＥＲ ７８３５、ＶＥＲ ８１７７ＶＥＲ−１１１３５、ＶＥＲ−６４０９、ＶＥＲ ６４４０、ＶＥＲ ６４８９、ＶＥＲ ６６２３、ＶＥＲ ６９４７、ＶＥＲ ７１３０、ＶＥＲ ７１４６、ＶＥＲ ７４４８、ＶＥＲ ７８３５、ＶＥＲ ８１７７、ピラゾロ［４，３−ｅ］１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン、および５−アミノ−イミダゾロ−［４，３−ｅ］−１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジンなど（全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００６／０１２８７０８号（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．））、ピラゾロ［４，３−ｅ］−［１，２，４］−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン（例えば、全体を参照によって本明細書に援用する、ＷＯ０１／９２２６４（Ｋａｓｅ ｅｔ ａｌ．）を参照）、２，７−二置換−５−アミノ−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン（例えば、全体を参照によって本明細書に援用する、ＷＯ０３／０４８１６３（Ｋａｓｅ ｅｔ ａｌ．）を参照）、２，５−二置換−７−アミノ−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］［１，３，５］トリアジン（例えば、全体を参照によって本明細書に援用する、Ｖｕ ｅｔ ａｌ．，"Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ［１，２，４］Ｔｒｉａｚｏｌｏ［１，５−ａ］［１，３，５］ｔｒｉａｚｉｎｅ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ａ２Ａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ，" Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４７（１７）：４２９１−４２９９（２００４）を参照）、９−置換−２−（置換−エチン−１−イル）−アデニン（例えば、全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，２１７，７０２号（Ｂｅａｕｇｌｅｈｏｌｅ ｅｔ ａｌ．）を参照）、７−メチル−８−スチリルキサンチン誘導体、ピラゾロ［４，３−ｅ）１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン、および５−アミノ−イミダゾロ−［４，３−ｅ］−１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン（例えば、全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００６／０１２８７０８号（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．）を参照）があるが、これらに限定されない。これらのアデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニストは、例示的であることを意図し、限定するものではない。
本発明のまたさらなる態様は、ＢＢＢ透過性を増加させ、その後ＢＢＢ透過性を減少させる方法に関する。本方法は、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体を活性化する１つまたは複数の作用物質の投与、その後のＡ２Ａアデノシン受容体シグナル伝達を遮断または阻害する作用物質の投与を含む。
一実施形態において、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体を活性化する１つまたは複数の作用物質は、治療物質とともに投与される。別の実施形態において、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する１つまたは複数の作用物質は、治療物質の前に投与される。本実施形態において、Ａ２Ａアデノシン受容体シグナル伝達を遮断または阻害する作用物質は、治療物質の投与後に投与される。
本発明のまた別の態様は、ＢＢＢ内皮細胞のアクチン細胞骨格を再構築する方法に関する。本方法は、内皮細胞をＡ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する１つまたは複数の作用物質に接触させる段階を含む。
アクチン細胞骨格は、細胞形状を維持するために不可欠である。内皮関門透過性は、アクチン細胞骨格の再構成によって影響され得る。アクチン細胞骨格は、皮質のアクチン辺縁、アクトミオシンストレスファイバー、および膜骨格のアクチン架橋の３つの独特な構造に構成される（Ｐｒａｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ Ａｃｔｉｎ Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ ｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ，"Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．７７：５３−６３（２００９）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。これらの構造は、内皮細胞の形状の制御において独自の役割を果たす。
一実施形態によると、アクチン細胞骨格の再構築は、内皮細胞間の間隔を増加させ、かつＢＢＢ透過性を増加させる。
好適なＡ１アデノシン受容体活性化物質およびＡ２Ａアデノシン受容体活性化物質は、上記に記載される。
本発明の本態様による一実施形態において、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者の活性化は、ＢＢＢ透過性に関して相乗的である。さらに別の実施形態において、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者の活性化は、ＢＢＢ透過性に関して相加的である。
Ａ１ ＡＲおよびＡ２Ａ ＡＲのＢＢＢ透過性の重要なメディエータとしての特定は、分子機序への第一歩となるが、内皮細胞における細胞変化を促進する特定の下流因子を解明するためには多くの研究が残されている。アデノシン受容体は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質と関連する、受容体と結合したＧタンパク質である。いくつかのＧαサブユニットが、タイトジャンクションで特定されている（Ｄｅｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｌｐｈａ Ｓｕｂｕｎｉｔ ｉｎ Ｔｉｇｈｔ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，"Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２５７５０−３（１９９６）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。これらのＧαサブユニットは、細胞骨格の再構築に関与するＲｈｏＡおよびＲａｃ１のような下流の酵素の活性に影響を与えることが知られている。実際に、他のグループによる研究は、ＲｈｏＡおよびＲａｃ１低分子ＧＴＰアーゼが、細胞外シグナル伝達に関与し、アクチン細胞骨格の変化を仲介することを示唆している（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，"Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ａｌｔｅｒ Ｂｒａｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｔｉｇｈｔ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｖｉａ ＲｈｏＡ，ＰＩ３ ｋｉｎａｓｅ，ａｎｄ ＰＫＢ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，"Ｆａｓｅｂ Ｊ．２１：３６６６−７６（２００７）、Ｊｏｕ ｅｔ ａｌ．，"Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｉｇｈｔ Ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ＲｈｏＡ ａｎｄ Ｒａｃｌ Ｓｍａｌｌ ＧＴＰａｓｅｓ，" Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４２，１０１−１５（１９９８）、およびＷｏｊｃｉａｋ−Ｓｔｏｔｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，"Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｃｔｉｎ Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ Ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｒｈｏ，Ｒａｃ，ａｎｄ Ｃｄｃ４２ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ，"Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７６：１５０−１６５（１９９８）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。さらに、アデノシンがＲｈｏ ＧＴＰアーゼを介してアクチンに影響を与えるということが証明されている（Ｓｏｈａｉｌ ｅｔ ａｌ．，"Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ｌｏｓｓ ｏｆ Ａｃｔｉｎ Ｓｔｒｅｓｓ Ｆｉｂｅｒｓ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｅｐａｔｉｃ Ｓｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｒｈｏ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，" Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４９：１８５−９４ ２００９）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。重要なことに、ＴＮＦ−αおよびトロンビンのような標準的な損傷シグナルに起因する炎症は、細胞骨格再構成によってタイトジャンクションを変化させて、ＢＢＢ透過性を増加させる（Ｗｏｊｃｉａｋ−Ｓｔｏｔｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，"Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｃｔｉｎ Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｃｅｌｌ−Ｃｅｌｌ Ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｒｈｏ，Ｒａｃ，ａｎｄ Ｃｄｃ４２ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ，" Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７６：１５０−６５（１９９８）、およびＬｕｍ ｅｔ ａｌ．，"Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ，" Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７４：７８７−８００（１９９６）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。脳内皮細胞のＡ１ ＡＲおよびＡ２Ａ ＡＲの活性化によって生じるシグナル伝達事象は、アクチン細胞骨格の再構築をもたらし、これは細胞形状を変化させることによって、内皮細胞間の間隔を増加させ、分子の拡散を増加させる。アデノシンは、同様の方式で他の内皮細胞関門特性に影響を与えることが示されている（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，"Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ Ａｇａｉｎｓｔ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｅｄｅｍａ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ− ａｎｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａ２−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｂａｒｒｉｅｒ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，"Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９８：Ｌ７５５−６７（２０１０）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。しかしながら、今回は、脳内皮細胞単層におけるアクトミオシンストレスファイバー形成は、特定のアゴニストによるＡ１ ＡＲまたはＡ２Ａ ＡＲの活性化時に観察された。反対に、ＡＲアンタゴニストによるこれらの受容体の遮断は、逆の形で作用し、細胞間の緊密性の増加をもたらす。ＡＲからの活性なシグナル伝達がない場合には、このモデルは厳重な関門を支持する（図２５）。このことは、ＡＲ活性化とストレスファイバー形成との強い相関を示す。ＡＲアゴニストがＢＥＣ単層におけるＴＥＥＲも減少させるという今回の観察を併せて考慮すると、細胞骨格要素を介して作用するＡＲ調節が、関門透過性を増加させる内皮細胞形状の変化をもたらすことが示される。
以下の実施例は、本発明の実施形態を説明するために提供されるが、決して本発明の範囲を限定することは意図しない。
実施例１−マウス
Ｃｄ７３−／−マウスは以前に記載されており（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｃｒｕｃｉａｌ Ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｅｃｔｏ−５'−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ（ＣＤ７３）ｉｎ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｌｅａｋａｇｅ Ｄｕｒｉｎｇ Ｈｙｐｏｘｉａ，"Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：１３９５−１４０５（２００４）（その全体を参照によって本明細書に援用する））、Ｃ５７ＢＬ／６に１４世代の戻し交配が行われている。Ｃｄ７３−／−マウスは、インビボおよびインビトロアッセイ法おいて、感染に対して明白な感受性を有さず、そのリンパ器官のサイズおよび細胞組成、ならびにそのＴ細胞応答およびＢ細胞応答に基づくと正常であると考えられる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｃｒｕｃｉａｌ Ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｅｃｔｏ−５'−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ（ＣＤ７３） ｉｎ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｌｅａｋａｇｅ Ｄｕｒｉｎｇ Ｈｙｐｏｘｉａ，"Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：１３９５−１４０５（２００４）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＣ５７ＢＬ／６マウスおよびｔｃｒａ−／−マウスをＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。マウスは、Ｃｏｒｎｅｌｌ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙまたはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｕｒｋｕにおいて、特定病原体除去条件下で交配および飼育された。アデノシン受容体遮断実験では、マウスに、０．６ｇ／Ｌのカフェイン（Ｓｉｇｍａ）を補充した飲用水、あるいはＤＭＳＯ（ＰＢＳ中４５％ ｖｏｌ．）中のＳＣＨ５８２６１ ２ｍｇ／ｋｇ（皮下１ｍｇ／ｋｇおよび腹腔内１ｍｇ／ｋｇ）、または４５％ＤＭＳＯのみをＥＡＥ誘導の１日前から与え始め、実験中与え続けた。マウスに対して行った全ての手順は、関連する動物実験委員会により承認されている。
実施例２−ＥＡＥ誘導およびスコア付け
全体を参照により本明細書に援用する、Ｓｗａｎｂｏｒｇ，"Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｉｎ Ｒｏｄｅｎｔｓ ａｓ ａ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ Ｄｉｓｅａｓｅ，"Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．７７：４−１３（１９９５）およびＢｙｎｏｅ ｅｔ ａｌ．，"Ｅｐｉｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ｔ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ Ｐｒｅｖｅｎｔ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｌｌｅｒｇｉｃ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，"Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９：３１７−３２８（２００３）に記載されているように、マウスにミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（「ＭＯＧ」）ＥＡＥ誘導措置を実施して、ＥＡＥを誘導した。簡単に述べると、ＭＯＧ３５−５５ペプチド（ＰＢＳ中３ｍｇ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ，Ｓｉｇｍａ）との１：１乳剤を各側腹部に皮下注射した（５０μｌ）。百日咳毒素（ＰＴＸ、２０ｎｇ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を免疫時および再び２日後に静脈内投与（ＰＢＳ中２００μｌ）した。疾患症状重症度に基づいて、ＥＡＥについてマウスに毎日スコア付けを行った：０＝疾患なし、０．５〜１＝尾の衰弱／引きずり、２＝尾の引きずりおよび後肢部分麻痺、３＝完全後肢麻痺、４＝後肢および前肢両方の麻痺、５＝死亡。スコア４のマウスは、安楽死させた。
実施例３−Ｔ細胞の調製および養子移入
マウスを、ＰＴＸを含まないＣＦＡ中のＭＯＧ３５−５５ペプチドで刺激した。１週間後、脾臓およびリンパ節からリンパ球を採取し、ＡＣＫ緩衝液（０．１５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）とともにインキュベートして赤血球を溶解した。細胞をＣＤ８抗体（ＴＩＢ−１０５）、ＩＡｂ，ｄ，ｖ，ｐ，ｑ，ｒ抗体（２１２．Ａ１）、ＦｃＲ抗体（２．４−Ｇ２）、Ｂ２２０抗体（ＴＩＢ−１６４）、ＮＫ１．１抗体（ＨＢ１９１）、次いでＢｉｏＭａｇヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭ、およびヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｑｉａｇｅｎ）とともにインキュベートした。負磁気の強化後、ＣＤ４＋細胞を、直接使用するか、あるいは特定の亜集団にさらに選別した。選別のために、ＣＤ４抗体（ＲＭ４−５）およびＣＤ７３抗体（ＴＹ／２３）で、一部の実験においてはＣＤ２５抗体（ＰＣ６１）で細胞を染色し、次いでＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて単離した。選別後の純度は、常に９９％を上回った。養子移入のために、全ＣＤ４＋または選別したＴ細胞を洗浄し、滅菌ＰＢＳ中に再懸濁させた。レシピエントマウスに、２００μｌの滅菌ＰＢＳ中の２．５×１０６以下の細胞を静脈投与した。
実施例４−フローサイトメトリー
細胞懸濁液をＣＤ４に対する蛍光色素結合抗体（ＲＭ４−５）、ＣＤ７３に対する蛍光色素結合抗体（ＴＹ／２３）、またはＦｏｘＰ３に対する蛍光色素結合抗体（ＦＪＫ−１６ｓ）で染色した。細胞内ＦｏｘＰ３染色は、製造業者（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の使用説明書に従って実行した。染色された細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に捕集した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）でデータを分析した。
実施例５−Ｔ細胞サイトカインアッセイ法
ＭＯＧ免疫マウスから選別したＴ細胞を照射Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞の存在下で、０または１０μＭ ＭＯＧペプチドとともに培養した。上澄みを１８時間後に回収し、Ｂｉｏ−ｐｌｅｘサイトカイン（Ｂｉｏｒａｄ）アッセイ法を用いて、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１β、およびＴＮＦαについてアッセイした。
実施例６−免疫組織化学検査（「ＩＨＣ」）
麻酔したマウスをＰＢＳで灌流し、脳、脾臓、および脊髄を単離し、Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ−ＯＣＴ培地中で瞬間凍結した。５μｍ切片（矢状方向の脳）をＳｕｐｅｆｒｏｓｔ／Ｐｌｕｓスライド（Ｆｉｓｈｅｒ）に付着させ、アセトン中で固定し、−８０°Ｃで保存した。免疫染色のために、スライドをＰＢＳ中０．０３％のＨ２Ｏ２で解凍および処理して内因性ペルオキシダーゼをブロックし、正常ヤギ血清（Ｚｙｍｅｄ）中のカゼイン（Ｖｅｃｔｏｒ）でブロックし、その後抗ＣＤ４５（ＹＷ６２．３）、抗ＣＤ４（ＲＭ４−５）、または抗ＩＣＡＭ−１（３Ｅ２）とともにインキュベートした。スライドをビオチン化ヤギ抗ラットＩｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）およびストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｚｙｍｅｄ）とともにインキュベートし、ＡＥＣ（赤色）基質キット（Ｚｙｍｅｄ）およびヘマトキシリン対比染色を用いて呈色した。カバーグラスでＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇを用いて封入し、照明下で撮影した（Ｚｅｉｓｓ）。
実施例７−リアルタイムｑ−ＰＣＲ
トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、Ｚ３１０脈絡叢細胞株からＲＮＡを単離した（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，"Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ Ｚ３１０ Ｃｈｏｒｏｉｄａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ｆｒｏｍ Ｍｕｒｉｎｅ Ｃｈｏｒｏｉｄ Ｐｌｅｘｕｓ，"Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．９５８：３７１−３８０（２００２）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。Ｒｅｖｅｒｓｅ−ｉＴキット（ＡＢＧｅｎｅ）を使用して、ｃＤＮＡを合成した。ＡＲに対して特異的なプライマー（要求に応じて使用可能）を使用して遺伝子発現レベルを測定し、ＡＢＩ ７５００リアルタイムＰＣＲシステム上で作動するＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎキット（ＡＢＧｅｎｅ）を使用してＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子レベルに標準化した。融解曲線分析を実施して、それぞれのｑＰＣＲ産物の特異性を測定した。
実施例８−ＥＡＥにおけるＣＤ７３の役割の評価
アデノシンの免疫調節特性および免疫抑制特性により、ＥＡＥにおけるＣＤ７３の役割を評価した。Ａ１アデノシン受容体（ＡＲ）欠損マウスにおけるＥＡＥ悪化の報告に基づき（Ｔｓｕｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，"Ａ１ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，"Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１５２１−１５２９（２００４）（その全体を参照によって本明細書に援用する））、細胞外アデノシンの生成を触媒することができないｃｄ７３−／−マウスは、重篤なＥＡＥを生じることが予想された。驚くべきことに、ｃｄ７３−／−マウスは、ＥＡＥの誘導に対して高い抵抗性を有した。しかしながら、ｃｄ７３−／−マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＮＳ抗原に対して免疫応答を生じる能力を有し、ｃｄ７３＋／＋Ｔ細胞欠損マウスに養子移入した場合、重篤なＥＡＥを生じる。また、野生型マウス由来のＣＤ７３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞もｃｄ７３−／−レシピエントに移入したときに疾患を生じたが、これはリンパ球上またはＣＮＳ中のいずれかにおけるＣＤ７３発現が、ＥＡＥにおいて脳にリンパ球が進入するために必要であることを示唆する。ｃｄ７３＋／＋マウスが広域スペクトルＡＲアンタゴニストカフェインおよびＡ２Ａ ＡＲ特異的アンタゴニストＳＣＨ５８２６１によりＥＡＥ誘導から保護されたことから、このデータは、ＣＤ７３自体ではなく、ＣＤ７３により生成された細胞外アデノシンが、ＥＡＥにおいてＣＮＳへのリンパ球の進入を制御するということを示唆している。これらの結果は、ＥＡＥ発症の制御におけるＣＤ７３およびアデノシンの役割をはじめて実証した。
実施例９−Ｃｄ７３−／−マウスはＥＡＥ誘導に対する抵抗性を有する
ＣＤ７３がＥＡＥ進行中に炎症を制御することにおいて役割を果たすかどうかを判断するために、ｃｄ７３−／−マウスおよび野生型（ｃｄ７３＋／＋）マウスに、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（「ＭＯＧ」）ＥＡＥ誘導措置を実施した（Ｓｗａｎｂｏｒｇ，"Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｉｎ Ｒｏｄｅｎｔｓ ａｓ ａ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ Ｄｉｓｅａｓｅ，"Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．７７：４−１３（１９９５）、Ｂｙｎｏｅ ｅｔ ａｌ．，"Ｅｐｉｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ｔ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ Ｐｒｅｖｅｎｔ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｌｌｅｒｇｉｃ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，"Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９：３１７−３２８（２００３）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。ＥＡＥ発症を毎日モニターすることにより、ｃｄ７３−／−マウスが、それらの野生型対照物と比較して疾患重症度の劇的な減少を常に示すことが明らかになった（図１）。疾患誘導の３週間後までに、ｃｄ７３−／−マウスは、野生型マウスの平均ＥＡＥスコア２．０（尾の引きずりおよび後肢部分麻痺）と比較して、わずか０．５（尾の衰弱）の平均ＥＡＥスコアを有した（図１）。
実施例１０−ｃｄ７３−／−マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞はＭＯＧ免疫化に応答する
次に、ＥＡＥの誘導に対するｃｄ７３−／−マウスの抵抗性が、免疫反応を抑制するｃｄ７３−／−リンパ球の能力の強化によって、あるいはこれらのリンパ球がＭＯＧ刺激に対して応答不能であることによって説明できるのかという疑問を投げかけた。天然ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞、すなわちＴｒｅｇは、積極的に誘導したＥＡＥを制御することができる（Ｋｏｈｍ ｅｔ ａｌ．，"Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｅｄｇｅ：ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｓｕｐｐｒｅｓｓ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｄｕｒｉｎｇ Ａｃｔｉｖｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，"Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：４７１２−４７１６（２００２）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。Ｔｒｅｇは最近になってＣＤ７３を発現することが示され、いくつかの報告はＣＤ７３の酵素活性がＴｒｅｇ機能に必要とされること示唆しているため（Ｋｏｂｉｅ ｅｔ ａｌ．，"Ｔ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒｉｍｅｄ Ｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ＣＤ４ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＣＤ７３，Ｗｈｉｃｈ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ＣＤ４ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ５'−Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｏ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ，"Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：６７８０−６７８６）、Ｄｅａｇｌｉｏ ｅｔ ａｌ．，"Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＣＤ３９ ａｎｄ ＣＤ７３ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｍｅｄｉａｔｅｓ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ，"Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０４：１２５７−１２６５（２００７）（その全体を参照によって本明細書に援用する））、Ｔｒｅｇの数および抑制活性がｃｄ７３−／−マウスにおいて正常であったかどうかを疑問視した。図２Ａに示すように、ＥＡＥ誘導の前または後のいずれにおいても、野生型マウスおよびｃｄ７３−／−マウスにおけるＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの頻度に有意差はなかった。同様に、ＣＤ７３を発現したＣＤ４＋Ｔ細胞の割合は、野生型マウスにおけるＥＡＥ誘導後、わずかに変化したにすぎなかった（図２Ｂ）。さらに、ＭＯＧ抗原特異的ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の増殖を阻害する野生型およびｃｄ７３−／−Ｔｒｅｇの抑制能力に有意差は観察されなかった。ｃｄ７３−／−Ｔ細胞がＭＯＧペプチドによって刺激されたときに反応できるかどうかを判断するために、増殖し、サイトカインを生成するこれら細胞の能力を評価した。ＭＯＧ免疫ｃｄ７３−／−マウスおよび野生型マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、様々な濃度のＭＯＧペプチドに応答して、同様の程度のインビトロ増殖を示した。しかしながら、ＭＯＧ免疫ｃｄ７３−／−マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、野生型のＣＤ７３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ７３−ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、インビトロＭＯＧ刺激後により高レベルのＩＬ−１７およびＩＬ−１βを分泌した（図２Ｃ）。ＩＬ−１７のレベルの上昇は、ＭＳ（Ｍａｔｕｓｅｖｉｃｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７ ｍＲＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ＣＳＦ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌｓ ｉｓ Ａｕｇｍｅｎｔｅｄ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，"Ｍｕｌｔ．Ｓｃｌｅｒ．５：１０１−１０４（１９９９）（その全体を参照によって本明細書に援用する））およびＥＡＥの発症（Ｋｏｍｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，"ＩＬ−１７ Ｐｌａｙｓ ａｎ Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ Ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，"Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：５６６−５７３（２００６）（その全体を参照によって本明細書に援用する））と関連し、一方高レベルの炎症性ＩＬ−１βサイトカインは、ＭＳの危険因子であり（ｄｅ Ｊｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，"Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−１ｂｅｔａ ａｎｄ ＩＬ−１Ｒａ ａｓ Ｒｉｓｋ Ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｌａｐｓｅ−Ｏｎｓｅｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，"Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１２６：１７２−１７９（２００２）（その全体を参照によって本明細書に援用する））、またＩＬ−１７産生のエンハンサーである（Ｓｕｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，"Ａ Ｃｒｕｃｉａｌ Ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）−１ ｉｎ ｔｈｅ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−１７−Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｔｈａｔ Ｍｅｄｉａｔｅ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，"Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０３：１６８５−１６９１（２００６）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。ＭＯＧ刺激後の野生型Ｔ細胞とｃｄ７３−／−Ｔ細胞との間には、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＮＦ−γおよびＴＮＦ−αの分泌の差は観察されなかった（図２Ｃ）。これらのアッセイ法の結果は全体として、ｃｄ７３−／−Ｔ細胞がＭＯＧ免疫化に十分に応答可能であることを示している。
次いで、ｃｄ７３−／−マウス由来のＴ細胞が、ＥＡＥを発生させる能力を有するかどうかを判断した。このことを試験するために、ｔｃｒａ−／−（ｃｄ７３＋／＋）レシピエントマウスへの移入後にＥＡＥを誘導する能力について、ＭＯＧ免疫ｃｄ７３−／−マウスの脾臓およびリンパ節由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を評価した。Ｔｃｒａ−／−マウスは、内因性Ｔ細胞が欠損し、自力でＥＡＥを発症させることができない（Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，"Ｍｉｃｅ Ｌａｃｋｉｎｇ Ａｌｐｈａ Ｂｅｔａ ＋ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ａｒｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｔｈｅ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，"Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７０：１３９−１４４（１９９６）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。ｃｄ７３−／−ドナーからＣＤ４＋Ｔ細胞を受け取ったＣｄ７３＋／＋ｔｃｒａ−／−レシピエントマウスは、野生型ＣＤ４＋Ｔ細胞を受け取ったものと比較して、著しく重症度の高い疾患を発症させた（図２Ｄ）。野生型およびｃｄ７３−／−ドナーのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ｃｄ７３＋／＋ｔｃｒａ−／−レシピエントマウスへの移入後に、同程度の増殖を示した。したがって、ｃｄ７３−／−マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＥＡＥを誘導できるだけでなく、ｃｄ７３＋／＋ｔｃｒａ−／−マウスに移入したときに野生型マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞よりもより重篤なＥＡＥを発生させる。これらの結果は、ｃｄ７３−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞がＭＯＧ刺激に応答して上昇したレベルのＩＬ−１７およびＩＬ−１β（ＥＡＥを悪化させることが知られている）を分泌したインビトロアッセイ法と一致し（図２Ｃ）、ｃｄ７３−／−マウスが、非造血細胞でＣＤ７３を発現しないため（ＣＮＳにおいて発現しない可能性が高い）、ＭＯＧ誘導ＥＡＥに対して抵抗性を有することを示している。
実施例１１−Ｃｄ７３−／−マウスは、ＥＡＥ誘導後にＣＮＳ内へのリンパ球浸潤をほとんど／全く示さない
ＥＡＥは、主にＣＤ４＋Ｔ細胞媒介疾患であり（Ｍｏｎｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，"Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｂｙ ＣＤ４＋，ＣＤ２５＋ ａｎｄ ＣＤ８＋ Ｔ Ｃｅｌｌｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｕｓｉｎｇ Ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，"Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．２３：１−７（２００４）（その全体を参照によって本明細書に援用する））、ＥＡＥの進行中に、ＣＮＳ抗原に対する炎症応答を開始するために、リンパ球はまずＣＮＳ内にアクセスしなければならず、その結果軸索の脱髄および麻痺をもたらす（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｉｍｅ Ｃｏｕｒｓｅ ａｎｄ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｅｖｅｎｔｓ Ｓｕｇｇｅｓｔ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂａｓｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，"Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５０２：２３６−２６０（２００７）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。ｃｄ７３−／−マウスにおけるＥＡＥ誘導後にＣＮＳリンパ球浸潤が観察されるかどうかを判断するために、脳切片および脊髄切片をＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ４５＋細胞の存在について免疫組織化学検査により検査した。Ｃｄ７３−／−マウスは、野生型マウス（図３Ａ〜Ｃ、Ｇ）と比較して、ＭＯＧ免疫化後１３日目の脳および脊髄におけるＣＤ４＋リンパ球（図３Ｄ〜Ｇ）およびＣＤ４５＋リンパ球（図４［追補：図１］）の劇的に低い頻度を示した。さらに、２ｄ２ ＴＣＲトランスジェニックマウス由来のＭＯＧ特異的Ｔ細胞（Ｂｅｔｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，"Ｍｙｅｌｉｎ Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ Ｄｅｖｅｌｏｐ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｏｐｔｉｃ Ｎｅｕｒｉｔｉｓ，"Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：１０７３−１０８１（２００３）（その全体を参照によって本明細書に援用する））が、野生型マウスまたはｃｄ７３−／−マウスのいずれかに移入し、同時にＥＡＥ誘導を行うリンパ球追跡実験において、野生型レシピエントマウスにおいては、ＣＮＳ中の２ｄ２細胞の割合は経時的に数倍に増加したが、ｃｄ７３−／−レシピエントにおいては、全く増加しなかった（図５）。これらの結果は全体として、ｃｄ７３−／−マウスにおいて観察されたＥＡＥ誘導に対する保護は、大幅に減少したＣＮＳリンパ球浸潤と関連することを示している。しかしながら、ＭＯＧ免疫ｃｄ７３−／−マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＥＡＥを発症するように同時に誘導されたｃｄ７３＋／＋ｔｃｒａ−／−マウスに移入したときに、ＣＮＳにアクセスする能力を有した（図３Ｋおよび３Ｌ）。実際に、ｃｄ７３−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞を受け取ったｃｄ７３＋／＋ｔｃｒａ−／−マウス（図３Ｋ、Ｌ）において、野生型ＣＤ４＋Ｔ細胞を受け取ったもの（図３Ｈ〜Ｊ）よりも早期かつ広範囲のＣＮＳのＣＤ４＋リンパ球浸潤が観察された。したがって、これらの結果は、ｃｄ７３−／−マウス由来のドナーＴ細胞はｃｄ７３＋／＋レシピエントマウスのＣＮＳに浸潤する能力を有することを示している。
実施例１２−効率的なＥＡＥ発症のためには、ＣＤ７３がリンパ球上またはＣＮＳ中のいずれかで発現されなければならない
次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ７３発現がＣＮＳにおけるＣＤ７３発現の欠如を補って、ＥＡＥを発症させることができるかどうかが問われた。したがって、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＭＯＧ免疫野生型マウスからｃｄ７３−／−レシピエントに養子移入し、同時にＥＡＥを誘導し、同様に処置した野生型レシピエントと疾患活動性を比較した（図６Ａ）。野生型レシピエントはＥＡＥ誘導後に予想通り疾患を発症したが、ｃｄ７３−／−レシピエントも疾患誘導３週間後までに平均疾患スコア１．５の顕著なＥＡＥを発症した。これは、ｃｄ７３−／−マウスがこれと同時点で通常示した平均スコアの０．５よりもはるかに高かった（図１）。ＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ７３発現とＥＡＥ感受性との関連をさらに明らかにするために、免疫野生型マウス由来の選別されたＣＤ７３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ７３−ＣＤ４＋Ｔ細胞、または免疫ｃｄ７３−／−マウス由来の全ＣＤ４＋（ＣＤ７３−）Ｔ細胞をｃｄ７３−／−レシピエントに移入し、同時にＥＡＥ誘導を行った（図６Ｂ）。野生型マウス由来のＣＤ７３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を受け取ったｃｄ７３−／−マウスは、誘導後３週間で平均スコアおよそ１．５のＥＡＥを発症した。反対に、野生型由来ＣＤ７３−ＣＤ４＋Ｔ細胞を受け取ったｃｄ７３−／−マウスは、有意なＥＡＥを発症しなかった。さらに、ＣＤ７３発現ｔｃｒａ−／−マウスにおいて重篤なＥＡＥを発生させる能力を有するｃｄ７３−／−ドナーマウス由来のＣＤ４＋細胞（図２Ｄ）はまた、レシピエントｃｄ７３−／−マウスにおいてＥＡＥを促進することができなかった（図６Ｂ）。したがって、Ｔ細胞におけるＣＤ７３発現は、非造血細胞におけるＣＤ７３発現の欠如を部分的に補うことはできるが、ＣＤ７３が両区画において発現されたときに、ＥＡＥが最も効果的に誘導される。
ＥＡＥの発症を促進するＣＤ７３発現非造血細胞の正体は未知である。多くの種類の内皮細胞がＣＤ７３を発現することから、ＢＢＢの血管内皮細胞は有望な候補と考えられた（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，"ＣＤ７３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｆｙｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｏｎ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，"Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２９８１−２９９０（１９９８）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。しかしながら、免疫組織化学検査により、マウス脳内皮細胞がＣＤ７３−であることが明らかにされた。しかしながら、これらの実験において、ＥＡＥ進行時にリンパ球のＣＮＳ進入地点である脳の脈絡叢において、ＣＤ７３が高度に発現されることが観察された（図６Ｃ）（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｉｍｅ Ｃｏｕｒｓｅ ａｎｄ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｅｖｅｎｔｓ Ｓｕｇｇｅｓｔ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂａｓｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，"Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５０２：２３６−２６０（２００７）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。図４Ｄは、ＥＡＥ誘導後１２日の野生型マウスの脈絡叢と関連する浸潤リンパ球を示す。また、わずかなＣＤ７３染色が、脊髄の髄膜下領域上にも観察された。これらの結果を総合すると、ＣＤ７３発現は、Ｔ細胞上であってもＣＮＳ中（おそらくは脈絡叢上）であっても、効率的なＥＡＥ発症に必要であるということが示される。
実施例１３−アデノシン受容体アンタゴニストは、ＥＡＥ誘導からマウスを保護する
ＣＤ７３はＡＭＰのアデノシンへの分解を触媒し、ＡＲはＣＮＳで発現されることから（Ｔｓｕｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，"Ａ１ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，"Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１５２１−１５２９（２００４））、Ｒｏｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｂｒａｉｎ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｕｐｏｎ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ａ２Ｂ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，"Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８６：２２０−２２７（２００３）（その全体を参照によって本明細書に援用する））、次にＡＲシグナル伝達がＥＡＥ進行において重要であるかどうかを判断した。ＥＡＥ実験の１日前およびその継続期間にわたって、野生型マウスおよびｃｄ７３−／−マウスをその飲用水中０．６ｇ／Ｌの広域スペクトルＡＲアンタゴニストカフェインで処置したが（Ｄａｌｌ'Ｉｇｎａ ｅｔ ａｌ．，"Ｃａｆｆｅｉｎｅ ａｓ ａ Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ，"Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．３８：７１７−７１８（２００４）（その全体を参照によって本明細書に援用する））、これはおおよそ１日当たりのカフェイン用量４．０ｍｇ／マウスに相当する（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，"Ａ１ ａｎｄ Ａ２Ａ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ａ１ ｍＲＮＡ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ：Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ Ｃａｆｆｅｉｎｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，"Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．７６２：１５３−１６４（１９９７）（その全体を参照によって本明細書に援用する））（図７Ａ）。カフェインを摂取した野生型マウスはＥＡＥ発症から劇的に保護され（図７Ａ）、このことは以前に公開された結果に匹敵する（Ｔｓｕｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，"Ａ１ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，"Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１５２１−１５２９（２００４）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。予想通り、カフェインを摂取したｃｄ７３−／−マウスは、ＥＡＥを発症しなかった（図７Ａ）。ＣＤ７３は脈絡叢で高度に発現されることから（図６Ｃ）、次にＡＲも脈絡叢で発現されるかどうかを判断した。Ｚ３１０マウス脈絡叢細胞株を使用して（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，"Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ Ｚ３１０ Ｃｈｏｒｏｉｄａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ｆｒｏｍ Ｍｕｒｉｎｅ Ｃｈｏｒｏｉｄ Ｐｌｅｘｕｓ，"Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．９５８：３７１−３８０（２００２）（その全体を参照によって本明細書に援用する））、Ａ１およびＡ２Ａアデノシン受容体サブタイプのｍＲＮＡのみをｑＰＣＲにより検出した（図７Ｂ）。Ａ１ＡＲ−／−マウスが、疾患誘導後に重篤なＥＡＥを発症することは既に示されているため（Ｔｓｕｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，"Ａ１ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，"Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１５２１−１５２９（２００４）（その全体を参照によって本明細書に援用する））、Ａ２Ａサブタイプに対して特異的なＡＲアンタゴニストであるＳＣＨ５８２６１による野生型マウスの処置（Ｍｅｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａ２Ａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ＳＣＨ ５８２６１ Ｐｒｏｔｅｃｔｓ Ｆｒｏｍ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｅｆｉｃｉｔ，Ｂｒａｉｎ Ｄａｍａｇｅ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ３８ ＭＡＰＫ ｉｎ Ｒａｔ Ｆｏｃａｌ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｉｓｃｈｅｍｉａ，"Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１０７３−１０７４：４７０−４８０（２００６）（その全体を参照によって本明細書に援用する））が、ＥＡＥ発症を防止することができるかどうかが問われた。野生型マウスに、ＥＡＥ誘導の１日前、および実験の全期間にわたり３０日間毎日、ＤＭＳＯ中のＳＣＨ５８２６１またはＤＭＳＯのみ１ｍｇ／ｋｇを腹腔内および皮下の両方で投与した（合計２ｍｇ／ｋｇ）（図７Ｃ）。ＳＣＨ５８２６１を摂取した野生型マウスは、ＤＭＳＯのみを摂取した野生型マウスと比較して、ＥＡＥ発症から劇的に保護された（図７Ｃ）。さらに、ＳＣＨ５８２６１を摂取した野生型マウスは、ＤＭＳＯで処置された野生型マウスと比較して、ＥＡＥ誘導後１５日目に脳および脊髄におけるＣＤ４＋リンパ球の頻度の顕著な低下を示した（図７Ｄ）。脈絡叢の接着分子（ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、およびＭａｄＣＡＭ−１など）がＥＡＥの病因に関与することが研究により示されていることから（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，"Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｏｒｏｉｄ Ｐｌｅｘｕｓ ｉｎ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，"Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．５２：１１２−１２９（２００１）（その全体を参照によって本明細書に援用する））、ＳＣＨ５８２６１処置が、ＥＡＥ誘導後に脈絡叢における接着分子発現に影響を及ぼしたかどうかを判断した。ＤＭＳＯおよびＳＣＨ５８２６１で処置した野生型マウス由来の脈絡叢の比較により、Ａ２Ａ ＡＲ遮断が、ＥＡＥ進行中に通常生じるＩＣＡＭ−１の上方制御を防止したことが示される（図８）。
これらの結果に基づき、ｃｄ７３−／−マウスが細胞外アデノシンの生成を触媒できないことが、ＭＯＧ免疫化後にＥＡＥを効率的に発症できないことを説明し、脈絡叢におけるＣＤ７３発現およびＡ２Ａ ＡＲシグナル伝達がＥＡＥ進行の必要条件であるという結論を下した。
本研究の目的は、ＭＳの動物モデルであるＥＡＥにおけるＣＤ７３の役割を評価することであった。ＣＤ７３は通常は免疫抑制性である細胞外アデノシンの形成を触媒し（Ｂｏｕｒｓ ｅｔ ａｌ．，"Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ５'−Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｎｄ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ａｓ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，"Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１２：３５８−４０４（２００６）（その全体を参照によって本明細書に援用する））、Ａ１ＡＲ−／−マウスが重篤なＥＡＥを示すことから（Ｔｓｕｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，"Ａ１ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，"Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１５２１−１５２９（２００４）（その全体を参照によって本明細書に援用する））、出願者らは、ｃｄ７３−／−マウスもまた重篤なＥＡＥを発症するであろうと予測した。しかしながら、ｃｄ７３−／−マウスは、ＥＡＥ誘導に対して高い抵抗性を有し、数多くの研究がｃｄ７３−／−マウスは炎症をより生じやすいことを証明していることを考慮すると、これは驚くべき発見である。例えば、ｃｄ７３−／−マウスは、ブレオマイシン誘導肺損傷をより生じやすく（Ｖｏｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｅｃｔｏ−５'−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ（ＣＤ７３）−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ａ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｕｎｇ Ｉｎｊｕｒｙ，"Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６：４４４９−４４５８（２００６）（その全体を参照によって本明細書に援用する））、血管炎症および新生内膜形成をより生じやすい（Ｚｅｒｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，"ＣＤ７３／ｅｃｔｏ−５'−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｅｏｉｎｔｉｍａ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，"Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１３：２１２０−２１２７（２００６）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。これらの報告と一致して、出願者らは、ｃｄ７３−／−Ｔ細胞が、ＭＯＧ刺激後に、より高いレベルのＥＡＥ関連炎症性サイトカインＩＬ−１βおよびＩＬ−１７を生成したことを示した。さらに、Ｔ細胞が欠損しているが末梢全体にわたってＣＤ７３を発現するｔｃｒａ−／−マウスへのｃｄ７３−／−Ｔ細胞の養子移入は、抗炎症メディエータとしてのアデノシンの役割と一致して、ＭＯＧ免疫化後の重篤なＣＮＳ炎症をもたらした。興味深いことに、ＭＳに対する最も効果的な療法の１つであるＩＦＮ−β治療は、インビトロおよびインビボの双方において、内皮細胞におけるＣＤ７３発現を上方制御することが示された（Ａｉｒａｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＦＮ−Ｂｅｔａ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：Ａ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ ＣＤ７３ ａｎｄ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ，"Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１１０：６４１−６４８（２００７）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。したがって、ＩＦＮ−βがＭＳ患者に利益を与える機序は完全には理解されていないが、既知の抗炎症効果および神経保護効果を付随するアデノシンの生成の増加が一因である可能性がある。
ＥＡＥ誘導に対する抵抗性と一致して、ｃｄ７３−／−マウスは、野生型マウスと比較して、ＥＡＥにおけるＣＮＳに浸潤する細胞の頻度が低かった。この発見は、ＣＤ７３生成アデノシンが、低酸素症における血管内皮を越える好中球の遊走、および流入領域リンパ節の高内皮細静脈を越えるリンパ球の遊走を制限することが既に示されていることから（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｃｒｕｃｉａｌ Ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｅｃｔｏ−５'−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ（ＣＤ７３） ｉｎ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｌｅａｋａｇｅ Ｄｕｒｉｎｇ Ｈｙｐｏｘｉａ，"Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００：１３９５−１４０５（２００４）（その全体を参照によって本明細書に援用する））、予期しないものであった。出願者らのデータは、対照的に、ＣＤ７３およびＣＤ７３により生成された細胞外アデノシンが、病原性Ｔ細胞のＣＮＳ内への効率的な通過に必要とされることを示している。したがって、ＣＤ７３およびアデノシンがＥＡＥにおけるＣＮＳリンパ球浸潤で果たす役割は、神経炎症の調節におけるそれらの役割よりも重大である。
ＣＮＳ内にＴ細胞が遊走するために、ＣＤ７３がどこで発現されなければならないかを知ることは重要である。ＣＤ７３は、Ｔ細胞のサブセット上（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，"ＣＤ７３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｆｙｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｏｎ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，"Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２９８１−２９９０（１９９８）（その全体を参照によって本明細書に援用する））、ならびに一部の上皮細胞上（Ｓｔｒｏｈｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ＣＤ７３ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａ，"Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：２５８８−２６０１（１９９７）（その全体を参照によって本明細書に援用する））および内皮細胞上（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，"ＣＤ７３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｆｙｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｏｎ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，"Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２９８１−２９９０（１９９８）（その全体を参照によって本明細書に援用する））に認められる。ここに提示されるデータは、ｃｄ７３−／−Ｔ細胞が、ＭＯＧ免疫化には十分応答するが、ＣＤ７３が非造血組織内で発現されない限りＣＮＳに進入できないことを明確に示している（すなわち、ｃｄ７３−／−マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞の養子移入後にＥＡＥを発症させるｃｄ７３＋／＋ｔｃｒａ−／−マウス）。また、非造血細胞におけるＣＤ７３の欠損は、Ｔ細胞におけるＣＤ７３発現により部分的に補うことができる（すなわち、ｃｄ７３−／−マウスは、ＣＤ７３−ＣＤ４＋Ｔ細胞ではなくＣＤ７３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞が養子移入されるとＥＡＥを生じやすくなる）。ＣＤ７３はヒト脳内皮細胞で発現されるため、ＢＢＢ内皮細胞がＣＮＳにおけるＣＤ７３の関連源とみなされているが（Ａｉｒａｓ ｅｔ ａｌ．，"Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＦＮ−Ｂｅｔａ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：Ａ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ ＣＤ７３ ａｎｄ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ，"Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１１０：６４１−６４８（２００７）（その全体を参照によって本明細書に援用する））、免疫組織化学検査により、マウス脳内皮細胞はＣＤ７３−であることが明らかになった。しかしながら、ＣＤ７３は、血液と脳脊髄液（ＣＳＦ）との間の関門を形成し、ＣＮＳにおけるリンパ球免疫監視を制御する役割を有する脈絡叢上皮細胞において、高度に発現されることがわかった（Ｓｔｅｆｆｅｎ ｅｔ ａｌ．，"ＣＡＭ−１，ＶＣＡＭ−１，ａｎｄ ＭＡｄＣＡＭ−１ ａｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ Ｃｈｏｒｏｉｄ Ｐｌｅｘｕｓ Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｂｕｔ Ｎｏｔ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ａｎｄ Ｍｅｄｉａｔｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ，"Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４８：１８１９−１８３８（１９９６）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。また、脈絡叢は、ＥＡＥ進行の開始時に、Ｔ細胞の進入地点であることも示唆されている（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｉｍｅ Ｃｏｕｒｓｅ ａｎｄ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｅｖｅｎｔｓ Ｓｕｇｇｅｓｔ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂａｓｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，"Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５０２：２３６−２６０（２００７）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。ＥＡＥおよびＭＳの双方におけるＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１結合を介したリンパ球−脳内皮細胞の相互作用の役割は、十分に立証されているが（Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，"Ａｎｔｉ−Ａｌｐｈａ４ Ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｒａｔｉｏｎａｌｅ，"Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ６４：１３３６−１３４２（２００５）（その全体を参照によって本明細書に援用する））、おそらく、内皮ＢＢＢを越えるリンパ球移動は、少なくともＥＡＥにおいて、疾患の開始よりも疾患の維持および進行にとってより重要である。
次の問題は、ＣＤ７３がＴ細胞のＣＮＳ内への遊走をどのようにして促進するのかということである。初期の研究は、リンパ球ＣＤ７３が、ＬＦＡ−１依存的にヒトリンパ球と内皮細胞との結合を促進し得ることを示した（Ａｉｒａｓ ｅｔ ａｌ．，"ＣＤ７３ Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ Ｖｉａ ａ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ−１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，"Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：５４１１−５４１７（２０００）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。しかしながら、これは、ｃｄ７３＋／＋ｔｃｒａ−／−マウスにおいて、ＣＤ７３欠損Ｔ細胞がＣＮＳに進入し、重篤な疾患をもたらすことが可能であるため、ＣＤ７３のＥＡＥにおける機能とは考えられない（図２Ｄ）。あるいは、ＣＤ７３は、酵素として機能して、細胞表面ＡＲのリガンドである細胞外アデノシンを生成することができる。現在の研究に関連しているのは、カフェインまたはＳＣＨ５８２６１によるＡＲ遮断がマウスをＥＡＥから保護し得ることを考えると、この後者の機能である。広域スペクトルＡＲアンタゴニストのカフェインも一部のホスホジエステラーゼを阻害するが（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，"Ｃａｆｆｅｉｎｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ Ｗｉｔｈ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ａｎｄ ａｓ Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，"Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．４３：３８７−３９８（１９８８）（その全体を参照によって本明細書に援用する））、そのＥＡＥ進行の調節は、ＡＲシグナル伝達に対するその影響によるものである可能性が高い（Ｔｓｕｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，"Ａ１ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，"Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１５２１−１５２９（２００４）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。この概念は、ＳＣＨ５８２６１もＡ２Ａ ＡＲシグナル伝達を特異的に阻害することによってＥＡＥ進行を防止するという事実によって支持される。ＣＤ７３ならびにＡ１ ＡＲ サブタイプおよびＡ２Ａ ＡＲサブタイプが脈絡叢において発現されることから、脈絡叢でＣＤ７３によって生成された細胞外アデノシンは、自己分泌の形でシグナル伝達を行うことができる。
アデノシンシグナル伝達は、脈絡叢において接着分子の発現を制御する可能性が高い。脈絡叢における接着分子ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、およびＭａｄＣＡＭ−１の上方制御がＥＡＥ進行に関連することは、研究により示されている（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｏｒｏｉｄ Ｐｌｅｘｕｓ ｉｎ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，"Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．５２：１１２−１２９（２００１）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。Ａ２Ａ ＡＲアンタゴニストＳＣＨ５８２６１で処置したマウスには、ＥＡＥ誘導後に通常生じるように、脈絡叢ＩＣＡＭ−１発現の増加が生じないことから（図８）（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，"Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｏｒｏｉｄ Ｐｌｅｘｕｓ ｉｎ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，"Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．５２：１１２−１２９（２００１）（その全体を参照によって本明細書に援用する））、本結果は、Ａ２Ａ ＡＲシグナル伝達が、ＥＡＥ進行時にＩＣＡＭ−１を増加させることを示している。
要約すると、このデータは、ＣＤ７３がＥＡＥ進行において重要な役割を果たすことを示している。ＣＤ７３を欠損したマウスは、ＥＡＥ誘導に関連する変性症状およびＣＮＳ炎症から保護される。これは、ＥＡＥにおいてリンパ球がＣＮＳ内へ効率的に進入するために、ＣＤ７３発現およびＡＲシグナル伝達が必要であることを証明する最初の研究である。本明細書に提示するデータは、ＭＳおよび他の神経炎症性疾患に対する新しい治療法につながる行程の最初の１歩を記す可能性がある。
実施例１４−ＢＢＢはアデノシン受容体の活性化を介して調節可能である
本実験の目的は、血液脳関門がアデノシン受容体の活性化によって調節可能であるかどうかを判断することであった。ＮＥＣＡは、非選択的アデノシン受容体アゴニストであり、Ａ１アデノシン受容体、Ａ２Ａアデノシン受容体、およびＡ３アデノシン受容体に対して同様の親和性を有し、Ａ２ｂアデノシン受容体に対して低い親和性を有する。アデノシン受容体の活性化がエバンスブルー色素の血液脳関門（ＢＢＢ）を越える溢出を増加させ得るかどうかを判断するために、マウスを、非選択的アデノシン受容体アゴニストであるＮＥＣＡ（ｎ＝５、１００μＬ ０．０１ｎＭ）；Ａ２Ａアデノシン受容体特異的アンタゴニストであるＳＣＨ５８２６１（ｎ＝５、１ｍｇ／ｋｇ）；ＢＢＢ漏出性を誘導することが知られている病原体であり、そのため陽性対照として使用される百日咳毒素（ｎ＝７、２００μＬ）；およびビヒクル対称としてのＰＢＳ（ｎ＝５、１００μＬ）で処置した。細胞外アデノシンを生成する能力を有さないＣＤ７３−／−マウスもＮＥＣＡで処置した（ｎ＝４、１００μＬ ０．０１ｎＭ）。処置は、２００μＬの１％エバンスブルー色素の静脈注射（合計２μｇの色素を注射）１時間前に、単回静脈注射として施した。エバンスブルーの投与４時間後、ケタミン／キシラジン混合物でマウスに麻酔をし、左心室を介して氷冷ＰＢＳで灌流した。脳を摘出し、５μＬ／ｍｇ（ｖ：ｗ）のｎ，ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で均質化した。組織をＤＭＦ中、室温で７２時間インキュベートして色素を抽出した。抽出後、組織／溶媒混合物を５００×ｇで３０分間遠心分離し、上澄み１００μＬをＢｉｏＴｅｘ分光光度計を用いて６２０ｎｍで読み取った。データは、エバンスブルーμｇ／ＤＭＦｍＬとして表す。
一般のアデノシン受容体アゴニストのＮＥＣＡによるマウスの処置は、血液脳関門を越える色素の移動を誘導し得る。これは、この関門がアデノシン受容体の活性化によって調節可能であることを示す。図９Ａにおいて、細胞外アデノシンを欠き、そのためアデノシン受容体を介してシグナルを十分に伝達できないＣＤ７３−／−マウスをＮＥＣＡで処置し、その結果ＰＢＳ対照に対して色素の移動がほぼ５倍の増加したことを示す。出願者らは、このアンタゴニストを使用したＡ２Ａアデノシン受容体の遮断がリンパ球の脳への進入を防止できることを示したことから、ＳＣＨ５８２６１を陰性対照として使用した（Ｍｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，"ＣＤ７３ ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｅｎｔｒｙ ｏｆ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｄｕｒｉｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０５（２７）：９３２５−９３３０（２００８）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。図９Ｂにおいて、ＮＥＣＡで処置したＷＴマウスも対照マウスを上回る増加を示している。百日咳はマウスＥＡＥモデルにおいて血液脳関門漏出性を誘導することが知られていることから、これを陽性対照として使用する。
実施例１５−Ａ２ＡおよびＡ２ｂアデノシン受容体はヒト内皮細胞株ｈＣＭＥＣ／Ｄ３において発現する
インビトロ血液脳関門（ＢＢＢ）を確立するために、ＢＢＢ特性を有するとして既に記載されているヒト脳内皮細胞株ｈＣＭＥＣ／Ｄ３（Ｗｅｋｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ Ｈｕｍａｎ Ａｄｕｌｔ Ｂｒａｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ，"Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１９（１３）：１８７２−４（２００５）、Ｐｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ｈＣＭＥＣ／Ｄ３ ａｓ ａ Ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｓｔｕｄｉｅｓ，"Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１０７（５）：１３５８−１３６８（２００８）（その全体を参照によって本明細書に援用する））を取得した。今回、これらの細胞におけるアデノシン受容体の発現パターンを確立した。
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞をコンフルエントまで成長させて採取し、トリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、製造業者の使用説明書に従ってＲＮＡを抽出した。Ｖｅｒｓｏ ｃＤＮＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いてｃＤＮＡを合成し、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。
図１０に示すように、Ａ２Ａアデノシン受容体およびＡ２ｂアデノシン受容体が、ヒト内皮細胞株ｈＣＭＥＣ／Ｄ３において発現されたことがわかった。
実施例１６−脳内皮細胞のアデノシン受容体刺激はＢＢＢを通るリンパ球遊走を促進する
血液脳関門（「ＢＢＢ」）は、内皮細胞から構成される。ＥＡＥ後期において、リンパ球はＢＢＢを通過することが知られている。脳内皮細胞のアデノシン受容体刺激が、ＢＢＢを通るリンパ球遊走を促進し得るかどうかを判断するために、インビトロＢＢＢを確立した。ＢＢＢ特性を有するとして既に記載されているヒト脳内皮細胞株ｈＣＭＥＣ／Ｄ３（Ｗｅｋｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ Ｈｕｍａｎ Ａｄｕｌｔ Ｂｒａｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ，"Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１９（１３）：１８７２−４（２００５）、Ｐｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ｈＣＭＥＣ／Ｄ３ ａｓ ａ Ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｓｔｕｄｉｅｓ，"Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１０７（５）：１３５８−１３６８（２００８）（その全体を参照によって本明細書に援用する））を取得した。
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞をトランスウェル上に播種し、コンフルエントまで成長させた。２×１０６ジャーカット細胞を、場合によってはＮＥＣＡ（一般アデノシン受容体［ＡＲ］アゴニスト）、ＣＣＰＡ（Ａ１ ＡＲアゴニスト）、ＣＧＳ ２１８６０（Ａ２Ａ ＡＲアゴニスト）、またはＤＭＳＯビヒクルとともに、上室に添加した。２４時間後、下室中の遊走した細胞を計数した。値は、非ＨＣＭＥＣＤ３播種トランスウェルを通って遊走する細胞の数に対するものである。
図１１に示すように、広域スペクトルアデノシン受容体アゴニストであるＮＥＣＡは、ある程度の遊走を誘導した。Ａ２Ａアデノシン受容体アゴニストであるＣＧＳは、低濃度で使用した場合に、インビトＢＢＢを越えるリンパ球遊走を促進した。Ａ１アゴニストであるＣＣＰＡは高レベルのリンパ球遊走を誘導したが、これはＣＣＰＡに対してより低い親和性を有し、そのためより高レベルのＣＣＰＡでのみ活性化されるＡ２Ａアデノシン受容体の活性化によるものと考えられる。
実施例１７−Ａ２Ａアデノシン受容体活性化はＣＰを越えるリンパ球遊走を促進する
脈絡叢（「ＣＰ」）は、ＣＮＳ内へのリンパ球遊走を制御する。ＣＰは、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体を発現する。ＥＡＥは、マウスにおいて、Ａ２Ａアデノシン受容体活性が遮断されると防止される。ＥＡＥは、Ａ１アデノシン受容体が存在しない場合に増進される。Ａ２Ａアデノシン受容体活性化が、ＣＰを越えるリンパ球遊走を助長すると仮定した。Ｚ３１０細胞はマウス脈絡叢細胞株である。
この仮説を試験するために、トランスウェル膜にＺ３１０細胞を播種し、コンフルエントまで成長させた。２×１０６ジャーカット細胞を、場合によってはＮＥＣＡ（ｎ＝１、一般ＡＲアゴニスト）、ＣＣＰＡ（ｎ＝１、Ａ１ ＡＲアゴニスト）、ＣＧＳ ２１８６０（ｎ＝１、Ａ２Ａ ＡＲアゴニスト）、またはＤＭＳＯビヒクル（ｎ＝１）とともに、上室に添加した。２４時間後、下室中の移動した細胞を計数した。値は、非Ｚ３１０播種トランスウェルを通って遊走する細胞の数に対するものであり、この結果は図１２に示す。
図１２に示すように、広域スペクトルアデノシン受容体アゴニストであるＮＥＣＡは遊走を誘導した。Ａ２Ａアデノシン受容体アゴニストであるＣＧＳは、ＣＰを越えるリンパ球遊走を促進した。Ａ１アゴニストであるＣＣＰＡは高レベルのリンパ球遊走を誘導したが、これはＣＣＰＡに対してより低い親和性を有し、そのため高レベルのＣＣＰＡでのみ活性化されるＡ２Ａアデノシン受容体の活性化によるものと考えられる。
実施例１８−ヒト脳内皮細胞はアデノシン受容体誘導ｃＡＭＰ制御に対して感受性を有する
アデノシン受容体活性化は、細胞中のｃＡＭＰレベルを制御する。ヒト脳内皮細胞のアデノシン受容体誘導ｃＡＭＰ制御に対する感受性を測定するために、ヒト脳内皮細胞を様々な濃度のアデノシン受容体アゴニストとともに培養し、その後図１３に示すようにｃＡＭＰレベル分析を行った。
ＨＣＭＥＣＤ３細胞を２４ウェルプレート上でコンフルエントまで成長させた。アデノシン受容体（「ＡＲ」）刺激はｃＡＭＰレベルに影響を与えることが知られていることから、場合によって様々な濃度のＮＥＣＡ（一般ＡＲアゴニスト）、ＣＣＰＡ（Ａ１ ＡＲアゴニスト）、ＣＧＳ ２１８６０（Ａ２Ａ ＡＲアゴニスト）、ＤＭＳＯビヒクル、またはホルスコリン（ｃＡＭＰを誘導する）を用いて細胞を処理した。１５分後、溶解緩衝液を添加し、細胞を−８０℃で凍結して反応を停止させた。各条件に対して２つの試料を用いた。ｃＡＭＰ Ｓｃｒｅｅｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてｃＡＭＰレベルをアッセイした。
図１３に示すように、広域スペクトルアデノシン受容体アゴニストＮＥＣＡは、ｃＡＭＰレベルを増加させ、これらの細胞がアデノシン受容体シグナル伝達に対して応答可能であること証明された。高レベルのＡ１アデノシン受容体アゴニストであるＣＣＰＡは、ｃＡＭＰレベルを増加させたが、これもＣＣＰＡに対してより低い親和性を有し、そのためより高レベルのＣＣＰＡでのみ活性化されるＡ２Ａアデノシン受容体の活性化によるものと考えられる。Ａ２Ａアデノシン受容体アゴニストであるＣＧＳは、ヒト脳内皮細胞株中のｃＡＭＰレベルをわずかに増加させた。
実施例１９−雌Ａ１アデノシン受容体ノックアウトマウスは野生型よりもより重篤なＥＡＥを発症する
Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体は、脈絡叢で発現される。Ａ２Ａアデノシン受容体アンタゴニストは、マウスをＥＡＥから保護する。Ａ１アデノシン受容体が欠損したマウスは、野生型対照よりもより重篤なＥＡＥを発症する傾向があるであろうか。この疑問に答えるために、野生型マウスおよびＡ１アデノシン受容体ヌルマウスの疾患プロファイルを比較した。
雌Ａ１アデノシン受容体ノックアウトマウス（Ａ１ＡＲＫＯ、ｎ＝５）および野生型マウス（ＷＴ、ｎ＝５）を２００８年２月１２日にＣＦＡ／ＭＯＧ３５−５５＋ＰＴＸで免疫し、４１日間毎日スコア付けした。図１４の結果が示すように、Ａ１ＡＲＫＯマウスは、ＷＴよりもより重篤なＥＡＥを発症し、またＷＴよりも速い速度で発病する。
実施例２０−アデノシン受容体アンタゴニストを与えられた野生型マウスの脳は、アデノシン受容体アンタゴニストを与えられたＣＤ７３−／−マウスの脳よりも高レベルのＦＩＴＣ−デキストランを有する
一般アデノシン受容体アンタゴニストであるカフェインの血液脳関門透過性に対する影響を検査するために、マウスに数日間カフェインを与えら、その後内皮透過性を評価するために一般に使用されるＦＩＴＣデキストランを注射した。
より具体的には、マウスに、水中の０．６ｇ／Ｌカフェイン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、または普通の水を５日間自由に飲ませた。マウスにＦＩＴＣデキストラン（１０，０００ＭＷ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を腹腔内注射し、３０分後に左心室を介して氷冷ＰＢＳでマウスを灌流した。脳を摘出し、ＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）中で瞬間凍結し、切断まで−８０℃で保存した。組織切片（５μｍ）を光学顕微鏡検査用にヘマトキシリンで、また、蛍光対比染色用にＤＡＰＩで染色した。結果を図１５に示す。
図１５Ａに示すように、カフェインを与えたＣＤ７３−／−マウスの脳切片を可視化すると、野生型マウスよりもはるかに薄い緑色を呈し、血液脳関門を越えるＦＩＴＣデキストラン溢出がより少ないことが示された。野生型マウスの脳切片は濃い緑色の背景を呈し（図１５Ｂ）、血液脳関門を越えるＦＩＴＣ−デキストラン溢出がより多いことを示した。図１６は、野生型マウスの結果をグラフ形式で示す。
実施例２１−アデノシン受容体アゴニストＮＥＣＡは血液脳関門を越えるエバンスブルー色素溢出を増加させる
本実験の目的は、血液脳関門がアデノシン受容体の活性化によって調節可能であるかを判断することであった。ＮＥＣＡは、非選択的アデノシン受容体アゴニストであり、Ａ１アデノシン受容体、Ａ２Ａアデノシン受容体、およびＡ３アデノシン受容体に対して同様の親和性を有し、Ａ２Ｂアデノシン受容体に対して低い親和性を有する。
アデノシン受容体の活性化が血液脳関門（ＢＢＢ）を越えるエバンスブルー色素の溢出を誘導するかどうかを判断するために、マウスを１日目にまず非選択的アデノシン受容体アゴニストであるＮＥＣＡ（ｎ＝２、１００μＬ ０．０１ｎＭ）、およびビヒクル対照としてのＰＢＳ（ｎ＝２、１００μＬ）で処置した。２日目に、マウスを次いでＣＦＡ−ＭＯＧ３５−５５および百日咳で免疫してＥＡＥを誘導した。次いで、ＮＥＣＡまたはＰＢＳを１日おきに３日目、５日目、７日目、および９日目に投与した。１０日目に、マウスに、２００μＬの１％エバンスブルー色素（合計２μｇの色素を注射）を静脈注射した。エバンスブルーの投与６時間後、ケタミン／キシラジン混合物でマウスに麻酔をし、左心室を介して氷冷ＰＢＳで灌流した。脳を摘出し、５μＬ／ｍｇ（ｖ：ｗ）のｎ，ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で均質化した。組織をＤＭＦ中、室温で７２時間インキュベートして色素を抽出した。抽出後、組織／溶媒混合物を５００×ｇで３０分間遠心分離し、上澄み１００μＬをＢｉｏＴｅｘ分光光度計を用いて６２０ｎｍで読み取った。データは、エバンスブルー ｐｇ／ＤＭＦ ｍＬとして表し、図１７に示す。
本実験は、一般アデノシン受容体アゴニストＮＥＣＡによるマウスの処置が、ＥＡＥに対して免疫したマウスのＣＮＳ内へのエバンスブルー色素の移動を誘導することを示す。これは、ＥＡＥモデルにおける血液脳関門がアデノシン受容体の活性化によって調節可能であることを示している。ＮＥＣＡで処置したＷＴ ＥＡＥマウスは、ＰＢＳ対照ＥＡＥマウスを上回るＢＢＢ透過性の増加を示している。
図１８は、ペグ化アデノシンデアミナーゼ（「ＰＥＧ−ＡＤＡ」）処置が、野生型マウスにおいてＥＡＥの発症を阻害することを示す追加実験の結果をグラフ形式で示す。ＥＡＥを誘導し、疾患活動性を毎日モニターし、対照ＰＢＳビヒクルのみまたは１５単位／ｋｇ 体重のＰＥＧ−ＡＤＡを４日ごとに腹腔内投与した野生型マウスにおいて、平均ＥＡＥスコアを算出した。黒四角は、ＰＢＳビヒクルを投与した野生型マウス（ｎ＝３）を表し、白四角は、ＰＥＧ−ＡＤＡを投与した野生型マウス（ｎ＝３）を表す。これらの結果は、アデノシンデアミナーゼ処置およびアデノシン受容体遮断が、野生型マウスをＥＡＥ誘導から保護することを示している。
実施例２２−マウスモデルおよびラットモデル
Ｊａｃｋｓｏｎ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＣ５７ＢＬ／６マウスを野生型として使用した。使用した全てのマウスは、生後７〜９週間、体重２０〜２５ｇであった。全てのラットは雌であり、かつ生後８週間、体重２００〜２２０ｇであった。マウスおよびラットは、特定病原体除去条件下で交配および飼育された。全ての手順は、承認されたＩＡＣＵＣプロトコルに準拠して実施した。
実施例２３−薬物およびデキストランの投与
アデノシン受容体アゴニストのＮＥＣＡ、ＣＣＰＡ、ＣＧＳ ２１８６０、およびＳＣＨ ５８２６１（Ｔｏｃｒｉｓ，Ｅｌｌｉｓｖｉｌｌｅ，ＭＯ）をそれぞれＤＭＳＯ中に溶解し、次いでＰＢＳで所望の濃度まで希釈し、ほとんどの場合、最終ＤＭＳＯは０．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）未満であった。レキスキャン（レガデノソン；ＴＲＣ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ）をＰＢＳ中に溶解した。ビヒクル対照として、ＤＭＳＯをＰＢＳで同じ濃度まで希釈した。ＦＩＴＣまたはテキサスレッド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のいずれかで標識した脱水デキストランをＰＢＳ中に１０ｍｇ／ｍＬまで再懸濁させた。デキストラン注射を含む全ての実験は、ＰＢＳ中の１．０ｍｇデキストランを用いた。薬物およびデキストランを同時に注射する実験において、デキストラン１．０ｍｇを薬物と混合して、最終体積２００μＬで所望の濃度にした。用量反応実験において、薬物およびデキストランを同時に注射した。ＳＣＨ ５８２６１の注射を除く全ての注射は、２７ゲージの針を用い後眼窩静脈内に行った。ＳＣＨ ５８２６１実験において、ＳＣＨ ５８２６１注射（１ｍｇ／ｋｇ）は腹腔内に行い、実験日前の４日間、マウスに毎日この濃度を前投与した。実験時に追加注射を施した。ビヒクル／薬物およびデキストランを５日目に注射し、ビヒクル／薬物投与３時間後に組織を回収した。レキスキャン実験において、５分おきの３回の注射でレキスキャンを静脈内投与し、別段に記載しない限り１５分後に組織を回収した。
実施例２４−処置および組織回収
用量反応実験ならびにＡ１ ＡＲノックアウトマウスおよびＡ２Ａ ＡＲノックアウトマウスを用いた実験において、薬物およびデキストランは同時に注射した。３時間後、ケタミン／キシラジンでマウスを麻酔し、イソフルランを含むノーズコーンを付与する。マウスを２５〜５０ｍＬの氷冷ＰＢＳで左心室を介して還流したあと、頭部を切断した。その脳を除去し、計量し、のちの分析のために凍結した。
実施例２５−脳中のデキストランの蛍光分析
氷冷５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．６）を凍結した脳に添加し（脳１００ｍｇ当たり１００μＬ）、氷上で解凍した。これらをダウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーで均質化し、室温（ｒｔ）で３０分間、１６．１×ｇの微量遠心管で遠心分離した。上澄みを新しい試験管に移し、等体積の無水メタノールを添加した。試料を室温で３０分間、１６．１×ｇで遠心分離した。上澄み（２００μＬ）をＣｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ９６ウェル黒色ポリスチレンアッセイプレート（透明底）に移した。さらに、５０％Ｔｒｉｓ−Ｃｌ／５０％無水メタノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）中にデキストラン０．００１〜１０μｇ／ｍＬを含有する一連の標準物質を各プレートに添加した。これらの標準曲線からデキストランの絶対濃度を求めた。ＢｉｏＴｅｋ（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ） Ｓｙｎｅｒｇｙ ４を用いて蛍光分析を実施した。４８８／５１９（励起／発光）でＦＩＴＣ−デキストランを検出し、テキサスレッド−デキストランを５９２／６１８で検出した。
実施例２６−初代脳内皮細胞単離
本方法は、既に記載されている手法を適合させた。Ｓｏｎｇ ＆ Ｐａｔｃｈｅｒ，"Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｂｒａｉｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｍａｉｎｔａｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，"Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍ．３９：３１３−３２０（２００３）（その全体を参照によって本明細書に援用する）。簡潔に述べると、生後１２週間のＣ５７ＢＬ／６マウスを安楽死させ、頭部を切断した。解剖した脳から小脳を分離し、滅菌ワットマン紙上で脳を慎重に転がすことによって大きい表面血管を除去した。次いで、Ｌ−グルタミンおよびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充した氷冷ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地にこの組織を加え、ダウンスホモジナイザーで均質化し、得られたホモジネートを４°Ｃで５分間、３８００×ｇで遠心分離した。上澄みの廃棄後、ペレットをＰＢＳ溶液中１８％（ｗ／ｖｏｌ）デキストランに再懸濁させ、激しく混合し、４°Ｃで１０分間、１００００×ｇで遠心分離した。泡沫状のミエリン層をデキストランの上澄みとともに穏やかな吸引により慎重に除去した。予め温めておいた（３７°Ｃ）消化培地（１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ／ディスパーゼ、４０μｇ／ｍＬのデオキシリボヌクレアーゼＩ、および０．１４７μｇ／ｍＬのプロテアーゼ阻害剤トシルリジンクロロメチルケトンを補充したＤＭＥＭ）にペレットを再懸濁させ、時々撹拌しながら３７°Ｃで７５分間インキュベートした。この懸濁液を３８００×ｇで遠心分離した。上澄みを廃棄し、ペレットを予め温めておいた（３７°Ｃ）ＰＢＳに再懸濁させ、３８００×ｇで遠心分離した。ペレットを完全培地（１０％血漿由来血清、Ｌ−グルタミン、１％抗生物質−抗真菌薬、１００ｍｇ／ｍＬヘパリン、および１００ｍｇ／ｍＬ内皮細胞成長サプリメントを含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２培地）に懸濁させた。得られた毛細血管フラグメントをマウスコラーゲンＩＶ（５０μｇ／ｍＬ）でコートした組織培養皿に脳１個／９．５ｃｍ２に相当する密度で播いた。培地は、２４時間後および４８時間後に交換した。最初の２日間、ピューロマイシン（８μｇ／ｍＬ）を培地に添加した。分析前に、この初代マウス脳内皮細胞を５〜７日後に培養物が完全なコンフルエントに達するまでインビトロで成長させた。
実施例２７−細胞培養およびｑＲＴ−ＰＣＲ
ｂＥｎｄ．３マウス脳内皮細胞株をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から取得し、１０％ＦＢＳを補充したＡＴＣＣが配合したＤＭＥＭ中で成長させた。トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抽出を用いて、ＲＮＡをｂＥｎｄ．３細胞から単離した。ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｅｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。アデノシン受容体およびＣＤ７３に対して特異的なプライマー（要求に応じて使用可能）を使用して遺伝子発現レベルを測定し、ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６リアルタイムｑＰＣＲシステム上で作動するＫａｐａＳｙｂｒ Ｆａｓｔ（ＫａｐａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を使用してＴＢＰハウスキーピング遺伝子レベルに標準化した。融解曲線分析を実施して、それぞれのｑＰＣＲ産物の特異性を測定した。
実施例２８−アデノシン受容体のウエスタンブロット法および免疫蛍光分析
初代マウス脳内皮細胞およびＢｅｎｄ．３細胞培養物を上述のように成長させた。プロテアーゼ阻害剤を含有する溶解緩衝液１ｍＬで細胞を溶解し、ＴＣＡ溶液最大２００μＬを用いて濃縮した。試料を１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロース紙に移動した。膜を１％ ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）でブロッキングし、抗Ａ１ ＡＲ一次抗体（ＡＡＲ−００６）および抗Ａ２Ａ ＡＲ一次抗体（ＡＡＲ−００２）（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ）とともに一晩インキュベートした。膜を洗浄し、次いでヤギ抗ウサギＨＲＰとともにインキュベートした。膜を完全に洗浄し、ＥＣＬ溶液で発光させ、Ｘ線フィルムで露光した。アデノシン受容体免疫染色のために、麻酔したマウスをＰＢＳで灌流し、脳を単離して、Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ−ＯＣＴ培地中で瞬間凍結した。５μｍ切片（矢状方向の脳）をＳｕｐｅｆｒｏｓｔ／Ｐｌｕｓスライド（Ｆｉｓｈｅｒ）に付着させ、アセトン中で固定し、−８０°Ｃで保存した。スライドを解凍し、ＰＢＳ中で洗浄し、正常ヤギ血清（Ｚｙｍｅｄ）中のＣａｓｅｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒ）でブロッキングし、その後抗ＣＤ３１（ＭＥＣ １３．３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および抗Ａ１ ＡＲ（Ａ４１０４、Ｓｉｇｍａ）または抗Ａ２Ａ ＡＲ（ＡＡＲ−００２、Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ）とともにインキュベートした。次いでスライドをヤギ抗ラットＩｇａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびヤギ抗ウサギＩｇテキサスレッド−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにインキュベートした。切片をＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で封入した。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｍ１蛍光顕微鏡で画像を取得した。
実施例２９−蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
脳内皮中のアデノシン受容体ｍＲＮＡを検出するために、ＦＩＴＣ標識Ｃｄ３１およびビオチン標識Ａ１またはＡ２Ａ ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、プローブ配列は要求に応じて使用可能）を用いてＦＩＳＨを実施した。麻酔したマウスをＰＢＳで灌流し、脳を単離して、Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ−ＯＣＴ培地中で瞬間冷凍した。１２マイクロメートルの凍結切片をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ／Ｐｌｕｓスライドにのせた（Ｆｉｓｈｅｒ）。スライド上で３０分間乾燥後、組織を４％中性緩衝パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で２０分間固定し、１×ＰＢＳ中で３分間すすいだ。次に、組織を０．１Ｍトリエタノールアミン中で簡潔に平衡化し、０．２５％無水酢酸を含む０．１Ｍトリエタノールアミン中で１０分間アセチル化した。アセチル化の直後に、切片を漸増するエタノール系によって脱水し、室温で保存した。組織をＰＢＳ中で２×１５分間再水和し、５×ＳＳＣ（ＮａＣｌ ０．７５Ｍ、クエン酸ナトリウム０．０７５Ｍ）中で１５分間平衡化した。次いで切片をハイブリダイゼーション緩衝液（５０％脱イオンホルムアミド、４×ＳＳＣ、サケ精子ＤＮＡ４０μｇ／ｍＬ、２０％（ｗ／ｖ）硫酸デキストラン、１×デンハート液）中、４２°Ｃで１時間プレハイブリダイズした。プローブ（３００ｎｇ／ｍＬ）を８０°Ｃで３分間変性させ、予め温めておいた（４２°Ｃ）緩衝液（ハイブリダイゼーションミックス）に添加した。ハイブリダイゼーションミックス２５０μＬを用いて、４２°Ｃで３８時間、各面にハイブリダイゼーション反応を実施し、パラフィルムで覆った。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは、ＦＩＴＣの蒸発および光退色を避けるために、４×ＳＳＣ−５０％ホルムアミド溶液を満たした暗箱内で実施した。インキュベーション後、切片を２×ＳＳＣ（室温）で３０分間、２×ＳＳＣ（６５°Ｃ）で１５分間、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（６５°Ｃ）で１５分間洗浄し、ＰＢＳ中で５分間平衡化した。ビオチンプローブの検出のために、１×カゼイン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有するＰＢＳ中で、切片をテキサスレッドＸ結合ストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｓ６３７０、１μｇ／ｍＬ）とともに室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ中で１５分間、次いで０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（６５°Ｃ）中で１５分間、ＰＢＳ中で１５分間洗浄することにより、過剰なストレプトアビジンを除去した。ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、切片にカバーグラスをかけた。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｍ１蛍光顕微鏡で画像を取得した。
実施例３０−注射および抗β−アミロイド抗体および免疫蛍光顕微鏡法
野生型マウスおよびトランスジェニック（ＡＤ）マウスに０．８０μｇのＮＥＣＡを投与（静脈内）した。３時間後、４００μｇのβ−アミロイドに対する抗体（２ｍｇ／ｍＬを２００μＬ；クローン６Ｅ１０、Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）を静脈内投与し、マウスを９０分間安静にさせた。次いで、マウスを麻酔し、上述のように灌流し、その脳をＯＴＣに入れ、のちの薄片作成のために急速冷凍した。矢状切片（６μｍ）をアセトン中で１０分間固定後、ＰＢＳ中で洗浄した。切片をカゼインで２０分間ブロッキングしたあと、１：５０希釈のヤギ抗マウスＩｇＣｙ５（ポリクローナル、１ｍｇ／ｍＬ、Ａｂｃａｍ，Ｃａｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）とともに２０分間インキュベートし、その後ＰＢＳ中で３回洗浄した。次いで、切片を乾燥させ、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ Ｈａｒｄｓｅｔ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で封入した。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｍ１蛍光顕微鏡で画像を取得した。
実施例３１−経内皮細胞電気抵抗（ＴＥＥＲ）アッセイ法
Ｂｅｎｄ．３細胞を１０％ＦＢＳを補充したＡＴＣＣが配合したＤＭＥＭ中、２４ウェルのトランスウェルインサート（孔径８μｍ、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）上で、単層が形成されるまで成長させた。Ｖｏｌｔｏｈｍｅｔｅｒ（ＥＶＯＭＸ，Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）を用いてＴＥＥＲを評価した。記録値から播種していないトランスウェルのバックグラウンド抵抗を引いて、ＴＥＥＲ絶対値を決定した。各トランスウェルそれぞれのＴ０からの絶対ＴＥＥＲの変化を変化百分率として表したあと、各処理群について平均を求めた。
実施例３２−内皮細胞のＦ−アクチン染色
Ｂｅｎｄ．３細胞を２４ウェルプレート中、円形カバーグラス上で成長させた（上述のとおり）。細胞を１μＭ ＣＣＰＡ、１μＭレキスキャン、ＤＭＳＯ、または培地のみで３分間または３０分間処理した。カバーグラスをＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、ＰＢＳ中で再び洗浄したあと、ＰＢＳの０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で透過処理した。ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で洗浄後、カバーグラスを１％ＢＳＡでブロッキングし、次いでＰｈａｌｌｏｄｉｎ−Ａｌｅｘａ ５６８で染色した。カバーグラスを洗浄し、ＤＡＰＩを含むＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてスライド上に封入した。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１蛍光顕微鏡で画像を取得した。
実施例３３−アルブミン取り込みアッセイ法
コラーゲンコートしたカバーグラス上で成長させたＢｅｎｄ．３細胞をアルブミン−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４（５０ｍｇ／ｍＬ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および培地のみ、ＤＭＳＯビヒクル、ＮＥＣＡ（１μＭ）、またはレキスキャン（１μＭ）のいずれかとともに３０分間インキュベートした。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｍ１蛍光顕微鏡を用いてアルブミン取り込みを可視化した（アルブミン＝赤色）。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎソフトウェアを用いて全アルブミン蛍光を記録し、Ｉｍａｇｅ−Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて測定した。
実施例３４−タイトジャンクション分子染色
コラーゲンコートしたカバーグラス上で成長させたＢｅｎｄ．３細胞をＤＭＳＯビヒクル、ＮＥＣＡ（１μＭ）、またはレキスキャン（１μＭ）とともに１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中の０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで透過処理した。細胞をＰＢＳ／ＢＳＡ／ヤギ血清でブロッキングしたあと、ＺＯ−１（１Ａ１２）、クローディン５（３４−１６００）、またはオクルディン（３Ｆ１０）のいずれかに対する抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。洗浄ステップ後、細胞をヤギ抗ウサギＩｇテキサスレッド−Ｘまたはヤギ抗マウスＩｇＣｙ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかとともにインキュベートした。カバーグラスを洗浄し、ＤＡＰＩを含むＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄを用いてスライド上に封入した。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｍ１蛍光顕微鏡で画像を取得した。
実施例３５−分析は広域スペクトルＡＲアゴニストＮＥＣＡが高分子に対するＢＢＢ透過性を増加させることを裏付ける
スチューデントＴ検定を用いて評価される統計的有意差は、Ｐ≦０．０５の場合に示される。
全てのＡＲ（Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、Ａ３）を活性化するＮＥＣＡの静脈内投与が、静脈内投与された蛍光標識デキストランのマウスＣＮＳ内への溢出の用量依存的増加をもたらすことが立証された（図１９）。重要なことに、ＮＥＣＡの用量の変更は、ビヒクルのみでの処置と比較して、１０，０００Ｄａデキストラン（図１９Ａ）および７０，０００Ｄａデキストラン（図１９Ｂ）の両方のＣＮＳ進入の用量依存的増加をもたらすことが観察された。デキストランのＣＮＳ進入の最大値は、０．０８ｍｇ／ｋｇのＮＥＣＡの場合に観察された。より高い濃度のＮＥＣＡは、付加的影響を及ぼさず、あるいは効率の低下を示したが、これは受容体脱感作に起因すると考えられる（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｓｕｂｔｙｐｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｒｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｋｉｎａｓｅｓ，"Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７：５４６−５２（２０００）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。これらの結果は、アデノシン受容体活性化がＢＢＢ透過性を増加させることを示している。
次に、ＮＥＣＡ投与後のＢＢＢ透過性の持続時間、およびその過程が可逆的であるかどうかを決定した。用量反応実験で決定された最小有効用量（０．０８ｍｇ／ｋｇ）のＮＥＣＡを用いた経時的実験において、ＮＥＣＡ処置後の関門透過性の増加は、一時的な不連続なものであり（図２０Ａ）、標識デキストランのＣＮＳ進入の最大値は処置後４〜６時間で観察された。これらのデータは、デキストランおよびＮＥＣＡが時間ゼロ（Ｔ０）で投与されたことから、脳におけるＦＩＴＣ−デキストランの経時的な蓄積を表している。ＮＥＣＡ処置後の不連続的な時間にどれだけの量のデキストランが脳に進入できるかを測定するために、第２の実験では、ＮＥＣＡ投与後の表示される時間にデキストランを投与した（図２０Ｂ）。これらのデータは、デキストラン注射９０分後の脳へのデキストラン進入を示す。ＮＥＣＡ処置後８時間（回収時間９．５時間）で、脳中の検出可能レベルのデキストランが最大値から減少し、ＮＥＣＡ処置１８時間後に投与したデキストランは脳で有意なレベルで検出されなかったので、処置後１８時間（回収時間１９．５時間）までに、このレベルはベースラインまで戻った（図２０Ｂ）。これらの結果は、ＮＥＣＡの静脈内投与が、８〜１８時間でベースラインに戻る、一時的な不連続的な期間の関門透過性増加をもたらすことを示している。
実施例３６−Ａ１およびＡ２Ａ ＡＲ活性化はＢＢＢ透過性を増加させる
Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、およびＡ３の４つのＡＲサブタイプが哺乳動物において発現される（Ｓｅｂａｓｔｉａｏ ｅｔ ａｌ．，"Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ，"Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４７１−５３４（２００９）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。どのＡＲが関門透過性に関与しているかを特定するために、それぞれの受容体サブタイプのｍＲＮＡ発現レベルをマウス脳内皮細胞で検査した。この細胞株において、Ａ１受容体およびＡ２Ａ受容体の発現は検出されたが、Ａ２Ｂ受容体またはＡ３受容体の発現は検出されなかった（図２１Ａ）。さらに、ＡＴＰ（ＣＤ３９）から細胞外アデノシンの触媒作用に必要とされる２つのエクト酵素であるＣＤ７３およびＣＤ３９の発現が、培養マウス脳内皮細胞において観察された。ＡＲ活性化がマウスにおいてＢＢＢのデキストラン透過性を増加させることから、次に、アデノシンの受容体がマウスＢＥＣによって発現されるかどうかを特定した。Ａ１ ＡＲおよびＡ２Ａ ＡＲに対する抗体およびプローブを用いて、免疫蛍光染色（図２１Ｂ）および蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（図２１Ｃ）によるマウス脳内のＣＤ３１共染色内皮細胞において、両ＡＲの発現を観察した。重要なことに、マウス脳から単離した初代内皮細胞において、Ａ１ ＡＲおよびＡ２Ａ ＡＲの両タンパク質の発現が、ウエスタンブロット分析によって検出された（図２１Ｄ）。興味深いことに、ヒト脳内皮細胞株ｈＣＭＥＣ／Ｄ３もＡ１ ＡＲおよびＡ２Ａ ＡＲの双方を発現した。これらのデータは、ＢＥＣが細胞外アデノシンに直接応答できることを示している。
ＡＲを介したＢＢＢ透過性の変化におけるＡ１受容体およびＡ２Ａ受容体の機能的貢献を調査するために、これらの受容体が欠損したマウスにおいてこの影響を研究した。重要なことに、ＷＴマウス、Ａ１ ＡＲ−／−マウス、およびＡ２Ａ ＡＲ−／−マウスの間で、ＢＢＢの１０，０００Ｄａデキストラン透過性の基本レベルに有意差はなかった（図２１Ｅ、２１Ｆ、２１Ｇ）。ＮＥＣＡ静脈内投与後、Ａ１ −／−およびＡ２Ａ−／−の両マウスは、野生型マウスと比較して、その脳内の静脈内投与デキストランの有意に低いレベルを示した（図２１Ｅおよび２１Ｆ）。これらのデータは、関門透過性の調節が、少なくとも部分的に、これら２つのＡＲサブタイプに仲介されることを示している。Ａ１ ＡＲもＡ２Ａ ＡＲも活性化に利用できない場合のマウスにおけるＮＥＣＡ投与のＢＢＢ透過性に対する影響を検査するために、Ａ１ ＡＲ−／−マウスをＮＥＣＡ投与前に選択的Ａ２ＡアンタゴニストＳＣＨ ５８２６１で処置した。Ａ１ ＡＲが欠損したマウスにおいてＡ２Ａ ＡＲシグナル伝達がこのアンタゴニストによって遮断されたとき、ＢＢＢ透過性の有意な増加は観察されなかった（図２１Ｇ）。これらのデータは、ＢＢＢ透過性の調節が、少なくとも部分的に、これら２つのＡＲサブタイプに仲介されることを示している。
これらの結果を裏付けるために、特異的Ａ１アゴニスト２−クロロ−Ｎ６−シクロペンチルアデノシン（ＣＣＰＡ）および特異的Ａ２Ａアゴニスト４−［２−［［６−アミノ−９−（Ｎ−エチル−ｂ−Ｄ−リボフラヌロンアミドシル）−９Ｈ−プリン−２イル］アミノ］エチル］ベンゼンプロパン酸（ＣＧＳ ２１６８０）を野生型マウスに投与した。ＣＧＳ ２１６８０（図２１Ｈ）およびＣＣＰＡ（図２１Ｉ）の両処置は、デキストランのＣＮＳへの進入の増加をもたらし、また、この増加はビヒクル処置と比較して多大であるが、ＮＥＣＡ投与後に観察されたものよりは有意に低かった。しかしながら、ＣＣＰＡおよびＣＧＳ ２１６８０は、組み合わせて使用した場合、ＮＥＣＡ処置で観察されたＣＮＳへのデキストラン進入の増加の影響を再現した（図２１Ｊ）。これらの結果は、アデノシン受容体の調節が、分子のＣＮＳへの進入を促進することを裏付けた。これらの結果を総合すると、ＢＥＣにおけるＡ１ ＡＲまたはＡ２Ａ ＡＲのいずれかの活性化は、分子のＣＮＳへの進入を促進し得るが、両ＡＲの活性化は相加効果を有するということが示される。
実施例３７−選択的Ａ２Ａ ＡＲアゴニストのレキスキャンはＢＢＢ透過性を増加させる
静脈内投与された化合物のＣＮＳ進入を促進するＡＲ活性化作用の治療上の用途の可能性を探るために、市販のＦＤＡ承認ＡＲアゴニストを実験的パラダイムにおいて試験した。ヒトにおける心筋血流イメージングでの使用に成功している特異的Ａ２Ａ ＡＲアゴニストのレキスキャン（Ｉｓｋａｎｄｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，"Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｖｅｒｓｕｓ Ｒｅｇａｄｅｎｏｓｏｎ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＤＶＡＮＣＥ Ｐｈａｓｅ ３ Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｒｉａｌ，"Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１４：６４５−５８（２００７）（その全体を参照によって本明細書に援用する））は、マウスにおいて、静脈内投与後にＢＢＢの１０，０００Ｄａデキストラン透過性を実際に増加させた（図２２Ａ）。興味深いことに、ＦＩＴＣ−デキストランは、単回レキスキャン注射５分後に脳中で検出可能であった。さらに、レキスキャンの静脈内投与は、ラットでもＢＢＢ透過性を増加させた（図２２Ｂ）。レキスキャン投与後のＢＢＢ透過性の増加の程度は、ＮＥＣＡ投与後の透過性の増加の程度よりもはるかに大きかった。また、興味深いことに、ＢＢＢ透過性の増加の持続時間は、ＡＲアゴニストの半減期と相関する。例えば、ＮＥＣＡ（半減期約５時間）による処置後のＢＢＢの開放および閉鎖の経時変化は、レキスキャン（半減期約３分間；（Ａｓｔｅｌｌａｓ Ｐｈａｒｍａ，"Ｌｅｘｉｓｃａｎ：Ｕ．Ｓ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ"（２００９）（その全体を参照によって本明細書に援用する））による処置後の経時変化よりもはるかに長い。薬物の持続注入を模倣することを意図した注射パラダイムにおいて、１５分間にわたるレキスキャンの３回の注射の結果、劇的に高いレベルの標識デキストランがラット脳で検出された（図２２Ｂ）。レキスキャンのＢＢＢ透過性に対する影響の持続時間を検査するために、マウスおよびラットの両者において、経時的なＣＮＳデキストラン進入を測定した。図２２Ｃは、１μｇのレキスキャンを同時投与したラットにおける、５分後のＢＢＢのＦＩＴＣ−デキストラン透過性の結果をグラフ形式で示す。レキスキャンの単回静脈注射後、ＢＢＢ透過性の最大増加が３０分後に観察され、処置１８０分後までにベースラインに戻った（図２２Ｄ）。ラットにおけるレキスキャン処置後にも同様の結果が観察された（図２２Ｅ）。重要なことに、レキスキャン処置後のＢＢＢ透過性に対する影響の持続時間は、ＮＥＣＡ処置後よりもはるかに短かったが、これはおそらくこれらの化合物の異なる半減期（ＮＥＣＡ約５時間、レキスキャン約３分間；（Ａｓｔｅｌｌａｓ Ｐｈａｒｍａ，"Ｌｅｘｉｓｃａｎ：Ｕ．Ｓ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ"（２００９）（その全体を参照によって本明細書に援用する））に起因すると考えられる。図２２Ｂにおける標識デキストランの２０倍を超える増加（単回注射と比較、図２２Ｅ）は、複数用量のレキスキャンの結果としてＢＢＢ開放にもたらされた相乗効果によって説明される。
これらの結果は、本研究で使用した、広域ＡＲアゴニストであるＮＥＣＡならびに特異的Ａ１およびＡ２Ａ ＡＲアゴニストであるＣＣＰＡおよびＣＧＳ ２１６８０に加え、ＦＤＡ承認Ａ２Ａアゴニストのレキスキャンも高分子に対するＢＢＢ透過性を増加させることを示した。
実施例３８−Ａ２Ａ拮抗作用はＢＢＢ透過性を減少させる
Ａ１受容体およびＡ２Ａ受容体の活性化作用が関門透過性を増加させるのであれば、ＡＲ拮抗作用は関門透過性を減少させ、分子のＣＮＳへの進入を防止するであろうという仮説をさらに立てた。Ａ２Ａアデノシン受容体の遮断がＣＮＳ内への白血球遊走を阻害することは、ＷＴマウスにおいて既に観察されている（Ｍｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，"ＣＤ７３ ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｅｎｔｒｙ ｏｆ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ Ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｄｕｒｉｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，"Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５：９３２５−３０（２００８）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。この仮説を特異的Ａ２Ａ ＡＲアンタゴニストを用いて試験した。Ａ２Ａ ＡＲアンタゴニスト２−（２−フラニル）−７−（２−フェニルエチル）−７Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｅ］［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン−５−アミン（ＳＣＨ ５８２６１）の腹腔内投与は、結果として１０，０００Ｄａ ＦＩＴＣ−デキストランのＷＴマウス脳への進入を有意に減少させた（図２２Ｆ）。このデータは、ＡＲシグナル伝達の遮断が、ＢＢＢを厳重にするかまたは閉鎖することを裏付ける。
実施例３９−β−アミロイドに対する抗体はＮＥＣＡ投与後に脳に進入する
ＢＢＢを通過させることが最も難しい治療物質は、抗体などの高分子であり、これはその巨大なサイズによる（約１５０ｋＤａ）。ＮＥＣＡによるアデノシン受容体調節が、抗体のＣＮＳへの進入を促進することができるかどうかが問われた。これを試験するために、ＡＤのダブル［アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）／プレセニリン（ＰＳＥＮ）］トランスジェニックマウスモデル［株Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＡＰＰｓｗｅ，ＰＳＥＮ１ｄＥ９）８５Ｄｂｏ／Ｊ］を使用した。これらのマウスは、ＡＤの特徴であるβ−アミロイド（Ａβ）プラークの同様の沈着を有する（Ｊａｎｋｏｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，"Ｍｕｔａｎｔ Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ Ｅｌｅｖａｔｅ ｔｈｅ Ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ４２ Ｒｅｓｉｄｕｅ Ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎ ｖｉｖｏ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ４２−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇａｍｍａ Ｓｅｃｒｅｔａｓｅ，"Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１３：１５９−１７０（２００４）、Ｍｉｎｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，"Ｎｅｕｒａｌ．Ｐｌａｓｔ．１２：２９９−３１０（２００５）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。
モノクローナル抗体６Ｅ１０（Ｃｏｖａｎｃｅ）は、脳室内注射によって投与したときにＡＤのマウスモデルにおいてＡβプラークの負担を有意に減少させることが証明されている（Ｔｈａｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ Ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｒｅｄｕｃｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｍｙｌｏｉｄ Ａｎｇｉｏｐａｔｈｙ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏ−ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅｓ ｉｎ Ａｇｅｄ Ｔｇ２５７６ Ｍｉｃｅ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６：４５０１−６（２００９）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。ＮＥＣＡ静脈内投与３時間後、６Ｅ１０抗体を静脈内投与した。９０分後、脳を回収し、切断し、二次Ｃｙ５標識抗体で染色した。６Ｅ１０抗体とＡβプラークとの結合は、ＮＥＣＡ処置マウスの脳全体において観察され、海馬領域にＡβプラークが集中していた（図２３Ａおよび２３Ｅ）。ビヒクルのみで処置したＡＤマウス（図２３Ａ、２３Ｂ、および２３Ｅ）またはＮＥＣＡもしくはビヒクルで処置したＷＴマウスでは、静脈注射した６Ｅ１０抗体の結合は観察されなかった。ＮＥＣＡ処置のみでもビヒクル処置のみでもＡＤマウスのＡβプラークを形成する能力に影響を与えなかった（図２３Ｃおよび２３Ｄ）。これらの結果は、静脈内投与したＡβに対する抗体が、ＡＲ活性化作用後にＢＢＢを通過し、ＣＮＳのＡβプラークと結合することができ（図２３Ｈ）、このほとんどは脳内の血管付近に位置することを示している（図２３Ｆおよび２３Ｇ）。これらの結果は、静脈投与されたβ−アミロイドに対する抗体が、ＡＲ活性化作用後にＢＢＢを通過することができることを示している。
実施例４０−ＡＲ活性化は培養マウスＢＥＣ単層における経皮内抵抗の減少をもたらす
ＡＲシグナル伝達がＢＢＢ透過性の変化をどのように仲介するかを特定するために、既に確立されたマウス脳内皮細胞株であるＢｅｎｄ．３（Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，"Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｂｅｒｒａｎｔ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｉｄｄｌｅ Ｔ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，"Ｃｅｌｌ ６２：４３５−４４５（１９９０）（その全体を参照によって本明細書に援用する））を使用した。哺乳動物において発現される４つの既知のＡＲサブタイプが存在するが（Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、およびＡ３（Ｓｅｂａｓｔｉａｏ ｅｔ ａｌ．，"Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ，"Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４７１−５３４（２００９）（その全体を参照によって本明細書に援用する））、Ｂｅｎｄ．３細胞では、Ａ１受容体およびＡ２Ａ受容体のｍＲＮＡ発現は検出されたが、Ａ２Ｂ受容体またはＡ３受容体のｍＲＮＡ発現は検出されなかった（図２４Ａ）。さらに、ＡＴＰから細胞外アデノシンの触媒作用に必要とされるエクト酵素であるＣＤ７３の発現が、これらの培養マウスＢＥＣにおいて観察された（図２４Ａ）。重要なことに、Ａ１ ＡＲおよびＡ２Ａ ＡＲのタンパク質発現はＢｅｎｄ．３細胞において観察され（図２４Ｂ）、これらの細胞が細胞外アデノシンに直接応答できることを立証している。
内皮細胞単層における経内皮細胞電気抵抗（ＴＥＥＲ）の減少は、内皮細胞間の細胞間隔の増加および関門透過性の増加と相関することが立証されている（Ｗｏｊｃｉａｋ−Ｓｔｏｔｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，"Ｒｈｏ ａｎｄ Ｒａｃ Ｂｕｔ ｎｏｔ Ｃｄｃ４２ Ｒｅｇｕｌａｔｅ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ，"Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１４：１３４３−１３５５（２００１）、Ｄｅｗｉ ｅｔ ａｌ．，"Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ：Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｎｇｕｅ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，"Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２１：１７１−１８０（２００４）（その全体を参照によって本明細書に援用する））。培養マウスＢＥＣの単層を用いたトランスウェルアッセイ法において（開始ＴＥＥＲ絶対平均値＝１８２オーム；中央値＝１８７オーム）、ＮＥＣＡまたはレキスキャンの添加後に、ビヒクルまたは培地のみを添加したＢＥＣと比較して、ＴＥＥＲの減少を観察した（図２４Ｃ）。ＡＲシグナル伝達はＢＥＣにおけるＴＥＥＲを変更するが、ＡＲ刺激後にＢＥＣにおける経細胞輸送の速度の変更は観察しなかった。例えば、ＮＥＣＡおよびレキスキャン誘導ＡＲシグナル伝達は、培地およびビヒクル処置対照と比較して、ＢＥＣにおける蛍光染色アルブミン取り込みの速度に影響を与えなかった（図２４Ｄ〜２４Ｈ）。
実施例４１−ＡＲ活性化は脳内皮細胞におけるアクトミオシンストレスファイバー形成およびタイトジャンクションの変更と相関する
アクチン細胞骨格は、細胞形状の維持および内皮関門完全性のために不可欠である。アクトミオシンストレスファイバーは、細胞形状において収縮を誘導するために必要であることから（Ｈｏｔｕｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｓｔｒｅｓｓ Ｆｉｂｅｒｓ ａｒｅ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ Ｔｗｏ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ａｃｔｉｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ Ｍｏｔｉｌｅ Ｃｅｌｌｓ，"Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７３：３８３−９４（２００６）、Ｐｒａｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ Ａｃｔｉｎ Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ ｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ，"Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．７７：５３−６３（２００９）（その全体を参照によって本明細書に援用する））、アデノシン受容体シグナル伝達がアクチンストレスファイバー誘導をもたらすと仮定した。
これを試験するために、脳内皮細胞（「ＢＥＣ」）をＣＣＰＡ（Ａ１アデノシン受容体を刺激するため）またはレキスキャン（Ａ２Ａアデノシン受容体を刺激するため）のいずれかで処理した（図２４Ｉ〜２４Ｐ）。図２４Ｉ〜２４Ｌに示すように、Ａ１アゴニストおよびＡ２Ａアゴニスト処理後、ビヒクルのみでの処理と比較して、アクチノマイシンストレスファイバーの顕著な誘導が観察された。このことは、ＡＲの活性化がＢＥＣにおける細胞骨格要素の変化を誘導して、関門透過性を増加させることを示している。
ＡＲシグナル伝達は、傍細胞透過性の機能尺度であるＴＥＥＲ、および細胞形状を制御するアクトミオシンストレスファイバーの変化を誘導するが、ＡＲシグナル伝達がＢＥＣ間の結合相互作用を変更するかどうかを判断することは重要である。したがって、ＡＲシグナル伝達がＢＥＣのタイトジャンクションを変更するかどうかを判断するために、Ｂｅｎｄ．３細胞をコンフルエント単層を形成するまで培養し、ＺＯ−１、クローディン５、またはオクルディンの発現が、ＡＲアゴニスト処理後に変更されるかどうかを判断した（図２４Ｑ〜２４Ｙ）。コンフルエントＢｅｎｄ．３細胞は、培地で成長させた場合、またはビヒクルで処理した場合には適切なタイトジャンクションを形成したが（図２４Ｑ、２４Ｔ、および２４Ｗ）、ＡＲアゴニスト処理は、タイトジャンクションタンパク質発現の変更を誘導した。例えば、ＮＥＣＡまたはレキスキャンで処理したＢｅｎｄ．３細胞は、処理後にオクルディン発現を大幅に減少させ、ＺＯ−１およびクローディン５をわずかに変更した（図２４Ｘおよび２４Ｙ）。これらの結果は全体として、ＢＥＣ透過性がタイトジャンクション分子発現の変化を介して、ＡＲシグナル伝達によって変化され得ることを示している。
図２５に概略的に示すように、Ａ１ ＡＲまたはＡ２Ａ ＡＲのいずれかの活性化は、ＢＢＢ透過性を一時的に増加させるが、両受容体の活性化は、ＢＢＢ透過性増加の相加効果をもたらすことを立証している。Ａ１ ＡＲおよびＡ２Ａ ＡＲによって仲介されるＢＢＢ透過性がドアとして機能し、活性化がそのドアを開き、局所アデノシン濃度が鍵となることが、本明細書において示される。
本明細書において好ましい実施形態を詳細に描写および説明したが、本発明の精神から逸脱することなく、様々な修正、追加、代用などを行ってもよく、これらはしたがって以下の特許請求の範囲において定義する本発明の範囲に含まれるとみなされることは、当業者には明らかであろう。

Claims (78)

  1. 対象において血液脳関門透過性を増加させるための方法であって、該対象に、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する作用物質を投与する段階を含む、方法。
  2. 血液脳透過性の前記増加が最大１８時間持続する、請求項１に記載の方法。
  3. Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する前記作用物質が、Ａ１受容体およびＡ２Ａ受容体の両者のアゴニストである、請求項１に記載の方法。
  4. Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する前記作用物質が、広域スペクトルアデノシン受容体アゴニストである、請求項３に記載の方法。
  5. Ａ１受容体およびＡ２Ａ受容体の両者の前記アゴニストがＡＭＰ５７９である、請求項３に記載の方法。
  6. Ａ１受容体およびＡ２Ａ受容体の両者の前記アゴニストがＮＥＣＡである、請求項４に記載の方法。
  7. Ａ１受容体およびＡ２Ａ受容体の両者の前記活性化が、血液脳関門透過性に関して相乗的である、請求項３に記載の方法。
  8. Ａ１受容体およびＡ２Ａ受容体の両者の前記活性化が、血液脳関門透過性に関して相加的である、請求項３に記載の方法。
  9. 対象において血液脳関門透過性を増加させるための方法であって、該対象に、Ａ１アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２Ａアデノシン受容体アゴニストを投与する段階を含む、方法。
  10. 前記Ａ１アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２Ａ受容体アゴニストが、Ａ１選択的アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２選択的アデノシン受容体アゴニストである、請求項９に記載の方法。
  11. 前記Ａ１アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２Ａ受容体アゴニストが、単一単位剤形として製剤化される、請求項９に記載の方法。
  12. 前記Ａ１アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２Ａ受容体アゴニストを同時に投与する、請求項９に記載の方法。
  13. 前記Ａ１アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２Ａ受容体アゴニストを連続的に投与する、請求項９に記載の方法。
  14. 前記Ａ１選択的アデノシン受容体アゴニストが、ＣＣＰＡ、８−シクロペンチル−１，３−ジプロピルキサンチン、Ｒ−フェニルイソプロピル−アデノシン、Ｎ６−シクロペンチルアデノシン、Ｎ（６）−シクロヘキシルアデノシン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  15. 前記Ａ２Ａ選択的アデノシン受容体アゴニストが、レキスキャン、ＣＧＳ ２１６８０、ＡＴＬ−１４６ｅ、ＹＴ−１４６（２−（１−オクチニル）アデノシン）、ＤＰＭＡ（Ｎ６−（２−（３，５−ジメトキシフェニル）−２−（２−メチルフェニル）エチル）アデノシン）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  16. Ａ１アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２Ａアデノシン受容体アゴニストと、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、またはビヒクルとを含む、組成物。
  17. 前記Ａ１アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２Ａ受容体アゴニストが、Ａ１選択的アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２選択的アデノシン受容体アゴニストである、請求項１６に記載の組成物。
  18. 治療物質をさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
  19. 前記治療物質がＣＮＳの疾患、障害、または病状を治療するのに好適である、請求項１８に記載の組成物。
  20. 前記治療物質が、アセトアミノフェン、アセチルサリチル酸、アシルトランスフェラーゼ、アルプラゾラム、アマンタジン、アミスルプリド、アミトリプチリン、アンフェタミン−デキストロアンフェタミン、アムサクリン、抗精神病薬、抗ウイルス薬、アポモルヒネ、アリモクロモル、アリピプラゾール、アセナピン、アスパルトアシラーゼ酵素、アトモキセチン、非定型抗精神病薬、アザチオプリン、バクロフェン、ベクラミド、ベンセラジド、ベンセラジド−レボドパ、ベンゾジアゼピン、ベンズトロピン、ベバシズマブ、ブレオマイシン、ブリバラセタム、ブロモクリプチン、ブプレノルフィン、ブプロピオン、カベルゴリン、カルバマゼピン、カルバトロール、カルビドパ、カルビドパ−レボドパ、カルボプラチン、クロラムブシル、クロルプロマジン、クロルプロチキセン、シスプラチン、シタロプラム、クロバザム、クロミプラミン、クロナゼパム、クロザピン、コデイン、ＣＯＸ−２阻害剤、シクロホスファミド、ダクチノマイシン、デクスメチルフェニデート、デキストロアンフェタミン、ジアモルヒネ、ダイアスタット、ジアゼパム、ジクロフェナク、ドネペジル、ドキソルビシン、ドロペリドール、エンタカポン、エピルビシン、エスシタロプラム、エトスクシミド、エトポシド、フェルバメート、フルオキセチン、フルペンチキソール、フルフェナジン、ホスフェニトイン、ガバペンチン、ガランタミン、γヒドロキシブチラート、ゲフィチニブ、ハロペリドール、ヒダントイン、ヒドロコドン、ヒドロキシジン、イブプロフェン、イホスファミド、ＩＧＦ−１、イロペリドン、イマチニブ、イミプラミン、インターフェロン、イリノテカン、ＫＮＳ−７６０７０４、ラコサミド、ラモトリジン、レベチラセタム、レボドパ、レボメプロマジン、リスデキサンフェタミン、リスリド、炭酸リチウム、脂肪分解酵素、メクロレタミン、ｍＧｌｕＲ２アゴニスト、メマンチン、メペリジン、メルカプトプリン、メソリダジン、メスクシミド、メタンフェタミン、メチルフェニデート、ミノサイクリン、モダフィニル、モルヒネ、Ｎ−アセチルシステイン、ナプロキセン、ネルフィナビル、ニューロトリン（ｎｅｕｒｏｔｒｉｎ）、ニトラゼパム、ＮＳＡＩＤ、オランザピン、オピエート、オセルタミビル、オキサプラチン、パリペリドン、パントテン酸キナーゼ２、パーキン、パロキセチン、ペルゴリド、ペリシアジン、ペルフェナジン、フェナセミド、フェネルジン、フェノバルビタール、フェネトライド、フェニトイン、ピモジド、Ｐｉｎｋ１、ピリベジル、ポドフィロトキシン、プラミペキソール、プレガバリン、プリミドン、プロクロルペラジン、プロマジン、プロメタジン、プロトリプチリン、ピリミジンジオン、クエチアピン、ラサギリン、レマセミド、リルゾール、リスペリドン、リトナビル、リツキシマブ、リバスティグミン、ロピニロール、ロチゴチン、ルフィナマイド、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、セレギン、セレギリン、セルチンドール、セルトラリン、バルプロ酸ナトリウム、スチリペントール、タキサン、テマゼパム、テモゾロマイド、テノホビル、テトラベナジン、チアミン、チオリダジン、チオチキセン、チアガビン、トルカポン、トピラマート、トポテカン、トラマドール、トラニルシプロミン、トラスツズマブ、三環系抗うつ薬、トリフルオペラジン、トリフルプロマジン、トリヘキシフェニジル、トリレプタル、バラシクロビル、バルノクタミド、バルプロミド、バルプロ酸、ベンラファクシン、水疱性口内炎ウイルス、ビガバトリン、ビンカアルカロイド、ザナミビル、ジプラシドン、ゾニサミド、ゾテピン、ズクロペンチキソール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１９に記載の組成物。
  21. 対象の脳に高分子治療物質を送達するための方法であって、該対象に、（ａ）Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する作用物質と、（ｂ）該高分子治療物質とを投与する段階を含む、方法。
  22. 前記高分子治療物質の前に、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する前記作用物質を投与する、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記高分子治療物質と同時に、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する前記作用物質を投与する、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記高分子治療物質を投与する５分前、１０分前、１５分前、３０分前、１時間前、２時間前、３時間前、４時間前、５時間前、６時間前、７時間前、８時間前、９時間前、１０時間前、１１時間前、１２時間前、１３時間前、１４時間前、１５時間前、１６時間前、１７時間前、または１８時間前までに、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する前記作用物質を投与する、請求項２１に記載の方法。
  25. 前記高分子治療物質がモノクローナル抗体である、請求項２１に記載の方法。
  26. 前記高分子治療物質が、６Ｅ１０、ＰＦ−０４３６０３６５、１３１Ｉ−ｃｈＴＮＴ−１／Ｂ ＭＡｂ、１３１Ｉ−Ｌ１９ＳＩＰ、１７７Ｌｕ−Ｊ５９１、ＡＢＴ−８７４、ＡＩＮ４５７、アレムツズマブ、抗ＰＤＧＦＲαモノクローナル抗体ＩＭＣ−３Ｇ３、アスタチンＡｔ２１１モノクローナル抗体８１Ｃ６、バピネオズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、シクスツムマブ、ダクリズマブ、Ｈｕ ＭｉＫ−β−１、ＨｕＭａｘ−ＥＧＦｒ、ヨウ素Ｉ−１３１モノクローナル抗体３Ｆ８、ヨウ素Ｉ−１３１モノクローナル抗体８１Ｃ６、ヨウ素Ｉ−１３１モノクローナル抗体８Ｈ９、ヨウ素Ｉ−１３１モノクローナル抗体ＴＮＴ−１／Ｂ、ＬＭＢ−７免疫毒素、ＭＡｂ−４２５、ＭＧＡＷＮ１、Ｍｅｌ−１４ Ｆ（ａｂ'）２、Ｍ−Ｔ４１２、ナタリズマブ、ノイラジアブ（Ｎｅｕｒａｄｉａｂ）、ニモツズマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ＳＤＺ ＭＳＬ−１０９、ソラネズマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、ザルツムマブ、タネズマブ、アフリベルセプト、ＭＥＤＩ−５７８、ＲＥＧＮ４７５、ムロモナブ−ＣＤ３、アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、アダリムマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、トシツモマブ−Ｉ１３１、エファリズマブ、アブシキシマブ、セルトリズマブペゴル、エクリズマブ、ＡＭＧ−１６２、ザノリムマブ、ＭＤＸ−０１０、抗０ＭＲＳＡ ｍＡｂ、パキセリズマブ、メポリズマブ、エプラツズマブ、抗ＲＳＶ ｍＡｂ、アフェリモマブ、カツマキソマブ、ＷＸ−Ｇ２５０、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるモノクローナル抗体である、請求項２５に記載の方法。
  27. Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する前記作用物質の前記投与ならびに前記高分子治療物質の前記投与が全身投与である、請求項２１〜２６のうちのいずれか一項に記載の方法。
  28. Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する前記作用物質の前記投与または前記高分子治療物質の前記投与が全身投与である、請求項２１〜２６のうちのいずれか一項に記載の方法。
  29. 対象においてＣＮＳの疾患、障害、または病状を治療するための方法であって、該対象に、（ａ）Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する少なくとも１つの作用物質と、（ｂ）治療物質とを投与する段階を含む、方法。
  30. Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する前記作用物質が、Ａ１受容体およびＡ２Ａ受容体の両者のアゴニストである、請求項２９に記載の方法。
  31. Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する前記作用物質が、広域スペクトルアデノシン受容体アゴニストである、請求項３０に記載の方法。
  32. Ａ１受容体およびＡ２Ａ受容体の両者の前記アゴニストがＡＭＰ５７９である、請求項３０に記載の方法。
  33. Ａ１受容体およびＡ２Ａ受容体の両者の前記アゴニストがＮＥＣＡである、請求項３１に記載の方法。
  34. 前記治療物質が高分子治療物質である、請求項２９に記載の方法。
  35. 前記高分子治療物質がモノクローナル抗体である、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記モノクローナル抗体が、６Ｅ１０、ＰＦ−０４３６０３６５、１３１Ｉ−ｃｈＴＮＴ−１／Ｂ ＭＡｂ、１３１Ｉ−Ｌ１９ＳＩＰ、１７７Ｌｕ−Ｊ５９１、ＡＢＴ−８７４、ＡＩＮ４５７、アレムツズマブ、抗ＰＤＧＦＲαモノクローナル抗体ＩＭＣ−３Ｇ３、アスタチンＡｔ２１１モノクローナル抗体８１Ｃ６、バピネオズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、シクスツムマブ、ダクリズマブ、Ｈｕ ＭｉＫ−β−１、ＨｕＭａｘ−ＥＧＦｒ、ヨウ素Ｉ−１３１モノクローナル抗体３Ｆ８、ヨウ素Ｉ−１３１モノクローナル抗体８１Ｃ６、ヨウ素Ｉ−１３１モノクローナル抗体８Ｈ９、ヨウ素Ｉ−１３１モノクローナル抗体ＴＮＴ−１／Ｂ、ＬＭＢ−７免疫毒素、ＭＡｂ−４２５、ＭＧＡＷＮ１、Ｍｅｌ−１４ Ｆ（ａｂ'）２、Ｍ−Ｔ４１２、ナタリズマブ、ノイラジアブ、ニモツズマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ＳＤＺ ＭＳＬ−１０９、ソラネズマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、ザルツムマブ、タネズマブ、アフリベルセプト、ＭＥＤＩ−５７８、ＲＥＧＮ４７５、ムロモナブ−ＣＤ３、アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、アダリムマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、トシツモマブ−Ｉ１３１、エファリズマブ、アブシキシマブ、セルトリズマブペゴル、エクリズマブ、ＡＭＧ−１６２、ザノリムマブ、ＭＤＸ−０１０、抗０ＭＲＳＡ ｍＡｂ、パキセリズマブ、メポリズマブ、エプラツズマブ、抗ＲＳＶ ｍＡｂ、アフェリモマブ、カツマキソマブ、ＷＸ−Ｇ２５０、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記治療物質が低分子治療物質である、請求項２９に記載の方法。
  38. 前記低分子治療物質が、アセトアミノフェン、アセチルサリチル酸、アシルトランスフェラーゼ、アルプラゾラム、アマンタジン、アミスルプリド、アミトリプチリン、アンフェタミン−デキストロアンフェタミン、アムサクリン、抗精神病薬、抗ウイルス薬、アポモルヒネ、アリモクロモル、アリピプラゾール、アセナピン、アスパルトアシラーゼ酵素、アトモキセチン、非定型抗精神病薬、アザチオプリン、バクロフェン、ベクラミド、ベンセラジド、ベンセラジド−レボドパ、ベンゾジアゼピン、ベンズトロピン、ベバシズマブ、ブレオマイシン、ブリバラセタム、ブロモクリプチン、ブプレノルフィン、ブプロピオン、カベルゴリン、カルバマゼピン、カルバトロール、カルビドパ、カルビドパ−レボドパ、カルボプラチン、クロラムブシル、クロルプロマジン、クロルプロチキセン、シスプラチン、シタロプラム、クロバザム、クロミプラミン、クロナゼパム、クロザピン、コデイン、ＣＯＸ−２阻害剤、シクロホスファミド、ダクチノマイシン、デクスメチルフェニデート、デキストロアンフェタミン、ジアモルヒネ、ダイアスタット、ジアゼパム、ジクロフェナク、ドネペジル、ドキソルビシン、ドロペリドール、エンタカポン、エピルビシン、エスシタロプラム、エトスクシミド、エトポシド、フェルバメート、フルオキセチン、フルペンチキソール、フルフェナジン、ホスフェニトイン、ガバペンチン、ガランタミン、γヒドロキシブチラート、ゲフィチニブ、ハロペリドール、ヒダントイン、ヒドロコドン、ヒドロキシジン、イブプロフェン、イホスファミド、ＩＧＦ−１、イロペリドン、イマチニブ、イミプラミン、インターフェロン、イリノテカン、ＫＮＳ−７６０７０４、ラコサミド、ラモトリジン、レベチラセタム、レボドパ、レボメプロマジン、リスデキサンフェタミン、リスリド、炭酸リチウム、脂肪分解酵素、メクロレタミン、ｍＧｌｕＲ２アゴニスト、メマンチン、メペリジン、メルカプトプリン、メソリダジン、メスクシミド、メタンフェタミン、メチルフェニデート、ミノサイクリン、モダフィニル、モルヒネ、Ｎ−アセチルシステイン、ナプロキセン、ネルフィナビル、ニューロトリン、ニトラゼパム、ＮＳＡＩＤ、オランザピン、オピエート、オセルタミビル、オキサプラチン、パリペリドン、パントテン酸キナーゼ２、パーキン、パロキセチン、ペルゴリド、ペリシアジン、ペルフェナジン、フェナセミド、フェネルジン、フェノバルビタール、フェネトライド、フェニトイン、ピモジド、Ｐｉｎｋ１、ピリベジル、ポドフィロトキシン、プラミペキソール、プレガバリン、プリミドン、プロクロルペラジン、プロマジン、プロメタジン、プロトリプチリン、ピリミジンジオン、クエチアピン、ラサギリン、レマセミド、リルゾール、リスペリドン、リトナビル、リツキシマブ、リバスティグミン、ロピニロール、ロチゴチン、ルフィナマイド、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、セレギン、セレギリン、セルチンドール、セルトラリン、バルプロ酸ナトリウム、スチリペントール、タキサン、テマゼパム、テモゾロマイド、テノホビル、テトラベナジン、チアミン、チオリダジン、チオチキセン、チアガビン、トルカポン、トピラマート、トポテカン、トラマドール、トラニルシプロミン、トラスツズマブ、三環系抗うつ薬、トリフルオペラジン、トリフルプロマジン、トリヘキシフェニジル、トリレプタル、バラシクロビル、バルノクタミド、バルプロミド、バルプロ酸、ベンラファクシン、水疱性口内炎ウイルス、ビガバトリン、ビンカアルカロイド、ザナミビル、ジプラシドン、ゾニサミド、ゾテピン、ズクロペンチキソール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記ＣＮＳの疾患、障害、または病状が、代謝疾患、行動障害、人格障害、認知症、癌、神経変性障害、疼痛、ウイルス感染症、睡眠障害、発作性障害、酸性リパーゼ疾患、ファブリー病、ウェルニッケ・コルサコフ症候群、ＡＤＨＤ、不安障害、境界性人格障害、双極性障害、うつ病、摂食障害、強迫性障害、統合失調症、アルツハイマー病、バース症候群およびトゥレット症候群、カナバン病、ハラーホルデン・スパッツ病、ハンチントン病、レビー小体病、ルー・ゲーリック病、マシャド・ジョセフ病、パーキンソン病、または下肢静止不能症候群である、請求項２９〜３８のうちのいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記疼痛が、神経因性疼痛、中枢性疼痛症候群、体性疼痛、内臓痛、または頭痛である、請求項３９に記載の方法。
  41. 対象においてＣＮＳの疾患、障害、または病状を治療するための方法であって、該対象に、（ａ）Ａ１選択的アデノシン受容体アゴニストと、（ｂ）Ａ２Ａ選択的受容体アゴニストと、（ｃ）治療物質とを投与する段階を含む、方法。
  42. 前記Ａ１選択的アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２Ａ選択的受容体アゴニストが、単一単位剤形として製剤化される、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記Ａ１選択的アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２Ａ選択的受容体アゴニストを同時に投与する、請求項４１に記載の方法。
  44. 前記Ａ１選択的アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２Ａ選択的受容体アゴニストを連続的に投与する、請求項４１に記載の方法。
  45. 前記Ａ１選択的アデノシン受容体アゴニストが、ＣＣＰＡ、８−シクロペンチル−１，３−ジプロピルキサンチン、Ｒ−フェニルイソプロピル−アデノシン、Ｎ６−シクロペンチルアデノシン、Ｎ（６）−シクロヘキシルアデノシン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
  46. 前記Ａ２Ａ選択的受容体アゴニストが、レキスキャン、ＣＧＳ ２１６８０、ＡＴＬ−１４６ｅ、ＹＴ−１４６（２−（１−オクチニル）アデノシン）、ＤＰＭＡ（Ｎ６−（２−（３，５−ジメトキシフェニル）−２−（２−メチルフェニル）エチル）アデノシン）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
  47. 前記対象に、Ａ１アデノシン受容体アゴニストおよびＡ２Ａアデノシン受容体アゴニストと、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、またはビヒクルとを含む組成物を投与する段階を含む、請求項４１に記載の方法。
  48. 前記治療物質が高分子治療物質である、請求項４１に記載の方法。
  49. 前記高分子治療物質がモノクローナル抗体である、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記モノクローナル抗体が、６Ｅ１０、ＰＦ−０４３６０３６５、１３１Ｉ−ｃｈＴＮＴ−１／Ｂ ＭＡｂ、１３１Ｉ−Ｌ１９ＳＩＰ、１７７Ｌｕ−Ｊ５９１、ＡＢＴ−８７４、ＡＩＮ４５７、アレムツズマブ、抗ＰＤＧＦＲαモノクローナル抗体ＩＭＣ−３Ｇ３、アスタチンＡｔ２１１モノクローナル抗体８１Ｃ６、バピネオズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、シクスツムマブ、ダクリズマブ、Ｈｕ ＭｉＫ−β−１、ＨｕＭａｘ−ＥＧＦｒ、ヨウ素Ｉ−１３１モノクローナル抗体３Ｆ８、ヨウ素Ｉ−１３１モノクローナル抗体８１Ｃ６、ヨウ素Ｉ−１３１モノクローナル抗体８Ｈ９、ヨウ素Ｉ−１３１モノクローナル抗体ＴＮＴ−１／Ｂ、ＬＭＢ−７ 免疫毒素、ＭＡｂ−４２５、ＭＧＡＷＮ１、Ｍｅｌ−１４ Ｆ（ａｂ'）２、Ｍ−Ｔ４１２、ナタリズマブ、ノイラジアブ、ニモツズマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ＳＤＺ ＭＳＬ−１０９、ソラネズマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、ザルツムマブ、タネズマブ、アフリベルセプト、ＭＥＤＩ−５７８、ＲＥＧＮ４７５、ムロモナブ−ＣＤ３、アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、アダリムマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、トシツモマブ−Ｉ１３１、エファリズマブ、アブシキシマブ、セルトリズマブペゴル、エクリズマブ、ＡＭＧ−１６２、ザノリムマブ、ＭＤＸ−０１０、抗０ＭＲＳＡ ｍＡｂ、パキセリズマブ、メポリズマブ、エプラツズマブ、抗ＲＳＶ ｍＡｂ、アフェリモマブ、カツマキソマブ、ＷＸ−Ｇ２５０、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記治療物質が低分子治療物質である、請求項４１に記載の方法。
  52. 前記低分子治療物質が、アセトアミノフェン、アセチルサリチル酸、アシルトランスフェラーゼ、アルプラゾラム、アマンタジン、アミスルプリド、アミトリプチリン、アンフェタミン−デキストロアンフェタミン、アムサクリン、抗精神病薬、抗ウイルス薬、アポモルヒネ、アリモクロモル、アリピプラゾール、アセナピン、アスパルトアシラーゼ酵素、アトモキセチン、非定型抗精神病薬、アザチオプリン、バクロフェン、ベクラミド、ベンセラジド、ベンセラジド−レボドパ、ベンゾジアゼピン、ベンズトロピン、ベバシズマブ、ブレオマイシン、ブリバラセタム、ブロモクリプチン、ブプレノルフィン、ブプロピオン、カベルゴリン、カルバマゼピン、カルバトロール、カルビドパ、カルビドパ−レボドパ、カルボプラチン、クロラムブシル、クロルプロマジン、クロルプロチキセン、シスプラチン、シタロプラム、クロバザム、クロミプラミン、クロナゼパム、クロザピン、コデイン、ＣＯＸ−２阻害剤、シクロホスファミド、ダクチノマイシン、デクスメチルフェニデート、デキストロアンフェタミン、ジアモルヒネ、ダイアスタット、ジアゼパム、ジクロフェナク、ドネペジル、ドキソルビシン、ドロペリドール、エンタカポン、エピルビシン、エスシタロプラム、エトスクシミド、エトポシド、フェルバメート、フルオキセチン、フルペンチキソール、フルフェナジン、ホスフェニトイン、ガバペンチン、ガランタミン、γヒドロキシブチラート、ゲフィチニブ、ハロペリドール、ヒダントイン、ヒドロコドン、ヒドロキシジン、イブプロフェン、イホスファミド、ＩＧＦ−１、イロペリドン、イマチニブ、イミプラミン、インターフェロン、イリノテカン、ＫＮＳ−７６０７０４、ラコサミド、ラモトリジン、レベチラセタム、レボドパ、レボメプロマジン、リスデキサンフェタミン、リスリド、炭酸リチウム、脂肪分解酵素、メクロレタミン、ｍＧｌｕＲ２アゴニスト、メマンチン、メペリジン、メルカプトプリン、メソリダジン、メスクシミド、メタンフェタミン、メチルフェニデート、ミノサイクリン、モダフィニル、モルヒネ、Ｎ−アセチルシステイン、ナプロキセン、ネルフィナビル、ニューロトリン、ニトラゼパム、ＮＳＡＩＤ、オランザピン、オピエート、オセルタミビル、オキサプラチン、パリペリドン、パントテン酸キナーゼ２、パーキン、パロキセチン、ペルゴリド、ペリシアジン、ペルフェナジン、フェナセミド、フェネルジン、フェノバルビタール、フェネトライド、フェニトイン、ピモジド、Ｐｉｎｋ１、ピリベジル、ポドフィロトキシン、プラミペキソール、プレガバリン、プリミドン、プロクロルペラジン、プロマジン、プロメタジン、プロトリプチリン、ピリミジンジオン、クエチアピン、ラサギリン、レマセミド、リルゾール、リスペリドン、リトナビル、リツキシマブ、リバスティグミン、ロピニロール、ロチゴチン、ルフィナマイド、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、セレギン、セレギリン、セルチンドール、セルトラリン、バルプロ酸ナトリウム、スチリペントール、タキサン、テマゼパム、テモゾロマイド、テノホビル、テトラベナジン、チアミン、チオリダジン、チオチキセン、チアガビン、トルカポン、トピラマート、トポテカン、トラマドール、トラニルシプロミン、トラスツズマブ、三環系抗うつ薬、トリフルオペラジン、トリフルプロマジン、トリヘキシフェニジル、トリレプタル、バラシクロビル、バルノクタミド、バルプロミド、バルプロ酸、ベンラファクシン、水疱性口内炎ウイルス、ビガバトリン、ビンカアルカロイド、ザナミビル、ジプラシドン、ゾニサミド、ゾテピン、ズクロペンチキソール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記ＣＮＳの疾患、障害、または病状が、代謝疾患、行動障害、人格障害、認知症、癌、神経変性障害、疼痛、ウイルス感染症、睡眠障害、発作性障害、酸性リパーゼ疾患、ファブリー病、ウェルニッケ・コルサコフ症候群、ＡＤＨＤ、不安障害、境界性人格障害、双極性障害、うつ病、摂食障害、強迫性障害、統合失調症、アルツハイマー病、バース症候群およびトゥレット症候群、カナバン病、ハラーホルデン・スパッツ病、ハンチントン病、レビー小体病、ルー・ゲーリック病、マシャド・ジョセフ病、パーキンソン病、または下肢静止不能症候群である、請求項４１〜５２のうちのいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記疼痛が、神経因性疼痛、中枢性疼痛症候群、体性疼痛、内臓痛、または頭痛である、請求項５３に記載の方法。
  55. 対象の血液脳関門の透過性を一時的に増加させる方法であって、
    血液脳関門の透過性の一時的増加を必要とする対象を選択する段階、
    Ａ１アデノシン受容体またはＡ２Ａアデノシン受容体のいずれかを活性化させる作用物質を供給する段階、および
    選択された該対象に、血液脳関門の透過性を一時的に増加させるのに効果的な条件下で、該Ａ１アデノシン受容体活性化物質または該Ａ２Ａアデノシン受容体活性化物質のいずれかを投与する段階
    を含む、方法。
  56. 前記Ａ１活性化物質または前記Ａ２Ａ活性化物質が、Ａ１アデノシン受容体アゴニストまたはＡ２Ａアデノシン受容体アゴニストである、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記Ａ１アゴニストまたは前記Ａ２Ａアゴニストが、Ａ１選択的アデノシン受容体アゴニストまたはＡ２Ａ選択的アデノシン受容体アゴニストである、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記対象に治療物質を投与する段階をさらに含む、請求項５５に記載の方法。
  59. 前記治療物質がＣＮＳの疾患、障害、または病状を治療するのに好適である、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記ＣＮＳの疾患、障害、または病状が、代謝疾患、行動障害、人格障害、認知症、癌、神経変性障害、疼痛、ウイルス感染症、睡眠障害、発作性障害、酸性リパーゼ疾患、ファブリー病、ウェルニッケ・コルサコフ症候群、ＡＤＨＤ、不安障害、境界性人格障害、双極性障害、うつ病、摂食障害、強迫性障害、統合失調症、アルツハイマー病、バース症候群およびトゥレット症候群、カナバン病、ハラーホルデン・スパッツ病、ハンチントン病、レビー小体病、ルー・ゲーリック病、マシャド・ジョセフ病、パーキンソン病、または下肢静止不能症候群である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記治療物質が、アセトアミノフェン、アセチルサリチル酸、アシルトランスフェラーゼ、アルプラゾラム、アマンタジン、アミスルプリド、アミトリプチリン、アンフェタミン−デキストロアンフェタミン、アムサクリン、抗精神病薬、抗ウイルス薬、アポモルヒネ、アリモクロモル、アリピプラゾール、アセナピン、アスパルトアシラーゼ酵素、アトモキセチン、非定型抗精神病薬、アザチオプリン、バクロフェン、ベクラミド、ベンセラジド、ベンセラジド−レボドパ、ベンゾジアゼピン、ベンズトロピン、ベバシズマブ、ブレオマイシン、ブリバラセタム、ブロモクリプチン、ブプレノルフィン、ブプロピオン、カベルゴリン、カルバマゼピン、カルバトロール、カルビドパ、カルビドパ−レボドパ、カルボプラチン、クロラムブシル、クロルプロマジン、クロルプロチキセン、シスプラチン、シタロプラム、クロバザム、クロミプラミン、クロナゼパム、クロザピン、コデイン、ＣＯＸ−２阻害剤、シクロホスファミド、ダクチノマイシン、デクスメチルフェニデート、デキストロアンフェタミン、ジアモルヒネ、ダイアスタット、ジアゼパム、ジクロフェナク、ドネペジル、ドキソルビシン、ドロペリドール、エンタカポン、エピルビシン、エスシタロプラム、エトスクシミド、エトポシド、フェルバメート、フルオキセチン、フルペンチキソール、フルフェナジン、ホスフェニトイン、ガバペンチン、ガランタミン、γヒドロキシブチラート、ゲフィチニブ、ハロペリドール、ヒダントイン、ヒドロコドン、ヒドロキシジン、イブプロフェン、イホスファミド、ＩＧＦ−１、イロペリドン、イマチニブ、イミプラミン、インターフェロン、イリノテカン、ＫＮＳ−７６０７０４、ラコサミド、ラモトリジン、レベチラセタム、レボドパ、レボメプロマジン、リスデキサンフェタミン、リスリド、炭酸リチウム、脂肪分解酵素、メクロレタミン、ｍＧｌｕＲ２アゴニスト、メマンチン、メペリジン、メルカプトプリン、メソリダジン、メスクシミド、メタンフェタミン、メチルフェニデート、ミノサイクリン、モダフィニル、モルヒネ、Ｎ−アセチルシステイン、ナプロキセン、ネルフィナビル、ニューロトリン、ニトラゼパム、ＮＳＡＩＤ、オランザピン、オピエート、オセルタミビル、オキサプラチン、パリペリドン、パントテン酸キナーゼ２、パーキン、パロキセチン、ペルゴリド、ペリシアジン、ペルフェナジン、フェナセミド、フェネルジン、フェノバルビタール、フェネトライド、フェニトイン、ピモジド、Ｐｉｎｋ１、ピリベジル、ポドフィロトキシン、プラミペキソール、プレガバリン、プリミドン、プロクロルペラジン、プロマジン、プロメタジン、プロトリプチリン、ピリミジンジオン、クエチアピン、ラサギリン、レマセミド、リルゾール、リスペリドン、リトナビル、リツキシマブ、リバスティグミン、ロピニロール、ロチゴチン、ルフィナマイド、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）、セレギン、セレギリン、セルチンドール、セルトラリン、バルプロ酸ナトリウム、スチリペントール、タキサン、テマゼパム、テモゾロマイド、テノホビル、テトラベナジン、チアミン、チオリダジン、チオチキセン、チアガビン、トルカポン、トピラマート、トポテカン、トラマドール、トラニルシプロミン、トラスツズマブ、三環系抗うつ薬、トリフルオペラジン、トリフルプロマジン、トリヘキシフェニジル、トリレプタル、バラシクロビル、バルノクタミド、バルプロミド、バルプロ酸、ベンラファクシン、水疱性口内炎ウイルス、ビガバトリン、ビンカアルカロイド、ザナミビル、ジプラシドン、ゾニサミド、ゾテピン、ズクロペンチキソール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
  62. 前記治療物質が高分子治療薬である、請求項５８に記載の方法。
  63. 前記治療物質がモノクローナル抗体である、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記モノクローナル抗体が、６Ｅ１０、ＰＦ−０４３６０３６５、１３１Ｉ−ｃｈＴＮＴ−１／Ｂ ＭＡｂ、１３１Ｉ−Ｌ１９ＳＩＰ、１７７Ｌｕ−Ｊ５９１、ＡＢＴ−８７４、ＡＩＮ４５７、アレムツズマブ、抗ＰＤＧＦＲαモノクローナル抗体ＩＭＣ−３Ｇ３、アスタチンＡｔ２１１モノクローナル抗体８１Ｃ６、バピネオズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、シクスツムマブ、ダクリズマブ、Ｈｕ ＭｉＫ−β−１、ＨｕＭａｘ−ＥＧＦｒ、ヨウ素Ｉ−１３１モノクローナル抗体３Ｆ８、ヨウ素Ｉ−１３１モノクローナル抗体８１Ｃ６、ヨウ素Ｉ−１３１モノクローナル抗体８Ｈ９、ヨウ素Ｉ−１３１モノクローナル抗体ＴＮＴ−１／Ｂ、ＬＭＢ−７免疫毒素、ＭＡｂ−４２５、ＭＧＡＷＮ１、Ｍｅｌ−１４ Ｆ（ａｂ'）２、Ｍ−Ｔ４１２、ナタリズマブ、ノイラジアブ、ニモツズマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ＳＤＺ ＭＳＬ−１０９、ソラネズマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、ザルツムマブ、タネズマブ、アフリベルセプト、ＭＥＤＩ−５７８、ＲＥＧＮ４７５、ムロモナブ−ＣＤ３、アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、アダリムマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、トシツモマブ−Ｉ１３１、エファリズマブ、アブシキシマブ、セルトリズマブペゴル、エクリズマブ、ＡＭＧ−１６２、ザノリムマブ、ＭＤＸ−０１０、抗０ＭＲＳＡ ｍＡｂ、パキセリズマブ、メポリズマブ、エプラツズマブ、抗ＲＳＶ ｍＡｂ、アフェリモマブ、カツマキソマブ、ＷＸ−Ｇ２５０、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記治療物質の前に、前記Ａ１アデノシン受容体活性化物質または前記Ａ２Ａアデノシン受容体活性化物質を投与する、請求項５８に記載の方法。
  66. 前記治療物質を投与する５分前、１０分前、１５分前、３０分前、１時間前、２時間前、３時間前、４時間前、５時間前、６時間前、７時間前、８時間前、９時間前、１０時間前、１１時間前、１２時間前、１３時間前、１４時間前、１５時間前、１６時間前、１７時間前、または１８時間前までに、前記Ａ１アデノシン受容体活性化物質または前記Ａ２Ａアデノシン受容体活性化物質を投与する、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記Ａ１アデノシン受容体活性化物質または前記Ａ２Ａアデノシン受容体活性化物質と、前記治療物質とを同時に投与する、請求項５８に記載の方法。
  68. 対象において血液脳関門透過性を減少させるための方法であって、該対象に、Ａ２Ａシグナル伝達を遮断または阻害する作用物質を投与する段階を含む、方法。
  69. Ａ２Ａシグナル伝達を遮断または阻害する前記作用物質が、Ａ２Ａ選択的アンタゴニストである、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記Ａ２ＡアンタゴニストがＳＣＨ ５８２６１である、請求項６９に記載の方法。
  71. 血液脳関門内皮細胞のアクチン細胞骨格を再構築する方法であって、該内皮細胞を、Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する作用物質に接触させる段階を含む、方法。
  72. 前記アクチン細胞骨格の再構築が、内皮細胞間の空間を増加させ、かつ血液脳関門透過性を増加させる、請求項７１に記載の方法。
  73. Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する前記作用物質が、Ａ１受容体およびＡ２Ａ受容体の両者のアゴニストである、請求項７１に記載の方法。
  74. Ａ１アデノシン受容体およびＡ２Ａアデノシン受容体の両者を活性化する前記作用物質が、広域スペクトルアデノシン受容体アゴニストである、請求項７３に記載の方法。
  75. Ａ１受容体およびＡ２Ａ受容体の両者の前記アゴニストがＡＭＰ５７９である、請求項７３に記載の方法。
  76. Ａ１受容体およびＡ２Ａ受容体の両者の前記アゴニストがＮＥＣＡである、請求項７４に記載の方法。
  77. Ａ１受容体およびＡ２Ａ受容体の両者の前記活性化が、血液脳関門透過性に関して相乗的である、請求項７３に記載の方法。
  78. Ａ１受容体およびＡ２Ａ受容体の両者の前記活性化が、血液脳関門透過性に関して相加的である、請求項７３に記載の方法。
JP2013529362A 2010-09-16 2011-09-16 血液脳関門の透過性を調節するためのアデノシン受容体シグナル伝達の使用法 Pending JP2013540748A (ja)

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