PL239642B1 - Kompozycja do doszklistkowego podawania białka leczniczego - Google Patents

Kompozycja do doszklistkowego podawania białka leczniczego Download PDF

Info

Publication number
PL239642B1
PL239642B1 PL426662A PL42666218A PL239642B1 PL 239642 B1 PL239642 B1 PL 239642B1 PL 426662 A PL426662 A PL 426662A PL 42666218 A PL42666218 A PL 42666218A PL 239642 B1 PL239642 B1 PL 239642B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
pamam
neurotrophin
protein
administration
dendrimer
Prior art date
Application number
PL426662A
Other languages
English (en)
Other versions
PL426662A1 (pl
Inventor
Bogusław MACHALIŃSKI
Bogusław Machaliński
Maria Dąbkowska
Dorota Rogińska
Original Assignee
Pomorski Univ Medyczny W Szczecinie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pomorski Univ Medyczny W Szczecinie filed Critical Pomorski Univ Medyczny W Szczecinie
Priority to PL426662A priority Critical patent/PL239642B1/pl
Priority to EP19461505.0A priority patent/EP3610885B1/en
Publication of PL426662A1 publication Critical patent/PL426662A1/pl
Publication of PL239642B1 publication Critical patent/PL239642B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/185—Nerve growth factor [NGF]; Brain derived neurotrophic factor [BDNF]; Ciliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins, e.g. NT-3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/595—Polyamides, e.g. nylon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines
    • C08G73/028—Polyamidoamines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G83/00—Macromolecular compounds not provided for in groups C08G2/00 - C08G81/00
    • C08G83/002—Dendritic macromolecules
    • C08G83/003—Dendrimers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy kompozycji do doszklistkowego podawania białka leczniczego, służącej leczeniu i zapobieganiu neurodegeneracyjnym chorobom siatkówki oka.
Choroby degeneracyjne siatkówki stanowią ważny problem kliniczny. Zwyrodnienie siatkówki występuje u około 25 milionów ludzi na świecie. Szacuje się, że w 2020 roku odsetek osób niewidomych z powodu chorób degeneracyjnych siatkówki w populacji europejskiej wyniesie 19,1%.
Choroby te mają charakter progresywny: w ciągu kilku lat od momentu rozpoznania prowadzą do postępującej ślepoty i trwałego inwalidztwa. Zaawansowany wiek jest podstawowym czynnikiem ryzyka rozwoju wielu degeneracyjnych schorzeń siatkówki prowadzących do upośledzenia widzenia oraz ślepoty, takich jak jaskra, zwyrodnienie barwnikowe siatkówki oraz zwyrodnienie plamki związane z wiekiem (ang. age-related macular degeneration; AMD) [Xu H, Chen M, Forrester JV: Para-inflammation in the aging retina. Prog Retin Eye Res 2009, 28(5): 348-68, Hims MM Ophthalmology 2003, 37: 109-125].
Są to schorzenia, uwarunkowane wieloma czynnikami, w tym środowiskowymi i genetycznymi, obecnie nieuleczalne ze względu na brak terapii przyczynowej [Ophthalmology. 2009; 116:57-65].
Zmiany funkcjonalne siatkówki tj. obniżenie ostrości widzenia, czułości kontrastowej, percepcji koloru, opóźnienie adaptacji do warunków nocnych [Jackson GR, Owsley C: Scotopic sensitivity during adulthood. Vision Res 2000, 40(18): 2467-73. Owsley C: Aging and Vision. Vision Res 2011, 51(13): 1610-22] są wynikiem nagromadzenia zaburzeń na poziomie molekularnym, obejmujących warstwę komórek nerwowych, nabłonka barwnikowego oraz błonę Brucha siatkówki oka.
Pomimo dużego postępu w obszarze leczenia chorób neurodegeneracyjnych dotychczas nie opracowano skutecznych terapii mających na celu zahamowanie procesów neurodegeneracyjnych i indukcję mechanizmów naprawczych w uszkodzonej siatkówce oka. Uważa się, że wpływ na degenerację siatkówki ma szereg czynników takich jak: spadek produkcji czynników neurotroficznych, wzrost stresu oksydacyjnego czy zmiany zachodzące w komórkach siatkówki pod wpływem stresu metabolicznego powodujące stany zapalne [LaVail, M.M. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89, 11249-11253, Paskowitz, D.M. IOVS 2007, 48, 430-437, Machalińska Retina IOVS 2013, 54, 13, 8292]. Mimo licznych doniesień dotyczących ochronnej roli neurotrofin na siatkówkę oka [Progress in retinal a nd Eye Research 29(2010) 443-465, Drug Discovery Today, 13, 3/4, p. 144; Macromolecular Biosci. 2012, 12, 608-620; Drug development and industrial pharmacy, 2013, 39(11): 1599-1617] do chwili obecnej nie został dokładnie zbadany długotrwały wpływ Neurotrofiny 4 (NT-4) na biologię siatkówki oka.
Pomimo wielu perspektywicznych zastosowań niskocząsteczkowych białek, takich jak neurotrofina-4, rozwój efektywnych technologii umożliwiających terapię celowaną obejmującą transport powyższego białka na biokompatybilnym nośniku, a następnie jego uwolnienie w określonym miejscu organizmu, nie został w dostatecznym stopniu określony. Jest to głównie spowodowane niedostateczną znajomością podstaw fizykochemicznych kontrolujących proces transportu i adsorpcji układu nośnik-białko i brakiem podejścia interdyscyplinarnego zespołów badawczych zajmujących się badaniami naukowymi dotyczącymi aspektów kinetycznych procesów adsorpcji/desorpcji białek na/z potencjalnie biokompatybilnych nośnikach w warunkach kiedy poddawane są one intensywnym siłom ścinania jakie występują w warunkach in vivo. Ponadto brak jest doniesień naukowych dotyczących tworzenia, w zdefiniowanych warunkach transportu dyfuzyjnego, biokompatybilnych stabilnych warstewek z zaadsorbowanymi białkami, o różnych ładunkach powierzchniowych i konformacji zaadsorbowanych makromolekuł, na powierzchniach o różnym stopniu szorstkości.
Dendrymery są to duże, trójwymiarowe, symetryczne polimery organiczne uzyskiwane w wyniku cyklicznego powtarzania serii reakcji polimeryzacji (określanej często jako polimeryzacja kaskadowa) wokół cząsteczki rdzeniowej prowadzących do dodawania kolejnych warstw do cząsteczki polimeru o kulistym kształcie. Dendrymery typu PAMAM (czyli poliamidoaminowe) uzyskiwane poprzez dobudowywanie do pojedynczej cząsteczki rdzeniowej (najczęściej NH3 lub etylenodiamina) kolejnych warstw jednostek -CH2CH2CONHCH2CH2N otrzymywanych z sekwencyjnego przyłączania akrylanu metylu i etylenodiaminy, zostały odkryte i opisane przez Tomalia D.A. i wsp. (Tomalia D.A. i wsp. „Starburst Cascade Polymers: Molecular Level Control od Sise, shape, Surface Chemistry, Topology, and Flexibility from Atoms to Macroscopic Matter”, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29:138 (1990)). W stanie techniki znane są również liczne sposoby ich otrzymywania (patrz: PCT/US83/02052, oraz patenty USA o numerach: 4 507 466, 4 558 120, 4 568 737, 4 587 329, 4 631 337, 4 694 064, 4 713 975, 4 737 550, 4 871 779 i 4 857 599). Kontrolowane i prowadzone etapowo warstwowe rozbudowywanie takiej struk
PL 239 642 B1 tury prowadzi do otrzymywania kolejnych generacji polimerów o precyzyjnie określonych rozmiarach, masach cząsteczkowych oraz liczbie znajdującej się na ich powierzchni grup funkcyjnych (w szczególności reszt aminowych) decydujących o kationowym charakterze cząsteczki polimeru.
Przyłączenie sześciu warstw jednostek -CH2CH2CONHCH2CH2N do rdzeniowej cząsteczki etylenodiaminy prowadzi do uzyskania polimeru szóstej generacji dendrymeru PAMAM G 6.0 (numer CAS 163442-69-1) o masie cząsteczkowej 58046 11 a.j.m. i 256 powierzchniowych grupach aminowych. Związek ten jest dostępny komercyjnie od lat 90.
Celem wynalazku jest dostarczenie substancji i postaci leków nadających się do doszklistkowego podawania leków okulistycznych, zwłaszcza przeznaczonych do leczenia lub zapobiegania chorobom neurodegeneracyjnym siatkówki oka.
Przedmiotem wynalazku jest kompozycja do doszklistkowego podawania białka leczniczego, znamienna tym, że zawiera białko lecznicze oraz poliamidoaminowy polikation dendrymeryczny połączony elektrostatycznie z tym białkiem leczniczym, przy czym białkiem leczniczym jest neurotrofina-4 (NT-4), a poliamidoaminowym polikationem dendrymerycznym jest dendrymer PAMAM, korzystnie PAMAM G 6.0.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompleks elektrostatyczny składający się z poliamidoaminowego polikationu dendrymerycznego PAMAM, korzystnie PAMAM G 6.0, oraz neurotrofiny-4 (NT-4).
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompleks elektrostatyczny określony powyżej do stosowania w medycynie, korzystnie do stosowania w profilaktyce lub leczeniu chorób oczu.
Korzystnie, kompleks elektrostatyczny do zastosowania według wynalazku charakteryzuje się tym, że chorobą oka jest choroba degeneracyjna siatkówki oka, zwłaszcza wybrana z grupy obejmującej: zwyrodnienie plamki związane z wiekiem, zanik girlandowaty, zwyrodnienie barwnikowe siatkówki oraz jaskrę.
Korzystnie, kompleks elektrostatyczny do stosowania według wynalazku charakteryzuje się tym, że jest on stosowany w leku przeznaczonym do podawania doszklistkowego neurotrofiny-4, zwłaszcza w postaci leku o spowolnionym uwalnianiu neurotrofiny-4.
Szczegółowy opis wynalazku
Zgodnie z wynalazkiem uzyskano uniwersalny bionośnik w skali nanometrycznej, przeznaczony do zastosowań medycznych, zwłaszcza do indukowania regeneracji siatkówki (poprawa jej funkcjonowania), korzystnie w chorobach neurodegeneracyjnych. Do wytworzenia bionośnika służącego do transportu i kontrolowanego uwalniania czynników neurotroficznych, tj. neurotrofiny 4, po ich podaniu doszklistkowym zastosowano komercyjnie dostępne rozgałęzione polielektrolity, dendrymery poliamidoaminowe szóstej generacji (6G). Wyznaczono siłę wiązania czynnik troficzny-nośnik, co umożliwiło opracowanie systemu lokalnego, długotrwałego i nieprzerwanego uwalniania białka w ciągu 60 dni. W modelu mysim in vivo, wykazano, że zaproponowane zgodnie z wynalazkiem formy nanostruktur są odpowiednie do korzystnego dotkankowego dostarczania farmakologicznie aktywnych związków biologicznych, które wykazują wpływ na funkcje uszkodzonej siatkówki na poziomie komórkowym i cząsteczkowym, w tym na jej właściwości pro-regeneracyjne i anty-degeneracyjne.
Utworzony kompleks elektrostatyczny neurotrofina 4-dendrymer PAMAM 6G przetestowano w zaburzeniach funkcji siatkówki oka w modelu selektywnego, ostrego uszkodzenia nabłonka barwnikowego oraz jego roli w mechanizmie „pouszkodzeniowej” neuroregeneracji siatkówki oka. Przeprowadzono szczegółową ocenę kinetyki zmian funkcjonalnych i morfologicznych w obrębie uszkodzonej siatkówki oka u myszy poprzez podanie kompleksu białko NT-4-dendrymer PAMAM do środowiska siatkówki oka. Następnie dokonano oceny procesu regeneracji siatkówki myszy po indukcji uszkodzenia obejmującego selektywnie nabłonek barwnikowy (RPE) siatkówki oka.
W pierwszym etapie dokonano indukcji selektywnego uszkodzenia nabłonka barwnikowego siatkówki oka myszy za pomocą jodanu sodu (NalOs), według ustalonego protokołu. Następnie, podano doszklistkowo kompleks elektrostatyczny białko-dendrymer i przeprowadzono szczegółową analizę kinetyki zmian siatkówki oka zwierząt. Badane parametry obejmowały przyżyciową ocenę funkcjonalną (ERG, elektroretinografia) oraz morfologiczną (OCT-SD, optyczna koherentna tomografia w domenie spektralnej) w wybranych 3 punktach czasowych - przed oraz w 7., 14. i 28. dobie od podania czynnika uszkadzającego (6 myszy każdej płci na punkt czasowy). W tych samych punktach czasowych, w pozyskanych preparatach siatkówki, zbadano kinetykę zmian siatkówkowej ekspresji czynnika neurotroficznego NT-4 na poziomie białka, co korelowało ze zmianami funkcjonalnymi siatkówki i endogenną odpowiedzią regeneracyjną pochodzącą z części nerwowej siatkówki. Zastosowane metody badawcze pozwoliły dokładniej określić efekt terapeutyczny zastosowanego układu białko-nośnik.
PL 239 642 B1
Przeprowadzone prace doświadczalne w modelu in vitro i in vivo pozwoliły na:
- uzyskanie stabilnego kompleksu elektrostatycznego białko NT-4-dendrymer PAMAM 6G umożliwiającego kontrolowaną w sposób ilościowy ciągłą desorpcję neurotrofin w obrębie szklistki i ich dyfuzję do komórek znajdujących się w nabłonku barwnikowym siatkówki w okresie 28 dni,
- określenie zakresów stężeń zaadsorbowanych białek oraz wpływu stężenia powierzchniowego biokompatybilnej warstwy neurotrofin na siatkówkę mysiego oka,
- wyznaczenie siły wiązania białko-dendrymer przez przeprowadzenie pomiarów desorpcji białek zarówno w roztworze buforu fosforanowego jak i układzie żelowym jakim jest szklistka oka mysiego; przeprowadzone pomiary umożliwiły wyznaczenie stałych równowagi dla wiązania białko -dendrymer oraz określiły szybkości dyfuzji neurotrofin ze szklistki do siatkówki,
- scharakteryzowanie stabilności utworzonych biokompatybilnych warstewek neurotrofin.
P r z y k ł a d 1. Otrzymywanie kompleksów elektrostatycznych składających się z PAMAM G 6.0 oraz neurotrofiny-4 (NT-4).
Roztwory NT-4
Sporządzanie roztworów neurotrofiny-4
Do uzyskania bionanonośników dendrymer-neurotrofina 4 wykorzystano komercyjnie zakupione białko NT-4 (recombinant human neurotrophin 4, CF, zakupiona w firmie R&D Systems o nr katalogowym 268-N4-250ug/CF). Roztwory białka o stężeniu 500 mg/L uzyskiwano przez rozpuszczenie NT-4 w buforze fosforanowym następnie roztwór filtrowano używając filtrów (centrifree ultrafiltration device, Merck Millipore, nr kat 4104). Aby zminimalizować błędy w określaniu dokładnego stężenia przygotowywanych w PBSie roztworów neurotrofiny-4 przed rozcieńczeniem określano ich wartości dwiema komplementarnymi technikami spektrofotometrycznymi: metodą BCA (abcam, AB207002) i pomiarem absorbancji przy długości fali 280 nm. Przed każdym eksperymentem rozcieńczano wyjściowy roztwór neurotrofiny-4 do wartości 5-100 mg/L. Wszystkie roztwory białka NT-4 były przygotowywane w zbuforowanym roztworze soli fizjologicznej bez jonów wapnia i magnezu (płyn PBS) o osmomolarnośc i 270-300 mOsmol/L i pH 7,4 +/- 0,2 (firma Biomed Lublin).
Skład płynu PBS: chlorek sodu NaCl 8 g/L, chlorek potasu KCl 0,2 g/L, wodorofosforan disodowy Na2HPO4 χ 12 H2O 2,9 g/L; difosforan potasu KH2PO4 0,2 g/L.
Badanie roztworów neurotrofiny-4
Określenie parametrów fizykochemicznych białek tj. współczynnik dyfuzji, średnic cząstek, ruchliwości mikroelektroforetycznej i potencjału zeta białek w roztworach jest istotne do oceny odwracalności adsorpcji lub jej braku z powierzchni polimerów PAMAM i ma kluczowe znaczenie w tworzeniu efektywnego leku Neurotrofina-4 - PAMAM. Współczynnik dyfuzji jak i wielkość NT-4 były określone w roztworze metodą dynamicznego rozpraszania światła (DLS/dynamic light scattering) używając aparatu Zetasizer Nano ZS (Malvern). Przeprowadzono charakterystykę fizykochemiczną molekuł NT-4 w roztworach PBSu o sile jonowej 0,15 M dla dwóch wartości pH 3,5 i 7,4. W czasie 33 dni sprawdzono zmiany współczynników dyfuzji NT-4 (temp. 293 K) jak również średnicę hydrodynamiczną w roztworze PBSu.
Na Fig. 1 przedstawiono stabilność białka NT-4 jako zależność współczynnika dyfuzji (część a)/ średnicy hydrodynamicznej (część b) w czasie. Punkty oznaczają wartości eksperymentalne z pomiarów DLS dla 200 μg/mL NT-4, 0,15 M PBS: (·) pH 7,4 and (o) pH 3,5. Część C przedstawia histogram z rozkładem średnicy hydrodynamicznej molekuł NT-4 w roztworze 0,15 M PBS o pH=7,4. Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe liczone z 6 pomiarów.
Na Fig. 2 przedstawiona została średnica hydrodynamiczna białka NT-4 określona metodą DLS w funkcji zmiany pH. Punkty oznaczają eksperymentalne wyniki uzyskane metodą dynamicznego rozpraszania światła dla roztworów NT-4 o stężeniu 200 μg/mL, 0,15 M PBS: (·, o) po ultrafiltracji, i (▲) bez ultrafiltracji.
Ponadto sprawdzono wielkość molekuł NT-4 zaadsorbowanych na powierzchni miki mikroskopem sił atomowych NanoWizard AFM (JPK Instruments AG). Mikę zanurzono w roztworze NT-4 w PBSie, o stężeniu 1 mg/L, czas adsorpcji to 1 minuta, następnie obficie przepłukano wodą ultraczystą przez 1 minutę w celu usunięcia nie zaadsorbowanych molekuł białka z jej powierzchni. Tak przygotowaną próbkę wysuszono na powietrzu przed samą analizą. Następnie za pomocą mikroskopu AFM określono pokrycia powierzchni miki molekułami zaadsorbowanej neurotrofiny, które wyniosło 1 mg/m2 za pomocą programu Loco’s Shire v.2.8.24.0 i ImageJ określono średnicę zaadsorbowanej molekuły NT-4.
Na Fig. 3 przedstawione zostały zdjęcia z mikroskopu AFM przedstawiające molekuły białka NT-4 zaadsorbowane na powierzchni miki.
PL 239 642 B1
Jak można zauważyć molekuły NT-4 mają kształt kulisty czym przypominają białka globularne. Ich średnica z pomiaru AFM wynosi 5,1 +/- 2 nm (po filtracji) co jest przedstawione na Fig. 3. Pomiary wielkości neurotrofiny zaadsorbowanej na powierzchni stałej techniką AFM są w dobrej zgodności z pomiarami tego białka w roztworze PBSu.
Zmierzono ruchliwość elektroforetyczną cząsteczek NT-4 w roztworze PBSu techniką mikroelektroforezy w celu ustalenia ładunku elektrokinetycznego jakie ma białko w roztworze elektrolitu PBS. Następnie przeliczono ją na potencjał zeta cząstki neurotrofiny co pozwoliło ustalić przy jakich wartościach pH używając oddziaływań elektrostatycznych można zaadsorbować białko NT-4 na powierzchni dendrymeru PAMAM.
Na Fig. 4 przedstawiony został potencjał zeta/ruchliwość elektroforetyczna (ξ/μθ) NT-4 w funkcji pH roztworu w 0,15 M roztworze PBS w temperaturze 293 K.
Tak jak można zauważyć ruchliwość elektroforetyczną neurotrofiny-4 w pH 3,5 wynosi 0,95 pm cm/s V co odpowiada potencjałowi zeta 19 mV natomiast w pH 9,5 wynosi ona -1,12 pm cm/s V co odpowiada potencjałowi zeta -20 mV. W roztworze PBS o pH 7,4 potencjał zeta przyjmuje nieznacznie ujemną wartość -5 mV.
Roztwory dendrymeru PAMAM
Do uzyskania kompleksów dendrymer-neurotrofina 4 wykorzystane zostały komercyjnie dostępne dendrymery PAMAM szóstej generacji 6G (Sigma Aldrich, nr katalogowy 536717). Roztwory PAMAM o stężeniu 50 mg/L uzyskiwano przez 1000-krotne rozcieńczenie w buforze fosforanowym PBS wyjściowego stężonego roztworu dendrymeru po czym roztwór filtrowano używając filtrów (0,1 pm lowest binding membrane for protein solutions, PVDF Durapore, Merck Millipore, nr produktu SLVV033RS). Wielkość (średnica hydrodynamiczna) polimeru PAMAM 6 była określona w roztworze metodą dynamicznego rozpraszania światła (DLS/dynamic light scattering) używając aparatu Zetasizer Nano ZS (Malvern). Na Fig. 5 przedstawiony został histogram rozkładu średnicy hydrodynamicznej dendrymeru PAMAM 6.0 określono metodą DLS. Punkty oznaczają eksperymentalne wyniki uzyskane metodą dynamicznego rozpraszania światła dla roztworów PAMAM o stężeniu 200 pg/mL w 0,15 M PBS o pH 7,4.
Jak można zauważyć średnica molekuły PAMAM z pomiaru DLS wynosi 7 +/- 0,2 nm (po filtracji) co jest przedstawione na rysunku nr 5. Histogram nr 5 pokazuje bardzo monodyspersyjny rozkład wielkości dendrymeru 85% wszystkich molekuł PAMAM ma średnicę oscylującą w granicach 7 +/- 1 nm.
Ruchliwość elektroforetyczną jak i potencjał zeta molekuł PAMAM określono w roztworze 0,15 M PBSu techniką mikroelektroforezy (LDV) w celu ustalenia ich nieskompensowanego ładunku elektrokinetycznego. Ruchliwość elektroforetyczna dendrymeru PAMAM w pH 7,4 wyniosła 1,16 +/- 0,19 pm cm/s V co odpowiada potencjałowi zeta 22,2 +/- 3,7 mV.
Otrzymywanie i charakterystyka kompleksu elektrostatycznego dendrymer-neurotrofina-4
Zaadsorbowano białko na powierzchni dendrymeru PAMAM G 6.0 wykorzystując oddziaływania elektrostatyczne. Adsorpcja neurotrofiny-4 na nośniku dendrymerowym była prowadzona w roztworze PBS (skład jak powyżej) o sile jonowej 0,15 M i pH 7,4 w ependorfce o pojemności 2 ml. W zastosowanych warunkach neurotrofina-4, jak to wynika z wartości jej potencjału zeta -5 mV, posiadająca ujemny ładunek elektrokinetyczny dyfunduje do powierzchni dendrymeru PAMAM o potencjale zeta 22 mV, a więc o dodatnim ładunku elektrokinetycznym.
Adsorpcja białka na nanonośniku przebiegała według następującej procedury:
i) zmierzono ruchliwość mikroelektroforetyczną białka NT-4 (metodą opisaną powyżej) oraz dendrymeru PAMAM (metodą opisaną powyżej), ii) warstwy NT-4 na powierzchni dendrymeru były formowane przez zmieszanie tych samych objętości roztworów tj. 0,5 ml roztworu NT-4 o stężeniu 40 mg L'1 z 0,5 ml roztworu PAMAM o stężeniu 100 mg L-1, iii) adsorpcja przebiegała przez 15 min co było wystarczającym czasem do osiągnięcia maksymalnego pokrycia/pełnej monowarstwy NT-4 na nanocząstce dendrymeru [Adamczyk, Z.; Bratek-Skicki, A.; Dąbrowska, P.; Nattich-Rak, M. Mechanisms of fibrinogen adsorption on latex particles determined by zeta potential and AFM measurements. Langmuir 2012, 28, 474-485], iv) cała procedura była wykonywana w ependorfkach przy intensywnym mieszaniu w temperaturze 293 K.
Zmierzono średnicę hydrodynamiczną wytworzonego kompleksu elektrostatycznego 20 pg/mL NT-4-50 pg/mL PAMAM w roztworze PBSu o pH 7,4 używając metody DLS. Wynosi ona 13,5 +/- 5 nm.
PL 239 642 B1
Na Fig. 6 przedstawiony został histogram rozkładu średnicy hydrodynamicznej kompleksu elektrostatycznego NT-4-PAMAM 6.0 określono metodą DLS. Punkty oznaczają eksperymentalne wyniki uzyskane metodą dynamicznego rozpraszania światła dla roztworów NT-4 (20 μg/mL)-PAMAM (50 μg/mL) w 0,15 M PBS o pH 7,4.
Potencjał zeta kompleksu elektrostatycznego 20 μg/mL NT-4-50 μg/mL PAMAM zmierzony techniką mikroelektroforezy w 0,15 M PBS pH 7,4 wynosił 12 +/- 8 mV.
Dodatkowo sprawdzono średnicę kompleksu elektrostatycznego NT-4-PAMAM zaadsorbowanych na powierzchni miki używając w tym celu mikroskopu sił atomowych NanoWizard AFM (JPK Instruments AG). Mikę zanurzono w roztworze NT-4-PAMAM w 0,15 M PBSie o pH 7,4, czas adsorpcji wynosił 15 minut, następnie obficie przepłukano strumieniem wody ultraczystej przez 1 minutę w celu usunięcia nie zaadsorbowanych cząsteczek białka lub kompleksu elektrostatycznego z jej powierzchni. Tak przygotowaną próbkę wysuszono na powietrzu przed samą analizą. Następnie za pomocą mikroskopu AFM określono pokrycia powierzchni miki molekułami zaadsorbowanego kompleksu elektrostatycznego, które wyniosło 0,5 mg/m2, za pomocą programu Loco’s Shire v.2.8.24.0 i ImageJ określono średnicę zaadsorbowanych kompleksów elektrostatycznych NT-4-PAMAM.
Na Fig. 7 przedstawione zostały zdjęcia z mikroskopu AFM przedstawiające kompleksy NT-4-PAMAM zaadsorbowane na powierzchni miki.
Jak można zauważyć kompleksy NT-4-PAMAM mają kształt kulisty a ich średnica uzyskana w pomiarach AFM wynosi 18 +/- 5 nm (po filtracji) co jest przedstawione na Fig. 7. Pomiary wielkości kompleksów NT-4-PAMAM zaadsorbowanych na powierzchni miki techniką AFM są w dobrej zgodności z pomiarami DLS w objętości roztworu.
Kinetyka desorpcji neurotrofiny-4 z kompleksów dendrymer-neurotrofina-4 w roztworze PBS
Badanie desorpcji neurotrofiny-4 z nanocząstek PAMAM w czasie 3 miesięcy wykonano techniką ubytku stężenia roztworu w jednostce czasu, metodą ELISA (test firmy R&D Systems kody DY992, DY990, DY994, DY999, DY995, WA126, DY006, DY268). W tym celu po adsorpcji NT-4 na dendrymerze PAMAM uzyskane roztwory poddano ultrafiltracji na sączkach o punkcie odcięcia 30 kDa w roztworze PBS. Masa cząsteczkowa pojedynczej molekuły neurotrofiny-4 wynosi 14 kDa dlatego wszystkie niezwiązane z dendrymerem białka NT-4 po filtracji znalazły się w przesączu. Stężenie NT-4 w uzyskanym przesączu oznaczano metodą ELISA. Technika ta była użyta do monitorowania uwalniania NT-4 z dendrymeru w funkcji czasu (Fig. 8) w roztworze 0,15 M PBSu o pH 7,4.
Na Fig. 6 przedstawiona została kinetyka desorpcji białka z nanobionośnika NT-4-PAMAM w funkcji czasu.
Z profilu kinetyki uwalniania NT-4 wynika, że zastosowanie nanobionośnika 50 μg/ml PAMAM-20 μg/ml NT-4 gwarantuje ciągłe uwalnianie białka na poziomach stężeń 200 +/- 50 pg/ml w czasie co najmniej 102 dni.
P r z y k ł a d 2. Stosowanie kompleksów elektrostatycznych składających się z PAMAM G 6.0 oraz neurotrofiny-4 (NT-4) w leczeniu chorób oczu.
Zwierzęta
Do badania wykorzystano myszy szczepu C57BL6/J/cmdb (Centrum Medycyny Doświadczalnej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku) obu płci, ważące 27-30 g. Procedury z wykorzystaniem myszy zostały wszczęte po uzyskaniu pozytywnej opinii lokalnej komisji etycznej do spraw doświadczeń na zwierzętach w Poznaniu (uchwała nr 53/2017 z dnia 06.10.2017 roku). Hodowlę zwierząt prowadzono w systemie klatek indywidualnie wentylowanych (regał IVC: BIO A.S. Vent II Ehret, Emmendingen, Niemcy), z dwunastogodzinnym cyklem dzień/noc oraz z dostępem do pożywienia i wody ad libitum.
Model ostrego uszkodzenia siatkówki oka
NaIO3 selektywnie niszczy nabłonek barwnikowy siatkówki oka, a następnie przylegającą do niego warstwę fotoreceptorową. Charakter uszkodzenia przypomina zmiany degeneracyjne siatkówki oka, obserwowane w przypadku jednostek chorobowych występujących u ludzi, np. zwyrodnienie plamki związane z wiekiem, zanik girlandowaty, czy zwyrodnienie barwnikowe siatkówki. Dlatego model ten jest przydatny w badaniach nad opracowaniem strategii terapeutycznych w leczeniu chorób ocznych o charakterze degeneracyjnym u ludzi.
Przed przystąpieniem do procedury uszkodzenia siatkówki wywołanego toksycznym działaniem NaIO3, myszy zostały poddane anestezji poprzez dootrzewnowe podanie roztworu ketaminy (40 mg/kg) i ksylazyny (4 mg/kg) (oba preparaty z Biowet, Puławy, Polska). Dodatkowo, stosując 0,5% roztwór chlorowodorku proksymetakainy (Alcaine; Alcon, Fort Worth, TX, USA) znieczulono rogówkę. Następnie, do spotu żylnego zagałkowego podano zwierzętom NaIO3 w pojedynczej dawce 25 mg/kg.
PL 239 642 B1
Doszklistkowe podawanie PAMAM oraz kompleksu PAMAM-NT4
Przed przystąpieniem do procedury, myszy zostały poddane anestezji poprzez dootrzewnowe podanie roztworu ketaminy (40 mg/kg) i ksylazyny (4 mg/kg). Dodatkowo, stosując 0,5% roztwór chlorowodorku proksymetakainy (Alcaine; Alcon, Fort Worth, TX, USA) znieczulono rogówkę. Kompleksy PAMAM-NT-4 oraz dendrymer PAMAM podano drogą doszklistkowej iniekcji do przeciwległych oczu. Objętość podawanego płynu wynosiła μΙ. Grupę kontrolną stanowiły zwierzęta, które otrzymały tylko iniekcję NaIO3.
Optyczna koherentna tomografia w domenie spektralnej (SD-OCT)
Optyczna koherentna tomografia w domenie spektralnej (ang. spectral domain optical coherence tomography; SD-OCT) umożliwia przyżyciową i nieinwazyjną ocenę morfologii siatkówki oka. Badanie wykonano przed oraz w 7. i 28. dobie od uszkodzenia siatkówki indukowanego toksyczną działalnością NaIO3 i doszklistkowym podaniu kompleksu dendrymer-neurotrofina 4 (n=12 myszy), z zastosowaniem systemu Bioptigen Envisu™ R2200-HR SD-OCT (Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy).
Przed przystąpieniem do procedury, myszy zostały znieczulone poprzez dootrzewnowe podanie roztworu ketaminy (40 mg/kg) i ksylazyny (4 mg/kg). Następnie, w celu rozszerzenia źrenic, do worka spojówkowego zwierząt podano 1% roztwór atropiny (Atropinum Sulfuricum WZF; Polfa Warszawa, Polska). Podczas całego okresu trwania badania myszy stosowano krople żelowe do oczu (Systane Gel Drops; Alcon, Fort Worth, TX, USA), które utrzymywały przejrzystość rogówki i zapewniały dobrą jakość uzyskiwanych obrazów.
Analizę morfometryczną grubości siatkówki oka przeprowadzono w oparciu o oprogramowanie InVivoVue i narzędzia „calliper” (Bioptigen, Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy), mierząc odległość między pierwszą warstwą hiperrefleksyjną, tj. granicą szklistkowo-siatkówkową, a nabłonkiem barwnikowym. Pomiarów dokonano we wszystkich kwadrantach siatkówki, w odległości 450 μm od środka tarczy nerwu wzrokowego.
Przyjęto, że średnia wartość wszystkich uzyskanych pomiarów stanowiła całkowitą grubość siatkówki oka. Aby zobrazować zmiany w grubości siatkówki oka myszy w kinetyce czasu, dane zostały przedstawione jako procentowa wartość oszacowana indywidualnie dla każdego osobnika, na podstawie pomiaru uzyskanego w 7. i 28. dobie, w odniesieniu do wartości otrzymanej przed uszkodzeniem wywołanym toksycznym działaniem NaIO3 i doszklistkowym podaniem kompleksu dendrymer-neurotrofina 4, która została przyjęta jako 100%.
Analiza morfometryczna skanów siatkówki oka wykazała, że w toku uszkodzenia siatkówki indukowanego toksyczną działalnością NaIO3 dochodzi do znacznego spadku grubości siatkówki. W grupie myszy, które otrzymały doszklistkową iniekcję kompleksu PAMAM-NT4 oraz dendrymeru PAMAM zaobserwowano pełną regenerację siatkówki (Fig. 9 i 10).
Na Fig. 9 przedstawione zostały reprezentatywne tomogramy siatkówek mysich przed oraz w 7. i 28. dobie po podaniu PAMAM-NT4, PAMAM oraz NaIO3 uzyskane za pomocą metody SD-OCT.
Na Fig. 10 przedstawiona została kinetyka zmian grubości siatkówki oka myszy przed oraz w 7. i 28. dobie po podaniu PAMAM-NT4, PAMAM oraz NaIO, wyznaczona na podstawie pomiarów morfometrycznych skanów siatkówki, uzyskanych za pomocą metody SD-OCT. Wartości uzyskane w 0 dobie przyjęto jako 100%.
Elektroretinografia (ERG)
Elektroretinografia (ang. electroretinography; ERG) pozwala w sposób obiektywny i nieinwazyjny ocenić funkcję bioelektryczną siatkówki oka. Badanie wykonano przed oraz w 7. i 28. dobie od uszkodzenia siatkówki indukowanego toksyczną działalnością NaIO3 i doszlistkowym podaniu kompleksu dendrymer-neurotrofina 4 (n=12 myszy), w warunkach skotopowych i fotopowych, z zastosowaniem stymulacji całopolowej (sag. full field ERG; ffERG, Ganzfeld).
Po całonocnej adaptacji do ciemności, do worka spojówkowego myszy podano 1% roztwór atropiny, w celu rozszerzenia źrenicy. Następnie, myszy zostały poddane anestezji poprzez dootrzewnowe podanie roztworu ketaminy (40 mg/kg) i ksylazyny (4 mg/kg). Aby zminimalizować dyskomfort zwierząt, spowodowany stosowaniem elektrod kontaktowych, rogówka została znieczulona 0,5% roztworem chlorowodorku proksymetakainy (Alcaine; Alcon, Fort Worth, TX, USA). Dla uzyskania zapisu ERG, zastosowano następujące rodzaje odprowadzeń: (i) elektroda czynna - rogówkowa, w postaci soczewki kontaktowej z wbudowanym złotym pierścieniem, (ii) elektroda bierna igłowa - referencyjna, umieszczana podskórnie w okolicy czołowej głowy myszy, pomiędzy uszami (iii) elektroda bierna igłowa - uziemiająca, wprowadzana podskórnie u podstawy ogona zwierzęcia (wszystkie rodzaje elektrod pochodziły z LKC Technologies, Gaithersburg, MD, USA).
PL 239 642 B1
Zapis ERG uzyskano przy użyciu systemu UTAS BigShot™ (LKC Technologies, Gaithersburg, MD, USA). Protokół składał się z następujących etapów:
1. Odpowiedź pręcikowa, uzyskana w adaptacji nocnej, przez stymulację błyskiem światła białego o niskim natężeniu (filtr neutralny 24 dB). Uśredniono 8 zapisów, zarejestrowanych w odstępach 8-sekundowych.
2. Odpowiedź pręcikowo-czopkowa, inicjowana w adaptacji nocnej, przez stymulację błyskiem światła białego o maksymalnym natężeniu (błysk standardowy, filtr 0 dB). Uśredniono 2 zapisy, zarejestrowane w odstępie 28 sekund.
3. Potencjał oscylacyjny, indukowany w adaptacji nocnej, przez stymulację pojedynczym błyskiem światła białego o maksymalnym natężeniu (błysk standardowy, filtr 0 dB).
4. Odpowiedź czopkowa, otrzymana po 10-minutowej adaptacji dziennej (natężenie oświetlenia cd/m2) i stymulacji standardowym błyskiem świetlnym (filtr 0 dB). Uśredniono 8 zapisów, zarejestrowanych w odstępach 1-sekundowych.
We wszystkich etapach używano filtru pasmowo-zaporowego do redukcji zakłóceń sieciowych (ang. notch filter).
Analizę funkcji bioelektrycznej siatkówki oka przeprowadzono w oparciu o amplitudę fali b, która była mierzona od największego załamania fali a do szczytu fali b lub, przy braku fali a, od linii izoelektrycznej do szczytu fali b.
Aby zobrazować zmiany elektrofizjologii siatkówki oka w kinetyce czasu, dane zostały przedstawione jako procentowa wartość oszacowana indywidualnie dla każdego osobnika, na podstawie pomiaru amplitudy fali b uzyskanego w 7. i 28. dobie, w odniesieniu do wartości otrzymanej przed uszkodzeniem wywołanym toksycznym działaniem NaIO3 i doszklistkowym podaniem kompleksu dendrymer-neurotrofina 4, która została przyjęta jako 100%.
Analiza zapisów ERG w kinetyce czasu wykazała, że u wszystkich grup doświadczalnych dochodzi do spadku amplitudy fali b odpowiedzi pręcikowej, pręcikowo-czopkowej, czopkowej, a także sumy potencjałów oscylacyjnych, w odniesieniu do pomiarów uzyskanych przed uszkodzeniem siatkówki wywołanym NaIO3 i doszklistkową iniekcją nanostruktur. Jednakże, w grupie myszy, którym podano kompleks PAMAM-NT-4, czynność bioelektryczna siatkówki była znacznie lepiej zachowana (Fig. 11 i 12).
Na Fig. 11 przedstawiono reprezentatywne elektroretinogramy odpowiedzi pręcikowej (A), pręcikowo-czopkowej (B), czopkowej (D) oraz sumy potencjałów oscylacyjnych (C) uzyskane w 28. dobie po podaniu PAMAM-NT4, PAMAM oraz NaIO3.
Na Fig. 12 przedstawiona została kinetyka zmian czynności bioelektrycznej siatkówki oka odpowiedzi pręcikowej (A), pręcikowo-czopkowej (B), czopkowej (D) oraz sumy potencjałów oscylacyjnych (C) przed oraz w 7. i 28. dobie po podaniu PAMAM-NT4, PAMAM oraz NaIO3. Pomiary uzyskane w 0 dobie przyjęto jako 100%.
Izolacja białka
Przed oraz w 7., 14. i 28. dobie od uszkodzenia siatkówki indukowanego toksyczną działalnością NaIO3 i doszlistkowym podaniu kompleksu dendrymer-neurotrofina 4, część myszy poddano eutanazji poprzez dyslokację rdzenia kręgowego i pobrano gałki oczne, z których wypreparowano osobno szklistkę oraz część neurosensoryczną siatkówki, wraz z nabłonkiem barwnikowym. Z otrzymanych bioptatów, przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu PARIS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) izolowano białko całkowite. W pierwszym etapie izolacji, zamrożone tkanki przenoszono do 300 μl buforu lizującego (ang. Cell Dissruption Buffer), wzbogaconego o mieszaninę inhibitorów proteaz (Protease Inhibitor Coctail, set III; Merck Millipore, Billerica, MA, USA) i fosfataz (1 mM fluorek sodu oraz 2 mM ortowanad sodu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)). Następnie, tkanki rozdrabniano, posługując się homogenizatorem ręcznym Omni TH zaopatrzonym w końcówki do prób twardych (Omni International, Kennesaw, GA, USA). Aby dokończyć proces lizy, homogenaty pozostawiono na lodzie na dodatkowe 10 min, a następnie wirowano z zachowaniem parametrów: 4°C, 14 000 rpm, 12 min. Uzyskany supernatant poddano spektrofotometrycznej ocenie stężenia białka metodą Bradford (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Ekstrakt białkowy wykorzystano do oceny stężenia neurotrofiny-4 immunoenzymatyczną metodą ELISA.
Kinetyka desorpcji neurotrofiny-4 z kompleksu dendrymer-neurotrofina-4 w szklistkach i siatkówkach oczu mysich
W celu sprawdzenia wpływu kompleksu na poprawę funkcjonowania mysich siatkówek określono poziomy stężeń NT-4 w oku mysim przed i po doszklistkowym podaniu 50 μg/ml PAMAM-20 μg/ml
PL 239 642 B1
NT-4 w objętości 1 μΙ. Charakterystykę rozpoczęto od sprawdzenia ekspresji neurotrofiny czwartej na poziomie narządu receptorowego jakim jest oko, po doszklistkowym podaniu NaIO3 w celu indukcji uszkodzenia siatkówki, dlatego wyizolowano zarówno siatkówki jak i szklistki od myszy według procedury opisanej w punkcie 2.1.6.
Przy pomocy techniki ELISA (abcam, R&D Systems, BD Biosciences) w szklistkach mysich określono stężenia NT-4 w dniu 0 czyli bez podania NaIO3, w 7. dobie po podaniu i w 28. dobie po podaniu substancji uszkadzającej siatkówkę co przedstawiono na Fig. 13 i 14.
Na Fig. 13 przedstawiona została ocena poziomów stężeń białka NT-4 w szklistkach mysich po podaniu NaIO3, dendrymeru PAMAM, kompleksu NT-4-PAMAM w 0, 7., 14. i 28. dobie po podaniu. a) Stężenie białka NT-4 jest podane w jednostce [pg/ml] b) Stężenie białka NT-4 jest podane w jednostce [pg/mg] tzn. że jest znormalizowane w przeliczeniu na masę białka całkowitego zawartego w poszczególnych mysich szklistkach.
Na podstawie uzyskanych wyników określono stężenia NT-4 w szklistkach mysich bez podania NaIO3 oznaczenie na rysunku jako 0 doba, które wynosiło 3,0 +/- 1,9 pg/ml, w 7. dobie po podaniu 2,3 +/- 0,3 pg/ml i w 28. dobie po podaniu 0 pg/ml. Na rysunku 8b) przedstawiono dane eksperymentalne dotyczące wyżej wymienionych stężeń NT-4 przeliczone na ilości neurotrofiny do całkowitej zawartości białka w szklistce. Całkowitą zawartość białka w szklistce określono przy po mocy metody Bradford.
Tą samą metodą zmierzono stężenia NT-4 w szklistkach uszkodzonego oka mysiego po podaniu doszklistkowym samego nośnika PAMAM w 7., 14. i 28. dobie od podania. Wyniki uzyskane przy pomocy techniki ELISA w szklistkach przedstawiono na rysunku 13a) i osiągnęły wartości w 7. dobie po podaniu 3,1 +/- 1,7 pg/ml i w 28. dobie po podaniu 0 pg/ml. Na rysunku 13b) przedstawiono dane eksperymentalne dotyczące wyżej wymienionych stężeń NT-4 przeliczone na ilości neurotrofiny do całkowitej zawartości białka znajdującego się w szklistce.
Dodatkowo zmierzono stężenia NT-4 w szklistkach uszkodzonego oka mysiego po podaniu doszklistkowym kompleksu 50 μg/ml PAMAM-20 μg/ml NT-4 w 7., 14. i 28. dobie od podania. Wyniki uzyskane przy pomocy techniki ELISA w szklistkach przedstawiono na rysunku nr 13a) i osiągnęły wartości w 7. dobie po podaniu 654 +/- 100 pg/ml i w 28. dobie po podaniu 28 +/- 15 pg/ml. Na rysunku 13b) przedstawiono dane eksperymentalne dotyczące wyżej wymienionych stężeń NT-4 przeliczone na ilości neurotrofiny do całkowitej zawartości białka znajdującego się w szklistce.
Na Fig. 14 przedstawiona została ocena poziomów stężeń białka NT-4 w siatkówkach mysich po podaniu NaIO, dendrymeru PAMAM, kompleksu NT-4-PAMAM w 0, 7., 14. i 28. dobie po podaniu. a) Stężenie białka NT-4 jest podane w jednostce [pg/ml] b) Stężenie białka NT-4 jest podane w jednostce [pg/mg], czyli jest znormalizowane w przeliczeniu na masę białka całkowitego zawartego w poszczególnych mysich siatkówkach.
Na podstawie uzyskanych wyników określono stężenia NT-4 [pg/ml] w siatkówkach mysich bez podania NaIO3 oznaczenie na rysunku 14 jako 0 doba, które wynosiło 9,9 +/- 0,2 pg/ml, w 7. dobie po podaniu 11,8 +/- 1,2 pg/ml i w 28. dobie po podaniu 11,1 +/- 1,1 pg/ml. Na rysunku 14b) przedstawiono dane eksperymentalne dotyczące stężeń NT-4 w siatkówkach mysich przeliczone na ilości neurotrofiny do całkowitej zawartości białka NT-4 w szklistce. Całkowitą zawartość białka w szklistce określono przy pomocy metody Bradford.
Tą samą metodą zmierzono stężenia NT-4 w siatkówkach uszkodzonego oka mysiego po podaniu doszklistkowym samego nośnika PAMAM w 7., 14. i 28. dobie od podania. Wyniki uzyskane przy pomocy techniki ELISA w szklistkach przedstawiono na rysunku nr 14a) i osiągnęły wartości w 7. dobie po podaniu 10,0 +/- 2 pg/ml i w 28. dobie po podaniu 5,8 +/- 1,5 pg/ml. Na rysunku 14b) przedstawiono dane eksperymentalne dotyczące wyżej wymienionych stężeń NT-4 przeliczone na ilości neurotrofiny do całkowitej zawartości białka NT-4 znajdującego się w szklistce.
Zmierzono również stężenia NT-4 w siatkówkach uszkodzonego oka mysiego po podaniu doszklistkowym kompleksu 50 μg/ml PAMAM-20 μg/ml NT-4 w 7., 14. i 28. dobie od podania. Wyniki uzyskane przy pomocy techniki ELISA w szklistkach przedstawiono na rysunku nr 14a) i osiągnęły wartości w 7. dobie po podaniu 14,9 +/- 5 pg/ml i w 28. dobie po podaniu 7,9 +/- 3 pg/ml. Na rysunku 14b) przedstawiono dane eksperymentalne dotyczące wyżej wymienionych stężeń NT-4 przeliczone na ilości neurotrofiny do całkowitej zawartości białka NT-4 znajdującego się w szklistce.
PL 239 642 B1
Zastrzeżenia patentowe

Claims (5)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Kompozycja do doszklistkowego podawania białka leczniczego, znamienna tym, że zawiera białko lecznicze oraz poliamidoaminowy polikation dendrymeryczny połączony elektrostatycznie z tym białkiem leczniczym, przy czym białkiem leczniczym jest neurotrofina-4 (NT-4), a poliamidoaminowym polikationem dendrymerycznym jest dendrymer PAMAM, korzystnie PAMAM G 6.0.
  2. 2. Kompleks elektrostatyczny składający się z poliamidoaminowego polikationu dendrymerycznego PAMAM, korzystnie PAMAM G 6.0, oraz neurotrofiny-4 (NT-4).
  3. 3. Kompleks elektrostatyczny określony w zastrz. 2 do stosowania w medycynie, korzystnie do stosowania w profilaktyce lub leczeniu chorób oczu.
  4. 4. Kompleks elektrostatyczny do stosowania według zastrz. 3, znamienny tym, że chorobą oka jest choroba degeneracyjna siatkówki oka, zwłaszcza wybrana z grupy obejmującej: zwyrodnienie plamki związane z wiekiem, zanik girlandowaty, zwyrodnienie barwnikowe siatkówki oraz jaskrę.
  5. 5. Kompleks elektrostatyczny do stosowania według zastrz. 3, znamienny tym, że jest on stosowany w leku przeznaczonym do podawania doszklistkowego neurotrofiny-4, zwłaszcza w postaci leku o spowolnionym uwalnianiu neurotrofiny-4.
PL426662A 2018-08-16 2018-08-16 Kompozycja do doszklistkowego podawania białka leczniczego PL239642B1 (pl)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL426662A PL239642B1 (pl) 2018-08-16 2018-08-16 Kompozycja do doszklistkowego podawania białka leczniczego
EP19461505.0A EP3610885B1 (en) 2018-08-16 2019-01-22 Composition for the intravitreal administration of therapeutic protein

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL426662A PL239642B1 (pl) 2018-08-16 2018-08-16 Kompozycja do doszklistkowego podawania białka leczniczego

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL426662A1 PL426662A1 (pl) 2020-08-24
PL239642B1 true PL239642B1 (pl) 2021-12-20

Family

ID=65817953

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL426662A PL239642B1 (pl) 2018-08-16 2018-08-16 Kompozycja do doszklistkowego podawania białka leczniczego

Country Status (2)

Country Link
EP (1) EP3610885B1 (pl)
PL (1) PL239642B1 (pl)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL446343A1 (pl) * 2023-10-10 2025-04-14 Pomorski Uniwersytet Medyczny W Szczecinie Kompozycja farmaceutyczna do doszklistkowego podawania zawierająca co najmniej jedną substancję aktywną oraz nośnik, kompleks elektrostatyczny zawierający co najmniej jedną substancję aktywną oraz nośnik oraz jego zastosowanie

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4558120A (en) 1983-01-07 1985-12-10 The Dow Chemical Company Dense star polymer
US4631337A (en) 1983-01-07 1986-12-23 The Dow Chemical Company Hydrolytically-stable dense star polyamine
US4568737A (en) 1983-01-07 1986-02-04 The Dow Chemical Company Dense star polymers and dendrimers
US4737550A (en) 1983-01-07 1988-04-12 The Dow Chemical Company Bridged dense star polymers
US4507466A (en) 1983-01-07 1985-03-26 The Dow Chemical Corporation Dense star polymers having core, core branches, terminal groups
US4587329A (en) 1984-08-17 1986-05-06 The Dow Chemical Company Dense star polymers having two dimensional molecular diameter
US4871779A (en) 1985-12-23 1989-10-03 The Dow Chemical Company Ion exchange/chelation resins containing dense star polymers having ion exchange or chelate capabilities
US4694064A (en) 1986-02-28 1987-09-15 The Dow Chemical Company Rod-shaped dendrimer
US4713975A (en) 1986-05-30 1987-12-22 The Dow Chemical Company Dense star polymers for calibrating/characterizing sub-micron apertures
US4857599A (en) 1988-02-08 1989-08-15 The Dow Chemical Company Modified dense star polymers
JP5484339B2 (ja) * 2007-10-05 2014-05-07 ウェイン ステート ユニバーシティー 合成物の持続的な放出のためのデンドリマー
AU2009212309B2 (en) * 2008-02-07 2014-04-03 Ceregene, Inc. Rescue of photoreceptors by intravitreal administration of an expression vector encoding a therapeutic protein
US8302052B2 (en) 2009-06-23 2012-10-30 Cadence Design Systems, Inc. Methods, systems, and computer program product for implementing hotspot detection, repair, and optimization of an electronic circuit design
JP6302091B2 (ja) * 2014-04-30 2018-03-28 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー デンドリマー組成物および眼の疾患の処置におけるその使用
CN111615528A (zh) * 2017-11-10 2020-09-01 约翰霍普金斯大学 树枝状聚合物递送系统和其使用方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL446343A1 (pl) * 2023-10-10 2025-04-14 Pomorski Uniwersytet Medyczny W Szczecinie Kompozycja farmaceutyczna do doszklistkowego podawania zawierająca co najmniej jedną substancję aktywną oraz nośnik, kompleks elektrostatyczny zawierający co najmniej jedną substancję aktywną oraz nośnik oraz jego zastosowanie

Also Published As

Publication number Publication date
PL426662A1 (pl) 2020-08-24
EP3610885A1 (en) 2020-02-19
EP3610885B1 (en) 2022-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Checa-Casalengua et al. Retinal ganglion cells survival in a glaucoma model by GDNF/Vit E PLGA microspheres prepared according to a novel microencapsulation procedure
Lai et al. Chitosan-g-poly (N-isopropylacrylamide) copolymers as delivery carriers for intracameral pilocarpine administration
Huang et al. Ultrasound-mediated nanoparticle delivery across ex vivo bovine retina after intravitreal injection
JP2004529934A (ja) 抗微小管剤およびポリペプチドまたはポリサッカリドを含む組成物、ならびに炎症状態を処置するための医薬品の調製のためのそれらの組成物の使用
Lambert et al. Nanosponge-mediated drug delivery lowers intraocular pressure
CN110352075A (zh) 角结膜被覆片和角结膜被覆片的制作方法
Andres-Guerrero et al. Novel technologies for the delivery of ocular therapeutics in glaucoma
Fayyaz et al. Dextran-based oxygen nanobubbles for treating inner retinal hypoxia
Villanueva et al. Turning the screw even further to increase microparticle retention and ocular bioavailability of associated drugs: The bioadhesion goal
Zhao et al. Micro-interaction of montmorillonite-loaded nanoparticles with mucin promotes retention of betaxolol hydrochloride on the ocular surface and the tear film microenvironment
Ali et al. Novel in-situ emulgel of acetazolamide for ocular drug delivery
EP3610885B1 (en) Composition for the intravitreal administration of therapeutic protein
CN107249577A (zh) 用于治疗青光眼的组合物和方法
Grimaudo et al. Parameters affecting the transscleral delivery of two positively charged proteins of comparable size
Yordanova Andonova A new direction in ophthalmic development: Nanoparticle drug delivery systems
US11622951B2 (en) Alpha-aminoadipate for treatment of vision loss and restoring sight
CN112022808A (zh) 用于治疗眼部疾病的用于递送水飞蓟宾和其他活性成分的纳米结构化制剂
CA2819616A1 (en) Methods for treating diseases of the retina
Gómez-Garzón et al. Application of nanotechnology in ophthalmology: Where are we?
US10780070B2 (en) Alpha-aminoadipate for treatment of vision loss and restoring sight
Silvestri et al. In Vitro and in vivo safety of Hyaluronic Acid-decorated microparticles for Intravitreal Injection of Palmitoylethanolamide, Citicoline, or glial-cell-derived neurotrophic factor
Al-Kinani et al. Nanotechnology in ophthalmic drug delivery
Gaikwad et al. Nanogel Development and its Importance in Ophthalmic Drug Delivery System
Pati et al. Nanoparticles as therapeutic agent for ophthalmic biomedical applications
Eltanameli Quercetin Loaded Chitosan Nanoparticles for the Treatment of Dry Eye Disease