CN1791669A - 用于预测血脑屏障通透性的方法和组合物 - Google Patents
用于预测血脑屏障通透性的方法和组合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1791669A CN1791669A CNA028126556A CN02812655A CN1791669A CN 1791669 A CN1791669 A CN 1791669A CN A028126556 A CNA028126556 A CN A028126556A CN 02812655 A CN02812655 A CN 02812655A CN 1791669 A CN1791669 A CN 1791669A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- brain
- mixture
- extract
- compound
- dodecane
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明提供在体外测定化合物或者化合物的混合物通透血脑屏障能力的方法和适用于该方法的膜片组合物。
Description
本发明涉及预测化合物通过血脑屏障能力的方法和用于该方法的膜片组合物。
发明背景
作为有效的治疗剂而要在中枢神经系统起作用的药物必须通透血脑屏障(BBB)。反之，避免不需要的中枢神经系统(CNS)效应，在外周发挥作用的药物则应当限制其通透BBB的能力。但不论哪种情况，了解候选药物的BBB通透性是必要的。然而，实验测定血-脑分配是艰难、耗时、昂贵的而且不适宜筛选大批量(collections)的化合物。广泛适用的、在开发候选药物早期预测BBB通透性的方法将对药物研究与开发将产生重要的影响。迫切需要在发现/开发过程早期阶段产生可以信赖地预测大量化合物BBB通透性相关数据的方法。
因此，本发明一个目的是提供实用、有效和可预测的体外测定试验化合物(如潜在的药物试剂)BBB通透能力的方法。
本发明另一目的是提供可用于该体外测定试验化合物BBB通透能力方法的膜片组合物。
本发明的特色是，BBB通透性测定方法和组合物具有高预测价值和高处理效率。
本发明另一特色是，所述方法和组合物适合于标准实验室机器人平台。
通过在下文的详细说明，本发明的这些及其它目的与特色将变得更加明显。
发明概述
本发明提供测定化合物或化合物的混合物透过血脑屏障能力的方法，方法包括测定所述化合物或化合物的混合物通过多孔滤膜被动弥散的速率，所述多孔滤膜浸渍了(impregnated with)脑极性类脂提取物和十二烷的混合物。
本发明进一步提供包括浸渍了脑极性类脂提出物和十二烷的混合物的多孔质固体托(porous solid support)的膜片组合物。
发明详述
在开发过程的早期能够为大量化合物即500-1,000个/日提供可靠的和可预测的有关血脑屏障(BBB)通透性数据的方法，将使得能够快速和便宜地选择和优化所需的具有脑通透特征的候选药物，并且有助于区分主动、旁细胞和跨细胞(转运)过程。预测BBB通透性的已知方法包括：使用数学工具的计算法，使用动物来源内皮细胞培养物的细胞培养方法，使用固定人工膜柱的高效液相色普法，使用临界胶束浓度方法的表面活性测量法，涉及取自活体动物脑组织样本的用于利用死后人脑微血管和动物体内研究的外部(external)HPLC分析的微量渗析技术。这些已知方法中无一完全适于获得经济、可靠和高度预测性的关于大量试验化合物的BBB通透性数据。
现在，有了这样令人惊奇的发现：化合物或化合物的混合物通透血脑屏障的能力可以以高度预测性、可重复、可靠、高效和经济的方式进行体外测定，测定是通过测定所述化合物或化合物的混合物通过一个浸渍了脑极性类脂提取物和十二烷混合物的多孔过滤膜被动弥散的速率而完成的。本发明方法方便地适于标准实验室机器人平台使用。
说明书和权利要求书中使用的术语“被动扩散”，定义为单个化合物分子或者化合物的混合物由于随机分子运动和浓度梯度而导致的穿越半透膜的过程。改良的被动扩散是既指缺乏外力如增加压力、减少压力、重力等，又指缺乏主动过程如代谢作用、使用运输装置等。
本发明方法是一简易、高通过量的使用极小量样品(通常小于0.1mg)准确地预测所述样品通透血脑屏障能力的物化方法。在实际操作中，化合物或化合物的混合物在缓冲溶液中的已知浓度的溶液与含有0％浓度所述化合物或化合物的混合物的缓冲溶液通过一个浸渍了脑极性类脂和十二烷的混合物的多孔过滤膜相隔开，其隔开方式是每种缓冲溶液与所述浸渍膜的另一侧相接触。测量一段时间后，测定各个缓冲溶液中所述化合物或者化合物的混合物的浓度，并计算扩散速率。
本发明的一个实施方案中，充满在缓冲溶液中已知浓度试验样品的溶液(供体)的96-孔板用96-孔滤板覆盖，在所述滤板中，多孔过滤膜浸渍了脑极性类脂提取物和十二烷的混合物，而且孔中充满含有0％浓度试验样品的缓冲溶液(受体)，这样每种缓冲溶液的表面与所述浸渍滤膜的另一面相接触；测量一段时间之后，移开供体板和受体板，测定每种缓冲溶液中样品浓度并计算通透率。
在本发明另一实施方案中，可以使用高通过量通透性仪器如pIONInc.，Woburn，MA制造的PSR4p仪器。在该实施方案中，使用浸渍了脑极性类脂提取物和十二烷的混合物的多孔过滤膜的人工膜做平行人工膜试验(PAMPA)。
适宜于本发明方法的缓冲溶液包括约pH 6.0-8.0、优选约7.2-7.6、更优选约pH 7.4的任何传统的缓冲溶液。
因此，本发明方法较目前本领域已知的那些方法显示出具有对于血脑屏障通透性的更高可预测性、更高通过量、低成本而且无需牺牲活体动物的优点。
本发明也提供膜片组合物，其包括浸渍了脑极性类脂提取物和十二烷的混合物的多孔质固体托。适用于本发明组合物的脑极性类脂提取物和十二烷的混合物，可以是在十二烷中的约10％重量/体积至30％重量/体积、优选约15％重量/体积至25％重量/体积、更优选约19％重量/体积至21％重量/体积的脑极性类脂提取物。
适用于本发明组合物的多孔质固体托包括任何通常使用的多孔材料，如96-孔滤板中使用的多孔材料，例如聚偏1，1-二氟乙烯或其等同物，优选聚偏1，1-二氟乙烯。
适用于本发明组合物的脑极性类脂提取物可以是合成的或天然的脑极性类脂提取物，它们可以在文献中提到或者商购得到的那些，如猪、羊、牛等动物的脑极性类脂提取物，优选猪的脑极性类脂提取物。
本发明组合物可以通过用脑极性类脂提取物和十二烷的混合物浸渍多孔质固体托而制备，浸渍按照每面积多孔质固体托含至少4μl/38mm2、优选约4μl/38mm2浓度的所述混合物进行。
为了更清楚地理解本发明，给出下列实施例。这些实施例仅仅是说明性的，并不能理解为以任何方式对于本发明保护范围的限定或者置于本发明本质之下。当然，除在本文中披露和描述的之外，通过下列实施例和上述描述，本发明的各种变改对于本领域技术人员而言是显而易见的。这般变改也落入本发明权利要求的保护范围之内。
实施例1
使用已知化合物比较评价本发明方法对于血脑屏障通透性的可预测性
在该评价实验中，已知其血脑屏障通透性的30个文献化合物(P.Crivari等，Journal of Medicinal Chemistry，2000，43，2204-2216)分别溶于二甲亚砜中，配制成浓度为5mg/ml的各个化合物的储备溶液。每100μL体积的储液加入到96-孔板的一个孔中，将该平板置于由pION，Inc.，Woburn，MA.制造的PSR4p通透性分析器中。通过机器人操作将10μl体积的储液加入到含有2.0mL pH 7.4的一个深的96-孔板中。机械地搅拌，得到的混合物即是供体溶液。通过机器人操作把每200μL体积供体溶液加入96-孔板的3个孔中，产生供体溶液。将含有溶于1mL十二烷的20mg由Avanti Polar Lipids，Inc.Alabaster，AL生产的猪极性脑脂质提取物的小瓶放置于PSR4p仪器的储罐中。4μL体积脑脂质溶液置于Millipore Corp.，Bedford，MA生产的96孔微量滴定器过滤孔之每一个孔的滤膜表面，其中滤膜是大约104μm厚的多孔(0.45μm)聚偏1，1-二氟乙烯材料。然后，将微量滴定板手动放置于定轨振荡器上1分钟，以产生具有通透20％重量/体积猪极性脑脂质提取物十二烷溶液的过滤膜的96孔微量滴定板。200μL体积的pH 7.4缓冲剂机器人操作地插入由此制备的微量滴定器96-孔滤板的孔中，制得受体平板，将该受体平板置于供体平板上形成三明治，并在环境温度下放置18小时。
然后，用Tecan Hombrechintikon，Switzerland制造的板状垫圈来制备UV透光的96-孔板(W plate)。从三明治中移去受体平板，通过机器人操作把150μL体积的受体溶液加入到W平板上，记录每一个受体孔在190-500nm的W吸收。然后，用UV平板代替板状垫圈中，再一次洗涤，通过机器人操作把150μL体积的供体溶液加入到UV平板上，记录每一个供体孔在190-500nm的UV吸收。
以通透性的线速度(Pe)测量被动扩散速率。使用pION Inc V1.4版本的PSR4p软件计算各个化合物的Pe。各个微量滴定板使用两个标准样品，异搏定和茶碱。Pe值≥4×10-6cm/sec时，BBB通透性定义为CNS+，Pe值≤2×10-6cm/sec时，BBB通透性定义为CNS-。数据是平均值，结果示于表I。
表I
| 实验化合物 | Pe(10-6cm/s) | CNS | |
| 评价 | 已知2 | ||
| 阿普唑仑 | 5.44 | + | + |
| 咖啡因1. | 1.30 | - | + |
| 氯丙嗪 | 6.36 | + | + |
| 氯巴占 | 16.85 | + | + |
| 可乐定 | 5.31 | + | + |
| 地昔帕明 | 11.89 | + | + |
| 地西泮 | 16.41 | + | + |
| β-雌二醇 | 11.61 | + | + |
| 丙米嗪 | 13.12 | + | + |
| 奥沙西泮 | 10.12 | + | + |
| 黄体酮 | 9.28 | + | + |
| 丙嗪 | 8.84 | + | + |
| 睾酮 | 16.75 | + | + |
| 硫喷妥钠 | 18.13 | + | + |
| 醛固酮 | 1.19 | - | - |
| 阿司咪唑1 | 10.66 | + | - |
| 阿替洛尔 | 0.84 | - | - |
| 氢化可的松 | 1.99 | - | - |
| 多巴胺 | 0.16 | - | - |
| Enoxin | 0.90 | - | - |
| 伊索昔康 | 0.25 | - | - |
| 洛美沙星 | 1.19 | - | - |
| 洛哌丁胺 | 0.00 | - | - |
| 皮质酮1 | 5.13 | + | - |
| 诺氟沙星 | 0.14 | - | - |
| 氧氟沙星 | 0.80 | - | - |
| 吡罗昔康 | 2.53 | - | - |
| 特非那定 | 0.0 | - | - |
| 替诺昔康 | 0.14 | - | - |
| 西咪替丁 | 0.00 | - | - |
1这些化合物涉及主动转运过程，即载体介导的转运(咖啡因)、Pgp外流(皮质酮)和快速的代谢作用(阿司咪唑)。
2Crivori，P.等人Journal of Medicinal Chemistry，2000，43，2204-2216。
由表I数据可以看出，本发明方法对于30个试验化合物(包括主动转运过程)具有90％准确性。对于被动扩散，本发明方法具有100％准确度。
实施例2
使用实验化合物比较评价本发明方法对于血脑屏障通透性的可预测性
使用基本上与实施例1描述的相同过程，但是用得自三个独立的CNS projects的实验化合物代替已知化合物，测定Pe值，并和从体内试验通过标准鼠脑试验方法或生物学终点法测得的血脑屏障通透性进行比较。结果示于表II。
表II
| 实验化合物 | Pe(10-6cm/s) | CNS | |
| 评价 | 体内试验 | ||
| A | 6.52 | + | + |
| B. | 6.07 | + | + |
| C | 18.99 | + | + |
| D | 11.61 | + | + |
| E | 9.68 | + | + |
| F | 10.62 | + | + |
| G | 15.11 | + | + |
| H | 5.20 | + | + |
| I | 13.75 | + | + |
| J | 0.40 | - | - |
| K | 0.13 | - | - |
| L | 0.05 | - | - |
| M | 0.03 | - | - |
| N | 0.08 | - | - |
Claims (12)
1.测定化合物或化合物的混合物通透血脑屏障能力的方法，其包括测定所述化合物或化合物的混合物通过浸渍了脑极性类脂提取物和十二烷的混合物的多孔过滤膜被动扩散的速率。
2.根据权利要求1的方法，其中所述提取物是猪脑极性类脂提取物。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述混合物是在十二烷中约20％重量/体积的脑极性类脂提取物。
4.根据权利要求1至3任一项的方法，其中所述浸渍膜具有约100μm至150μm的厚度。
5.根据权利要求1至4任一项的方法，其中所述滤膜具有约0.45μm的孔径。
6.根据权利要求1至5任一项的方法，其中所述滤膜是聚偏1，1-二氟乙烯滤膜。
7.根据权利要求1至6任一项的方法，其中所述膜每38mm2膜片浸渍约4μl脑极性类脂提取物和十二烷的混合物。
8.膜片组合物，其包括浸渍了脑极性类脂提取物和十二烷的混合物的多孔质固体托。
9.根据权利要求8的组合物，其中所述提取物是猪脑极性类脂提取物。
10.根据权利要求8或9的组合物，其中所述混合物是十二烷中约20％重量/体积的脑极性类脂提取物。
11.根据权利要求8至10任一项的组合物，其中多孔质固体托是聚偏1，1-二氟乙烯滤膜。
12.根据权利要求8至11任一项的组合物，其中每38mm2所述膜浸渍至少4μl在十二烷中20％重量/体积脑极性类脂提取物混合物。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/US2002/019736 WO2003003007A2 (en) | 2001-06-29 | 2002-06-20 | Methods and compositions useful for the prediction of blood-brain barrier permeation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1791669A true CN1791669A (zh) | 2006-06-21 |
Family
ID=36788771
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA028126556A Pending CN1791669A (zh) | 2002-06-20 | 2002-06-20 | 用于预测血脑屏障通透性的方法和组合物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1791669A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103221535A (zh) * | 2010-09-16 | 2013-07-24 | 康奈尔大学 | 腺苷受体信号转导调节血脑屏障通透性的用途 |
-
2002
- 2002-06-20 CN CNA028126556A patent/CN1791669A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103221535A (zh) * | 2010-09-16 | 2013-07-24 | 康奈尔大学 | 腺苷受体信号转导调节血脑屏障通透性的用途 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Canfield et al. | Effect of reversible ATP depletion on tight-junction integrity in LLC-PK1 cells | |
| Karadzovska et al. | Assessing vehicle effects on skin absorption using artificial membrane assays | |
| EP2879789B1 (de) | System mit einer anschlussplatte für einen mikrofluidischen probenchip, dem mikrofluidischem probenchip und einer kontrolleinheit | |
| EP2192984B1 (de) | Teilaktives mikrofluidisches system für die 3d-zellkultivierung sowie verfahren zu dessen perfusion | |
| US20030068614A1 (en) | Transdermal assay with magnetic clamp | |
| Pulsoni et al. | Comparison between Franz diffusion cell and a novel micro-physiological system for in vitro penetration assay using different skin models | |
| US20050208477A1 (en) | Raised surface assay plate | |
| WO1999031503A1 (de) | Positionierung und elektrophysiologische charakterisierung einzelner zellen und rekonstituierter membransysteme auf mikrostrukturierten trägern | |
| IL153468A (en) | System and method for optimizing tissue barrier transfer of compounds | |
| DE60027279T2 (de) | Screening-verfahren von kandidaten verbindungen für empfindlichkeit gegenüber gallenexkretion | |
| MacKerron et al. | A microfluidic platform for the characterisation of CNS active compounds | |
| Molteni et al. | A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment | |
| CN112041422A (zh) | 具有灌注功能的生物反应器 | |
| EP3639914A1 (en) | Polymeric membranes with human skin like permeability properties and uses thereof | |
| CN1791669A (zh) | 用于预测血脑屏障通透性的方法和组合物 | |
| Lee et al. | Laminar stream of detergents for subcellular neurite damage in a microfluidic device: a simple tool for the study of neuroregeneration | |
| WO2018106132A1 (en) | Microfluidic device for cell culture in gradient of bioactive substance | |
| Ault et al. | SH-SY5Y cells as a model for sigma receptor regulation of potassium-stimulated dopamine release | |
| CA2448746A1 (en) | Methods and compositions useful for the prediction of blood-brain barrier permeation | |
| Walum et al. | Cellular methods for identification of neurotoxic chemicals and estimation of neurotoxicological risk | |
| DE102008056037A1 (de) | Mikrofluidischer Bioreaktor | |
| DE202011108681U1 (de) | Miniaturisierter Bioreaktor | |
| US20030165813A1 (en) | Methods and compositions useful for the prediction of blood-brain barrier permeation | |
| Ghosh | Novel membranes for simulating biological barrier transport | |
| Tsai et al. | Selection considerations for membranes and models for in vitro/ex vivo permeation studies |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |