DE60027279T2

DE60027279T2 - Screening-verfahren von kandidaten verbindungen für empfindlichkeit gegenüber gallenexkretion

Info

Publication number: DE60027279T2
Application number: DE60027279T
Authority: DE
Inventors: L. Edward Chapel Hill LECLUYSE; L. Kim Chapel Hill BROUWER; Xingrong New London LIU
Original assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; University of North Carolina System
Current assignee: University of North Carolina at Chapel Hill; University of North Carolina System
Priority date: 1999-03-17
Filing date: 2000-03-17
Publication date: 2007-03-29
Anticipated expiration: 2020-03-18
Also published as: EP1659403A3; DK1659403T3; ES2263464T3; ATE542135T1; ATE437360T1; WO2000055355A3; BR0009073A; US20040219513A1; AU4014500A; CA2365398C; US20100173333A1; EP1659403A2; US6780580B2; EP2112511B1; JP4451570B2; DE60027279D1; EP2112511A1; AU2008264187A1; AU2008264187B2; AU2005225094B2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screening von Verbindungen, die in erster Linie Kandidaten zur Verwendung als therapeutische Mittel sind, die gegenüber einer biliären Exkretion empfindlich sind. Die Erfindung betrifft insbesondere ein in vitro-Verfahren zum Screening von Kandidatenverbindungen bezüglich einer Empfindlichkeit gegenüber einer biliären bzw. Gallen-Exkretion. Verbindungen können zur Verwendung als therapeutische Mittel zur Verabreichung an Menschen oder andere warmblütige Wirbeltiere ausgewählt sein.
Tabelle der Abkürzungen

AUC

– Fläche unter der Kurve

BSEP

– Gallensalz-Exportpumpe

Cl_B

– biliäre Clearance

Cl_in

– intrinsische Clearance

cMOAT

– canaliculärer multispezifischer organischer Anionentransporter

CFDA

– Carboxyfluoresceindiacetat

DMEM

– Dulbecco's modified Eagle's medium

EDTA

– Ethylendiamintetraessigsäure

HP

– Hewlett Packard

HPLC

– Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

hr

– Stunde

i.v.

– intravenös

i.p.

– intraperitoneal

K_m

– Michaelis-Menten-Konstante für Enzym-Substratreaktion

LC/MS

– Flüssigkeitschromatographie/Massenspektrometrie

mg pr.

– Milligramm Protein

min

– Minute

MDR2

– Multi-Arzneistoffresistenzprotein 2

MRP2

– Multi-Arzneistoffresistenz-assoziiertes Protein 2

Ntcp

– Na+/Taurocholat cotransportierendes Polypeptid

OATP1

– Organisches Ion-Anion transportierendes Polypeptid 1

OATP2

– Organisches Ion-Anion transportierendes Polypeptid 2

P-gp

– P-Glycoprotein

SD

– Standardabweichung

UV

– Ultraviolett

UV/VIS

– Ultraviolett/sichtbar

V_max

– maximale Geschwindigkeit der Enzym-katalysierten Reaktion

Technischer Hintergrund
Der First-Pass-Metabolismus bedeutet die Absorption therapeutischer Mittel, Arzneistoffe oder anderer Verbindungen in die Blutzufuhr der Pfortader, die zur Leber führt. Wenn ein Arzneistoff bzw. Arzneimittel geschluckt wird, absorbiert der Magen und der Dünndarm dieses mit einer anschließenden Strömung ins Blut zur Pfortader, dem Eintritt zur Leber. Die Leber kann dann wiederum den Arzneistoff in hohen Konzentrationen durch die Leberblutzufuhr rasch absorbieren und metabolisieren. Somit können große Mengen des Arzneistoffes nicht im systemischen Blutkreislauf oder der Wirkstelle des Arzneistoffes auftreten. Zusätzlich kann ein rascher Metabolismus über den First-Pass-Metabolismusweg zur Bildung von hohen Plasmakonzentrationen unerwünschter Metaboliten führen.
Somit können in der Leber oftmals therapeutische Zusammensetzungen in unerwünschter Weise aus dem Blutkreislauf des Tieres insofern entfernt werden, als sie von den Hepatocyten (Leberzellen) aufgenommen und über die Gallenkanälchen in die Galle ausgeschieden werden. Die Aufnahme in die Hepatocyten wird durch Transportsysteme vermittelt, die den Hepatocyten endogen sind, einschließlich Ntcp und cMOAT. Solche Transporter bewegen Xenobiotica wie therapeutische Zusammensetzungen ebenso wie endogene Verbindungen durch die sinusoidale Membran der Hepatocyten hindurch. Gallenkanälchen sind Strukturen innerhalb des Lebergewebes, die aus den Leberzellen ausgeschiedene Bestandteile aufnehmen und in der Galle zu einem gemeinsamen Gallenweg zur Entfernung aus dem Tier transportieren. De biliäre Exkretion von Substraten ist somit ein komplexes Verfahren, das die Translokation durch die Sinusoidal-Membran, die Bewegung durch das Cytoplasma und den Transport durch die canaliculäre Membran hindurch einschließt.
Das Aufkommen kombinatorischer Chemietechniken hat die Identifizierung extrem großer Anzahlen von Verbindungen ermöglicht, die ein Potential als therapeutische Mittel aufweisen. Jedoch haben Assays bezüglich der Empfindlichkeit gegenüber einer biliären Exkretion, die solche Kandidatenverbindungen, die ein geringeres Potential für eine Aufnahme durch Hepatocyten und eine Exkretion durch Gallenkanälchen rasch identifizieren können, den Syntheseweg und das Screening von pharmakologischen Aktivitäten hinter sich gelassen. Zahlreiche In vivo- (beispielsweise Gallenwegskanülierte Tiere) und In vitro-Zubereitungen (beispielsweise isolierte perforierte Leber, isolierte Hepatocyten bzw. Leberzellen, Leberzellen-Couplets, Leberplasmamembranvesikeln und exprimierte Transportproteine) wurden dazu verwendet, biliäre Exkretionsprozesse zu untersuchen. Siehe beispielsweise Oude Elferink et al., Biochim. Biophys. Acta 1241: 215–268, 1995.
Zusätzlich wurden Kurzzeit-(3–8 Stunden)-kultivierte Leberzell-Couplets dazu verwendet, die biliäre Exkretion von fluoreszierenden Verbindungen unter Verwendung einer Fluoreszenzmikroskopie, wie von Graf und Boyer, J. Hepatol. 10: 387–394, 1990 beschrieben, zu überprüfen. Jedoch ist die Anwendung kultivierter Hepatocyten-Couplets zur Untersuchung der biliären Exkretion von Xenobiotica dahingehend beschränkt, als das Substrat ein fluoreszierendes Chromophor enthalten muss.
Langzeit-(typischerweise mehr als 24 Stunden)-kultivierte Hepatocyten stellen die Polarität mit Kanälchen-artigen Strukturen wieder her. Siehe beispielsweise Barth und Schwarz, Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 4985–4987, 1982; Maurice et al., J. Cell Sci. 90: 79–92, 1988; Talamini et al., Hepatology 25: 167–172, 1997. Obwohl primäre Hepatocyten, die unter konventionellen Kulturbedingungen gehalten wurden, zur Untersuchung des Arzneistoffmetabolismus und der Hepatotoxizität verwendet wurden, waren Langzeitkulturen von Hepatocyten nicht als Modell zur Untersuchung des hepatobiliären Transports geeignet. Insbesondere, wie von Groothuis und Meijer, J. Hepatology 24 (Suppl. 1): 3–28, 1996 und LeCluyse et al., Adv. Drug Del. Ref. 22: 133–186, 1996 beschrieben, wurde ein rascher Verlust einer Leber-spezifischen Funktion einschließlich der hepatischen Transporteigenschaften und ein Versagen, normale Gallenkanälchen-Netzwerke zu etablieren und eine normale Hepatocytenmorphologie aufrechtzuerhalten, in solchen Kulturen beobachtet.
Die existierenden Verfahren haben sich als nicht breit zur Untersuchung der humanen biliären Exkretion anwendbar erwiesen. Zusätzlich können die existierenden Ansätze nicht dazu verwendet werden, effizient den biliären Exkretionsprozess für eine größere Anzahl von Arzneistoffkandidaten zu überprüfen. Es existiert deswegen ein lange bestehender Bedarf nach einem Assay zur Überprüfung der Empfindlichkeit von Kandidatenverbindungen für eine hepatische Aufnahme und eine biliäre Exkretion. Ein solcher Assay würde die Elimination solcher Verbindungen mit einer unerwünscht hohen Empfindlichkeit bezüglich einer biliären Exkretion vor einer weiteren Auswertung als therapeutische Mittel bereits früh im Evaluationsverfahren ermöglichen. Es existiert dementsprechend ein lange bestehender Bedarf für eine rasche Identifizierung geeigneter Kandidatenverbindungen (d.h. Verbindungen, die für eine biliäre Exkretion nicht empfindlich sind), um diese weiterhin als therapeutische Mittel zu testen.
Zusammenfassung der Erfindung
Hierin ist ein Verfahren zum Screening einer Kandidatenverbindung bezüglich einer Empfindlichkeit gegenüber einer biliären Exkretion offenbart. Das Verfahren umfasst die Schritte der Bereitstellung einer Kultur von Hepatocyten, wobei die Kultur zumindest ein Gallenkanälchen umfasst, das einen canaliculären Raum aufweist; das Exponieren einer Kandidatenverbindung gegenüber der Kultur; und die Bestimmung der Menge der Kandidatenverbindungen im canaliculären Raum des zumindest einen Gallenkanälchens, wobei die Menge der Kandidatenverbindung im canaliculären Raum des zumindest einen Gallenkanälchens die Empfindlichkeit der Kandidatenverbindung gegenüber einer biliären Exkretion anzeigt, gemäß des Verfahrens von Anspruch 1. Die Kultur der Hepatocyten umfasst vorzugsweise eine Langzeitkultur in einer Sandwich-Konfiguration.
Es ist demgemäß eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein rasches und preiswertes Verfahren zum Screening von Kandidatenverbindungen bezüglich einer Empfindlichkeit gegenüber einer biliären Exkretion bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein In vitro-Verfahren zum Screening von Kandidatenverbindungen bezüglich einer Empfindlichkeit gegenüber einer biliären Exkretion bereitzustellen.
Es ist eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Screening von Kandidatenverbindungen bezüglich einer Empfindlichkeit gegenüber einer biliären Exkretion bereitzustellen, das das Screening vieler Kandidatenverbindungen in einem einzigen Arbeitsschritt erleichtert. Es ist eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein High-Throughput-Verfahren bzw. Verfahren mit hohem Durchsatz des Screenings von Kandidatenverbindungen bereitzustellen, bezüglich einer Empfindlichkeit gegenüber einer biliären Exkretion.
Einige der Aufgaben der Erfindung wurden oben angesprochen, andere Aufgaben werden sich aus der Beschreibung ergeben, wenn sie in Verbindung mit den begleitenden Laborbeispielen und Zeichnungen zur Hand genommen werden, wie sie hierin nachstehend am besten beschrieben sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A ist eine graphische Darstellung, die die kumulative Aufnahme von [³H]Inulin, (1 μM) in Standardpuffer (geschlossene Symbole) und Ca⁺⁺-freiem Puffer (offene Symbole) in Hepatocyten-Monolayers zeigt, die für 3 Stunden kultiviert wurden;
1B ist eine graphische Darstellung, die die kumulative Aufnahme von [³H] (1 μM) in Standardpuffer (geschlossene Symbole) und Ca⁺⁺-freiem Puffer (offene Symbole) in Hepatocyten zeigt, die in einer Sandwich-Konfiguration für 96 Stunden kultiviert wurden;
2A ist eine graphische Darstellung, die die kumulative Aufnahme von [¹⁴C]Salicylat (1 μM) in Standardpuffer (geschlossene Symbole) und Ca⁺⁺-freiem Puffer (offene Symbole) in Hepatocyten-Monolayers zeigt, die für 3 Stunden kultiviert wurden;
2B ist eine graphische Darstellung, die die kumulative Aufnahme von [¹⁴C]Salicylat (1 μM) in Standardpuffer (geschlossene Symbole) und Ca⁺⁺-freiem Puffer (offene Symbole) in Hepatocyten zeigt, die in einer Sandwich-Konfiguration für 96 Stunden kultiviert wurden;
3A ist eine graphische Darstellung, die die kumulative Aufnahme von [³H]Methotrexat (1 μM) in Standardpuffer (geschlossene Symbole) und Ca⁺⁺-freiem Puffer (offene Symbole) in Hepatocyten-Monolayers darstellt, die für 3 Stunden kultiviert wurden;
3B ist eine graphische Darstellung, die die kumulative Aufnahme von [³H]Methotrexat (1 μM) in Standardpuffer (geschlossene Symbole) und Ca⁺⁺-freiem Puffer (offene Symbole) in Hepatocyten zeigt, die in einer Sandwich-Konfiguration für 96 Stunden kultiviert wurden;
4A ist eine graphische Darstellung, die die kumulative Aufnahme von [³H](D-pen^2,5)Enkephalin (15 μM) in Standardpuffer (geschlossene Symbole) und Ca⁺⁺-freiem Puffer (offene Symbole) in Hepatocyten-Monolayers darstellt, die für 3 Stunden kultiviert wurden;
4B ist eine graphische Darstellung, die die kumulative Aufnahme von [³H](D-pen^2,5)Enkephalin (15 μM) in Standardpuffer (geschlossene Symbole) und Ca⁺⁺-freiem Puffer (offene Symbole) in Hepatocyten zeigt, die in einer Sandwich-Konfiguration für 96 Stunden kultiviert wurden;
5A ist eine graphische Darstellung, die die kumulative Aufnahme von [³H]Taurocholat (1 μM) in Standardpuffer (geschlossene Symbole) und Ca⁺⁺-freiem Puffer (offene Symbole) in Hepatocyten-Monolayers darstellt, die für 3 Stunden kultiviert wurden;
5B ist eine graphische Darstellung, die die kumulative Aufnahme von [³H]Taurocholat (1 μM) in Standardpuffer (geschlossene Symbole) und Ca⁺⁺-freiem Puffer (offene Symbole) in Hepatocyten zeigt, die in einer Sandwich-Konfiguration für 96 Stunden kultiviert worden sind;
6A ist eine graphische Darstellung, die das Verhältnis zwischen dem Prozentsatz der Dosis zeigt, die in Rattengalle in vivo ausgeschieden wurde, und den biliären Exkretionsindex in 96-stündigen Sandwich-kultivierten Hepatocyten für die nachfolgenden Modellsubstrate: Inulin (☐), Salicylat (♦), Methotrexat (O), [D-pen^2,5]Enkephalin (
) und Taurocholat (
). Der biliäre Exkretionsindex wurde aus den 10-minütigen kumulativen Aufnahmedaten (1A bis 5B) auf Grundlage von Gleichung 3 berechnet. Die gestrichelte Linie ist die Anpassung der linearen Regressionsgleichung an die Daten;
6B ist eine graphische Darstellung, die das Verhältnis zwischen dem Prozentsatz der in Rattengalle in vivo ausgeschiedenen Dosis und der in vivo intrinsischen biliären Clearance und der in vitro biliären Clearance in 96-stündigen Sandwich-kultivierten Hepatocyten für die folgenden Modellsubstrate darstellt: Inulin (☐), Salicylat (♦), Methotrexat (O), [D-pen^2,5]Enkephalin (
) und Taurocholat (
). Die in vivo intrinsische biliäre Clearance wurde aus Gleichung 2 auf Grundlage von biliären In vivo-Clearance-Werten aus der Literatur berechnet. Die biliäre In vitro-Clearance wurde aus Gleichung 4 berechnet. Die gestrichelte Linie ist die Anpassung einer linearen Regressionsgleichung an die Daten;
7A ist eine graphische Darstellung, die die kumulative Aufnahme von [³H]264W94 (3 μM) in Standardpuffer (geschlossene Symbole) und Ca⁺⁺-freiem Puffer (offene Symbole) in Hepatocyten-Monolayers zeigt, die für 3 Stunden kultiviert worden sind;
7B ist eine graphische Darstellung, die die kumulative Aufnahme von [³H]264W94 (3 μM) in Standardpuffer (geschlossene Symbole) und Ca⁺⁺-freiem Puffer (offene Symbole) in Hepatocyten zeigt, die in einer Sandwich-Konfiguration für 96 Stunden kultiviert wurden;
8A ist eine graphische Darstellung, die die kumulative Aufnahme von [³H]2169W94 (3 μM) in Standardpuffer (geschlossene Symbole) und Ca⁺⁺-freiem Puffer (offene Symbole) in Hepatocyten-Monolayers, die für 3 Stunden kultiviert wurden, darstellt und
8B ist eine graphische Darstellung, die die kumulative Aufnahme von [³H]2169W94 (3 μM) in Standardpuffer (geschlossene Symbole) und Ca⁺⁺-freiem Puffer (offene Symbole) in Hepatocyten zeigt, die in einer Sandwich-Konfiguration für 96 Stunden kultiviert worden sind;
9A präsentiert die chemischen Strukturen der Verbindung 264W94, wobei das Sternchen die Position des gleichförmig eingebauten ¹⁴C anzeigt; und
9B präsentiert die chemischen Strukturen der Verbindung 2169W94, wobei das Sternchen die Position des gleichförmig eingebauten ¹⁴C anzeigt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Screening einer Kandidatenverbindung oder Substrates bezüglich der Empfindlichkeit gegenüber einer biliären Exkretion bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Schritte der Bereitstellung einer Kultur von Hepatocyten, wobei die Kultur zumindest ein Gallenkanälchen mit einem canaliculären Raum; das Exponieren einer Kandidatenverbindung gegenüber der Kultur; und die Bestimmung einer Menge der Kandidatenverbindung im canaliculären Raum des zumindest einen Gallenkanälchens umfasst, wobei die Menge der Kandidatenverbindung im canaliculären Raum des zumindest einen Gallenkanälchens die Empfindlichkeit der Kandidatenverbindung gegenüber einer biliären Exkretion anzeigt, gemäß dem Verfahren von Anspruch 1.
Wie der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet zu würdigen weiß, schließt die in vivo biliäre Exkretion von Substraten die Translokation durch die sinusoidale Membran, eine Bewegung durch das Cytoplasma und den Transport durch die canaliculäre Membran hindurch ein. Somit werden in einer bevorzugten Hepatocyten-Kultur der vorliegenden Erfindung funktionelle Eigenschaften, die von Hepatocyten in vivo gezeigt werden, etabliert. Beispielsweise wird die Etablierung von hepatischen Transportsystemen, wie beispielsweise sinusoidalen oder canaliculären Transportsystemen oder sowohl sinusoidalen als auch canaliculären Transportsystemen besonders gemäß der vorliegenden Erfindung ins Auge gefasst. Beispielhafte Transportsysteme schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Ntcp, cMOAT, OATP1, OATP2, MRP2, P-gp, BSET und MDR2.
Zusätzlich sind die Etablierung von zumindest einem Gallenkanälchen und der Etablierung normaler Hepatocyten-Morphologie in den Hepatocyten-Kulturen ebenfalls gemäß der vorliegenden Erfindung ins Auge gefasst worden. Vorzugsweise umfasst die Kultur eine Vielzahl von Gallenkanälchen. Besonders bevorzugt umfasst die Vielzahl von Gallenkanälchen ein canaliculäres Netzwerk. Die Menge der Kandidatenverbindung, wie unten ausführlich diskutiert werden wird, im canaliculären Raum des zumindest einen Gallenkanälchens zeigt die Empfindlichkeit der Kandidatenverbindung gegenüber der biliären Exkretion an.
Während die folgenden Begriffe vom Fachmann auf dem Gebiet gut zu verstehen sein müssten, werden die folgenden Definitionen zur Erleichterung der Erklärung der Erfindung dargelegt.
Der Begriff „Kandidatenverbindung" oder „Kandidatensubstrat" soll jede Verbindung bedeuten, bei der die Charakterisierung der Empfindlichkeit der Verbindung gegenüber einer biliären Exkretion erwünscht ist. Beispielhafte Kandidatenverbindungen oder Substrate schließen Xenobiotica, wie beispielsweise Arzneistoffe oder andere therapeutische Mittel, Karzinogene und Umweltgifte ebenso wie Endobiotica, beispielsweise Steroide, Fettsäuren und Prostaglandine ein.
Die Kandidatenarzneistoffe und andere therapeutische Mittel, die gemäß des Verfahrens der vorliegenden Erfindung gescreent werden, sollen in der Behandlung von warmblütigen Wirbeltieren in Erwägung gezogen werden. Deswegen betrifft die Erfindung Säugetiere und Vögel.
Ins Auge gefasst wird die Behandlung von Säugetieren, wie beispielsweise Menschen, ebenso wie von solchen Säugetieren von Bedeutung, die gefährdet sind (beispielsweise Sibirische Tiger), die eine ökonomische Bedeutung aufweisen (Tiere, die zur Ernährung durch Menschen auf Farmen gezüchtet werden) und/oder die eine soziale Bedeutung aufweisen (Tiere, die als Haustiere oder in Zoos gehalten werden), beispielsweise andere Carnivoren bzw. Fleischfresser als Menschen (beispielsweise Katzen und Hunde), Schweine (Schweine, Borstenvieh und Wildschweine), Wiederkäuer (beispielsweise Vieh, Ochsen, Schafe, Giraffen, Hirsche, Ziegen, Bisons und Kamele) und Pferde. Ebenfalls ins Auge gefasst wird die Behandlung von Vögeln, einschließlich der Behandlung von solchen Arten von Vögeln, die gefährdet sind, in Zoos gehalten werden, ebenso wie Geflügel, insbesondere domestiziertes Geflügel, beispielsweise Pute, beispielsweise Truthahn, Hühnchen, Enten, Gänse, Perlhühner und dergleichen, weil sie ebenfalls für den Menschen eine ökonomische Bedeutung aufweisen. Somit wird die Behandlung von Vieh ins Auge gefasst, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, domestizierte Schweine (Schweine und Borstenvieh), Wiederkäuer, Pferde, Pute und dergleichen.
Der Begriff „biliäre Exkretion" soll einen biologischen Prozess bedeuten, wobei die Substanzen aus dem Kreislaufsystem eines Tiers durch Aufnahme durch Hepatocyten (Leberzellen) entfernt und in die Galle über die Gallenkanälchen ausgeschieden werden. Die Aufnahme in diese Hepatocyten wird durch Transportsysteme vermittelt, die für Hepatocyten endogen sind, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Ntcp und OATP1. Gallenkanälchen sind Strukturen innerhalb von Lebergewebe, die ausgeschiedene Bestandteile aus den Hepatocyten aufnehmen und die Galle an einen Gallenweg zur Entfernung aus dem Tier transportieren.
Der Satz „eine Menge einer Kandidatenverbindung" und/oder der Satz „die Bestimmung einer Menge einer Kandidatenverbindung in dem zumindest einen Gallenkanälchen" wie hierin und in den Ansprüchen verwendet, soll irgendeine Menge einer Kandidatenverbindung bedeuten, die von Hepatocyten aufgenommen und in das zumindest eine Gallenkanälchen gemäß des Assays der vorliegenden Erfindung ausgeschieden wird. Beispielsweise kann „eine Menge" sich auf im Wesentlichen keine Kandidatenverbindung beziehen, die in dem zumindest einen Gallenkanälchen nach Exposition einer Kandidatenverbindung gegenüber einer Kultur gemäß der vorliegenden Erfindung vorliegt. Alternativ kann „eine Menge" sich auf im Wesentlichen alle Kandidatenverbindungen beziehen, die in dem zumindest einen Gallenkanälchen nach Exposition einer Kandidatenverbindung gegenüber einer Kultur gemäß der vorliegenden Erfindung vorliegt. Somit kann der Satz „eine Menge einer Kandidatenverbindung in dem zumindest einen Gallenkanälchen" so verwendet werden, dass Kandidatenverbindungen beschrieben werden, die nicht in hohem Maße ausgeschieden, extensiv bzw. umfassend ausgeschieden und extensiv und rasch ausgeschieden werden.
Der Satz „Bestimmung einer Menge der Kandidatenverbindung in dem zumindest einen Gallenkanälchen" soll die Verwendung einer biliären Clearance-Berechnung, wie hierin nachstehend beschrieben, bedeuten. Der Satz „Bestimmung einer Menge einer Kandidatenverbindung in dem zumindest einen Gallenkanälchen" kann ebenfalls den Nachweis einer reduzierten Menge einer Markerverbindung aufgrund der Aufnahme einer Kandidatenverbindung in das zumindest eine Gallenkanälchen wie in der High-Throughput-Ausführungsform des Assays der vorliegenden Erfindung, die hierin nachstehend beschrieben ist, betreffen. Somit sollen quantitative und qualitative Bestimmungen „einer Menge einer Kandidatenverbindung in dem zumindest einen Gallenkanälchen" im Umfang der vorliegenden Erfindung liegen.
Der Satz „eine Menge einer Kandidatenverbindung" und/oder der Satz „Bestimmung einer Menge einer Kandidatenverbindung in dem zumindest einen Gallenkanälchen" soll ebenfalls das Screening von Beispielsweise einer Klasse oder Reihe von Kandidatenverbindungen und dann das Etablieren eines Rankings der Empfindlichkeit gegenüber einer biliären Exkretion der Kandidatenverbindung innerhalb der Klassen oder Reihe bedeuten. Es wird somit gemäß der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in Erwägung gezogen, dass die Kandidatenverbindung oder -verbindungen bei denen weniger oder eine niedrigere Empfindlichkeit gegenüber einer Exkretion gemäß eines solchen Rankings beobachtet wird, für weitere Experimente oder Entwicklungen als therapeutisches Mittel ausgewählt werden kann, während Verbindungen, bei denen eine höhere oder größere Empfindlichkeit gegenüber einer Exkretion gemäß eines solchen Rankings beobachtet wird, von einer weiteren experimentellen Untersuchung oder Entwicklung als therapeutisches Mittel ausgeschlossen werden können.
Jedoch, wie es für den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet offensichtlich wäre, ist die Eigenschaft, dass eine Verbindung gegenüber einer biliären Exkretion empfindlich ist, nicht notwendigerweise deren Ausschluss aus einer weiteren Entwicklung der Verbindung als therapeutisches Mittel. Tatsächlich basiert die Entscheidung, ob mit der Entwicklung einer speziellen Kandidatenverbindung als therapeutisches Mittel weitergemacht wird, auf vielen Faktoren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, der biologischen Aktivität der Kandidatenverbindung. Während die Empfindlichkeit gegenüber einer biliären Exkretion ein wichtiger Faktor ist, ist es nicht nur der einzige Faktor, der typischerweise durch den Durchschnittsfachmann in Erwägung gezogen wird. Die Charakterisierung der Empfindlichkeit gegenüber einer biliären Exkretion gemäß des Verfahrens der vorliegenden Erfindung stellt somit Daten bereit, die zur Verwendung durch den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bei der Auswertung, ob mit der Entwicklung einer Kandidatenverbindung als therapeutisches Mittel weitergemacht werden soll, wünschenswert ist.
Der Begriff „Markerverbindung" soll eine chemische Verbindung bedeuten, die unter Verwendung von Standardnachweistechniken leicht nachweisbar ist, wie beispielsweise Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Spektrophotometrie, Szintillations-Spektroskopie, Chromatographie, Flüssigkeitschromatographie/Massenspektroskopie (LC/MS), Colorimetrie und dergleichen. Beispielhafte Markerverbindungen schließen somit ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, fluorogene oder fluoreszierende Verbindungen, chemilumineszierende Verbindungen, colorimetrische Verbindungen, UV/VIS-absorbierende Verbindungen, Radionuclide und Kombinationen hiervon.
Therapeutische Zusammensetzungen, die aufgenommen und umfassend durch biliäre Exkretionsprozesse ausgeschieden werden und die hierin beschrieben sind, weisen typischerweise eine minimale Chance auf, therapeutische Wirkungen mit sich zu bringen. Es ist somit sehr wünschenswert, einen In vitro-Test für eine Empfindlichkeit einer Verbindung gegenüber einer Hepatocyten-Aufnahme und biliären Exkretion zu etablieren, um die Elimination einer Verbindung mit einer unerwünscht hohen Empfindlichkeit vor einer weiteren Auswertung als therapeutisches Mittel früh im Evaluationsprozess zu erleichtern. Der biliäre Exkretionsassay der vorliegenden Erfindung stellt einen solchen Test bereit.
Ratten-Hepatocyten sind in einer Kultur zur Verwendung im Verfahren der vorliegenden Erfindung bevorzugt; jedoch soll jede geeignete Quelle von Hepatocyten, wie es für den Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich ist, innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen. Beispielhafte Quellen schließen warmblütige Vertebraten, wie oben aufgelistet, ein. Insbesondere schließen beispielhafte Quellen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Menschen, Affen, Menschenaffen, Katzen, Hunde, Schweine, Borstenvieh, Rinder, Ochsen, Schafe, Pferde, Truthähne, Hühnchen, Enten und Gänse.
Das biliäre Exkretionsassayverfahren der vorliegenden Erfindung kann wahlweise das Etablieren einer Sandwichkultur von Hepatocyten umfassen, wobei zumindest eine Hepatocyten-Schicht zwischen zwei Schichten einer Matrix gebildet werden. Während die Konfiguration als Sandwichkultur die bevorzugte Konfiguration für die Kultur ist, wird jede geeignete Konfiguration, wie sie sich für den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet ergeben würde, als innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet. Beispielsweise werden Cluster, Aggregate oder andere Assoziationen oder Gruppierungen von Hepatocyten in einer Kultur, in der zumindest ein Gallenkanälchen gebildet wird und bei der funktionelle Eigenschaften der Hepatocyten etabliert werden, als innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung fallend betrachtet. Vorzugsweise erleichtert die Kulturkonfiguration die Bildung einer Vielzahl von Gallenkanälchen. Insbesondere erleichtert die Kulturkonfiguration die Bildung eines canaliculären Netzwerks. Die Menge einer Kandidatenverbindung zeigt, wie hierin ausführlich diskutiert, im canaliculären Raum des Gallenkanälchens die Empfindlichkeit der Kandidatenverbindung gegenüber einer biliären Exkretion an.
Zusätzlich werden in der bevorzugten Sandwich-Konfiguration Hepatocyten in Monolayers zwischen zwei Schichten einer Matrix oder einer Gerüstbildung kultiviert. Die Hepatocyten können jedoch auch in der Matrix eingebettet sein oder können nicht-gleichförmig vertikal durch die Matrix, horizontal, diagonal oder in irgendeiner Kombination hiervon sich derart erstrecken, dass eindimensionale, zweidimensionale oder dreidimensionale Hepatocyten-Aggregate gebildet werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird es somit ins Auge gefasst, dass die Hepatocyten-Kulturen durch Mischen von Hepatocytenzellen mit einer geeigneten Matrix und durch Einführen des Gemisches in einen geeigneten Kulturbehälter, wie beispielsweise eine Multi-Wellplatte gebildet werden.
Während Collagen ein bevorzugtes Substrat oder Gerüst für die Kultur der Hepatocyten ist, liegt jegliches Substrat oder Gerüst, gleichgültig ob natürlich oder synthetisch oder Kombinationen hiervon, wie es für den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet klar wäre, innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Beispielsweise werden andere biologische Substrate, einschliesslich, jedoch nicht beschränkt auf, Laminin und dem Basalmembran-abgeleitetem Zellkultursubstrat unter dem eingetragenen Markennamen Matrigel^® von Collaborative Biomedical Products, Inc., Bedford, Massachusetts, vertrieben, als geeignetes Substrat- oder Gerüstbildungs-Material angesehen. Synthetische Matrixmaterialien, Substratmaterialien oder Gerüstbildungsmaterialien, die typischerweise aus einer Vielzahl von Materialien, wie beispielsweise Polymeren, hergestellt sind, fallen ebenfalls in den Umfang der vorliegenden Erfindung. Die Variation der Bestandteilsmaterialien mit einer speziellen Matrix zur Verwendung in Kultur-Hepatocyten wird ebenfalls gemäß der Verfahren der vorliegenden Erfindung in Erwägung gezogen.
Die kultivierten Hepatocyten werden vorzugsweise als „Langzeitkultur" kultiviert. Der Begriff „Langzeitkultur" soll Hepatocyten bedeuten, die für zumindest ungefähr 12 Stunden kultiviert wurden. Besonders bevorzugt bedeutet „Langzeitkultur" Hepatocyten, die für zumindest ungefähr 24 Stunden, für zumindest ungefähr 48 Stunden oder für zumindest ungefähr 72 Stunden kultiviert wurden. Noch mehr bevorzugt soll der Begriff „Langzeitkultur" Hepatocyten betreffen, die für zumindest ungefähr 96 Stunden kultiviert worden sind. Langzeitkultivieren ermöglicht die Bildung von Gallenkanälchen und die Etablierung von funktionellen Eigenschaften innerhalb der Hepatocyten.
Gemäß der lang praktizierten Konvention des Patentgesetzes bedeuten die Begriffe „ein" und „eine", „ein oder mehrere", wenn sie in dieser Anmeldung, einschließlich den Ansprüchen, verwendet werden.
Seite-an-Seite-Ausführungsform
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden replizierte Hepatocyten-Kulturen etabliert, vorzugsweise in einer Sandwich-Konfiguration. Eine erste Kultur wird einem Standardpuffer gegenüber ausgesetzt und eine zweite Kultur wird gegenüber Ca⁺⁺-freiem Puffer ausgesetzt. Die Exposition gegenüber dem Ca⁺⁺-freien Puffer zerstört die Gallenkanälchen innerhalb der Hepatocyten-Monolayers durch Abbauen von Adhäsionsprozessen oder von Kreuzungskomplexen in der Monolayer der Hepatocyten. Während die Exposition gegenüber Ca⁺⁺-freiem Puffer ein bevorzugtes Verfahren zum Abbauen der Adhäsionsprozesse oder der Kreuzungskomplexe ist, um die Gallenkanälchen im Wesentlichen zu zerstören, wird jede geeignete Technik zum Abbauen der Adhäsionsprozesse oder der Kreuzungskomplexe zur Förderung einer beträchtlichen Zerstörung der Gallenkanälchen, wie sie sich für den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet ergeben würde, als innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegend angesehen. Beispielhafte Techniken schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, auf die Verabreichung an die Kultur von Peptiden, die mit Zell-an-Zell-Bindungsstellen interagieren, um dadurch eine Bindung an benachbarte Zellen zu verhindern.
Eine Kandidatenverbindung oder Verbindungen werden dann jeder Kultur zugesetzt. Die Kandidatenverbindung(en) kann nicht innerhalb des Gallenkanälchens in der Kultur zurückgehalten werden, die mit Ca⁺⁺-freiem Puffer behandelt wurde. Somit kann in dieser Kultur die Kandidatenverbindung(en) in die Hepatocyten aufgenommen werden und innerhalb des Cytoplasmas der Hepatocyten zurückgehalten werden. Jedoch wird jede Menge der Kandidatenverbindung(en), die durch die Hepatocyten durch die canaliculäre Membran hindurch ausgeschieden wird, in das Puffermedium strömen und wird entfernt werden, wenn das Puffermedium entfernt wird. Im Gegensatz hierzu werden, wenn Kandidatenverbindung(en) an die Hepatocyten-Sandwich-Kultur, in der die Gallenkanälchen intakt sind, verabreicht wird/werden, jede Kandidatenverbindung(en), die durch die Zellen aufgenommen wird/werden und durch die Zellen ausgeschieden werden, sowohl im Cytoplasma der Hepatocyten als auch in den Gallenkanälchen zurückgehalten.
Es ist dann wünschenswert, eine Messung der Menge einer Kandidatenverbindung zu erzielen, die innerhalb der intakten Gallenkanälchen vorliegt. Die Puffermedien werden aus den Kulturen entfernt und die Kulturen werden gewaschen und lysiert. Wie in den unten präsentierten Laborbeispielen beschrieben, kann das Lysieren der Zellen innerhalb der Kultur durch Zusatz eines geeigneten Lyse-Puffers, gekoppelt mit einem Schütteln der Kultur, erreicht werden. Ein bevorzugter Lyse-Puffer schließt ein Detergens ein. Die erwünschte Messung wird durch Vergleichen der Menge der Kandidatensubstanz, die im Lysat von der Kultur vorliegt, die zerstörte Gallenkanälchen aufweist (wie beispielsweise durch Exposition gegenüber Ca⁺⁺-freiem Medium) im Vergleich zum Lysat aus der Kultur mit intakten Gallenkanälchen gewonnen. Zwei spezielle Berechnungen wurden dazu verwendet, die Kulturen zu vergleichen und eine Menge der Kandidatenverbindung, die in den intakten Gallenkanälchen zurückbleibt, zu bestimmen. Wie oben beschrieben, zeigt die Menge der Kandidatenverbindung in den intakten Gallenkanälchen die Empfindlichkeit der Kandidatenverbindung gegenüber einer biliären Exkretion an.
Eine Berechnung ist als biliärer Exkretionsindex beschrieben, die eine Berechnung der Aufnahme und der Exkretion der Kandidatenverbindung wie folgt ist:
100% × {(Aufnahme in der Kultur mit intakten Gallenkanälchen minus der Aufnahme innerhalb von Hepatocyten nur in der Ca⁺⁺-freien Kultur) geteilt durch (Aufnahme in der Kultur mit intakten Gallenkanälchen)}. Die andere Berechnung ist eine biliäre Clearance-Berechnung, die wie folgt durchgeführt wird: (Aufnahme in der Kultur mit intakten Gallenkanälchen minus Aufnahme der Hepatocyten nur in der Ca⁺⁺-freien Kultur) geteilt durch (Zeit der Inkubation multipliziert mit der Konzentration der Kandidatenverbindung im Puffermedium).
Nach Vergleich des In vitro-Assays der vorliegenden Erfindung mit einem Standard-in vivo-Assay bezüglich der biliären Exkretion, wie in den Laborbeispielen unten beschrieben, wurde bestimmt, dass die biliäre Clearance eine genauere und wünschenswertere Bewertung der Exkretion bereitstellt. Insbesondere differenzierte die In vitro-Gallen-Clearance-Berechnung adäquat zwischen Kandidatensubstanzen, die Folgendes sind: (1) nicht hoch ausgeschieden; (2) umfassend ausgeschieden; und (3) umfassend und rasch ausgeschieden. Somit wurde die biliäre Clearance-Berechnung in der vorliegenden Erfindung verwendet.
Metabolitenassay-Ausführungsform
In den Hepatocyten des Verfahrens der vorliegenden Erfindung können bestimmte metabolische Aktivitäten (die als Phase-1-Aktivitäten bezeichnet werden) beträchtlich reduziert werden. Die beträchtliche Reduktion der metabolischen Aktivität, gekoppelt mit der Aufrechterhaltung des biliären Transports, repräsentiert einen Vorteil des in vitro biliären Exkretionsassays der vorliegenden Erfindung dahingehend, als eine Differenzierung zwischen biliärer Exkretion einer Stammkandidatenverbindung gegen einen Metaboliten oder mehrere Metaboliten der Stammkandidatenverbindung durchgeführt werden kann. Dieses Merkmal umfasst einen bedeutenden Aspekt der vorliegenden Erfindung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Metabolitenassays der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren die Etablierung eines ersten und zweiten Satzes von Kulturen von Hepatocyten, wobei jede Kultur vorzugsweise zumindest eine Schicht von Hepatocyten umfasst, die zwischen zwei Schichten von Collagen eingebaut ist und zumindest ein Gallenkanälchen, das innerhalb zumindest einer Schicht der Hepatocyten ausgebildet ist. Der erste Satz an Kulturen schließt intakte Gallenkanälchen ein und der zweite Satz der Kulturen schließt zerstörte Gallenkanälchen ein.
Die metabolische Enzymaktivität und/oder Transportsysteme werden dann in den Hepatocyten von einer der Kulturen innerhalb jedes des ersten und zweiten Satzes von Kulturen gemäß von in der Technik anerkannten Verfahren induziert, unter Verwendung von Induktoren, von denen bekannt ist, dass sie die Phase I hepatische Enzymaktivität nach oben regulieren, beispielsweise Phenobarbital und β-Naphthoflavon. Beispielhafte Induktoren und Techniken, die mit denselben in Verbindung stehen, sind von Parkinson, A. (1996), Biotransformation of Xenobiotics in Casarett and Doull's Toxicology. The Basic Science of Poisons., 5. Ausg. (Klaassen, C.D., Hsg.), Seiten 113–186, McGraw Hill, New York, und von LeCluyse et al., (1996) Cultured rat hepatocytes, in Models for Assessing Drug Absorption and Metabolism (Borchard et al., Hgs.), Seiten 121–160, Plenum Press, New York beschrieben, deren Inhalt durch diese Bezugnahme hierin mit aufgenommen ist.
Eine Kandidatenstamm-Verbindung wird den ersten und zweiten Sätzen der Kulturen für eine Zeit ausgesetzt, die ausreichend ist, um eine Aufnahme der Kandidatenstamm-Verbindung zu ermöglichen. Jeder Satz von Kulturen wird gewaschen und danach lysiert. Die Menge an Kandidatenstamm-Verbindung, die im Lysat vorhanden ist, gewonnen aus der Kultur in jedem Satz von Kulturen, die inaktive metabolische Enzyme aufweisen, wird gemäß Anspruch 2 bestimmt. Die Menge des Metaboliten der Kandidatenstamm-Verbindung, die in dem aus der Kultur in jedem Satz von Kulturen gewonnenen Lysat vorliegt, die aktive metabolische Enzyme aufweisen, wird ebenfalls gemäß dem Verfahren nach Anspruch 2 bestimmt.
Ein biliärer Clearance-Wert für die Kulturen mit inaktiven metabolischen Enzymen wird unter Verwendung der Menge an Kandidatenstamm-Verbindung im Kulturlysat berechnet. Der berechnete biliäre Clearance-Wert wird dann dazu verwendet, die Empfindlichkeit der Kandidatenstamm-Verbindung gegenüber einer biliären Exkretion zu bestimmen, wie es oben beschrieben ist. Ein biliärer Clearance-Wert für die Kulturen mit aktiven metabolischen Enzymen wird unter Verwendung der Menge an Metabolit der Kandidatenstamm-Verbindung im Kulturlysat berechnet. Der berechnete biliäre Clearance-Wert wird dann dazu verwendet, die Empfindlichkeit des Metaboliten gegenüber einer biliären Exkretion, wie oben beschrieben, zu bestimmen. Diese Information wird beispielsweise bei der Evaluierung als nützlich angesehen, ob oder ob nicht eine therapeutische Zusammensetzung in einer Pro-Drug-Form verabreicht wird.
Es wird in Erwägung gezogen, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung innerhalb von Standard-Multiwellassayplatten durchgeführt werden kann, wie es in der Technik bekannt ist, wie beispielsweise die 96-Well-Mikrotiterplatten, die von ICN Pharmaceuticals, Inc. (Costa Mesa, Kalifornien) erhältlich sind. Somit kann eine Vielzahl von Kandidatenverbindungen gleichzeitig bezüglich einer Empfindlichkeit gegenüber der biliären Exkretion innerhalb von multiplen Wells einer Multi-Wellplatte gescreent werden.
Die folgenden Laborbeispiele wurden mit eingeschlossen, um bevorzugte Arbeitsweisen der Erfindung zu illustrieren. Bestimmte Aspekte der folgenden Laborbeispiele werden bezüglich Techniken und Verfahren beschrieben, die von den vorliegenden Erfindern gefunden oder ins Auge gefasst wurden, so dass diese in der Praxis der Erfindung gut arbeiten. Diese Laborbeispiele werden durch Verwendung von Standard-Laborpraktiken der Erfinder exemplifiziert. Im Lichte der vorliegenden Offenbarung und des allgemeinen Fachwissens auf dem Gebiet werden Fachleute auf dem Gebiet erkennen, dass die nachfolgenden Laborbeispiele lediglich als beispielhaft anzusehen sind und dass zahlreiche Veränderungen, Modifikationen und Veränderungen verwendet werden können, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.
Laborbeispiele
Die folgenden Laborbeispiele betreffen die Etablierung einer Korrelation der biliären Exkretion in Sandwich-Kultur-Rattenhepatocyten (vorliegendes Verfahren) und in vivo in Ratten (Standard). Fünf Modellsubstrate, die ein unterschiedliches Spektrum von biliären Exkretionseigenschaften repräsentieren, wurden ausgewählt, um das Verhältnis zwischen dem Prozentsatz der in der Galle in vivo in Ratten und in vitro unter Verwendung von Sandwich-kultivierten Hepatocyten gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung ausgeschiedenen Dosis zu überprüfen. Die fünf Modellsubstrate schlossen Inulin, Salicylat, Methotrexat, [D-pen^2,5]Enkephalin und Taurocholat ein.
Zusätzlich ist ein Vergleich von in vivo und in vitro biliärer Exkretion von 264W94 und seinem Metaboliten in Beispiel 4 dargelegt. Verbindung 2169W94 ist der O-demethylierte Metabolit von 264W94 in Ratten und Menschen, der eine weitere Konjugation mit Uridin-5'-diphosphoflucuronsäure durchmachen kann, um ein Glucuronid-Konjugat zu bilden (Silver et al., ISSX Proceedings, (San Diego, Kalifornien, USA), Seite 387, 1996). Die Strukturformeln der Verbindungen 264W94 und 2169W94 sind in 9 präsentiert.
Materialien und Methoden, die in den Beispielen verwendet wurden
Chemikalien. [³H] Taurocholat (3,4 Ci/mmol; Reinheit > 97%), – [¹⁴C]Salicylat (55,5 mCi/mmol; Reinheit > 99%) und [³H][D-pen^2,5]Enkephalin (36 Ci/mmol; Reinheit > 97%) wurden von Dupont New England Nuclear (Boston Massachusetts) bezogen. [³H]Methotrexat (13,7 Ci/mmol; Reinheit > 99%) und [³H]Inulin (1,3 Ci/mmol; Reinheit 97%) wurden von Amersham International pcl (Buckinghamshire, England) bezogen. Die Verbindungen [¹⁴C]264W94 ((3R, 5R)-3-Butyl-3-ethyl-2,3,4,5-tetrahydro-7,8-dimethoxy-5-phenyl-1,4-benzothiazepin-1,1-dioxid; 45,5 mCi/mmol; Reinheit > 99%) und [¹⁴C]2169W94 ((3R, 5R)-3-Ethyl-2,3,4,5-tetrahydro-7-methoxy-8-hydroxy-5-phenyl-1,4-benzothiazepin-1,1-dioxid; 43,7 mCi/mmol; Reinheit > 99%) wurden von Glaxo Wellcome, Inc. bezogen (Research Triangle Park, North Carolina). Collagenase (Typ I, Klasse I) wurde von Worthington Biochemical Corp. (Freehold, New Jersey) bezogen. Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) fötales Rinderserum und Insulin wurden von Gibco (Grand Island, New York) bezogen. Rattenschwanz-Collagen (Typ I) wurde von Collaborative Biomedical Research (Bedford, Massachusetts) bezogen. Alle weiteren Chemikalien und Reagenzien waren von analytischer Güte und waren einfach aus kommerziellen Quellen erhältlich.
Tiere. Männliche Wistarratten (250–280 g) von Charles River Laboratory (Raleigh, North Carolina) wurden als Leberspender verwendet. Die Ratten wurden einzeln in Käfigen aus rostfreiem Stahl in einem konstant alternierenden 12-stündigen Licht- und Dunkelzyklus zumindest 1 Woche bevor die Studie durchgeführt wurde, beherbergt und wurden ad libitum bis zur Verwendung gefüttert. Gallen-Weg-kanülierte Ratten (200–250 g) wurden von Charles River (Raleigh, North Carolina) bezogen. Alle Verfahren wurden durch das Institutional Animal Care and Use Committee at the University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, North Carolina, bestätigt.
Herstellung von Kulturschalen. Kunststoffkulturschalen (60 mm) wurden mit Rattenschwanz-Collagen zumindest 1 Tag vor der Herstellung der Hepacyten-Kultur vorbeschichtet. Um ein geliertes Collagen-Substrat zu gewinnen, wurde eine eiskalte neutralisierte Collagen-Lösung (0,1 ml, 1,5 mg/ml, pH 7,4) auf jede Kulturschale verteilt. Frisch beschichtete Schalen wurden bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator für ungefähr 1 Stunde angeordnet, um es dem Matrixmaterial zu ermöglichen, zu gelieren, gefolgt vom Zusatz von 3 ml DMEM zu jeder Schale und Aufbewahrung in einem befeuchten Inkubator.
Kultur von Ratten-Hepatocyten. Hepatocyten wurden mit einer zweischrittigen Perfusionsmethode isoliert. Kurz gesagt wurden die Ratten mit Ketamin und Xylazin (60 und 12 mg/kg i.p.) vor der Portalvenen-Kanülierung anästhesiert. Die Leber wurde für 10 min in situ mit mit Sauerstoff versetztem Ca⁺⁺-freiem Krebs-Henseleit-Hydrogencarbonat-Puffer perfundiert, der Collagenase Typ I (0,5 mg/ml) enthielt. Die Leberkapsel wurde mit Scheren entfernt. Die Hepatocyten wurden durch vorsichtiges Schütteln der Leber in 100 ml DMEM freigesetzt.
Die freigesetzten Zellen wurden durch einen sterilen Nylonfilter (70 μm) filtriert. Die Hepatocyten-Suspensionen wurden bei 50 X g für 3 min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 25 ml DMEM resuspendiert und in einem gleichen Volumen 90%igem isotonischem Polyvinylpyrrolidonbeschichtetem Siliciumdioxid-Colloid-Zentrifugationsmedium (pH 7,4) vertrieben unter der eingetragenen Marke PERCOLL^® durch Pharmacia, Inc. of Piscataway, New Jersey, resuspendiert. Die sich ergebende Zellsuspension wurde bei ungefähr 70 bis ungefähr 150 X g für 5 min zentrifugiert. Das Pellet wurde in 50 ml DMEM resuspendiert und die Zellsuspensionen wurden in einem Röhrchen bzw. Reagenzglas, gefolgt von einer Zentrifugation bei 50 X g für 3 min vereinigt. Die Hepatocyten-Lebensfähigkeit wurde durch Trypan-Blauausschluss bestimmt. Nur solche Hepatocyten-Zubereitungen mit einer Lebensfähigkeit von mehr als 90% wurden für weitere Studien verwendet.
Hepatocyten-Suspensionen wurden mit DMEM hergestellt, das 5% fötales Kalbsserum, 1 μm Dexamethason und 4 mg/l Insulin enthielt. Hepatocyten-Suspensionen wurden den vorbeschichteten Schalen in einer Dichte von ungefähr 2–3 × 10⁶ Zellen/60-mm-Schalen zugesetzt. Ungefähr 1 Stunde nach dem Ausplattieren der Zellen wurde das Medium abgesaugt und 3 ml frisches DMEM wurde zugesetzt. Für Transportstudien wurden Hepatocyten, die für 3–5 Stunden ohne Collagen-Überschichtung ausgesät wurden, als 3-Stunden- oder Kurzzeit-kultivierte Hepatocyten definiert.
Um Sandwich-kultivierte Hepatocyten herzustellen, wurden neutralisierte Collagen-Lösung (0,5 ml, ungefähr 1,5 bis ungefähr 3,5 mg/ml, pH 7,4) den Monolayers 24 Stunden, nachdem die Zellen ausgesät wurden, zugesetzt. Kulturen mit einer Collagen-Überschichtung wurden für 45 min bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator inkubiert, um die Gelierung des Collagens vor Zusatz von DMEM zu ermöglichen. Das Medium wurde auf einer täglichen Basis ausgetauscht, bis zum vierten Tag, nachdem die Zellen ausgesät wurden. Diese Hepatocyten wurden als 96-Stunden- oder Langzeit-kultivierte Hepatocyten bezeichnet.
Kumulative Aufnahmestudien in Sandwich-kultivierten Hepatocyten. Hepatocyten, die in einer Collagen-Sandwich-Konfiguration kultiviert wurden, wurden in 3 ml Standardpuffer oder Ca²⁺-freiem Puffer bei 37°C für 10 min inkubiert. Nach Entfernen des Inkubationspuffers wurde die Aufnahme durch Zusatz von 3 ml Standardpuffer, der Substrat enthielt, zu jeder Schale, begonnen. Nach Inkubation für die vorgesehenen Zeiten wurden die kumulative Aufnahme durch Absaugen der Inkubationslösung und durch Spülen viermal mit 3 ml eiskaltem Standardpuffer zur Entfernung von extrazellulärem Substrat beendet. Nach dem Waschen wurden 2 ml 1% Triton X-100 Lösung den Kulturschalen zugesetzt und die Zellen wurden durch Schütteln der Schale auf einem Shaker für 20 min bei Raumtemperatur lysiert. Eine Teilmenge (1 ml) des Lysats wurde durch Flüssigkeit-Szintillationsspektrometrie analysiert. Ein Bio-rad DC Proteinassay-Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornien) wurde dazu verwendet, die Proteinkonzentration in den Kulturextrakten unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard zu bestimmen. Triton X-100 (1%) störte den Assay nicht. Alle Werte für die Substrataufnahme in die Zell-Monolayers wurden bezüglich einer unspezifischen Bindung an das Collagen durch Subtrahieren der Substrataufnahme korrigiert, die in den geeigneten Kontrollschalen in Abwesenheit von Zellen, wie vorher beschrieben, bestimmt wurde.
Biliäre Exkretion in Ratten nach intravenöser Verabreichung von 264W94 und nach oraler Verabreichung von 2169W94. [¹⁴C]264W94 wurde als eine Lösung in einem Gemisch aus sterilem Wasser/Polypropylenglycol400/Ethanol (2:1:1 V/V/V) in einer Konzentration von 0,125 mg/ml formuliert. Im Anschluss an eine Sammlung von Prä-Dosisgalle [¹⁴C]264W94-Lösung wurde durch Caudalvenen-Injektion (0,1 mg/kg) verabreicht. Für die 2169W94-Studien wurde [¹⁴C]2169W94 als Suspension in einer Konzentration von 0,1 mg/ml in 0,5% (G/V) Methylcellulose in Wasser hergestellt. Im Anschluss an die Sammlung von Prä-Dosisgalle wurde eine [¹⁴C]2169W94-Suspension durch Sondenfütterung (1,0 mg/kg) verabreicht. Alle Ratten wurden in individuellen Kunststoffmetabolismuskäfigen angeordnet, die den Ratten eine uneingeschränkte Bewegung ermöglichten. Die Galle wurde in Polypropylenbehältern gesammelt, die von Eis umgeben waren. Für die 264W94-Studien wurde der Gallenbehälter bei 8 und 24 Stunden nach der Dosierung gewechselt. Frühere Studien zeigten, dass Proben auf Eis für 24 Stunden stabil waren. Gallenproben wurden bei –20°C bis zur Analyse aufbewahrt.
Analytisches Verfahren. Teilmengen von Zell-Lysat und Gallenproben, die 264W94 oder 2169W94 enthielten, wurden mit zweifachen Volumina eisgekühltem Acetonitril vermischt und zur Entfernung von ausgefällten Proteinen zentrifugiert. Der Überstand wurde unter Stickstoff bei Raumtemperatur abgedampft und in 100 μl eines 70/30-Gemisches von 50 mM Ammoniumacetat/Acetonitril/Trifluoressigsäure (95:5:0,1 V:V:V) und Acetonitril rekonstituiert. Die Probenextrakte wurden auf einer WATERS^TM SYMMETRY^TM C18-Säule (3,9 × 150 mm) injiziert und durch ein 85:15-Gemisch von 50 mM Ammoniumacetat (pH 4,0) und Acetonitril eluiert; der Prozentsatz von Acetonitril wurde durch einen WATERS^TM 600E Systemcontroller auf 55% über eine Zeitspanne von 20 min hin erhöht und danach auf 10% während der nächsten 10 Minuten.
Radioaktiver Kohlenstoff, der aus der HPLC eluierte, wurde mit einem Online-Radioaktivitäts-Detektor (RADIOMATIC FLO-ONE/BETA^TM Radio-Chromatography Detector Series 500 TR Reihe, Packard Instrument Co.) quantifiziert. Die Peaks von 264W94, 2169W94 und 2169W94 Glucuronid wurden durch Vergleichen mit einer aufgereinigten Standardverbindung identifiziert. Unter diesen Bedingungen wurde eine Basislinienauftrennung dieser drei Bestandteile erreicht. Die Konzentration der drei Bestandteile wurde durch Normalisieren der eluierten Radioaktivität in jedem Peak mit der gesamt injizierten Radioaktivität bestimmt.
Datenanalyse. Die Aufnahmedaten wurden mit dem Proteingehalt normalisiert und als Durchschnitt ± Standardabweichung von 3 bis 4 getrennten Zubereitungen von Hepatocyten ausgedrückt. Die statistischen Unterschiede zwischen den Durchschnittswerten für die 10-minütige kumulative Substrataufnahme in Gegenwart und Abwesenheit von Ca²⁺ wurden durch Verwendung des wohl bekannten Student-t-Tests bestimmt. Ein p-Wert von < 0,05 wurde als signifikant betrachtet.
Die in vivo biliäre Clearance, Cl_B (ml/min/kg Körpergewicht) wurde gemäß Gleichung 1 berechnet:
wobei die Menge Galle_(0-T) die Menge an Stammarzneistoff repräsentiert, die in der Galle von 0 bis Zeitpunkt T gewonnen wurde, wenn der größte Teil des Arzneistoffs aus dem systemischen Kreislauf eliminiert wurde und AUC_0-T repräsentiert die Fläche unter der Plasmakonzentrations-Zeitkurve von 0 bis Zeitpunkt T (in Minuten).
Die in vivo intrinsische Clearance (CLB_in, ml/min/kg Körpergewicht) wurde gemäß Gleichung 2 auf Grundlage des gut gerührten Modells der hepatischen Ablagerung geschätzt, unter der Annahme, dass die biliäre Exkretion der vorherrschende Eliminationsweg ist (Pang et al., J. Pharmacokinet. Biopharm. 5: 625–653, 1977).
wobei Q eine hepatische Plasmaströmung der Ratte von 40 ml/min/kg Körpergewicht {(Blutströmung × (1-Hämatokrit)}; Pollack et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 18: 197–202, (1989) und Cl_B die biliäre Clearance für Modellverbindungen repräsentiert, die in der Literatur berichtet wurden oder die aus Gleichung 1 berechnet wurden.
Die biliäre Exkretion von Substraten in den Monolayers wurde quantitativ durch den biliären Exkretionsindex bestimmt, basierend auf Gleichung 3:
wobei Aufnahme_Standard und Aufnahme_CA++-frei die kumulative Aufnahme von Substrat über ein 10-minütiges Intervall in den Hepatocyten-Monolayers repräsentiert, die in einem Standardpuffer bzw. in Ca⁺⁺-freiem Puffer präinkubiert wurden.
Die biliäre Clearance in den Sandwich-kultivierten Hepatocyten, Cl_B(Kultur) (ml/min/kg Körpergewicht) wurde gemäß Gleichung 4 berechnet:
wobei Zeit_Inkubation 10 min und Konzentration_Medium die initiale Substratkonzentration im Inkubationsmedium repräsentierte. Das Rattenlebergewicht und der Proteingehalt im Lebergewebe wurden als 40 g/kg Körpergewicht und 0,20 g/g Lebergewicht angenommen (Seglen et al., Methods in Cell Biology (13. Ausg., Prescott D. M., Hsg.), Seiten 30–78, Academic Press, New York, 1976), und das jeweils in allen Berechnungen.
Zusammenfassung der Ergebnisse der Beispiele
Die biliäre Exkretion der fünf Modellsubstrate in Langzeit-Sandwich-kultivierten Hepatocyten gemäß der vorliegenden Erfindung war mit ihren in vivo biliären Exkretionseigenschaften konsistent. Die Quantifizierung der biliären Exkretion in den kultivierten Hepatocyten unter Verwendung der biliären Exkretionsindexberechnung ist hierin oben beschrieben. Kurz gesagt, repräsentiert der biliäre Exkretionsindex den Prozentsatz von in den Gallenkanälchen zurückgehaltenem Substrat. Die Ergebnisse der Laborbeispiele zeigen, dass Verbindungen, die eine vernachlässigbare biliäre Exkretion in vivo auf Grundlage des Prozentsatzes der in der Galle ausgeschiedenen Dosis durchmachen (beispielsweise Inulin, Salicylat) einen niedrigeren biliären Exkretionsindex (ungefähr Null) aufweisen. Verbindungen, die in der Galle in vivo umfassender ausgeschieden werden (beispielsweise Methotrexat [D-pen^2,5]Enkephalin und Taurocholat) weisen einen hohen biliären Exkretionsindex (ungefähr 50%) auf.
Das Verhältnis zwischen dem biliären Exkretionsindex und dem Prozentsatz der Dosis, die in der Galle in vivo ausgeschieden wurde, zeigt eine grundsätzliche Korrelation. Methotrexat und [D-pen^2,5]Enkephalin repräsentieren Verbindungen, die „sehr stark" in der Galle ausgeschieden werden (ungefähr 60 und 70% der i.v. Dosis wurden in der Galle bei 1 Stunde jeweils wiederentdeckt). Im Gegensatz hierzu wird Taurocholat „rasch und umfassend" insofern ausgeschieden, als dass beinahe die gesamte i. v. Dosis in der Galle in weniger als 1 Stunde ausgeschieden wurde. Der biliäre Exkretionsindex kann somit zwischen Verbindungen unterscheiden, die eine extensive gegen eine vernachlässigbare oder niedere biliäre Exkretion durchmachen.
Jedoch scheint der biliäre Exkretionsindex nicht dazu in der Lage zu sein, zwischen Verbindungen zu unterscheiden, die in die Galle in hohem Maße ausgeschieden werden, wie Methotrexat (biliärer Exkretionsindex: ungefähr 55%) oder [D-pen^2,5]Enkephalin (biliärer Exkretionsindex: ungefähr 42%) und Verbindungen, die in die Galle „rasch und umfassend" ausgeschieden werden, wie Taurocholat (biliärer Exkretionsindex: ungefähr 56%). Diese Einschränkung des biliären Exkretionsindex kann auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass dieser Index in erster Linie durch die canaliculären exkretorischen Funktionen bestimmt wird. Der Prozentsatz des i.v. verabreichten Substrates, das in die Galle in vivo ausgeschieden wird, wird durch die sinusoidale Aufnahmeaktivität, die canaliculäre exkretorische Aktivität ebenso wie andere kompetitive Eliminationsprozesse bestimmt.
Die biliäre Clearance repräsentiert einen effektiveren Parameter zum Vergleich des Verhältnisses zwischen in vivo und in vitro biliärer Exkretion. Die in vivo biliäre Clearance wurde in den Laborbeispielen als Verhältnis der in die Galle zum Zeitpunkt T ausgeschiedenen Menge und der Plasma-AUC zwischen Zeit 0 und Zeit T berechnet. Weil der größte Teil der verabreichten Dosis zum Zeitpunkt T eliminiert war, entspricht die biliäre Clearance ungefähr der biliären Clearance, die von Zeitpunkt 0 bis Zeitpunkt T (unendlich) berechnet wurde. Die in dieser Art und Weise berechnete biliäre Clearance ist eine Funktion der intrinsischen biliären Clearance und der hepatischen Plasmaströmungsgeschwindigkeit. Um die Effekte der Plasmaströmung zu eliminieren, wurde die intrinsische biliäre Clearance auf Grundlage des „gut gerührten" Modells der hepatischen Anordnung berechnet, wie es von Pang und Rollan in J. Pharmacokinet. Biopharm. 5: 625–653, 1977 beschrieben wurde. Desgleichen wurde die in vitro biliäre Clearance als das Verhältnis der in die canaliculären Netzwerke in den Hepatocyten-Monolayers ausgeschiedenen Menge und der AUC im Inkubationsmedium berechnet.
In den Sandwich-kultivierten Hepatocyten war das Inkubationsmedium allen Hepatocyten in der Schale zum selben Zeitpunkt zugänglich. Somit sollte die berechnete in vitro biliäre Clearance die intrinsische biliäre Clearance repräsentieren. Weil jedoch die biliäre Exkretion zwei Prozesse einschließt, nämlich die Aufnahme durch die sinusoidale Membran hindurch und die Exkretion durch die canaliculäre Membran hindurch, sollte die echte intrinsische biliäre Clearance durch den Transport durch die canaliculäre Membran bestimmt und auf Grundlage der intrazellulären Substratkonzentrationen berechnet werden. Deswegen können die in vivo und in vitro „intrinsischen" Clearance-Werte, berechnet in den Laborbeispielen als „apparente" intrinsische biliäre Clearance-Werte bezeichnet werden, die durch den langsamsten Schritt im Prozess limitiert werden würden, entweder die sinusoidale Aufnahme oder die canaliculäre Exkretion.
Die Korrelation zwischen der in vitro biliären Clearance und der in vivo intrinsischen biliären Clearance war hoch (r² = 0,9865) für die fünf Modellsubstrate. Gemäß der in vivo intrinsischen biliären Clearance können die fünf Modellsubstrate in drei Gruppen klassifiziert werden: Verbindungen, die nicht in die Galle ausgeschieden werden (Inulin und Salicylat; ungefähr 0 ml/min/kg), Verbindungen, die in die Galle in hohem Maße ausgeschieden werden (Methotrexat und [D-pen^2,5]Enkephalin, ungefähr 17,3 ml/min/kg und ungefähr 34,4 ml/min/kg) und Verbindungen, die rasch und umfassend in die Galle ausgeschieden werden (Taurocholat, ungefähr 116,9 ml/min/kg). Die geschätzte in vitro biliäre Clearance differenzierte adäquat zwischen diesen drei Gruppen von Verbindungen (ungefähr 0,4 bis 13 und 56 ml/min/kg). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die biläre Clearance das Verhältnis zwischen der in vivo und in vitro biliären Exkretion im Vergleich zu dem biliären Exkretionsindex genauer charakterisiert.
Beispiel 1
Kumulative Aufnahme in kultivierten Hepatocyten
Die kumulative Aufnahme von Inulin war vernachlässigbar (weniger als 0,01% des anfänglich zugesetzten Substrats) bei allen Inkubationszeitpunkten in entweder Langzeit- oder Kurzzeit-kultivierten Hepatocyten (1A und 1B). In den 3-Stunden-kultivierten Hepatocyten war die kumulative Aufnahme von Salicylat, Methotrexat und [D-pen^2,5]Enkephalin in Standardpuffer und in Ca²⁺-freiem Puffer nicht signifikant verschieden (2A, 3A und 4A; p > 0,05). Jedoch wurde eine gering höhere kumulative Aufnahme von Taurocholat in Standardpuffer im Vergleich zu Ca²⁺-freiem Puffer beobachtet (5A); bei 10 min war die kumulative Aufnahme in Standardpuffer ungefähr 10% höher als in Ca²⁺-freiem Puffer (p = 0,0352). In 96-Stunden-kultivierten Hepatocyten wies extrazelluläres Ca²⁺ keine Wirkung auf die kumulative Aufnahme von Salicylat auf (2B, p > 0,05). Jedoch war die Aufnahme von Methotrexat [D-pen^2,5]Enkephalin und Taurocholat in Langzeit-kultivierten Hepatocyten in Standardpuffer signifikant höher als in Ca²⁺-freiem Puffer (3B, 4B und 5B; p < 0,05).
Beispiel 2
Verhältnis zwischen dem Prozentsatz der in die Galle in Ratten ausgeschiedenen Dosis und des biliären Exkretionsindex in kultivierten Hepatocyten
Die fünf Modellsubstrate, die ein unterschiedliches Spektrum von biliären Exkretionseigenschaften repräsentieren, wurden ausgewählt, um das Verhältnis zwischen dem Prozentsatz der in die Galle in vivo in Ratten ausgeschiedenen Dosis und dem biliären Exkretionsindex in Sandwich-kultivierten Hepatocyten zu überprüfen. Eine Information bezüglich des Prozentsatzes der Dosis, die nach i.v. Verabreichung in Rattengalle ausgeschieden wurde, wurde aus der Literatur bezogen. Der Umfang von Inulin- und Salicylat-Sekretion in die Galle war vernachlässigbar (Eriksson et al., Acta. Physiol. Scand. 95: 1–5, 1975; Laznicekand et al., Eur. J. Drug Met. Pharmacokinet. 19: 21–26, 1994). Ungefähr 50–60% einer 22 μmol/kg Methotrexat-Dosis (Bremnes et al., Cancer Res. 49: 2460–2464, 1989; Masuda et al., Cancer Res. 57: 3506–10, 1997) und 70% einer 14,5 μmol/kg [D-pen^2,5]Enkephalin-Dosis (Chen et al., Pharm. Res. 14: 345–350, 1997) wurden in Rattengalle bei 1 Stunde als unveränderter Arzneistoff ausgeschieden. Die biliäre Taurocholat-Exkretion war rascher und umfangreicher als Methotrexat und [D-pen^2,5]Enkephalin. In 1 Stunde wurden tatsächlich 100% der Dosis (8,0 μmol/kg) in der Rattengalle wiedergefunden (Inoue et al., Biochim. Biophy. Acta. 833: 211–216, 1985).
Die biliäre Exkretion in den Sandwich-Kultur-Hepatocyten kann quantitativ als der biliäre Exkretionsindex ausgedrückt werden, berechnet aus Gleichung 3, auf Grundlage der 10-minütigen kumulativen Aufnahmedaten in den 3B bis 5B. Der biläre Exkretionsindex von Inulin und Salicylat wurde als vernachlässigbar angesehen, weil keine statistisch signifikanten Unterschiede in der kumulativen Aufnahme von Inulin oder Salicylat zwischen Standardpuffer und Ca²⁺-freiem Puffer (p > 0,05) beobachtet wurden. Der biläre Exkretionsindex von Methotrexat [D-pen^2,5]Enkephalin und Taurocholat betrug 55,4 ± 18,3%, 42,4 ± 6,5% bzw. 56,4 ± 5,2%. Das Verhältnis zwischen dem Prozentsatz dieser Dosis, ausgeschieden in Rattengalle in vivo, und dem biliären Exkretionsindex, gemessen in dem in vitro System, ist in 6A dargestellt. Der biliäre Exkretionsindex war für die Verbindungen, die eine vernachlässigbare biliäre Exkretion in vivo durchmachen, sehr niedrig (beispielsweise Inulin und Salicylat). Im Gegensatz hierzu war der biliäre Exkretionsindex für Verbindungen, die in die Galle in vivo ausgeschieden werden, moderat hoch (beispielsweise Methotrexat, [D-pen^2,5]Enkephalin und Taurocholat).
Beispiel 3
Korrelation der in vitro und in vivo biliären Clearance
Die biliäre in vivo Clearance (ml/min pro kg Körpergewicht) von Inulin, Salicylat, Methotrexat und Taurocholat betrug 0,035 (Utesch et al., Vitro Cell. Dev. Biol, 27A: 858–863, 1991), ~0 (Laznicekand et al., Eur. J. Drug Met. Pharmacokinet. 19: 21–26, 1994), 12,1 (Masuda et al., Cancer Res. 57: 3506–10, 1997) und 29,8 (Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta. 833: 211–216, 1985). Die in vivo biliäre Clearance von [D-pen^2,5]Enkephalin, 18,5 ml/min/kg, wurde auf Grundlage von Gleichung 1 aus den von Chen und Pollack berichteten Daten berechnet (Chen und Pollack, Pharm. Res. 14: 345–350, 1997). Auf Grundlage dieser in vivo biliären Clearance-Werte wurde die intrinsische biliäre Clearance von Inulin, Salicylat, Methotrexat, [D-pen^2,5]Enkephalin und Taurocholat aus Gleichung 2 berechnet (0,04, 17,3, 34,4 und 116,9 ml/min/kg).
Die in vitro biliäre Clearance von Inulin, Salicylat, Methotrexat, [D-pen^2,5]Enkephalin und Taurocholat, berechnet aus Gleichung 4 auf Grundlage der 10-minütigen kumulativen Aufnahmedaten (1B bis 5B) betrug jeweils 0, 0, 4,1 ± 1,0, 12,6 ± 2,2 bzw. 56,2 ± 6,0 ml/min/kg. Die in vivo intrinsische biliäre Clearance korrelierte gut mit der in vitro biliären Clearance (r² = 0,9865) für die fünf Modellverbindungen (6B).
Beispiel 4
Vergleich der biliären In vivo- und In vitro-Exkretion von 264W94 und seiner Metaboliten
Die Strukturformeln der Verbindungen 264W94 und 2169W94 sind in 9 präsentiert. Verbindung 2169W94 ist der O-demethylierte Metabolit von 264W94 in Ratten und Menschen, die eine weitere Konjugation mit Uridin-5'-diphosphoflucuronsäure zur Bildung eines Glucuronid-Konjugats durchmachen (Silver et al.; ISSX Proceedings, (San Diego, Kalifornien, USA), Seiten 387, 1996).
Nach der i.v. Verabreichung von [¹⁴C]264W94 an Ratten (0,24 μmol/kg) wurden weder 264W94 noch 2169W94 nach 24 Stunden in der Galle nachgewiesen. Jedoch wurden 35,4% (n = 2) der gesamten verabreichten Radioaktivität in der Galle in der ersten Stunde wiedergewonnen. Ungefähr 30,0% der Radioaktivität, die in der Galle aufgefunden wurde, war das 2169W94-Glucuronid; die verbleibenden 70% der Radioaktivität in der Galle repräsentierten nicht-identifizierte Metabolite. Nach der oralen Verabreichung von [14C]264W94 an Ratten (2,4 μmol/kg) wurde 2169W94 in der Galle nach 24 Stunden nicht nachgewiesen. Jedoch wurden 66,4% (n = 2) der gesamten verabreichten Radioaktivität in der Galle nach 8 Stunden wiedergewonnen. Ungefähr 88,7% der Radioaktivität in der Galle lagen in Form des 2169W94 Glucuronid-Konjugats vor. Diese In vivo-Resultate demonstrieren, dass 264W94 und sein O-demethyliertes Produkt, 2169W94 eine vernachlässigbare biliäre Exkretion durchmachen, jedoch macht das Glucuronid-Konjugat von 2169W94 eine umfassende biliäre Exkretion in Ratten durch.
Um die biliäre Exkretion von 264W94 und seiner Metaboliten in 3 Stunden und 96 Stunden kultivierten Hepatocyten zu bestimmen, wurden Hepatocyten-Monolayer in Standard- oder Ca²⁺-freiem Puffer inkubiert, bevor die kumulative Aufnahme in Standardpuffer durchgeführt wurde, der 3 μM [¹⁴C]264W94 oder [¹⁴C]2169W94 enthielt (7 und 8). In 3 Stunden kultivierten Hepatocyten war die kumulative Aufnahme, gemessen durch Gesamtradioaktivität von 264W94 oder 2169W94 in den Hepatocyten, die in Standardpuffer oder Ca²⁺-freiem Puffer (p > 0,05) präinkubiert wurden, ähnlich, was nahelegt, dass die Aufnahme von 264W94 und 2169W94 in Kurzzeit-kultivierten Hepatocyten nicht durch die Präinkubation der Monolayers in Ca²⁺-freiem Puffer beeinträchtigt wurde. In 96 Stunden kultivierten Hepatocyten war die 10-minütige kumulative Aufnahme von 264W94, gemessen durch die Gesamtradioaktivität, nicht signifikant in den Monolayers verschieden, die in Standardpuffer oder Ca²⁺-freiem Puffer präinkubiert wurden (p < 0,05).
Eine HPLC-Analyse des Zell-Lysats bei 10 min zeigte, dass 73,0% der Gesamtradioaktivität in Form von 264W94 vorlagen und 3,3% betrug das 2169W94-Glucuronid-Konjugat; 2169W94 wurde im Lysat nicht nachgewiesen. In 96 Stunden Sandwich-kultivierten Hepatocyten war die 10-minütige kumulative Aufnahme von 2169W94 ungefähr 70% größer in Gegenwart von Ca²⁺ als in Abwesenheit von Ca²⁺ (p < 0,05). In dem 10-minütigen Zell-Lysat lagen ungefähr 16,7% der Gesamtradioaktivität in Form von 2169W94 vor und ungefähr 58,5 lagen als das 2169W94 Glucuronid-Konjugat vor. Verbindungen 2169W94 bildet das Glucuronid-Konjugat, das in die Gallenkanälchen-Netzwerke in Langzeit-kultivierten Hepatocyten ausgeschieden werden.
Um die Nützlichkeit des biliären in vitro-Exkretionsassays der vorliegenden Erfindung weiter zu charakterisieren, um die in vivo biliäre Exkretion von Arzneistoff-Metaboliten vorhersagen zu können, wurden die in vitro und in vivo biliäre Exkretion von 264W94 und seinen O-demethylierten Metaboliten 269W94 und 2169W94-Gucuronid überprüft. Kürzlich zeigten in in vitro-Studien, die mit Ratten- und humanen Lebermicrosomen durchgeführt wurden, präzisionsgeschnittene Leberschnitte und cDNA, die aus den hepatischen Cytochrom p450 Isozymen exprimiert wurden, das 264W94 in der 8-Methoxy-Position einen O-demethylierten Metabolit bildete. Unter den mehreren überprüften Cytochrom p450 Isozymenen war das CYP3A4 das Isozym, das in erster Linie in den Metabolismus von 264W94 involviert war (Silver et al., ISSX Proceedings (San Diego, Kalifornien, USA), S. 387, 1996).
In vivo-Ablagerungs- bzw. -Verteilungsstudien demonstrierten, dass weder 264W94 noch sein O-demethylierter Metabolit, 2169W94, in die Galle ausgeschieden wurden. Jedoch wurde das 2169W94-Glucuronid-Konjugat zusammen mit anderen nicht-identifizierten Metaboliten umfassend in die Galle ausgeschieden. Das Fehlen einer biliären Exkretion von 264W94 in Langzeit-Sandwich-kultivierten Hepatocyten stimmte mit der vernachlässigbaren in vivo biliären Exkretion von 264W94 überein.
In vivo wurde ein Äquivalent von ungefähr 35% 264W94 in die Galle als Metaboliten bei einer Stunde nach i.v. Verabreichung von 264W94 ausgeschieden. In kultivierten Hepatocyten jedoch war die biliäre Exkretion von 264W94 vernachlässigbar (7B). Diese offensichtliche Diskrepanz zwischen der biliären In vivo- und In vitro-Exkretion für Metaboliten von 264W94 kann durch Unterschiede in den metabolischen Aktivitäten erklärt werden. In vivo macht 264W94 eine O-Demethylierung zur Bildung von 2169W94 durch und anschließend wird 2169W94 mit Uridin-5'-phosphoglucuronsäure zur Bildung von 2169W94-Glucuronid konjugiert. Dieses Glucuronid-Konjugat macht 30% der Gesamtmenge, die in die Galle ausgeschieden wird, aus. Im Lysat von Langzeit-Sandwich-kultivierten Hepatocyten, die mit 264W94 inkubiert wurden, wurden nur ungefähr 3% der Gesamtmenge, die inkubiert war, als 2169W94-Glucuronid-Konjugat nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigten an, dass die Langzeit-kultivierten Hepatocyten nicht zu einer O-Demethylierungsreaktion in der Lage waren. Konsequenterweise wurde vernachlässigbares Glucuronid-Konjugat gebildet und in die Galle ausgeschieden.
Jedoch wurde nach Inkubation der Monolayers mit 2169W94, dem O-demethylierten Metabolit von 264W94, 58,5% von 2169W94 zu Glucuronid-Konjugaten umgewandelt und eine signifikante biliäre Exkretion wurde in den kultivierten Hepatocyten beobachtet (8B). Evident ist, dass die Phase-I-metabolischen Aktivitäten, wie beispielsweise die O-Demethylierung, signifikant verschlechtert werden, während die Phase-II-metabolischen Aktivitäten, wie beispielsweise die Glucuronid-Konjugierung, zumindest teilweise in den Langzeit-Sandwich-kultivierten Hepatocyten aufrechterhalten werden, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Somit zeigt dieses Laborbeispiel weiterhin an, dass der Assay der vorliegenden Erfindung zur Vorhersage der in vivo biliären Exkretion eines Substrats in seiner Stammform verwendet werden kann. Tatsächlich macht die Anwendung des vorliegenden In vitro-Assayverfahrens zur Untersuchung und zur Vorhersage der in vivo biliären Exkretion von Metaboliten eine Betrachtung des Status der metabolischen Aktivitäten in den Monolayers erforderlich.
Literatur
Die unten aufgelistete Literatur, ebenso wie alle Literaturstellen, die in der Beschreibung erwähnt werden, sind hierdurch durch ihre Bezugnahme in einem solchen Umfang mit aufgenommen, dass sie die Methoden, Techniken und/oder hierin verwendeten Zusammensetzungen ergänzen, erklären oder einen Hintergrund für diese bereitstellen bzw. lehren.

Boyer and Soroka, Gastroenterology 109: 1600–1611, 1995
Bremnes et al., Cancer Res. 49: 2460–2464, 1989.
Chen et al., Pharm. Res. 14: 345–350, 1997.
Dunn et al., FASEB J. 3: 174–177, 1989.
Eriksson et al., Acta. Physiol. Scand. 95: 1–5, 1975.
Haugland, Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1992–1994), p. 134, Molecular Probes, Inc., 1992.
Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta. 833: 211–216, 1985.
Laznicekand et al., Eur. J. Drug Met. Pharmacokinet. 19: 21–26, 1994.
LeCluyse et al., Am. J. Physiol. 266 (Cell Physiol. 35): C1764–1774, 1994.
LeCluyse et al., Cultured rat hepatocytes, in Models for Assessing Drug Absorption and Metabolism (Borchard et al. eds), pp 121–160, Plenum Press, New York, 1996.
Liu et al., Pharm. Res. Init. 13: S-393 (8003), 1996.
Liu et al., Hepatology 24: 370A (973), 1996.
Liu et al., Pharm. Res, 24: S-459 (3007), 1997.
Liu et al., Hepatology 26: 297A (675), 1997.
Liu et al., Pharm. Sci. 1: S-119, 1998.
Liu et al., Pharmaceutical Research, 15: 1533–1539, 1998.
Masuda et al., Cancer Res. 57: 3506–10, 1997.
Pang et al., J. Pharmacokinet. Biopharm. 5: 625–653, 1977.
Parkinson, A., Biotransformation of Xenobiotics in Casarett and Doull's Toxicology. The Basic Science of Poisons., 5^th Ed. (Klaassen, C. D. ed.) pp. 113–186, McGraw Hill, New York, 1996.
Pollack et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 18: 197–202, 1989.
Seglen, Methods in Cell Biology (13^th Ed., Prescott D. M. Eds.) pp. 30–78, Academic Press, New York, 1976.
Sidhu et al., Pharmacogenetics 5: 24–36, 1993.
Silver et al., ISSX Proceedings (San Diego, California USA) pp. 387, 1996.
Utesch et al., In Vitro Cell Dev. Biol. 27A: 858–863, 1991.

Es sollte klar sein, dass verschiedene Details der Erfindung verändert werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Weiterhin ist die vorhergehende Beschreibung lediglich zu illustrativen Zwecken dargelegt, und nicht zum Zwecke der Beschränkung – die Erfindung ist durch die beiliegenden Ansprüche definiert.

Claims

Verfahren zum Screening einer Kandidatenverbindung in vitro bezüglich ihrer Empfindlichkeit gegenüber einer in vivo-Gallenausscheidung, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (a) Etablieren von ersten und zweiten Kulturen von Hepatocyten in Inkubationsmedium, wobei jede Kultur zumindest ein Gallenkanälchen umfaßt, und wobei die erste Kultur intakte Gallenkanälchen aufweist und die zweite Kultur zerstörte Gallenkanälchen aufweist; (b) Aussetzen einer Kandidatenverbindung gegenüber der ersten Kultur und der zweiten Kultur für eine Zeitspanne (T), die ausreichend ist, um die Aufnahme der Kandidatenverbindung zu ermöglichen; (c) Waschen und darauf Lysieren der ersten und zweiten Kulturen; (d) Messen einer Menge der Kandidatenverbindung, die in einem Lysat vorliegt, das aus jeder der Kulturen in Schritt (c) gewonnen wurde; und (e) Berechnen eines biliären Clearance-Wertes, der aus der ersten Kultur mit intakten Gallenkanälchen und der zweiten Kultur mit zerstörten Gallenkanälchen abgeleitet ist, unter Verwendung der Menge an Kandidatenverbindung in jedem Kulturlysat, die in Schritt (d) gemessen wurde, wobei die biliäre Clearance durch die Menge an Kandidatenverbindung, die in die intakten Gallenkanälchen ausgeschieden wurde, geteilt durch die Fläche unter der Kurve (AUC) der Kandidatenverbindung im Inkubationsmedium berechnet wird, wobei der berechnete biliäre Clearance-Wert die Empfindlichkeit der Kandidatenverbindung gegenüber einer Gallenausscheidung in vivo anzeigt.
Verfahren zum Screening eines Metaboliten einer Kandidaten-Stammverbindung in vitro für die Empfindlichkeit gegenüber einer in vivo Gallenausscheidung, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: (a) Etablieren eines ersten Satzes und eines zweiten Satzes von zwei Kulturen von Hepatocyten in Inkubationsmedium, wobei jede Kultur zumindest ein Gallenkanälchen umfaßt, wobei eine erste Kultur innerhalb jedes Satzes intakte Gallenkanälchen aufweist und eine zweite Kultur innerhalb jedes Satzes zerstörte Gallenkanälchen aufweist; (b) Exponieren einer Kandidaten-Stammverbindung gegenüber der ersten Kultur und der zweiten Kultur jedes Satzes für eine Zeit (T), die ausreichend ist, um die Aufnahme der Kandidaten-Stammverbindung zu ermöglichen; (c) Induzieren von Phase I, Phase II oder der Aktivität metabolischer Transportenzyme oder Kombinationen hiervon in den Hepatocyten des ersten Satzes von Kulturen; (d) Waschen und Lysieren der ersten und zweiten Kulturen jedes Satzes; (e) Messen einer Menge an Kandidaten-Stammverbindung, die in einem Lysat vorliegt, das aus jeder Kultur in Schritt (d) gewonnen wird; (f) Messen einer Menge des Metaboliten der Kandidaten-Stammverbindung, die in einem Lysat vorliegt, das aus jeder Kultur in Schritt (d) gewonnen wurde; (g) Berechnen eines biliären Clearance-Wertes, abgeleitet aus der ersten Kultur, die intakte Gallenkanälchen aufweist und der zweiten Kultur, die zerstörte Gallenkanälchen aufweist, unter Verwendung der Menge einer Kandidaten-Stammverbindung in jedem Kulturlysat gemessen in (e), wobei der berechnete biliäre Clearance-Wert die Empfänglichkeit der Kandidaten-Stammverbindung gegenüber einer Gallenausscheidung anzeigt; und (h) Berechnen eines biliären Clearance-Wertes, abgeleitet aus der ersten Kultur, die intakte Gallenkanälchen aufweist, und der zweiten Kultur, die zerstörte Gallenkanälchen aufweist, unter Verwendung der Menge des Metaboliten der Kandidaten-Stammverbindung in jedem Kulturlysat, gemessen in Schritt (f), wobei der berechnete biliäre Clearance-Wert die Empfindlichkeit des Metaboliten der Kandidaten-Stammverbindung gegenüber einer Gallenausscheidung in vivo anzeigt, wobei die biliäre Clearance in Schritt (g) und (h) durch die Menge an Kandidatenverbindung, die in die intakten Gallenkanälchen ausgeschieden wird, geteilt durch die Fläche unter der Kurve (AUC) der Kandidatenverbindung im Inkubationsmedium berechnet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Hepatocyten aus einer Quelle isoliert werden, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Ratten, Menschen, Affen, Menschenaffen, Katzen, Hunden, Schweinen, Borstenvieh, Rindern, Ochsen, Schafen, Pferden, Truthähnen, Hühnern, Enten und Gänsen besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Kultur der Hepatocyten weiterhin eine Langzeitkultur von Hepatocyten umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Kultur der Hepatocyten weiterhin ein kanalikuläres Netzwerk umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Kultur der Hepatocyten weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, daß sie eine Konfiguration aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Clustern von Hepatocyten, Aggregaten von Hepatocyten, zumindest einer Schicht von Hepatocyten und Kombinationen hiervon besteht.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Hepatocyten in eine Matrix eingebettet sind.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Kultur der Hepatocyten weiterhin eine Sandwichkultur von Hepatocyten umfaßt, wobei die Sandwichkultur zumindest eine Schicht von Hepatocyten und zumindest ein Gallenkanälchen mit der zumindest einen Schicht von Hepatocyten umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Sandwichkultur von Hepatocyten weiterhin eine Langzeitsandwichkultur von Hepatocyten umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei zumindest eine Schicht von Hepatocyten zwischen zwei Schichten einer Matrix als Sandwich ausgebildet ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Matrix aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem biologischen Matrixmedium, einem synthetischem Matrixmedium und Kombinationen hiervon besteht.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das biologische Matrixmedium aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Kollagenen, Lamininen, von Basalmembranen abgeleiteten Komplexen, Derivaten hiervon und Kombinationen hiervon besteht.
Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Schritte (a) bis (d) in zumindest einem Well einer Multi-Well-Platte durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 2, das weiterhin das Screening einer Vielzahl von Kandidaten-Stammverbindungen und einer Vielzahl von Metaboliten der Kandidaten- Stammverbindungen gleichzeitig bezüglich ihrer Empfindlichkeit gegenüber einer Gallenausscheidung umfaßt.
Verfahren nach einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche, das weiterhin den Schritt umfaßt, zwischen einer Kandidatenverbindung, die nicht in der Galle ausgeschieden wird, einer Kandidatenverbindung, die in der Galle in hohem Maße ausgeschieden wird und einer Kandidatenverbindung, die wiederholt und ausgiebig in der Galle ausgeschieden wird, unter Verwendung des biliären Clearance-Wertes zu differenzieren.