JP6997800B2 - 神経炎症性障害の処置に使用される小有機分子 - Google Patents
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Description
X1及びX2は各々独立にS、O又はN-R4であり、R4は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択され、
X3は、CN、ハロゲン、ニトロ、CO-X9及びSO2X9からなる群から選択され、X9は、OH、O-及びNH2からなる群から選択され、
X4、X5、X6、X7及びX8は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、アミン、ハロゲン、アルコキシ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、CN、ニトロ、CO-X10及びSO2X10からなる群から各々独立に選択され、X10は、OH、O-及びNH2からなる群から選択され、
R1とR2の一方は存在せず、他方のR1及びR2は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、アミン、ハロゲン、アルコキシ、ヘテロアリール、CN、CO-X11及びSO2X11からなる群から選択され、X11は、OH、O-及びNH2からなる群から選択され、
R3は、OR5、O-及びNR6R7からなる群から選択され、R5、R6及びR7は、H、アルキル、シクロアルキル及びアリールからなる群から各々独立に選択され、
点線の各々は独立に単結合又は二重結合である。
X12、X13、X15及びX16は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、アミン、ハロゲン、アルコキシ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、CN、NO2、CO-X19及びSO2X19からなる群から各々独立に選択され、X19は、OH、O-及びNH2からなる群から選択され、
X14及びX18は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、アミン、ハロゲン、アルコキシ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、CN、NO2、CO-X20及びSO2X20からなる群から各々独立に選択され、X20は、OH、O-及びNH2からなる群から選択され、
X17はS、O又はN-R9であり、R9は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択され、
nは1又は2であり、
R8は、アルキル、ハロゲン化アルキル、シクロアルキル及びアリールからなる群から選択される。
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X12、X13、X15及びX16は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、アミン、ハロゲン、アルコキシ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、CN、NO2、CO-X19及びSO2X19からなる群から各々独立に選択され、X19は、OH、O-及びNH2からなる群から選択され、
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nは1又は2であり、
R8は、アルキル、ハロゲン化アルキル、シクロアルキル及びアリールからなる群から選択される。
X21及びR10は、アルキル、ハロゲン化アルキル、シクロアルキル、アリール、アミン、ハロゲン、アルコキシ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、CN、NO2、CO-X23及びSO2X23からなる群から各々独立に選択され、X23は、OH、O-及びNH2からなる群から選択され、
X22は、OR12、O-及びNR13R14からなる群から選択され、R12、R13及びR14は、H、アルキル、シクロアルキル及びアリールからなる群から各々独立に選択され、
R11は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、アミン、ハロゲン、アルコキシ、ヘテロアリール、CN、CO-X24及びSO2X24からなる群から選択され、X24は、OH、O-及びNH2からなる群から選択される。
X24はO又はSである。
R16は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、アミン、ハロゲン、アルコキシ、ヘテロアリール、CN、CO-X24及びSO2X24からなる群から選択され、X24は、OH、O-及びNH2からなる群から選択される。
R17及びR18は各々独立に、任意に置換されているフェニル環であり、
R19は、H、アルキル、シクロアルキル及びアリールからなる群から選択され、
R20とR21の一方は存在せず、他方のR20又はR21は、H、アルキル、シクロアルキル及びアリールからなる群から選択され、
点線の各々は独立に単結合又は二重結合である。
R22及びR23は、H、アルキル、シクロアルキル及びアリールからなる群から各々独立に選択され、
X27は、ハロゲン化アルキル、アミン、ハロゲン、アルコキシ、ヒドロキシ、CN及びNO2からなる群から選択される。
X28は、ハロゲン化アルキル、アミン、ハロゲン、アルコキシ、ヒドロキシ、CN及びNO2からなる群から選択される。
R25は、アルキル、ハロゲン化アルキル、シクロアルキル、アリール、アミン、ハロゲン、アルコキシ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、CN及びNO2からなる群から選択される。
X29は、OR26、O-及びNR27R28からなる群から選択され、R26、R27及びR28は、H、COR29、アルキル、シクロアルキル及びアリールからなる群から各々独立に選択され、R29は、H、アルキル、シクロアルキル及びアリールからなる群から選択され、
X30は、OR30、O-及びNR31R32からなる群から選択され、R30、R31及びR32は、H、COR33、アルキル、シクロアルキル及びアリールからなる群から各々独立に選択され、R33は、H、アルキル、シクロアルキル及びアリールからなる群から選択される。
X31は、S及びOから選択され、
R34は、ハロゲン化アリール及びハロゲン化ヘテロアリールから選択され、
R35及びR36は、H、アルキル、シクロアルキル及びアリールからなる群から各々独立に選択される。
本明細書では「小分子」と「小有機分子」という用語は、互換性があり、分子量2000g/mol以下の有機分子を指す。一部の実施形態によれば、小分子の分子量は1000g/mol以下である。一部の実施形態によれば、小分子の分子量は750g/mol以下である。一部の実施形態によれば、小分子の分子量は500g/mol以下である。
小分子-SM
実験的自己免疫性脳脊髄炎-EAE、
再発寛解型-RR、
多発性硬化症-MS、
再発寛解型実験的自己免疫性脳脊髄炎-RR-EAE、
プロテオリピドタンパク質ペプチド-PLP、
ミエリン-乏突起膠細胞糖タンパク質ペプチド-MOG、
リン酸緩衝食塩水-PBS(Phosphate buffered saline)、
完全フロイントアジュバント-CFA(Complete Freund’s Adjuvant)、
百日咳毒素-PTX、
骨形成タンパク質-BMP、
血液脳関門-BBB、
中枢神経系-CNS、
時間-hr、h、
分-min。
ハイスループットスクリーニング(HTS)バイオアッセイ
ポリ-L-リジン(Sigma-Aldrich)を384ウェルプレートに添加し、室温で30分インキュベーション後に除去した。DMEM/F12、2%FBS、ペニシリン100単位/ml、ストレプトマイシン(Biological industries)100mg/mlを含むアッセイ培地を、各ウェルに添加した。次いで、組換えヒトBMP-2(rhBMP-2、R&D Systems)を、最終濃度2μg/mlまで各ウェルに添加した。ATDC5細胞(Sigma-Aldrich)を収集し、アッセイ培地に再懸濁し、最終濃度2000細胞/ウェルまで添加した。最後に、ヘパリン(Sigma-Aldrich)を、最終濃度2μg/mlまで添加した。細胞を、48時間37℃で5%CO2と一緒に加湿チャンバ中でBPM-2の潜在的小分子阻害剤の存在又は非存在下でインキュベーションした。インキュベーション後、ALPレベル及び細胞生存率を、完全に自動化された手順で測定した。細胞をPBSで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma-Aldrich)を補充したPBS中に0.2%Triton X-100を含む溶解緩衝剤を用いて溶解し、室温で25分間インキュベーションした。次いで、CDP-Star(登録商標)化学発光基質(Sigma-Aldrich)を添加し、25分間室温で暗所でインキュベーション後に発光を測定して、ALPレベルを求めた。最後に、CellTiter-Glo(登録商標)試薬(Biological Industries)を添加し、10分間インキュベーション後に発光を測定して、細胞生存率を求めた。
SJL雌性マウス(6~8週齢)において0.1ml PBS中のプロテオリピドタンパク質ペプチド(Sigma-Aldrichによって合成されたPLP139-151)100μg/マウスで皮下免疫処置して(0日目)、RR-EAEを誘導した。結核菌H37RA(MT、DIFCO製)500μgを含む等量の完全フロイントアジュバント(CFA、DIFCO製)でペプチドを乳化した。0.2ml PBS中の百日咳毒素(PTX、Sigma-Aldrich製)300ngも、マウスに腹腔内注射した。2回目のPTX注射(300ng/マウス)を、48時間後に行った。
7.5%子ウシ血清、2.5%ウシ胎仔血清及び0.4μl/mlペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco)を含む最少必須培地(aMEM:a-minimum essential medium)(Gibco)中で37℃、5%CO2でP19細胞を成長させた。細胞に新しい培地を48時間毎に補充した。分化検査の場合、P19細胞を濃度2×105細胞/60mm細菌皿で培養し、刺激しないか、又は以下の刺激と一緒にインキュベーションした。
1)5×10-7M全トランス型レチノイン酸(RA:retinoic acid)(Sigma)
2)RA+5ng/ml rhBMP2(R&D systems)
3)RA+rhBMP-2+500ng/mlマウス抗ヒトBMP-2/4mAb(R&D systems)
4)RA+rhBMP-2+SM1/SM7/SM9(Maybridge(HitFinder(商標)コレクション))濃度:0.625、1.25及び2.5μM。
P19細胞を6ウェルプレートに播いた(3.5×105細胞/ウェル)。翌日、細胞を処理しないか、又は5×10-7M RA、5ng/ml BMP-2若しくはSMで4時間処理した。細胞を氷冷PBSで洗浄し、収集し、プロテアーゼ阻害剤カクテル及びホスファターゼ阻害剤としてオルトバナジン酸ナトリウム(Na3VO4)(Sigma-Aldrich)を補充した氷冷RIPA緩衝剤(Sigma-Aldrich)を用いて溶解した。タンパク質濃度を、BCAタンパク質アッセイキット(Pierce、Rockford、IL)を用いて測定した。細胞溶解物(タンパク質40~60μg)を、4~15%SDS-PAGEゲル電気泳動によって分離し、次いでニトロセルロース膜に0.2Aで2時間転写した。膜を5%(w/v)脱脂粉乳で室温で1時間ブロックし、次いで抗ホスホSmad1/5/9、抗Smad1(Cell signaling Technology、Beverly、MA、USA)及び抗チューブリン(Sigma-Aldrich)抗体と一緒に室温で2時間インキュベーションした。膜を洗浄し、アルカリホスファターゼ複合二次抗体(Jackson Laboratories Immune Research、PA、USA)と一緒にインキュベーションした。シグナルを、増感化学発光キット(Clarity、BioRad Laboratories、Richmond、CA)を用いて検出し、デジタル画像を、MicroChemi(DNR Bio-imaging Systems、Jerusalem、Israel)によってキャプチャーした。タンパク質レベルを、ImageJソフトウェアを用いて定量化し、{アルファ}-チューブリンに対して規準化した。
小分子のハイスループットスクリーニング
BMP-2とBMP受容体IAの構造-機能関係を評価するATDC5細胞アッセイが、Kellerら(Nature Structural&Molecular Biology 2004 11、481~488)に最初に記載された。多量の治療薬候補をスクリーニングするために、BMP阻害を検出するATDC5細胞バイオアッセイを、ハイスループットスクリーニングに使用するように改作した。バイオアッセイは、BMP-2及びヘパリンの投与によるマウスATDC5細胞におけるアルカリホスファターゼ(ALP)産生の刺激、並びに阻害剤候補の存在下におけるALPレベルの測定に基づく。アッセイは、以下の特徴によって特徴付けられる。
Z’=1-3(σp+σn)/Iμp+μnI
ここで、σ=標準偏差、μ=平均、p=陽性(BMPあり)、n=陰性(BMPなし)及びI=値
RR-EAEモデルを用いた疾患進行に対するインビボでのSMの効果
上記実施例1で確認された小分子阻害剤の効果を、SJLマウスにおいて実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルを用いてインビボで更に試験した。EAEは、再発寛解型多発性硬化症(MS)のモデルとして役立つ。EAEを実験手順の項に記載のように誘導した。SM1~9又はビヒクル単独(5%DMSOのPBS溶液)を、250μg/マウス(10mg/kg/日)の腹腔内注射によって、免疫化後9日目から開始して次の30日間毎日投与した。動物を誘導後45日目までEAEの症候についてモニターし、以下のようにスコア化した:0=疾患なし、1=尾部麻痺、2=後肢虚弱、3=後肢麻痺、4=後肢+前肢麻痺及び5=瀕死。
EAEにおける脱髄に対するSM1、SM6、SM7及びSM9の効果
脱髄及び再ミエリン化プロセスに対するSMの直接効果を分析した。脊髄を各群の6匹のマウスから取り出し、脊髄の腰部を切断し(10μm冠状パラフィン切片)、ミエリン及び浸潤部染色のためにLFB-H&E(ルクソールファストブルーとH&E)処理した。図6Aに示すように、浸潤部及び脱髄の数の増加がビヒクル処置群において認められた。すべての検査したSMで有髄領域%のわずかな上昇傾向があったが(図6B)、有意な効果は、10mg/kg SM7(10mg/kg SM7処置群における34.0±0.8%対ビヒクルにおける28.3±1.8% p=0.04、高投与量は毒性のために検査されなかった)、20mg/kg SM9(34.6±1.6%、p=0.03)、及び10mg/kg SM6(34.8±1.6%=p,0.03)で認められた。これらの結果は、これらのSM処置に応答した再ミエリン化プロセスの増加若しくは脱髄の減少又はその両方を示している可能性がある。
インビトロでの神経形成に対するSM1、SM7及びSM9の効果
次に、P19分化モデルにおける神経形成に対する小分子の効果を測定した。マウス胚由来の奇形癌腫細胞であるP19細胞は、レチノイン酸(RA)刺激に応答してニューロンに分化し、この分化は、rhBMP-2(骨形成タンパク質-2)の添加によって阻止され得ることが実証された[8]。ニューロン分化はニューロンマーカーMAP-2の発現によって表され、BMP-2の添加はこのマーカーのレベルを低下させる。マウス抗BMP-2/4モノクローナル抗体の添加は、BMP-2の効果を逆転させ、ニューロン表現型の獲得を誘導する。したがって、P19細胞におけるニューロンマーカーMAP-2の発現に対するSM1、SM7及びSM9の効果をRA及びBMP-2の存在下で調べた。3つの分子濃度を試験した:0.625μM、1.25μM及び2.5μM。
P19細胞におけるSMADシグナル伝達に対するSM1、SM7及びSM9の効果
標準的なBMPシグナルは、SMADリン酸化を介して媒介されることが知られている。BMPは、I及びII型セリン/スレオニンキナーゼ受容体の複合体に結合することによってシグナルを伝達する。リガンド結合は、受容体のリン酸化を誘導し、次いで受容体Smad(R-Smad)1、5及び8を介して標準的なシグナル伝達を活性化する。R-Smadは、活性化I型受容体によってリン酸化される。次いで、それらはSmad4と複合し、核移行を誘発する[16]。P19細胞においてBMP-2による刺激に応答して誘導される標準的なSMAD1/5/8シグナル伝達のリン酸化に対するSMの効果を調べた。
BMP-4阻害に対するSM1、SM7、SM9及びSM6の効果
BMP-2とBMP-4の高い相同性のために、BMP-2及びBMP-4シグナル伝達を阻害するSMの能力も調べた(抗BMP-2/4mAbの効果と同様)。ATDC5細胞の刺激のためにrhBMP-4をrhBMP-2の代わりに使用した以外は、スクリーニングに使用した同じバイオアッセイ(すなわち、ALP及び生存率検出を伴うATDC5バイオアッセイ)によってBMP-4中和を分析した。
図9に示すように、SM1とSM6は、BMP-4及びBMP-2によって誘導されるALP産生に対して同じ効果を有した。SM7とSM9のどちらも、BMP-4よりもわずかに大きくBMP-2を阻害すると思われた(2.5μM SM7の場合、BMP-4の29.8%阻害に比べてBMP-2の47.3%阻害、及び2.5μM SM9の場合、BMP-4の18.9%阻害に比べてBMP-2の29.1%阻害)。
脳室下帯(SVZ)及び顆粒細胞下層(SGZ)における神経芽細胞マーカーダブルコルチン(DCX)の新規発現に対するSM1、SM7、SM9及びSM6の効果
RR-EAEを誘導したマウスに小分子SM1、SM7、SM9、SM6又は対応するビヒクル250μg/マウス(低-L)又は500μg/マウス(高-H)を腹腔内注射した。SMを免疫化後9日目から30日間毎日注射した。免疫組織化学分析では、各群の3匹のマウスに免疫化後9日目から8日間ブロモ-2’-デオキシウリジン(BrdU)を毎日腹腔内注射した。図10A~10Bを見て分かるように、EAEマウスのSVZにおけるBrdU+DCX+細胞の定量化によれば、SM9L(低用量のSM9)はBrdU+DCX+細胞において有意な増加をもたらした。対照ビヒクルに比べてSM9H、SM1L、SM1H及びSM6HによるBrdU+DCX+細胞の誘導の増加傾向も結果から明らかである。
図11A~11Bは、SM又はビヒクル処置後のEAEマウスにおけるBrdU+DCX+細胞の免疫組織化学的標識化を示す。BrdU+DCX+細胞の定量化から、ビヒクル処置に比べてSM9L、SM6L及びSM7Lによって誘導されたBrdU+DCX+細胞の増加傾向と共に、SM9HによるSGZにおけるBrdU+DCX+細胞の有意な誘導増加が明らかになった。
SGZにおける成熟ニューロンマーカーNeuNの新規発現に対するSM1、SM7、SM9及びSM6の効果。
この実験では、マウスのSGZにおけるBrdU+NeuN+細胞の量を評価した。図12A~12Bは、Olympus8.1顕微鏡(倍率10倍)を用いた、SM又はビヒクルで処置されたEAEマウスにおけるBrdU+NeuN+細胞の免疫組織化学的標識化を示す。BrdU+NeuN+細胞の定量化から、ビヒクル処置に比べてSM9Hによって誘導されたBrdU+NeuN+細胞の増加傾向と共に、SM1H及びSM9L処置マウスによるSGZにおけるBrdU+NeuN+細胞の有意な誘導増加が明らかになった。
背景として本開示の主題に関連すると考えられる参考文献を以下に示す。
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[17]WO 2013/186777
Claims (12)
- 一般式(I)の化合物又はその塩を含む医薬組成物であって、
X1及びX2は各々独立にS、O又はN-R4であり、R4は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択され、
X3は、CN、ハロゲン、NO2、CO-X9及びSO2X9からなる群から選択され、X9は、OH、O-及びNH2からなる群から選択され、
X4、X5、X6、X7及びX8は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、アミン、ハロゲン、アルコキシ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、NO2、CN、CO-X10及びSO2X10からなる群から各々独立に選択され、X10は、OH、O-及びNH2からなる群から選択され、
R1とR2の一方は存在せず、他方のR1及びR2は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、アミン、ハロゲン、アルコキシ、ヘテロアリール、CN、CO-X11及びSO2X11からなる群から選択され、X11は、OH、O-及びNH2からなる群から選択され、
R3は、OR5、O-及びNR6R7からなる群から選択され、R5、R6及びR7は、H、アルキル、シクロアルキル及びアリールからなる群から各々独立に選択され、
点線の各々は独立に単結合又は二重結合である、
医薬組成物。 - 神経炎症性疾患の処置に使用される、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記処置が追加の治療薬を更に含む、請求項2に記載の医薬組成物。
- 前記神経炎症性疾患が多発性硬化症である、請求項2又は3に記載の医薬組成物。
- 前記多発性硬化症が再発寛解型多発性硬化症である、請求項4に記載の医薬組成物。
- X 1 及びX 2 は各々Sである請求項6に記載の医薬組成物。
- X 3 はCNである請求項6に記載の医薬組成物。
- X 4 、X 5 、X 6 、X 7 及びX 8 は各々Hである請求項6に記載の医薬組成物。
- R 1 はHである請求項6に記載の医薬組成物。
- R 3 はOR 5 であり、R 5 はメチル又はエチルである請求項6に記載の医薬組成物。
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