CN111615528A - 树枝状聚合物递送系统和其使用方法 - Google Patents

树枝状聚合物递送系统和其使用方法 Download PDF

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R·莎玛
A·莎玛
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Abstract

提供了含有高密度表面羟基的低代树枝状聚合物和其合成方法。具体地，描述了在相对低代下具有高表面官能团的低聚乙二醇(OEG)样树枝状聚合物(例如，在三代下约120个羟基，大小仅为1‑2nm)。还描述了包含一种或多种预防剂、治疗剂和/或诊断剂的树枝状聚合物调配物和其使用方法。所述调配物适合于局部、肠内和/或肠胃外递送，以治疗眼、脑和神经系统(CNS)的一种或多种疾病、病状和损伤，具体地与小胶质细胞和星形胶质细胞的病理活化相关的那些疾病、病状和损伤。

Description

树枝状聚合物递送系统和其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年11月10日提交的美国申请第62/584,623号的权益和优先权，该申请以全文引用的方式并入本文中。
关于联邦政府资助研究的声明
本发明是在由美国国立卫生研究院授予的授权号NIBIB-1R01EB018306-01、NICHD-1R01HD076901-01A1和5R01EY025304-04下由政府支持进行的。政府享有本发明的某些权利。
序列表的引用
创建于2018年11月12日并且大小为3,792字节的以命名为“JHU_C_14798_ST25.txt”的文本文件提交的序列表根据37C.F.R.§1.52(e)(5)通过引用特此并入。
技术领域
本发明总体上涉及分子递送系统领域，并且更具体地，涉及用于将预防剂、治疗剂和/或诊断剂递送到受试者的中枢神经系统以预防、治疗和/或诊断疾病和/或病状的树枝状聚合物。
背景技术
中枢神经系统(CNS)病症影响着全球预计10亿人，并且预计未来将成为人口更严重的威胁。CNS疾病通常与高度复杂的人脑的改变或退化相关，并且对科学家和临床医生构成了巨大挑战。在主要死亡原因中，CNS病症在当前临床护理与患者需求之间的一些差距增长最快。这在很大程度上是由于寿命延长，从而导致患有神经性疾病的患者数量激增，并且导致全世界社会经济和医疗负担的增加(W.M.Pardridg,《今日药物发现(Drug DiscoveryToday)》,12,54(2007))。从商业角度出发，应该期望制药组织在神经治疗学的发现、开发和转化方面做出积极的努力，但与此相反，由于后期临床试验失败的风险很高，许多这些制药组织已经暂停或减少了其对CNS项目的投资(G.Wegener等人,《国际神经精神药理学杂志(International Journal of Neuropsychopharmacology)》,16,1687(2013))。在开发针对CNS疾病(如自身免疫性疾病、脑瘤和眼部病症)的疗法方面的主要临床挑战是实现治疗剂到损伤位点的临床相关暴露，由于CNS转运屏障，难以进入损伤位点。神经药物通过几乎不可渗透的CNS屏障的不良转运限制了CNS病症(从原发性脑瘤到神经性疾病和视网膜疾病)的有效治疗的发展。血脑屏障(BBB)(神经药物开发的主要障碍)是动态且具高度选择性的物理屏障，该物理屏障通过调节化学品的摄取并且限制毒素和血源性病原体的进入来维持脑组织稳态(W.A.Banks,《自然·综述：药物发现(Nature Reviews Drug Discovery)》,15,275(2016))。将药物递送到CNS的其它部位面临类似的挑战，如对于治疗眼病的血视网膜屏障(BRB)和病理依赖性屏障(如传统的实体瘤屏障)。
尽管神经科学领域在理解脑的构成、作用和功能方面取得了惊人的进步，但神经性病症领域的治疗性发展仍落后于其它疾病领域(如传染病、癌症和心血管病症)的治疗。大多数脑相关的病症属于由美国食品和药物监督管理局(“FDA”)鉴定的孤儿病或罕见病症类别。与任何其它疾病领域相比，CNS药物的发现和临床开发在临床前和临床上的靶向性、安全性、功效、成本和失败风险方面均对制药公司构成了巨大挑战。因此，在过去的十年中，各种大型制药公司中止了CNS药物的发现和开发项目(Wegener,G.等人,《国际神经精神药理学杂志》,16,1687(2013))。此外，药物通过血脑屏障(“BBB”)的不良转运限制了针对CNS相关病症的有效治疗的开发(Upadhyay,R.K.《国际生物医学研究(BioMed ResearchInternational)》,869269(2014))。非常需要开发基于疾病病理学的创新方法，以便跨BBB适合地递送治疗剂来治疗神经性病症。
神经性病症的大多数治疗需要高剂量施用，从而导致全身性副作用和毒性。规避CNS屏障的常规方法是高度侵袭性的，由此造成进一步的附带损害，并且由于并发症的高风险限制了重复治疗方案中可能的剂量数量。局部施用的疗法通常还表现出通过脑实质的不良扩散，从而导致有限的脑部分布并且需要导致毒性的高剂量。专注于使用化学方法或机械方法暂时破坏BBB的最新策略在空间上通常是非特异性的，还允许不期望的潜在有害分子进入，并且可能诱导有害的免疫应答(X.Dong,《治疗诊断学(Theranostics)》,8,1481(2018))。现有的神经性病症的疗法的临床上显著的差异构成对开发创新性、侵袭性较小的专用药物递送媒剂的迫切需要，该药物递送媒剂可以增强跨CNS屏障的治疗剂递送，并且靶向损伤位点处的关键病变细胞。
由活化的小胶质细胞/巨噬细胞(mi/ma)介导的神经炎症是许多神经性病症的主要标志(M.T.Heneka等人,《自然·综述(Nature Reviews)》2014,14,463(2014)；R.M.Ransohoff,《科学(Science)》,353,777(2016))。促炎性mi/ma活化破坏BBB/BRB，并且可能通过向神经元和胶质释放凋亡信号引起继发性损害。抗炎活化促进血管形成和细胞生长，同时抑制免疫应答。因此，用免疫调节剂靶向促炎和抗炎mi/ma表型两者是对疾病病理具有特异性的有效治疗策略。可以在全身性施用后有效地穿透CNS屏障、在脑组织中自由扩散并且定位于CNS损伤位点处的关键病理细胞的纳米载剂极为罕见(S.Kannan等人,《科学转化医学(Science translational medicine)》,4,130ra46E(2012)；J.Kwon等人,《ACS纳米(ACS Nano.)》2016,10,7926；Y.Anraku等人,《自然·通讯(Nature Communications)》8,1001(2017))。除了有利的脑转运特性之外，开发基于纳米药物的针对CNS病症的治疗剂的关键目标是设计可以便利地转化到临床的纳米构建体。有待用于临床设置中的潜在纳米颗粒的主要标准是其安全特性；其它期望的特征包含水溶性、合成再现性和成功商业化的大规模生产的可行性(S.Mignani等人,《先进药物递送评论(Advanced Drug DeliveryReviews)》(2017))。
基于其独特的结构特征和物理特征，树枝状聚合物已经显示出作为各种生物医学应用(包含靶向的药物/基因递送、成像和诊断)的纳米载剂的前所未有的潜力(Sharma,A.等人,《RSC进展(RSC Advances)》,4,19242(2014)；Caminade,A.-M.等人,《材料化学杂志B(Journal of Materials Chemistry B)》,2,4055(2014)；Esfand,R.等人,《今日药物发现》,6,427(2001)；以及Kannan,R.M.等人,《内科医学杂志(Journal of InternalMedicine)》,276,579(2014))。
然而，尽管发表了大量关于构建体树枝状聚合物的简易且快速策略的开发的科学报告，但仍然存在重大的挑战。因此，仍然需要用于靶向的递送系统的经过改进的纳米材料以靶向CNS。
因此，本发明的目的是提供树枝状聚合物组合物和其使用方法，以改进向CNS的分子递送。
本发明的目的是还提供治疗脑和中枢神经系统的疾病、病症和损伤的手段，具体地与活化的小胶质细胞和/或星形胶质细胞相关的那些疾病、病症和损伤。
本发明的另外的目的是提供生物相容性和廉价的纳米材料，以将靶向的药物递送到中枢神经系统而几乎没有局部毒性或全身性毒性。
发明内容
描述了树枝状聚合物，这些树枝状聚合物具有至少1个OH基团/nm3(羟基数量/以nm3为单位的体积)、优选地至少5个OH基团/nm3的高密度羟基。通常，这些树枝状聚合物的分子量介于约500道尔顿到约100,000道尔顿之间、优选地介于约500道尔顿到约50,000道尔顿之间、最优选地介于约1,000道尔顿到约10,000道尔顿之间。通常，这些树枝状聚合物的平均直径介于约1nm与约15nm之间、优选地介于约1nm与约5nm之间、最优选地介于约1nm与约2nm。
描述了树枝状聚合物，这些树枝状聚合物包含：(a)中央核；(b)一个或多个支化单元；以及(c)端官能团。(a)、(b)和(c)的示例性化学部分独立地选自：二季戊四醇、季戊四醇、2-(氨基甲基)-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇、2-乙基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇、3,3',3”,3”'-硅烷四基四(丙烷-1-硫醇)、3,3-二乙烯基戊-1,4-二烯、3,3',3”-次氮基三丙酸、3,3',3”-次氮基三(N-(2-氨基乙基)丙酰胺)、3,3',3”,3”'-(乙烷-1,2-二基双(氮杂三基))四丙酰胺、3-(羧甲基)-3-羟基戊二酸、2,2'-((2,2-双((2,2-羟乙氧基)甲基)丙烷-1,3-二基)双(氧基))双(乙-1-醇)、四(3-(三氯甲硅烷基)丙基)硅烷、1-硫代甘油、2,2,4,4,6,6-六氯-1,3,5,215,415,615-三氮杂三膦杂环己三烯、3-(羟甲基)-5,5-二甲基己烷-2,4-二醇、4,4',4”-(乙烷-1,1,1-三基)三苯酚、2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪、5-(羟甲基)苯-1,2,3-三醇、5-(羟甲基)苯-1,3-二醇、1,3,5-三(二甲基(乙烯基)甲硅烷基)苯、碳硅氧烷核、次氮基三甲醇、乙二胺、丙烷-1,3-二胺、丁烷-1,4-二胺、2,2',2”-次氮基三(乙-1-醇)、α环糊精、β环糊精、γ环糊精、葫芦脲、苯-1,2,3,4,5,6-六硫醇、单糖、二糖、三糖、寡糖、壳聚糖以及其衍生物。在一些实施例中，这些树枝状聚合物是1代(G1)、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9或G10树枝状聚合物。
这些树枝状聚合物的表面羟基密度介于约1个羟基(-OH)基团/nm2与15个OH基团/nm2之间、介于约3个OH基团/nm2与15个OH基团/nm2之间、介于约4个OH基团/nm2与15个OH基团/nm2之间、介于约4个OH基团/nm2与10个OH基团/nm2之间、至少1个OH基团/nm2；至少2个OH基团/nm2；至少3个OH基团/nm2；至少4个OH基团/nm2；至少5个OH基团/nm2；并且分子量介于约500道尔顿与约100,000道尔顿之间、介于约500道尔顿与约50,000道尔顿之间、介于约1,000道尔顿与约20,000道尔顿之间、介于约1000道尔顿与约10,000道尔顿之间。
计算表面羟基的方法是本领域已知的。首先计算树枝状聚合物的表面积。在PAMAM树枝状聚合物的情况下，可以假定为球形来计算表面积。G4羟基封端的PAMAM树枝状聚合物的分子量为约14,215道尔顿，所测得直径为
Figure BDA0002578439840000041
(即，4.5nm)，并且具有64个表面羟基。通过式A＝47πr2计算假定为球形形状的G4 PAMAM树枝状聚合物的估计的表面积，因此其为约63.62nm2。因此，G4 PAMAM树枝状聚合物上的羟基的表面密度为约1.01个OH基团/nm2。同样，分子量为约28,826道尔顿、所测得直径为
Figure BDA0002578439840000051
(即，5.4nm)并且表面羟基为128个的G5羟基封端的PAMAM树枝状聚合物的羟基的表面密度为约1.4个OH基团/nm2(基于91.61nm2的估计表面积)。分子量为约58,048道尔顿、所测得直径为
Figure BDA0002578439840000052
(即，6.7nm)并且表面羟基为256个的G6羟基封端的PAMAM树枝状聚合物的羟基的表面密度为约1.82个OH基团/nm2(基于141.03nm2的估计表面积)。
还提供了树枝状聚合物复合物的组合物，这些组合物包含包封、缔合和/或缀合在树枝状聚合物中的一种或多种预防剂、治疗剂和/或诊断剂。通常，一种或多种预防剂、治疗剂和/或诊断剂以按重量计约0.01％到约30％、优选地约1％到约20％、更优选地约5％到约20％的浓度包封、缔合和/或缀合在该树枝状聚合物复合物中。优选地，预防剂、治疗剂和/或诊断剂通过一个或多个选自由以下组成的组的键与该树枝状聚合物共价地缀合：二硫、酯、醚、硫酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、肼和酰胺，任选地通过一个或多个间隔子。在一些实施例中，该间隔子是预防剂、治疗剂和/或诊断剂，如N-乙酰半胱氨酸。示例性活性剂包含抗炎药、化学治疗剂、抗癫痫剂、血管扩张剂和抗感染剂。
还描述了使用具有高密度表面羟基的树枝状聚合物通过向有需要的受试者施用以治疗、预防和/或成像眼、脑和/或中枢神经系统(CNS)的一种或多种疾病、病状和/或损伤的一种或多种症状的方法。通常，这些病状与小胶质细胞和星形胶质细胞的病理活化相关。这些组合物靶向活化的小胶质细胞和星形胶质细胞；并且有效地缓解或预防或成像该眼、该脑和/或该神经系统的与活化的小胶质细胞和星形胶质细胞相关的这些一种或多种疾病、病状和/或损伤的一种或多种症状。通常，这些树枝状聚合物复合物是静脉内施用的。
附图说明
图1A-1E是(图1A)基于低代高密度PEG的树枝状聚合物(D2-OH-60)、(图1B)商业上可获得的双-MPA-G4-OH-64-超支化聚酯、(图1C)4代PAMAM树枝状聚合物、(图1D)8臂星形PEG(8-OH基团)、(图1E)线性PEG(2-OH基团)和(图1F)具有多个OH基团的支化多糖右旋糖酐的结构表示。
图2是条形图，其示出了出生后第1天在4小时和24小时时间点通过每克组织静脉内注射剂量的百分比所测得的CP兔幼仔中D2-OH-60-Cy5、双-MPA-G4-OH64-Cy5和PAMAM-G4-OH64-Cy5在脑的三个子区域(皮质、脑室周围区域和海马体)中的比较定量分布。
图3是条形图，其示出了出生后第1天在24小时时间点通过每克组织静脉内注射剂量的百分比所测得的CP兔幼仔相对于健康兔幼仔中D2-OH-60-Cy5、双-MPA-G4-OH64-Cy5和PAMAM-G4-OH64-Cy5在脑的三个子区域(皮质、脑室周围区域和海马体)中的比较定量分布。
图4是条形图，其示出了出生后第1天在4小时和24小时时间点通过每克组织静脉内注射剂量的百分比所测得的CP兔幼仔的主要器官(心脏、肺、肾脏和肝)和血浆中的D2-OH-60-Cy5、双-MPA-G4-OH64-Cy5和PAMAM-G4-OH64-Cy5在脑的三个子区域(皮质、脑室周围区域和海马体)中的比较定量分布。
图5是条形图，其示出了用浓度增加的PEGOL-60处理24小时的BV-2细胞的MTT细胞活力测定结果。n＝3。
图6A-6J是条形图，其示出了单独的PEGOL-60(即无药物)在体外显示出抗炎和抗氧化特性：用100ng/ml LPS刺激BV2鼠类小胶质细胞持续3小时，随后用树枝状聚合物共处理持续24小时；图6A-6D示出了用对照、LPS或10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、500μg/mlPEGOL-60处理24小时的BV-2细胞中TNFα(图6A)、INOS(图6B)、IL10(图6C)和IL6(图6D)的mRNA水平的变化倍数；图6E-6G示出了用对照、LPS或10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、500μg/mlPEGOL-60处理24小时的BV-2细胞中CD206(图6E)、Argl(图6F)和IL4(图6G)的mRNA水平的变化倍数；图6H-6I示出了用对照、LPS或10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、500μg/ml PEGOL-60处理24小时的BV-2细胞中分泌性TNFα的量(图6H)和反应性物种亚硝酸盐的产生(图6I)；图6J示出了用对照、H2O2或10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、500μg/ml PEGOL-60处理24小时的BV-2细胞的细胞活力。
图7A-7F是条形图，其示出了PEGOL-60在CP模型中的体内功效，其中在PND1，将CP幼仔的同窝仔畜随机地分为PBS、PEGOL-60单剂量组和PEGOL-60重复剂量组，并且分别接受PBS(PND1)、PEGOL-60(PND1)或PEGOL-60(PND1和PND3)。在处理之前(基线，0小时)以及处理后24小时、48小时和96小时(n＝6)进行神经行为测试，包含处理后24小时、48小时和96小时各组的吮吸和吞咽(图7A)、头部移动(图7B)和体重增加(图7C)。测量在PND5(n＝3)各组间包含TNF-α(图7D)、IL-1β(图7E)和IL-6(图7F)的促炎细胞因子。
图8A-8B是条形图，图8A示出了在注射后的不同时间点(1小时、4小时和24小时，n＝6)，与年龄匹配的健康对照相比(n＝4)，具有脑性瘫痪的新生兔幼仔中PEGOL-60-Cy5在脑的三个子区域(皮质、PVR和海马体)中的定量生物分布；图8B示出了在注射后的不同时间点(1小时、4小时和24小时，n＝6)新生脑性瘫痪兔幼仔的主要器官和血浆中PEGOL-60-Cy5的定量生物分布。
具体实施方式
I.定义
术语“药学上可接受的”是指根据如食品和药物管理局等机构的指导方针在合理的医学判断范围内、适合于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症的、与合理的益处/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。术语“载剂”或“赋形剂”是指调配物中的有机或无机、天然或合成的非活性成分，其中一种或多种活性成分与其组合。在一些实施例中，载剂或赋形剂是添加到药物组合物中以促进化合物的施用和/或不对生物体造成显著刺激并且不消除所施用化合物的生物活性和特性的惰性物质。
术语“生物相容性”和“生物上相容的”通常是指通常对接受者无毒并且不对接受者造成任何显著的不利影响的材料连同其任何代谢物或降解产物。通常而言，生物相容性材料是当施用于患者时不引发显著的炎性或免疫应答的材料。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指化合物的无毒但足以提供所期望或参考结果的量。例如，有效量可以指足以减轻或抑制所治疗的病症、疾病或病状的一种或多种症状或以其它方式提供所期望的药理效应和/或生理效应的剂量。精确剂量将根据多种因素而变化，如受试者依赖性变量(例如，年龄、免疫系统健康状况等)、所治疗疾病或病症的严重程度以及施用途径和所施用药剂的药代动力学。所需的确切量因受试者而异，这取决于受试者的物种、年龄和总体状况、所治疗疾病的严重程度、所使用的特定化合物和其施用模式。适当的有效量可以由本领域的普通技术人员确定。
除非另外指明，否则术语“分子量”通常是指本体聚合物的相对平均链长。在实践中，可以使用各种方法(包含凝胶渗透色谱法(GPC)或毛细管测粘法)估计或表征分子量。GPC分子量报告为与数均分子量(Mn)相反的重均分子量(Mw)。毛细管测粘法提供对分子量的估计，作为使用一组特定的浓度、温度和溶剂条件由稀释聚合物溶液确定的固有粘度。
术语“衍生物”是指包含但不限于所公开化合物的水解产物、还原产物或氧化产物的修饰。水解反应、还原反应和氧化反应是本领域已知的。
术语“亲水性”是指对水具有亲和力的特性。例如，亲水性聚合物(或亲水性聚合物链段)是主要可溶于水溶液和/或具有吸水趋势的聚合物(或聚合物链段)。通常，聚合物越亲水，该聚合物越倾向于溶解于水、与水混合或被水润湿。
术语“疏水性”是指对水缺乏亲和力或排斥水的特性。例如，聚合物(或聚合物链段)越疏水，该聚合物(或聚合物链段)越倾向于不溶于水、不与水混合或不被水润湿。
术语“治疗剂”是指可以被施用以预防或治疗疾病或病症的药剂。治疗剂可以是核酸、核酸类似物、小分子、拟肽、蛋白质、肽、碳水化合物或糖、脂质或表面活性剂或其组合。
术语“治疗”或“预防”疾病、病症或病状的一种或多种症状在可能易患该疾病、病症和/或病状但尚未被诊断为患有该疾病、病症或病状的动物中发生；抑制该疾病、病症或病症，例如阻碍其进展；并且缓解该疾病、病症或病状，例如使该疾病、病症和/或病状消退。治疗疾病或病状包含改善特定疾病或病状的至少一种症状，即使潜在的病理生理学没有受到影响，如通过施用镇痛剂来治疗受试者的疼痛，即使此类药剂不治疗疼痛的原因。
术语“靶向部分”是指定位于特定位置或远离该特定位置的部分。该部分可以是例如蛋白质、核酸、核酸类似物、碳水化合物或小分子。该位置可以是组织、特定的细胞类型或亚细胞区室。
术语“掺入”和“包封”是指将药剂掺入、调配或以其它方式包含在组合物中和/或组合物上，而不考虑掺入药剂或其它材料的方式。
II.组合物
A.树枝状聚合物
树枝状聚合物是包含表面端基的三维、超支化、单分散、球状和多价大分子(Tomalia,D.A.等人,《生物化学会汇刊(Biochemical Society Transactions)》,35,61(2007)；以及Sharma,A.等人,《ACS Macro快报(ACS Macro Letters)》,3,1079(2014))。由于其独特的结构特征和物理特征，树枝状聚合物已经显示出作为各种生物医学应用(包含靶向的药物/基因递送、成像和诊断)的纳米载剂的前所未有的潜力(Sharma,A.等人,《RSC进展》,4,19242(2014)；Caminade,A.-M.等人,《材料化学杂志B》,2,4055(2014)；Esfand,R.等人,《今日药物发现》,6,427(2001)；以及Kannan,R.M.等人,《内科医学杂志》,276,579(2014))。
树枝状聚合物正在成为各种生物医学应用(包含药物/基因传递、靶向、成像和诊断)的潜在候选物(oliman,GM等人,《化学通讯(Chem.Commun.)》2011,47,9572；以及Tomalia,DA等人,《生物化学会汇刊》2007,35,61)。在若干种不同类型的树枝状聚合物中，由于其商业可获得性、水溶性和生物相容性，已经广泛探索了将聚氨基胺(PAMAM)树枝状聚合物用于药物递送应用(Tomalia,DA等人,《聚合物杂志(Polym J)》1985,17,117)。小尺寸和易于调节的多个表面基团的存在使这些纳米颗粒成为将药物转运到CNS的极佳载剂。早期研究示出，非细胞毒性、羟基封端的4代PAMAM树枝状聚合物(约4nm大小，无任何靶向配体)可以穿过受损的BBB，并且靶向脑中的损伤位点处的活化的小胶质细胞(比健康对照多几倍)(Lesniak,WG等人,《分子药剂学(Mol Pharm.)》2013,10)。这些树枝状聚合物即使在静脉内剂量>500mg/kg时也是无毒的，并且通过肾脏被完整清除。这些发现在各种小型和大型动物模型中得到了验证(Kannan,S等人,《科学转化医学》2012,4,130ra46；Kambhampati,SP等人,《眼科学和视觉科学研究(Invest Ophthalmol Vis Sci)》2015,56；Nance,E等人,《控释杂志(J.Control.Release)》2015,214,112；Mishra,MK等人,《ACS纳米》2014,8,2134；以及《纳米医学(Nanomedicine)》2010,5,1317)。这些中性树枝状聚合物在活化的小胶质细胞中的选择性摄取和定位可能归因于其穿过受损的BBB并且在脑实质中迅速扩散、随后被持续吞噬的活化的胶质细胞摄取的能力。
最近的研究示出，树枝状聚合物表面基团可以对其生物分布产生重大影响(Nance,E.等人,《生物材料(Biomaterials)》,101,96(2016))。更具体地说，与健康对照相比，在脑性瘫痪(CP)的兔模型中全身性施用后，不具有任何靶向配体的羟基封端的4代PAMAM树枝状聚合物(约4nm大小)已经显示出穿过受损的BBB显著更多(>20倍)，并且选择性地靶向活化的小胶质细胞和星形胶质细胞(Lesniak,W.G.等人,《分子药剂学》,10(2013))。参见Kannan,S.等人,《科学转化医学》,4,130ra46(2012)；Iezzi,R.等人,《生物材料》,33,979(2012)；Mishra,M.K.等人,《ACS纳米》,8,2134(2014)；Kambhampati,S.P.等人,《欧洲药学和生物药理学杂志(European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics),95,B部分,239(2015)》；Zhang,F.等人,《控释杂志》,249,173(2017)；Guo,Y等人,《公共科学图书馆·综合(PLOS ONE)》,11,e0154437(2016)；以及Inapagolla,R.等人,《国际药学研究杂志(International Journal of Pharmaceutics)》,399,140(2010)。
术语“树枝状聚合物”包含但不限于具有内部核和连接到此内部核并且从此内部核延伸的重复单元的层(或“代”)的分子架构，每一层具有一个或多个支化点和连接到最外代的端基的外表面。在一些实施例中，树枝状聚合物具有规则的树枝状聚合物或“星放射状”分子结构。
通常，树枝状聚合物的直径为约1nm到约50nm、更优选地约1nm到约20nm、约1nm到约10nm或约1nm到约5nm。在一些实施例中，直径介于约1nm到约2nm之间。在优选实施例中，树枝状聚合物的直径有效地穿过血脑屏障(“BBB”)并且在靶细胞中保留延长的时间段。
在优选实施例中，树枝状聚合物包含多个羟基。一些示例性含有高密度羟基的树枝状聚合物包含商业上可获得的聚酯树突状的聚合物，如超支化2,2-双(羟基-甲基)丙酸聚酯聚合物(例如，超支化双-MPA聚酯-64-羟基，4代)、树突状的聚甘油。
在一些实施例中，含有高密度羟基的树枝状聚合物是低聚乙二醇(OEG)样树枝状聚合物。例如，可以使用高效、稳健和原子经济的化学反应(如Cu(I)催化的炔烃-叠氮化物点击和光催化的硫醇-烯点击化学)合成2代OEG树枝状聚合物(D2-OH-60)。通过使用正交超单体和超核策略，可以在最少的反应步骤中以非常低的代获得高密度的多元醇树枝状聚合物。这种树枝状聚合物主链具有贯穿该结构的不可裂解的聚醚键，以避免树枝状聚合物在体内崩解，并且允许将这种树枝状聚合物作为单一实体从身体中消除(不可生物降解)。在优选实施例中，树枝状聚合物如下文式I所示。
Figure BDA0002578439840000111
示例性树枝状聚合物包含但不限于聚氨基胺(PAMAM)、聚酯、聚赖氨酸、聚丙胺(POPAM)、聚(丙烯亚胺)(PPI)、蝶烯(iptycene)、脂肪族聚(醚)和/或芳香族聚醚树枝状聚合物。树枝状聚合物可以具有羧基、胺和/或羟基端。树枝状聚合物可以为任何代，包含但不限于1代、2代、3代、4代、5代、6代、7代、8代、9代或10代。在一些实施例中，树枝状聚合物是用作平台的PAMAM树枝状聚合物，并且用表面基团改性以增加羟基的数量。
树枝状聚合物复合物的每个树枝状聚合物可以具有与其它树枝状聚合物类似或不同的化学性质(例如，第一树枝状聚合物可以包含PAMAM树枝状聚合物，而第二树枝状聚合物可以包含POPAM树枝状聚合物)。在一些实施例中，第一树枝状聚合物或第二树枝状聚合物可以进一步包含另外的药剂。多臂PEG聚合物包含具有至少两个带有巯基或硫代吡啶端基的支链的聚乙二醇；然而，可以使用带有其它端基(如琥珀酰亚胺基或马来酰亚胺端)的PEG聚合物。可以使用分子量范围为10kDa到80kDa的PEG聚合物。
通常，树枝状聚合物的完整架构可以区分为内核部分，然后是径向连接的支化单元(即，代)，这些支化单元进一步用在树枝状聚合物的外表面处带有所期望端基的化学官能团修饰。
在一些实施例中，树枝状聚合物呈纳米颗粒形式，并且在美国公开申请第US2011/0034422号、第US 2012/0003155号和第US 2013/0136697中进行了详细描述。
可以改变树枝状聚合物的分子量以制备聚合物纳米颗粒，这些聚合物纳米颗粒形成具有针对特定应用而优化的特性(如药物释放速率)的颗粒。树枝状聚合物的分子量可以介于约150Da与1MDa之间。在某些实施例中，聚合物的分子量介于约500Da与约100kDa之间、更优选地介于约1kDa与约50kDa之间、最优选地介于约1kDa与约20kDa之间。
在一些实施例中，将树枝状聚合物的不同变型用作递送媒剂以递送一种或多种活性剂，包含但不限于树突和核壳构造树枝状分子(tectodendrimer)。树突是树突状的楔形物，这些树枝状楔形物包括在核(官能团，f＝l)处的一种类型的功能和在外围(f＝8、16、32等)处的另一种类型的功能。核壳构造树枝状分子通常由中央树枝状聚合物构成，该中央树枝状聚合物具有连接在其外围处的多个树枝状聚合物。在一些实施例中，如N-乙酰基半胱氨酸等活性剂与树突或核壳构造树枝状分子缀合。
1.中央核
多官能核部分允许围绕核逐步添加支化单元(即，代)。PAMAM的核是二胺(通常是乙二胺)，该二胺与丙烯酸甲酯反应，并且然后与另一种乙二胺反应以产生0代(G-0)PAMAM。核部分可以适当地用不同的化学部分替代。例如，PAMAM树枝状聚合物可以使用点击化学在核处含有四(环氧乙烷)(Han SC等人,《韩国化学会通报(Bull.Korean Chem.Soc.)》33,3501-3504(2012))。
表1中列出了适合作为核部分的示例性化学结构，包含二季戊四醇、季戊四醇、2-(氨基甲基)-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇、2-乙基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇、3,3',3”,3”'-硅烷四基四(丙烷-1-硫醇)、3,3-二乙烯基戊-1,4-二烯、3,3',3”-次氮基三丙酸、3,3',3”-次氮基三(N-(2-氨基乙基)丙酰胺)、3,3',3”,3”'(乙烷-1,2-二基双(氮杂三基))四丙酰胺、3-(羧甲基)-3-羟基戊二酸、2,2'-((2,2-双((2-羟乙氧基)甲基)丙烷-1,3-二基)双(氧基))双(乙-1-醇)、四(3-(三氯甲硅烷基)丙基)硅烷、1-硫代甘油、2,2,4,4,6,6-六氯-1,3,5,215,415,615-三氮杂三膦杂环己三烯、3-(羟甲基)-5,5-二甲基己烷-2,4-二醇、4,4',4”-(乙烷-1,1,1-三基)三苯酚、2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪、5-(羟甲基)苯-1,2,3-三醇、5-(羟甲基)苯-1,3-二醇、1,3,5-三(二甲基(乙烯基)甲硅烷基)苯、碳硅氧烷核、次氮基三甲醇、乙二胺、丙烷-1,3-二胺、丁烷-1,4-二胺、2,2',2”-次氮基三(乙-1-醇)、α环糊精、β环糊精、γ环糊精、葫芦脲、苯-1,2,3,4,5,6-六硫醇、单糖、二糖、三糖、寡糖或其叠氮化物改性的部分、炔烃改性的部分。在一些实施例中，核部分是壳聚糖。因此，叠氮化物改性的壳聚糖或炔烃改性的壳聚糖适合于使用点击化学与支化单元缀合。在一些实施例中，核部分是乙二胺或四(环氧乙烷)。
在一些实施例中，核部分是如式II所示的直链或支链的聚乙烯甘油：
Figure BDA0002578439840000131
X可以是胺、酸、醛、醇、乙炔、烯丙基、丙烯酸盐、叠氮化物、甲苯磺酰基、甲磺酸盐、硫醇、N-羟基琥珀酰亚胺活化的酸、马来酰亚胺。
表1.合成羟基封端的树枝状聚合物的各种结构单元(核、支化单元、表面基团、单体)的结构表示
Figure BDA0002578439840000132
Figure BDA0002578439840000141
Figure BDA0002578439840000151
Figure BDA0002578439840000161
Figure BDA0002578439840000171
2.支化单元
表1中列出了适合作为支化单元的示例性化学结构，包含二季戊四醇、季戊四醇、2-(氨基甲基)-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇、2-乙基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇、3,3',3”,3”'-硅烷四基四(丙烷-1-硫醇)、3,3-二乙烯基戊-1,4-二烯、3,3',3”-次氮基三丙酸、3,3',3”-次氮基三(N-(2-氨基乙基)丙酰胺)、3,3',3”,3”'(乙烷-1,2-二基双(氮杂三基))四丙酰胺、3-(羧甲基)-3-羟基戊二酸、2,2'-((2,2-双((2-羟乙氧基)甲基)丙烷-1,3-二基)双(氧基))双(乙-1-醇)、四(3-(三氯甲硅烷基)丙基)硅烷、1-硫代甘油、2,2,4,4,6,6-六氯-1,3,5,215,415,615-三氮杂三膦杂环己三烯、3-(羟甲基)-5,5-二甲基己烷-2,4-二醇、4,4',4”-(乙烷-1,1,1-三基)三苯酚、2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪、5-(羟甲基)苯-1,2,3-三醇、5-(羟甲基)苯-1,3-二醇、1,3,5-三(二甲基(乙烯基)甲硅烷基)苯、碳硅氧烷核、次氮基三甲醇、乙二胺、丙烷-1,3-二胺、丁烷-1,4-二胺、2,2',2”-次氮基三(乙-1-醇)、α环糊精、β环糊精、γ环糊精、葫芦脲、苯-1,2,3,4,5,6-六硫醇、单糖、二糖、三糖、寡糖或其叠氮化物改性的部分、炔烃改性的部分。在一些实施例中，支化单元是壳聚糖。因此，叠氮化物改性的壳聚糖或炔烃改性的壳聚糖适合于使用点击化学与核部分或另外的相同或不同的支化单元缀合。在一些实施例中，支化单元是丙烯酸甲酯或乙二胺。
在一些实施例中，支化单元是如式II所示的直链或支链的聚乙烯甘油。
在一些实施例中，支化单元是超单体，即ABn结构单元。示例性超单体包含AB4、AB5、AB6、AB7、AB8结构单元。超单体策略极大地增加了可用端基的数量。示例性超单体是AB5正交超单体，该正交超单体包含一个叠氮官能团和五个烯丙基，该正交超单体通过使具有五个烯丙基的二季戊四醇与单甲苯磺酰化的三甘醇叠氮化物反应来制备(方案2)。
3.表面基团
表面基团或端官能团不限于伯胺端基、羟基端基、羧酸端基、硫醇端。在一些实施例中，可以通过用于核和支化单元的缀合方法中的一种方法添加所期望的表面基团。
表I中所列出的化学部分中的任一个化学部分可以用作通过上文所描述的常见缀合方法中的任一种缀合方法与一个或多个支化单元缀合的表面基团。在优选实施例中，表面基团是1-硫代甘油，其通过光化学硫醇-烯反应与一个或多个支化单元缀合。
在一些实施例中，树枝状聚合物能够特异性地靶向特定的组织区域和/或细胞类型，优选地中枢神经系统(CNS)和眼的细胞和组织。在一些实施例中，树枝状聚合物能够特异性地靶向身体的炎症位点，优选地CNS和眼的炎症位点。具有羟基端基的线性聚合物和星形聚合物不靶向脑和视网膜的受损细胞。然而，具有高密度羟基官能团的树枝状聚合物和树突状的聚合物以独立于代且也独立于结构单元的方式有效地靶向受损细胞。实例描述了关于新合成的树枝状聚合物如何似乎不仅靶向小胶质细胞和小噬细胞而且还靶向涉及脑损伤的其它细胞。
在优选实施例中，树枝状聚合物具有在这些树枝状聚合物的外围上的多个羟基(-OH)基团。羟基(-OH)基团的优选表面密度为至少1个OH基团/nm2(羟基表面基团的数目/以nm2为单位的表面积)。例如，在一些实施例中，羟基的表面密度大于2、3、4、5、6、7、8、9、10；优选地至少10、15、20、25、30、35、40、45、50或大于50。在另外的实施例中，羟基(-OH)基团的表面密度介于约1与约50之间，优选地5-20个OH基团/nm2(羟基表面基团的数量/以nm2为单位的表面积)，同时分子量介于约500Da与约10kDa之间。
在一些实施例中，树枝状聚合物可以具有暴露在外表面上的羟基的一部分，其中其它羟基位于树枝状聚合物的内部核中。在优选实施例中，树枝状聚合物的羟基(-OH)基团的体积密度为至少1个OH基团/nm3(羟基的数量/以nm3为单位的体积)。例如，在一些实施例中，羟基的体积密度为2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10、15、20、25、30、35、40、45和50。在一些实施例中，羟基的体积密度介于约4个基团/nm3到约50个基团/nm3之间，优选地介于约5个基团/nm3到约30个基团/nm3之间，更优地选介于约10个基团/nm3到约20个基团/nm3之间。在2代高密度多羟基树枝状聚合物(D2-OH-60)的情况下，羟基的体积密度为约14个基团/nm3。
在优选实施例中，树枝状聚合物包含有效数量的羟基，以靶向与CNS或眼的疾病、病症或损伤相关的活化的小胶质细胞和/或星形胶质细胞。
B.偶联剂和间隔子
树枝状聚合物复合物可以由与树枝状聚合物、树突状的聚合物或超支化聚合物缀合或连接的治疗上的活性剂或化合物形成。任选地，活性剂经由一个或多个间隔子/连接子通过不同的键(如二硫键、酯键、碳酸酯键、氨基甲酸酯键、硫酯键、肼键、酰肼键和酰胺键)与树枝状聚合物缀合。在一些实施例中，连接经由适当的间隔子发生，该间隔子在药剂与树枝状聚合物之间提供二硫桥键。在这种情况下，在身体中发现的还原条件下，树枝状聚合物复合物能够通过硫醇交换反应在体内快速释放药剂。
术语“间隔子”包含用于将治疗上预防性或诊断性活性剂与树枝状聚合物连接的化合物。间隔子可以是单个化学实体，或连接在一起以桥接聚合物与治疗剂或显像剂的两个或更多个化学实体。间隔子可以包含具有巯基、硫代吡啶、琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺、乙烯基砜和碳酸酯端的任何小化学实体、肽或聚合物。
间隔子可以选自以巯基、硫代吡啶、琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺、乙烯基砜和碳酸酯基团封端的化合物。间隔子可以包含硫代吡啶封端的化合物，如二硫代二吡啶、3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(LC-SPDP)或6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-LC-SPDP)。间隔子还可以包含肽，其中这些肽是线性或环状的，基本上具有巯基，如谷胱甘肽、高半胱氨酸、半胱氨酸和其衍生物、arg-gly-asp-cys(RGDC)、环(Arg-Gly-Asp-d-Phe-Cys)(c(RGDfC))、环(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Cys)、环(Arg-Ala-Asp-d-Tyr-Cys)。间隔子可以是巯基酸衍生物，如3巯基丙酸、巯基乙酸、4巯基丁酸、硫杂环戊烷-2-酮、6巯基己酸、5巯基戊酸和其它巯基衍生物，如2巯基乙醇和2巯基乙胺。间隔子可以是硫代水杨酸和其衍生物、(4-琥珀酰亚胺氧基羰基-甲基-α-2-吡啶基硫代)甲苯、(3-[2-吡啶硫代]丙酰酰肼，该间隔子可以具有马来酰亚胺端，其中该间隔子包含聚合物或小化学实体，如双-马来酰亚胺二甘醇和双-马来酰亚胺三甘醇、双-马来酰亚胺乙烷、双马来酰亚胺己烷。间隔子可以包含乙烯基砜，如1,6-己烷-双-乙烯基砜。间隔子可以包含硫代糖苷，如硫代葡萄糖。间隔子可以是还原蛋白(如牛血清白蛋白和人血清白蛋白)、任何能够形成二硫键的硫醇封端的化合物。间隔子可以包含具有马来酰亚胺、琥珀酰亚胺基和硫醇端的聚乙二醇。
在一些实施例中，间隔子/连接子是γ-氨基丁酸(GABA)连接子、烯丙基连接子、炔丙基连接子、乙硫醇连接子、吡啶二硫化物连接子。在优选实施例中，间隔子/连接子通过醚键、硫酯键、氨基甲酸酯键、碳酸酯键、肼键或酰胺键中的一个或多个与树枝状聚合物缀合，以改善生理条件下的稳定性(例如，与酯键相比)。
在其它实施例中，不同连接子(例如，烯丙基、炔丙基等)通过不同的键(例如，醚键、酯键、氨基甲酸酯键、碳酸酯键等)连接在树枝状聚合物表面上，这些键可以参与用于缀合如NAC等活性剂的点击化学。在另外的实施例中，树枝状聚合物通过一个连接子与第一活性剂缀合，而通过不同的连接子与第二活性剂缀合。
C.治疗剂、预防剂和诊断剂
各种药剂可以包含在待递送的颗粒中。药剂可以是蛋白质或肽、糖或碳水化合物、核酸或寡核苷酸、脂质、小分子或其组合。核酸可以是对蛋白质进行编码的寡核苷酸，例如DNA表达盒或mRNA。代表性寡核苷酸包含siRNA、microRNA、DNA和RNA。在一些实施例中，活性剂是治疗性抗体。一种或多种类型的活性剂可以包封、复合或缀合到树枝状聚合物。例如，树枝状聚合物通过二硫桥键与一个或多个NAC分子缀合，并且通过酰胺键与一个或多个抗体缀合。
示例性治疗剂包含抗炎药、抗恶性细胞增生的药剂、化学治疗剂、血管扩张剂、神经活性剂和抗感染剂。在一些实施例中，树枝状聚合物通过以二硫键、酯键、醚键、硫酯键、氨基甲酸酯键、碳酸酯键、肼键或酰胺键结尾的间隔子与靶向部分、显像剂和/或治疗剂连接。
在一些实施例中，活性剂是靶向剂。
靶向部分包含叶酸、线性或环状RGD肽、TAT肽、LHRH和BH3。
1.治疗剂
术语“树枝状聚合物复合物”是指与一种或多种治疗剂、预防剂或诊断剂缀合或复合的树枝状聚合物。一种或多种治疗剂与树枝状聚合物复合、共价地连接或分子内分散或包封在树枝状聚合物内。在一些实施例中，两种或更多种不同的治疗剂可以通过共价和/或非共价相互作用与树枝状聚合物缔合。
当通过静脉内注射施用时，树枝状聚合物复合物仅在患病条件下而不是在正常条件下可以优先穿过血脑屏障(BBB)。优选地，一种或多种药剂与树枝状聚合物连接或缀合，这些树枝状聚合物能够优先地在靶位点(即，疾病位点和/或损伤位点)处释放药物。例如，一些药物可以在体内发现的还原条件下在细胞内释放。与药剂连接的树枝状聚合物复合物可以用于执行若干个功能，包含靶向、定位于患病位点处、释放药物和成像目的。树枝状聚合物复合物可以用靶向部分进行标记或不用靶向部分进行标记。在一些实施例中，通过间隔子或连接子分子形成树枝状聚合物与药剂或显像剂之间的二硫键。
在一些实施例中，分子包含抗体，例如达利珠单抗(daclizumab)、贝伐单抗
Figure BDA0002578439840000211
兰尼单抗
Figure BDA0002578439840000212
巴利昔单抗(basiliximab)、兰尼单抗(ranibizumab)和哌加他尼钠(pegaptanib sodium)或肽(如SN50)以及NF拮抗剂。
在一些实施例中，一种或多种靶向疾病或病状的潜在原因的治疗剂以及一种或多种缓解疾病或病状的一种或多种症状的治疗剂。因此，为了治疗脑白质营养不良，树枝状聚合物可以与防止或减少极长链脂肪酸产生的药剂、促进过氧化物酶体增殖的药剂、促进极长链脂肪酸去除的药剂、增加ABCD2表达的药剂或其组合缀合。一个实例是VBP15，即一种游离类固醇药物。
优选的活性剂包含但不限于：防止或减少极长链脂肪酸产生的药剂、促进过氧化物酶体增殖的药剂、促进极长链脂肪酸去除的药剂(例如，4-丁酸苯酯)、增加ABCD2表达的药剂(例如，苯扎贝特(benzafibrate))、拟甲状腺素药(例如，伊罗替罗(eprotirome)、苏比替罗(sobetirome))、酶类(例如，半乳糖神经酰胺酶和芳基硫酸酯酶A、天冬氨酸酰化酶)、减少神经炎症的药剂(例如，N-乙酰半胱氨酸、吡格列酮、维生素E)以及干扰基因转录或转化的RNA寡核苷酸。在特别优选的实施例中，该试剂是N-乙酰半胱氨酸、4-苯基丁酸、苯扎贝特、甲状腺激素(T3)、苏比替罗、吡格列酮、白藜芦醇、VBP15、维生素E、芥酸、辅酶Q10、氯马斯汀、半乳糖神经酰胺酶(GALC)、天冬氨酸酰化酶(ASPA)或芳基硫酸酯酶A(ARSA)。其它合适的活性剂，包含但不限于抗炎剂、神经活性剂和显像剂。树枝状聚合物可以与多于一种药剂和多于一种类型的药剂缀合。
在一些实施例中，组合物包含一种或多种抗兴奋剂和/或D-抗谷氨酸剂。示例性化合物是MK801、美金刚胺、氯胺酮、1-MT。
a.抗炎剂
在一些实施例中，组合物包含一种或多种抗炎剂。抗炎剂减轻炎症，并且包含甾体药物和非甾体药物。
优选的抗炎药是包含N-乙酰半胱氨酸的抗氧化剂药物。优选的NSAIDS包含甲芬那酸(mefenamic acid)、阿司匹林(aspirin)、二氟尼柳(Diflunisal)、双水杨酸酯(Salsalate)、布洛芬(Ibuprofen)、萘普生(Naproxen)、非诺洛芬(Fenoprofen)、酮洛芬(Ketoprofen)、去酮洛芬(Deacketoprofen)、氟比洛芬(Flurbiprofen)、奥沙普秦(Oxaprozin)、洛索洛芬(Loxoprofen)、吲哚美辛(Indomethacin)、舒林酸(Sulindac)、依托度酸(Etodolac)、酮咯酸(Ketorolac)、双氯芬酸(Diclofenac)、萘丁美酮(Nabumetone)、吡罗昔康(Piroxicam)、美洛昔康(Meloxicam)、替诺昔康(Tenoxicam)、屈恶昔康(Droxicam)、氯诺昔康(Lornoxicam)、伊索昔康(Isoxicam)、甲氯芬那酸(Meclofenamic acid)、氟芬那酸(Flufenamic acid)、托芬那酸(Tolfenamic acid)、塞来昔布(elecoxib)、罗非昔布(Rofecoxib)、伐地昔布(Valdecoxib)、帕瑞昔布(Parecoxib)、罗美昔布(Lumiracoxib)、依托考昔(Etoricoxib)、非罗考昔(Firocoxib)、磺酰苯胺(Sulphonanilides)、尼美舒利(Nimesulide)、尼氟灭酸(Niflumic acid)以及利克飞龙(Licofelone)。
代表性小分子包含：如甲基强的松、地塞米松等类固醇；包含COX-2抑制剂、皮质类固醇抗炎剂、金化合物抗炎剂、免疫抑制剂、抗炎剂和抗血管生成剂的非甾体抗炎剂；如丙戊酸、D-氨基膦酰戊酸酯、D-氨基膦酰戊酸酯庚酸酯等抗兴奋毒性剂；如巴氯芬、NMDA受体拮抗剂、水杨酸盐抗炎剂、兰尼单抗等谷氨酸形成/释放抑制剂；包含阿柏西普和雷帕霉素的抗VEGF剂。其它抗炎药物包含非甾体药物，如吲哚美辛、阿司匹林、对乙酰氨基酚(acetaminophen)、双氯芬酸钠(diclofenac sodium)和布洛芬。皮质类固醇可以是醋酸氟轻松(fluocinolone acetonide)和甲基强的松龙(methylprednisolone)。
示例性免疫调节药物包含环孢霉素(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)和雷帕霉素。在一些实施例中，抗炎剂是阻断一种或多种如T细胞等免疫细胞类型的作用或阻断免疫系统中的蛋白质(如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素17-A、白细胞介素12和23)的生物药物。
在一些实施例中，抗炎药物是合成的或天然的抗炎蛋白。可以将对选择免疫组分具有特异性的抗体添加到免疫抑制疗法中。在一些实施例中，抗炎药物是抗T细胞抗体(例如，抗胸腺细胞球蛋白或抗淋巴细胞球蛋白)、抗IL-2Rα受体抗体(例如，巴利昔单抗或达利珠单抗)或抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗(rituximab))。
许多炎性疾病可以通过脂多糖(LPS)受体、toll样受体4(TLR4)与病理上升高的信号传导相关。因此，人们对发现将TLR4抑制剂作为潜在的抗炎剂非常感兴趣。最近，解出了与抑制剂E5564结合的TLR4的结构，使得能够设计和合成靶向E5564结合结构域的新型TLR4抑制剂。这些在美国专利第8,889,101中进行了描述，该美国专利的内容通过引用并入。如Neal等人,《公共科学图书馆·综合》2013；8(6):e65779e所报告的，与小分子文库的有限筛选方法结合使用的相似性搜索算法鉴定了与E5564位点结合并抑制TLR4的化合物。先导化合物C34是具有式C17H27NO9的2-乙酰胺基吡喃糖苷(MW 389)，其在体外抑制肠上皮细胞和巨噬细胞中的TLR4，并且减少内毒素血症和坏死性小肠结肠炎的小鼠模型中的全身性炎症。因此，在一些实施例中，活性剂是一种或多种TLR4抑制剂。在优选实施例中，活性剂是C34和其衍生物、类似物。
在优选实施例中，一种或多种抗炎药物在向哺乳动物受试者施用之后从树枝状聚合物纳米颗粒中释放，其释放量有效地抑制炎症至少1天、2天、3天、4天、5天、6天，优选地至少1周、2周或3周，更优选地至少一个月、两个月、三个月、四个月、五个月或六个月。
b.化学治疗剂
化学治疗剂通常包含通过干扰癌细胞中的DNA合成或功能而起作用的药学上或治疗上的活性化合物。基于化学治疗剂在细胞水平上的化学作用，可以将这些化学治疗剂分类为细胞周期特异性药剂(在细胞周期的某些阶段期间有效)和细胞周期非特异性药剂(在细胞周期的所有阶段期间有效)。化学治疗剂的实例包含烷化剂、血管生成抑制剂、芳香化酶抑制剂、抗代谢药、蒽环类药物、抗肿瘤抗生素、铂类药物、拓扑异构酶抑制剂、放射性同位素、放射致敏剂、检查点抑制剂、PD1抑制剂、植物生物碱、糖酵解抑制剂以及其前药。
PD-1抑制剂的实例包含例如对人PD-1具有特异性的基因工程化的完全人免疫球蛋白G4(IgG4)单克隆抗体MDX-1106和最近由US FDA批准的派姆单抗(pembrolizumab)。
代表性化学治疗剂包含但不限于：安吖啶(amsacrine)、博来霉素(bleomycin)、白消安(busulfan)、卡培他滨(capecitabine)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(ciplatin)、克拉屈滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarabine)、克立他酶(crisantaspase)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多西他赛(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxins)、表柔比星(epirubicin)、依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲(hydroxycarb amide)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊立替康(innotecan)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、脂质体多柔比星(liposomal doxorubicin)、脂质体柔红霉素(liposomal daunorubici)、洛莫司汀(lomustine)、氮芥(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、美司钠(mesna)、氨甲喋呤(methotrexate)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、培美曲塞(pemetrexed)、喷司他丁(pentostatin)、丙卡巴肼(procarbazine)、雷替曲塞(raltitrexed)、沙铂(satraplatin)、链脲佐菌素(streptozocin)、替尼泊苷(teniposide)、替加氟-尿嘧啶(tegafur-uracil)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷(teniposide)、噻替哌(thiotepa)、硫鸟嘌呤(tioguanine)、拓扑替康(topotecan)、曲奥舒凡(treosulfan)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)、紫杉醇(taxol)和其衍生物、曲妥珠单抗(trastuzumab)
Figure BDA0002578439840000241
西妥昔单抗(cetuximab)和利妥昔单抗(
Figure BDA0002578439840000242
或
Figure BDA0002578439840000243
)、贝伐单抗
Figure BDA0002578439840000244
和其组合。代表性促凋亡剂包含但不限于氟达拉滨牛皮苷(fludarabinetaurosporine)、环己酰亚胺(cycloheximide)、放线菌素D、乳糖苷神经酰胺(lactosylceramide)、15d-PGJ(2)5和其组合。
包含一种或多种化学治疗剂的树枝状聚合物复合物可以在如抑制检查点蛋白(如PD-1或CTLA-4)、过继性T细胞疗法和/或癌症疫苗的免疫疗法之前使用或与该免疫疗法结合使用。引发和活化用于过继性T细胞癌症疗法的体外T细胞的方法是本领域已知的。参见例如Wang等人,《血液(Blood)》,109(11):4865-4872(2007)和Hervas-Stubbs等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》,189(7):3299-310(2012)。癌症疫苗的实例包含例如
Figure BDA0002578439840000251
(西普鲁塞-T)，其是用于治疗前列腺癌的基于树突状细胞的疫苗(Ledford等人,《自然(Nature)》,519,17-18(2015年3月5日))。这种疫苗和其它用于免疫疗法的组合物和方法在Palucka等人,《自然·综述：癌症(Nature Reviews Cancer)》,12,265-277(2012年4月)中进行了综述。
在一些实施例中，树枝状聚合物复合物有效地治疗、成像和/或预防神经发育病症中脑的小胶质细胞的炎症(包含例如雷特综合征)。在优选实施例中，树枝状聚合物复合物将用于递送抗炎剂(D-NAC)和抗兴奋毒性剂和D-抗谷氨酸剂。优选的候选物是：MK801、美金刚胺、氯胺酮、1-MT。
c.神经活性剂
已经开发且使用了多种药物以试图中断、影响或暂时停止朝神经元损伤的谷氨酸兴奋性毒性级联。一种策略是“上游”尝试以减少谷氨酸释放。这类药物包含为钠通道阻断剂的利鲁唑(riluzole)、拉莫三嗪(lamotrigine)和利法利嗪(lifarizine)。常用的尼莫地平(nimodipine)是电压依赖性通道(L型)阻断剂。还尝试影响偶联的谷氨酸受体本身的各个位点。这些药物中的一些包含非尔氨酯(felbamate)、艾芬地尔(ifenprodil)、镁、美金刚胺和硝酸甘油。这些“下游”药物试图影响如自由基形成、一氧化氮形成、蛋白水解、核酸内切酶活性和ICE样蛋白酶形成(导致程序性细胞死亡或细胞凋亡的过程中的重要组分)等细胞内事件。
用于治疗神经退行性疾病的活性剂是本领域众所周知的，并且可以基于待治疗的症状和疾病而变化。例如，帕金森氏病的常规治疗可以包含左旋多巴(levodopa)(通常与多巴脱羧酶抑制剂或COMT抑制剂组合)、多巴胺激动剂或MAO-B抑制剂。
亨廷顿氏病的治疗可以包含用于帮助减少异常行为和移动的多巴胺阻断剂或用于控制移动等的如金刚烷胺(amantadine)和丁苯那嗪(tetrabenazine)等药物。其它有助于减轻舞蹈病的药物包含神经松驰剂和苯二氮卓。如金刚烷胺或瑞马西胺(remacemide)等化合物已经显示出初步的积极结果。可以用抗帕金森病药物治疗运动功能减退和僵硬，特别是在青少年病例中，并且可以用丙戊酸治疗肌阵挛性运动机能亢进。可以用类似于普通人群中所使用的那些药物治疗精神症状。选择性血清素再摄取抑制剂和米氮平被推荐用于抑郁症，而非典型抗精神病药物被推荐用于精神病和行为问题。
利鲁唑
Figure BDA0002578439840000261
(2-氨基-6-(三氟甲氧基)苯并噻唑)(即一种抗兴奋毒素)在患有ALS的受试者中产生了改善的存活时间。其它药物(大多数用于标签外)和干预措施可以减轻由ALS引起的症状。一些治疗改善了生活质量，并且一些似乎延长了寿命。常见的ALS相关疗法在Gordon,《衰老和疾病(Aging and Disease)》,4(5):295-310(2013)中进行了综述，参见例如其中的表1。已经在一项或多项临床试验中对多种其它药剂进行了测试，其功效从无效果到有希望。示例性药剂在Carlesi等人,《意大利生物学学报(ArchivesItaliennes de Biologie)》,149:151-167(2011)中进行了综述。例如，疗法可以包含：如他仑帕奈(8-甲基-7H-1,3-间二氧杂环戊烯并(2,3)苯并二氮杂卓)等降低兴奋性毒性的药剂；如头孢曲松或美金刚胺等头孢菌素；如辅酶Q10、锰卟啉(manganoporphyrin)、KNS-760704[(6R)-4,5,6,7-四氢-N6-丙基-2,6-苯并噻唑-二胺二盐酸盐，RPPX]或依达拉奉(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，MCI-186)等降低氧化应激的药剂；如组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂(包含丙戊酸、TCH346(二苯并(b,f)氧呯-10-基甲基-甲基丙-2-炔胺)、米诺环素(minocycline)或牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)等减少细胞凋亡的药剂；如沙利度胺(thalidomide)和雷公藤红素(celastol)等减轻神经炎症的药剂；如胰岛素样生长因子1(IGF-1)或血管内皮生长因子(VEGF)等神经营养剂(neurotropic agent)；如阿莫洛莫(arimoclomol)等热休克蛋白诱导剂；或如雷帕霉素或锂等自噬诱导剂。
阿尔茨海默氏病的治疗可以包含例如乙酰胆碱酯酶抑制剂，如他克林(tacrine)、利斯的明(rivastigmine)、加兰他敏(galantamine)或多奈哌齐(donepezil)；如美金刚胺等NMDA受体拮抗剂；或抗精神病药物。
路易体痴呆的治疗可以包含例如乙酰胆碱酯酶抑制剂，如他克林、利斯的明、加兰他敏或多奈哌齐；N-甲基d-天冬氨酸受体拮抗剂美金刚胺；例如左旋多巴或司来吉兰(selegiline)等多巴胺能疗法；如奥氮平(olanzapine)或氯氮平(clozapine)等抗精神病药；如氯硝西泮(clonazepam)、褪黑激素(melatonin)或喹硫平(quetiapine)等REM病症疗法；抗抑郁和抗焦虑疗法，如选择性血清素再摄取抑制剂(西酞普兰(citalopram)、艾司西酞普兰(escitalopram)、舍曲林(sertraline)、帕罗西汀(paroxetine)等)或血清素和去甲肾上腺素再摄取抑制剂(文拉法辛(venlafaxine)、米氮平和安非他酮(bupropion))(参见例如Macijauskiene等人,《传统医学(考纳斯)(Medicina(Kaunas))》,48(1):1-8(2012))。
示例性神经保护剂也是本领域中已知的，包含例如谷氨酸拮抗剂、抗氧化剂和NMDA受体刺激剂。其它神经保护剂和治疗包含半胱天冬酶抑制剂、营养因子、抗蛋白聚集剂、治疗性低温和促红细胞生成素。
用于治疗神经机能障碍的其它常见活性剂包含：用于治疗运动症状的金刚烷胺和抗胆碱能药物、用于治疗精神病的氯氮平、用于治疗痴呆的胆碱酯酶抑制剂以及用于治疗日间嗜睡的莫达非尼。
d.抗感染剂
抗生素包含：如青霉素和氨苄青霉素等β-内酰胺；如头孢呋辛、头孢克洛、头孢氨苄、头孢羟氨华(cephydroxil)、头孢泊肟酯(cepfodoxime and proxetil)等头孢菌素；如强力霉素(doxycycline)和米诺环素等四环素类抗生素；如阿奇霉素、红霉素、雷帕霉素和克拉霉素等大环内酯类抗生素；如环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、加替沙星、左氧氟沙星和诺氟沙星、妥布霉素、粘菌素或氨曲南等氟喹诺酮；以及如红霉素、阿奇霉素或克拉霉素等已知具有抗炎活性的抗生素。
2.诊断剂
树枝状聚合物纳米颗粒可以包含用于确定所施用颗粒的位置的诊断剂。还可以预防性地使用这些药剂。示例性诊断材料包含顺磁性分子、荧光化合物、磁性分子和放射性核素。合适的诊断剂包含但不限于X射线显像剂和造影剂。放射性核素也可以用作显像剂。示例性放射性标记包含14C、36C1、57Co、58Co、51Cr、125I、131I、111Ln、152Eu、59Fe、67Ga、32P、186Re、35S、75Se、175Yb。其它合适的造影剂的实例包含不透射线的气体或排气化合物。在一些实施例中，掺入树枝状聚合物纳米颗粒中的显像剂是荧光团(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE))、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)、元素颗粒(例如，金颗粒)。
D.赋形剂和装置
这些组合物可以与赋形剂组合施用。在优选实施例中，通过如注射等全身性途径施用该组合物。典型的载剂是无菌水、盐水、磷酸盐缓冲盐水和其它可注射载剂。
描述了调配用于通过肠胃外(肌内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)、肠内和局部施用途径施用的药物组合物。
1.肠胃外施用
可以通过硬膜下、静脉内、鞘内、心室内、动脉内、羊膜内、腹膜内或皮下途径肠胃外施用这些树枝状聚合物。
对于液体调配物，药学上可接受的载剂可以是例如水溶液或非水溶液、悬浮液、乳液或油。肠胃外媒剂(用于皮下、静脉内、动脉内或肌内注射)包含例如氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏和固定油。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇和可注射有机酯，如油酸乙酯。水性载剂包含例如水、醇/水溶液、环糊精、乳液或悬浮液(包含盐水和缓冲介质)。还可以以乳液例如油包水形式施用这些树枝状聚合物。油的实例是石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、橄榄油、葵花油、鱼肝油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、矿脂和矿物。用于肠胃外调配物的合适脂肪酸包含例如油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的实例。
适用于肠胃外施用的调配物可以包含使调配物与预期接受者的血液等渗的抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质以及可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。静脉内媒剂可以包含流体和营养补充剂、电解质补充剂，如基于林格氏葡萄糖的补充剂。通常，水、盐水、水性葡萄糖和相关的糖溶液以及如丙二醇或聚乙二醇等乙二醇是优选的液体载剂，特别是对于可注射溶液。
用于可注射组合物的可注射药物载剂是本领域普通技术人员众所周知的(参见,例如,《药剂学和药学实践(Pharmaceutics and Pharmacy Practice)》,利平科特出版公司(J.B Lippincott Company),宾夕法尼亚州费城,Banker和Chalmers编辑,第238-250页(1982)，以及《ASHP可注射药物手册(ASHP Handbook on Injectable Drugs)》,Trissel,第15版,第622-630页(2009))。
对流增强递送(“CED”)的调配物包含低分子量销售溶液和如甘露醇等糖类。
2.肠内施用
可以肠内施用这些树枝状聚合物。载剂或稀释剂可以是固体调配物的固体载剂或稀释剂、液体调配物的液体载剂或稀释剂或其混合物。
对于液体调配物，药学上可接受的载剂可以是例如水溶液或非水溶液、悬浮液、乳液或油。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇和可注射有机酯，如油酸乙酯。水性载剂包含例如水、醇/水溶液、环糊精、乳液或悬浮液(包含盐水和缓冲介质)。
油的实例是石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、橄榄油、葵花油、鱼肝油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、矿脂和矿物。用于肠胃外调配物的合适脂肪酸包含例如油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的实例。
媒剂包含例如氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏和固定油。调配物包含例如可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂的水性和非水性等渗无菌注射溶液和使调配物与预期接受者的血液等渗的溶质以及可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。媒剂可以包含例如流体和营养补充剂、电解质补充剂，如基于林格氏葡萄糖的补充剂。通常，水、盐水、水性葡萄糖和相关的糖溶液是优选的液体载剂。还可以用蛋白质、脂肪、糖类和婴儿配方奶粉的其它组分来调配这些载剂。
3.局部施用
可以局部施加活性剂和任选的递送媒剂。局部施用可以包含例如在外科手术过程中直接施加于暴露的组织、脉管系统或组织或假体。局部施用的优选组织是眼。
III.制备树枝状聚合物纳米颗粒的方法
还描述了合成树枝状聚合物和制备树枝状聚合物纳米颗粒的方法。
A.树枝状聚合物
可以通过多种化学反应步骤来制备树枝状聚合物。通常根据允许在构造的每个阶段控制其结构的方法来合成树枝状聚合物。树突状结构主要通过两种不同的方法合成：发散或会聚。
在一些实施例中，使用发散方法制备树枝状聚合物，其中该树枝状聚合物由多官能核组装而成，该多官能核通过一系列反应(通常是迈克尔反应)向外延伸。该策略涉及将具有反应性和保护性基团的单体分子与多官能核部分偶联，这导致围绕该核逐步添加代，然后去除保护性基团。例如，首先通过将N-(2-氨基乙基)丙烯酰胺单体偶联到氨核上来合成PAMAM-NH2树枝状聚合物。
在其它实施例中，使用会聚方法制备树枝状聚合物，其中树枝状聚合物由最终位于球体表面处的小分子构建而成，并且反应向内进行、向内构建并且最终连接到核上。
存在许多其它制备树枝状聚合物的合成途径，如正交方法、加速方法、双阶段会聚方法或超核方法、超单体方法或支化单体方法、双指数方法；正交偶联方法或两步法、两种单体方法、AB2-CD2方法。
在一些实施例中，采用一种或多种铜辅助叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)、狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应、硫醇-烯和硫醇-炔反应以及叠氮化物-炔烃反应，可以通过点击化学对树枝状聚合物的核、一个或多个支化单元、一个或多个连接子/间隔子和/或一个或多个表面基团进行修饰以允许与另外的官能团(支化单元、连接子/间隔子、表面基团等)、单体和/或活性剂缀合(Arseneault M等人,《分子(Molecules)》2015年5月20日；20(5):9263-94)。在一些实施例中，将预制的树突点击到高密度羟基聚合物上。“点击化学”涉及例如通过第一部分的表面上的炔烃部分(或其等价物)与第二部分上的叠氮化物部分(例如，存在于三嗪组合物上)(或其等价物)(或任何活性端基，例如伯胺端基、羟基端基、羧酸端基、硫醇端基等)之间的1,3-偶极环加成反应偶联两个不同部分(例如，核基团和支化单元；或支化单元和表面基团)。
在一些实施例中，树枝状聚合物合成对选自由以下组成的组的一种或多种反应进行回复：硫醇-烯点击反应、硫醇-炔点击反应、CuAAC、狄尔斯-阿尔德点击反应、叠氮化物-炔烃点击反应、迈克尔加成、环氧开环、酯化、硅烷化学和其组合。
在另外的实施例中，基于PEG的树枝状聚合物采用使用正交化学的较少反应步骤以克量级数量快速合成，并且与广泛研究的PAMAM树枝状聚合物的4代相比，在2代下呈现类似的表面密度(约60个端羟基)。
任何现有的树突状平台均可以用于制备所期望的功能的树枝状聚合物，即，通过缀合含有如1-硫代甘油或季戊四醇等部分的高羟基而具有高密度的表面羟基。可以合成和探索示例性树突状平台，如聚氨基胺(PAMAM)、聚(丙烯亚胺)(PPI)、聚-L-赖氨酸、三聚氰胺、聚(醚羟胺)(PEHAM)、聚(酯胺)(PEA)和聚甘油。
B.树枝状聚合物复合物
树枝状聚合物复合物可以由与树枝状聚合物、树突状的聚合物或超支化聚合物缀合或连接的治疗上的活性剂或化合物形成。一种或多种活性剂与树枝状聚合物的缀合是本领域已知的，并且在美国公开申请第US 2011/0034422号、第US 2012/0003155号和第US2013/0136697号中进行了详细描述。
在一些实施例中，一种或多种活性剂与树枝状聚合物共价地连接。在一些实施例中，活性剂通过被设计成在体内裂解的连接部分连接到树枝状聚合物。连接部分可以被设计成被水解地、酶促地或其组合方式裂解，以便在体内提供活性剂的持续释放。选择连接部分的组合物和其与活性剂的连接点两者，使得连接部分的裂解释放活性剂或其合适的前药。还可以根据活性剂的所期望的释放速率来选择连接部分的组合物。
在一些实施例中，连接通过二硫键、酯键、醚键、硫酯键、氨基甲酸酯键、碳酸酯键、肼键或酰胺键中的一个或多个发生。在优选实施例中，连接通过适当的间隔子发生，该间隔子在药剂与树枝状聚合物之间提供二硫桥键。在这种情况下，在身体中发现的还原条件下，树枝状聚合物复合物能够通过硫醇交换反应在体内快速释放药剂。用于形成的一些合适的间隔子是前述药剂与树枝状聚合物之间的二硫桥键。
连接部分通常包含一个或多个有机官能团。合适的有机官能团的实例包含仲酰胺(-CONH-)、叔酰胺(-CONR-)、仲氨基甲酸酯(-OCONH-；-NHCOO-)、叔氨基甲酸酯(-OCONR-；-NRCOO-)、脲(-NHCONH-；-NRCONH-；-NHCONR-、-NRCONR-)、甲醇(-CHOH-、-CROH-)、二硫化物基团、腙、酰肼、醚(-O-)和酯(-COO-、-CH2O2C-、CHRO2C-)，其中R是烷基、芳基或杂环基团。通常，鉴于活性剂的所期望的释放速率，可以选择连接部分内的一个或多个有机官能团的同一性。另外，可以选择一个或多个有机官能团以促进活性剂与树枝状聚合物的共价连接。在优选实施例中，连接可以通过适当的间隔子发生，该间隔子在药剂与树枝状聚合物之间提供二硫桥键。在身体中发现的还原条件下，树枝状聚合物复合物能够通过硫醇交换反应在体内快速释放药剂。
在某些实施例中，连接部分包含与间隔基团组合的上文所描述的有机官能团中的一个或多个。间隔基团可以由原子的任何组装(包含低聚物和聚合物链)构成；然而，间隔基团中的原子总数优选地介于3个原子与200个原子之间、更优选地介于3个原子与150个原子之间、更优选地介于3个原子与100个原子之间、最优选地介于3个原子与50个原子之间。合适的间隔基团的实例包含烷基、杂烷基、烷基芳基、低聚和聚乙二醇链以及低聚和聚(氨基酸)链。间隔基团的变型提供了对体内抗炎剂释放的另外的控制。在连接部分包含间隔基团的实施例中，一个或多个有机官能团将通常用于将间隔基团连接到抗炎剂和树枝状聚合物两者。
用于将活性剂共价连接到树枝状聚合物上的反应和策略是本领域已知的。参见例如March,《高等有机化学(Advanced Organic Chemistry)》,第5版,2001,威利国际出版公司(Wiley-Interscience Publication),纽约)和Hermanson,《生物偶联技术(Bioconjugate Techniques)》,1996,爱思唯尔出版公司(Elsevier Academic Press),美国。由于涉及官能团的相容性、保护基团策略和不稳定键的存在，因此可以根据所期望的连接部分以及活性剂和树枝状聚合物的整体结构来选择给定活性剂共价连接的适当方法。
最佳载药量将必要地取决于许多因素，包含药物的选择、树枝状聚合物的结构和大小以及待治疗的组织。在一些实施例中，以以下浓度将一种或多种活性药物包封、缔合和/或缀合到树枝状聚合物：按重量计约0.01％到约45％、优选地约0.1％到约30％、约0.1％到约20％、约0.1％到约10％、约1％到约10％、约1％到约5％、约3％到约20％和按重量计约3％到约10％。然而，可以通过常规方法(如所描述的那些方法)来鉴定任何给定药物、树枝状聚合物和靶位点的最佳载药量。
在一些实施例中，活性剂和/或连接子的缀合通过一个或多个表面和/或内部羟基发生。因此，在一些实施例中，活性剂/连接子的缀合通过缀合之前树枝状聚合物的总可用羟基的约1％、2％、3％、4％、5％发生。在其它实施例中，活性剂/连接子的缀合发生在缀合之前树枝状聚合物的小于5％、小于10％、小于15％、小于20％、小于25％、小于30％、小于35％、小于40％、小于45％、小于50％、小于55％、小于60％、小于65％、小于70％、小于75％总可用羟基上。在优选实施例中，树枝状聚合物复合物保留有效量的羟基以靶向小神经胶质和/或星形胶质细胞，同时与有效量的活性剂缀合以治疗、预防和/或成像眼和/或CNS的疾病、病症和/或损伤。
IV.使用方法
还描述了使用树枝状聚合物复合物组合物的方法。在优选实施例中，树枝状聚合物复合物穿过受损或损坏的BBB，并且靶向活化的小胶质细胞和星形胶质细胞。
A.治疗方法
可以施用这些调配物以治疗与感染、炎症或癌症相关的病症，具体地那些具有扩展到神经系统(尤其是CNS)的全身性炎症的病症。
通常，向有需要的个体施用有效量的树枝状聚合物复合物，这些树枝状聚合物复合物包含树枝状聚合物与一种或多种治疗活性剂、预防活性剂和/或诊断活性剂的组合。树枝状聚合物还可以包含靶向剂，但是如实例所表明的，这些对于递送到脊髓和脑中的受损组织不是必需的。
在一些实施例中，树枝状聚合物复合物包含与树枝状聚合物连接或缀合的药剂，该药剂能够在体内发现的还原条件下优先地在细胞内释放药物。该药剂可以共价地连接或分子内分散或包封。与对照(例如，用不含树枝状聚合物的活性剂治疗的受试者)相比，选择向受试者施用的树枝状聚合物复合物的量以递送有效量，从而减轻、预防或以其它方式缓解待治疗疾病或病症的一种或多种临床或分子症状。
B.待治疗的病状
这些组合物适用于治疗眼、脑和神经系统中的一种或多种疾病、病状和损伤，具体地与小胶质细胞和星形胶质细胞的病理活化相关的那些疾病、病状和损伤。这些组合物还可以用于治疗其它疾病、病症和损伤(包含胃肠病症、眼部疾病)并且治疗对神经在疾病或病症中起作用的其它组织。这些组合物和方法也适用于预防用途。
优选地直径小于15nm并且羟基表面密度为至少3个OH基团/nm2、优选地直径小于10nm并且羟基表面密度为至少4个OH基团/nm2、更优选地直径小于5nm并且羟基表面密度为至少5个OH基团/nm2并且最优选地直径介于1nm到2nm之间并且羟基表面密度为至少4个OH基团/nm2的递送治疗剂、预防剂或诊断剂的树枝状聚合物复合物组合物选择性地靶向小胶质细胞和星形胶质细胞，这些小胶质细胞和星形胶质细胞在包含神经发育性疾病、神经退行性疾病、坏死性小肠结肠炎和脑癌的许多病症和病状的发病机制中发挥关键作用。因此，以有效治疗或缓解与小胶质细胞和星形胶质细胞的病理病状相关的病状的剂量单位量来施用这些树枝状聚合物复合物。通常，树枝状聚合物通过靶向这些细胞来递送药剂以特异性地治疗神经炎症。
小胶质细胞是一种遍布脑和脊髓定位的神经胶质细胞(胶质细胞)。小胶质细胞占在脑内发现的所有细胞的10-15％。作为驻留的巨噬细胞，小胶质细胞在中枢神经系统(CNS)中充当主动免疫防御的第一和主要形式。小胶质细胞在CNS损伤之后起着关键作用，并且可以基于损害的时机和类型，既具有保护效应，也具有有害效应(Kreutzberg,G.W,《神经科学趋势(Trends in Neurosciences)》,19,312(1996)；Watanabe,H.等人,《神经科学快报(Neuroscience Letters)》,289,53(2000)；Polazzi,E等人,《胶质细胞(Glia)》,36,271(2001)；Mallard,C.等人,《儿科研究(Pediatric Research)》,75,234(2014)；Faustino,J.V.等人,《神经科学杂志：神经科学学会官方杂志(The Journal of Neuroscience:TheOfficial Journal Of The Society For Neuroscience)》,31,12992(2011)；Tabas,I.等人,《科学》,339,166(2013)；以及Aguzzi,A.等人,《科学》,339,156(2013))。小神经胶质功能的变化还影响正常的神经元发育和突触修剪(Lawson,L.J.等人,《神经科学(Neuroscience)》,39,151(1990)；Giulian,D.等人,《神经科学杂志：神经科学学会官方杂志》,13,29(1993)；Cunningham,T.J.等人,《神经科学杂志：神经科学学会官方杂志》,18,7047(1998)；Zietlow,R.等人,《欧洲神经科学杂志(The European Journal OfNeuroscience)》,11,1657(1999)；以及Paolicelli,R.C.等人,《科学》,333,1456(2011))。小胶质细胞在形态上经历了明显的变化，从分枝的结构到变形虫样结构，并且在损伤之后增殖。由此产生的神经炎症破坏了受损位点处的血脑屏障，并且导致急性神经元和慢性神经元和少突胶质细胞死亡。因此，靶向性促炎性小胶质细胞应该是有力且有效的治疗策略。可以利用神经炎性疾病中受损的BBB将携带纳米颗粒的药物转运到脑中。
在优选实施例中，以有效治疗有需要的受试者的小神经胶质介导的病理学而没有任何相关的毒性的量施用树枝状聚合物。
在一些实施例中，待治疗的受试者是人。在一些实施例中，待治疗的受试者是儿童或婴儿。所有方法均可以包含鉴定和选择需要治疗的受试者或将从施用所描述的组合物中受益的受试者的步骤。
1.眼部疾病和损伤
这些组合物和方法适用于治疗与眼相关的不适、疼痛、干燥、过度流泪、损伤、感染、烧伤。
可以治疗的眼部病症的实例包含：阿米巴角膜炎、真菌性角膜炎、细菌性角膜炎、病毒性角膜炎、盘状角膜炎(onchorcercal keratitis)、细菌性角膜结膜炎、病毒性角膜结膜炎、角膜营养不良性疾病、福斯氏角膜内皮营养不良症(Fuchs'endothelialdystrophy)、睑板腺功能障碍、前部睑缘炎和后部睑缘炎、结膜充血、结膜坏死、瘢痕性瘢痕和纤维化(cicatrical scaring and fibrosis)、点状上皮角膜炎(punctate epithelialkeratopathy)、丝状角膜炎、角膜糜烂(comeal erosions)、变薄、溃疡和穿孔、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、史蒂文斯-约翰逊综合征(Stevens-Johnson syndrome)、自身免疫性干眼症、环境性干眼症、角膜新生血管疾病、角膜移植后排斥反应预防和治疗、自身免疫性葡萄膜炎、感染性葡萄膜炎、前葡萄膜炎、后葡萄膜炎(包含弓形体病)、全葡萄膜炎、玻璃体或视网膜炎性疾病、眼内炎预防和治疗、黄斑水肿、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、增殖性和非增殖性糖尿病视网膜病变、高血压性视网膜病变、视网膜自身免疫性疾病、原发性和转移性眼内黑色素瘤、其它眼内转移性肿瘤、开角型青光眼、闭角型青光眼、色素性青光眼以及其组合。其它病症包含角膜损伤、烧伤或擦伤、白内障和年龄相关性眼退化或与此相关的视力退化。
在优选实施例中，待治疗的眼部病症是年龄相关性黄斑变性(AMD)。年龄相关性黄斑变性(AMD)是黄斑的神经退行性、神经炎性疾病，其引起中央视觉丧失。年龄相关性黄斑变性的发病机制涉及脉络膜(视网膜下的血管层)、视网膜色素上皮(RPE)、感觉神经视网膜下的细胞层、布鲁赫氏膜和感觉神经视网膜本身的慢性神经炎症。
2.神经性和神经退行性疾病
神经退行性疾病是神经系统的慢性进行性病症，其影响神经性和行为性功能并且涉及导致不同的组织病理学和临床综合征的生物化学变化(Hardy H等人,《科学》1998；282:1075-9)。抵抗细胞退化机制的异常蛋白质在细胞内累积。在一组受到影响而其它保持完好的意义上，神经元丢失的模式是选择性的。通常，这种疾病没有明确的诱因。经典地被描述为神经退行性的疾病是阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病和帕金森氏病。
由活化的小胶质细胞和星形胶质细胞介导的神经炎症是各种神经性病症的主要标志，从而使其成为潜在的治疗靶标(Hagberg,H等人,《神经病学年鉴(Annals ofNeurology)》2012,71,444；Vargas,DL等人,《神经病学年鉴》2005,57,67；以及Pardo,CA等人,《国际精神病学评论(International Review of Psychiatry)》2005,17,485)。多项科学报告表明，通过靶向这些细胞在早期减轻神经炎症可以延迟疾病的发作，并且进而可以为治疗提供更长的治疗窗(Dommergues,MA等人,《神经科学》2003,121,619；Perry,VH等人,《自然·综述：神经病学(Nat Rev Neurol)》2010,6,193；Kannan,S等人,《科学转化医学》2012,4,130ra46；以及Block,ML等人,《自然·综述：神经病学》2007,8,57)。跨血脑屏障递送治疗剂是具有挑战性的任务。神经炎症导致对血脑屏障(BBB)的破坏。可以利用神经炎性病症中受损的BBB以跨脑转运载有药物的纳米颗粒(Stolp,HB等人,《心血管精神病学与神经病学(Cardiovascular Psychiatry and Neurology)》2011,2011,10；和Ahishali,B等人,《国际神经科学杂志(International Journal of Neuroscience)》2005,115,151)。
这些组合物和方法还可以用于递送活性剂以治疗神经性或神经退行性疾病或病症或中枢神经系统病症。在优选实施例中，这些组合物和方法在治疗和/或缓解与神经性或神经退行性疾病或病症或中枢神经系统病症相关的神经炎症方面是有效的。这些方法通常包含向受试者施用有效量的组合物以增加认知或减少认知下降、增加认知功能或减少认知功能下降、增加记忆或减少记忆下降、增加能力或学习能力或减少能力或学习能力下降或其组合。
神经变性是指神经元结构或功能的逐渐丧失，包含神经元死亡。例如，这些组合物和方法可以用于治疗患有疾病或病症的受试者，该疾病或病症如帕金森氏病(PD)和PD相关病症、亨廷顿氏病(HD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、阿尔茨海默氏病(AD)和其它痴呆、如克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob Disease)等朊病毒疾病、皮质基底节变性、额颞叶痴呆、HIV相关认知障碍、轻度认知障碍、运动神经元疾病(MND)、脊髓小脑性共济失调(SCA)、脊髓性肌肉萎缩症(SMA)、弗立特里希氏共济失调、路易体痴呆病、阿尔珀氏病(Alpers'Disease)、贝敦氏症(Batten Disease)、脑-眼-面-骨骼综合征、皮质基底节变性、吉斯特曼-施特劳斯病(Gerstmann-Straussler-Scheinker Disease)、苦鲁病、利氏病、单肢肌萎缩、多系统萎缩症、多系统萎缩伴直立性低血压(Shy-Drager综合征)、多发性硬化症(MS)、神经变性伴脑铁沉积、斜视性眼阵挛-肌阵挛(Opsoclonus Myoclonus)、后皮层萎缩、原发性进行性失语、进行性核上性麻痹、血管性痴呆、进行性多灶性白质脑病、路易体痴呆(DLB)、腔隙综合征、脑积水、韦尼克-科尔萨科夫综合征(Wemicke-Korsakoff'ssyndrome)、脑炎后痴呆、癌症和化学疗法相关的认知障碍和痴呆以及抑郁症诱发的痴呆和假性痴呆。
在一些实施例中，病症是过氧化物酶体病症或脑白质营养不良，其特征在于对隔离神经细胞的髓鞘的生长或维持的有害效应。脑白质营养不良可以是例如18q综合征伴髓鞘碱性蛋白缺乏、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性播散性脑白质炎、急性出血性白质脑病、X-连锁肾上腺脑白质营养不良(ALD)、肾上腺脊髓神经病变(AMN)、艾卡尔迪-古铁雷斯综合征(Aicardi-Goutieres Syndrome)、亚历山大病、成人型常染色体显性遗传性脑白质营养不良(ADLD)(Adult-onset Autosomal Dominant Leukodystrophy)、常染色体显性弥漫性脑白质病伴神经轴突球体(HDLS)(Autosomal Dominant DiffuseLeukoencephalopathy with neuroaxonal spheroids)、常染色体显性迟发性脑白质病(Autosomal Dominant Late-Onset Leukoencephalopathy)、儿童共济失调伴弥漫性CNS髓鞘形成减少(CACH或白质消融性脑病(Vanishing White Matter Disease))、卡纳万病、伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(Cerebral Autosomal DominantArteropathy with Subcortical Infarcts and Leukoencephalopathy)(CADASIL)、脑腱性黄瘤症(CTX)、伴有白质脑病的颅骨干骺端发育不良(Craniometaphysical Dysplasiawith Leukoencephalopathy)、伴有RNASET2的囊性脑白质病、无临床症状的广泛脑白质异常(Extensive Cerebral White Matter abnormality)、表现为小脑共济失调和痴呆的家族性成人型脑白质营养不良症、伴有成人型痴呆和糖脂储存异常的家族性脑白质营养不良症、类球状细胞白质营养不良症(克拉伯病)、模拟慢性进行性多发性硬化症的遗传性成人型脑白质营养不良症、伴有基底神经节和小脑萎缩的髓鞘形成减少(HABC)、髓鞘形成减少、促性腺激素分泌不足、性腺功能减退和牙发育不全(4H综合征)、脂膜性骨发育不良(Lipomembranous Osteodysplasia)伴脑白质营养不良(纳苏病(Nasu Disease))、异染性脑白质营养不良(MLD)、伴皮层下囊肿的巨脑性白质脑病(MegalencephalicLeukodystrophy with subcortical Cysts)(MLC)、伴有轴突球体的神经轴突白质脑病(遗传性弥漫性白质脑病合并轴索球样变-HDLS)、新生儿肾上腺脑白质营养不良(NALD)、眼指齿发育不良(Oculodetatoldigital Dysplasia)伴脑白质异常、伴色素神经胶质的正染色脑白质营养障碍、卵巢白质营养不良综合征(Ovarioleukodystrophy Syndrome)、佩梅病(Pelizaeus Merzbacher Disease)(X连锁痉挛性截瘫)、雷夫叙姆病、Sjogren-Larssen综合征、嗜苏丹型脑白质营养不良、范德克纳普综合征(van der Knaap Syndrome)(空泡性脑白质营养不良伴皮质下囊肿或MLC)、白质消融性脑病(VWM)或儿童共济失调伴弥漫性中枢神经系统髓鞘形成减少(CACH)、X连锁肾上腺脑白质营养不良(X-ALD)和包含Zellweger综合征的Zellweger谱系病症、新生儿肾上腺脑白质营养不良、婴儿雷夫叙姆病(InfantileRefsum Disease)、伴脊髓与脑干受累以及脑白质乳酸升高的脑白质病(LBSL)或DARS2脑白质病。在优选实施例中，脑白质营养不良是肾上腺脑白质营养不良(ALD)(包含X连锁ALD)、异染性脑白质营养不良(MLD)、克拉伯病(球状脑白质营养不良)或DARS2脑白质病。
在一些实施例中，受试者患有兴奋性毒性病症。兴奋性毒性是神经细胞由于过度刺激变得受损的过程。包含中风、创伤性脑损伤、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默氏病和脊髓损伤的多种病状与兴奋性毒性相关。对神经细胞的损伤导致对应的神经性症状，这些症状可能根据损伤的细胞和损伤的广泛程度而变化。一旦损伤，神经细胞无法修复，并且患者可能经历永久性损害。已经开发且使用了多种药物以试图中断、影响或暂时停止朝神经元损伤的谷氨酸兴奋性毒性级联。一种策略是“上游”尝试以减少谷氨酸释放。这类药物包含为钠通道阻断剂的利鲁唑、拉莫三嗪和利法利嗪。常用的尼莫地平是电压依赖性通道(L型)阻断剂。还尝试影响偶联的谷氨酸受体本身的各个位点。这些药物中的一些包含非尔氨酯、艾芬地尔、镁、美金刚胺和硝酸甘油。这些“下游”药物试图影响如自由基形成、一氧化氮形成、蛋白水解、核酸内切酶活性和ICE样蛋白酶形成(导致程序性细胞死亡或细胞凋亡的过程中的重要组分)等细胞内事件。因此，在一些实施例中，树枝状聚合物复合物包含一种或多种用于治疗兴奋性毒性病症的活性剂。
在一些实施例中，受试者患有神经系统病症或需要神经保护。示例性病状和/或受试者包含但不限于已经患有、患有或可能患有或遭受中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤、创伤后应激综合征或其组合的受试者。
在一些实施例中，以有效量向有需要的受试者施用这些组合物和方法，以减轻或预防神经退行性疾病中的一种或多种分子或临床症状或一种或多种引起神经变性的机制。
用于治疗神经退行性疾病的活性剂是本领域众所周知的，并且可以基于待治疗的症状和疾病而变化。例如，帕金森氏病的常规治疗可以包含左旋多巴(通常与多巴脱羧酶抑制剂或COMT抑制剂组合)、多巴胺激动剂或MAO-B抑制剂。
亨廷顿氏病的治疗可以包含用于帮助减少异常行为和移动的多巴胺阻断剂或用于控制移动等的如金刚烷胺和丁苯那嗪等药物。其它有助于减轻舞蹈病的药物包含神经松驰剂和苯二氮卓。如金刚烷胺或瑞马西胺等化合物已经显示出初步的积极结果。可以用抗帕金森病药物治疗运动功能减退和僵硬，特别是在青少年病例中，并且可以用丙戊酸治疗肌阵挛性运动机能亢进。可以用类似于普通人群中所使用的那些药物治疗精神症状。选择性血清素再摄取抑制剂和米氮平被推荐用于抑郁症，而非典型抗精神病药物被推荐用于精神病和行为问题。
利鲁唑
Figure BDA0002578439840000381
(2-氨基-6-(三氟甲氧基)苯并噻唑)(即一种抗兴奋毒素)在患有ALS的受试者中产生了改善的存活时间。其它药物(大多数用于标签外)和干预措施可以减轻由ALS引起的症状。一些治疗改善了生活质量，并且一些似乎延长了寿命。常见的ALS相关疗法在Gordon,《衰老和疾病》,4(5):295-310(2013)中进行了综述，参见例如其中的表1。已经在一项或多项临床试验中对多种其它药剂进行了测试，其功效从无效果到有希望。示例性药剂在Carlesi等人,《意大利生物学学报》,149:151-167(2011)中进行了综述。例如，疗法可以包含：如他仑帕奈(8-甲基-7H-1,3-间二氧杂环戊烯并(2,3)苯并二氮杂卓)等降低兴奋性毒性的药剂；如头孢曲松或美金刚胺等头孢菌素；如辅酶Q10、锰卟啉、KNS-760704[(6R)-4,5,6,7-四氢-N6-丙基-2,6-苯并噻唑-二胺二盐酸盐，RPPX]或依达拉奉(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，MCI-186)等降低氧化应激的药剂；如组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂(包含丙戊酸、TCH346(二苯并(b,f)氧呯-10-基甲基-甲基丙-2-炔胺)、米诺环素或牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)等减少细胞凋亡的药剂；如沙利度胺和雷公藤红素等减轻神经炎症的药剂；如胰岛素样生长因子1(IGF-1)或血管内皮生长因子(VEGF)等神经营养剂；如阿莫洛莫等热休克蛋白诱导剂；或如雷帕霉素或锂等自噬诱导剂。
阿尔茨海默氏病的治疗可以包含例如乙酰胆碱酯酶抑制剂，如他克林、利斯的明、加兰他敏或多奈哌齐；如美金刚胺等NMDA受体拮抗剂；或抗精神病药物。
路易体痴呆的治疗可以包含例如乙酰胆碱酯酶抑制剂，如他克林、利斯的明、加兰他敏或多奈哌齐；N-甲基d-天冬氨酸受体拮抗剂美金刚胺；例如左旋多巴或司来吉兰等多巴胺能疗法；如奥氮平或氯氮平等抗精神病药；如氯硝西泮、褪黑激素或喹硫平等REM病症疗法；抗抑郁和抗焦虑疗法，如选择性血清素再摄取抑制剂(西酞普兰、艾司西酞普兰、舍曲林、帕罗西汀等)或血清素和去甲肾上腺素再摄取抑制剂(文拉法辛、米氮平和安非他酮)(参见例如Macijauskiene等人,《传统医学(考纳斯)》,48(1):1-8(2012))。
示例性神经保护剂也是本领域中已知的，包含例如谷氨酸拮抗剂、抗氧化剂和NMDA受体刺激剂。其它神经保护剂和治疗包含半胱天冬酶抑制剂、营养因子、抗蛋白聚集剂、治疗性低温和促红细胞生成素。
用于治疗神经机能障碍的其它常见活性剂包含：用于治疗运动症状的金刚烷胺和抗胆碱能药物、用于治疗精神病的氯氮平、用于治疗痴呆的胆碱酯酶抑制剂以及用于治疗日间嗜睡的莫达非尼。
3.神经发育病症
神经发育病症通常意味着脑从一开始就没有正常形成。可能发生基础神经发育过程的异常调节，或者可能存在可能呈各种形式的损害带来的破坏。经典地，将自闭症和注意力缺陷多动障碍描述为神经发育病症。
脑性瘫痪(CP)是最常见的儿科神经/神经发育病症中的一种病症，目前估计影响大约2到3/1000活产儿(Kirby,RS等人,《发育障碍研究(Research in DevelopmentalDisabilities)》,32,462(2011))。CP在童年早期就被认识到，并且病状贯穿整个生命周期持续存在。CP最常见的原因包含早产、缺氧缺血和胎盘功能不全、产时窒息和母胎炎症(Dammann,O.,《儿科学报(Acta Pcediatrica)》2007,96,6；Yoon,BH等人,《美国妇产科杂志(American Journal of Obstetrics and Gynecology)》2000,182,675；以及O'Shea,TM等人,《儿童神经学学报(Journal of child neurology)》2012,27,22)。尽管CP在病因学上是异质的，并且疾病的机制非常复杂，然而神经炎症是常见的与病因学无关的病理生理机制。靶向神经炎症并且直接在受损位点处递送药物可以是有益的。
这些组合物和方法还可以用于递送活性剂以治疗如脑性瘫痪等神经发育病症。在优选实施例中，这些组合物和方法在治疗和/或缓解与如脑性瘫痪等神经发育病症相关的神经炎症方面是有效的。
在一些实施例中，树枝状聚合物复合物有效地治疗、成像和/或预防神经发育病症中脑的小胶质细胞的炎症(包含例如雷特综合征)。在优选实施例中，树枝状聚合物复合物将用于递送抗炎剂(D-NAC)和抗兴奋毒性剂和D-抗谷氨酸剂。优选的候选物是：MK801、美金刚胺、氯胺酮、1-MT。
在一些实施例中，树枝状聚合物复合物有效地治疗、成像和/或预防自闭症谱系病症中的脑小胶质细胞的炎症。术语“谱系”是指患有ASD的儿童可能患有的各种症状、技能和受损或残疾程度。一些儿童因其症状而轻度受损，而其它则严重残疾。最新版的《精神病症诊断与统计手册(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders)》(DSM-5)不再包含阿斯伯格综合征(Asperger's syndrome)；尽管阿斯伯格综合征的特征被包含在更广泛的ASD类别内。
目前，FDA批准用于治疗ASD的方面的唯一药物是抗精神病药利培酮(维思通(Risperdal))和阿立哌唑(安立復(Abilify))。对于患有ASD的儿童来说，可以在标签外开出的一些药物包含以下：
抗精神病药物更常用于治疗如精神分裂症等严重的精神疾病。这些药物可能有助于减少儿童(包含患有ASD的儿童)的攻击性和其它严重的行为问题。这些药物还有助于减少重复行为、多动和注意力问题。
通常开出如氟西汀或舍曲林等抗抑郁药物来治疗抑郁症和焦虑症，但有时开出这些抗抑郁药物来减少重复行为。一些抗抑郁药还可以有助于控制患有ASD的儿童的攻击性和焦虑。
如哌醋甲酯(methylphenidate)
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等兴奋剂药物在治疗患有注意力缺陷多动障碍(ADHD)的人方面是安全且有效的。哌醋甲酯也已经被证明有效地治疗患有ASD的儿童的多动。但对治疗有应答的患有ASD的儿童并不多，并且那些确实有应答的儿童比患有ADHD并且不患有ASD的儿童表现出更多的副作用。
树枝状聚合物缀合物应该对这种个体的治疗和诊断具有功效，特别是考虑到最近的研究显示患有自闭症的患者具有神经炎症迹象，如死后脑标本和CSF细胞因子水平中活化的小胶质细胞和星形胶质细胞的存在增加所见。Vargas等人,《神经病学年鉴》2005年1月；57(l):67-81。《神经病学年鉴》勘误表2005年2月；57(2):304。
4.脑肿瘤
所公开的树枝状聚合物的有效血脑肿瘤屏障(BBTB)渗透和均匀的实体肿瘤分布可以显著增强对脑肿瘤的治疗剂递送。具有小尺寸、接近中性表面电荷的高密度羟基表面基团选择性地定位于与炎症，具体地神经炎症相关的细胞中。
这些组合物和方法可用于通过延迟或抑制受试者的肿瘤的生长、减少肿瘤的生长或大小、抑制或减少肿瘤的转移和/或抑制或减少与肿瘤发展或生长相关的症状来治疗患有良性或恶性肿瘤的受试者。
可以用这些组合物和方法治疗的癌症类型包含但不限于脑肿瘤，包含神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、胶质肉瘤、星形细胞瘤、脑干神经胶质瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤、非神经胶质瘤、听神经瘤、颅咽管瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、松果体细胞瘤、松果体母细胞瘤、原发性脑淋巴瘤、神经节瘤、神经鞘瘤、脊索瘤(cordomas)和垂体瘤。
树枝状聚合物复合物可以与一种或多种另外的治疗活性剂组合施用，已知这些治疗活性剂能够治疗脑肿瘤或与其相关的症状。
例如，可以通过静脉内施用或在外科手术期间向脑施用树枝状聚合物以去除肿瘤的全部或一部分。树枝状聚合物可以用于递送化学治疗剂、增强如经受放射疗法的受试者等的辅助疗法的药剂，其中羟基封端的树枝状聚合物以有效遏制或抑制DDX3在脑增殖性疾病中的活性的量与至少一种放射增敏剂共价连接。
本领域普通技术人员将理解，除化学疗法之外，外科介入和放射疗法也用于治疗神经系统癌症。放射疗法意指在受试者中的癌症位置附近向受试者施用电离辐射。在一些实施例中，以两种或更多种剂量施用放射增敏剂，并且随后在受试者中的癌症位置附近向受试者施用电离辐射。在另外的实施例中，放射增敏剂然后是电离辐射的施用可以重复2个或更多个周期。
通常，电离辐射的剂量随肿瘤的大小和位置而变化，但是剂量在0.1Gy到约30Gy的范围内，优选地在5Gy到约25Gy的范围内。
在一些实施例中，电离辐射呈立体定向消融放射疗法(SABR)或体部立体定向放射疗法(SBRT)的形式。
5.肠胃病症
先天性免疫受体toll样受体4(TLR4)被认为是造血和非造血细胞上细菌内毒素(脂多糖，“LPS”)以及在炎性或传染性病症期间释放的多种内源性分子的受体。多种疾病均归因于包含传染性和非传染性过程两者的夸大的TLR4信号传导。这些包含坏死性小肠结肠炎(NEC)、腹部脓毒症、肺炎、关节炎、胰腺炎和动脉粥样硬化。在优选实施例中，待治疗的疾病是NEC。
在优选实施例中，单一树枝状聚合物复合物组合物可以同时治疗和/或诊断包含胃肠道和中枢神经系统的人体的两个不同位置处的多种症状。例如，包含与治疗剂、预防剂或诊断剂连接的树枝状聚合物的树枝状聚合物复合物组合物可以通过肠内施用治疗胃肠区域，同时在吸收到血流中之后，选择性地靶向小胶质细胞和星形胶质细胞。小胶质细胞和星形胶质细胞在NEC的发病机制中起关键作用。
C.剂量和有效量
在一些体内方法中，以治疗有效量向受试者施用树枝状聚合物复合物。术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗、抑制或减轻正在治疗的病症的一种或多种症状或以其它方式提供期望的药理学和/或生理学效果的剂量。精确剂量将根据多种因素而变化，如受试者依赖性变量(例如，年龄、免疫系统健康状况等)、疾病或病症以及所实现的治疗。
通常，组合物的剂量可以是被治疗的受试者的约0.0001mg/kg到约1000mg/kg体重、约0.01mg/kg到约100mg/kg体重、约0.1mg/kg到约10mg/kg以及约0.5mg到约5mg/kg体重。受试者通常是哺乳动物，最优选地人。通常，对于静脉内注射或输注，剂量可以更低。
例如，树枝状聚合物复合物组合物的量有效地将一种或多种活性剂递送到炎症位点(具体地中枢神经系统的炎症或眼部炎症)处或其附近的细胞。因此，在一些实施例中，包含一种或多种活性剂的树枝状聚合物复合物组合物的量有效地改善受试者的炎症。在优选实施例中，与未经治疗的对照受试者相比，有效量的树枝状聚合物复合物组合物在受试者的细胞中不诱导显著的细胞毒性。优选地，与未经治疗的对照相比，树枝状聚合物复合物组合物的量有效地预防或减轻受试者的炎症和/或疾病或病症的另外的相关症状。
通常，将调整施用的时机和频率以平衡给定治疗或诊断时间表的功效与给定递送系统的副作用。示例性给药频率包含连续输注、单次和多次施用，如每小时、每天、每周、每月或每年给药。
在一些实施例中，向人每天一次、两次或三次或每隔一天、两天、三天、四天、五天或六天施用剂量。在一些实施例中，每周、每两周、每三周或每四周约一次或两次施用剂量。在一些实施例中，每月、每两个月、每三个月、每四个月、每五个月或每六个月施用约一次或两次剂量。
普通技术人员将理解，给药方案可以是足以治疗受试者病症的任何时间长度。术语“慢性”意指给药方案的时间长度可以是几小时、几天、几周、几个月或可能几年。
在一些实施例中，该方案包含疗法轮次的一个或多个周期，然后是药物假期(例如，无药物)。疗法轮次可以采用例如上文所讨论的施用。同样，药物假期可以是1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天；或1周、2周、3周、4周或1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月。
树枝状聚合物复合物可以与一种或多种另外的治疗活性剂组合施用，已知这些治疗活性剂能够治疗上文所讨论的病状或疾病。
D.对照
可以将树枝状聚合物复合物组合物的效果与对照进行比较。适当的对照是本领域已知的并且包含例如未经处理的细胞或未经治疗的受试者。在一些实施例中，对照是来自经过治疗的受试者或未经治疗的受试者的未经处理的组织。优选地，对照的细胞或组织源自与经过处理的细胞或组织相同的组织。在一些实施例中，未经治疗的对照受试者患有与经过治疗的受试者相同的疾病或病状或有患有该疾病或病状的风险。
E.组合
作为治疗或预防性治疗方案的一部分，可以单独地或与一种或多种另外的活性剂组合地施用树枝状聚合物复合物组合物。可以与第二活性剂在同一天或不同的一天施用树枝状聚合物复合物组合物。例如，可以在第一天、第二天、第三天或第四天或其组合施用包含树枝状聚合物复合物组合物的组合物。
术语“组合(combination)”或“组合(combined)”用于指两种或更多种药剂的伴随、同时或相继施用。因此，组合可以伴随地(例如，作为掺入物)、单独但同时(例如，通过进入同一受试者体内的单独的静脉内管线)、或相继(例如，先给予化合物或药剂中的一种，然后给予第二种)施用。
实例
实例1：2代高密度多羟基树枝状聚合物(D2-OH-60，也称为PEGOL-60)的合成
方法和材料
试剂
除非另有说明，否则所有试剂均按原样使用。炔丙基溴溶液(在甲苯中占80wt％)、烯丙基溴、氢化钠(在矿物油中的60％分散液)、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、1-硫代甘油、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)、N,N'-二异丙基乙胺(DIPEA)、对甲苯磺酰氯、四乙二醇、三氟乙酸(TFA)、γ-(Boc-氨基)丁酸(BOC-GABA-OH)、五水合硫酸铜、抗坏血酸钠、无水二氯甲烷(DCM)、无水四氢呋喃(THF)和无水二甲基甲酰胺(DMF)购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(美国密苏里州圣路易斯)。Cy5-单-NHS酯和FITC购自安玛西亚生物科学公司(Amersham Biosciences)-通用电气医疗集团(GE Healthcare)。所有其它ACS级溶剂均来自飞世尔科技公司(FisherScientific)。氘化溶剂二甲亚砜(DMSO-d6)、水(D2O)、甲醇(CD3OD)和氯仿(CDCl3)购自剑桥同位素实验室公司(Cambridge Isotope Laboratories,Inc.)(马萨诸塞州安多弗)。透析膜(MW截留1000Da)获自光谱实验室公司(Spectrum Laboratories Inc.)(美国加利福尼亚州兰乔多梅斯兹)。
中间体和树枝状聚合物的合成
化合物2的制备：将二季戊四醇(1)(5g，19.66mmol)溶于30ml无水二甲基甲酰胺(DMF)中，并且在0℃下进行搅拌。将氢化钠(5.66g，235.83mmol)分批缓慢添加到搅拌溶液中，并且搅拌15分钟。然后在0℃下添加炔丙基溴(24.23ml，163.10mmol，80％w/w甲苯溶液)，并且在室温下继续搅拌另外6小时。将反应混合物冷却，并且在水(40mL)与乙酸乙酯(50mL)之间分配。用水(3×50mL)和盐水(2×50mL)洗涤有机层，然后干燥(Na2SO4)、过滤并且在真空中蒸发。通过二氧化硅快速柱色谱法(乙酸乙酯/己烷15:85v/v)纯化粗产物，以便以60％的产率得到化合物2。
化合物3的制备：将二季戊四醇(1)(6g，23.59mmol)溶解于无水DMF(20mL)和四氢呋喃(THF，50mL)中；并且在0℃下搅拌溶液。将氢化钠(6.23g，259.55mmol)分批缓慢添加到搅拌溶液中，并且搅拌15分钟。随后在0℃下缓慢添加用无水THF(20mL)稀释的烯丙基溴(11.2mL，129.77mmol)；并且在0℃下继续搅拌另外30分钟，随后在室温(“rt”)(25℃)下搅拌90分钟。借助于TLC持续地监测反应。一旦在TLC上观察到最大产物形成，就用冰淬灭反应。用KMnO4浸液对TLC进行染色。将反应混合物冷却，并且在水(40mL)与乙酸乙酯(50mL)之间分配。用水(3×50mL)和盐水(2×50mL)洗涤有机层，然后干燥(Na2S04)、过滤并且在真空中蒸发。通过二氧化硅快速柱色谱法(乙酸乙酯/己烷25:75v/v)纯化粗产物，以便以40％的产率得到化合物3。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.87(ddd,J＝22.5,10.6,5.4Hz,5H),5.24(dd,J＝17.2,1.5Hz,5H),5.21-5.10(m,5H),4.01-3.90(m,10H),3.70(s,2H),3.46(dd,J＝26.4,13.1Hz,14H)。
化合物4的制备：在0℃下，将含对甲苯磺酰氯(10.5g，57mmol)的80ml二氯甲烷逐滴添加2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙-l-醇(5g，28.5mmol)和三乙胺(12ml，85mmol)的混合物中。然后将混合物在室温下搅拌过夜。完成后，用HCl的稀溶液洗涤有机层3次，并且然后用盐水洗涤。在减压下去除二氯甲烷，并且通过使用含30％乙酸乙酯的己烷在二氧化硅上进行快速色谱法纯化粗材料，以便以80％产率得到无色油状化合物4。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.81(d,J＝8.3Hz,2H),7.35(d,J＝8.2Hz,2H),4.19-4.15(m,2H),3.73-3.69(m,2H),3.67-3.63(m,2H),3.61(s,4H),3.37(t,J＝5.0Hz,2H),2.46(s,3H)。
化合物5的制备：将化合物3(1g，2.19mmol)溶解于无水DMF(15mL)中，并且在0℃下搅拌。将氢化钠(132mg，5.47mmol)分批缓慢添加到搅拌溶液中，并且将溶液搅拌15分钟。然后缓慢添加4-甲基苯磺酸2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙基酯4(862mg，2.63mmol)，并且在0℃下继续搅拌另外180分钟。借助于TLC监测反应。用饱和氯化铵溶液淬灭反应，并且用乙酸乙酯萃取。用水(3×50mL)和盐水(2×50mL)洗涤有机层，然后干燥(Na2SO4)、过滤并且在真空中蒸发。用KMnO4浸液对TLC进行染色。通过二氧化硅快速柱色谱法(乙酸乙酯/己烷25:75v/v)纯化粗产物，以便以70％的产率得到化合物5。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.92(ddt,J＝21.5,10.6,5.3Hz,5H),5.38-5.23(m,5H),5.18(dd,J＝10.5,1.2Hz,5H),4.06-3.90(m,10H),3.82-3.55(m,10H),3.55-3.34(m,18H).HRMS(ESI+-TOF)m/z:C31H53N3O9[M+H]+的计算值：612.7770；发现值：612.3852。
化合物6的制备：将六炔丙基化的化合物2(1当量)和叠氮基衍生物(每乙炔当量)悬浮于配备有磁力搅拌棒的5mL微波小瓶中的1:1的DMF与水的混合物中。向其中添加溶解于最小量的水中的CuS04 5H2O(每乙炔0.5当量)和抗坏血酸钠(每乙炔0.5当量)。将小瓶密封，并且在50℃下在微波中使反应辐射持续6小时。借助于TLC监测反应完成，并且完成后，用乙酸乙酯(60mL)稀释反应混合物。用EDTA饱和溶液洗涤有机层(3-4次)，并且用无水硫酸钠干燥，随后在真空中浓缩。已经广泛证明此程序去除痕量的铜盐。使用含3％甲醇的DCM作为洗脱液通过柱色谱法纯化所期望的化合物，以便以65％的产率得到透明油状化合物。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ7.69(s,6H),5.94-5.77(m,30H),5.18(dd,J＝57.0,13.8Hz,60H),4.51(s,24H),3.96-3.84(m,72H),3.68-3.49(m,52H),3.51-3.27(m,108H).(MALDI-TOF)m/z:C24H352N18O61的计算值：4153.2400；发现值：4153.4610。
化合物8的制备：在10mL玻璃小瓶中装入含烯烃封端的树枝状聚合物6(370mg，0.08mmol)和1-硫代甘油7(1.54ml，17.8mmol)的4mL DMF。添加2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(140mg，0.53mmol)，并且将反应混合物在UV光(365nm)下搅拌12小时。12小时之后，停止反应，并且使用二乙醚沉淀反应混合物。将形成的沉淀物用二乙醚洗涤若干次，以去除过量的1-硫代甘油。将残留物溶解于DMF中，并且相对DMF透析6小时，随后使用对应于1000MWCO的透析膜进行水透析持续8小时。然后将经过纯化的产物冻干，以便以70％的产率获得透明油状物。1H NMR(500MHz,MeOD)δ8.01(s,6H),4.58(d,28H),3.95(s,12H),3.80-3.73(m,32H),3.65(s,36H),3.62(d,36H),3.56(m,56H),3.54-3.51(m,60H),3.48-3.44(m,30H),3.40(s,50H),3.37(s,60H),2.73(dd,30H),2.67(t,J＝7.0Hz,60H),2.60(dd,28H),1.95-1.76(m,60H).13C NMR(126MHz,MeOD)δ144.7,124.3,73.1,71.4,70.5,70.1,69.4,64.6,63.9,50.0,47.1,45.6,42.1,35.0,29.6,29.1,26.8.(MALDI-TOF)m/z:C304H592N18O121S30的计算值：7397.8850；发现值：7425.4480。HPLC纯度：95.4％，保留时间：8.0分钟。
动态光散射(DLS)和ζ电位(ζ)
PEGOL-60的大小和ζ电位分布是使用配备有50mW He-Ne激光器(633nm)的Zetasizer Nano ZS(英国伍斯特马尔文仪器有限公司(Malvern Instrument Ltd.))通过动态光散射(DLS)确定的。将树枝状聚合物溶解于去离子水(18.2Ω)中，以使浓度为0.5mg/mL。通过乙酸纤维膜(0.2微米，颇尔生命科学公司(PALL Life Science))过滤溶液，并且在25℃下以173°的散射角一式三份地进行DLS测量。为了进行ζ电位测量，将树枝状聚合物溶解于10mM氯化钠溶液中以得到0.1mg/mL的浓度。读数一式三份地进行，并且记录平均值。
核磁共振(1H和13C{1H}NMR)
在环境温度下，在Bruker 500MHz光谱仪上记录1H和13C{1H}NMR光谱。相对于作为内标的四甲基硅烷(TMS)，以ppm为单位报告化学位移。将CDCl3(1H，δ7.27ppm；13C，δ77.0ppm(三重态的中心共振))、D2O(1H，δ4.79ppm)和CD3OD(1H，δ3.31ppm和13C，δ49.0ppm)的残留质子溶剂用于化学位移校准。1H NMR光谱中的共振多重性表示为“s”(单峰)、“d”(双峰)、“t”(三重峰)和“m”(多重峰)。宽共振用“b”表示。
高效液相色谱法(HPLC)
使用HPLC(马萨诸塞州米尔福德沃特斯公司(Waters Corporation))分析化合物的纯度。HPLC配备有1525二元泵、在线脱气器AF、717加自动进样器、2998光电二极管阵列检测器和与Waters Empower软件介接的2475多λ荧光检测器。使用对称C18反相柱(沃特斯)，粒径为5μm，长度为25cm，并且内径为4.6mm。使用PDI检测器在210nm处监测HPLC色谱图，并且使用PDI和荧光检测器两者在650nm和210nm两处监测荧光标记的缀合物。使用从90:10(H2O/ACN)开始的梯度流进行注射，在20分钟内逐渐增加到10:90(H2O/CAN)，并且在25分钟内回到90:10(H2O/ACN)，从而维持流速为1毫升/分钟。
质谱
使用正模式的ESI在BrukermicroTOF-II质谱仪上进行准确的质量测量(HRMS)，并且将样品直接引入CH3CN:H2O(9:1)溶剂系统。将质子化的分子离子[M+nH]n+或加合物[M+nX]n+(X＝Na,K,NH4)用于经验式确认。在Bruker Autoflex MALDI-TOF仪器上使用线性正模式和55-100％的激光功率进行MALDI-TOF实验。将芥子酸用作基质。
结果
假设树枝状聚合物表面上的高密度羟基的存在可以是这些树枝状聚合物在神经炎症位点处靶向的累积的驱动力。出于这一假设，制备了具有高密度表面羟基的基于PEG的树枝状聚合物。通过使用生物相容、廉价且水溶性的结构单元通过基于点击化学的高效化学转化而封端60个羟基(PEGOL-60)来开发靶向神经炎症的2代PEG树枝状聚合物纳米颗粒。
颗粒突破受损的BBB，并且在脑/视网膜中的受损位点处的活化的小胶质细胞、星形胶质细胞和其它细胞中累积。还评估了具有可比较的羟基表面密度(64个OH)的商业上可获得的双-MPA超支化的聚酯树状物大分子。
基于PEG的树枝状聚合物D2-OH-60(也称为PEGOL-60)的合成是使用超核和超单体策略完成的，从而以最少的合成步骤以较低的代获得了许多端基。使用如铜(I)催化的炔烃叠氮化物点击(CuAAC)和硫醇-烯点击化学等高效且稳健的化学反应构建树枝状聚合物(Sharma,A.等人,《ACS Macro快报》,3,1079(2014)；以及Rostovtsev,V.V.等人,《应用化学国际版(Angewandte ChemieInternational Edition)》,41,2596(2002))。通过在NaH和炔丙基溴的存在下进行二季戊四醇1的炔丙基化来合成超核2，以便以60％的产率获得六炔丙基化产物(方案1)。NMR光谱清楚地显示存在六个炔丙基质子。
Figure BDA0002578439840000471
方案1.超核(2)的合成
在两个合成步骤中制备超单体5(方案2)。在第一步骤中，对二季戊四醇1进行烯丙基化反应，以选择性地获得具有五个烯丙基的AB5单体，从而保持一个羟基臂完整。通过执行柱色谱法从三、四、五和六烯丙基化产物的混合物中分离纯产物3。然后使化合物3与单甲苯磺酰化三甘醇叠氮化物4反应，以获得具有一个叠氮官能团和五个烯丙基的AB5正交超单体5。叠氮基团的目的是参与核2上的CuAAC点击反应，而烯烃基团可以用于与硫醇化单体进行光催化的硫醇-烯点击反应。
Figure BDA0002578439840000481
方案2.超单体(5)的合成
然后使超核2和超单体5进行CuAAC点击反应，以产生具有30个端烯烃官能团的1代树枝状聚合物(6)。1H NMR揭示了在5.8ppm、5.2ppm和3.9ppm下烯丙基质子的出现，而在2.4ppm下示出炔丙基质子的明显消失。另外，三唑质子的明显尖峰在7.69ppm下出现在1HNMR中。化合物(6)的理论分子量为4153.24Da，并且MALDI-ToF分析揭示在4156.49Da下的峰证实了产物的形成。使化合物6(D1-烯丙基30)通过硫醇-烯点击反应与1-硫代甘油(7)反应，以产生表面处具有60个羟基的2代树枝状聚合物(D2-OH-60或PEGOL-60,8)。1H NMR显示烯丙基端基完全消失，并且硫代甘油基团中出现质子(2.8-2.5ppm)以及1.8ppm处出现特性亚甲基质子。通常，由于来自多个质子的重叠信号的存在，树枝状聚合物的1H NMR表征具有挑战性，但是对于PEGOL-60的构造来说，特性烯丙基和炔丙基信号的连续出现和完全消失允许简单且稳健的表征工具来精确地确认其结构。
Figure BDA0002578439840000491
方案3.具有60个端羟基的2代树枝状聚合物(8)的合成。
HPLC进一步确认了纯度，其中产物在每个步骤的保留时间上都示出明显的位移。D1-烯丙基30(化合物6)的保留时间为12.8分钟，并且相对更具极性的最终树枝状聚合物PEGOL-60(化合物8)在210nm处的保留时间为7.1分钟。MALDI-TOF光谱显示在7433Da下的峰，其与PEGOL-60的7398Da的理论分子量非常一致。PEGOL-60具有1.9±0.2nm的大小和接近中性的ζ电位(-1.90±0.67mV)。使用1H NMR、MALDI-ToF、HRMS和HPLC对所有其它中间体和最终化合物进行表征。
为了克服按比例扩大树枝状聚合物合成的传统挑战，已经开发了合成策略以产生具有高纯度和效率的复杂树突状结构。为了构建PEGOL-60，使用了超核-超单体和正交方法的组合，并且开发了加速方案以构建这种在较低代下具有高密度表面羟基的树枝状聚合物(与PAMAM树枝状聚合物在2代下为60个相比，在4代为64个)(R.Sharma等人,《高分子化学(Polymer Chemistry)》,5,4321(2014)；R.Sharma等人,《化学通讯》2014,50,13300)。使用这种加速方法，通过基于Cu(I)催化的炔烃叠氮化物(CuAAC)和硫醇-烯点击化学的高效和正交化学转化从核开始在四个反应步骤中合成PEGOL-60(V.V.Rostovtsev等人,《应用化学国际版》,41,2596(2002)；Hoyle CE等人,《应用化学国际版》2010,49,1540)。产生无缺陷树枝状聚合物的关键在于采用以逐层方式偶联结构单元的化学转化。由于空间拥挤，在较低代时似乎有效的常规偶联反应在具有较高数量的反应端的较高代变得迟滞，这导致结构缺陷和不对称。点击化学概念已经成为有价值的合成工具，该合成工具包括易于执行、高度稳健、高产、原子经济和模块化的反应池。在点击转化的列表中，因为具有高度的易选性、正交性和立体选择性，所以CuAAC和硫醇-烯点击是最强大且应用最广泛的两种。这些点击转化已经成功地用于聚合物化学、生物缀合反应、树枝状聚合物合成以及化学实体的巨大的文库的产生(Moses JE等人,《化学学会评论(Chemical Society Reviews)》2007,36,1249)。
实例2：荧光显像剂与树枝状聚合物纳米颗粒的缀合
方法和材料
中间体和树枝状聚合物的合成
化合物9的制备：向树枝状聚合物8(620mg，0.08mmole)于DMF(10mL)中的搅拌溶液中添加BOC-GABA-OH(85mg，0.41mmole)，然后添加EDC(160mg，0.83mmole)和DMAP(103mg，0.83mmole)。然后将反应混合物在RT下搅拌24小时。完成后，将反应混合物相对DMF透析6小时，随后用水透析12小时，每4小时更换水。然后将水溶液冻干以产生化合物9。1H NMR(500MHz,MeOD)δ7.94(s,7H),4.54-4.48(m,24H),3.88(s,16H),3.75-3.63(m,29H),3.60-3.53(m,66H),3.53-3.47(m,44H),3.47-3.42(m,56H),3.41-3.36(m,24H),3.33(s,55H),3.26(s,38H),2.71-2.45(m,122H),1.78(dd,J＝20.4,14.4Hz,68H),1.39(s,45H)。HPLC纯度：95.4％，保留时间：18.2分钟
化合物10的制备：向化合物9(620mg，0.08mmole)于无水DCM(3mL)中的搅拌溶液中逐滴添加三氟乙酸(0.6mL)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。然后蒸发溶剂，并且用甲醇稀释反应混合物，随后在旋转蒸发仪上蒸发。将这一过程重复若干次，以去除痕量的TFA。蒸发溶剂，以便以定量产率得到呈灰白色吸湿固体的化合物10。
化合物11的制备：向化合物10(600mg，0.07mmole)于DMF(5mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(0.2mL，以将溶液的pH调节到7.4)，随后添加溶解于1mL DMF中的Cy5 NHS酯(55mg，0.15mmole)。在RT下继续搅拌12小时。将反应混合物相对DMF透析12小时，每4小时更换DMF，随后用水透析6小时。然后将水溶液冻干，以便以％为单位的一定产率得到呈蓝色固体的化合物11。1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.37(t,J＝12.9Hz,Cy5 H),8.00(s,三唑H),7.82(s,Cy5H),7.64(t,J＝6.9Hz,Cy5H),7.33(d,J＝8.3Hz,Cy5 H),6.59(t,J＝12.3Hz,Cy5 H),6.31(d,J＝7.6Hz,Cy5 H),4.76-4.65(m,树枝状聚合物H),4.64-4.39(m,树枝状聚合物H),4.14(m,树枝状聚合物H),3.82(s,树枝状聚合物H),3.69-3.12(m,树枝状聚合物H),2.72-2.30(m,树枝状聚合物H),1.80-1.61(m,树枝状聚合物H),1.32-1.14(m,cy5 H),1.10(t,J＝7.0Hz,Cy5 H),0.99(t,J＝7.2Hz,Cy5 H)。HPLC纯度：92.3％，保留时间：12.1分钟
化合物13的制备：向G4-64OH-聚酯-超支化-双-MPA 12(2g，0.27mmole)于DMF(20mL)中的搅拌溶液中添加BOC-GABA-OH(280mg，1.36mmole)，随后添加EDC(470mg，2.5mmole)和DMAP(305mg，2.5mmole)。然后将反应混合物在RT下搅拌24小时。完成后，将反应混合物相对DMF透析12小时，随后用水透析12小时，每3小时更换水。然后将水溶液冻干以得到化合物13。产率：76％。1H NMR(500MHz,DMSO)δ4.25-4.10(m,树枝状聚合物H),3.59-3.34(m,树枝状聚合物H),1.63(dt,J＝13.8,6.7Hz,gaba连接子H),1.37(s,BOC H),1.15-0.95(m,树枝状聚合物H)。
化合物14的制备：向化合物13(1g，0.13mmole)于无水DCM(2ml)中的搅拌溶液中逐滴添加TFA(1.5ml)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。然后蒸发溶剂，并且用甲醇稀释反应混合物，随后在旋转蒸发仪上蒸发。将这一过程重复若干次，以去除痕量的TFA。蒸发溶剂，以便以定量产率得到化合物14。
化合物15的制备：向化合物14(200mg，0.02mmole)于DMF(3mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(0.1ml，以将pH调节到7.4)，随后添加溶解于1ml DMF中的Cy5 NHS酯(18.43mg，0.03mmole)。在RT下继续搅拌12小时。将反应混合物相对DMF透析12小时，每4小时更换DMF，随后用水透析24小时。然后将水溶液冻干，以便以82％的产率得到呈蓝色固体的化合物15。1H NMR(500MHz,DMSO)δ9.41(s,CY5 H),8.37(t,J＝12.8Hz,CY5 H),7.80(d,J＝22.5Hz,CY5H),7.63(t,J＝7.6Hz,CY5H),7.32(d,J＝8.0Hz,CY5 H),6.58(t,J＝12.2Hz,CY5 H),6.31(d,J＝13.6Hz,CY5 H),5.04-4.94(m,树枝状聚合物H),4.70-4.56(m,树枝状聚合物H),4.31-3.97(m,树枝状聚合物H),3.70-3.38(m,树枝状聚合物H),1.69(s,CY5 H),1.35-0.88(m,CY5&树枝状聚合物H)。HPLC纯度：100％，保留时间：11.5分钟
化合物17的制备：向8臂星形PEG 10K(16)(1g，0.1mmole)于DMF(15mL)中的搅拌溶液中添加BOC-GABA-OH(61mg，0.3mmole)，随后添加EDC(115mg，0.6mmole)和DMAP(74mg，0.6mmole)。然后将反应混合物在RT下搅拌24小时。完成后，将反应混合物相对DMF透析12小时，随后用水透析12小时，每3小时更换水。然后将水溶液冻干以得到化合物17。产率：70％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ4.17-4.08(m,PEG H),3.62-3.45(m,PEG H),1.66-1.56(m,连接子H),1.37(s,BOC H)。
化合物18的制备：向化合物17(1g，0.1mmole)于无水DCM(4mL)中的搅拌溶液中逐滴添加TFA(3mL)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。然后蒸发溶剂，并且用甲醇稀释反应混合物，随后在旋转蒸发仪上蒸发。将这一过程重复若干次，以去除痕量的TFA。蒸发溶剂，以便以定量产率得到化合物18。
化合物19的制备向化合物18(250mg，0.02mmole)于DMF(5mL)中的搅拌溶液中添加DIPEA(0.1ml，以将pH调节到7.4)，随后添加溶解于1mL DMF中的异硫氰酸荧光素(18mg，0.04mmole)。在RT下继续搅拌12小时。将反应混合物相对DMF透析12小时，每4小时更换DMF，随后用水透析24小时。然后将水溶液冻干，以便以定量产率得到呈黄色固体的化合物19。1HNMR(500MHz,DMSO)δ6.73-6.49(m,FITC H),4.57(t,J＝5.5Hz,PEG H),4.13(dd,J＝9.3,5.0Hz,PEG H),3.70-3.44(m,PEG H),1.82-1.68(m,连接子H)
结果
为了使用荧光光谱法和共焦显微镜研究生物分布，将荧光标签青色素5(Cy5)与树枝状聚合物D2-OH-60(化合物8)缀合。荧光团仅连接在树枝状聚合物的两个臂上，以维持其固有特性完整并且避免对生物分布产生任何影响。为了连接成像染料，使用EDC、DMAP将D2-OH-60(化合物8)与γ-(Boc-氨基)丁酸)偶联以获得树枝状聚合物9，D-GABA-NHBOC，随后使用三氟乙酸/DCM(1/5)对BOC基团进行脱保护以得到具有胺基的树枝状聚合物10。最后，具有作为TFA盐的两个胺基的树枝状聚合物10与Cy5单NHS酯在pH 7.0-7.5下反应，以获得Cy5标记的树枝状聚合物D2-OH-60-Cy5或PEGOL-60-Cy5(化合物11，方案4)。1H NMR清楚地揭示了缀合后芳香族区域中Cy5质子的存在，并且HPLC色谱图示出保留时间从D-GABA-NHBOC(化合物9，210nm)的8.4分钟到PEGOL-60-Cy5(化合物11，210nm和650nm)的7.6分钟的明显变化。
使用类似的方法，Cy5还连接到商业上可获得的双-MPA-G4-OH-64-聚酯-超支化聚合物(化合物12，方案5)和G4-PAMAM-OH-64。使用(方案6，化合物18)，使用类似的方法将异硫氰酸荧光素(FITC)与8臂星形PEG偶联。使用了线性PEG FITC和右旋糖酐FITC。
Figure BDA0002578439840000531
方案4.Cy5标记的树枝状聚合物11的合成。
Figure BDA0002578439840000532
方案5.Cy5标记的超支化双-MPA聚酯15的合成。
Figure BDA0002578439840000533
方案6.异硫氰酸荧光素(FITC)标记的8臂星形PEG(化合物19)的合成。
实例3：D2-OH-60-Cy5在脑中的定量脑分布
方法和材料
CP兔模型和D2-OH-60-cy5的施用
从罗宾逊服务公司(Robinson Services Inc.)(美国北卡罗来纳州)购买了定时怀孕的新西兰白兔，并且在外科手术前一周到达了该设施。所有动物均在环境条件(22℃，50％相对湿度和12小时的光/暗循环)下饲养，并且贯穿研究采取了必要的预防措施，以使与实验治疗相关的疼痛和应激最小化。实验程序得到了约翰霍普金斯大学动物保护和利用委员会(IACUC)的批准。经过一周的适应之后，在妊娠第28天(G28)对怀孕的兔进行剖腹手术，并且如先前所描述的沿子宫壁共接受3,200EU的脂多糖(LPS，大肠杆菌血清型0127:B8，密苏里州圣路易斯西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))注射(Saadani-Makki,F.等人,《美国妇产科杂志》,199,651el(2008)；和Kannan,S.等人,《脑血流与代谢杂志：国际脑血流与代谢学会的官方期刊(Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism:OfficialJournal Of The International Society Of Cerebral Blood Flow And Metabolism),31,738(2011))。幼仔在G31天(足月)自然产生，并且保存在温度为约32℃-35℃且相对湿度为约50％-60％的温育箱中。来自注射LPS的母兔的幼仔被定义为脑性瘫痪(CP)幼仔。
免疫组织化学
在PND1，动物接受静脉内(i.v.)施用D2-OH-60-cy5(55mg/kg，200μL)，并且在注射后24小时时处死。将兔麻醉，并且用PBS经心脏灌注，随后用10％福尔马林灌注。分离所有主要器官(肾脏、肺、肝、心脏)和血浆，并且快速冷冻。取出脑，并且分成两半。将一半快速冷冻以用于荧光定量，并且将另一半在10％福尔马林中固定过夜，并且在分级蔗糖溶液中冷冻保护。通过含3％正常驴血清的0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)阻断冠状切片(30μm，1:6系列)。然后将切片在4℃下与山羊抗IBAl(1:500，美国马萨诸塞州艾宾公司(Abeam))温育过夜。随后洗涤切片，并且与荧光二抗(1:250；1:250；美国马萨诸塞州生命技术公司(LifeTechnologies))在室温下一起温育2小时。接下来，将切片与DAPI(1:1000，英杰公司(Invitrogen))一起温育15分钟。洗涤之后，将载玻片干燥，并且用封固剂(美国加利福尼亚州卡平特里亚达科公司(Dako))做盖片。共焦图像使用Zeiss ZEN LSM 710(美国加利福尼亚州蔡司公司(Zeiss))获取，并且使用ZEN软件进行处理。
结果
为了评估D2-OH-60的体内分布，在出生后第1天(PND1)将D2-OH-60-Cy5(55mg/kg)系统地(i.v.)注射到CP幼仔中。注射后24小时，分析D2-OH-60-Cy5在如脑室周围白质区域(胼胝体、侧脑室角和内囊)和皮质等不同脑区域处的分布。D2-OH-60-cy5广泛分布于脑的所有区域，但在脑室周围区域(如穹窿和侧脑室)处的浓度较高。
为了评估D2-OH-60相比于双-MPA-G4-OH64的体内分布，在PND1，将D2-OH-60-cy5和双-MPA-G4-OH64-cy5(55mg/kg)系统地(i.v.)注射到CP幼仔中。在注射后24小时，分析了D2-OH-60-cy5和双-MPA-G4-OH64-cy5在脑室周围白质区域(胼胝体、侧脑室角和内囊)处的分布，在这些区域中发生最严重的脑损伤并且活化的胶质细胞累积于CP幼仔的脑中。将D2-OH-60-cy5与活化的小胶质细胞(IBA1阳性细胞)共定位于CP幼仔中，这类似于双-MPA-G4-OH64-cy5。D2-OH-60-cy5主要与活化的小胶质细胞共定位于CP幼仔中的脑室周围白质区域(包含胼胝体、侧脑室角和内囊)处。另外，还评估了D2-OH-60-cy5和双-MPA-G4-OH64-cy5在皮质中的分布。将D2-OH-60-cy5与分支的小胶质细胞(休眠小胶质细胞)共定位于皮质中，这也类似于双-MPA-G4-OH64-cy5。
接下来，评估D2-OH-60相比于PAMAM-G4-OH64的体内分布。在PND1，将D2-OH-60-cy5和PAMAM-G4-OH64-cy3(55mg/kg)系统地(i.v.)注射到CP幼仔中。注射后24小时，分析D2-OH-60-cy5和PAMAM-G4-OH64-cy3在脑室周围白质区域(胼胝体、侧脑室角)处的分布。将D2-OH-60-cy5和PAMAM-G4-OH64-cy3两者与活化的小胶质细胞共定位于CP幼仔中。将D2-OH-60-cy5和PAMAM-G4-OH64两者与活化的小胶质细胞共定位于CP幼仔中的脑室周围白质区域处，如胼胝体和侧脑室角。
还评估了线性PEG、星形PEG和右旋糖酐的体内分布。在PND1，将线性PEG、星形PEG和右旋糖酐(55mg/kg)系统地(i.v.)注射到CP幼仔中。注射后24小时，分析线性PEG、星形PEG和右旋糖酐在脑室周围白质区域(胼胝体、侧脑室角)处的分布。CP幼仔中的脑室周围区域(包含胼胝体和侧脑室角)中没有线性PEG、星形PEG或右旋糖酐，这表明线性PEG、星形PEG和右旋糖酐未穿过血脑屏障。
实例4：D2-OH-60-Cy5、双-MPA-G4-OH64-Cy5和PAMAM-G4-OH64-Cy5在脑和主要器官中的定量生物分布比较
方法和材料
以幼仔重量的55mg/kg重量的剂量向出生后(PND)第1天的脑性瘫痪(CP)幼仔静脉内施用所有三种基于树枝状聚合物的纳米颗粒(D2-OH-60-Cy5、双-MPA-G4-OH64-Cy5和PAMAM-G4-OH64-Cy5)。注射之后4小时和24小时时处死幼仔。用PBS灌注幼仔。分离所有主要器官(心脏、肺、肝、肾)和血浆，并且快速冷冻。如定量生物分布部分所提及的，取出脑，并且将一半快速冷冻保存用于荧光定量，并且将另一半保存用于共焦成像。
为了通过荧光光谱法评估树枝状聚合物在脑内的分布和定量，将脑进一步微解剖成三个子区域：皮质、脑室周围区域(PVR)和海马体。图2示出了D2-OH-60-Cy5和商业上可获得的双-MPA-G4-OH64-Cy5以及PAMAM-G4-OH64-Cy5在这三个子区域中的比较脑分布。具有高密度表面羟基的所有三种树枝状聚合物均可以穿过受损的血脑屏障(BBB)，并且以类似的量存在于皮质、PVR和海马体中。尽管似乎在4小时的时间点存在更多双-MPA，但在24小时时没有示出任何差异。与在PVR区域中示出更多累积的PAMAM不同，D2-OH-60-Cy5和双-MPA-G4-OH64-Cy5在所有三个子区域中均示出类似的分布。与健康对照相比，D2-OH-60-Cy5和双-MPA-G4-OH64-Cy5两者示出在PND1 CP幼仔的皮质、PVR和海马体中的摄取高出若干倍(图3)。除了在肾脏和血浆中之外，所有三种树枝状聚合物在所有其它主要器官(心脏、肺、肝脏)中的分布均类似。与PAMAM-G4-OH64-Cy5相比，肾脏和血浆中的D2-OH-60-Cy5和双-MPA-G4-OH64-Cy5的量在4小时和24小时两者时均少得多，这表明其循环时间更短并且肾清除更快(图4)。
实例5：眼中PEGOL-60-Cy5的定量分布
方法和材料
大鼠脂质注射的AMD模型和PEGOL-60-Cy5的施用
这一实验性AMD模型选用8周龄的斯普拉-道来(SD)大鼠。这些研究根据ARVO指南和约翰·霍普金斯大学(Johns Hopkins)批准的动物方案进行。将大鼠饲养在环境条件(22℃、50％相对湿度和12小时的光/暗循环)下。在第0天，使用微量注射器在视网膜下注射含2μL HpODE(脂质)的0.5M硼酸盐缓冲液(20μg/mL)，以在视网膜下形成气泡。为了评估脂质注射之后第3天D2-OH-60-Cy5的眼部生物分布，将D2-OH-60-Cy5调配成无菌盐水(200μL)，并且以20mg/Kg的浓度静脉内施用。在施用树枝状聚合物后48小时和7天时处死大鼠。在安乐死之后的适当时间点摘除眼球，并且进行铺片和横截面分析。
组织处理、免疫组织化学和共焦成像。
铺片：将眼球在冰中在PBS中温育1小时，并且去除包含晶状体的前段。将视网膜和脉络膜分离并且在2％PFA中固定12小时，随后用山羊血清封闭6小时。使用抗兔Iba-1将小胶质细胞/巨噬细胞在4℃下染色12小时，并且用Cy3标记的山羊抗兔抗体再次染色。将FITC标记的凝集素用于标记和染色血管和单核细胞。使用4个径向弛豫切口制备铺片，并且将其安装在盖玻片上，并且在共焦710显微镜下使用平铺、Z堆叠功能成像。使用Zeiss软件对图像进行处理。
横截面：将眼球在含5％蔗糖的2％PFA中固定3小时，并且去除包含晶状体的前段，并且对后段进行蔗糖梯度处理直到20％为止。使用OCT将组织冷冻保存，并且沿视神经切片(10μm切片)。用山羊血清封闭切片，并且使用Iba-1对小胶质细胞/巨噬细胞进行染色，使用凝集素对血管和单核细胞进行染色，并且使用DAPI对细胞核进行染色。将染色的切片在共焦710显微镜下进行成像。
结果
除脑渗透之外，还检查了PEGOL-60-Cy5与活化的mi/ma在视网膜下脂质注射诱导的年龄相关性黄斑变性(AMD)模型中的共定位以确定其穿过血视网膜屏障的能力，以便应用于眼后部疾病中(Baba T,《美国病理学杂志(The American Journal of Pathology)》2010,176,3085。
AMD是多因素眼部退行性疾病，其涉及多种活化的mi/ma介导的病理学，包含氧化应激、炎症和新血管形成(Madeira MH,《炎症介质(Mediators of Inflammation)》2015,2015,15)。毒性脂质的病理性堆积导致患者视力丧失，并且目前尚无可行的针对干性和早期AMD的可用疗法。
在视网膜下注射脂质产生的干性AMD大鼠模型中，对PEGOL-60-Cy5的靶向能力进行了测试，以诱导细胞损伤，从而导致称为气泡的新血管形成区域。脉络膜铺片的共焦成像示出以最小信号在健康组织中全身性施用之后用活化的mi/ma定位的PEGOL-60-Cy5信号特异性地位于气泡区域中。
铺片和横截面两者均表明PEGOL-60-Cy5树枝状聚合物靶向视网膜和脉络膜组织两者的炎症区域并且保留在这些炎症区域中。在视网膜组织中，发现PEGOL-60-Cy5定位于小胶质细胞中，这些小胶质细胞累积在径向血管和气泡边缘的毛细血管附近。用凝集素对血管进行染色，用Iba-1对小胶质细胞/巨噬细胞进行染色，使用Cy5标记树枝状聚合物(PEGOL-60-Cy5)，并且用DAPI对细胞核进行染色。5X放大率表明，静脉内施用的树枝状聚合物仅位于炎症区域中。更高的放大率图像(40X)表明，发现PEGOL-60-Cy5共定位于视网膜的气泡区域中的渗漏血管附近的活化的小胶质细胞/巨噬细胞中。高放大率图像清楚地表明，PEGOL-60-Cy5共定位于与受损区域相关的视网膜小胶质细胞中，从而确认了靶向的定位。
在脉络膜组织中，仅在对应于脉络膜中的气泡区域的受损区域中的活化的巨噬细胞和肥大性视网膜色素上皮(RPE)中发现了树枝状聚合物。用Iba-1和树枝状聚合物(D2-OH-60-Cy5)对脉络膜组织的凝集素(血管)、小胶质细胞/巨噬细胞进行染色。20X图像示出在气泡区域发现了树枝状聚合物，并且更高的放大率图像(40X图像)证实了树状大分子共定位于气泡区域中的活化的巨噬细胞和肥大性视网膜色素上皮(RPE)中。
对后段(视网膜+脉络膜复合体)进行横断面分析，以获得详细的生物分布。切片揭示出，在视网膜中，树枝状聚合物共定位于活化的小胶质细胞、Müller胶质细胞(基于定位)和单核细胞中。对大鼠眼后段的十微米切片的凝集素(血管)、小胶质细胞/巨噬细胞(Iba-1)、细胞核(DAPI)和使用Cy5标记的树枝状聚合物(PEGOL-60-Cy5)进行染色。5X图像揭示了整个后段切片，其中气泡区域具有炎症特性(标记为Iba-1阳性的累积细胞)。更高的放大率20X图像表明，树枝状聚合物仅共定位于脉络膜和视网膜中的活化的小胶质细胞/巨噬细胞和视网膜中的Müller细胞的炎症区域中。因此，横截面证实了这些发现，示出PEGOL-60定位于视网膜和脉络膜中的活化的mi/ma和CNV血管中，在气泡区域而不是眼睛的健康区域中。
总之，PEGOL-60表明了在全身性施用后大鼠AMD模型中视网膜和脉络膜中的病理依赖性生物分布。这些结果表明，PEGOL-60是用于AMD的全身性靶向疗法的有希望的药物载剂，在AMD以及其它后段眼病(如糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、色素性视网膜炎和葡萄膜炎)中，几乎没有可行的可用治疗性干预措施(M.Karlstetter等人,《视网膜与眼科研究进展(Progress in Retinal and Eye Research)》,45,30(2015))。
实例6：PEGOL-60-Cy5靶向胶质母细胞瘤(GBM)小鼠模型中的肿瘤相关巨噬细胞
方法和材料
GBM的小鼠模型和PEGOL-60-Cy5的施用
6-8周大的C57BL/6小鼠购自杰克森实验室(Jackson Laboratories)(美国缅因州巴尔港)，并且实验程序遵循ACUC批准的方案进行。使GL261鼠类GBM肿瘤细胞在37℃和5％CO2下在补充有10％热灭活的FBS(吉博科实验室(Gibco Laboratories))、1％pen/strep抗生素(吉博科实验室)和1％1-谷氨酰胺(吉博科实验室)的低谷氨酰胺RPMI(马里兰州盖瑟斯堡吉博科实验室)中在温育箱中生长。通过胰蛋白酶脱离(纽约康宁康宁公司(CorningInc))收集细胞用于接种。通过IP注射100mg/kg氯胺酮(纽约州梅尔维尔汉瑞祥公司(HenrySchein))和10mg/kg甲苯噻嗪(爱达荷州博伊西VetOne公司)在生理盐水(马里兰州盖瑟斯堡质量生物有限公司(Quality Biological Inc.))中的混合物对小鼠进行麻醉。沿颅骨的中线制造切口，并且钻一个钻孔以供汉密尔顿氏注射器(内华达州里诺汉密尔顿公司(Hamilton Company))插入。通过立体定位框架和自动注射泵(伊利诺伊州伍德戴尔Stoelting公司)以0.2微升/分钟的速率将含100,000个GL261细胞的2μL培养基注射到右半球纹状体中。然后将小鼠缝合(爱惜康公司(Ethicon Inc.)；新泽西州萨默维尔)，并且监测外科手术恢复。为了施用PEGOL-60-Cy5，在接种后第15天向小鼠静脉内注射55mg/kgPEGOL-60-Cy5。施用之后24小时，对小鼠进行灌注并且收集脑。
GBM模型的免疫组织化学和共焦成像
在肿瘤接种后第14天，向动物静脉内施用55mg/kg PEGOL-60-Cy5，并且在24小时后收集脑。将脑在10％福尔马林(西格玛奥德里奇公司)中固定24小时，随后从10％到30％的蔗糖梯度各自固定24小时。然后将脑冰冻，并且冠状地切片成30μm的切片。在室温下，将脑切片在补充有0.1％Triton-X(西格玛奥德里奇公司)、1％牛血清白蛋白(西格玛奥德里奇公司)和5％正常山羊血清(西格玛奥德里奇公司)的1x TBS(吉博科实验室)中封闭持续4小时。用番茄凝集素(1:1000，Vector实验室；加利福尼亚州伯林盖姆)标记小胶质细胞，并且用NucBlue DAPI细胞染色(英杰公司)标记细胞核。然后用封固剂(达科公司)对载玻片做盖片。在Zeiss ZEN LSM710(蔡司公司)上获取共焦图像，并且用ZenLite软件进行处理。
结果
在GBM的鼠类模型中进一步评估PEGOL-60，以估计在促炎性疾病中用活化的mi/ma进行的这种特异性共定位是否也延伸到靶向性抗炎M2表型mi/ma中，以及其是否可以贯穿实体肿瘤均匀地分布。这些靶肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是宿主巨噬细胞，这些宿主巨噬细胞具有诱导的抗炎表型以促进肿瘤生长并且通过来自癌细胞的分泌信号抑制肿瘤杀伤免疫应答，从而使其成为免疫调节剂再极化成抗癌细胞的理想治疗靶标(Yang Y等人,《血液学与肿瘤学(Hematol Oncol)》2017,10,58)。
尽管发现了许多强而有力的新抗癌疗法，但临床结果并未转化为GBM，因为这些治疗不能以临床相关的量穿透BBB并且进入实体脑肿瘤中，由此需要导致全身性毒性的高剂量。探索了PEGOL-60-Cy5在GBM的GL261颅内注射小鼠模型中的肿瘤靶向能力，该模型已经得到广泛表征并且已知密切概括人的免疫特性(Jacobs VL等人,《ASN神经(ASN Neuro)》2011,3,AN20110014)。
将GL261鼠类GBM细胞接种到小鼠的纹状体中，并且在接种后第15天静脉内施用PEGOL-60-Cy5。
全身性施用后，PEGOL-60-Cy5选择性地靶向肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。施用后24小时时收集脑，并且收集和检查树枝状聚合物(Cy5)、细胞核(DAPI)和TAM(凝集素)的共焦图像。PEGOL-60与TAM共定位在肿瘤中，而在对侧半球的健康脑组织展现出最小的树枝状聚合物信号。共焦图像还表明，PEGOL-60完全穿透肿瘤中心，并且贯穿肿瘤均匀分布在TAM之间。树枝状聚合物摄取清楚地描绘了肿瘤边界，其中树枝状聚合物信号处于肿瘤内的TAM中，而在肿瘤周围区域看到的信号极少。
总之，已经证明在全身性施用后，PEGOL-60-Cy5特异性地靶向实体瘤内的TAM，同时在对侧半球中展现出最小的信号。树枝状聚合物能够完全穿透实体肿瘤并且贯穿实体肿瘤分布，从而克服实体肿瘤递送的BBB和传统屏障两者，如脉管系统发育不良和高间质液压力。PEGOL-60-Cy5的信号清楚地描绘了肿瘤区域，这证明了其对脑健康部位(甚至在肿瘤周围区域)超过mi/ma的TAM的特异性。这些发现表明，PEGOL-60提供了理想的纳米平台，使用该纳米平台将免疫疗法特异性且系统性地递送到GBM中的实体瘤中，而不会损害健康脑组织。
实例7：PEGOL-60的抗氧化和抗炎活性的体外评估
方法和材料
细胞培养
从密歇根州儿童医院的细胞培养设施获得BV2鼠类小胶质细胞。将细胞在37℃和5％CO2下在补充有10％热灭活的胎牛血清和1％pen/strep的DMEM(吉博科实验室)中在温育箱中进行培养。每3天通过胰蛋白酶脱离和传代来维持细胞。在80％-90％汇合时，收集细胞并且接种在24孔板中用于实验。
细胞毒性评估
将BV-2鼠类小胶质细胞细胞系如实验部分所描述的进行培养，并且以每孔10,000个细胞的浓度接种在96孔板(西格玛公司(Sigma))的交替孔中。然后允许细胞粘附并且生长24小时。在补充有10％HI-FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基中制备1000μg/mLPEGOL-60储备溶液，对其进行涡旋、超声处理和无菌过滤。然后将此溶液在培养基中稀释以制成100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL和0.1μg/mL PEGOL-60的储备溶液。将培养基从96孔板的所有孔中吸出，并且将含有PEGOL-60的培养基或新鲜培养基替换在细胞上，这允许其再培养另外24小时。制备12mM MTT(加利福尼亚州卡尔斯巴德英杰公司)在无菌PBS中的储备溶液，并且通过涡旋和超声波处理进行混合。从所有孔中去除培养基，并且向每个孔中添加100μL新鲜培养基以及另外的通过移液与培养基混合的10μL MTT溶液。然后允许细胞在MTT中温育四小时，之后将85μL MTT培养基去除，并且用如通过移液完全混合的150μL DMSO(康宁公司)替换。将DMSO与细胞在37℃下温育10分钟，之后在运行Gen5软件的协同Mx微孔板读数器(佛蒙特州威努斯基伯腾公司(BioTek))上读取每个孔在λ＝540nm处的吸光度之前，再次通过移液将孔混合。在减去培养基对照的背景后，将吸光度全部转化为与未经处理的细胞相比的比率。使用三个板，并且在每个板上一式三份地进行处理，并且取平均值以产生一个数据点。
LPS刺激和评估
将BV2鼠类小胶质细胞接种在24孔板中。在无血清培养基中，用100ng/ml LPS(西格玛奥德里奇公司)刺激细胞3小时，随后与PEGOL-60和100ng/ml LPS共温育24小时。将PEGOL-60溶解于培养基中，并且通过20μm孔过滤器冲洗过滤。通过格里斯反应(Griessreaction)收集培养基并且分析亚硝酸盐的产生(威斯康辛州麦迪逊普洛麦格公司(Promega Corporation))，并且通过ELISA(加利福尼亚州圣地亚哥生物传奇公司(Biolegend))分析TNFα分泌。
将细胞收集在1mL Trizol(英杰公司)中用于PCR分析。简而言之，添加200μL氯仿(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))，并且摇动样品，并且在冰上温育15分钟。然后将样品以12000rpm离心15分钟，并且收集水性级分。向每种样品中添加500μL异丙醇(赛默飞世尔公司)，混合，并且在冰上温育10分钟。再次将样品以12000rpm离心15分钟，并且用含75％乙醇的DEPC水(英杰公司)洗涤。将样品用nanodrop(赛默飞世尔公司)进行测定以确定RNA浓度并且转化为cDNA(加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司(Applied Biosystems))。将样品在StepOne Plus实时PCR系统(应用生物系统公司)上用快速PCR板上的绿色syber试剂(赛默飞世尔公司)进行测量。通过相对于未经处理的、未经刺激的对照样品归一化的2-ΔΔCT计算来确定相对表达。从伯乐公司(Biorad)(加利福尼亚州赫拉克勒斯伯乐实验室(Bio-Rad Laboratories)获得IL10、iNOS和CD204的PCR引物。TNFα(F:CCA GTG TGG GAAGCT GTC TT(SEQ ID NO:1)；R:AAG CAA AAG AGG AGG CAA CA(SEQ ID NO:2)、IL6(F:TCCAGT TGC CTT CTT GGG AC(SEQ ID NOG:3)；R:GTG TAA TTA AGC CTC CGA CTT G(SEQ IDNO:4))、Argl(F:TCA TGG AAG TGA ACC CAA CTC TTG(SEQ ID NO:5)；R:TCA GTC CCT GGCTTA TGG TTA CC(SEQ ID NO:6))、IL4(F:TGT AGG GCT TCC AAG GT(SEQ ID NO:7)；R:GAAAGA GTC TCT GCA GCT C(SEQ ID NO:8))以及GAPDH(F:TGT CGT GGA GTC TAC TGG TGTCTT C(SEQ ID NO:9)；R:CGT GGT TCA CAC CCA TCA CAA(SEQ ID NO:10))的PCR引物购自集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies)(爱荷华州科拉尔维尔集成DNA技术公司)。
氧化应激诱导的细胞死亡
将BV2鼠类小胶质细胞用D2-OH-60预处理24小时，然后用500μM H2O2(西格玛奥德里奇公司)氧化应激损害持续3小时。通过胰蛋白酶化收集细胞，将其与台盼蓝(康宁公司)1:1混合，并且对细胞活力进行计数。
结果
研究了PEGOL-60固有的抗氧化和抗炎功效(Posadas I等人,《美国国家科学院学报(Proceedings of the National Academy of Sciences)》2017,114,E7660；Chauhan AS等人,《生物大分子(Biomacromolecules)》2009,10,1195)。首先，通过MTT测定发现暴露24小时之后PEGOL-60在高达至少1000μg/mL下没有细胞毒性(图5；n＝3,p<0.05)。
为了估计PEGOL-60的治疗功效，用LPS攻击BV2鼠类小胶质细胞以诱导促炎状态，然后与LPS和PEGOL-60共处理并且估计炎症和氧化应激的标志物。在不添加任何抗氧化剂或抗炎剂的情况下，用PEGOL-60进行的处理导致包含TNF-α、IL-6、IL-10和iNOS(图6A-6D)的促炎细胞因子表达显著降低以及以通常剂量依赖性方式上调抗炎标志物CD-206、Arg-1和IL-4(图6E-6G)。通过高500μg/ml PEGOL-60处理，促炎标志物和抗炎标志物两者均恢复到接近健康水平。在蛋白质水平上，这导致细胞外分泌的TNFα(图6H；p<0.001)和亚硝酸根离子(图6I；p<0.001)显著降低。
基于这种强大的抗氧化作用，还估计了PEGOL-60在氧化应激损害后的功效。H2O2攻击之后，用PEGOL-60进行的预处理导致细胞活力(图6J；p<0.001)显著改善。这种抗氧化作用与在体外和体内两者观察到的没有治疗有效载荷的若干种其它树枝状聚合物构建体的结果一致(Neibert K等人,《分子药剂学》2013,10,2502；Posadas I等人,《美国国家科学院学报》2017,114,E7660；Chauhan AS等人,《生物大分子》2009,10,1195)。这种抗氧化作用可能是由于树枝状聚合物主链中的自由电子充当清除剂中以和活性氧物质(ROS)而造成的。主链中的这些清除剂对(ROS)的进入可能受到支化臂的空间抑制，其中每个连续的代层均进一步屏蔽内部。PEGOL-60具有作为优异的纳米载剂的理想特性，因为其以相对低的代实现了高密度羟基，从而允许主链可用于ROS清除。
实例8：PEGOL-60的体内功效和安全特性
方法和材料
PEGOL-60的体内施用
在PND1，将CP组的同窝仔畜随机地分为3个子组：PBS、PEGOL-60单剂量和PEGOL-60重复剂量组。PEGOL-60单剂量组中的兔在PND1接受单剂量PEGOL-60(100mg/kg，200μL)静脉内注射。PEGOL-60重复剂量组中的兔在PND1和PND3接受PEGOL-60(100mg/kg，200μL)静脉内注射。PBS组中的兔在PND1接受单剂量PBS(200μL)静脉内注射。注射前，所有用于施用的溶液均使用0.2um
Figure BDA0002578439840000631
注射器过滤器(纽约州华盛顿港颇尔公司(PallCorporation))进行灭菌。
行为测试
每天监测动物(n＝6)的总体身体状况(例如，体重增加、食物摄取等)。在药物施用之前(基线，0小时)以及药物施用后24小时、48小时和96小时，由对实验不知情的人员在PND1进行神经行为测试。
对每只动物进行录像持续10分钟，并且以0-3的量表(0＝最差；3＝最佳)对头部移动进行评分，如先前针对兔所描述的(E.Nance等人,《生物材料》,101,96(2016)；Z.Zhang等人,《疾病神经生物学(Neurobiology of Disease)》,94,116(2016))。用Wombaroo兔代乳品(密歇根州贝尔维尔完美宠物公司(Perfect Pets Inc))喂养幼仔，并且以0-3的量表(最差-最佳)对吮吸/吞咽进行估计(J.Yang等人,《化学评论(Chemical Reviews)》115,5274(2015))。为了使疾病表型变异性的影响最小化，使用每个幼仔在治疗前(0小时)和治疗后24小时、48小时和96小时的行为评分变化来评估疗法的功效。详细地说，将治疗前(0小时)每个幼仔在PND1的行为评分用作基线评分。每个幼仔在治疗后24小时、48小时和96小时的神经行为评分的变化计算如下：
从基线的变化(48)＝评分(48小时)-评分(0小时)或从基线的变化(96)＝评分(96小时)-评分(0小时)
将每个组中的所有幼仔的变化进行求平均，并且在各组之间进行比较。
实时PCR
在PND5，对来自所有组的幼仔(n＝3)实施安乐死。快速采集脑，并且将其储存于RNAlater溶液(美国纽约州格兰德岛生命技术公司)中。对脑室周围区域(PVR)白质和小脑白质区域进行显微解剖(约50mg)。根据制造商的说明，使用TRIZOL(美国纽约州格兰德岛生命技术公司)萃取总RNA。使用Nanodrop ND-1000分光光度计(马里兰州沃克斯维尔赛默飞世尔科技公司)对RNA样品进行定量。首先使用含有RNase抑制剂的高容量cDNA逆转录试剂盒(美国纽约州格兰德岛生命技术公司)从总RNA样品中逆转录单链互补DNA(cDNA)。使用快速7500实时PCR系统(美国纽约州格兰德岛生命技术公司)，使用Power
Figure BDA0002578439840000641
绿色PCR预混液(Green PCR Master Mix)(美国纽约州格兰德岛生命技术公司)进行实时PCR。扩增条件包含在48℃下进行30分钟、在95℃下进行10分钟、在95℃下进行40个循环持续15秒和在60℃下持续1分钟。引物是定制设计并且从集成DNA技术公司(美国爱荷华州)订购的。将比较Ct方法用于估计差异基因表达。相对于对给定样品(ΔCt)内的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)进行编码的管家基因的表达水平归一化每个样品的基因表达水平；将治疗组与健康对照组之间的差异用于确定ΔΔCt。2-△△Ct给出了基因表达的相对变化倍数。引物是：
TNF-α(正向)TAGTAGCAAACCCGCAAGTG(SEQ ID NO:11)；
TNF-α(反向)CTGAAGAGAACCTGGGAGTAGA(SEQ ID NO:12)。
IL-1β(正向)TGCCAACCCTACAACAAGAG(SEQ ID NO:13)；
IL-1β(反向)AAAGTTCTCAGGCCGTCATC(SEQ ID NO:14)。
IL-6(正向)CATCAAGGAGCTGAGGAAAGAG(SEQ ID NO:15)；
IL-6(反向)CCTTGGAAGGTGCAGATTGA(SEQ ID NO:16)。
GAPDH(正向)TGACGACATCAA GAA GGTGGTG(SEQ ID NO:17)；
GAPDH(反向)GAAGGTGGAGGAGTGGGTGTC(SEQ ID NO:18)。
结果
在出生后(PND)第1天，将CP同窝仔畜随机地分为3个子组：PBS、PEGOL-60单剂量和PEGOL-60重复剂量组。通过在PND1静脉内注射，PEGOL-60单剂量组中的兔以100mg/kg接受单剂量的含PEGOL-60的200μL无菌PBS。通过在PND1和PND3静脉内注射，PEGOL-60重复剂量组中的兔以100mg/kg接受含PEGOL-60的200μL无菌PBS。通过在PND1静脉内注射，PBS组中的兔接受单剂量的PBS(200μL)。每天监测兔幼仔的总体状况、神经行为和体重。应注意，各组之间的吮吸和吞咽、头部移动和体重增加没有显著差异(图7A-C)。此外，各组之间的细胞因子表达没有显著变化(图7D-F)。这些结果表明，PEGOL-60不会进一步削弱CP幼仔中的神经行为评分，这表明PEGOL-60是用于体内的无毒载剂。
实例9：PEGOL-60-Cy5生物分布在脑性瘫痪(CP)新生兔模型中的定量脑分布
方法和材料
CP兔模型和PEGOL-60-Cy5的施用
从罗宾逊服务公司(美国北卡罗来纳州)购买了新西兰白兔，并且在繁殖前两周到达该设施。所有动物均在环境条件(22℃，50％相对湿度和12小时的光/暗循环)下饲养，并且贯穿研究采取了必要的预防措施，以使与实验治疗相关的疼痛和应激最小化。实验程序得到了约翰霍普金斯大学动物保护和利用委员会(IACUC)的批准。在妊娠第28天(G28)对定时怀孕的兔进行剖腹手术，并且如先前所描述的沿子宫壁共接受3,200EU的脂多糖(LPS，大肠杆菌血清型O127:B8，密苏里州圣路易斯西格玛奥德里奇公司)注射(F.Saadani-Makki等人,《美国妇产科杂志》,199,65l.el(2008)；S.Kannan等人,《发展神经科学(DevelopmentalNeuroscience)》,33,231(2011)；S.Kannan等人,《发展神经科学-巴塞尔(Dev Neurosci-Basel)》,33(2011))。在G30，通过静脉内注射
Figure BDA0002578439840000651
(0.5单位/千克)(密歇根州罗契斯特市JHP制药公司(JHP Pharmaceuticals))诱导兔。分娩之后，将兔幼仔保持在温度为约32℃-35℃并且相对湿度为约50％-60％的温育箱中，并且每天喂饲兔代乳品(澳大利亚南澳大利亚州Wombaroo公司)三次。在出生后第1天(PND1)，健康对照和CP幼仔通过静脉内注射接受单剂量的PEGOL-60-Cy5(55mg/kg，200μL)。在注射后1小时、4小时和24小时时处死CP幼仔。注射后24小时处死健康对照。注射前，所有用于施用的溶液均使用0.2um
Figure BDA0002578439840000652
注射器过滤器(纽约州华盛顿港颇尔公司)进行灭菌。
CP模型的免疫组织化学
在PND1，动物接受静脉内(i.v.)施用PEGOL-Cy5(55mg/kg，200μL)，并且在注射后24小时时处死。将兔麻醉，并且用PBS经心脏灌注。分离所有主要器官(肾脏、肺、肝、心脏)和血浆，并且快速冷冻。取出脑，并且分成两半。将一半快速冷冻以用于荧光定量，并且将另一半在10％福尔马林中后固定48小时，并且在分级蔗糖溶液中冷冻保护。通过含3％正常驴血清的0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)阻断冠状切片(30μm，1:6系列)。对于PEGOL-60-Cy5和小胶质细胞共定位，将切片与山羊抗IBAl(1:250，美国马萨诸塞州艾宾公司)在4℃下温育过夜。随后洗涤切片，并且与荧光二抗(1:250；美国马萨诸塞州生命技术公司)在室温下一起温育2小时。接下来，将切片与DAPI(1:1000，英杰公司)一起温育15分钟。洗涤之后，将载玻片干燥，并且用封固剂(美国加利福尼亚州卡平特里亚达科公司)做盖片。共焦图像使用ZeissZEN LSM 710(美国加利福尼亚州蔡司公司)获取，并且使用ZEN软件进行处理。
CP幼仔脑显微解剖程序
处死和灌注后，将每个兔幼仔脑的一个半球快速冷冻并且保存在-80℃下，直到遵循最近出版的手稿中概括的步骤进行显微解剖为止。简而言之，在干冰床上的一次性替氏培养皿(petri dish)中使脑温热，然后用干净的剃刀刀片将其切成相等厚度的五个部分。丢弃脑干和带有嗅球的前部部分，之后用最新的手术刀片将剩余部分的皮质取出，并且将其放置于预先称重的1.5mL埃彭道夫管(Eppendorf tube)中。然后在放大镜下从剩余组织中分离出海马体和脑室周围区域，并且将其放置于单独的预先称重的1.5mL埃彭道夫管中。再次对每个埃彭道夫管进行称重以确定样品质量，然后将所有样品储存于-80℃下，直到通过均质化进行下游处理并且萃取为止。获得每个脑的三个皮质样品、两个PVR样品和一个海马体样品，将这些样品各自一起求平均，以为每个脑的每个脑亚单位提供一个树枝状聚合物摄取值。
从组织样品中萃取树枝状聚合物
简而言之，从-80℃取出器官(心脏、肺、肝脏、肾脏、脑)，在冰上缓慢解冻，并且对其进行称重。解剖器官以获取已知量的组织样品(3份来自肝脏、肺、肾脏，并且2份来自心脏)。使用最近发布的方案进一步对脑半球进行显微解剖，以分离皮质、海马体和脑室周围区域。从脑的这些子区域中获取已知量的组织样品(3份来自皮质、2份来自PVR并且1份来自海马体)。在Bullet Blender Storm 24组织均质器(纽约州阿弗里尔帕克村下一代优势公司(Next Advantage Inc.))上，用在甲醇中的0.9mm-2.0mm不锈钢均质珠以1mL:100mg组织比率将组织样品均质化持续10分钟，在4℃下脑功率水平为6，并且所有其它主要器官功率水平为12。然后，在4℃下将均质化的样品以15000rpm离心10分钟。将澄清的上清液转移到蛋白质lo-bind埃彭道夫管中，并且储存在-80℃下。
荧光定量
将上清液解冻，再次离心，并且将130μL上清液转移到微量比色皿(加利福尼亚州阿塔斯卡德罗Starna细胞公司(Starna Cell Inc.))中以进行测量。使用运行Panorama3软件(马里兰州哥伦比亚岛津科学仪器有限公司(Shimadzu Scientific Instruments))的RF5301PC荧光分光光度计，确定每个样品中Cy5的荧光强度(λex＝645nm，λem＝662nm)。根据健康对照组织的荧光值调整背景荧光。然后使用D2-OH-60-Cy5的校正曲线将荧光强度值转换为树枝状聚合物浓度，以获得适当的狭缝宽度。将血浆在dPBS(康宁公司)中稀释10倍，然后通过0.2μm孔PES过滤器，并且如上文针对器官样品所描述的进行测量。
结果
分别使用共焦显微镜和荧光光谱法在定性和定量两者上评估新生兔脑瘫模型中PEGOL-60-Cy5的体内BBB渗透和靶向神经炎症的能力。CP由对发育中的脑造成的损伤/损害(包含母体感染/炎症)引起的，并且导致后代出现运动、感觉和认知障碍(Rosenbaum PN等人,《医学发展和儿童神经病学(Developmental Medicine&Child Neurology)》,49,8(2007))。以未成熟白质中弥漫性小神经胶质和星形胶质细胞活化为特征的脑室周围白质软化症是人CP的病理生理标志之一(Haynes RL等人,《神经病理学与实验神经学杂志(Journal of Neuropathology&Experimental Neurology)》,62,441(2003))。除白质损伤外，CP还涉及灰质区域的神经元损伤，包含CP患者的脑皮质和海马体(Andiman SE等人,《脑病理学(Brain Pathology)》,20,803(2010)；C.R.Pierson CR等人,《神经病理学学报(ActaNeuropathologica)》,114,619(2007))。
在母体子宫炎症诱导的脑性瘫痪lapine模型中，在单次全身性给药之后1、4和24小时，研究胼胝体(白质)、海马体和皮质对PEGOL-60-Cy5的摄取。此模型概括了在人类患者中观察到的标志小神经胶质和星形细胞促炎性活化以及如下肢僵硬和痉挛等特征行为标志物。在PND1，CP幼仔(n＝3)接受静脉内施用PEGOL-60-Cy5(55mg/kg)，并且在注射后1小时、4小时和24小时处死，并且将其与静脉内施用同等剂量之后24小时处死的健康对照(n＝3)进行比较。PEGOL-60-Cy5与活化的mi/ma在CP幼仔中的胼胝体、海马体和皮质处的共定位(由缩短过程的变形虫体指示)强烈表明树枝状聚合物在脑中的这些受损位点处的活化的小胶质细胞中累积(Reid SM等人,《医学发展和儿童神经病学》57,1159(2015))。PEGOL-60-Cy5主要分布于这些活化的mi/ma的核周细胞质中。示出PEGOL-60-Cy5能够从血管中溢出，并且在1小时内迅速定位于胼胝体、海马体和皮质的受损脑区域的活化的mi/ma中。PEGOL-60-Cy5信号强度在活化的mi/ma中增加了4小时，并且在注射之后24小时以类似的水平存在，这证明纳米颗粒在损伤位点处的累积具有局部持续释放的潜力。相比之下，在注射后24小时，在健康对照中未观察到mi/ma共定位。
接下来，在三个不同的时间点(1小时、4小时和24小时)在CP幼仔(n＝6)中研究了PEGOL-60-Cy5的定量脑和器官生物分布，并且将其与年龄匹配的健康对照(n＝5)进行比较。不是像常规地那样测量全脑树枝状聚合物水平，而是对脑进行显微解剖以分离脑室周围区域(PVR)、海马体和皮质，以便测量在此模型中存在活化的小胶质细胞的这些区域中的局部摄取(A.Sharma等人,《控释杂志》2018,283,175(2018))。早期研究示出，在PVR中，活化的mi/ma的参与度很高，这可能是由于心室作为巨噬细胞募集到脑中的途径的作用(W.G.Lesniak等人,Nance,《摩尔制药(Mol Pharm)》,10(2013),I.Corraliza,《细胞神经科学前沿(Frontiers in Cellular Neuroscience)》8,262(2014))。由于在学习、记忆和运动功能中的作用，海马体和皮质是脑性瘫痪病理中涉及的区域(Reid SM等人,《医学发展和儿童神经病学》,57,1159(2015))。这种显微解剖使得能够评估脑的这些临床相关子区域中的局部树枝状聚合物摄取，而不是总体脑数量。为了避免血液和树枝状聚合物卡在血管中而造成干扰，用PBS灌注幼仔。与健康对照相比，在CP动物的脑中检测到树枝状聚合物摄取的显著增加(图8A)(p<0.01，与健康对照相比，学生T检验)。可以将PEGOL-60在CP动物的受损脑区域中的选择性摄取解释为因为其具有以下能力：i)穿过受损的BBB；ii)由于其中性电荷而在脑实质内有效扩散；以及iii)被吞噬细胞活化的mi/ma吸收。
基于纳米医学的治疗学的临床转化的主要关注问题是其在疾病区域之外的器官中的不需要的累积。估计了PEGOL-60-Cy5在所有主要器官(心脏、肺、肝、脾脏、肾脏)和血浆中的生物分布。结果表明树枝状聚合物从体内快速清除，在所有时间点，在任何主要器官中累积所注射剂量的不到1％(图8B)。对于所有器官均观察到类似的趋势，在4小时达到峰值累积，并且然后在24小时时清除。通过均质化的组织萃取物的荧光光谱法获得结果，并且以所注射剂量占总器官(或总血浆体积)的百分比报告。注射后24小时时血清中存在不到0.2％的树枝状聚合物表明树枝状聚合物从循环中迅速清除。有趣的是，这种树枝状聚合物示出与先前在这种具有PAMAM-D4-OH、具有类似的大小、形状和表面羟基数量的纳米颗粒的CP模型中观察到的脑摄取水平类似的水平，但是展现出从循环和其它重要器官中清除快得多的速率(W.G.Lesniak等人,Nance,《摩尔制药》,10(2013),I.Corraliza)。这种在24小时内从体内迅速清除的速率以及新生CP兔脑受损区域中持续的细胞聚集使这种树枝状聚合物成为设计针对小儿神经炎性疾病疗法的绝佳平台。
早期研究表明，具有64个端羟基的全身性施用的羟基封端的4代聚(酰胺基胺)树状大分子(PAMAM-D4-OH)穿过受损的CNS屏障，并且在脑损伤位点处的活化的mi/ma中特异性累积，同时展现出跨多种神经退行性疾病的大小动物模型在健康脑组织中的最小累积(S.Kannan等人,《科学转化医学》,4,130ra46(2012)；S.P.Kambhampati等人,《眼科学和视觉科学研究》,56(2015))。用同等大小和类似主链的阳离子和阴离子树枝状聚合物没有观察到类似的神经炎症靶向(Nance,E.等人,《生物材料》,101,96(2016))。理论上，这种固有的靶向能力是由树枝状聚合物可能具有的高密度表面羟基引起的，这是由于这些树枝状聚合物独特的支化结构(在4代PAMAM中，每nm2约有1个羟基端基)，这是其它聚合物纳米颗粒难以实现的。
受这些发现的启发，已经设计并且开发了基于羟基官能化的PEG的树枝状聚合物纳米载剂用于系统性靶向CNS病症中活化的mi/ma。此构建体被设计成在比PAMAM树枝状聚合物更低的代下展现出更大的羟基表面密度，以便具有类似的神经炎症靶向能力和更低的合成负担(在2代下每nm2约5个羟基端基)。考虑到临床转化的要求，使用水溶性、廉价且生物相容的结构单元，通过基于点击化学的高效化学转化使用最少的反应步骤将这种树枝状聚合物开发成单分散无缺陷的树枝状聚合物。这种构建体(称为D2-OH-60或PEGOL-60)是由基于PEG的结构单元构成的，并且与在4代下具有以八个合成步骤实现的64个羟基表面基团的PAMAM-D4-OH相比，这种构建体在2代下具有在四个反应步骤中产生的60个羟基(中性)表面基团。PEGOL-60树枝状聚合物主链被设计成主要由稳定的醚键组成，以防止生物系统中的酶降解或分解，从而允许其通过肾脏完整地排泄。PEGOL-60被设计成通过其每nm2 5个基团的高密度表面羟基端基展现出固有的神经炎症靶向性，具有小尺寸、接近中性电荷、水溶性和生物相容性，由此通过消除对合成后修饰的要求来简化转化过程。
在三种不同的CNS疾病模型中，通过基于荧光光谱法的定量和共焦显微镜在体内验证了PEGOL-60在神经炎症位点处靶向相关细胞的能力，以估计PEGOL-60穿过BBB和BRB两者、穿透实体肿瘤并且靶向疾病相关小胶质细胞和巨噬细胞的能力。为此，采用了母体子宫炎症诱导的脑瘫(CP)的兔模型、胶质母细胞瘤(GBM)的鼠类常位模型和视网膜下脂质诱导的年龄相关性黄斑变性(AMD)的大鼠模型。在全身性施用时，PEGOL-60成功地穿过受损的CNS屏障，并且特异性地定位于兔脑性瘫痪模型、小鼠胶质母细胞瘤模型和大鼠年龄相关性黄斑变性模型中的活化的小胶质细胞/巨噬细胞、肿瘤相关巨噬细胞和/或脑或视网膜中的视网膜色素上皮细胞，同时从外周器官快速清除。
还基于先前的发现(即某些树枝状聚合物在不添加治疗有效载荷的情况下展现出抗氧化和抗炎作用)在体外探索了PEGOL-60的固有治疗特性(M.Hayder等人,《科学转化医学》,3,81ra35(2011)；K.Neibert等人,《分子药剂学》,10,2502(2013))。PEGOL-60在暴露于炎性环境的小胶质细胞中也展现出强大的固有抗氧化和抗炎作用，并且在体外或体内均未示出副作用。最后，还研究了PEGOL-60对CP幼仔中神经行为的影响。
这种羟基PEG树枝状聚合物可以作为绝佳的纳米载剂应用于各种神经炎性疾病，以将疗法特异性地递送到脑损伤位点，从而提高治疗效果。
实例10：大规模树枝状聚合物-药物合成的稳健合成策略
NAC是天然存在的氨基酸L-半胱氨酸的N-乙酰基衍生物，并且充当抗氧化剂和抗炎药。几十年来，NAC已经广泛用于儿童和成人临床。NAC是谷氨酸调节剂，并且有助于恢复人体的天然抗氧化剂，谷胱甘肽。神经炎症导致神经胶质细胞中谷胱甘肽耗竭，这导致其神经保护性功能丧失。因为可以与蛋白质结合的硫醇基的存在，NAC通常由于其生物利用率差而被高剂量给予。使用树枝状聚合物平台靶向递送NAC不仅可以选择性地将NAC递送到损伤位点处的活化的神经胶质细胞，还可以有助于降低神经元毒性。树枝状聚合物-NAC(D-NAC)比游离药物好100倍，并且在兔CP模型、小鼠缺氧缺血模型和不同动物的其它神经炎症模型中示出显著的功效(Kannan S等人,《控释杂志》2015,214,112)。
为了满足D-NAC对临床试验的需求，需要完善的、高度可再生的且稳健的方法来构建这种千克量级的缀合物。描述了不同的合成策略以大规模合成D-NAC。
以G4 PAMAM树枝状聚合物-NAC为例来说明这些合成策略。在此所描述的合成方法通常适用于上文所描述的树枝状聚合物和其它待递送的药剂。
方法和材料
中间体和树枝状聚合物-药物缀合物的合成
G4-(OH)39(GABA-NHBOC)25(化合物22)的制备：向PAMAM G4-OH(4.85g；化合物21)于无水DMF(50ml)的搅拌溶液中添加Boc-GABA-OH(2.498g)、DMAP(1.67g)，并且在室温(RT)下搅拌持续5分钟以制备澄清溶液。在30分钟的时间段内，将EDC.HCl(2.94g)分批添加到反应混合物中。将反应混合物在RT下搅拌持续36小时。将反应混合物转移到1kD MW截留纤维素透析管(cut-off cellulose dialysis tubing)中，并且相对水透析持续24小时，定期更换水3到4次。将透析管的内含物转移到预先称重的50mL falcon管中并冻干，以得到呈白色蓬松吸湿固体的所期望产物，化合物22。产率：85％，5.3g。
G4-(OH)39(GABA-NHTFA)25(化合物23)的制备：在火焰烘干的250ml圆底烧瓶中取BOC保护的树枝状聚合物，化合物22(5.3gm)，并且在氮气气氛下添加30ml DCM以溶解该化合物。将溶液超声处理持续15分钟以制备均匀溶液，在搅拌的同时逐滴添加10ml TFA。将反应混合物在RT下搅拌持续12小时。反应的颜色从无色变为浅棕色。一旦完成，蒸发DCM。用甲醇稀释反应混合物，并且使用旋转蒸发器蒸发。重复该程序，直到过量的TFA完全消失。将该反应混合物在高真空下放置持续3小时以去除任何痕量的溶剂，以便得到呈白色蓬松吸湿材料的化合物23，该化合物可以直接用于下一步骤而无需任何进一步纯化。
化合物24、25和26的制备：化合物24购自西格玛公司，并且按原样使用。使用先前公开的方案合成化合物25和26(Navath,R.S.；Kurtoglu,Y.E.；Wang,B.；Kannan,S.；Romero,R.；Kannan,R.M.《生物缀合化学(Bioconjug Chem)》,2008,19,2446)。
N-乙酰基-S-((3-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-3-氧代丙基)硫代)半胱氨酸[SPDP-NAC连接子](化合物27)的制备：在火焰烘干的100mL圆底烧瓶中，装入3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP，化合物26)(5g，16.02mmole)，并且在惰性气氛下将其溶解于无水四氢呋喃(THF，15mL)中。逐滴添加溶解于THF(15mL)中的N-乙酰基半胱氨酸(NAC，2.87g，17.62mmole，1.1当量)的溶液。反应混合物在几分钟内变为黄色。将反应混合物在RT下搅拌持续4小时。通过TLC监测反应，并且一旦起始材料(SPDP)被消耗，就使用旋转蒸发器去除溶剂。使用CombiFlash系统上预包装的高性能redisep金RfTM80克二氧化硅柱纯化粗产物，保持流量60毫升/分钟。在DCM中开始柱，并且在含4％MeOH的二氯甲烷中以75.4％产率(4.4g)收集呈白色粉末的纯的所期望产物。
化合物28(D-NAC)的制备：在火焰烘干的500mL圆底烧瓶中，装入化合物23(6g)，并且在惰性气氛下将其溶解于无水DMF(40mL)中。对烧瓶进行超声处理并涡旋，直到其形成澄清溶液。通过添加二异丙基乙胺将反应混合物的pH调节到7.0-7.5。将反应混合物搅拌持续30分钟，并且一旦pH稳定，就缓慢添加溶解于DMF(20mL)的化合物27(4.76g，35当量)。将反应混合物在氮气下在室温下搅拌持续12小时。将反应混合物转移到1000截留透析袋中，并且相对DMF透析持续6小时，随后用水透析持续24小时，每2到3小时定期更换溶剂。将透析管的内含物转移到预先称重的50mL falcon管中并冻干，以得到呈白色蓬松粉末的树枝状聚合物-NAC缀合物，化合物28，其中产率为：90％，7.0g。计算最终缀合的程度，将树枝状聚合物的介于8到7.5ppm之间的NH质子与在1.8ppm下的NAC的N-乙酰基质子和约4.4ppm的NAC的-CH质子进行比较。
化合物29(D-Allyl)的制备：在0℃下，向PAMAM-G4-OH(化合物21，530mg，0.037mmole)于无水DMF(15mL)中的搅拌溶液分批添加NaH(200mg，8.33mmole)。在15分钟后，添加烯丙基溴(0.127mL，1.48mmole)，并且在RT下继续搅拌持续24小时。然后相对DMF透析溶液，随后用水透析持续24小时。将水溶液冻干以得到呈白色粉末的产物。
化合物30的制备：向化合物29(192mg，0.012mmole)于DMF(5mL)中的搅拌溶液中添加2-(boc-氨基)乙硫醇(200mg，1.12mmole)，随后添加催化量的2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPAP)。将反应混合物在UV光下搅拌持续24小时。相对DMF透析反应，随后用水透析持续24小时。将水溶液冻干以得到呈白色粉末的产物。
化合物31的制备：向化合物30(200mg)于DCM(2.5mL)中的搅拌溶液中添加三氟乙酸(2mL)，并且继续搅拌持续4小时。将反应用甲醇淬灭，并且将溶剂在减压下蒸发。添加甲醇并蒸发若干次以去除TFA。将残留物在减压下干燥，以便以定量产率得到吸湿固体。
通过醚连接子制备D-NACa(化合物28a)：在火焰烘干的500mL圆底烧瓶中，装入化合物31(300mg，0.018mmole)，并且在惰性气氛下将其溶解于无水DMF(10mL)中。对烧瓶进行超声处理并涡旋，直到其形成澄清溶液。通过添加二异丙基乙胺将反应混合物的pH调节到7.0-7.5。将反应混合物搅拌持续30分钟，并且一旦pH稳定，就缓慢添加溶解于DMF(10mL)的化合物27(331mg，0.909mmole)。将反应混合物在氮气下在室温下搅拌持续12小时。将反应混合物转移到1000截留透析袋中，并且相对DMF透析持续6小时，随后用水透析持续24小时，每2到3小时定期更换溶剂。将透析管的内含物转移到预先称重的50mL falcon管中并冻干，以得到呈白色蓬松粉末的树枝状聚合物-NAC缀合物，化合物28b。
化合物32的制备：具有混合的羟基和胺表面基团的化合物32购自Dendritech并按原样使用。
D-NACb(化合物28b)的制备：在火焰烘干的500mL圆底烧瓶中，装入双官能树枝状聚合物，化合物32(1g，0.071mmole)，并且在惰性气氛下将其溶解于无水DMF(20mL)中。对烧瓶进行超声处理并涡旋，直到其形成澄清溶液。通过添加二异丙基乙胺将反应混合物的pH调节到7.0-7.5。将反应混合物搅拌持续30分钟，并且一旦pH稳定，就缓慢添加溶解于DMF(10mL)的化合物27(910mg，2.5mmole)。将反应混合物在氮气下在室温下搅拌持续12小时。将反应混合物转移到1000截留透析袋中，并且相对DMF透析持续6小时，随后用水透析持续24小时，每2到3小时定期更换溶剂。将透析管的内含物转移到预先称重的50mL falcon管中并冻干，以得到呈白色蓬松粉末的树枝状聚合物-NAC缀合物，化合物28b。
化合物33的制备：向圆底烧瓶中添加aldrithiol-2(6.19g)，并且将其溶解于25mL甲醇中。然后逐滴添加溶解于甲醇(5mL)中的2-巯基乙醇。将反应在室温下继续过夜。然后，在减压下蒸发所有挥发物。将残留物通过柱色谱法进行纯化，通过用己烷和乙酸乙酯的混合物洗脱。收集呈纯的淡黄色油状物(2.14g，75％产率)的所获得产物(化合物33)。
化合物34的制备：在室温下在N2气体下，向烘箱烘干的圆底烧瓶中添加溶解于10mL无水DCM(10mL)中的4-硝基苯基氯甲酸酯(2.30g)。然后，将溶解于无水DCM(5mL)的2-吡啶基二磺酰基乙醇(2.14g)和吡啶(0.9mL)的混合物添加到该溶液中。在6小时之后，制备溶解于无水DCM(10mL)的另外的4-硝基苯基氯甲酸酯(1.16g)和吡啶(0.5mL)，并且将其添加到反应混合物中。在室温下搅拌过夜之后，将反应介质用DCM(ACS级，10mL)稀释并且用1MHCl(60mL)洗涤三次。将所收集的有机层经无水Na2SO4干燥并过滤。将所有有机挥发物在真空下蒸发，并且将残留物通过柱色谱法进行纯化，如用己烷和乙酸乙酯的混合物洗脱。收集呈纯的黄色油状物产物(3.08g，76.2％产率)的产物(化合物34)。
化合物35和D-NACc通过碳酸酯连接子(化合物28c)的制备：向烘箱烘干的250mL圆底烧瓶中装入溶解于无水DMF(15mL)的PAMAM G6-OH(1.00g)。在N2气体环境下，在40℃油浴中搅拌该溶液之后，添加溶解于无水DMF(5mL)中的DMAP。然后将溶解于10mL无水DMF的碳酸酯连接子添加到该溶液中，并且将反应混合物在40℃下搅拌持续48小时。在反应结束时，通过更换溶剂至少三次来转移溶液以使用透析膜(MWCO 8kD)相对DMF进行透析。然后将含有化合物35的透析溶液转移到圆底烧瓶中，并且将溶解于无水DMF(4mL)的NAC(0.44g)逐滴添加到该溶液中。在室温下搅拌过夜之后，转移溶液以使用透析膜(MWCO 8kD)相对DMF进行透析，并且将溶剂替换至少两次。在将该溶液添加到无水乙醚(100mL)之后，收集呈固体产物的沉淀物并在减压下干燥过夜。作为最后的步骤，将所得固体溶解于DPBS(45mL)中，并且相对DI水(MWCO 8kD)进行透析持续4小时。将透析的溶液冻干，以获得呈灰白色固体(1.54g)的树枝状聚合物-NAC缀合物，D-NAC(化合物28c)。
化合物36的制备：将化合物25(94.8mg，0.41mmol)溶解于1.0mL无水DMF中，并且向该澄清溶液中添加DMAP(25.2mg，0.21mmol)和溶解于3.0mL无水DMF中的pyBOP(322.7mg，0.62mmol)。在0℃下搅拌反应混合物持续30分钟之后，添加溶解于2.0mL无水DMF中的G6-OHPAMAM树枝状聚合物(200.0mg，3.44μmol)，并且将反应在室温下搅拌持续2天。然后将粗产物相对DMF透析以去除副产物和过量反应物，随后在乙醚中沉淀以除去DMF。将最终纯化的产物再溶解于H2O中，冻干并且获得呈黄色的化合物(240.0mg)。
D-NACd通过酯连接子(28d)的制备：将化合物36(200mg，5.02μmol)溶解于3.0mL无水DMF中，并且然后将溶解于2.0mL无水DMF的NAC(54.6mg，0.334mmol)添加到圆底烧瓶中。将反应混合物在室温下搅拌持续24小时。然后，蒸发所有挥发物，并且通过相对DMF进行透析来纯化粗产物，以去除副产物和过量反应物，随后用水进行透析，以除去所有有机溶剂。最后，将其冻干并且获得呈浅黄色的化合物(180.0mg)。
D-NAC-NAC(化合物37)的制备：向化合物21(400mg，0.027mmole)于DMF(10mL)中的搅拌溶液中添加NAC二聚体(363mg，1.12mmole)、EDC(300mg，1.562mmole)和DMAP(136mg，1.114mmole)。将反应混合物在40℃下搅拌持续48小时。将反应混合物转移到1000截留透析袋中，并且相对DMF透析持续24小时，随后用水透析持续24小时，每2到3小时定期更换溶剂。将透析管的内含物转移到预先称重的50mL falcon管中并冻干，以得到呈浅黄色粉末的D-NAC-NAC缀合物37。
化合物38的制备：使N-乙酰基半胱氨酸与过量2,2'-二硫代二吡啶在甲醇中反应过夜，并且通过柱色谱法用乙酸乙酯:己烷(90:10)的洗脱系统来纯化所获得的粗制品。通过1HNMR光谱法来表征经过纯化的浅黄色化合物(化合物38)。
化合物39的制备：将化合物38(919.64mg，3.38mmol)溶解于4.0mL无水DMF中，并且向该澄清溶液中添加DMAP(206.27mg，1.69mmol)和溶解于8.0mL无水DMF中的pyBOP(2.64g，5.07mmol)。在0℃下搅拌反应混合物持续30分钟之后，添加溶解于8.0mL无水DMF中的G4-PAMAM树枝状聚合物(0.40mg，28.14μmol)，并且将反应在室温下继续持续3天。然后，用DMF稀释粗产物并相对DMF进行透析，以去除副产物和过量反应物，随后用H2O进行纯化，以除去任何有机溶剂。将最终纯化的产物冻干并且获得呈浅黄色的固体(358.0mg)(产物的理论分子量：20319gmol-1，NAC/PAMAM的#：24，NAC％(w/w)：19.2，衍生自HPLC的纯度％：90.64，Hd：2.38±0.26nm，PDI：0.74，ζ电位：4.41±0.61mV)。
D-NAC-NAC(化合物40)的制备：将化合物39(300.0mg，14.76μmol)和N-乙酰基半胱氨酸(115.6mg，0.71mmol)溶解于15.0mL DMF中。在室温下搅拌24小时之后，将反应混合物用DMF稀释并且相对DMF进行透析以去除过量游离药物分子，并且然后，随后用H2O进行纯化以除去任何有机溶剂。在产物在冷二乙醚中沉淀之后，将最终树枝状聚合物-药物缀合物冻干并且获得呈浅黄色的固体(化合物40)(250.0mg)。产物的理论分子量：21568gmol-1，NAC/PAMAM的#：48，NAC％(w/w)：36.3，衍生自HPLC的纯度％：98.47，Hd：4.90±+0.24nm，PDI：0.48，ζ电位：3.64±+1.14mV)。
结果
树枝状聚合物-NAC正在经历临床转化。为了满足临床前/临床需要，需要高度优化和系统化的合成方案，该方案可以以最小数量的反应步骤产生具有高再现性、纯度和产率的千克量级量的D-NAC。在该实例中，描述了用于D-NAC合成的可扩展方案(策略1)。其在学术研究实验室中以10克量级和由合同研究实验室以千克量级进行验证。此外，还开发了在树枝状聚合物上的连接子中构建具有修饰的D-NAC的若干种其它方便且容易的合成方法(策略2到6)。
策略1：D-NAC通过酯连接子
目标是开发和设计一种近乎完美的合成途径，该合成途径具有在多个水平上降低成本的潜力。开发并验证了用于D-NAC合成的可扩展的方法，(方案7)，其已经转移到潜在的cGMP制造商。该合成方案：(1)使合成时间减少一半，(2)使用“制造友好的”溶剂和试剂，(3)提高纯度并减少溶剂使用。
合成方案的代价最高的组分之一是树枝状聚合物(例如，4代PAMAM树枝状聚合物)的合成，并且在每个合成步骤，在进行纯化时存在树枝状聚合物的一些产率损失。为了克服该损失，使该方案中树枝状聚合物上的反应步骤的数量最小化。一半的反应步骤涉及小分子合成，该小分子合成确实比处理树枝状聚合物较不复杂且昂贵。
D-NAC是4代羟基端PAMAM树枝状聚合物的缀合物，其与通过二硫键连接的NAC共价缀合。D-NAC含有与树枝状聚合物连接的平均22±3个NAC分子。该合成以半会聚方式进行，并且涉及两种主要中间体的构建：1)双官能树枝状聚合物(化合物23，方案7)；2)NAC-SPDP-NHS(N-乙酰基-S-((3-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-3-氧代丙基)硫代)半胱氨酸)连接子(化合物27，方案7)。最终步骤涉及缝合这两种中间体以产生最终缀合物(化合物28)。
更具体地，在第一步骤期间，在存在BOC-GABA-OH和偶联剂(EDC和DMAP)的情况下，使用酯化反应构建BOC保护的双官能树枝状聚合物(化合物22)。通过比较来自缀合物中不同区域的整合，通过1H NMR观察到22到25个连接子的连接。使用含25％三氟乙酸(TFA)的无水二氯甲烷(DCM)进行BOC的脱保护，从而产生具有22到25个端胺的双官能树枝状聚合物(化合物23)。质子NMR清楚地显示与BOC质子相对应的峰的消失。
另一方面，NAC-SPDP-NHS-连接子(化合物27)的合成是在3个步骤中实现的。首先，通过硫醇-二硫化物交换使3-巯基丙酸与2,2'-二吡啶基二硫化物(化合物24)反应，以得到2-羧乙基2-吡啶基二硫化物(化合物25)。随后使用N,N'-二环己基碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺酯化，以引入高度反应性N-琥珀酰亚胺酯，从而得到化合物26。最终通过硫醇-二硫化物交换来添加N-乙酰基半胱氨酸，以产生N-乙酰基-S-((3-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-3-氧代丙基)硫代)半胱氨酸(化合物27)。
在最终连接步骤期间，在pH为7.5到8下使用胡宁氏碱(Hunig's base)偶联双官能胺封端的树枝状聚合物(化合物23)和活化的NAC-SPDP-NHS(化合物27)以产生D-NAC(化合物28)。使用1H NMR和质谱法(LCMS/MALDI-ToF)很好地表征了所有中间体和最终缀合物。使用HPLC获得中间体和最终D-NAC缀合物的纯度。D-NAC的大小为5.649nm，如通过动态光散射测量的，并且此缀合物的中性ζ电位为3.92±1.18mV。
Figure BDA0002578439840000761
方案7：D-NAC(化合物28)的合成途径中的关键步骤。试剂和条件：(i)EDC，DMAP，DMF，36小时，RT，85％；(ii)DCM:TFA(3:1)，RT，12小时，定量产率；(iii)3-巯基丙酸，乙酸，无水乙醇，2小时，RT，78％；(iv)DCC，N-羟基琥珀酰亚胺，DCM，0℃到RT，3小时，82％；(v)N-乙酰基-L-半胱氨酸，无水THF，2小时，65％。(vi)N,N-二异丙基乙胺，pH 7.5，DMF，RT，24小时，90％。
Figure BDA0002578439840000771
方案8.用于D-NAC合成的先前策略.
NAC负载的再现性
先前方案(方案8)中的第一步骤使用Fmoc-γ-Abu-OH，其需要使用碱性条件(哌啶/DMF)脱保护。该脱保护步骤是关键步骤，并且影响最终药物的负载效率。由于树枝状聚合物与连接子之间的酯连接易于碱性水解，因此用于脱保护的过量哌啶/DMF也导致连接子部分裂解，从而导致不同批次中药物的最终负载的不一致性。在新开发的方法(方案9)中，用BOC-GABA-OH替换Fmoc-γ-Abu-OH。可以在温和的酸性条件下使用含25％TFA的DCM容易地去除BOC保护基团，从而保持酯键完整。该步骤在10g量级上重现若干次，其中一致的结果显示没有酯水解。
缩短合成时间
用于合成D-NAC的先前方案包含3个步骤：相对DMF进行透析持续至少24小时，随后在每个步骤(在Fmoc-γ-Abu-OH缀合之后，在Fmoc-脱保护之后以及在NAC缀合之后)用水进行透析持续另外的24小时，以去除过量的试剂和副产物。在新开发的方案中，该方法仅需要1个步骤：相对DMF和水两者进行透析(在NAC-SPDP缀合之后的最终步骤)。此外，在先前的策略中，在树状聚合物上执行每个步骤。树枝状聚合物上的每个步骤均需要至少2天的透析，随后进行2天的冻干，使得合成持续3到4周。然而，在新方案中，SPDP-NAC连接子在几个小时内单独合成。这显著缩短了可以在7到10天内实现的合成时间段。
经济和工业友好方案
在先前的方案中，为了补偿脱保护步骤期间的酯水解，需要过量的连接子用于高负载。改进的方法更稳健，并且不需要高负载的连接子，因为在脱保护步骤期间不存在连接子水解，从而节省成本。此外，由于在需要DMF透析的新方案中仅存在一个步骤，这使得合成更环保、经济和工业友好。树枝状聚合物是合成中最昂贵的材料。透析的每个步骤都会导致一些树枝状聚合物损失。在新方案中，树枝状聚合物上的合成步骤的数量减少，从而导致成本降低。
策略2：D-NAC通过醚连接子和无铜硫醇-烯点击化学
在寻求简化化学以制备树枝状聚合物-NAC缀合物的过程中，寻求高度稳健的化学转化，例如硫醇-烯点击、硫醇-炔点击或铜催化的炔烃-叠氮化物点击反应(Sharma,R等人,《化学通讯》,2014,50,13300；Sharma,R等人,《高分子化学》2014,5,4321；Sharma,R等人,《高分子化学》2015,6,1436；Sharma,R等人,《纳米尺度(Nanoscale)》2016,8,5106；Sharma,A等人,《RSC进展》2014,4,19242；Sharma,A等人,《ACS Macro快报》2014,3,1079；Sharma,R等人,《大分子(Macromolecule)》2011,44,521；以及Nguyen,PT等人,《RSC进展》2016,6,76360)。在过去的十年中，点击化学已经使合成化学领域革新，并且已经对高度复杂的聚合物结构和树枝状结构的构建做出了巨大贡献。
在下一尝试中，使用光化学-硫醇-烯点击反应来消除策略1的第一步骤中通过其将连接子连接到树枝状聚合物上的酯连接。尽管树枝状聚合物表面上的该酯键受阻并且不易被酯酶裂解，但是期望开发出具有除可裂解二硫键之外的不可裂解键的更稳健的缀合物。为此目的，在第一步骤中通过不可裂解的醚键将连接子缀合在树枝状聚合物上(方案9)。醚键是稳健的，不经历水解并且不是酯酶的底物。
更具体地，G4-OH(化合物21)在氢化钠的存在下与烯丙基溴反应。通过质子NMR，通过连接子的BOC质子与树枝状聚合物的内部酰胺质子的比较积分来容易地计算缀合在树枝状聚合物表面上的连接子的数量。然后使用TFA按照策略2中所述的类似条件使BOC脱保护，以得到双官能醚连接的树枝状聚合物(化合物30)。质子NMR清楚地揭示了BOC质子在光谱中的消失。双官能树枝状聚合物缀合物，化合物30最终与SPDP-NAC-连接子(化合物27)反应，以得到在树枝状聚合物表面上具有醚键的D-NACa(化合物28a)。通过1H NMR和HPLC表征所有中间体和最终缀合物。
缀合物中醚键的存在是高度稳定的，并且不干扰NAC的释放。此外，醚键而不是酯键可能改进缀合物的稳定性并且进而改进其保质期。
Figure BDA0002578439840000791
方案9：D-NACa通过醚连接子(8a)的合成途径中的关键步骤.试剂和条件：(i)烯丙基溴，NaH，DMF，24小时；(ii)BOC-氨基乙硫醇，DMPAP，UV，RT，24小时，定量产率；(iii)DCM，TFA，RT，24小时；(iv)N,N-二异丙基乙胺，pH 7.5，DMF，RT，24小时。
策略3：D-NAC通过酰胺连接子(没有GABA连接子)
策略1中所述的D-NAC的合成在可扩展性方面是高效的，并且提供易于获得的散装材料。同时，一个重要目标是开发一种完美的合成设计，该合成设计将具有在多个水平上降低成本的潜力。为了使树枝状聚合物上的反应步骤的数量最小化并且为了减少总反应步骤，设计了策略3(方案10)。在该策略中，使用完全会聚的途径；其中，SPDP-NAC-连接子(化合物27)在没有GABA连接子的一个合成步骤中直接与商业上可获得的双官能树枝状聚合物缀合。胺是树枝状聚合物表面的固有部分。该方法的主要优点包含大大减少反应步骤的数量，并且大多数反应步骤涉及较便宜的小分子合成。在树枝状聚合物上仅存在一个反应步骤。如先前在本报告中描述的合成SPDP-NAC-连接子(7)，并且进一步使商业上可获得的双官能PAMAM树枝状聚合物(60％OH/40％NH2，化合物32)的胺基在pH 7.5下在DMF中反应，以得到所期望的树枝状聚合物-NAC缀合物，化合物28b。使用NMR光谱法、高分辨率质谱法、HPLC和MALDI-TOF质谱法广泛表征所有中间体和最终化合物。
Figure BDA0002578439840000801
方案10：D-NACb(化合物28b)在没有GABA连接子的情况下的合成途径中的关键步骤。试剂和条件：(i)N,N-二异丙基乙胺，pH 7.5，DMF，RT，24小时。
策略4：D-NAC通过碳酸酯连接子(没有GABA连接子)
在改进树枝状聚合物-NAC合成的另一个尝试中，使用2-吡啶基二硫乙基碳酸酯(PDEC)作为连接子来构建D-NACc(策略4)。这种合成D-NAC(化合物28c)的新方法具有若干优点。该方案消除了SPDP交联剂的使用。尽管SPDP广泛用于生物缀合，但其在经济上不利于大规模合成($4,500/5-g，根据多伦多研究化学品公司(Toronto Research Chemicals)的价格)。使用PDEC连接子，因为其可以使用较便宜的试剂容易地合成。使Aldrithiol与巯基乙醇反应以获得化合物33(方案11)。使化合物33的羟基焦点与4-硝基苯氯甲酸酯反应以获得化合物34，该化合物直接与PAMAM-OH反应以通过树枝状聚合物(化合物35)上的碳酸酯键来连接连接子。最后，NAC通过二硫化物交换反应引入(化合物28c)。
Figure BDA0002578439840000811
方案11：D-NACc(化合物28c)通过碳酸酯连接子的合成途径中的关键步骤。试剂和条件：(i)2-巯基乙醇，无水甲醇，3小时，RT，75％；(ii)4-硝基苯氯甲酸酯，吡啶，无水DCM，24小时，RT，76％；(iii)DMAP，无水DMF，48小时，40℃；(iv)N-乙酰基-L-半胱氨酸，无水DMF，24小时，RT。
策略5：D-NAC通过酯连接子(没有GABA连接子)
为了减少步骤和试剂的数量以降低成本，将化合物25直接用作连接子。代替如在策略1中所述的缀合GABA-BOC-OH并且然后使其脱保护以得到游离胺，使吡啶二硫化物连接子(化合物25)通过树枝状聚合物上的酯键直接反应以得到化合物36(方案12)。然后使化合物36与NAC经受硫化物交换反应以得到GABA游离酯连接的树枝状聚合物-NAC缀合物(D-NACd，化合物28d)。该策略显著减少了方案中的合成步骤的数量，因此减少了时间并且使得该合成方法更经济。
Figure BDA0002578439840000812
方案12：D-NACd(8d)通过酯连接子的合成途径中的关键步骤。试剂和条件：(i)PyBOP，DMAP，无水DMF，2天，0℃到RT；(ii)N-乙酰基-L-半胱氨酸，无水DMF，24小时，RT。
策略6：D-NAC-NAC(直接缀合)
为了增加NAC负载同时保持树枝状聚合物的固有靶向能力完整(使用用于缀合的最小表面羟基)，设计并开发了一种策略以将两个NAC分子每树枝状聚合物上的羟基位点连接(方案13)。该策略具有若干优点：1)使用树枝状聚合物上类似数量的羟基，NAC负载可以加倍；2)NAC分子的一半通过谷胱甘肽敏感的二硫键缀合，而另一半通过需要酯酶水解并释放游离药物的酯键连接。这可能导致NAC的持续释放。为了构建D-NAC-NAC，使用EDC和DMAP通过酯键将N,N'-二乙酰基-L-半胱氨酸(NAC二聚物)直接缀合在羟基的表面上以获得D-NAC-NAC(化合物37)，其中NAC分子的一半通过树枝状聚合物表面上的酯键缀合，并且一半通过二硫键与另一NAC分子缀合。
Figure BDA0002578439840000821
方案13：D-NAC-NAC的合成途径中的关键步骤。试剂和条件：(i)N,N'-二乙酰基-L-半胱氨酸，EDC，DMAP，DMF，48小时
策略7：D-NAC-NAC
开发了D-NAC-NAC的另一种合成途径(方案14)。通过二硫化物交换反应使NAC与aldrithiol(化合物24)反应以得到化合物38。利用化合物38中的NAC的游离基团与树枝状聚合物的羟基反应以在缀合物(化合物39)中形成酯键。然后通过第二二硫化物交换反应使缀合物，化合物39与另一个NAC分子反应以得到最终的缀合物D-NAC-NAC(化合物40)。
Figure BDA0002578439840000822
方案14：D-NAC-NAC的合成途径中的关键步骤。试剂和条件：(i)N-乙酰基-L-半胱氨酸，无水甲醇，3小时，RT，75％；(ii)PyBOP，DMAP，无水DMF，3天，OoC-RT；(iii)N-乙酰基-L-半胱氨酸，无水DMF，24小时，RT。
在此设计的用于构建D-NAC的合成方案是高度稳健的且可再现的，涉及工业友好的溶剂，并且容易地提供最终缀合物的快速合成。D-NAC的改进的合成还允许产生具有其它连接和结构单元的D-NAC。
序列表
<110> 约翰斯·霍普金斯大学（The John Hopkins University）
<120> 树枝状聚合物递送系统和其使用方法
<130> JHU C 14798 PCT
<150> 62/584,623
<151> 2017-11-10
<160> 18
<170> PatentIn版本3.5
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Claims (40)

1.一种树枝状聚合物，其包括多个羟基，
其中所述树枝状聚合物的羟基(-OH)基团的体积密度为至少1个OH基团/nm3(羟基的数量/以nm3为单位的体积)。
2.根据权利要求1所述的树枝状聚合物，其中所述树枝状聚合物的羟基(-OH)基团的体积密度为至少5个OH基团/nm3。
3.一种树枝状聚合物，其包括多个羟基，
其中所述树枝状聚合物的羟基(-OH)基团的表面密度为至少1个OH基团/nm2(羟基的数量/以nm2为单位的表面积)。
4.根据权利要求3所述的树枝状聚合物，其中所述树枝状聚合物的羟基(-OH)基团的表面密度为至少3个OH基团/nm2。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的树枝状聚合物，其中所述树枝状聚合物的分子量介于约500道尔顿到约100,000道尔顿之间。
6.根据权利要求1到4中任一项所述的树枝状聚合物，其中所述树枝状聚合物的分子量介于约500道尔顿到约50,000道尔顿之间。
7.根据权利要求1到4中任一项所述的树枝状聚合物，其中所述树枝状聚合物的分子量介于约1,000道尔顿到约10,000道尔顿之间。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的树枝状聚合物，其中所述树枝状聚合物的直径介于约1nm与约15nm之间。
9.根据权利要求1到7中任一项所述的树枝状聚合物，其中所述树枝状聚合物的直径介于约1nm与约5nm之间。
10.根据权利要求1到7中任一项所述的树枝状聚合物，其中所述树枝状聚合物的直径介于约1nm与约2nm之间。
11.一种树枝状聚合物，其包括：(a)中央核；(b)一个或多个支化单元；以及(c)端官能团，
其中(a)、(b)和(c)中的每一个独立地选自由以下组成的组：乙二胺、丙烯酸甲酯、二季戊四醇、季戊四醇、2-(氨基甲基)-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇、2-乙基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇、3,3',3”,3”'-硅烷四基四(丙烷-1-硫醇)、3,3-二乙烯基戊-1,4-二烯、3,3',3”-次氮基三丙酸、3,3',3”-次氮基三(N-(2-氨基乙基)丙酰胺)、3,3',3”,3”'-(乙烷-1,2-二基双(氮杂三基))四丙酰胺、3-(羧甲基)-3-羟基戊二酸、2,2'-((2,2-双((2-羟乙氧基)甲基)丙烷-1,3-二基)双(氧基))双(乙-1-醇)、四(3-(三氯甲硅烷基)丙基)硅烷、1-硫代甘油、2,2,4,4,6,6-六氯-1,3,5,215,415,615-三氮杂三膦杂环己三烯、3-(羟甲基)-5,5-二甲基己烷-2,4-二醇、4,4',4”-(乙烷-1,1,1-三基)三苯酚、2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪、5-(羟甲基)苯-1,2,3-三醇、5-(羟甲基)苯-1,3-二醇、1,3,5-三(二甲基(乙烯基)甲硅烷基)苯、碳硅氧烷核、次氮基三甲醇、乙二胺、丙烷-1,3-二胺、丁烷-1,4-二胺、2,2',2”-次氮基三(乙-1-醇)、α环糊精、β环糊精、γ环糊精、葫芦脲、苯-1,2,3,4,5,6-六硫醇、单糖、二糖、三糖、寡糖、壳聚糖以及其衍生物。
12.根据权利要求11所述的树枝状聚合物，其中所述树枝状聚合物是1代(G1)、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10树枝状聚合物。
13.根据权利要求11和12中任一项所述的树枝状聚合物，其中所述核由炔烃改性的二季戊四醇制备。
14.根据权利要求11到13中任一项所述的树枝状聚合物，其中所述一个或多个支化单元由一种或多种超单体制备。
15.根据权利要求14所述的树枝状聚合物，其中所述一种或多种超单体是AB5正交超单体，所述正交超单体包含一个叠氮官能团和五个烯丙基，所述正交超单体通过使具有五个烯丙基的二季戊四醇与单甲苯磺酰化的三甘醇叠氮化物反应来制备。
16.根据权利要求11到15中任一项所述的树枝状聚合物，其中所述树枝状聚合物的表面羟基密度为至少1个OH基团/nm2。
17.根据权利要求11到15中任一项所述的树枝状聚合物，其中所述羟基的表面羟基密度为至少7个OH基团/nm2。
18.根据权利要求11到17中任一项所述的树枝状聚合物，其中所述树枝状聚合物的分子量介于约500道尔顿到约100,000道尔顿之间。
19.根据权利要求11到17中任一项所述的树枝状聚合物，其中所述树枝状聚合物的分子量介于约500道尔顿到约50,000道尔顿之间。
20.根据权利要求11到17中任一项所述的树枝状聚合物，其中所述树枝状聚合物的分子量介于约1,000道尔顿到约10,000道尔顿之间。
21.根据权利要求1到20中任一项所述的树枝状聚合物，其中所述树枝状聚合物呈树突的形式。
22.根据权利要求1到20中任一项所述的树枝状聚合物，其中所述树枝状聚合物被进一步组织成核壳构造树枝状聚合物(tectodendrimer)。
23.根据权利要求1到22中任一项所述的树枝状聚合物，其包括一种或多种预防剂、治疗剂和/或诊断剂，所述一种或多种预防剂、治疗剂和/或诊断剂包封、缔合和/或缀合在所述树枝状聚合物中。
24.根据权利要求23所述的树枝状聚合物，其中所述一种或多种预防剂、治疗剂和/或诊断剂以按重量计约0.01％到约30％、优选地约1％到约20％、更优选地约5％到约20％的浓度包封、缔合和/或缀合在所述树枝状聚合物中。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的树枝状聚合物，其中所述一种或多种预防剂、治疗剂和/或诊断剂任选地通过一个或多个间隔子与所述树枝状聚合物共价地缀合。
26.根据权利要求23到25中任一项所述的树枝状聚合物，其中所述一种或多种预防剂、治疗剂和/或诊断剂通过一个或多个选自由以下组成的组的键与所述树枝状聚合物共价地缀合：二硫、酯、醚、硫酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、肼和酰胺。
27.根据权利要求25所述的树枝状聚合物，其中所述间隔子是预防剂、治疗剂和/或诊断剂。
28.根据权利要求27所述的树枝状聚合物，其中所述间隔子是N-乙酰半胱氨酸。
29.根据权利要求23到28中任一项所述的树枝状聚合物，其中所述一种或多种治疗剂是抗炎药、化学治疗剂、血管扩张剂和抗感染剂。
30.一种用于治疗、预防和/或成像眼、脑和/或神经系统(CNS)的一种或多种疾病、病状和/或损伤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据权利要求1到29中任一项所述的组合物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述眼、所述脑和/或所述神经系统的所述一种或多种疾病、病状和/或损伤是与活化的小胶质细胞和星形胶质细胞相关的疾病、病状和损伤。
32.根据权利要求30或权利要求31所述的方法，其中树枝状聚合物组合物的量有效地靶向一种或多种活化的小胶质细胞和星形胶质细胞。
33.根据权利要求30到32中任一项所述的方法，其中所述树枝状聚合物组合物的量有效地缓解所述眼、所述脑和/或所述神经系统的所述一种或多种疾病、病状和/或损伤的一种或多种症状。
34.根据权利要求30到33中任一项所述的方法，其中所述树枝状聚合物组合物是静脉内施用的。
35.一种制备具有高密度表面羟基的树枝状聚合物的方法，所述方法包括：
(a)通过对第一单体进行炔丙基化来制备一个或多个超核，其中所述第一单体包括两个或更多个用于炔丙基化的反应性基团；
(b)通过将烯丙基缀合在n个反应性基团上并且将一个叠氮基团缀合到第二单体的反应性基团中的一个反应性基团上来由具有(n+1)个反应性基团的所述第二单体制备一个或多个超单体ABn，其中n等于或大于2；
(c)将用于铜(I)催化的炔烃叠氮化物点击化学的超核和超单体混合以产生1代树枝状聚合物；
(d)将1代树枝状聚合物与用于硫醇-烯点击化学的第三单体混合以产生2代树枝状聚合物，其中所述第三单体至少包括硫醇基和至少一个羟基。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述第一单体、所述第二单体和所述第三单体独立地选自由以下组成的组：二季戊四醇、季戊四醇、2-(氨基甲基)-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇、2-乙基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇、3,3',3”,3”'-硅烷四基四(丙烷-1-硫醇)、3,3-二乙烯基戊-1,4-二烯、3,3',3”-次氮基三丙酸、3,3',3”-次氮基三(N-(2-氨基乙基)丙酰胺)、3,3',3”,3”'-(乙烷-1,2-二基双(氮杂三基))四丙酰胺、3-(羧甲基)-3-羟基戊二酸、2,2'-((2,2-双((2,2-羟乙氧基)甲基)丙烷-1,3-二基)双(氧基))双(乙-1-醇)、四(3-(三氯甲硅烷基)丙基)硅烷、1-硫代甘油、2,2,4,4,6,6-六氯-1,3,5,215,415,615-三氮杂三膦杂环己三烯、3-(羟甲基)-5,5-二甲基己烷-2,4-二醇、4,4',4”-(乙烷-1,1,1-三基)三苯酚、2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪、5-(羟甲基)苯-1,2,3-三醇、5-(羟甲基)苯-1,3-二醇、1,3,5-三(二甲基(乙烯基)甲硅烷基)苯、碳硅氧烷核、次氮基三甲醇、乙二胺、丙烷-1,3-二胺、丁烷-1,4-二胺、2,2',2”-次氮基三(乙-1-醇)、α环糊精、β环糊精、γ环糊精、葫芦脲、苯-1,2,3,4,5,6-六硫醇、单糖、二糖、三糖、寡糖、壳聚糖以及其衍生物。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述更多个超单体ABn是AB2、AB3、AB4、AB5、AB6、AB7和AB8。
38.根据权利要求33到35中任一项所述的方法，其中所述更多个超单体是AB5。
39.根据权利要求35到38中任一项所述的方法，其中所述第一单体和所述第二单体是二季戊四醇，并且所述第三单体是1-硫代甘油。
40.根据权利要求35到39中任一项所述的方法，其中所述树枝状聚合物进一步与一种或多种治疗剂、预防剂和/或诊断剂复合和/或缀合。
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