JP2005538060A - 抗炎症性組成物および使用の方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ケモカイン、ＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳの活性を阻害する活性化合物を含有する医薬組成物に関する。また、該発明はこれらの医薬組成物を使用して炎症性および免疫調節性障害および疾患を治療する方法に関する。

Description

連邦政府支援による研究または開発
防衛高等研究企画庁（ＤＡＲＰＡ）グラントＮｏ．Ｎ６５２３６−９９−１−５４２０。

発明の背景
本発明は、ＣＣＲ１受容体への各種ケモカイン、たとえばＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳの結合を阻害する活性化合物およびそれらの薬剤的に受容できる塩を含む医薬組成物に関する。また、それはこれらの医薬組成物を使用して炎症性および免疫調節性障害および疾患を治療するための方法に関する。

ヒトの健康は外来病原体を検出し、撲滅する能力に依存し、そうしなければそのような病原体は個体の貴重な資源を侵害し、および／または病気を誘発するかもしれない。白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ（ＷＢＣｓ）：ＴおよびＢリンパ球、単球、好酸球、好塩基球、ならびに好中球）、リンパ組織およびリンパ管を含む免疫系は身体の防御系である。感染と闘うために、ＢおよびＴリンパ球は体内をくまなく循環し、抗原提示細胞と相互作用し、病原体を検出する。いったん侵入物が検出されれば、細胞傷害性Ｔ細胞が感染部位に動員されて病原体を撲滅する。ケモカインはＴリンパ球、好中球およびマクロファージの動員および活性化のための分子標識として作用し、病原体との闘いの場に目印をつける。

免疫系は、個体を病原体から防御する一方で反乱を起こすことも可能である。不適切なケモカインシグナリングはリウマチ性関節炎、多発性硬化症などの炎症性疾患を引き起こすとされている。リウマチ性関節炎では、骨関節における無秩序なケモカイン蓄積が浸潤性マクロファージおよびＴ−細胞を引きつけ、活性化する。これらの細胞の活動が滑液細胞増殖を誘発し、それにより炎症ならびに骨および軟骨の損失につながる（ＤｅＶｒｉｅｓ，Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．１９９９）。多発性硬化症のようなある種の脱髄疾患の特徴は、中枢神経系へのケモカインが媒介するマクロファージおよびＴ細胞の動員である（Ｋｅｎｎｅｄｙ ａｎｄ Ｋａｒｐｕｓ １９９９）。ケモカインによる移植片への有害なＷＢＣの動員がその後のかかる移植片拒絶に関連している（ＤｅＶｒｉｅｓ，Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．１９９９）。ケモカインは炎症およびリンパ球成長に重要な役割を果たしているため、それらの活動を特異的に操作する能力は、現在は十分な治療法がない疾患を緩和し、進行を止めることに非常に大きな影響を与えるであろう。さらに、広汎性の、病気を悪化させる高価な免疫抑制剤なしに移植片拒絶を極めて小さくできるかもしれない。

４０より多くの小ペプチド（７〜１０ｋＤ）のグループであるケモカインは、ＷＢＣ上に発現されたＧ蛋白質共役シグナリングカスケードによりシグナルを伝達する受容体と結合し、それらの化学誘引性および化学刺激性機能を媒介する。受容体は１以上のリガンドを結合してもよい；たとえば、受容体ＣＣＲ１はＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）、ＭＩＰ−１α（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）およびＭＩＰ−１βケモカインを結合する。現在まで、２４種のケモカイン受容体が公知である。すべてのケモカインの数、複数のリガンド結合受容体、およびＷＢＣ上の異なる受容体特性から、きちんと制御された、特有の免疫反応が考えられる（Ｒｏｓｓｉ ａｎｄ Ｚｌｏｔｎｉｋ ２０００）。ケモカイン活性は対応する受容体の調節により制御可能であり、関連する炎症性および免疫疾患を治療し、器官および組織移植を可能にすることができる。

受容体ＣＣＲ１および、たとえばＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＲＡＮＴＥＳを含むそのケモカインリガンドは、リウマチ性関節炎、移植片拒絶（共に（ＤｅＶｒｉｅｓ，Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．１９９９）に総説される）、および多発性硬化症（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｓａｎｔａｍｂｒｏｇｉｏ ｅｔ ａｌ．２０００；Ｉｚｉｋｓｏｎ，Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０００；Ｒｏｔｔｍａｎ，Ｓｌａｖｉｎ ｅｔ ａｌ．２０００）に関係するため、将来有望な治療標的と考えられる。実際、機能−遮断抗体、改変されたケモカイン受容体リガンドおよび小有機化合物が発見されていて、それらのあるものは首尾よくある種のケモカイン−媒介疾患を予防または治療することが証明されている（（Ｒｏｓｓｉ ａｎｄ Ｚｌｏｔｎｉｋ ２０００）に総説される）。特に、リウマチ性関節炎の実験モデルでは、シグナリングを遮断する、改変されたＲＡＮＴＥＳリガンドが投与された場合、疾患の進行が妨げられる（Ｐｌａｔｅｒ−Ｚｙｂｅｒｋ，Ｈｏｏｇｅｗｅｒｆ ｅｔ ａｌ．１９９７）。機能−遮断抗体および小ペプチド療法は将来有望であるが、それらは分解の危険、いったん投与されると極端に短い半減期、ならびに多くの蛋白質の開発特性および製造特性のための莫大な費用を欠点として持つ。小有機化合物はしばしばｉｎ ｖｉｖｏでより長い半減期を有し、有効であるためにより少ない用量を必要とし、しばしば経口投与が可能であり、そして結果として経費が軽減されるので、それらは好ましい。ある種のＣＣＲ１の有機アンタゴニストは以前に記載されている（Ｈｅｓｓｅｌｇｅｓｓｅｒ，Ｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９８；Ｎｇ，Ｍａｙ ｅｔ ａｌ．１９９９；Ｌｉａｎｇ，Ｍａｌｌａｒｉ ｅｔ ａｌ．２０００；Ｌｉａｎｇ，Ｒｏｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．２０００）。そのような化合物はある種の動物モデルの疾患の治療において有効であることが示されている（Ｌｉａｎｇ，Ｍａｌｌａｒｉ ｅｔ ａｌ．２０００）ため、当該技術分野においてより多くの化合物が薬剤として集積されることが所望される。本出願者らはこの集積における重要な手段であることが期待される有効なＣＣＲ１の有機アンタゴニストを同定している。

本明細書に開示された型のピペラジン誘導体は公知の抗炎症剤である（たとえば、ＷＯ９８／５６７７１、ＷＯ９７／４４３２９、ＷＯ９９／３７６５１、ＷＯ９９／３７６１９、ＷＯ００／５３６００を参照されたい）。本明細書に開示された具体的なピペラジン誘導体は今までＣＣＲ１アンタゴニストとして確認されていない。

発明の概要
一態様では、本発明は薬剤的に受容できるキャリアおよび、たとえばＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳを含む各種ケモカインのＣＣＲ１受容体への結合を阻害する活性化合物を含む組成物を提供する。

別の態様では、本発明はたとえばＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳを含む各種ケモカインの活性を阻害する活性化合物を投与することによりＣＣＲ１受容体を遮断する方法を提供する。

別の態様では、本発明は本発明の組成物を投与することにより炎症性および免疫調節性障害および疾患を治療する方法を提供する。
発明の詳細な説明
本発明は薬剤的に受容できるキャリアおよび各種ケモカイン（たとえば主要リガンドＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１δ、骨髄前駆細胞阻害因子−１（ＭＰＩＦ−１）、血液濾液Ｃ−Ｃ−１（ＨＣＣ−１）、ロイコタクチンおよびＲＡＮＴＥＳを含む）のＣＣＲ１受容体への結合を阻害する活性化合物を含む組成物を提供する。

本発明の組成物は炎症性障害の治療に有用である。
定義
“アルキル”は直鎖アルキル基、分枝鎖アルキル基、またはシクロアルキル基を含む、飽和脂肪族基を表す。好ましい態様では、直鎖または分枝鎖アルキルは骨格に１０以下、より好ましくは６以下、そして最も好ましくは４以下の炭素原子を有する。同様に、好ましいシクロアルキルはそれらの環状構造に３〜１０炭素原子、そしてより好ましくは環状構造に３〜６炭素を有する。代表的なアルキル基にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロヘキシルなどが挙げられるが、それらに限定されない。メチルおよびエチルが好ましい。

“アルコキシ”は、酸素原子を介して親分子部分に結合する、（上記で定義した）アルキル基を表す。代表的なアルコキシ基には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ネオペントキシおよびｎ−ヘキソキシが挙げられるが、それらに限定されない。

“アリール”は５〜１０炭素原子のいずれかの１価芳香族炭素環基を表す。アリール基は二環式（すなわちフェニル（またはＰｈ））または多環式（すなわちナフチル）であってよく、そして置換されていなくても置換されてもよい。好ましいアリール基には、フェニル、ナフチル、フリル、チエニル、ピリジル、インドリル、キノリニルまたはイソキノリニルが挙げられる。

“ハロアルキル”は、１以上のハロゲン原子で置換された、（上記で定義した）アルキル基を表す。代表的なハロアルキル基にはトリフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリクロロメチル、クロロエチル、ブロモブチル、２−トリフルオロエチル、１−フルオロメチル−２−フルオロエチル、３−ブロモ−２−フルオロプロピル、１−ブロモメチル−２−ブロモエチルなどが挙げられるが、それらに限定されない。トリフルオロメチルがとりわけ好ましい。

“ハロゲン”はフッ素、塩素、臭素およびヨウ素を表す。
“ヘテロシクリル”は５〜１０、好ましくは５または６の環原子を含む安定な、飽和、部分不飽和、または芳香基を表す。環は置換基により１回またはそれより多く置換されてよい。環は単環−、二環−または多環であってよい。ヘテロシクリル基は炭素原子ならびに窒素、酸素、および硫黄からなる群から独立して選択される１〜３までのヘテロ原子からなる。ヘテロシクリル基の例としては、アクリジン、ベンザチアゾリン、ベンズイミダゾール、ベンゾフラン、ベンゾピラン、ベンズオキサゾリン、ベンゾチアペン、ベンズチアゾール、ベンゾチオフェニル、カルバゾール、シンノリン、フラン、イミダゾール、１Ｈ−インダゾール、インドール、イソインドール、イソキノリン、イソチアゾール、モルホリン、オキサゾール（すなわち、１，２，３−オキサジアゾール）、フェナジン、フェノチアジン、フェノキサジン、フタラジン、ピペリジン、ピペラジン、プテリジン、プリン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、ピロール、キナゾリン、キノリン、キノキサリン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロキノリニル、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロチエニルならびにそのスルホキシドおよびスルホン誘導体、チアモルホリン、チアゾール、１，３，４−チアジアゾール、チエン、チオフェン、１，３，５−トリアジン、トリアゾール（すなわち、１，２，３−トリアゾール）などが挙げられる。

“置換された”とは、一部分が少なくとも１、好ましくは１〜３の置換基を含むことを意味する。適切な置換基には水素（Ｈ）、およびヒドロキシル（−ＯＨ）、アミノ（−ＮＨ２）、オキシ（−Ｏ−）、カルボニル（−ＣＯ−）、チオール、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ニトリル、ニトロ、アリールおよびヘテロシクリル基が挙げられる。これらの置換基は場合によりさらに１〜３の置換基で置換されていてよい。置換された置換基の例としてはカルボキサミド、アルキルメルカプト、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシレート、アルコキシカルボニル、アルキルアリール、アラルキル、アルキルヘテロシクリルなどが挙げられる。

ケモカイン、ＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳの活性を阻害する化合物
一態様において、本発明の活性化合物は式（１）：

（式中、ｎは０、１、または２であり；
Yは酸素または硫黄であり；
Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^３はそれぞれ独立して水素、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ハロアルキルまたはニトロである）の化合物である。

好ましくは、式（２）の活性化合物：

（式中、ｎは０、１、または２であり；
Yは酸素または硫黄であり；そして
Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^３はそれぞれ独立して水素、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ハロアルキルまたはニトロである）。

とりわけ好ましい化合物（１）にはＲ^１およびＲ^２が水素であり、そしてＲ^３がハロゲン（とりわけ好ましくは塩素またはフッ素）または水素であるものが挙げられる。
本発明において有用な化合物は市販されているか、または公知の手順により作製することができる（たとえば、ＦＲ １，４４１，０７１およびＪＰ ６３０４１９０７を参照されたい）。

試験
本発明の化合物がＣＣＲ１受容体のアンタゴニストであることを証明するために、それらがケモカイン、ＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳを阻害するかどうかを確認することができる。好ましくは、そのような化合物は以下の特性を有する：
（１）ケモカインであるＭＩＰ−１αまたはＲＡＮＴＥＳのＣＣＲ１受容体への結合を強力に阻害する；
（２）ＣＣＲ１に対するＣａ^２＋応答の有意な阻害；および
（３）限定された非特異的Ｃａ^２＋応答。

標準ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイを使用してＣＣＲ１受容体に対する化合物の親和性（それによって受容体に競合的に結合してＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳの活性を阻害する）を証明することができる。以下の例を参照されたい。好ましくは、活性化合物は＜１０μＭ、より好ましくは＜５μＭ、最も好ましくは＜１μＭのＩＣ_５０値を示す。

ＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳの活性を阻害する化合物はＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳ刺激細胞において細胞内Ｃａ^２＋濃度に影響を及ぼす。ＣＣＲ１受容体へのリガンド結合はＧ−蛋白質誘発性ホスホリパーゼＣの活性化を起こし、そしてそれはホスファチジルイノシトールリン酸からイノシトールリン酸およびジアシルグルセロールへの変換を引き起こす。イノシトールリン酸は次に細胞内部位に位置する受容体に結合して、細胞質にＣａ^２＋を放出する。細胞内ストアからの放出によるＣａ^２＋濃度増大に加え、受容体へのイノシトールリン酸の結合は、細胞膜を横切る、細胞への細胞外カルシウム流入を増加させる。したがって、ＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳによるＣＣＲ１受容体の活性化、そしてその後の本発明の化合物による活性化の阻害は、細胞内遊離Ｃａ^２＋濃度の増大をアッセイすることにより確かめることができる。一般に、このことはｑｕｉｎ−２、ｆｕｒａ−２およびｉｎｄｏ−１のようなカルシウム−感受性蛍光プローブの使用により行うことができる。以下の実施例を参照されたい。Ｃａ^２＋応答を遮断する活性化合物の作用は存在する活性化合物およびケモカインの量に依存する。一般に、１０ｎＭのケモカインが存在する場合、１０μＭの活性化合物はＣａ^２＋応答を２０〜１００％阻害することになる。

活性化合物が非特異的Ｃａ^２＋応答を引き起こすかどうかを確かめることは、上記のように活性化合物を添加し、記載されたＣａ^２＋応答を測定し、その後別のケモカイン受容体に対する公知のアンタゴニスト（たとえば、ＣＸＣＲ４リガンドであるブラジキニンまたはＳＤＦ−１）を添加することにより確かめることができる。同等の反応は、活性化合物が非特異的に結合していることを示す。

医薬組成物
活性化合物投与のための医薬組成物は好都合には投与量単位で提示されてよく、そして製剤技術分野で周知の方法のいずれかにより調製することができる。すべての方法は、１以上の補助的な成分を構成するキャリアと活性化合物を混合する工程を含む。一般に、医薬組成物は液体キャリアもしくは微細に分割された固体キャリアまたは両方と活性化合物を均一に、そして十分に混合し、そして必要な場合、産物を所望する製剤に形作ることにより調製する。医薬組成物では、活性化合物は疾患の過程または状態に対して所望する効果を及ぼすために十分な量が含められる。

活性化合物を含む医薬組成物は経口的な使用に適した形状、たとえば、錠剤、トローチ剤、薬用ドロップ、水性もしくは油性懸濁剤、分散粉末剤もしくは顆粒剤、乳剤、硬もしくは軟カプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤であってよい。経口的な使用を意図した組成物は医薬組成物の製造のために当該技術分野で公知の任意の方法に従って調製してよく、そしてそのような組成物は薬剤的にふさわしく、風味のよい調製物を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤および保存剤からなる群から選択される１以上の物質を含んでいてもよい。錠剤は、錠剤の製造に適切な非毒性の薬剤的に受容できる添加剤と混合した活性成分を含有する。これらの添加剤はたとえば、不活性希釈剤、たとえば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム；造粒および崩壊剤、たとえばコーンスターチ、またはアルギン酸；結合剤、たとえばデンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム、および潤滑剤、たとえばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであってよい。錠剤は被覆しなくてもよく、または消化管における崩壊および吸収を遅らせるために、公知の技術で被覆して、それによって長期間にわたる持続作用を提供してもよい。たとえば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルのような時間遅延物質を使用してよい。それらはまた、米国特許第４，２５６，１０８号；第４，１６６，４５２号；および第４，２６５，８７４号に記載の技術により被覆して、徐放のための浸透圧治療錠を形成することができる。

経口的な使用のための製剤はまた、活性成分が不活性な固体希釈剤、たとえば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合した、硬ゼラチンカプセル剤、または活性成分が水または油性媒体、たとえば落花生油、流動パラフィン、またはオリーブ油と混合した軟ゼラチンカプセル剤として提示されてよい。

水性懸濁剤は、水性懸濁剤の製造に適した添加剤と混合した活性物質を含有する。そのような添加剤は懸濁化剤、たとえばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴムであり；分散化または湿潤剤は天然に存在するリン脂質、たとえばレシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物、たとえばポリオキシエチレンステアレート、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物、たとえば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合物、たとえば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、またはエチレンオキシドと脂肪酸および無水ヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合物、たとえば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであってよい。水性懸濁剤はさらに１以上の保存剤、たとえばエチル、またはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシベンゾエート、１以上の着色剤、１以上の香味剤、および１以上の甘味剤、たとえばショ糖またはサッカリンを含有してよい。

油性懸濁剤は、植物油、たとえば落花生油、オリーブ油、ゴマ油またはココナッツ油中、または流動パラフィンのような鉱物油中に活性成分を懸濁することにより製剤化することができる。油性懸濁剤は造粘剤、たとえば蜜蝋、固形パラフィンまたはセチルアルコールを含有してもよい。先に記載したような甘味剤、および香味剤を添加して風味のよい経口調製物を提供することができる。これらの組成物はアスコルビン酸のような酸化防止剤の添加により保存してもよい。

水の添加による水性懸濁剤の調製に適した分散粉末剤または顆粒剤は、分散化または湿潤剤、懸濁化剤および１以上の保存剤と混合した活性成分を提供する。適切な分散化または湿潤剤および懸濁化剤はすでに述べたものによって例示される。さらに付加的な添加剤、たとえば甘味剤、香味剤および着色剤が存在してよい。

本発明の医薬組成物はまた、水中油型乳剤の形状であってもよい。油性相は植物油、たとえばオリーブ油もしくは落花生油、または鉱物油、たとえば流動パラフィンまたはそれらの混合物であってよい。適切な乳化剤は、天然に存在するゴム、たとえばアラビアゴムまたはトラガカントゴム、天然に存在するリン脂質、たとえばダイズレシチン、および脂肪酸と無水ヘキシトールに由来するエステルまたは部分エステル、たとえばソルビタンモノオレエート、および上記の部分エステルとエチレンオキシドの縮合物、たとえばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであってよい。乳剤はさらに甘味剤および香味剤を含んでいてよい。

シロップ剤およびエリキシル剤は甘味剤、たとえばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールまたはショ糖とともに製剤化してもよい。そのような製剤はさらに粘滑剤、保存剤ならびに香味剤および着色剤を含んでいてもよい。

医薬組成物は滅菌注射用水性または油脂性懸濁剤の形状であってもよい。この懸濁剤は先に記載している適切な分散化剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して公知の技術に従って製剤化することができる。滅菌注射用製剤はまた非毒性の非経口的に受容できる希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液、たとえば１，３−ブタンジオール中の溶液であってよい。使用することができる受容可能なビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、滅菌不揮発性油は慣習的に溶媒または懸濁化媒体として使用される。この目的のために、合成モノ−またはジグリセリドを含む任意の刺激の少ない不揮発性油を使用してよい。さらに、オレイン酸のような脂肪酸は注射用製剤に用途がある。

本発明の化合物はまた薬物の直腸投与のための坐剤の形状で投与してもよい。これらの組成物は、常温では固体であるが直腸温では液体であり、したがって直腸で溶けて薬物を放出する適切な非刺激性の添加剤と薬物を混合することにより調製してもよい。そのような材料はココアバターおよびポリエチレングリコールである。

局所使用には、本発明の化合物を含有するクリーム剤、軟膏剤、ゼリー、溶液または懸濁剤などが使用される。（この適用のためには、局所適用は口内洗浄剤およびうがい液が含まれる）。

本発明の医薬組成物および方法は、上記の病的状態の治療に通常適用される、本明細書に記載の別の治療用活性化合物をさらに含んでいてよい。
ケモカイン受容体調節を必要とする状態の治療または予防において、適切な投与量は一般に１日につき約０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ患者体重であり、それは単一または複数の投与量として投与することができる。好ましくは、投与量は１日につき約０．１〜約２５０ｍｇ／ｋｇ；より好ましくは１日につき約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇであろう。適切な投与量は１日につき約０．０１〜２５０ｍｇ／ｋｇ、１日につき約０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ、または１日につき約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇであってよい。この範囲内で投与量は１日につき０．０５〜０．５、０．５〜５または５〜５０ｍｇ／ｋｇであってよい。経口投与では、好ましくは治療される患者の症状により投与量を調節するために、組成物は活性成分を１．０〜１０００ミリグラム、とりわけ活性成分を１．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、５０．０、７５．０、１００．０、１５０．０、２００．０、２５０．０、３００．０、４００．０、５００．０、６００．０、７５０．０、８００．０、９００．０および１０００．０ミリグラム含む錠剤の形状で提供される。化合物は１日につき１〜４回、好ましくは１日につき１回または２回の投与計画で投与してよい。

しかし、いずれか特定の患者のための具体的な投与量および投与頻度は変化してよく、使用する具体的な化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用時間、年齢、体重、全身の健康状態、性、常食、投与様式および時間、排出速度、薬物の組み合わせ、具体的な状態の重症度、ならびに治療をうける受容者を含む多様な因子に依存することになる。

ＣＣＲ１受容体を阻害する方法
本発明はさらに、ＣＣＲ１受容体へのケモカインの結合を阻害するために適した条件下で、ＣＣＲ１受容体を発現する細胞と上記の組成物を接触させることにより、ＣＣＲ１受容体へのＭＩＰ−１αまたはＲＡＮＴＥＳの結合を阻害する方法を提供する。

炎症性および免疫調節性障害および疾患を治療する方法
本発明はさらに、上記組成物の治療的有効量を、それを必要とする患者に、炎症性疾患の治療に十分な時間投与することにより、炎症性疾患を治療する方法を提供する。“治療する”とは、障害またはその症状を予防する、阻害するまたは緩和することを表す。

ＣＣＲ１はヒトのようなほ乳動物において、好酸球および／またはリンパ球機能を妨害するか、または促進するための標的を提供する。ＣＣＲ１を阻害する化合物は、治療のための好酸球および／またはリンパ球機能の調節にとりわけ有用である。したがって、本発明は多様な炎症性および免疫調節性障害および疾患の予防および／または治療に有用な化合物に関する。

たとえば、１以上のＣＣＲ１の機能を阻害する本発明の化合物を投与して炎症を阻害する（すなわち、緩和するか、または予防する）ことができる。結果として、１以上の炎症過程、たとえば白血球遊出、走化性、（たとえば、酵素、ヒスタミンの）エキソサイトーシスまたは炎症メディエータ遊離を阻害することができる。たとえば、（たとえば喘息における）炎症部位への好酸球浸潤は本発明の方法に従って阻害することができる。

同様に、ＣＣＲ１の１以上の機能を促進する本発明の化合物を投与して、白血球遊出、走化性、（たとえば、酵素、ヒスタミンの）エキソサイトーシスまたは炎症メディエータ遊離のような炎症反応を刺激すると、結果として炎症過程を有益に促進する。たとえば寄生虫感染と闘うために好酸球を動員することができる。

ヒトのような霊長類に加え、多様な他のほ乳類を本発明の方法に従って治療することができる。たとえば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、モルモット、ラットまたは別のウシ属、ヒツジ科、ウマ科、イヌ科、ネコ科、げっ歯類もしくはマウス種を含むがそれらに限定されないほ乳類を治療することができる。しかし、該方法を他の種、たとえば鳥類（たとえばニワトリ）にも同様に実施することができる。

炎症および感染に関連した疾患および状態は、本発明の方法を使用して治療することができる。好ましい態様では、疾患または状態とは、炎症反応を調節するために好酸球および／またはリンパ球の作用が阻害または促進されることである。

ＣＣＲ１阻害剤で治療することができるヒトまたは他の種の疾患または状態には以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：呼吸性アレルギー疾患、たとえば喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患、過敏性肺炎、好酸球性肺炎（たとえばレフラー（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ）症候群、慢性好酸球性肺炎）、遅延型過敏症、間質性肺疾患（ＩＬＤ）（たとえば、突発性肺線維症、またはリウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、全身性硬化症、シェーグレン症候群、多発性筋炎または皮膚筋炎に関連したＩＬＤ）；全身性アナフィラキシーまたは過敏性反応、薬物アレルギー（たとえばペニシリン、セファロスポリンに対して）、昆虫刺傷アレルギー；自己免疫疾患、たとえばリウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、多発性硬化症、乾癬性関節炎、脳脊髄炎、アルツハイマー病、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、若年型糖尿病；糸球体腎炎、自己免疫性甲状腺炎、ベーチェット病；ギラン−バレー症候群、急性細胞−媒介移植片拒絶反応（たとえば腎臓移植片拒絶反応）、同種移植片拒絶反応または移植片対宿主疾患を含む移植片拒絶反応（たとえば移植において）；蕁麻疹、皮膚脈管炎、クローン病および潰瘍性大腸炎のような炎症性大腸疾患；脊椎関節疾患；強皮症；乾癬（Ｔ−細胞媒介乾癬を含む）および皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹を含む炎症性皮膚疾患；血管炎（たとえば壊死性、皮膚、および過敏性血管炎）；好酸球性筋炎、好酸球性筋膜炎；皮膚または器官の白血球浸潤を伴う癌、含む炎症性またはアレルギー性疾患および状態。再潅流傷害、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、ある種の血液癌、サイトカイン−誘発毒性（たとえば、敗血症性ショック、内毒素性ショック）、多発性筋炎、皮膚筋炎を含むがそれらに限定されない、好ましくない炎症反応が阻害されるべき別の疾患または状態は治療することができる。本発明の化合物はしたがって多様な炎症性および免疫調節性障害および疾患の予防および治療に有用である。

本発明の組成物が炎症性障害の治療に有用であることを証明するために使用することができる標準ｉｎ ｖｉｖｏアッセイは、多発性硬化症についての実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルおよびリウマチ性関節炎についてのアジュバント−誘発関節炎モデルのための動物モデルを含む。

本発明の組成物は、経口、非経口（たとえば、筋肉内、腹腔内、静脈内、ＩＣＶ、大槽内注射もしくは注入、皮下注射、またはインプラント）、吸入噴霧、経鼻、経膣、直腸内、舌下、または局所の投与経路により投与してよく、そして単独でまたは一緒に、またはそれぞれの投与経路に適切な慣用の薬剤的に受容できる非毒性のキャリア、アジュバントおよびビヒクルを含有する適切な投与量単位製剤で製剤化してもよい。マウス、ラット、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、サルなどの温血動物の治療に加えて、本発明の組成物はヒトでの使用に有効である。

組み合わせ療法
先に記載のように、ケモカイン受容体活性を調節して、炎症性および免疫調節性障害および疾患を予防および治療する組み合わせ療法は、本発明の化合物とそのような用途に対して公知の別の化合物の組み合わせにより説明される。

たとえば、炎症の治療または予防において、本発明の化合物はオピエートアゴニスト、５−リポキシゲナーゼ阻害剤のようなリポキシゲナーゼ阻害剤、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤のようなシクロオキシゲナーゼ阻害剤、インターロイキン−１阻害剤のようなインターロイキン阻害剤、ＮＭＤＡアンタゴニスト、一酸化窒素阻害剤もしくは一酸化窒素合成の阻害剤、非ステロイド性抗炎症剤、またはサイトカイン−抑制性抗炎症剤のような抗炎症剤または鎮痛剤、たとえばアセトアミノフェン、アスピリン、コデイン、フェンタニル、イブプロフェン、インドメタシン、ケトロラック、モルヒネ、ナプロキセン、フェナセチン、ピロキシカム、ステロイド性鎮痛剤、スフェンタニル、スンリンダック、テニダップなどと一緒に使用してもよい。同様に、本発明の化合物は疼痛緩和剤；カフェイン、Ｈ２−アンタゴニスト、シメチコン、水酸化アルミニウムまたは水酸化マグネシウムのような増強物質；フェニレフリン、フェニルプロパノールアミン、プソイドフェドリン、オキシメタゾリン、エピネフリン、ナファゾリン、キシロメタゾリン、プロピルヘキセドリン、またはレボ−デスオキシ−エフェドリンのような鬱血除去剤；コデイン、ヒドロコデイン、カラミフェン、カルベタペンタン、またはデキストラメトルファンのような鎮咳剤；利尿剤；および鎮静性または非鎮静性抗ヒスタミン剤と一緒に投与してもよい。

以下の実施例は本発明を説明することを意図し、限定するものではない。

実施例
実施例１：材料および方法
Ａ．化合物コレクション
本明細書で使用する化合物コレクションは、市販の小分子からなる。ソースプレートはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に個々の化合物を１または５ｍｇ／ｍｌで含有した。これらのＣＬＩＰ（プール中の化合物ライブラリー（ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｙ ｉｎ ｐｏｏｌｓ））からプレートを作製し、そこではウェルごとに１０化合物が添加され、２０％ ＤＭＳＯで５〜５０μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。それぞれの混合物２０μｌのアリコートを試験プレートに入れ、それらは使用まで−２０℃で保存した。

Ｂ．細胞
ＣＣＲ１トランスフェクタント
ＣＣＲ１−ＮＳＯ細胞
ＣＣＲ１を発現している安定なトランスフェクタント細胞株（ＣＣＲ１−ＮＳＯ）は、４．５ｇ／Ｌ グルコース、５％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０ｍＭ ＨＣｌ、２５０μｇ／Ｌ キサンチン（１Ｎ ＮａＯＨ中のキサンチン １００Ｘストック由来）、１５μｇ／Ｌ ヒポキサンチン（０．１Ｎ ＮａＯＨ中のヒポキサンチン １００Ｘストック由来）、１０ｍｇ／Ｌ チミジン（Ｈ_２Ｏ中のチミジン １００Ｘストック由来）、５０μＭ β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）（Ｈ_２Ｏ中のＢＭＥ １０００Ｘストック由来）、および１．５ｍｇ／Ｌ ミコフェノール酸（エタノール中の２．５ｍｇ／ｍｌ ミコフェノール酸ストック由来）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で培養した。細胞は５％ ＣＯ_２／９５％ 空気、１００％ 湿度、３７℃で培養し、濃度が０．５〜１．０ｘ１０^６細胞／ｍｌの間のときに採取した。細胞は週に２回、１：４で継代培養した。

ＣＣＲ１−２９３細胞
ヒト胎児腎臓アデノウイルス−形質転換細胞株２９３（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）はヒトＣＣＲ１で安定にトランスフェクションした。ｐＩＲＥＳｐｕｒｏベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）はＥｃｏＲＶ−ＮｏｔＩ制限部位にクローニングしたプロラクチンシグナル配列およびＦＬＡＧエピトープを含むように操作した。ヒトＣＣＲ１ ｃＤＮＡクローンはＮｏｔＩ部位にサブクローニングし、挿入物は強力なｐＣＭＶプロモーターに機能可能に連結した。細胞は、５％ ＣＯ_２／９５％ 空気下、１００％ 湿度、３７℃において、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌ 炭酸水素ナトリウム、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸、１．０ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１０％ ウシ胎児血清を補足したダルベッコ改変イーグル培地中、２μｇ／ｍｌ ピューロマイシンによる選抜下で培養した。細胞は週に２回、１：５で継代培養し、１ｘ１０^６細胞／ｍｌにおいて採取した。

ＴＨＰ−１細胞
ＴＨＰ−１細胞はＡＴＣＣから入手し、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌ 炭酸水素ナトリウム、４．５ｇ／Ｌ グルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．０５％ ２−メルカプトエタノールおよび１０％ ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ−１６４０培地中で懸濁液として培養し、週に２回、１：５で継代培養し、１ｘ１０^６細胞／ｍｌにおいて採取した。

Ｃ．アッセイ
ＣＣＲ１リガンド結合の阻害
ＣＣＲ１発現細胞は遠心分離し、アッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．１、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および０．２％ ウシ血清アルブミン）に再懸濁し、濃度５．６ｘ１０^６細胞／ｍｌ（ＣＣＲ１−ＮＳＯ）または２．２ｘ１０^６細胞／ｍｌ（ＣＣＲ１０２９３）とした。スクリーニングアッセイは以下のように行った。初めに、化合物を含むアッセイプレートに細胞０．０９ｍｌ（５ｘ１０^５ＣＣＲ１−ＮＳＯ細胞／ウェルまたは２ｘ１０^５ＣＣＲ１−２９３細胞／ウェル）を添加し、それぞれの化合物の最終濃度を約２〜１０μＭとした。次に、^１２５Ｉ標識ＭＩＰ−１α（Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＬより入手）をアッセイバッファーで最終濃度が〜５０ｐＭになるように希釈し、１ウェルにつき約３０，０００ｃｐｍとしたものを０．０９ｍｌ添加し、プレートを密閉し、振とう機試料台上で、約３時間、４℃でインキュベートした。反応物は真空セルハーベスター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；Ｍｅｉｄｅｎ，ＣＴ）上で０．３％ ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液中に予め浸漬したＧＦ／Ｂガラスフィルター上に吸引した。シンチレーション液（５０μｌ；Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ ２０，Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）をそれぞれのウェルに添加し、プレートを密閉して、放射能をＴｏｐ Ｃｏｕｎｔ ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で測定した。希釈液だけ（総カウントのため）または過剰なＭＩＰ−１αまたはＭＩＰ−１β（１μｇ／ｍｌ、非特異的結合のため）のいずれかを含む対照ウェルを使用して、それぞれの化合物の組の総阻害割合を計算した。ＣＬＩＰプレートを試験した後、４０％以上の阻害を示すウェルを確認した。確認した場合、ＣＬＩＰの個々の化合物について反応性を試験した（デコンボリューション工程）。ＩＣ_５０値は受容体への標識ＭＩＰ−１αの結合を５０％まで減少させるために必要な濃度である。

カルシウム動員
細胞内ストアのカルシウムの放出を検出するために、培養した細胞は３μＭのＩＮＤＯ−１ＡＭ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ；Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と共に室温で４５分間、細胞培地中でインキュベートし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。ＩＮＤＯ−１ＡＭ負荷後、細胞はフラックスバッファー（ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）および１％ ＦＢＳ）に再懸濁した。カルシウム動員はＰｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ分光光度計（Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を使用して、３５０ｎｍでの励起ならびに４００ｎｍおよび４９０ｎｍでの蛍光発光の二重同時記録により測定した。相対的細胞内カルシウムレベルは４００ｎｍ／４９０ｎｍ発光比として表した。実験は、３７℃で、フラックスバッファー２ｍｌ中にそれぞれ１０^６細胞を含むキュベット中で絶えず混合しながら行った。ケモカインリガンドは１〜１００ｎＭの範囲にわたり使用してもよい。発光比は時間（一般に２〜３分）に対してプロットした。リガンド遮断化合物候補（１０〜２０μＭ）は１０秒で添加し、続いてケモカイン（ＭＩＰ−１α；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を６０秒で、および対照ケモカイン（ブラジキニン；ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ、ＣＡ）を１５０秒で添加した。いくつかの実験では、リガンド遮断化合物候補および細胞は同時に添加し、ＭＩＰ−１αは４０秒後に添加した。

走化性アッセイ
走化性アッセイは、９６−ウェル走化性チャンバー（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で、５μｍポア ポリカーボネート、ポリビニルピロリドン−被覆フィルターを使用して行った。間質−由来因子（ＳＤＦ−１）は特異性対照として使用した。下部チャンバーは２９μｌの０．１ｎＭ ＭＩＰ−１αおよび種々の量の阻害剤を負荷し、頂上チャンバーは２０μｌ中に１００，０００ ＴＨＰ−１細胞を含有した。チャンバーは３７℃で１〜２時間インキュベートし、下部チャンバーの細胞数は、Ｃｙｑｕａｎｔアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、核酸含量を測定する蛍光色素法、および顕微鏡観察により定量した。

実施例２：ＭＩＰ−１αとＣＣＲ１の結合の阻害剤の同定
Ａ．アッセイ
受容体ＣＣＲ１とリガンドの結合を妨げる小有機分子を同定するために、細胞表面上に外来ＣＣＲ１を発現する細胞への放射活性リガンド（ＭＩＰ−１α）結合を検出するアッセイを使用した。化合物が結合を阻害する場合、競合的であろうとなかろうと、阻害されない対照に比較して、より少ない放射能計数が観察されることになる。

細胞表面上に構成的にヒトＣＣＲ１を発現するＮＳＯマウス骨髄腫細胞株（ＣＣＲ１−ＮＳＯ）およびヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）癌細胞株（ＣＣＲ１−２９３）を構築し；これらの細胞はＭＩＰ−１αを結合する別のケモカイン受容体を欠如する。それぞれのプールが１０種の有機化合物候補を含有するＣＬＩＰプレート中のそれぞれのウェルに、等しい数の細胞を添加した。次に細胞を放射標識したＭＩＰ−１αと共にインキュベートした。結合していないリガンドは細胞を洗浄することにより除去し、結合したリガンドは放射能計数を定量することにより測定した。どんな有機化合物も含まずにインキュベートされた細胞が総計数を表し；非特異的結合は非標識リガンドおよび標識リガンドと細胞をインキュベートすることにより測定した。阻害割合は、方程式：
％阻害＝１−［（試料ｃｐｍ）−（非特異的ｃｐｍ）］／［（総ｃｐｍ）−（非特異的ｃｐｍ）］ｘ１００
により決定した。

Ｂ．ＣＣＲ１−ＮＳＯ細胞を使用して同定した化合物ライブラリー由来の阻害剤
試験化合物の第１の組では、正規化標準偏差は１９％であり；したがって、有意な阻害は３８％より大きいと決定し；４０％阻害が選択された閾値であった。試験した数のウェル中で、５８ウェルの内容物が４０％以上、ＭＩＰ−１α結合を阻害した。これらの５８ウェルの内容物はＣＬＩＰフォーマット中で再試験し、そこでは６つが結合を４０％以上阻害した。この結果は、６ウェルのそれぞれにおける１０化合物の内の少なくとも１つがＣＣＲ１へのＭＩＰ−１α結合を阻害することを示した。それぞれのウェルの１０化合物のうちのどれがＭＩＰ−１αとＣＣＲ１の結合を阻害するかを確定するために、アッセイでそれぞれの化合物の個々の阻害活性を試験することによりプールをデコンボリューションした。ある種の化合物は一緒に作用して結合を阻害することがあり、デコンボリューションアッセイは個々に化合物を試験するだけなので、組み合わせでは有効であるが単独では有効でない化合物はこの実験では見出されなかった。３種の化合物候補が同定された：

第２の組の化合物のスクリーニングでは、正規化標準偏差は１７％で、３４％以上の阻害活性が有意であることを示し；再度、４０％閾値を使用した。これらのＣＬＩＰでは３９ウェルが４０％以上の阻害を示した。ＣＬＩＰとして２回目にスクリーニングした場合、これらのウェルのうち１４が４０％以上リガンドを減少させた。化合物を個々に試験することにより、１３の阻害剤候補を同定した。

Ｃ．ＣＣＲ１−２９３細胞を使用して同定した化合物ライブラリー由来の阻害剤
より高レベルでＣＣＲ１を発現するＣＣＲ１−２９３細胞を使用することにより、ノイズ対シグナル比が改善され、正規化標準偏差は約１０％であった。第１の組の化合物のスクリーニングでは、初めのスクリーニングで４６ウェルが２０％以上のリガンド結合の阻害を示し、２回目のスクリーニングでＣＬＩＰフォーマット中の１０ウェルがリガンド結合を阻害した。個々に化合物を試験することにより、６種の候補を同定した：

ＣＣＲ１−２９３細胞を使用した第１の組の化合物のアッセイのように、第２の組の化合物のスクリーニングも、おそらくこれらの細胞の使用のためにより小さい正規化標準偏差を示した。初めの試験で結合を阻害した３５ＣＬＩＰウェルの内、８ウェルが確認された。化合物の個々の試験により３種の候補を同定した：

実施例３：用量応答曲線
ＣＣＲ１に対する候補化合物の親和性を確かめ、そのリガンド結合を阻害する能力を確認するために、１ｘ１０^−８〜１ｘ１０^−４Ｍまでの化合物の濃度範囲で阻害活性を滴定した。アッセイは、化合物の量が変化すること以外は本質的にＣＬＩＰスクリーニングと同様であり；細胞数およびリガンド濃度は一定に保った。実験時に市販されていた化合物だけを測定した。確認した２２の候補のうち、以下の１６種に対して用量応答実験を行った：
ＣＣＸ−３３４３、ＣＣＸ−１０５７、ＣＣＸ−１３０７、ＣＣＸ−１５１３、ＣＣＸ−２３８、ＣＣＸ−３３４５、ＣＣＸ−３４９３、ＣＣＸ−４４２５、ＣＣＸ−４４６２，ＣＣＸ−４６８２、ＣＣＸ−４６９、ＣＣＸ−５０６２、ＣＣＸ−５１１９、ＣＣＸ−５４１、ＣＣＸ−６０１９およびＣＣＸ−６５３０．
用量依存的様式でＭＩＰ−１α結合を阻害することができない試験化合物はＣＣＸ−２３８、ＣＣＸ−４４２５、およびＣＣＸ−４４６２であった。阻害活性を有する化合物は、表１に示すようにＣＣＲ１に対する親和性がさまざまであった。

化合物ＣＣＸ−５４１およびＣＣＸ−４６９は１μＭ以下の親和性を示した。化合物ＣＣＸ−５０６２、ＣＣＸ−３３４５、およびＣＣＸ−３３４３は阻害活性があったが、最高の試験濃度においてＭＩＰ−１α結合を完全に阻害することができず；それらの親和性はおよそ２μＭであると推定した。化合物ＣＣＸ−６０１９、ＣＣＸ−４６８２、ＣＣＸ−１３０７およびＣＣＸ−１０５７は阻害活性を示したにも関わらず、それらはＣＣＲ１に対して１８μＭ〜４５μＭまでの低い親和性を示した。ＣＣＲ１とＭＩＰ−１αリガンドの結合を阻害できる多くの化合物が同定されているが、ＣＣＸ−５４１およびＣＣＸ−４６９の２種だけが高い親和性を有した。他のより低い親和性のＭＩＰ−１α結合阻害化合物が同定されたが、阻害の性質が未知（競合的または非競合的）のため、これらの化合物がＲＡＮＴＥＳのような別のＣＣＲ１リガンドの結合阻害に、より効果的であるかどうかは明らかでなかった。

実施例４：ＣＣＲ１機能アッセイ
ＣＣＲ１は７回膜貫通型、Ｇ−蛋白質結合受容体である。そのような受容体の結合により誘発されるシグナリングカスケードの特徴は、細胞内ストアからのカルシウムイオンのパルス様放出である。カルシウム動員アッセイは、ＭＩＰ−１α阻害化合物候補がさらにＣＣＲ１シグナリングを阻害することができるかどうかを決定するために行われた。有用であるためには、明確にリガンド結合およびシグナリングを阻害できる候補化合物が所望された。

ＭＩＰ−１α結合に応答したカルシウムイオン放出は、遊離しているカルシウムイオンの存在において蛍光を発するが、キレート化カルシウムイオンの存在では発しない、細胞透過性ＩＮＤＯ−１ＡＭ指標物質を使用して測定した。ＣＣＲ１−２９３またはＴＨＰ−１細胞にＩＮＤＯ−１を負荷し、そしてＭＩＰ−１α添加に応答したカルシウム放出をアッセイした。特異性について制御するために、同様に７回膜貫通型受容体を介してシグナルを伝達する、第２の非−ＣＣＲ１結合ケモカインであるブラジキニンを添加した。化合物がなければ、ＭＩＰ−１α添加により蛍光シグナルのパルスが見られることになる。化合物がＣＣＲ１−ＭＩＰ−１αシグナリングを明確に阻害する場合、ＭＩＰ−１α添加ではシグナルパルスは見られないが、ブラジキニン添加によりパルスは観察されることになる。しかし、化合物が非特異的にシグナリングを阻害する場合、ＭＩＰ−１αおよびブラジキニンを両方添加してもパルスは見られないことになる。

表２に示すように、選択された試験化合物ＣＣＸ−４６９、ＣＣＸ−５４１、ＣＣＸ−１５１３およびＣＣＸ−３４９３の中で、ＣＣＸ−４６９だけが有意に、そして特異的にＣＣＲ１のシグナリングを阻害することが可能であった。ＣＣＸ−５４１およびＣＣＸ−１５１３はカルシウムレベルに非特異的な作用を有し、そしてＣＣＸ−３４９３は、ＭＩＰ−１αまたはブラジキニンのいずれが誘発してもシグナリングに影響を与えなかった。

実施例５（予言的）
ケモカインの主要な機能の１つは、病原体侵入部位にＷＢＣを引き寄せる能力である。カルシウム動員により決定されるように、化合物がＭＩＰ−１α結合およびＣＣＲ１シグナリングを阻害するだけでなく、ＣＣＲ１機能も阻害することを確かめるために、走化性アッセイを使用する。単球に類似するＴＨＰ−１骨髄単球性白血病細胞は、ＭＩＰ−１αによる化学誘引の標的として使用する。ＴＨＰ−１細胞はマイクロウェル移動チャンバーのトップコンパートメントに置くが、ＭＩＰ−１αおよび増大する濃度の化合物は下部チャンバーに負荷する。阻害剤の非存在下では、ＴＨＰ−１細胞はＭＩＰ−１αケモカインに反応して下部チャンバーに移動し；化合物がＣＣＲ１機能を阻害する場合、ＴＨＰ−１細胞の大部分は上部チャンバーにとどまる。

本発明の多くの変動は、上記の詳細な説明から当業者には明らかであろう。そのような明らかな変動は、添付の特許請求の範囲に完全に意図された範囲内である。

Claims (9)

1. 薬剤的に受容できるキャリアおよび式（１）：
   

   

   （式中、ｎは０、１、または２であり；
   Yは酸素または硫黄であり；
   Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^３はそれぞれ独立して水素、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ハロアルキルまたはニトロである）
   の化合物を含む組成物。
2. 化合物（３）が式（２）：
   

   

   （式中、ｎは０、１、または２であり；
   Yは酸素または硫黄であり；そして
   Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^３はそれぞれ独立して水素、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ハロアルキルまたはニトロである）の化合物である、請求項１に記載の組成物。
3. Ｒ^１およびＲ^２が水素である、請求項１に記載の組成物。
4. Ｒ^３がハロゲンである、請求項１に記載の化合物。
5. Ｒ^３が塩素またはフッ素である、請求項４に記載の化合物。
6. Ｒ^３が水素である、請求項１に記載の化合物。
7. 薬剤的に受容できるキャリアおよび化合物（１）：
   

   

   を含む組成物。
8. ＣＣＲ１受容体へのＭＩＰ−１αまたはＲＡＮＴＥＳであるケモカインの結合を阻害するための方法であって、ＣＣＲ１受容体へのケモカインの結合を阻害するのに十分な時間、ＣＣＲ１受容体を発現する細胞と請求項１または２に記載の組成物を接触させることを含む前記方法。
9. 炎症性疾患を治療するのに十分な時間、請求項１または２に記載の組成物の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、炎症性疾患を治療する方法。