CN108883207A - 树状体-生物粘合剂聚合物水凝胶纳米胶水和其用途 - Google Patents

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Abstract

用一种或多种生物粘合剂聚合物、一种或多种树状体以及任选地一种或多种治疗剂、预防剂或诊断剂来形成一种纳米胶水。生物粘合剂聚合物和树状体用官能团修饰以允许在例如紫外线照射的一个或多个刺激下进行交联，并在组织部位处原位形成水凝胶。在角膜伤口修复中，与未处理角膜或用缝合线处理的角膜相比，纳米胶水使得愈合速度提高，同时结疤更少并且炎症更少。治疗剂可共价结合到前体组分并且被递送到特定眼隔室，从而提供比递送游离形式的药物更有效的眼部病症的治疗制剂。还提供了制备并使用水凝胶和水凝胶前体组合物的方法。

Description

树状体-生物粘合剂聚合物水凝胶纳米胶水和其用途
相关申请的引用
本申请要求2016年2月8日提交的美国临时专利申请号62/292,741的权益，所述申请特此出于所有目的通过引用并入，如同将其在本文中完全阐述。
以电子版形式提交的材料的引用并入
本申请含有已经由EFS-Web以ASCII格式提交并特此通过引用整体并入的序列表。2017年2月8日创建的所述ASCII拷贝名为P13910-02_ST25.txt且大小为2,544字节。
技术领域
本发明涉及水凝胶粘合剂的领域，并且更具体地说，涉及伤口修复和病症治疗。
背景技术
创伤性或手术损伤之后的伤口修复具有显著的临床重要性。这些伤口经常用缝合线进行密封。然而，缝合线具有多个缺点，包括侵入性治疗，愈合不均匀，往往变得松散和/或断裂，并且经常需要通过熟练的从业者去除。此外，缝合可能导致炎症，增加感染的风险，并且在角膜伤口的情况下可能造成新血管形成并诱发散光。相比之下，无缝合线手术与使用缝合线的手术相比具有更低的感染率(Stonecipher K等人，《眼科学文献(ArchOphthalmol.)》，109(11):1562-1563(1991))。先前的研究已探究过水凝胶粘合剂，但是它们由于缺乏生物相容性、缺乏拉伸强度和应用部位受限而不受欢迎(GrinstaffMW等人，《生物材料(Biomaterials)》，28(35):5205-5214(2007)；GrinstaffMW等人，《欧洲化学杂志(Chemistry-AEuropean Journal)》，8(13):2838-2846(2002))。
预防并抵抗炎症、感染和其它并发症将有利于组织愈合。如果可使用系统递送一个或多个活性剂，则这将是更好的。在眼部病症的治疗中，局部用抗生素和类固醇分别降低感染和角膜结疤的风险。然而，所述药物经常被眼泪分泌物清除，并且因此需要重复给药，而这可能导致患者不依从性、角膜变色、眼内压升高、以及角膜刺激和毒性(Gibson JM等人，《美国眼科综述(US Ophthalmic Review)》，8(1):2-7(2015)；Mahajan HS等人，《碳水化合物聚合物(Carbohydrate Polymers)》，122:243-247(2015))。
因此，本发明的目的是提供一种有效地密封组织(例如，良好的覆盖、生物相容性、机械强度和可降解性)并促进伤口修复的纳米胶水或其前体制剂。
本发明的另一个目的是提供一种使用水凝胶或其前体来密封组织的方法，所述水凝胶或其前体在从业者施加外部刺激时或在引入到组织时可被触发以胶凝并密封组织。
本发明的又一个目的是提供用于密封眼部组织，并且更优选地用于以持续方式同时局部地递送活性剂的组合物和方法。
本发明的又一个目的是提供一种使用可在结膜下施用的可注射凝胶制剂通过以持续方式递送药物诸如皮质类固醇(消炎药)和抗菌药物来治疗角膜炎症和感染的方法。
发明内容
一种用于密封组织并任选地递送治疗剂、预防剂和/或诊断剂的水凝胶或水凝胶前体已被开发，并且在本文中被称为“纳米胶水”。所述纳米胶水用一个或多个树状体分子(或其衍生物)和一个或多个生物粘合剂聚合物(或其衍生物)形成，其中所述树状体分子和所述生物粘合剂聚合物在施加一个或多个外部刺激时或在组织内的一个或多个生理条件下进行交联。在优选的实施方案中，所述树状体和所述生物粘合剂聚合物进行化学修饰以包含光可交联基团(例如，疏基和乙烯基；疏基和马来酰亚胺基团；疏基和烯烃基团；疏基和炔烃基团；氨基和醛基；氨基和羧酸酯基团；甲基丙烯酸酯基团；以及丙烯酸酯基团)。具有官能团的这些树状体和生物粘合剂聚合物在暴露于外部刺激(诸如紫外线照射、钴蓝光、氩气激光或可见光)之后在组织部位处原位形成纳米胶水。任选地，治疗剂、预防剂或诊断剂结合到树状体分子或与树状体分子复合，并且以持续且受控方式在施用部位处释放。
在某些实施方案中，一个或多个树状体分子是2-10代聚酰胺-胺(PAMAM)树状体，任选地以一个或多个官能团封端，所述一个或多个官能团诸如羟基、氨基、羧基、烷氧基甲硅烷基、疏基、吡啶基、乙烯基、甲基丙烯酰基、烯烃、烷基和/或环状不饱和烃。
在某些实施方案中，所述一个或多个生物粘合剂聚合物是透明质酸、脱乙酰壳多糖、海藻酸盐、琼脂糖、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、甲基纤维素、纤维素、聚环氧烷、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇或其衍生物。
已开发密封并提供治疗剂、预防剂和/或诊断剂的受控、持续地局部释放的树状体纳米胶水。纳米胶水具有使组织固定的所需的机械特性。它还可用于递送加速伤口愈合并递送抗菌且消炎的药物的药剂以预防感染和疤痕组织形成。所述制剂是外科医生友好的。它在施加期间是粘性液体并且在激光照射之后快速聚合，从而为外科医生提供工作的较长时间窗口。纳米胶水的强度可通过激光施加的持续或通过改变纳米胶水的各个组分的百分比来调节。
其它材料可并入到制剂中以增加柔性、强度或控制药物递送特性。实例是增加强度和柔性的透明质酸。治疗剂、预防剂和/或诊断剂可直接并入到树状体、与树状体键合或配制到颗粒中，以实现治疗剂诸如类固醇和抗菌药物(抗生素药物)的持续释放。这可用于减少滴眼剂使用，从而减少副作用。
所述制剂具有多模式应用并且可针对不同部位或目的进行改进以施用，例如作为较松的凝胶进行结膜下施用，以增加药物可用性并帮助针对各种角膜和前段疾病诸如角膜炎症、角膜新血管形成、角膜移植物排斥以及可能的虹膜炎和前葡萄膜炎的持续药物释放。各个组分的百分比以适当的稀释进行改变来形成透明的柔性药库凝胶，所述透明的柔性药库凝胶可进行玻璃体内注射以用于针对各种后段疾病诸如糖尿病性视网膜病、仅次于年龄相关性黄斑变性(AMD)的脉络膜新血管形成(CNV)和其它视网膜病症的持续药物释放。使用透明质酸作为改进制剂中的主要组分与玻璃体状凝胶良好整合，从而使树状体与药物从凝胶释放并且将药物递送到靶向的视网膜细胞以用于增强长期功效，从而使玻璃体内注射的频率显著降低。
所述制剂对于治疗需要频繁滴眼剂而经常导致眼部表面刺激和毒性的病状具有优势，并且在内眼压(IOP)和患者不适方面可具有更好的安全性特征。与滴眼剂相比，结膜下凝胶减少了副作用。基于光可交联的树状体-透明质酸的纳米胶水可用于密封角膜切口和同时释放抗生素/类固醇，以预防感染和炎症并加速角膜伤口愈合。除能够原位施加和通过使用树状体以定制方式进行光固化来提供高交联密度的益处之外；凝胶中的透明质酸内含物促进伤口愈合并整合到角膜基质中；同时以持续方式同时释放抗生素/类固醇以解决感染/炎症的问题。所述制剂还是透明的，这在眼部应用中明显是有益的。
在优选的实施方案中，纳米胶水被施用来密封角膜组织和/或被施用来治疗各种角膜和前段病症，诸如角膜炎症、角膜新血管形成以及角膜移植物手术、虹膜炎和葡萄膜炎的并发症。与用缝合线进行处理或不处理的角膜切口愈合相比，纳米胶水改善角膜切口的愈合。它还耐受受伤的眼隔室的高眼内压，避免泄漏，与角膜牢固地粘合，并且与缝合线相比引起更少的角膜水肿或纤维变性。与用缝合线进行处理相比，角膜愈合更快并且具有更少的结疤、炎症和新血管形成。
在某些实施方案中，治疗剂是消炎、抗感染或抗血管生成的小分子或生物大分子。
纳米胶水的益处是针对炎症的靶向生物分布，因为树状体可在伤口部位处与巨噬细胞共定位，从而提供靶向递送以治疗巨噬细胞介导的疾病或病症。
纳米胶水还可用于密封其它类型的损伤，包括密封硬脑膜、肺膜、腹膜、胃肠道、内皮和烧伤。纳米胶水具有其它应用。例如，纳米胶水可用于针对子宫内和生殖道感染的阿莫西林的持续释放。
附图说明
图1A至图1G是作为透明、柔性且发粘的胶水的树状体-透明质酸水凝胶的不同组分和形成的示意图。图1A是与一个或多个甲基丙烯酸酯的光可交联基团结合，形成D-MA结合物的树状体的示意图。图1B是与一个或多个甲基丙烯酸酯结合，形成HA-MA结合物的透明质酸嵌段的示意图。图1C是进一步与消炎药(类固醇)地塞米松结合，形成MA-D-Dex结合物的D-MA的示意图。图1D是进一步与抗菌药物莫西沙星结合，形成MA-D-Mox结合物的D-MA的示意图。图1E是药物结合的光活化树状体-透明质酸水凝胶的形成的示意图。图1F示出了纳米胶水的不同比率的树状体和透明质酸组分(HA:D)(10:90)、(30:70)、(50:50)、(70:30)和(90:10)的溶胀和降解速率。图1G是纳米胶水的制剂2的示意图。
图2描绘了纳米胶水在新鲜兔眼中的爆裂压力和机械特性的离体评估：在中央角膜中产生3mm直线切口，从而引起张口的伤口，并且通过施加纳米胶水溶液并使用激光进行光固化30秒来密封切口。纳米胶水的光聚合通过透明凝胶形成来指示，并且密封剂耐受高眼内压，从而与缝合线相比避免流体泄漏。插图表：新鲜摘除的兔眼球的离体眼内压(IOP)测量：使用配备有digimano测压计的定制盐水注入系统测量IOP测量值。用纳米胶水密封的切口耐受高IOP，与缝合线相比避免泄漏，这表明与缝合线相比，所述纳米胶水与角膜牢固地粘合。
图3示出了大鼠撕裂角膜的光学传输断层摄影(OCT)成像：使用OCT来评估纳米胶水在密封角膜撕裂和伤口愈合方面的功效。左图是具有良好角膜组织结构的正常角膜的OCT图像。中间图是具有用10-0缝合线缝合的撕裂的角膜，在第7天引起纤维变性和角膜开裂(黄色箭头)，指示伤口愈合不佳。右图是用纳米胶水密封的角膜撕裂(白色箭头)，具有最少的纤维变性和更好的伤口愈合。
图4描绘了纳米胶水于大鼠角膜撕裂模型中在密封角膜切口和帮助角膜切口的伤口愈合方面的功效的临床观察：使用角膜刀在大鼠角膜上产生3mm直线角膜撕裂并且使用纳米胶水制剂密封，从而使得形成透明屏障(白色箭头)。临床上评定动物的伤口愈合，直至使用纳米胶水之后的第14天为止，所有使用纳米胶水的大鼠的角膜愈合得到加强，而在缝合的角膜中引起角膜新血管形成和炎症，如图的左角处的白色箭头所指示。
图5A至图5G使用流变学和SEM表征可注射凝胶。5A)是可注射凝胶形成的动态时间扫描光流变学。当储能模量(G')超过损耗模量(G")时，接近凝胶点(箭头)。虚线(---)示出了UV光打开的时间。5B)是展示其粘弹性行为(G'>>G")的可注射凝胶的频率扫描测量。5C)是示出相似动态粘度的具有和不具有D-Dex的可注射凝胶的粘度相对于频率曲线图。5D)是示出剪切致稀特性的具有和不具有D-Dex的可注射凝胶的粘度相对于剪切速率曲线图。5F)是示出表面形态的具有和不具有D-Dex的脱水可注射凝胶的SEM图像。5G)是展示具有多孔结构的内部形态的FITC染色凝胶部分的共焦图像。
图6是在2959(I-2959)的存在下用硫醇化透明质酸(HA-SH)、树状体-戊烯酸结合物(D-Ene)和树状体-地塞米松结合物(D-Dex)形成的光活化的树状体-透明质酸水凝胶的示意图。在此D-Dex物理地包埋在凝胶制剂中。
图7A至图7E描绘了制备的结合物的表征。7A)是在239nm下监测的D-Dex(32.8分钟)、Dex(22.4分钟)和Dex-连接基团(27.6分钟)的HPLC色谱图。7B)是在模拟泪液中的D-Dex结合物的药物释放曲线。7C)是可注射凝胶在pH 7.4和5下的溶胀和降解曲线。7D)是可注射凝胶制剂在pH 7.4和5下的D-Dex和游离Dex释放曲线。7E)插图-描绘凝胶的溶胀行为的重量变化测量。
图8A和图8B在结膜下注射的树状体的生物分布。在结膜下注射凝胶制剂中的荧光标记的树状体(D-Cy5)并且在注射之后7天评定生物分布。角膜基质(蓝色，凝集素)、巨噬细胞(绿色，Iba-1)、树状体(红色，Cy5)。8A)是具有规则组织结构的正常角膜的中心横截面；存在非常少的角膜Iba-1染色细胞(巨噬细胞)；树状体未在巨噬细胞中共定位。8B)是被Iba-1阳性细胞(巨噬细胞)浸润的碱烧伤的中央角膜。Cy5信号(树状体)在Iba-1染色细胞中共定位，从而展示树状体针对炎症的固有靶向能力。比例尺100μm。
图9是用于评定中央角膜厚度(CCT)的角膜的前段光学相干断层摄影(OCT)成像。上部图：D-Dex凝胶处理的眼睛的中央角膜的OCT图像展示与其基线相比在POD 7和14的接近正常的角膜结构。这些图像表明炎症消退。中间图：用游离Dex凝胶处理的中央角膜的OCT图像展示薄的不规则上皮层和基质水肿，这表明炎症正在发生。底部图：用安慰剂凝胶处理的中央角膜的OCT图像具有与用游离Dex处理的眼睛相似的特征。
图10A至图10D是示出三组大鼠的眼部参数的图，每组大鼠在角膜被碱烧伤之后，(i)用具有树状体-地塞米松结合物和少量的游离地塞米松(D-Dex)的树状体-透明质酸水凝胶进行结膜下处理，(ii)用具有游离地塞米松(游离Dex)的树状体-透明质酸水凝胶进行结膜下处理，以及(iii)不进行处理(未处理的阳性对照)。图10A是示出随时间推移(手术后天数，POD)的中央角膜厚度(CCT，μm)的线图。图10B是示出随时间推移(POD)的眼内压(IOP，mm/Hg)的线图。图10C是示出随时间推移(POD)的估计的新血管形成的面积(NV)(mm2)的线图。图10D是示出随时间推移(POD)的角膜混浊分数(中值；范围)的柱形图。
图11示出角膜横截面的共焦显微镜图像。左图：在手术后第7天和第14天观察到少量的Iba-1染色的细胞浸润物(巨噬细胞)。中间图和右图：与D-Dex凝胶组不同，游离Dex凝胶和安慰剂凝胶组两者在手术后第7天和第14天均具有持续性的IBA-1染色的细胞浸润物(巨噬细胞)。比例尺100μm。
图12描绘了示出在结膜下处理之后通过在POD 7和14使用RT-PCR测量角膜组织中的细胞因子mRNA表达水平来评定角膜炎症的柱形图。(TNF-α)-肿瘤坏死因子-α，(IL-1β)-白介素-1β，(IL-6)-白介素-6，(MCP-1)-单核细胞趋化蛋白-1，(VEGF)-血管内皮生长因子。结果归一化到健康对照并且表示为平均值±SEM，n＝10。
具体实施方式
I.定义
术语“治疗剂”是指可被施用来预防或治疗疾病或病症的一个或多个症状的药剂。这些治疗剂可以是核酸、核酸类似物、小分子、拟肽、蛋白质、肽、碳水化合物或糖、脂或表面活性剂或其组合。
如本文所用，术语“诊断剂”通常是指可被施用来显示出、精确定位并限定病变位置的药剂。
如本文所用，术语“预防剂”通常是指可被施用来预防疾病或预防某些状况(像怀孕)的药剂。
短语“药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织相接触而没有过量毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症、与合理的利益/风险比相称的组合物、聚合物以及其它材料和/或剂型。短语“药学上可接受的载体”是指将任何主题组合物从一个器官或身体的一部分携带或转移到另一个器官或身体的另一部分所涉及的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填料、稀释剂、溶剂或包封材料。每种载体在与主题组合物的其它成分相容的意义上必须是“可接受的”并且对患者是无害的。
短语“治疗有效量”是指在可应用于任何医学治疗的合理的利益/风险比下产生一定的所需效果的治疗剂的量。有效量可根据因素诸如所治疗的疾病或病状、所施用的特定靶向构建体、受试者的大小或疾病或病状的严重程度而变化。本领域的普通技术人员可根据经验确定特定化合物的有效量而无需进行过多的实验。预防剂是指可预防病症、疾病或病状的药剂。实例包括预防感染的疫苗和预防怀孕的避孕药。
术语“治疗”是指预防或减轻疾病、病症或病状的一个或多个症状。治疗疾病或病状包括改善特定疾病或病状的至少一种症状，即使根本的病理生理未受影响，诸如通过施用止痛剂来治疗受试者的疼痛，虽然这种药剂不治疗疼痛的病因。
如本文所用，术语“生物相容的”通常是指连同其任何代谢物或其降解产物通常对于患者是无毒的，并且不会对受者造成任何显著不利影响的材料。通常来说，生物相容性材料是当施用到患者时不引发显著的炎性或免疫应答的材料。
如本文所用，术语“生物可降解的”通常是指将在生理条件下降解或腐蚀而成为能够被受试者代谢、消除或排泄的更小单元的材料。降解时间取决于组成和形态。降解时间可以是数月至数年。
如本文所用，术语“密封”意指基本上覆盖底物(例如，组织)的粗糙表面、空腔或空隙或者覆盖组织表面的顶部，并且任选地在接触表面处形成共价键或非共价键。“密封”还可是指防止某些气体、液体、溶质、大分子或细菌的迁移或转移的屏障效应。
如本文所用，术语“树状体”包括但不限于具有内核、规则地附接到此起始核心的重复单元的内层(或“代”)以及附接到最外代的末端基团的外表面的分子结构。
如本文所用，术语“生物粘合剂聚合物”是指可粘合到生物底物的天然或合成聚合物。聚合物与组织的粘合可通过(i)物理或机械连接、(ii)初级或共价化学键和/或(iii)次级化学键(即，离子)实现。
如本文所用，术语“交联”意指包含亲核基团的前体分子与包含亲电子基团的前体分子之间的共价连接的形成，这使得材料的分子量增加。“交联”还可是指非共价连接(诸如离子键)或共价键和非共价键的组合的形成。
如本文所用，术语“光交联”意指通过施加辐射能来使乙烯基或其它不饱和键断裂并形成交联。
如本文所用，术语“外部刺激”引发并非固有的特定官能反应，诸如物理、化学、生物、机械和照射刺激。
如本文所用，“聚合物网络”是指基本上所有的单体、低聚物或聚合物通过其可用的官能团经由分子间共价连接键合而形成大分子的过程的产物。
如本文所用，“生理的”是指存在于活脊椎动物中的条件。具体地，生理条件是指人体中的条件，诸如温度、pH、含水介质等。如本文所用，“生理温度”是指在35℃至42℃之间的范围内的温度，优选地大约37℃。
如本文所用，“交联密度”是指相应分子的两个交联(Mc)之间的平均分子量。
如本文所用，“溶胀”是指由于生物材料吸收水而使得体积和质量增加。“水吸收”和“溶胀”同义地使用。
如本文所用，“胶凝点”或“胶凝”是指粘性模量和复数模量彼此相交并且粘度增加的点。因此，胶凝点是液体开始呈现凝胶的半固体特征的阶段。
如本文所用，“原位形成”通常是指在注射之前和注射时基本上不交联，但是在身体的注射部位处于生理条件下或通过外部刺激触发时彼此形成共价连接、非共价连接或组合的前体分子的混合物的能力。
如本文所用，“平衡态”是指当在水中于恒定条件下储存时水凝胶不经历质量增加或损失的状态。
如本文所用，“官能化”意指以引起官能团或官能部分的附接的方式进行修饰。例如，分子可通过引入使得所述分子成为强亲核体或强亲电体的分子来官能化。例如，分子(诸如透明质酸)可进行官能化来成为硫醇、胺、丙烯酸酯或醌。
如本文所用，术语“活性剂”或“生物活性剂”在本文中可互换使用来指代诱导所需的药理和/或生理效应的化学或生物化合物，其可以是预防性的、治疗性的或诊断性的。所述术语还涵盖活性剂的药学上可接受的药理活性衍生物，包括但不限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物和类似物。
II.纳米胶水
纳米胶水粘合到潮湿组织，允许受控放置，并且实现快速固化来密封伤口。纳米胶水可用于递送治疗剂、预防剂和/或诊断性剂并且因此对于治疗根本性病症并加速伤口愈合是有用的。
A.水凝胶密封剂或其前体
包含两种主要组分：生物粘合剂聚合物，其提供强度和柔性并且是生物相容的以便与受伤组织整合并加速伤口愈合；和树状体，其与生物粘合剂聚合物锚固以便提供高密度的交联点并且因此提供所需的机械强度。
在一个优选的实施方案中，用乙烯基或其它不饱和基团和亲核基团独立地修饰前体组分以便实现水凝胶的原位光交联和形成。
i.树状体
在优选的实施方案中，树状体是无毒的并且具有多个表面基团，所述表面基团能够用多个光可交联基团修饰，以实现在低密度下的高交联密度和与活性剂的潜在结合。
适用的树状体包括但不限于聚酰胺-胺(PAMAM)、聚丙烯亚胺(POPAM)、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚酯、蝶烯、酯族聚(醚)和/或芳族聚醚树状体。树状体复合物的各树状体可以是相同的或具有与其它树状体相似或不同的化学性质(例如，第一树状体可包括PAMAM树状体，而第二树状体可以是POPAM树状体)。在一些实施方案中，第一树状体或第二树状体还可包括另一种药剂，诸如多臂PEG聚合物，其包含具有至少两个携带巯基或巯基吡啶末端基团的支链的聚乙二醇。可使用携带其它末端基团(诸如琥珀酰亚胺基或马来酰亚胺末端)的其它PEG聚合物。可使用分子量为10kDa至80kDa的PEG聚合物。可形成具有一个或多个树状体的复合物。
树状体的实例包括但不限于聚酰胺-胺(PAMAM)、聚酯、聚赖氨酸以及聚丙烯亚胺(PPI)。PAMAM树状体可包含不同的核，具有酰胺-胺结构嵌段，并且可具有任何代的羧基、胺和羟基末端，包括但不限于1代PAMAM树状体、2代PAMAM树状体、3代PAMAM树状体、4代PAMAM树状体、5代PAMAM树状体、6代PAMAM树状体、7代PAMAM树状体、8代PAMAM树状体、9代PAMAM树状体或10代PAMAM树状体。在优选的实施方案中，树状体在制剂中是可溶的并且是4、5或6代(“G”)树状体。
如本文所用，术语“PAMAM树状体”意指聚酰胺-胺树状体，其可包含不同的核，具有酰胺-胺结构嵌段。其制备方法对于本领域技术人员是已知的并且通常涉及在中心起始核心周围产生树枝状β-丙氨酸单元的同心壳体(代)的两步迭代反应序列。此PAMAM核-壳结构的直径随着所添加的壳体(代)而线性增加，并且表面基团根据树枝状分支数学在每一代处呈指数扩增。它们在G0至G10代内是可用的，具有5种不同的核心类型和10种官能表面基团。树状体分支聚合物可由聚酰酰胺-胺(PAMAM)、聚甘油、聚酯、聚醚、聚赖氨酸或聚乙二醇(PEG)、多肽树状体组成。树状体可具有附接到其官能表面基团的羟基基团。
在一些实施方案中，树状体呈纳米颗粒形式并且详细描述于国际专利公开号WO2009/046446、PCT/US2015/028386、PCT/US2015/045112、PCT/US2015/045104和美国专利第8,889,101号中。
ii.生物粘合剂聚合物
生物粘合剂聚合物包括粘合到生物组织的天然或合成聚合物。如本文所用，生物粘合剂聚合物通过共价键合、非共价相互作用(例如，氢键)和/或物理缠结与组织底物粘合。
在一些具体实施方案中，生物粘合剂聚合物是指在呼吸、鼻、子宫颈阴道、肠胃、直肠、视觉和听觉系统的组织中用于粘合的粘膜粘合剂聚合物。
1.透明质酸(HA)
HA是在发育、伤口愈合和炎症中发挥重要作用的细胞外基质的天然存在的免疫中性糖胺聚糖。其粘弹性特性和眼部表面长驻留时间使得其适用于若干组织修复实践，包括保护角膜内皮的眼科用途。HA还被鉴定为跨膜细胞表面粘合分子CD44的配体(Zhu SN等人，《英国眼科学杂志(Br J Ophthalmol.)》，81(1):80-4(1997))。
在一个优选的实施方案中，被树状体分子交联的HA形成用于组织修复的水凝胶密封剂。Ha的分子量范围大；并且在一些实施方案中，选择15-20kDa的HA。为了进行交联，首先在三个官能团中的一个或多个处化学修饰HA：葡糖醛酸羧酸、伯羟基和仲羟基基团以及N-乙酰基基团(脱酰胺之后)。最主要的是，羧酸酯已通过碳二亚胺介导的反应、酯化和酰胺化进行修饰；羟基已通过醚化、二乙烯基砜交联、酯化和双环氧化物交联进行修饰。关于HA的化学修饰的详细综述可见于Kuo JW，Prestwich GD，《生物来源的材料-材料分析和植入物使用，综合生物材料(Materials ofBiological Origin–Materials Analysis andImplantUses,Comprehensive Biomaterials)》，Elsevier(2010)中。
2.其它生物粘合剂聚合物
可并入的生物粘合剂聚合物包括合成和天然聚合物。优选的生物粘合剂聚合物具有暴露的羧基基团。这些包括天然聚合物，诸如海藻酸盐和纤维素以及合成修饰的纤维素，包括甲基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯以及硝化纤维，诸如羧甲基纤维素、羟甲基纤维素和甲基纤维素。可使用的合成聚合物包括聚酯诸如聚(羟基酯)，像聚丙交酯-乙交酯、聚丙交酯和聚乙交酯、聚原酸酯、聚酐、聚羟基链烷酸酯诸如聚3羟基丁酸酯、聚4羟基丁酸酯及其共聚物，以及非生物可降解聚合物诸如丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯、其共聚物和衍生物、聚乙烯醇、聚酰胺以及聚碳酸酯。制备的共混物和共聚物包括聚亚烷基、聚亚烷基二醇、聚环氧烷、聚对苯二甲酸亚烷基二醇酯、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯基卤化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯以及其共聚物。所有的聚合物可商购获得。
iii.允许刺激响应性胶凝的修饰
树状体和生物粘合剂聚合物用交联部分进行修饰以实现刺激响应性胶凝。在优选的实施方案中，树状体和生物粘合剂聚合物进行化学修饰以包含光可交联基团(例如，疏基和乙烯基；疏基和马来酰亚胺基团；氨基和醛基；氨基和羧酸酯基团；甲基丙烯酸酯基团；以及丙烯酸酯基团)。
在一些实施方案中，将一个或多个甲基丙烯酸酯或丙烯酸酯基团修饰到树状体和生物粘合剂聚合物两者上，或者修饰到一种物质上，同时另一种物质用疏基进行修饰。这些修饰允许进行光交联以固化前体材料并形成纳米胶水。
在另一个实施方案中，树状体和生物粘合剂聚合物进行修饰以允许可点击的疏基-烯或疏基-炔反应，其中一种物质进行官能化而以疏基封端，而另一种物质用烯烃或炔烃官能团进行修饰。例如，烯烃可以是降冰片烯。这些疏基-烯或疏基-炔反应有时通过光照射来促进。
在又其它的实施方案中，交联用硫醇-马来酰亚胺、胺-醛或胺-羧酸酯反应来实现，并且树状体和生物粘合剂聚合物用相关基团进行修饰。
在光交联反应中，可包括光引发剂。光引发剂是化合物，其在光吸收下经历光反应，从而产生能够引发不饱和组分的交联的反应性物质。示例性光引发剂包括化合物。
在一些实施方案中，光交联水凝胶是适于进行眼部治疗的透明柔性凝胶。
B.治疗剂、预防剂和诊断剂
纳米胶水可包含包封的、结合到水凝胶的组分或者包封于/结合到分散在水凝胶前体中的持续释放纳米颗粒/微颗粒制剂中的一个或多个治疗剂、预防剂或诊断剂。在一些实施方案中，所述药剂可经由与琥珀酸酐反应用琥珀酸酯基团进行修饰，所述药剂之后在其羟基基团处结合到树状体和/或生物粘合剂聚合物，以便允许酯键和药剂在组织中的水解介导的持续释放。
代表性治疗剂包括但不限于消炎药(包括免疫抑制剂和抗过敏剂)和抗感染剂。消炎药的实例包括类固醇，像曲安奈德、氟轻松、泼尼松龙、地塞米松、氯替泼诺、氟米龙。免疫调节药物诸如：环孢霉素、他克莫司和雷帕霉素。非类固醇消炎药包括酮咯酸、奈帕芬胺和双氯芬酸。抗感染剂包括抗病毒剂、抗菌剂、抗寄生虫剂和抗真菌剂。示例性抗生素包括莫西沙星、环丙沙星、红霉素、左氧氟沙星、头孢唑林、万古霉素、替加环素、庆大霉素、妥布霉素、头孢他啶、氧氟沙星、加替沙星；抗真菌剂：两性霉素、伏立康唑、游霉素。
活性剂可包括降低眼内压(IOP)的抗青光眼剂、抗血管生成剂、生长因子以及其组合。抗青光眼剂的实例包括前列腺素类似物诸如曲伏前列素和拉坦前列素，前列腺胺诸如比马前列素；β-肾上腺素能受体拮抗剂诸如噻吗洛尔、倍他洛尔、左倍他洛尔和卡替洛尔，β-2肾上腺素能受体激动剂诸如溴莫尼定和阿可乐定，碳酸酐酶抑制剂诸如布林佐胺、乙酰唑胺和多佐胺，缩瞳剂(即，拟副交感神经药)诸如毛果芸香碱和碘依可酯)、seretonergics、毒蕈碱和多巴胺能激动剂。
代表性抗血管生成剂包括但不限于血管内皮生长因子(VEGF)的抗体诸如贝伐单抗和rhuFAb V2(雷珠单抗，)和其它抗VEGF化合物，包括阿柏西普(哌加他尼钠、抗VEGF核酸配体或EYE001)(EyetechPharmaceuticals公司)；色素上皮衍化因子(PEDF)；COX-2抑制剂诸如塞来考昔和罗非考昔干扰素α；白介素-12(IL-12)；沙利度胺以及其衍生物诸如来那度胺角鲨胺；内皮抑素；血管抑素；核糖酶抑制剂诸如(Sirna Therapeutics公司)；多官能抗血管生成剂诸如(AE-941)(Aeterna实验室，魁北克城，加拿大)；受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂诸如舒尼替尼酪氨酸激酶抑制剂诸如索拉非尼和厄洛替尼表皮生长因子受体的抗体诸如帕尼单抗和西妥昔单抗以及本领域已知的其它抗血管生成剂。
在一些情况下，活性剂是对眼睛进行成像或以其它方式对眼睛进行评定的诊断剂。诊断剂的实例包括顺磁性分子、荧光化合物、磁性分子和放射性核素、x射线成像剂以及对照介质。
活性剂可以其中性形式或以药学上可接受的盐的形式存在。在一些情况下，可能希望的是，制备包含活性剂的盐的制剂，这是因为盐的一个或多个有利物理特性，诸如增强的稳定性或所希望的溶解性或溶解特征。
通常，药学上可接受的盐可通过在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中将游离酸或游离碱形式的活性剂与化学计算量的适当的碱或酸反应来制备；通常，优选非水介质，像醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。药学上可接受的盐包括活性剂的衍生自无机酸、有机酸的盐、碱金属盐和碱土金属盐以及通过将药物与合适的有机配体反应形成的盐(例如，季铵盐)。合适的盐的列表例如见于《雷明顿药物科学(Remington's PharmaceuticalSciences)》，第20版，Lippincott Williams&Wilkins，巴尔的摩，马里兰州，2000，第704页。有时以药学上可接受的盐的形式施用的眼科药物的实例包括噻吗洛尔马来酸盐、溴莫尼定酒石酸盐和双氯芬酸钠。
在某些实施方案中，纳米胶水包含一个或多个局部麻醉剂。代表性局部麻醉剂包括丁卡因、利多卡因、阿美索卡因、丙美卡因、利诺卡因以及布比卡因。在一些情况下，可将一个或多个另外的药剂(诸如透明质酸酶)添加到纳米胶水来加速并改进局部麻醉剂的分散。
C.制剂
纳米胶水可作为液体或在溶液中与一个或多个药学上可接受的赋形剂一起在一个或多个药学上可接受的载体中施用。代表性赋形剂包括溶剂、稀释剂、pH调节剂、防腐剂、抗氧化剂、悬浮剂、润湿剂、粘度调节剂、张度剂、稳定剂以及其组合。合适的药学上可接受的赋形剂优选地选自通常被认为安全(GRAS)并且可施用给个体而不导致不希望的生物副作用或不想要的相互作用的材料。
药物组合物可用于施用到待治疗的眼隔室(例如，玻璃体、视网膜下空间、脉络膜下空间、巩膜外层、结膜、结膜下、巩膜、前房和角膜以及其中的隔室，例如上皮下、基质内、内皮)、或角膜表面，并且可以适于每种施用途径的单位剂型配制。
用于其它用途的药物组合物包括被配制用于针对子宫内和生殖道感染的抗生素的持续释放的纳米胶水。纳米胶水还可被配制用于其它类型的损伤，包括密封硬脑膜、肺膜、腹膜、胃肠道、内皮和烧伤。
纳米胶水的益处是针对炎症的靶向生物分布，因为树状体可在伤口部位处与巨噬细胞共定位，从而提供靶向递送以治疗巨噬细胞介导的疾病或病症。
D.试剂盒
在一些实施方案中，组合物提供在试剂盒中。制剂使用药学上可接受的“载体”制备，所述药学上可接受的“载体”由被认为是安全且有效的并且可施用给个体而不导致不希望的生物副作用或不想要的相互作用的材料构成。通常，纳米胶水呈单剂量单位的形式，或者呈试剂盒的形式，其中第一组件含有液体来使第二组件中的干燥组分再水化。这些可包括例如用于施用的组件诸如点滴器，或另一种点药器装置诸如双筒注射器。
III.制备组合物的方法
用于制备树状体的方法对于本领域技术人员是已知的并且通常涉及在中心起始核心周围产生树枝状β-丙氨酸单元的同心壳体(代)的两步迭代反应序列。此PAMAM核-壳结构的直径随着所添加的壳体(代)线性增加。同时，表面基团根据树枝状分支数学在每一代处呈指数扩增。它们在G0至G10代内是可用的，具有5种不同的核心类型和10种官能表面基团。树状体分支聚合物可由聚酰胺-胺(PAMAM)、聚酯、聚醚、聚赖氨酸或聚乙二醇(PEG)、多肽树状体组成。可替代地，具有各种末端基团的树状体可购自销售商诸如Dendritech公司。
对具有各种官能团的树状体和/或生物粘合剂聚合物进行修饰以允许刺激触发的胶凝是已知的。透明质酸的硫醇化在文献中进行了描述。Kafedjiiski K等人，《国际制药学杂志(Int JPharm)》，343(1-2):48-58(2007)报道了通过在水性溶剂中使用EDC-NHS偶联反应将L-半胱氨酸乙酯结合到羧基(-COOH)基团而合成硫醇化透明质酸。所得的产物经受氧化以形成二硫化物(-S-S-)桥，所述桥允许HA形成凝胶以用于药物递送。作为替代方案，可生成在透明质酸上的游离疏基以允许疏基-烯点击反应。在此方法中，因为在含水介质中的反应可能引起二硫化物形成，所以针对此修饰反应优选惰性条件，其提供对取代度的更好控制并且避免原位二硫化物形成。此修饰的详细程序在实施例部分进行解释。
活性剂还可进行修饰以允许共价附接和受控释放。可替代地，活性剂可与一种或两种前体组分混合，并且分散在形成的水凝胶中。
在光交联中，可调整照射强度、暴露时间、光引发剂的量和/或水凝胶前体组分的浓度以控制前体溶液的固化速度，并调制形成的水凝胶的机械特性。在优选的实施方案中，低强度的UV照射允许前体组分在一分钟内，优选地在30秒内胶凝，这不对视网膜细胞造成损害。
IV.使用组合物的方法
纳米胶水可用作组织伤口或手术切口的密封剂，用于小分子、微颗粒/纳米颗粒、DNA/siRNA等的可注射递送，以治疗疾病或病症，并且用作滴注制剂，用于药剂向粘膜表面的持续且增强的可透过递送。在一个实施方案中，将水凝胶前体溶液施用到组织部位，并且刺激触发的胶凝原位发生。可替代地，将形成的可注射水凝胶注射到组织部位中以形成药库。施加纳米胶水的不同方法基于纳米胶水中的化学基团的动力学、组织部位和从业者的需要。
A.眼部应用
角膜伤口
眼睛角膜在折射和聚焦对于清晰视觉所需要的光线方面发挥着重要作用。角膜的独特特征在于有序排列的基质胶原纤维和缺少血管造成透明性。
角膜伤口由外科手术(例如，移植、白内障去除和眼内透镜植入的切口、激光辅助的原位角膜磨镶术)、感染(例如，溃烂)以及创伤性损伤(例如，撕裂、穿孔)导致。
在一个优选的实施方案中，由在UV照射时交联的透明质酸和树状体形成的水凝胶作为角膜伤口的密封剂施加，其中前体施加到角膜伤口并且以定制方式原位光固化。
B.其它伤口或手术切口
在其它实施方案中，纳米胶水用于密封羊膜内破裂或手术切口，密封开放式和微创胸部手术两者的空气泄露，密封血管重建部位处的血管系统，密封并减少胃肠外科手术的吻合泄漏，并且密封心血管手术的伤口。
与当前可用的粘合剂或密封剂(即，血纤维蛋白、氰基丙烯酸酯、明胶/凝血酶产品、PEG聚合物以及白蛋白/戊二醛产品)相比，纳米胶水在生物相容性、低毒性、透明性、对于多用途修饰和药物结合的支持以及胶凝动力学的可调节性方面具有优势。
C.待治疗的病症
除密封组织之外，纳米胶水可用于局部递送活性剂。在眼部疾病或病症的治疗中，局部抗生素和类固醇降低感染和角膜结疤的风险。然而，药物经常被眼泪分泌物清除，这经常导致重复给药、眼内压升高、角膜刺激和毒性以及潜在的角膜变色(Gibson JM等人，《美国眼科综述(US Ophthalmic Review)》，8.1:2-7(2015)；Mahajan SH等人，《碳水化合物聚合物(Carbohydrate Polymers)》，5月20日；122:243-7(2015))。
纳米胶水形成透明的柔性可注射凝胶，所述凝胶可在玻璃体内注射用于持续释放药物，以治疗各种后段疾病，例如糖尿病性视网膜病、脉络膜新血管形成(CNV)以及年龄相关性黄斑变性(AMD)。可治疗的眼睛病症的另外的实例包括阿米巴角膜炎、真菌角膜炎、细菌角膜炎、病毒角膜炎、盘尾丝虫角膜炎(onchorcercal keratitis)、细菌角膜结膜炎、病毒角膜结膜炎、角膜营养不良性疾病、富克斯氏内皮营养不良、斯耶格伦氏综合征、斯-约二氏综合征、自身免疫干眼疾病、环境性干眼疾病、角膜新血管形成疾病、角膜移植后排斥预防和治疗、自身免疫葡萄膜炎、感染性葡萄膜炎、前葡萄膜炎、后葡萄膜炎(包括弓形体病)、全葡萄膜炎、玻璃体或视网膜的炎性疾病、眼内炎预防和治疗、黄斑水肿、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、增殖性和非增殖性糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病、视网膜自身免疫疾病、原发性和转移性眼内黑素瘤、其它眼内转移性肿瘤、开角型青光眼、闭角型青光眼、色素性青光眼以及其组合。
树状体-生物粘合剂聚合物纳米胶水可在一段时间内提供治疗剂的持续释放。例如，在施用之后，治疗剂可释放至少6小时、至少12小时、至少1天、至少2天、至少3天、至少一周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少2月、至少3月、至少6月、至少9月、至少1年或更久。
相较于施用其它药物递送系统，施用水凝胶或水凝胶前体后进行光照射介导的固化随时间推移导致更少的炎症或使IOP增加。在施用后约3天，直至施用后14天或更久，可观察到相对于使用缝合线造成的炎症或IOP增加，炎症或IOP减少。甚至在施用常规或先前可用的药物递送系统的情况下，炎症或IOP也随时间减少。然而，当使用本文公开的方法和组合物时，炎症或IOP的减少或避免是持久性且更显著。炎症或IOP的减少或避免在施用后可持续至少约3天、至少约14天、至少约20天或至少约30天。
通过参考以下非限制性实施例将进一步理解本发明。
实施例1.具有共价附接的树状体-药物结合物的光交联树状体-透明质酸水凝胶的制备。
材料和方法
用甲基丙烯酸酯修饰树状体(D-MA)(制剂1)
将PAMAM G2和G4羟基树状体的表面用甲基丙烯酸酯基团进行修饰，从而实现光交联(组分1)。通过采用并优化先前建立的实验室程序来合成光可交联树状体(G2、G3、G4和G6)。简而言之，使用PyBOP/DIEA偶联反应将甲基丙烯酸共价结合到树状体的表面基团，并且使用水将所得的产物纯化并透析。使用1H NMR和HPLC确认产物(D-MA)的形成(图1A)。
光可交联的树状体-药物结合物(组分2)的合成
制备具有光可交联基团的合成的树状体地塞米松结合物(MA-D-Dex)(G2-G6)，所述结合物可增强伤口愈合并预防角膜结疤和新血管形成。所述药物不限于曲安奈德、布地奈德、氟轻松、环孢霉素、雷帕霉素等(泼尼松龙、地塞米松、氯替泼诺、氟米龙、酮咯酸、奈帕芬胺、双氯芬酸、环孢霉素、他克莫司)(图1C)。
光可交联树状体抗生物组分(组分3)的合成
合成具有光可交联基团的树状体莫西沙星结合物(MA-D-Mox)，所述结合物可提供抗菌屏障并且避免经常引起角膜炎症、眼内炎和角膜混浊的任何感染机会。抗生素不限于抗菌-环丙沙星、红霉素、左氧氟沙星、头孢唑林、抗病毒-万古霉素、庆大霉素、妥布霉素、头孢他啶、氧氟沙星、加替沙星、两性霉素、伏立康唑、游霉素和抗真菌剂(图1D、图1E)。还合成了树状体-头孢唑林(D-Cef)和树状体-妥布霉素(D-Tob)
用甲基丙烯酸酯修饰透明质酸(HA-MA)(组分4)
使用2步程序合成透明质酸-甲基丙烯酸酯(HA-MA)。第一步是将可商购获得的透明质酸钠(Na-HA)转化为TBA盐(HA-TBA)，并且第二步涉及使用PyBOP/DIEA偶联反应用甲基丙烯酸共价修饰透明质酸上的羟基基团(图1B)。
以高度甲基丙烯酸酯化合成光可交联透明质酸，其能够与树状体更好地交联并且提供柔性而不损害纳米胶水的机械特性。所述聚合物不限于胶原、硫酸软骨素、普鲁兰、脱乙酰壳多糖、环糊精、聚乙二醇(直链和星形PEG)、聚-L-赖氨酸、PLGA、PGA、聚-己内酯等(图1C)。
选择适当的比率(D:HA)：使用不同比率的树状体和透明质酸组分(HA:D)(10:90)、(30:70)、(50:50)、(70:30)和(90:10)以优化胶水的溶胀、强度和稳定性。在模拟泪液(pH7.0)中执行稳定性和溶胀研究。发现如果增加HA含量，则溶胀特性增加且稳定性降低，因此组合物以更快的速率降解。具有(10:90)和(30:70)的聚合物比率的纳米胶水制剂未示出显著的溶胀并且在20天内是稳定的。根据稳定性研究，因为纳米胶水是柔性且稳定的，所以适当的组成是(30:70)(图1F)。
纳米胶水的光交联形成
预混合D-MA、HA-SH和D(-MA)-Dex或D(-MA)-Mox。施加氩气绿色激光(325nm)20至30秒。
结果
图1A至图1F示出了形成纳米胶水的程序。形成的水凝胶是透明、柔性且发粘的。
实施例2.在离体受伤兔眼球中与缝合线相比的纳米胶水的光学和机械特性。
材料和方法
在新鲜摘除的成熟兔眼球上产生不同类型的角膜切口。使用不同的伤口结构并且使用定制设计的测压计系统与盐水注入来测量爆裂压力。将具有预混合的制剂的纳米胶水制剂施加在具有不同伤口结构的角膜切口上，并且施加氩气绿色激光(325nm)(用于甲基丙烯酸酯系统，制剂1)或钴蓝光(用于疏基-烯点击化学，制剂2)20至30秒，从而产生与缝合线相比可耐受高眼内压的快速光交联的透明眼部绷带。简言之，在中央角膜中产生3mm直线切口，从而引起张口的伤口。产生通道切口。产生3mm环钻中央切口。使用测压计系统测量盐水注入的爆裂压力。预混合用于形成纳米胶水的组分(40％D-HA和60％HA-MA)并且施加在角膜切口上。施加氩气绿色激光(325nm)20至30秒。
结果
快速固化用于形成纳米胶水的组分，从而产生适于伤口的形状的透明胶水，避免流体泄漏。据信，尤其与缝合线相比，纳米胶水与角膜牢固粘合。图2示出了测试装置和切口的照片，并且包括插图表1，其示出与缝合线相比纳米胶水耐受高眼内压。
实施例3.在体内受伤大鼠角膜中与缝合线相比的纳米胶水的光学和机械特性。
材料和方法
体内评估，使用托吡卡胺和10％去氧肾上腺素，将大鼠麻醉并且使瞳孔扩张。使用2.75-mm角膜刀产生全层中央角膜切口。起初向后导向刀，并且在穿透之后将其以一定角度导向以避免损伤水晶体及其囊。然后将切口缝合(10-0聚丙烯缝合线或尼龙)或用以上提及的纳米胶水胶合。在缝合/胶合之后，用荧光素或钴蓝光确认角膜切口被封闭。
在手术之后，执行24小时、72小时、7天和2周定期复查。在第7天使用光学相干断层摄影(OCT)对大鼠角膜进行成像。临床评定动物的伤口愈合，直至第14天为止。
结果
在缝合/用纳米胶水胶合之后，使用标准技术用荧光素或钴蓝光确认角膜切口被封闭。在纳米胶水和缝合线处理组两者中，在24小时内形成前房。
与引起炎症、新血管形成和角膜不规则的缝合线相比，用纳米胶水密封的角膜显示快速愈合和乐观的结果。在切口周围具有较少的角膜增厚。缝合和胶合的角膜两者均展示一定程度的纤维变性，其可作为超反射率在OCT扫描中看到(图3)。
在第7天，在缝合角膜中更排他性地观察到炎症和新血管形成。在第7天，用单一10-0缝合线缝合的角膜撕裂具有纤维变性和角膜水肿，据信，这显示不佳的伤口愈合。用纳米胶水密封的角膜撕裂具有一定的纤维变性，但是具有较少的角膜水肿；它还具有良好的伤口对合。
在纳米胶水处理组中，凝胶密封伤口直至第10天，并且伤口完全愈合而没有感染或毒性和炎症的迹象。
在第14天，所有用纳米胶水处理的大鼠的伤口完全消退而仅具有微小的结疤，而缝合的角膜发生角膜新血管形成、炎症和角膜不规则(图4)。
另外，缝合的和胶合的眼睛显示具有形成的前房的正常前段结构，与正常眼睛相似。在胶水和缝合线两者的情况下，在24小时内均形成眼房。在POD 7，缝合的角膜中显示炎症和新血管形成。在胶水处理的切口的情况下。胶水似乎密封伤口直至第10天，并且伤口完全愈合而没有感染或毒性和炎症的迹象(图4)。
实施例4.用于结膜下注射来治疗角膜炎症和感染的具有包埋的树状体-药物结合物的光交联树状体-透明质酸水凝胶的制备。
材料和方法
材料
从Dendritech公司(米德兰，密歇根，美国)购买水凝胶-和胺-官能化乙二胺四代核PAMAM树状体(G4-OH；诊断级；64个端基)。从西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(圣路易斯，密苏里州，美国)购买地塞米松(Dex)、琥珀酸酐(SA)、N,N'-二异丙基乙胺(DIEA)、三氟乙酸(TFA)、无水二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)和4-戊烯酸(Kosher)。使用定制合成服务从Creative PEGWorks公司(教堂山，北卡罗来纳州，美国)购买透明质酸硫醇，分子量10k(10％取代度)。从Bachem Americas公司(托伦斯，加利福尼亚州，美国)购买(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基-鏻六氟磷酸盐(PyBOP)。从安玛西亚生物技术-通用电气医疗集团(Amersham Biosciences-GE Healthcare)(匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国)购买Cy5-单-NHS酯。从飞世尔科技公司(Fisher Scientific)获得ACS级DMF、二氯甲烷(DCM)、二乙醚、己烷、乙酸乙酯、HPLC级水、乙腈和甲醇并且按原样用于透析、纯化和柱层析。从仕必纯有限公司(Spectrum Laboratories)(多明戈斯农场，加利福尼亚州，美国)获得透析膜(截留分子量1000&2000Da)。
用琥珀酸酯修饰Dex
在氮气气氛和冰浴下将Dex(500mg，1.28mmol)溶解在50mL圆底烧瓶中的10mLDMF/DMA(8:2)中。向其中添加溶解在5mL的DMF/DMA(8:2)和0.25mL的TEA中的琥珀酸酐(192mg，1.91mmol)，并且将反应混合物在0℃下搅拌3小时，然后在室温下搅拌48小时。地塞米松具有三个羟基基团并且最具反应性的羟基基团在位置21处。为了避免连接基团结合到在位置11和17处的-OH基团，在反应中使用与地塞米松相比不多于1.2摩尔当量的琥珀酸酐。
方案1.地塞米松-21-琥珀酸酯的合成。
通过使用乙酸乙酯/甲醇(90:10)作为流动相在硅胶GF254板(沃特曼公司(Whatman)，皮斯卡塔，新泽西)上执行薄层色谱法(TLC)来监测反应的完成。减压蒸发反应溶剂，并且使用乙酸乙酯:甲醇(99.5:0.5)作为洗脱液，通过穿过硅胶用柱色谱法纯化粗产物以得到Dex-21-琥珀酸酯(535mg，>90％产率)。通过使用1H NMR光谱法表征获得的纯化产物，其中DMSO-d6作为溶剂并且四甲基硅烷(TMS)用作内部标准。
树状体-Dex结合物的合成
在氮气下，在0℃将Dex-21-琥珀酸酯(Dex-连接基团，255mg，0.541mmol)溶解在50mL圆底烧瓶中的无水DMF(5mL)中，向其中添加溶解在DMF(5mL)和DIEA(300μL)中的PyBOP(703.9mg，1.35mmol)，并且使反应混合物在冰浴中搅拌1小时。将溶解在无水DMF(10mL)中的PAMAM G4-OH(505mg，0.036mmol)逐滴添加到以上反应混合物，并且在氮气下搅拌48小时。将溶剂混合物于真空中在25℃下蒸发。将粗产物再溶解在DMF(20mL)中并且在DMF中经受透析(膜截留分子量＝2kDa)48小时，其中溶剂更换至少6次。在室温下减压蒸发获得的溶液，并且使用冷乙醚将所得的发粘的粘性溶液沉淀两次以去除痕量DMF。将所得的产物再溶解在甲醇中，并且减压再蒸发和经受过夜高真空处理，以产生灰白色的半固体树状体-曲安西龙结合物(D-Dex，630mg)。将所得的半固体产物溶解在冰冷的DI水中，并且通过每小时更换水以在4℃下用DI水透析(膜MWCO＝1kDa)5小时，以便去除痕量DMF和甲醇。将所得的水层冻干以得到蓬松的白色D-Dex粉末(600mg)。
方案2.树状体-连接基团-Dex的合成。
通过1H NMR表征D-Dex结合物的药物负载并且通过反相HPLC表征其纯度。
用–烯-或-去甲-基团修饰树状体
还开发了可使用光-点击疏基-烯化学形成柔性且可注射凝胶或角膜粘合剂的水凝胶制剂。在PAMAM树状体的表面羟基基团(-OH)与4-戊烯酸或降冰片烯酸的羧酸部分之间使用单步偶联反应合成D-ENE或D-Nor。使用质子NMR，估计大约28至29个4-戊烯酸分子结合到一个树状体分子。结合物易溶于水、PBS缓冲液和盐水中。
在氮气气氛下，在0℃将4-戊烯酸(ENE，60.0mg，0.58mmol)溶解在50mL RBF中的3mL的无水DMF中，向其中添加溶解在DMF(5mL)和DIEA(300μL)中的PyBOP(560mg，0.88mmol)，并且使反应混合物在冰浴中搅拌1小时。将溶解在10mL无水DMS中的G4-OH(550mg，0.04mmol)逐滴添加到以上反应混合物，并且在氮气下搅拌48小时。将溶剂混合物于真空中在25℃下蒸发。将粗产物再溶解在DMF(20mL)中，并且在DMF中经受透析(膜截留分子量＝1kDa)24小时，其中溶剂更换至少4次。在室温下减压蒸发获得的溶液，并且使用冷乙醚将所得的发粘的粘性溶液沉淀两次以去除痕量DMF。将所得的产物溶解在冰冷的DI水中，并且通过每小时更换水以在4℃下用DI水透析(膜MWCO＝1kDa)6小时，以便去除痕量DMF。将所得的水层冻干以得到蓬松的玻璃状白色D-ENE粉末(590mg)。
方案3.树状体-戊烯酸的合成。
通过1H NMR表征D-Dex结合物的药物负载并且通过反相HPLC表征其纯度。
用游离疏基修饰透明质酸
首先将HA的钠盐(NaHA)转化为四丁基铵盐(HA-TBA)，以便能够溶于DMSO/DMF(20:80)中以用于有效的硫醇化反应。为了制备HA-TBA，将NaHA以2％(w/w)溶解在超纯水(UPH-DI H2O)中，并且通过添加DOWEX 50W质子交换树脂(西格玛公司(Sigma)，密苏里州，美国)进行离子交换，同时剧烈搅拌5小时。使用WHATMAN滤纸过滤掉树脂并且用TBA-OH将滤液滴定至pH为7.4。将所得的溶液在-80℃下冻干以获得灰白色的松软固体，另外将固体溶解在DI-H2O中并经受水透析(膜MWCO＝2kDa)以去除过量TBA-OH。将所得的水层再次经受冻干并储存在-20℃下，直至使用。使用1H NMR分析确认离子交换。
在氮气气氛下，在50℃将HA-TBA(615mg，0.027mmol)溶解在100mL RBF中的10mL无水DMSO中，向其中添加溶解在20mL的无水DMF中的DCC(640mg，3.01mmol)和DMAP(137.5mg，1.12mmol)。将催化量的对苯二酚添加到反应混合物以避免二硫化物形成。将3-巯基丙酸(300mg，2.81mmol)溶解在10ml的无水DMF中并逐滴添加到RBF中，并且在氮气气氛下在室温下将反应搅拌48小时。将反应混合物在50mL离心管中离心以去除形成的DCU，并且在真空下将溶剂层以2KD MWCO透析管用DMF透析36小时，以便去除未反应的化合物和可溶的DCU。减压蒸发获得溶液以获得发粘的半固体TBA-HA-SH，将其溶解在NaCl溶液(在催化量的TECEP下，0.5g NaCl/100mL的H2O)中并搅拌20分钟，并且将溶液用冷丙酮沉淀三次，然后用冷乙醇沉淀五次，以去除TECEP和过量的盐。将所得的白色固体溶解在DI H2O中并立即冷冻在液氮中，并且在-80℃下冻干以获得白色HA-SH粉末(370mg)。
方案4.硫醇化透明质酸的合成。
用游离疏基替代性地修饰透明质酸
在高取代度下将硫醇化透明质酸合成为光点击水凝胶的硫醇组分。使用三步法合成HA-SH。在第一步中，使用离子交换法将可商购获得的透明质酸(HA)的钠盐转化为DMF/DMSO可溶解的四丁基铵(TBA)盐(HA-TBA)。在第二步中，使用Steglich酯化反应将3-(三苯甲基硫基)丙酸结合到透明质酸的羟基(-OH)基团。使用三苯甲基保护的疏基丙酸以避免硫酯和二硫键形成。在第三步中，使用在DMF/DCM(1:5)混合物中的5％TFA并在Et3SiH存在下选择性地去保护三苯甲基基团以获得TBA-HA-SH中间体。然后使用NaCl溶液完全交换TBA+基团，并且将反应混合物用冷丙酮和乙醇洗涤以去除过量的TBA、DTT和NaCl，从而产生携带游离-SH端基的透明质酸。
方案5.硫醇化透明质酸的替代合成。
制剂2的制备
使用双筒注射器将比率为(50:50)的HA-SH和D-Ene或D-Nor与0.005％光引发剂(Irgacure)混合来形成化学交联的纳米胶水制剂，并且可施加在角膜切口上。为了固化，照射钴蓝光或闪光光源，从而在30秒内引起纳米胶水光交联(图1G)。
结合物的HPLC表征
通过配备有1525二元泵、2998光电二极管矩阵(PDA)检测器、2475多波长荧光检测器以及与Empower软件对接的717自动采样器(保持在4℃下)的HPLC(沃特斯公司(WatersCorporation)，米尔福德，马塞诸塞州)分析树状体结合物的纯度。使用PDA检测器在205(G4-OH)和239nm(Dex结合树状体)下监测HPLC色谱图。新鲜制备水/乙腈(0.1％w/w TFA)、过滤、脱气并用作流动相。使用具有TSK凝胶保护柱的TSK凝胶ODS-80Ts(250×4.6mm，内径，5μm)用于研究(东曹生物科技有限公司(Tosoh Bioscience LLC)，日本)。使用梯度流动，初始条件为90:10(H2O/ACN)，逐渐将比率改变为70:30(H2O/ACN)，直至20分钟，然后逐渐将乙腈百分比增加至50％，使得比率在30分钟时为50:50(H2O/ACN)，然后再次将乙腈降低至30％，使得比率在40分钟时为70:30(H2O/ACN)。将梯度在50分钟时返回至初始条件90:10(H2O/ACN)，其中针对所有结合物，流速为1mL/分钟。
注射器中的光交联树状体-透明质酸水凝胶
通过分别使用比率为1:2的树状体组分(D-ENE)和透明质酸组分(HA-SH)经由疏基-烯光聚合制备可注射树状体-透明质酸凝胶。简言之，在PBS中制备单个组分的溶液并且在冰上储存，直至混合。通过将D-Dex和游离Dex溶解在PBS中制备D-Dex和游离Dex溶液，使得10μL溶液含有1.6mg的呈D-Dex或游离Dex形式的Dex。针对每次注射，将20μL的HA-SH溶液、10μL的D-ENE溶液、10μL的D-Dex或游离Dex溶液以及5μL的光引发剂(Irgacure 2959(汽巴公司(Ciba)，巴塞尔，瑞士)，5mg/mL于DMSO中)在0.5mL微量离心管中混合。将浑浊混合物溶液负载到0.5cc胰岛素注射器中并且在UV光下放置5分钟。在此制剂中，将D-Dex或游离Dex物理地包埋在可注射凝胶中。
结果
由于其低毒性特征和接近中性的表面电荷，使用四代羟基封端的PAMAM树状体(G4-OH)，从而实现组织中的非特异性保留和相互作用。在树状体与结合药物之间使用琥珀酸间隔物，因为酯键实现更好的药物释放(Kambhampati SP等人，《欧洲制药学与生物制药学杂志(Eur JPharm Biopharm)》，九月；95(Pt B):239-49(2015))。
针对以下反应，用1H NMR光谱确认修饰或结合之后的结构：
(i)Dex-连接基团的特征在于：对应于连接基团的–CH2质子的在1.34ppm、1.36ppm和1.87ppm处的峰，和对应于羧酸的在12.22ppm处的峰确认Dex-连接基团的形成；
(ii)树状体-Dex(D-Dex)的特征在于：表示Dex的甲基质子(-CH3)的在0.80ppm、0.88ppm和1.49ppm处的三个峰，对应于树状体的修饰的亚甲基质子(–CH2)的在4.02ppm处的新峰，以及对应于Dex的芳烃质子的在5.0ppm与7.4ppm之间的峰；基于来自NMR的质子积分，大约7至8个Dex分子结合到一个树状体分子。结合物易溶于水、PBS缓冲液和盐水；
(iii)树状体-烯(D-Ene)的特征在于：对应于4-戊烯酸的H2C＝和＝CHC烯质子的在4.97ppm、5.05ppm、5.80ppm周围的新的多重峰，和对应于树状体的修饰的亚甲基质子(–CH2)的在4.02ppm处的新的峰。基于质子积分，大约15个4-戊烯酸分子结合到一个树状体分子。结合物易溶于水、PBS缓冲液和盐水；以及
(iv)HA-TBA盐的特征在于：对应于TBA的甲基(–CH3)质子的在0.85ppm至0.87ppm之间的新的多重峰，和对应于TBA的亚甲基(–CH2)质子的从1.23ppm至1.59ppm的两个新峰。硫醇化HA的特征在于不存在TBA的特征峰。
反相HPLC确认Dex-连接基团和树状体-Dex(D-Dex)结合物的纯度。疏水性游离Dex在22.4分钟时洗脱，而Dex-连接基团在27.6分钟时洗脱(在37.1分钟时没有痕迹)。在相似的HPLC条件下，在32.8分钟时观察到D-Dex结合物的宽峰(在240nm下监测)，这与开始的树状体的峰不同(保留时间15分钟)。结合物在很大程度上是纯的，因为没有观察到与游离Dex或Dex-连接基团相关的‘特征’峰。D-Dex结合物的宽峰可归因于高负载(约8个分子/树状体)，从而产生一些非极性特征。
图6示出了形成包封树状体-dex结合物的树状体-透明质酸凝胶的图。D-Ene用于锚固直链硫醇化透明质酸(HA-SH)。在推动活塞之后，从针头释放胶状溶液，从而确认可注射的透明凝胶的形成。
实施例5.可注射水凝胶的流变特性和形态。
使用时间扫描测量评定凝胶的形成和交联动力学。在UV照射(直至约60秒)之前并且直至照射之后40秒，溶液具有低粘度(图5A)，从而表明是可易注射的溶液。在60秒时进行UV照射之后，储能模量(G')增加，损耗模量(G")稳定，交叉点(G'>G")在约160秒时发生(即，UV处理之后100秒)，表明在此时间段内负载聚合物溶液内经由疏基-烯点击进行的胶凝(图3A)。这表明胶凝在很短的约1分钟的UV暴露内发生，并且凝胶达到约1kPa的储能模量。胶凝时间未受在预聚物溶液中并入D-Dex的影响。在水合环境下，在37℃下实施胶凝之后的频率扫描(0.01-10Hz，在LVER内)测量，以便评定G'、G"和复数粘度(|η*|)(图5B和图5C)。对于所有的可注射凝胶(有或没有D-Dex)，G"总是低于G'(G'＞＞G")，并且与频率无关，从而表明是稳定的粘弹性交联网络(图5B)。并入D-Dex不显著地改变可注射凝胶的流变特性(没有D-Dex，G'-148.4±0.5Pa，G"–5.2±0.1Pa，有D-Dex，G'–216.5±0.9Pa，G"–8.2±0.08Pa)。复数粘度(|η*|)的量值随着频率增加而降低，从而指示可注射凝胶是剪切致稀的(图5C和图5D)。剪切致稀可归因于凝胶系统中的HA，如在Healon(可注射HA凝胶)中所观察到的。并入D-Dex的凝胶中粘度少量增加(约22.5％)，从而表明小的D-Dex诱导的充填效应。
使用SEM成像来评定具有和没有D-Dex的可注射凝胶的表面形态。HMDS脱水凝胶在两种情况下(具有和没有D-Dex)均示出具有条纹的密度均匀的结构(图5F)。有趣的是，呈干燥形式的D-Dex似乎作为沉淀结合到可注射凝胶中(图5F)。脱水的凝胶样品表现出与水合状态相比显著的体积降低(降低约45％)。去除水可能导致D-Dex并入凝胶中致密结构的形成和D-Dex沉淀。在共焦显微镜下对FITC标记的水凝胶的横截面进行成像，以便研究交联形态和孔密度。横截面展示相似的交联结构形成的孔，在天然水凝胶中和在D-Dex并入凝胶中，大小均在60nm至100μm的范围内(图5G)。
实施例6.Dex从树状体-Dex(D-Dex)结合物和树状体-透明质酸水凝胶的体外释放。
材料和方法
制备D-Dex结合物并且如在实施例4中进行表征。在树状体与结合药物之间使用琥珀酸间隔物，并且酯键能够使药物从D-Dex结合物释放。
Dex从D-Dex结合物的释放表征为模拟玻璃体液[具有0.03％透明质酸钠(Lifecore biomedical公司，明尼苏达州，美国)和0.1％TritonX(西格玛公司(Sigma)，密苏里州，美国)的Hanks平衡盐溶液]作为稳定剂和表面活性剂减少释放的Dex沉降。在配备有摇动器的37℃下的水浴中维持3mg/mL的浓度。在适当的时间点，从培养混合物中取出200μL的溶液，冷冻在液氮中并冻干。为了此冻干粉末，添加400μL的50:50(DCM:EtOAc)并进行超声处理10分钟，并且在4℃下在10,000rpm下离心5分钟。收集上清液，将溶剂通过氮气吹扫蒸发并用200μL的50:50H2O:ACN重构并且经受HPLC分析。使用校准图定量从D-Dex释放的Dex的百分比。
在生理相关流体诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS 1X，pH 7.4)和柠檬酸盐缓冲液(pH 5)中评定可注射凝胶的溶胀和降解。对于稳定性研究，使用2mL微量离心管(直径＝8.0mm，厚度4mm)的盖上的圆形缝隙制备具有已知量的D-Dex或游离Dex的凝胶丸粒。将预称重的丸粒(对于每个组，n＝3)放置在含有1mL缓冲液的12孔板中并且在37℃下培养。在离散时间点，使用抹刀小心提起丸粒并且使用纸巾吸出过量水分并称重。使用公式(Wc/Wi)×100计算溶胀比，其中Wc是当前的溶胀重量，Wi是初始凝胶重量。使用公式((Wis–Wcd)/Wis)×100计算降解率，其中Wis是初始溶胀重量，Wcd是固化降低重量。
通过在含有5mL的SAH溶液的8mL闪烁管中培养凝胶丸粒来分析D-Dex和游离Dex从可注射凝胶的释放。在特定时间点，抽出100μL的样品并且使用HPLC分析。使用校准图定量从D-Dex释放的游离Dex的百分比。
结果
结果在图7A至图7E中示出。图7A是在239nm下监测的D-Dex(32.8分钟)、Dex(22.4分钟)和Dex-连接基团(27.6分钟)的HPLC色谱图。
图7B是在模拟泪液中药物从D-Dex结合物释放的图。图7C是D-Dex和游离Dex从pH分别为7.4和5的可注射凝胶制剂释放的图。在较早时间点处的释放曲线显示爆发性释放。
图7D是pH分别为7.4和5的可注射凝胶的溶胀和降解的图。图7E和图7F是描绘凝胶的溶胀特性的重量变化的图。
实施例7.包埋在树状体-透明质酸交联凝胶中的树状体分子在大鼠角膜中的体内生物分布
材料和方法
用荧光标记对树状体分子进行标记
合成并表征荧光标记的G4-OH树状体，如在Lesniak WG等人，《分子药理学(MolPharm.)》，10(12):4560-4571(2013)中所述。简言之，用反应性胺表面端基修饰四代羟基封端的PAMAM树状体(D)，其进一步与N-羟基琥珀酰亚胺单酯Cy5染料反应以生成D-Cy5结合物。
角膜碱烧伤模型
涉及动物的所有程序符合动物在眼科和视觉研究中的使用的视觉与眼科学研究协会声明和Johns Hopkins大学的IACUC研究指导。从哈兰实验室公司(HarlanLaboratories)(弗雷德里克，马里兰州)获得总计57只Lewis大鼠(7至8周龄)。所有动物的重量在150g与200g之间，并且将它们在恒定温度(20℃±1℃)和湿度(50％±5％)下圈养。它们以标准大鼠饲料进食并且随意获得水。所用程序和测试以肌内注射0.9％氯胺酮(Bioniche制药公司，森林湖，伊利诺伊州，美国)/0.1％赛拉嗪(Phoenix制药公司，圣约瑟夫，密苏里州，美国)和0.5％局部丙美卡因(山德士公司(Sandoz)，霍尔兹克钦，德国)在全身麻醉下执行。通过在角膜上施加0.5N NaOH生成角膜碱烧伤。简言之，将直径为0.5cm的样品盘SS-033(WESCOR公司，洛根，犹他州，美国)切割成4分体。将分体在0.5N NaOH中浸泡10秒，然后在中央角膜上放置15秒。使用眼药瓶立即用30mL的BSS溶液冲洗烧伤面积和结膜囊。
施用到鼠大眼睛
将D-Cy5溶解在PBS中(250μg D-Cy5，在10uL中)并且整合到如实施例4中所述的40μl的可注射凝胶系统中，并且负载到0.5mL 30G胰岛素注射器中，接着进行UV光暴露3分钟，直至形成凝胶。将D-Cy5凝胶注射到结膜下，从而形成疱。注射D-Cy5七天后，使用致死量的戊巴比妥钠(Lundbeck公司，迪尔菲尔德，伊利诺伊州，美国)将大鼠麻醉，并且收集眼睛。
免疫组织化学分析
摘除眼睛并且在冰冷的PBS中洗涤5分钟。将眼球固定在5％蔗糖溶液中的4％PFA中5小时，然后经受蔗糖梯度处理。使用在异戊烷中的干冰将眼球分别以1:2比率冷冻于20％蔗糖/最佳切割温度(OCT)中。将冷冻片(Cryoblocks)储存在-80℃下，直至使用低温恒温器(美康公司(Microm)，沃尔多夫，德国)切割20-μm切片。将来自每个冷冻片的四个切片用于图像分析。将切片在兔抗离子钙结合衔接子1分子(Iba-1；Wako Chemicals公司，里士满，弗吉尼亚州，美国)中培养，所述分子是巨噬细胞标记物；然后施加用于基质和血管的山羊抗兔-Cy3二抗(生命科技公司(Life Technologies)，格兰德岛，纽约，美国)和同工凝集素GS-IB4 AF488(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)，马萨诸塞州)。使用共焦显微镜(模型710单元；卡尔蔡司公司(Carl Zeiss)，索恩伍德，纽约，美国)分析切片的角膜和虹膜部分。激发和发射波长以及激光设置对于所有组织是相同的。取切片的Z堆叠体并进行折叠以得到贯穿整个截面的深度的图像。
结果
使用Iba-1作为角膜巨噬细胞的标记物。在正常眼睛中，在中央角膜区域中存在少量Iba-1+(图8A)。在对中央角膜进行碱烧伤之后，注意到在角膜基质和上皮层中巨噬细胞浸润(Iba-1+)增加(图8B)。烧伤还引起角膜厚度显著增加，这是在临床上与碱烧伤角膜炎(角膜炎症)一致的发现。为了展示从结膜下可注射凝胶释放的树状体的靶向和一周保留，使用荧光标记的树状体(D-Cy5)。为了避免组织自体荧光，利用实验室中的先前建立的程序，使用共价附接到树状体的近IR成像剂(Cy5)(S.P.Kambhampati等人，树状体曲安奈德结合物到小神经胶质细胞和人类视网膜色素上皮细胞中的细胞内递送，《欧洲制药学与生物制药学杂志(European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics)》95(2015)239-249，W.G.Lesniak等人，荧光标记的PAMAM树状体在新生兔中的生物分布：对神经炎症的作用，《分子药理学(Molecular pharmaceutics)》10(12)(2013)4560-4571)。结膜下注射D-Cy5凝胶七天后，成像研究展示了病理学依赖性生物分布：发现从凝胶释放的D-Cy5在碱烧伤组中共定位并保留在中央角膜中的浸润巨噬细胞中(图8B)，而在正常眼睛中，未引发D-Cy5信号(图8A)，从而表明树状体生物分布限于发炎和病态组织/细胞。另外，碱烧伤导致虹膜中巨噬细胞的活化和浸润，并且还发现D-Cy5仅共定位在发炎组织中的虹膜血管附近的巨噬细胞中(数据未示出)。病理学依赖性生物分布可归因于以下因素的组合：诸如树状体特性(大小和表面电荷)，病态组织中屏障的破坏以及活化巨噬细胞的改变特性(Nance,E.等人，对神经炎症的树状体介导的靶向的纳米级作用，《生物材料(Biomaterials)》101(2016)96-107)。
实施例8.在大鼠角膜碱烧伤之后用递送树状体-地塞米松(D-Dex)的树状体-透明质酸凝胶进行体内结膜下处理。
材料和方法
如在实施例7中所述在大鼠上执行角膜碱烧伤。
施用凝胶处理
在碱烧伤之后，将动物随机化以进行以下三组之一中的处理：(i)包埋在可注射的树状体-透明质酸光交联凝胶中的树状体-地塞米松结合物，具有少量的游离地塞米松(D-Dex组，n＝10)，(ii)在可注射的树状体-透明质酸光交联凝胶中的游离地塞米松(游离dex组，n＝10)，以及(iii)无药物，仅可注射的树状体-透明质酸光交联凝胶，n＝10。D-Dex和游离Dex组两者均用存在于D-Dex和游离Dex制剂两者中的等量Dex基进行处理(1.6mg的Dex/眼睛)。鉴于D-Dex结合物在其施用之后的前几天中释放的地塞米松不足，决定用每剂量游离地塞米松总剂量的0.5％的大剂量对其进行加强(即：结合到树状体凝胶的1.6mg地塞米松和另外剂量的0.16mg的游离地塞米松)。游离地塞米松组接受总计1.6mg的游离地塞米松。树状体组中另外小剂量的游离药物(0.16mg)在注射之后超过前几小时之后不可能具有治疗性作用。所有形式的药物并入到可注射凝胶制剂(它是与实施例4的相同的凝胶制剂)中。将凝胶组分预混合并负载到注射器中，并且使用UV暴露进行交联以形成凝胶。在注射时，组分呈凝胶形式)并且使用30号0.5cc胰岛素注射器在结膜下注射。施用的总体积不超过40μL。
临床和分子水平评估
在基线处并且在以下暴露后时间点处对动物进行评定：24小时、72小时和7天。还对动物子集进行定期复查至14天。
使用前房光学相干断层摄影(OCT)(Bioptigen Envisu R-级OCT，Bioptigen公司，北卡罗来纳州，美国)进行中央角膜厚度(CCT)和角膜结构分析。
使用手动眼压计(Icare LAB眼压计，爱凯公司(Icare)，芬兰)测量眼内压(IOP)的变化。选择针对大鼠的设置R，并且出于准确度的原因对每只眼进行三次单独的IOP测量。
通过对透明度进行分级来对角膜混浊进行评分，如Larkin DF等人，《临床与实验免疫学(Clin Exp Immunol.)》，107:381-391(1997)先前所报道。通过估计新生血管的径向穿透和其角度范围，并且通过假定平均角膜直径为2.5mm，使得新血管形成(NV)的最大面积不大于2.52πmm2(＝19.63mm2)来评定估计的NV面积。
针对免疫组织化学分析，将角膜(n＝3，针对每个组)在冷PBS中洗涤并且如实施例7所述进行处理，以用于免疫组织化学分析。将染色切片在共焦显微镜下进行成像。手动计数中央角膜中的角膜巨噬细胞。
针对细胞因子表达分析，将角膜(n＝10，针对每个组)在液氮中急速冷冻，并且使用预冷却(在液氮中)的瓷研钵和研杵小心地均化到组织粉末中。遵循制造商的说明书，用TRIzol试剂(生命科技公司，格兰德岛，纽约)对总RNA进行纯化。遵循制造商的说明书，使用高容量cDNA反转录系统(生命科技公司)将总计3μg的RNA反转录为cDNA。通过StepOnePlus实时PCR系统(生命科技公司)用快速SYBR Green主混合物(生命科技公司)执行qRT-PCR。使用大鼠GAPDH对靶基因的表达水平进行归一化并且通过比较循环阈值Ct法(2^-(ΔΔCt))进行计算。
结果
中央角膜厚度(CCT)：所述组之间的CCT没有基线差异(D-Dex相对于游离Dex：p＝0.4；D-Dex相对于阳性对照：p＝0.67；游离Dex相对于阳性对照：p＝0.69)。如所期待，在POD1和3时所有组中CCT均增加(参见图9、图10A和表3)。截止到POD 7，所有组中角膜厚度具有改善倾向，但是在D-dex组中更明显。在POD 14时，D-dex组中的平均角膜厚度最薄。D-dex组与游离dex组之间的角膜厚度的比较显示，在POD 3(p＝0.04)和POD 7(p＝0.009)时CCT在前者中更薄(参见图9、图10A和表3)。对于D-dex组和阳性对照的比较，在POD 3(p＝0.01)、POD 7(p＝0.001)和POD 14(p＝0.01)时CCT对于前者更薄。用类固醇进行的处理导致眼内和结膜炎症减轻，使得角膜厚度降低。如在此所示，在碱烧伤之后，D-Dex组在角膜基质消退方面具有最有利的结果。
眼内压：如图10B和表3所展示，三个组中任意两组之间的IOP没有基线差异(d-dex相对于游离dex：p＝0.25；d-dex相对于未处理的：p＝0.3；以及游离dex相对于未处理的：p＝0.89)。在POD 3时，首次注意到统计意义上的显著差异：d-dex组中的平均IOP是10±0.2mmHg，而在游离dex组中，它是12.14±0.63(p＝0.02)；未处理组中的平均IOP是11.91±1.28(与d-dex组的比较，p＝0.04)。截止到POD 7，这些差异在具有11.33±0.62mmHg的平均IOP的d-dex组的情况下变得更明显，而游离dex组具有14.45±0.5mmHg的平均IOP(p＝0.001)。在POD 14时，d-dex组具有10.9±0.66mmHg的平均IOP，与其基线IOP相似，而游离dex组具有19.38±1.8mmHg的平均IOP(p<0.001)(参见图10B和表3)。值得注意的是，类固醇处理组中任一组的IOP均没有临床上显著的提高，然而，D-Dex组具有更有利的结果，其中IOP具有更适度的增加，并且没有明显的IOP峰。这可归因于此特定树状体-地塞米松制剂的缓慢类固醇释放特征。避免IOP峰或IOP的持续提高是临床实践的显著优点。
估计的新血管形成面积：新生血管在所有组中出现的时间不早于POD 3。如图10C、图4和表3所示，被新血管占据的面积在d-dex组中保持相对稳定，在POD 7时，其平均面积是2.5±0.32mm2，相比之下，游离dex组的平均面积是3.32±0.34(p＝0.009)。新血管形成在炎性连锁反应中是后发病。在较早阶段对炎症的抑制可解释在此所见的差异，其中D-Dex具有最好的结果。
角膜混浊分数：对于所有组，中值混浊分数在基线处全部是零。早在POD 1时角膜丧失其透明度，然而，阳性对照组一直未恢复，如图10D、图4和表3所示-在POD 14时，对照组具有2.5的平均混浊分数(范围：1-4)。在POD 14时，未处理组具有2.5的平均混浊分数(范围：1-4)。早在POD 3时，在各组之间观察到统计意义上的显著差异。D-dex组的中值混浊分数是2.5(范围：0-4)，而游离dex组的中值混浊分数是3.5(范围：1-3，p<0.001)。在POD 7(p＝0.006)时和在POD 14(p＝0.008)时，此差异在统计意义上仍然是显著的。相似碱烧伤的角膜混浊的原因是角膜炎症和水肿。就临床上评定的角膜混浊而言，D-Dex组具有最好的结果(参见图10D、图4和表3)。这是角膜炎症的治疗中D-Dex结合物的增强功效的另一个量度。
免疫组织化学和共焦显微镜：在POD 7和14时使用免疫组织化学和使用共焦显微镜的高分辨率成像，以便定性地评定存在于中央角膜中的巨噬细胞的数量。此量度提供不同处理降低组织炎症的能力的另一种间接估计。如先前在生物分布部分中所解释，碱烧伤导致角膜的结构损害和巨噬细胞浸润。
用安慰剂凝胶处理的阳性对照组显示在POD 7时巨噬细胞在中央角膜中积聚，这与在遭受碱烧伤后未给予任何类固醇处理的角膜中所见的类似。在这些阳性对照中，在POD14时观察到持续的Iba-1阳性浸润物(巨噬细胞)。还在大鼠模型中观察到中央角膜结构的一定改善，这可归因于天然愈合过程(图11，右图)。游离Dex凝胶组在POD 7时也显示了中央角膜的Iba-1阳性细胞浸润物(巨噬细胞)，然而，它确实在POD 14时部分地消退，这可归因于从结膜下凝胶释放的游离Dex的治疗活性(图11，中间图)。关于巨噬细胞消除的最好结果见于D-Dex组，其中在POD 7时识别到最少数量的浸润细胞。截止到POD 14，浸润物几乎完全消退(图11，左图)。
使用RT-PCR评估炎性细胞因子产生：图12A至图12E示出了不同处理之后炎性细胞因子的表达。为了进一步表征对炎症改善处理的应答，在POD 7和POD 14时评定炎性细胞因子。广泛地报道了碱烧伤在急性和慢性阶段中使得炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和VEGF)升高。在POD 7时，与阳性对照相比，IL-6 mRNA水平在D-Dex组中显著地更低(平均值±SEM 0.7±0.13相对于9.8±3.53，p<0.001)(图5)；对于与阳性对照相比的游离Dex组中IL-6水平的比较，同样如此(3.0±0.3相对于9.8±3.53，p<0.001)。与阳性对照相比，MCP-1 mRNA水平在POD 7时在D-Dex组中显著地更低(0.7±0.13相对于4.0±1.24，p<0.001)；然而，对于游离Dex组与阳性对照的比较，并非如此(p＝0.259)(图12)。在POD 14时，与阳性对照相比，D-Dex和游离Dex组两者均从处理受益，如通过MCP-1的mRNA水平所示：12.5±5.49和15.4±3.22分别相对于阳性对照组的98.7±15.42(p<0.001，针对两个比较)。值得注意的是，在POD 14时，当与阳性对照相比时，VEGF的mRNA水平仅在D-Dex组中显著地更低(6.3±1.02相对于27.2±5.66，p<0.001；p＝0.004，针对游离Dex与阳性对照之间的比较)(图12)。VEGF的mRNA的此差异可解释为何与其它组相比，D-Dex组在POD 14时具有较少的角膜新血管形成。总体上，细胞因子分析的结果与本发明的临床结果一致，从而表明D-Dex组在角膜炎症消退方面具有最好的结果。此消炎活性在角膜移植手术中在降低移植失败的几率方面是高度有益的。
结论：角膜炎症是重要病理事件，在许多疾病中发挥关键作用，其通过破坏正常角膜稳态而使其发展到晚期阶段。局部类固醇在减少白细胞/巨噬细胞浸润方面是有益的，但是需要频繁地给药，这可能引起角膜毒性和融解(M.D.Wagoner，眼睛的化学损伤：病理生理学和治疗的当前概念，《眼科学综览(Survey of ophthalmology)》41(4)(1997)275-313；S.Den等人，角膜碱损伤之后早期系统性倍他米松或环孢霉素A的经由炎性细胞因子减少的功效，《斯堪的纳维亚眼科学报(Acta Ophthalmologica Scandinavica)》82(2)(2004)195-199；P.C.Donshik等人，局部皮质类固醇对于碱烧伤角膜的溃烂的作用，《眼科学文献(Archives of Ophthalmology)》96(11)(1978)2117-2120)。如本发明所示，目的在于靶向引起炎症的细胞并且以持续方式递送类固醇的疗法是可行的选择，所述疗法可在手术时施用。在本发明中，使用轻度大鼠碱烧伤损伤作为角膜炎症的模型。利用PAMAM G4羟基树状体定位于活化的结膜巨噬细胞中的固有靶向能力来开发地塞米松的持续、靶向和细胞内递送以减弱角膜炎症。具有约20％的有效载荷的D-Dex结合物在水溶液中是高度可溶的。结合物展示出在体外LPS活化巨噬细胞中的改善的消炎活性(在10倍低的浓度下是游离地塞米松的消炎活性的约1.6倍)。
为了延长并维持D-Dex的生物可利用性，开发了基于树状体和透明质酸、交联的疏基-烯点击光化学的可注射凝胶系统。凝胶制剂拥有粘弹性特性，是可易于注射的并且提供D-Dex的持续释放。在结膜下施用之后从可注射凝胶释放的树状体靶向具有碱烧伤的中央结膜中的活化巨噬细胞并共定位于其中。并入D-Dex的凝胶的单一结膜下注射导致2周的延长功效。D-Dex凝胶处理展示更好的结果，诸如中央结膜厚度减小，角膜清澈度改善，没有眼内压提高的迹象。与游离药物相比，使角膜炎症减弱的D-Dex凝胶处理的药效动力学作用通过中央角膜中巨噬细胞浸润的显著减少和促炎细胞因子产生被抑制来展示。
本文公开的本发明的组合物和方法支持树状体是角膜的炎性病症的有效治疗媒介物的概念。本发明的组合物和方法的树状体-凝胶制剂的施用途径也是独特的，即结膜下。此途径在临床上也是可用的，不需要昂贵的资源，诸如手术室，并且潜在的空间也允许施用相对大体积的药物。药物储器的递送使患者不需要局部药滴的重复滴注，并且可改善依从性和结果。尽管最近开发了针对眼睛的后段的药库，但是目前没有特定设计来提供对结膜的长效药物递送的可商购获得的药物。本发明描绘的系统被特定设计来向眼睛的前段递送药物，并且在治疗角膜炎症方面显示是有效的。
列表：
表1：角膜混浊分级
混浊等级 透明度
0 透明
1 少量透明度损失
2 虹膜血管可见
3 瞳孔外形可见
4 瞳孔外形模糊
表1：角膜混浊分数。角膜透明度作为在结膜下施用D-Dex、游离Dex或安慰剂之后的功效量度。分级量度来自Larkin等人(大鼠角膜同种异体移植排斥中浸润移植物和房水的细胞的识别和表征，《临床与实验免疫学(Clinical&Experimental Immunology)》107(2)(1997)381-391)。
表2：引物序列
表3-临床结果汇总
表3：D-Dex、游离Dex和安慰剂(阳性对照)凝胶的结膜下处理后的临床结果的汇总。所有结果显示为平均值±标准偏差，混浊分数除外，其显示为中值(中间四分值范围)。POD-手术后天数；CCT-中央结膜厚度；NV-新血管形成；IOP-眼内压。
序列表
<110> 约翰霍普金斯大学(The Johns Hopkins University)
<120> 树状体-生物粘合剂聚合物水凝胶纳米胶水和其用途
<130> P13910-02
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<211> 20
<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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Claims (23)

1.一种纳米胶水，其包含：
树状体，和
生物粘合剂聚合物，
其中所述树状体分子和所述生物粘合剂聚合物在暴露于一个或多个外部刺激或组织内的一个或多个生理条件时彼此可交联。
2.根据权利要求1所述的纳米胶水，其中所述组合物还包含治疗剂、预防剂或诊断剂。
3.根据权利要求2所述的纳米胶水，其中所述治疗剂、预防剂或诊断剂结合到树状体或与树状体复合。
4.根据权利要求2所述的纳米胶水，其包含选自由以下组成的群组的药剂：消炎药、抗感染剂、抗青光眼剂、降低眼内压(IOP)的药剂、抗血管生成剂、生长因子以及生长因子。
5.根据权利要求2所述的纳米胶水，其包含诊断剂，所述诊断剂选自由以下组成的群组：顺磁性分子、荧光化合物、磁性分子、放射性核素、x射线成像剂以及对比剂。
6.根据权利要求3所述的纳米胶水，其包含治疗剂，所述治疗剂选自由以下组成的群组：地塞米松、倍他米松、曲安西龙、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、可的松、氢化可的松以及其它类固醇和非类固醇消炎药(NSAIDS)。
7.根据权利要求1所述的纳米胶水，其中所述树状体是任选地以一个或多个官能团封端的2-6代聚酰胺-胺(PAMAM)树状体，所述一个或多个官能团选自由以下组成的群组：羟基、氨基、羧基、烷氧基甲硅烷基、巯基、吡啶基、乙烯基、甲基丙烯酰基以及环状不饱和烃。
8.根据权利要求1所述的纳米胶水，其包含以一个或多个羟基封端的4、5或6代PAMAM树状体。
9.根据权利要求1所述的纳米胶水，其包含生物粘合剂聚合物，所述生物粘合剂聚合物选自由以下组成的群组：透明质酸、脱乙酰壳多糖、海藻酸盐、琼脂糖、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、甲基纤维素、纤维素、聚环氧烷、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、普鲁兰以及其衍生物。
10.根据权利要求1所述的纳米胶水，其包含透明质酸或其衍生物。
11.根据权利要求1所述的纳米胶水，其中所述树状体或生物粘合剂聚合物通过刺激可交联，所述刺激选自由以下组成的群组：光照射、pH改变、盐浓度改变以及温度改变。
12.根据权利要求11所述的纳米胶水，其中所述树状体或生物粘合剂聚合物通过紫外光照射可交联。
13.一种密封组织或向有需要的个体递送治疗剂、预防剂或诊断剂的方法，其包括：
向所述有需要的个体的所述组织施用根据权利要求1至13中任一项所述的纳米胶水，和
使所述树状体和/或生物粘合剂聚合物交联。
14.根据权利要求14所述的方法，其中所述纳米胶水通过注射施用。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述纳米胶水被施用到眼睛的表面或隔室(结膜下、前房内、脉络膜上腔、局部、玻璃体内以及视网膜下)或相邻组织。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述纳米胶水以有效密封伤口的量被施用到所述伤口。
17.根据权利要求12所述的方法，其中所述纳米胶水被施用来密封硬脑膜、肺膜、腹膜、胃肠、内皮或烧伤组织。
18.根据权利要求12所述的方法，其中所述纳米胶水被施用到组织表面以形成屏障。
19.根据权利要求12所述的方法，其中所述纳米胶水作为凝胶进行结膜下施用以用于持续治疗眼部/结膜炎症。
20.根据权利要求19所述的方法，其用于治疗碱/酸烧伤、干眼、角膜炎症、角膜感染、虹膜炎或葡萄膜炎。
21.一种包含根据权利要求1至11中任一项所述的纳米胶水的剂量单位的试剂盒。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述剂量单位包含干燥组分的容器和液体组分的容器，所述干燥组分和所述液体组分混合在一起而形成所述纳米胶水。
23.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述剂量单位是滴瓶或具有混合尖端的双筒注射器或点药器。
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