KR101145693B1 - Ｈｍ74의 옥시데카하이드로나프탈렌 조절제 - Google Patents

Ｈｍ74의 옥시데카하이드로나프탈렌 조절제 Download PDF

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Abstract

HM74를 발현하는 숙주 세포를 이용하여 다음 화학식 I의 효능제 활성이 있는 옥시데칼린형 분자를 얻을 수 있다:
화학식 I
Figure 112009064099731-pct00016
옥시데카하이드로나프탈렌 조절제, HM74, 염증, GPCR, 혈관확장

Description

ＨＭ74의 옥시데카하이드로나프탈렌 조절제{Oxydecahydronaphthalene modulators of HM74}
G 단백질-결합된 수용체 (GPCR)는 세포 신호 전달에 관여하는 내재성 막 단백질(integral membrane proteins)이다. GPCR는 신경전달물질, 호르몬, 방향제(odorant) 및 빛 등을 포함하는 다양한 세포외적 신호에 반응하고, 세포내에서 2차 메신저 반응을 개시할 수 있도록 신호를 변환시킬 수 있다. 많은 치료용 약물이 GPCR를 표적으로 하는데, 그 이유는 이들 수용체가 염증, 혈관확장, 심박동수, 기관지확장(broncholdilation), 내분비물 분비 및 연동운동을 포함하는 다양한 생리학적 반응을 중재하기 때문이다.
천식, 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 건선, 그리고 류마티스 관절염(RA)과 같은 질환이 일반적으로 T 헬퍼 세포, 단핵세포-대식세포 및 호산구가 관여하는 염증성 병인을 가지는 것으로 보여진다. 코르티코스테로이드를 이용하는 현행 항-염증 치료법은 천식에는 효과가 있지만 대사적 부작용 및 내분비 부작용과 연관되어 있다. 폐 또는 비강 점막을 통하여 흡수될 수 있는 흡입형 제형에서도 동일한 가능성이 있다. RA 또는 COPD에 만족스런 경구 치료법은 없다.
사람 단핵세포로부터 HM74를 분자 클로닝하여 HM74는 케모킨 수용체(Nomura et al., Int. Immunol. (1993) 5(10):1239-1249)라고 예측하였다. HM74는 골수, 비장, 편도선, 및 기관에서 주로 발현된다.
사람 세포에도, 관련은 있으나 별개인 수용체 HM74A가 포함되어 있다. HM74 및 HM74A의 아미노산 서열은 약 95% 상동하다. 그러나, HM74A의 리간드는 공지되어 있지만, HM74의 리간드는 공지되어 있지 않다. 니아신 또는 니코틴산은 HM74A 리간드이다(Wise 등, J. Biol. Chem. 278:9869-9874, 2003). 그러나, 니아신은 HM74의 불량한 활성화 물질이다.
마우스 게놈에는 HM74A 유전자가 포함되어 있지만 HM74 유전자는 포함되어 있지 않다.
이와 같은 상황하에서, HM74 및 HM74A는 공동-조절을 설명한다. Taqman-PCR을 이용하여, 출원인은 HM74 및 HM74A 발현이 과립세포 중의 TNFα에 의해 50배 유도되었고, 단핵세포에 LPS 또는 TNFα에 의해 10-20배 유도되었다는 것을 밝혀내었다. 또한, HM74 및 HM74 발현은 사람의 정상적인 기관지 상피세포에서 천식의 병인에 중요한 것으로 알려진 TH2 사이토킨, IL-4 또는 IL-13에 의해서도 4-5배 유도된다. HM74 및 HM74A 발현은 사람의 1차 호산구에서 IL-5에 의해 상향 조절된다. 마지막으로, 쥐 천식 실험 모델에서 폐 HM74A 발현이 상향 조절된다.
HM74 및 HM74A의 제한된 조직 분포 및 이의 조절로 천식, COPD 및 RA와 같은 염증성 과정에서의 HM74 및 HM74A 역할을 제시한다.
질병 내에 GPCR의 역할에 있어, GPCR의 활성을 조절하여 질병을 치료할 수 있다면, GPCR 리간드들의 동정 및 특징화에 의해 GPCR의 활성이 관여하는 질병 상태를 치료하는 신규한 조성물 및 방법을 개발할 수 있을 것이다. 본 발명은 HM74에 작용하는 분자를 확인하고, 특징을 조사하여 관련 질환을 확인 및 치료하는데 이용할 수 있는 조성물 및 방법을 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 HM74를 활성화시키지만 HM74A는 활성화시키지 않는 분자에 관계한다.
본 발명의 또 다른 한 측면에서, HM74의 조절제를 확인하는 방법을 설명한다. 예를 들면, 목적하는 방법은, 화학적 잔기를 제공하고, HM74를 발현하는 세포를 제공하고, 화학적 잔기가 HM74의 신호화 활성을 조절하는지의 여부를 측정(이때 이와 같은 조절이 본 발명의 효능제(agonist) 존재 또는 부재하에서 일어나는 지를 확인하는 것도 포함된다)하는 단계를 포함한다. 관련 측면에서, 화학적 잔기에는 펩티드, 항체, 효능제, 역효능제 및 길항제가 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 또한, 다른 조절제를 확인하기 위해 경쟁 분석법(competition assay)에서 공지의 조절제가 이용될 수 있다.
융합된 환 디하이드로피란(옥시데카하이드로나프탈렌 및 옥시데칼린으로서도 공지됨)이 HM74를 활성화시킨다. 이들 화합물들이 HM74를 발현하는 세포, 가령, CHO 세포, 293 세포, L1.2 세포에서 선택적 투여량-반응성 칼슘 이동을 유발한다.
관심 대상의 옥시데칼린은 다음과 같은 화학식의 화합물이다:
Figure 112006058979233-pct00001
상기 식에서,
X는 O, NR2 또는 S이고;
R1은 C1-C18 알킬(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 치환될 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C1-C18 알케닐(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 치환될 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C1-C18 알키닐(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 치환될 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C3-C18 아릴(이는 측쇄를 함유할 수 있거나 브릿지를 함유할 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 치환될 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C5-C18 사이클로알킬(이는 측쇄를 함유할 수 있거나 브릿지를 함유할 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 치환될 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); 또는 이들의 조합이고;
R2는 R1 기이거나 (C1-C10) 알킬-(C3-C10) 사이클로알킬(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 치환될 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다)이거나; X와 R2는 환을 형성할 수 있고;
R3은 H 또는 R1이며;
Y는 카보닐, 시프 염기(Schiff base), 옥신, 케탈, 아세탈, 옥사졸리딘, 티아졸리딘 또는 에놀 에스테르이다.
이들 관심대상 화합물들은 일반적으로 효능제들이다. 따라서, 이들 관심대상 화합물들은 약물 후보물질로 개발될 수 있다. 관심대상 화합물들은 또한 예를 들면, 경쟁 분석법을 통하여 HM74를 조절하는 다른 분자를 확인하는데 이용될 수도 있다.
본 발명의 또 다른 측면에는 치료요법적 조성물이 포함되는데, 이와 같은 조성물에는 핵산, 항체, 폴리펩티드, 효능제, 역효능제, 길항제가 포함된다. 또한, 본 발명의 방법에는 이와 같은 치료요법적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 질병을 치료하고, HM74 신호화 활성을 조절하는 것도 포함된다.
이와 같은 본원 발명의 특징 및 다른 특징들은 다음의 상세한 설명과 첨부된 도면을 통하여 명백해질 것이다. 또한, 다양한 문헌에서 특정 과정 및 조성물을 좀더 상세하게 설명한다. 이들 각 문헌은 참고문헌으로 본원에 인용한다.
본 발명은 HM74를 활성화시키는 분자의 발견에 근거한다.
HM74 암호화 서열은 공지되어 있다(Nomura 등, 상기참고). HM74를 수득하고, 제조하고, 이용하는 방법들도 본원에 제공되어 있다. HM74의 공지된 기능적 활성이 악영향을 받지 않는 한, HM74 암호화 서열 및 아미노산 서열의 변화는 용인된다.
본 발명의 화합물은 HM74를 조절하고, HM74의 효능제이며, 따라서, 천식과 같은 염증을 특징으로 하는 질환의 약물 후보물질이 된다.
본 발명의 화합물은 HM74 길항제를 스크리닝하는데 이용할 수도 있다. 예를 들면, HM74를 발현하는 세포를 시험 화합물에 노출시키고, 그 다음 본 발명의 효능제에 노출시킨다. 그 다음, 예컨대 칼슘 이동에 대한 시험 화합물의 효과를 확인하여 시험 화합물이 본원 발명의 효능제에 의해 유도된 칼슘 이동 수준을 감소시켰는지의 여부를 결정한다.
예를 들면, 효능제 및 역효능제를 확인하는 다른 검사방법도 본 발명의 범위 내에 속한다.
관심의 대상인 옥시데칼린은 다음과 같은 구조를 가진다:
Figure 112006058979233-pct00002
상기 식에서,
X는 O, NR2 또는 S이고;
R1은 C1-C18 알킬(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 치환될 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C1-C18 알케닐(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 치환될 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C1-C18 알키닐(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 치환될 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C3-C18 아릴(이는 측쇄를 함유할 수 있거나 브릿지를 함유할 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 치환될 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C5-C18 사이클로알킬(이는 측쇄를 함유할 수 있거나 브릿지를 함유할 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 치환될 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); 또는 이들의 조합이고;
R2는 R1 기이거나 (C1-C10) 알킬-(C3-C10) 사이클로알킬(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 치환될 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다)이거나; X와 R2는 환을 형성할 수 있고;
R3은 H 또는 R1이며;
Y는 카보닐, 시프 염기, 옥신, 케탈, 아세탈, 옥사졸리딘, 티아졸리딘 또는 에놀 에스테르이다.
관심대상 화합물들은 일반적으로 효능제들이다. 따라서, 이들 관심대상 화합물들은 약물 후보 물질로 개발될 수 있다. 이들 관심대상 화합물들은 또한 예를 들면, 경쟁 분석법을 통하여 HM74를 조절하는 다른 분자를 확인하는데 이용될 수도 있다.
"알킬"은 직쇄 또는 측쇄 탄화수소를 말한다. 대표적으로 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 3급-부틸, 2급-부틸, 펜틸 및 헥실이 있다. 탄화수소에는 한 개 또는 그 이상의 불포화 3중 결합이 포함될 수도 있다.
"알콕시"는 산소 원자에 결합된 알킬기를 말한다. 예를 들면, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시 및 펜톡시가 있다.
"아릴"은 방향족 탄화수소인 환이다. 예로는 페닐 및 나프틸이 포함된다.
"헤테로원자"는 일반적으로 분자를 특징짓는 원자들과는 상이한 원자를 말한다. 따라서, 탄화수소의 경우에는 탄소 또는 수소가 아닌 원자는 헤테로원자가 된다. 통상 생물학적으로 수용가능한 헤테로원자에는 산소, 황, 질소등이 포함된다.
"헤테로아릴"은 한 개 또는 그 이상의 탄소원자가 헤테로원자로 대체된 아릴기를 말한다. 예를 들면, 피리딜, 이미다졸일, 피롤일, 티에닐, 퓨릴, 피라닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 인돌릴, 퀴놀릴, 나프티리딜, 및 이소옥사졸릴이 있다.
"측쇄형"은 하나 또는 그 이상의 부위에 한 개 또는 그 이상의 측쇄를 갖는 구조를 말한다. 가지는 상기에서 정의한 R기 또는 다른 측쇄가 될 수 있다.
"사이클로알킬"은 환형 탄화수소를 말한다. 일부 예로는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 및 사이클로헥실이 있다. 다양한 길이의 브릿지가 포함될 수도 있다.
"헤테로사이클"은 한 개 또는 그 이상의 탄소원자들이 헤테로원자로 대체된 사이클로알킬을 말한다. 예를 들면, 피롤리디닐, 피레리디닐, 및 피레라지닐이 있다.
"헤테로알킬"은 한 개 또는 그 이상의 탄소원자가 헤테로원자로 대체된 알킬을 말한다. 에테르도 헤테로알킬이다.
"치환된"이란 기본적인 유기 라디칼이 한 개 또는 그 이상의 치환체를 가지는 것을 의미한다. 따라서, 원자 또는 기는 분자에서 또 다른 원자 또는 기로 대체된다. 대표적인 치환체에는 할로겐, C1-C8 알킬, -CN, 알콕실, 하이드록실, 황화물, 황산염, 설폰아미드, 아민, 아미드, 알코올, 케토기, C6-C18 아릴, 할로겐화된 C1-C18 알킬, 아질산염기 또는 질산염기가 포함된다.
"할로겐"은 예를 들면, 염소, 불소 또는 브롬이다.
"알케닐"은 한 개 또는 그 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 탄화수소이다. 탄화수소는 측쇄형이 될 수도 있다.
"환"이란 한 개의 환, 복수의 환 구조중 한 개의 환, 또는 복수의 환 구조를 말하는데, 이때 복수개의 환 중 두 개 또는 그 이상은 융합될 수 있으며, 복수개의 환 중 하나 또는 그 이상은 방향족환이 되거나, 헤테로원자를 포함하거나 치환되거나 또는 이들이 조합된 구조가 될 수도 있다. 환은 이중환 또는 다중환이 될 수도 있다. 환에는 다양한 길이의 브릿지가 포함될 수 있다.
"측쇄"는 다른 구조에 부착된 원자 또는 분자를 의미한다. 따라서, 측쇄는 상기 정의한 R기, 알킬, 아릴, 사이클로알킬 등이 될 수 있다.
"브릿지"는 두 개 구조간의 연결기를 말한다. 예를 들면, 알킬, 알케닐 등의 비-환형 탄화수소(헤테로원자를 포함하거나 치환되거나, 측쇄를 가지거나 이의 조합된 형태일 수 있음)는 아릴 또는 사이클로알킬기와 같은 두 개의 환형 탄화수소를 연결할 수 있다. 브릿지는 또한 환형 구조의 적어도 두 개 원자를 연결하는 환형 구조내에 포함될 수도 있다. 분자내 브릿지에는 0, 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 원자가 포함될 수도 있다. 분자내 브릿지는 선형, 측쇄형이 될 수도 있고, 치환체를 포함할 수도 있다.
관심의 대상인 화합물에는 생체-이용성을 강화시키기 위해 프로드럭(prodrug)을 형성하도록 유도화될 수 있는 관능기가 포함된다. 따라서, 본 발명은 투여후에 대사되어 생활성 형으로 되는, 관심대상인 다양한 활성 화합물의 변형체를 고려한다. 이와 같은 생활성 약물 전구물질들은 생체가역적 담체, 잠재성 약물(latent drug), 약물 운반 시스템 또는 프로드럭으로도 알려져 있다. ("Bioreversible Carriers in Drug Design" E.B. Roche, ed., Pergamon, NY, 1987; "Prodrugs as Novel Drug Delivery Systems," Higuchi & Stella, eds., American Chemical Society, DC, 1975).
약물의 화학적 변형은 약물역동학의 특정 면을 다루기 위한 것으로 예를 들면, 지질 장벽을 통과해야 하는 극성 화합물의 이용성을 어떻게 강화시키는지, 생체내에서 일반적으로 분해되기 쉬운 화합물을 어떻게 안정화시키는지 등을 다루기 위한 것이다.
프로드럭을 만드는 다른 이유로는 생활성 약물의 독성, 특이성 결여, 불안정성, 흡수 부위에서의 대사, 너무 빠른 흡수, 환자의 적응성, 가령, 맛이 없거나 주사 부위의 통증, 의사가 수용하기 힘들거나 또는 제형화의 문제 등이 포함된다.
통상의 변형으로는 에스테르화반응이 있으나, 카르복실기의 유도체화에 국한시키지는 않는다. 화학은 이와 같은 유도체, 예를 들면 아민, 이민, 황 함유 치환체 및 아미드를 만들기 위해 존재한다.
에스테르의 경우에 다양한 치환제가 추가될 수 있는데, 예를 들면, 치환될 수 있는 무측쇄형, 환형 또는 측쇄형 탄화수소가 여기에 포함될 수도 있고, 한 개 또는 그 이상의 이중결합 또는 삼중결합이 포함될 수 있고, 환형 구조를 포함할 수도 있고, 탄화수소 기본구조에는 질소, 황 또는 산소 등과 같은 하나 또는 그 이상의 헤테로원자를 포함할 수도 있다.
에스테르를 구성하는 R기를 고려할 때, 고려해야 할 또 다른 인자는 효소 분해에 대한 민감성이다. 따라서, 생체이용성에는 입체적 전하 및 배열형태 요인들이 결정적일 수 있다. 예를 들면, 측쇄형 알킬기는 에스테라제 활성 부위로 접근에 대한 입체적 방해가 될 수 있어 가수분해 속도를 지연시킨다. 생체이용성이 지연되는 것은 바람직하지 않으며 또는 생체이용성이 연장되는 것은 바람직하다.
다른 환경에서, 약물의 수성 용해도를 강화시키는 것은 바람직하다. 이와 같은 목적을 달성하는 치환체의 예로는 숙시네이트, 설페이트, 헤미숙시네이트, 포스페이트, 아미노산, 아세테이트, 아민 등이 포함된다.
아미드, 이미드, 카보네이트, 하이드란토인 등의 질소들을 유도체화할 수 있다. 질소에 반응하는데 적절한 기로는 하이드록시메틸기 또는 하이드록시알킬기가 일반적이고, 아실옥시알킬기 및 아실기도 포함된다.
카보닐기는 유도화 부위가 된다. 유도체의 예로는 시프 염기, 옥신, 케탈, 아세탈, 옥사졸리딘, 티아졸리딘 및 에놀 에스테르 등이 있다.
상기 논의된 유도체는 약물과 치환체의 공유결합으로 구성되는데, 치환체가 약물에 다른 방법, 예를 들면 수소결합, 반데르발스힘(van der Waals forces), 정전기력, 소수성 상호작용 등에 의해 부착될 수 있다.
유도화반응의 또 다른 수단은 비효소적 기작을 이용하여 프로드럭로부터 제거된 치환체를 이용하는 것이다. 예를 들면, (2-옥소-1,3-디옥솔-4-일) 메틸 에스테르, 만니히(Mannich) 염기, 옥사졸리딘, 분자내 가수분해를 촉매하는 기본 측쇄를 가진 에스테르, 분자내 친핵성 환화-제거 반응을 하는 에스테르 또는 아미드를 가지는 프로드럭이 포함된다. 환화반응 기전은 페놀, 알코올, 및 아민을 함유하는 약물에 이용할 수 있다("Prodrug Design" Testa & Mayer in "Encyclopedia of Pharmaceutical Technology," 2nd ed. V. 3, Swarbrick & Boylan, eds., Marcel Dekker, 2002).
따라서, 본 발명은 HM74 활성을 조절하는 화합물을 얻기 위해 일단 투여된 후에 반응하거나 또는 생체에서 작용하는 화합물을 생산하기 위한 공지의 합성 방법을 수행하여 관심대상 화합물의 추가 변형을 고려할 수 있다.
"등가의 아미노산 잔기"는 두 개 이상의 서열을 분석을 위해 정렬할 때, 아미노산들이 단백질 서열내에서 실질적으로 동일한 위치를 차지하는 것을 말한다. 본 발명의 바람직한 HM74 폴리펩티드는 야생형 HM74의 것과 충분히 동일한 아미노산 서열을 가진다. "야생형"의 의미는 국소적이든 범위가 더 넓든 간에 정의한 집단에 존재하는 가장 흔한 형태 또는 대립형을 의미한다. "충분히 동일한"는 제2아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에 대해 동일한 또는 등가의(유사한 측쇄를 가지는) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 충분한 또는 최소의 숫자로 포함하는 제1아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 말하는데, 제1 및 제2아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 공통의 구조 도메인 또는 공통의 기능적 활성을 가진다. 예를 들면, HM74 활성과 최소 96% 상동성을 가지는 공통의 구조 도메인을 포함하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 충분히 동일한 것으로 정의할 수 있다.
여기에서 호환적으로 이용되는 것으로써, "HM74 활성," "HM74의 생물학적 활성" 또는 "HM74의 기능적 활성"는 표준 기술에 의해 생체내 또는 시험관 내에서 측정하였을 때, HM74를 발현하는 세포상에서 HM74 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산 분자에 의해 발휘되는 활성을 말한다. HM74 활성은 제2단백질에 대한 효소활성 또는 연합과 같은 직접 활성과 제2단백질과 HM74의 상호작용에 의해 중개되는 세포 신호화 활성과 같은 간접활성이 될 수 있다. 바람직한 양태에서, HM74 활성에는 다음의 활성 중 적어도 한 개 또는 그 이상의 활성이 포함된다; (i) HM74 신호 경로에서 단백질과 상호작용하는 능력; (ii) HM74 리간드와 상호작용하는 능력; (iii) 활성화되면 숙주 세포를 변경시키는 능력; (iv) 본 발명의 분자 결합에 대한 활성화; 그리고 (v) 세포내 표적 단백질과 상호작용하는 능력.
본 발명의 한 측면에는 세포에서 HM74 발현이 포함되는데, HM74가 활성화되었을 때 반응을 설명한다. 여기에서 사용된 것과 같이, "핵산 분자"는 DNA 분자 (가령, cDNA 또는 게놈DNA) 및 RNA 분자(가령, mRNA) 및, 핵산 유사체를 이용하여 생성된 DNA 또는 RNA 유사체 등이 포함된다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥이 될 수 있는데, 이중-가닥 DNA가 바람직하다.
"분리된" 핵산 분자란 핵산의 자연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 핵산 분자를 말한다. 바람직하게는 "분리된" 핵산은, 핵산이 유도된 유기체의 게놈 DNA에서 HM74를 암호화하는 핵산에 자연적으로 인접하는 서열(핵산의 5' 및 3' 단부에 위치하는 서열)이 없다. 분리된 HM74 핵산 분자에는 핵산이 유도된 세포의 게놈 DNA에서 오픈 리딩프레임 핵산 분자에 자연적으로 인접하는 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb 또는 0.1 kb 미만의 핵산 서열이 포함될 수 있다. 또한, "분리된" 핵산 분자 예를 들면, cDNA 분자는 재조합 기술에 의해 생산되는 경우에 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나 또는 화학적으로 합성되는 경우에 화학적 전구물질 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다.
본 발명의 핵산 분자, 예를 들면 HM74를 암호화하는 핵산 분자는 표준 분자 생물학 및 서열(Nomura 등, 상기참고)을 이용하여 분리할 수 있다. HM74 서열의 전부 또는 일부를 이용하여, 표준 하이브리드화 및 클로닝 기술에 따라 HM74 핵산 분자를 분리할 수도 있다(예를 들면, Sambrook 등, eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989에 기술됨).
본 발명의 핵산 분자는 표준 PCR 증폭 기술에 따라 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머와, 주형으로서 cDNA, mRNA 또는 게놈 DNA를 이용하여 증폭시킬 수 있다. 이와 같이 증폭된 핵산을 적절한 벡터에 클로닝하여 DNA 서열 분석으로 특징을 조사할 수도 있다. 또한, HM74 뉴클레오티드 서열에 상응하는 올리고뉴클레오티드는 표준 합성 기술에 의해 예컨대 자동화 DNA 합성기를 이용하여 제조할 수도 있다.
또한, 본 발명의 핵산 분자는 HM74를 암호화하는 핵산 서열의 일부, 예를 들면, 리간드가 결합되는 경우에 감지가능한 세포내 사건을 만드는 세포외 도메인 및/또는 세포내 도메인을 암호화하는 단편만으로 구성될 수 있다. 바람직하게는 감지가능한 세포내 사건은 정상적인 숙주 세포내에서 HM74가 활성화될 때 관찰되는 것이다.
HM74 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 HM74의 부분을 분리시키고, HM74 단백질의 암호화된 부분을 발현하고(시험관내 재조합 발현을 통하여), HM74의 암호화된 부분의 활성을 평가함으로써 "HM74의 생물학적으로 활성 부분"을 암호화하는 핵산 단편을 준비할 수 있다.
또한, 본 발명은, 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여, 설명된 HM 74의 뉴클레오티드 서열과 상이하지만, 전술한 바와 같이 실질적으로 동일한 HM74 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다.
HM74의 아미노산 서열에 변화를 유도하는 DNA 서열의 다형성이 집단(가령, 사람 집단)내에 존재할 수 있다는 것을 당분야의 숙련자는 인지할 것이다. HM74 암호화 서열에 이와 같은 유전학적 다형성은 자연 대립형질 변이로 인하여 집단내에 개인간에도 존재할 수 있다. 대립형질은 주어진 유전자 위치에서 대안적으로 발생되는 유전자 군중에 하나이다. 여기에서 사용된 것과 같이, "유전자" 및 "재조합 유전자"는 HM74 단백질, 바람직하게는 포유류 HM74 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산 분자를 말한다. 여기에서 사용된 것과 같이, "대립형질변이체(allelic variant)"는 HM74 위치에서 발생할 수 있는 뉴클레오티드 서열 또는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 말한다. 대안적인 대립형질은 다수의 다른 개체간에 관심대상 유전자를 서열화함으로써 확인할 수도 있다. 그것은 다양한 개체에서 동일한 유전적 위치를 확인하기 위해 하이브리드화 프로브를 이용하면 바로 확인할 수 있다. 이와 같은 뉴클레오티드의 임의적인 그리고 모든 변이 및 이로 인한 HM74에서의 아미노산 다형성 또는 변이는, 자연 대립형질 변이의 결과이며 HM74의 기능적 활성을 변경시키지 않는 것으로 본 발명의 범위내에 속한다.
또한, 사람의 HM74와는 상이한 뉴클레오티드 서열을 가지나, 실질적으로 동일한 활성을 가지는 다른 종(HM74 상동체)에서 얻은 HM74 단백질을 암호화하는 핵산 분자도 본 발명의 범위내에 속한다. 본 발명의 HM74 cDNA의 자연 대립형질 변이 및 상동체에 상응하는 핵산 분자는 엄격한 하이브리드화 조건하에서 표준 하이브리드화 기술에 따라 하이브리드화 프로브로서 사람 cDNA 또는 이의 일부분을 이용하여 여기에서 설명한 사람 HM74 핵산과의 상동성에 근거하여 분리할 수 있다.
여기에서 사용된 것과 같이, "엄격한 조건하에 하이브리드화하는"은 하이브리드화 조건 및 뉴클레오티드 서열이 일반적으로 하이브리드화된 상태를 유지하면서 세척하는 조건을 말한다. 이와 같은 엄격한 조건은 당분야의 숙련자에게 공지된 것으로, 문헌("Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.)에서 찾아볼 수 있다. 엄격한 하이브리드화 조건의 바람직한 비-제한적 예로는 약 45℃에서 6X 염화나트륨/구연산나트륨 (SSC)에서 하이브리드화 후에, 50-65℃에서 0.2 X SSC, 0.1% SDS로 1회 또는 그 이상으로 세척하는 것을 말한다. 바람직하게는 엄격한 조건하에서 HM74 서열 또는 이의 상보체에 하이브리드화하는 본 발명의 분리된 핵산 분자는 자연-발생 핵산 분자에 상응한다. 여기에서 이용된 것과 같이, "자연-발생" 핵산은 자연에서 생성될 수 있는(자연 단백질을 암호화하는) 뉴클레오티드 서열을 가지는 RNA 또는 DNA 분자를 말한다.
집단에 존재할 수 있는 HM74 서열의 자연 발생 대립형질 변이체에 추가하여, 당업자는 뉴클레오티드 서열 내에 돌연변이에 의한 변화를 도입시켜, HM74 단백질의 생물학적 활성을 실질적으로 변화시키지 않고 암호화된 HM74의 아미노산 서열의 변화를 유도할 수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다. 따라서, "비-필수"아미노산 잔기에 아미노산 치환을 유도할 수 있는 뉴클레오티드 치환을 할 수 있다. "비-필수"아미노산 잔기는 생물학적 활성의 실질적인 변화없이 HM74의 야생형 서열로부터 변경될 수 있는 잔기를 말한다. "필수" 아미노산 잔기는 실질적으로 생물학적 활성에 요구되는 것이다. 예를 들면, 다양한 종의 보존안되거나 또는 반-보존된 아미노산 잔기는 활성에 있어서 비-필수적인 것이고, 변화의 표적이 되기 쉽다. 또는, 다양한 종의 HM74 단백질에서 보존된 아미노산 잔기는 활성에 대해 필수적인 것으로 변화의 표적이 되어서는 안된다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기에 변화를 가지는 HM74 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 관계한다. 이와 같은 HM74 단백질은 공지의 아미노산 서열과는 상이하지만 생물학적 활성을 보유한다. 하나의 양태에서, 분리된 핵산 분자에는 공지의 HM74 아미노산 서열에 최소 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 포함된다.
공지의 HM74의 것과는 상이한 서열을 가지는 HM74 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자는, 암호화된 단백질 내로 한 개 또는 그 이상의 아미노산 치환, 추가 또는 결손을 도입하도록 하는 공지의 HM74의 뉴클레오티드 서열 속에 한 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 치환, 추가 또는 결손을 도입하여 생성될 수 있다.
부위-지시된(site-directed) 돌연변이 유발 및 PCR-중개한 돌연변이 유발과 같은 표준 기술을 이용하여 돌연변이를 도입시킬 수 있다. 바람직하게는 보존성 아미노산 치환은 한 개 또는 그 이상의 예측된 비-필수 아미노산 잔기에서 만든다. "보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기 패밀리는 당분야에 정의되어 있다. 패밀리에는 염기성 측쇄를 가지는 아미노산(가령, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 가지는 아미노산(예, 아스파르트산, 글루타민산), 전하를 띄지 않는 극성 측쇄를 가지는 아미노산(가령, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 가지는 아미노산(가령, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오틴, 트립토판), 베타-분지 측쇄를 가지는 아미노산(가령, 트레오닌, 발린, 이소루이신) 그리고 방향족 측쇄를 가지는 아미노산(가령, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘) 등이 포함된다. 따라서, HM74에 예상 비필수 아미노산은 바람직하게는 동일한 측쇄를 가지는 패밀리내에 또 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 또는 포화 돌연변이와 같이 HM74 암호화 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 돌연변이를 도입시킬 수 있는데, 생성된 돌연변이는 HM74 생물학적 활성에 대해 스크리닝하여 활성을 보유하는 돌연변이를 확인한다. 돌연변이 생성 후에, 암호화된 단백질을 재조합적으로 발현하고, 단백질의 활성을 결정할 수 있다.
목적하는 핵산을 만들기 위해 이용될 수 있는 변형 뉴클레오티드의 예로는 5-플로오르우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오드우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카복시하이드록시메틸)우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, β-D-갈락토실퀴에오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, β-D-만노실퀘오신, 5-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산, 와이부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필)우라실 및 2,6-디아미노퓨린이 포함된다.
HM74 기능에 영향을 주는 한 가지 방법은 HM74 발현에 영향을 주는 것이다. 따라서, HM74 mRNA 발현 수준을 다소 감소시키거나 증가시키기 위해 전사 수준을 조절할 수 있는데, 이는 세포 표면에서 HM74 발현 수준을 약간 증가 또는 감소시키게 되는 결과를 초래할 수도 있다. 이와 같은 조절이 가능하도록 하는 한 가지 방법은 예컨대 상동성 재조합에 의해 HM74 암호화 서열의 인접부분 게놈의 적절한 위치로 도입될 수 있는 조절가능한 프로모터를 사용하는 것이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 항-HM74 항체를 포함한다. 여기에서 사용된 바와 같은 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성있는 부분, 예를 들면, HM74와 같은 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부분을 포함하는 분자를 말한다. HM74에 특이적으로 결합하는 분자는 HM74에는 결합하나 시료, 가령 HM74를 자연적으로 포함하는 생물학적 시료에 있는 다른 분자들에는 실질적으로 결합하지 않는 분자이다. 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성 부분의 예를 들면 펩신과 같은 효소로 항체를 처리하면 생성될 수 있는 F(ab) 및 F(ab')2 단편이 포함된다. 본 발명은 HM74에 결합하는 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 제공한다. 여기에서 사용된 바와 같은 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"는 HM74의 특정 에피토프와 면역작용할 수 있는 항원 결합 부위의 클론 또는 한종류의 이디오타입(idiotype)을 포함하는 항체 분자들의 집단을 말한다. 따라서, 모노클로날 항체 조성물은 전형적으로 특정 HM74 단백질 에피토프에 대하여 단일 결합 친화력을 나타낸다.
당분야에는 다양한 다른 항원-결합 형태의 항체가 공지되어 있는데, 예를 들면, 단편, 키메라 항체, 재조합 항체, 사람화된 항체 등이 있다.
본 발명의 다른 측면에는 HM74(또는 이의 부분)을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터가 포함된다. 여기에서 사용되는 바의 "벡터"는 이에 연결된 다른 핵산을 운반시킬 능력이 있는 핵산 분자를 말하는 것이다. 벡터의 한가지 형태가 "플라스미드"인데 이는 추가 DNA 단편이 연결되는 원형의 이중 가닥의 DNA 루프를 말한다. 벡터의 또 다른 한가지 형태는 바이러스성 벡터인데, 추가 DNA 단편이 바이러스 게놈안으로 연결되는 것이다. 특정 벡터들은 숙주 세포내에서 자가 복제할 수 있다(예를 들면 세균성 복제 오리진을 가지는 세균 벡터 및 에피좀성 포유류 벡터). 다른 벡터들(가령, 비-에피좀성 포유류 벡터)는 숙주 세포내로 도입시에 숙주 세포의 게놈에 통합되어, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터, 발현 벡터들은 작용을 할 수 있도록 연결되어 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 일반적으로 재조합 DNA 기술에서 발현 벡터의 이용성은 플라스미드(벡터) 형태가 된다. 그러나, 본 발명은 등가의 기능을 할 수 있는 바이러스 벡터들(예를 들면, 복제 결함성 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스)과 같은 다른 형태의 발현 벡터를 포함한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산을 발현하는데 적절한 형태의 본 발명의 핵산을 포함한다. 이는 재조합 발현 벡터에는 발현에 이용될 숙주 세포에 근거하여 선택된, 한 가지 이상의 조절 서열이 포함되어, 발현될 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있다는 것을 말한다. 재조합 발현 벡터내에서, "작동 가능하게 연결된"이란 (예를 들면, 벡터가 숙주 세포내로 도입되었을 때 숙주 세포 또는 시험시험관 전사/해독 시스템내에서) 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 관심대상인 뉴클레오티드 서열이 조절서열(들)에 연결되어 있다는 것을 의미한다. "조절 서열"이란 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소들(예를 들면, 폴리아데닐화 신호)을 포함한다는 의미가 된다. 이와 같은 조절 서열은 Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology Vol. 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)에서 설명하고 있다. 조절 서열에는 많은 숙주 세포형에서 뉴클레오티드 서열(예, 조직 특이적 조절 서열)의 구성적 발현을 지시하는 것들이 포함된다. 당업자들은, 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질 발현 수준 등의 인자들에 따라 발현 벡터의 고안이 달라질 수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 여기에서 설명하는 핵산에 의해 암호화되는 단백질 또는 펩티드(예를 들면, HM74, HM74의 돌연변이형, 융합 단백질 등)을 생산하기 위해 숙주 세포내로 도입될 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 진핵 또는 원핵 세포에서 HM74를 발현할 수 있도록 고안되는데, 예를 들면, 이. 콜리와 같은 세균 세포, 곤충 세포 (베큘로바이러스 발현 벡터 이용), 효모 세포 또는 포유류 세포 등이 된다. 적절한 숙주 세포는(참조: Goeddel, (상기참고))에서 설명하고 있다. 또는 재조합 발현 벡터를 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 폴리메라제를 이용하여 시험관 내(in vitro)에서 전사 및 해독할 수도 있다.
또 다른 태양에서, HM74 발현 벡터는 효모 발현 벡터가 된다. 에스. 세레비시에 (S. cerevisiae)와 같은 효모에서 발현에 사용되는 벡터에는 pYepSecl (Baldari et al., EMBO J. (1987) 6:229-234), pMFa (Kurjan et al., Cell (1982) 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., Gene (1987) 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) 및 pPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA)등이 포함된다.
또는, HM74는 베큘로바이러스 발현 벡터를 이용하여 곤충 세포에서 발현시킬 수 있다. 배양된 곤충세포(Sf9세포)에서 단백질 발현에 이용될 수 있는 베큘로바이러스 벡터는 pAc 시리즈 (Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156-2165) 및 pVL 시리즈 (Lucklow et　al., Virology (1989) 170:31-39)가 포함된다.
또 다른 태양에서, 본 발명의 핵산은 포유류 발현 벡터를 이용하여 포유류 세포에서 발현된다. 포유류 발현 벡터의 예로는 pCDM8 (Seed, Nature (1987) 329:840) 및 pMT2PC (Kaufman et al., EMBO J. (1987) 6:187-195)등이 있다. 포유류 세포에서 이용되는 경우에, 발현 벡터의 조절 기능은 흔히 바이러스 조절 요소들에 의해 제공된다. 예를 들면, 흔히 이용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스 및 원숭이 바이러스 40에서 유도할 수 있다. 진핵 및 원핵 세포 모두에 이용할 수 있는 다른 적절한 발현 시스템은 Sambrook 등, (상기 참고)의 16 및 17장을 참고하면 된다.
포유류 세포의 안정적인 형질전환을 위해서는 이용되는 발현 벡터 및 형질전환 기술에 따라, 세포의 일부 작은 분획만을 게놈내로 외부 DNA 에 결합시킬 수 있다. 통합체(integrant)를 확인하고 선택하기 위해서는 선택적 마커(marker)(예를 들면 항생제 저항성)를 암호화하는 유전자를 관심대상 유전자와 함께 숙주 세포내로 일반적으로 도입시킬 수 있다. 바람직한 선택적 마커에는 G418, 하이그로마이신, 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여하는 것들이 포함된다. 선택적 마커를 암호화하는 핵산을 HM74를 암호화하는 것과 동일한 벡터 상에서 숙주 세포 내로 도입시키거나 별도의 벡터 상에서 도입시킬 수도 있다. 도입된 핵산에 의해 안정적으로 형질감염된 세포는 약물 선별성을 이용하여 확인할 수 있는데, 예를 들면, 선별가능한 마커 유전자가 결합된 세포는 생존하게 되며, 그렇지 않은 다른 세포는 죽게 된다.
HM74에 관련되어 이를 활성화시키는 관심대상 화합물은 융합된 환을 가진 디하이드로피란이며, 이는 옥시데칼린형 화합물을 포함한다. 옥시데칼린은 옥시데카하이드로나프탈렌의 다른 이름이다. 이와 같은 디하이드로피란은 일반 구조를 가진다.
관심의 대상인 디하이드로피란 및 옥시데칼린은 U.S. 특허 6,399,653, WO 97/48691 및 von Roedern, Mol. Div. (1998) 3:253-256에서 교시된 것과 같이 제조할 수 있다.
관심의 대상인 옥시데칼린은 다음의 구조를 가진다:
Figure 112006058979233-pct00003
상기 식에서,
X는 O, NR2 또는 S이고;
R1은 C1-C18 알킬(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 치환될 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C1-C18 알케닐(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 치환될 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C1-C18 알키닐(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 치환될 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C3-C18 아릴(이는 측쇄를 함유할 수 있거나 브릿지를 함유할 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 치환될 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C5-C18 사이클로알킬(이는 측쇄를 함유할 수 있거나 브릿지를 함유할 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 치환될 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); 또는 이들의 조합이고;
R2는 R1 기이거나 (C1-C10) 알킬-(C3-C10) 사이클로알킬(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 치환될 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다)이거나; X와 R2는 환을 형성할 수 있고;
R3은 H 또는 R1이며;
Y는 카보닐, 시프 염기, 옥신, 케탈, 아세탈, 옥사졸리딘, 티아졸리딘 또는 에놀 에스테르이다.
관심대상 화합물들은 일반적으로 효능제들이다. 따라서, 이들 관심대상 화합물은 약물 후보물질로 개발될 수 있다. 관심대상 화합물은 또한 예를 들면, 경쟁 분석법을 통하여 HM74를 조절하는 다른 분자를 확인하는데 이용될 수도 있다.
바람직한 화합물은 R2가 메틸, 에틸, 또는 사이클로헥실인 경우, R1이 n-알킬 또는 C1-C4 측쇄형 알킬이 아니거나; 또는 R1이 아세틸기로 치환될 수 있는 C1-C4 측쇄형 알킬 또는 C1-C4 알코올인 경우, R1이 n-(C1-C8) 알킬, (C1-C4) 측쇄형 알킬 또는 티오 치환된 페닐이 아닌 화합물이다.
"알킬"은 직쇄 또는 측쇄 탄화수소를 말한다. 대표적인 예로 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 3급-부틸, 2급-부틸, 펜틸 및 헥실이 있다. 탄화수소에는 한 개 또는 그 이상의 불포화 3중 결합이 포함될 수도 있다.
"알콕시"는 산소원자에 결합된 알킬기를 말한다. 예를 들면, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시 및 펜톡시가 있다.
"아릴"은 방향족 탄화수소이다. 예로는 페닐 및 나프틸이 포함된다.
"헤테로원자"는 일반적으로 분자를 특징짓는 원자들과는 상이한 원자를 말한다. 따라서, 탄화수소의 경우에는 탄소 또는 수소가 아닌 원자가 헤테로원자이다. 통상 생물학적으로 허용되는 헤테로원자에는 산소, 황, 질소 등이 포함된다.
"헤테로아릴"은 하나 또는 그 이상의 탄소원자가 헤테로원자로 대체된 아릴기를 말한다. 예를 들면, 피리딜, 이미다졸릴, 피롤릴, 티에닐, 퓨릴, 피라닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 인돌릴, 퀴놀릴, 나프티리디닐, 및 이소옥사졸릴이 있다.
"사이클로알킬"은 환형 탄화수소를 말한다. 일부 예로는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 및 사이클로헥실이 있다.
"헤테로사이클"은 한 개 또는 그 이상의 탄소원자들이 헤테로원자로 대체된 사이클로알킬을 말한다. 예를 들면, 피롤리디닐, 피레리디닐, 및 피페라지닐이 있다.
"헤테로알킬"은 한 개 또는 그 이상의 탄소원자가 헤테로원자로 대체된 알킬을 말한다. 에테르도 헤테로알킬이 된다.
"치환된"이란 기본적인 유기 라디칼이 한 개 또는 그 이상의 치환체를 가지는 것을 의미한다. 따라서, 원자 또는 기는 분자에서 또 다른 원자 또는 기로 대체된다. 대표적인 치환체에는 할로겐, C1-C8 알킬, -CN, 알콕실, 하이드록실, 황화물, 황산염, 설폰아미드, 아민, 아미드, 알코올, 케토기, C6-C18 아릴, 할로겐화된 C1-C18 알킬, 아질산염기 또는 질산염기등이 포함된다.
"할로겐"은 예를 들면, 염소, 불소 또는 브롬이 된다.
"알케닐"은 하나 또는 그 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 탄화수소이다. 탄화수소는 측쇄형이 될 수도 있다.
"환"이란 한 개의 환, 복수의 환 구조중 한 개의 환, 또는 복수의 환 구조를 말하는데, 이때 복수개의 환 중 두 개 또는 그 이상은 융합될 수 있으며, 복수개의 환 중 하나 또는 그 이상은 방향족환이거나, 헤테로원자를 포함하거나 치환되거나 이들의 조합된 구조가 될 수도 있다. 환은 이중환 또는 다중환이 될 수도 있고, 환에는 다양한 길이의 브릿지가 포함될 수 있다.
관심대상 화합물은 HM74에 결합하여, HM74를 활성화시키지만, HM74A에 결합하지는 않는다.
관심대상 옥시데칼린은 U.S. 특허 6,399,653에서 설명하는 것과 같이 공지된 방법으로 합성할 수 있다.
본 발명의 옥시데칼린형 화합물은 투여에 적절한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 이와 같은 조성물은 전형적으로 활성 성분과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 여기에서 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 담체"는 약제학적 조성물과 양립할 수 있는 임의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제, 항진균제, 등장액 및 흡수 지연제 등을 포함한다는 의미가 된다. 약제학적 활성 물질에 이와 같은 매질 및 물질을 이용하는 것은 당분야에 잘 공지되어 있다. 활성 화합물과 임의 통상의 매질 또는 물질이 양립하지 않는 경우를 제외하고는, 조성물에 이들을 이용하는 것을 고려한다. 보충 활성 성분이 조성물에 포함될 수도 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 원하는 투여 경로에 적합해야 한다. 투여 경로를 예를 들면, 비경구적 경로 예를 들면, 정맥, 피내(intradermal), 피하, 구강(흡입), 경피(국소), 점막 및 직장 투여를 포함한다. 비경구적, 피내, 또는 피하 투여에 이용되는 용액 또는 현탁액에는 다음의 성분들이 포함될 수 있다: 주사용 물과 같은 멸균 희석제, 염용액, 비휘발성 오일(fixed oil), 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용액; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 중아황산염과 같은 항산화제; EDTA와 같은 킬레이트제; 아세테이트, 구연산염 또는 인산염과 같은 완충제, 및 염화나트륨 또는 덱스트로즈와 같은 등장성 조절용 물질. HCl 또는 NaOH와 같은 산 또는 염기를 이용하여 pH를 조절할 수 있다. 비경구 제형은 유리 또는 플라스틱으로 만든 앰플, 1회용 주사기 또는 다중 투여량 바이알에 담을 수 있다.
주사용으로 적절한 약제학적 조성물에는 멸균 주사용 용액 또는 분산액을 즉석에서 만들기 위한 멸균된 수용성 용액(물에 용해되는 경우) 또는 분산액 및 멸균된 분말이 포함된다. 정맥 투여 경우에, 적절한 담체에는 생리학적 염, 정균수(bacteriostatic water), 크레모포(Cremophor) EL
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(BASF; Parsippany, NJ) 또는 인산염-완충 염 (PBS)이 포함된다. 모든 경우에 조성물은 멸균되어야 하고, 주사를 용이하게 할 수 있도록 어느 정도 유동성을 가져야 한다. 조성물은 제조 및 보관 조건하에서 안정적이어야 하고, 세균 및 진균류와 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적절한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 매질이 될 수 있다. 레시틴과 같은 피복제를 이용하거나 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기를 유지시키고 계면활성제를 사용함으로써 적절한 유동성을 유지할 수도 있다. 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로잘 등의 다양한 항균제 및 항진균제에 의해 미생물의 작용을 예방할 수 있다. 많은 경우에, 예를 들어 자당, (만니톨, 솔비톨과 같은) 폴리알코올 또는 염화나트륨과 같은 등장성 물질을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 흡수를 연장시키기 위해서는 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 물질을 조성물에 포함시킬 수도 있다.
상기 나열한 성분들중 하나 또는 복합된 성분을 포함하는 적절한 용매에 요구량의 활성 화합물을 혼입시키고, 필요한 경우에 멸균 여과시키면 멸균된 주사용 용액을 만들 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본적인 분산 매질과 상기 나열된 성분중 요구되는 기타 성분들을 포함하는 멸균 비이클내로 활성 화합물을 혼입시켜 분산액을 만들 수 있다. 멸균된 주사용 용액의 제조에 사용되는 멸균된 분말의 경우에 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조로써 기존의 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 및 임의 추가된 원하는 성분의 분말을 얻을 수 있다.
경구 조성물에는 일반적으로 비활성 희석제 또는 식용 담체가 포함된다. 조성물은 젤라틴 캡슐에 담거나 정제로 압착시킬 수 있다. 경구용 치료제 투여를 목적으로 하는 경우에, 활성 화합물을 부형제와 혼입시켜, 정제, 트로치(troches) 또는 캡슐 형태로 이용할 수도 있다. 또한 경구용 조성물은 유체 담체를 이용하여 시럽 또는 액체 제형을 만들기 위해 또는 구강 세척제로 이용하기 위해 제조되며, 이때 유체 담체의 화합물을 구강으로 공급하고, 가글한 후 뱉아내거나 삼킬 수도 있다.
약제학적으로 사용가능한 결합제 및/또는 보조제 물질이 조성물의 일부로 포함될 수 있다. 정제, 알약, 캡슐, 트로치 등에는 유사한 특징을 가지는 다음의 성분 또는 화합물이 포함될 수 있다: 미세결정 셀롤로오즈, 검 트라가캔스(tragacanth) 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분 또는 락토즈와 같은 부형제, 알긴산, 프리모겔(Primogel) 또는 옥수수 전분과 같은 분해제; 스테아르산 마그네슘 또는 스테로트(Sterotes)와 같은 윤활제; 콜로이드성 이산화 실리콘과 같은 유동화제(glidant); 자당 또는 사카린과 같은 감미제; 페퍼민트, 메틸 살리실산염 또는 오렌지 향과 같은 방향제.
흡입에 의해 투여하는 경우에, 화합물은 이산화탄소와 같은 기체로 된 적절한 추진체를 포함하는 가압 용기 또는 분배기 또는 흡입기를 통하여 에어로졸 분무 형태로 제공될 수 있다.
전신 투여는 점막 또는 경피 수단을 이용할 수 있다. 점막 또는 경피 투여의 경우에, 침투해야 하는 장벽에 적절한 침투제를 제형에 이용한다. 일반적으로 적절한 침투제는 당분야에 공지되어 있는데, 예를 들면 경점막 투여의 경우 계면활성제, 담즙산 및 푸시딘산 유도체 등이 포함될 수 있다. 비강 스프레이 또는 좌약을 통하여 경점막 투여를 할 수 있다. 경피 투여의 경우에 활성 화합물을 당분야에 일반적으로 공지된 연고, 고약(salve), 겔 또는 크림 형태로 제형화할 수 있다.
화합물을 직장으로 운반하기 위해 좌약(가령, 코코아 버터 및 기타 글리세리드와 같은 통상의 좌약 기초물을 사용) 또는 보유(retention) 장관제 형태로 조제할 수도 있다.
하나의 태양에서, 활성 화합물이 신체로부터 신속하게 빠져 나가는 것에 대하여 화합물을 보호해주는 담체와 함께 제조될 수 있는데 예를 들면, 임플란트 및 미세캡슐형 운반 시스템을 포함하는 방출 제어 제형과 같이 제조된다. 생분해가능하고, 생체적합성 폴리머 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드리드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르소에스테르 및 폴리락트산과 같은 것들이 이용될 수 있다.
이와 같은 제형을 만드는 방법은 당업자에 명백할 것이다. 또한 재료는 알자 사(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼 사(Nova Pharmaceuticals, Inc.) 등에서 시판되는 것을 이용할 수 있다. 리포좀 현탁액(감염된 세포를 표적으로 하고, 단클론 항체를 포함하는 리포좀을 포함함)도 약제학적으로 허용가능한 담체로 이용할 수도 있다. 이와 같은 것들은 U.S.　특허　4,522,811에서 설명하는 것과 같이 당분야에 공지된 방법으로 제조할 수 있다.
투여 용이성 및 투약의 균일성을 위해 투약 단위 형으로 경구 또는 비경구 조성물을 조제하는 것이 특히 유익하다. 여기에서 이용된 투약 단위형은 치료를 받을 개체에 단위 투약하기에 적합한 물리적으로 별개의 단위를 말하는데, 이때 각 단위에는 요구되는 약제학적 담체와 함께 원하는 치료 효과를 얻기 위해 계산된 예정된 양의 활성 화합물을 포함한다. 질병의 종류와 중증도에 따라 활성 성분 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들면, 0.1 내지 20 mg/kg)를 환자에 투여하는 적절한 초기 투여량이 되며, 이때 이 양을 1회 또는 그 이상으로 별도 투여하거나 연속 주입할 수 있다. 전형적인 1일 투여량은 전술한 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상이 될 수도 있다. 상태에 따라, 수일 또는 그 이상 동안에 반복 투여하여 질병 증상이 원하는 정도로 감소될 때까지 치료를 지속한다. 그러나, 다른 투여량 섭생을 이용할 수도 있다. 치료 과정은 통상적인 기술 및 검사법을 이용하여 용이하게 모니터할 수 있다. WO　94/04188에는 예시적인 투약 섭생이 소개되어 있다. 본 발명의 투약 단위형 설계는 활성 화합물의 독특한 성질, 얻고자 하는 특정 치료요법적 효과, 개체 치료용 활성 화합물과 같은 화합물에서의 고유한 제한요소 등에 따라 직접적으로 영향을 받고, 지시된다.
약제학적 조성물은 투여용 지시사항이 함께 있는 용기, 팩 또는 분배기에 포함될 수 있다.
관심대상의 HM74 조절제를 치료 방법(치료 또는 예방) 및 스크리닝 검사에 이용할 수 있다. 관심대상의 HM74 조절제를 HM74 발현 또는 활성을 조절하는 다른 약물 또는 화합물을 스크리닝하는데 이용하거나 염증이 특징이 되는 질환 치료에 이용할 수 있다. 관심대상의 조절제들은 HM74 단백질의 불충분하거나 또는 과도한 생산으로 인한 이상에 이용되거나 또는 HM74 야생형 단백질과 비교하여 활성이 감소되거나 변종 활성을 가지는 HM74 단백질 생산으로 인한 이상(질환)에 사용할 수 있다. 본 발명은 또한 스크리닝 검사에 의해 확인된 신규한 HM74 조절제 및 전술한 치료를 위한 이의 용도도 포함한다.
본 발명은 조절제, 예를 들면 HM74에 결합하여 HM74 발현 또는 HM74 활성에 자극 또는 억제 효과를 주는 후보물질 또는 시험 화합물 또는 물질(가령, 펩티드, 펩티드모방물질, 소분자, 항체 또는 다른 약물)을 확인하는 방법("스크리닝 검사"라고도 함)을 제공한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 HM74에 결합하거나 그의 활성을 조절할 수 있는 후보물질 또는 시험 화합물을 스크리닝하는 검사법을 제공한다. 따라서, 스크리닝 검사는 HM74를 조절하는 다른 퓨로세미드형(furosemide-like) 및 옥시데칼린형 화합물을 확인하는데 이용할 수 있다. 이와 같은 조절제를 경쟁 분석법에 이용하여 HM74 길항제와 같은 다른 조절제를 확인할 수도 있다.
하나의 태양에서, 검사는 세포계 검사가 있는데, 이때 세포 표면에서 HM74의 막-결합형을 발현하는 세포를 시험 화합물과 접촉시키고, HM74를 활성화시키는 시험 화합물의 능력을 측정한다. 예를 들면, 세포는 효모 세포 또는 포유류 기원의 세포가 될 수 있다. HM74를 활성화시키는 시험 화합물의 능력은, 예를 들어, HM74와 복합체를 형성한 화합물 또는 HM74의 위치를 감지함으로써 시험 화합물이 HM74에 결합했음을 확인할 수 있게 하는 방사능 동위원소 또는 효소 표지화로 시험 화합물을 결합시킴으로써 측정할 수 있다. 예를 들면, 시험 화합물에 직간접적으로 125I, 35S, 14C 또는 3H로 표지화시키고 방사능 방출의 직접적 카운팅 또는 신틸레이션 카운팅으로 상기 방사능 동위원소를 감지한다. 또는, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스포타제 또는 루시페라제와 같은 효소로 시험 화합물에 효소 표지화시키고 적절한 기질이 생성물로 전환되는 것을 측정하여 효소 표지화를 감지할 수 있다. 바람직한 태양에서, 검사는 세포의 표면상에 HM74의 막결합형을 발현하는 세포를 HM74에 결합하는 것으로 공지된 화합물과 함께 시험 화합물에 접촉시키고, HM74와 상호작용하는데 있어, 공지의 화합물과 경쟁하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 것을 포함한다.
또 다른 태양에서, 검사는 세포계 검사로써, 세포의 표면상에 HM74의 막결합형을 발현하는 세포를 시험 화합물과 접촉시키고, 시험 화합물이 HM74의 활성을 조절(자극 또는 억제)하는 능력을 측정하는 것을 포함한다. HM74의 활성을 조절하는 시험 화합물의 능력은 예를 들어 시험 화합물이 HM74를 활성화 또는 억제시키는 능력을 측정하여 수행될 수 있다. 그것은 활성화된 HM74가 신호 경로와 연관된 세포내 또는 막 표적 분자와 상호작용하면 명백할 것이다. 여기에서 사용된 바와 같이, "표적 분자"는 자연상태에서 HM74가 결합하거나 상호작용하는 분자이며, 예를 들면, HM74를 발현하는 세포의 표면상의 분자, 제2세포 표면 상의 분자, 세포외 환경(extracellular milieu)에 있는 분자, 세포 막의 내부 표면과 연합된 분자 또는 세포질 분자 등이다. HM74 표적 분자는 비(非)-HM74 분자가 될 수도 있다. 하나의 태양에서, HM74 표적 분자는 세포막을 통하여 세포내로 세포외 신호(예를 들어, HM74에 화합물이 결합하여 생성된 신호)의 전달을 촉진시킬 수 있는 신호 전달 경로의 성분이다. 예를 들면, 표적은, HM74와 하류(downstream) 신호 생성 분자의 연합을 촉진하는 단백질 또는 촉매 활성을 가지는 제2의 세포내 단백질이 될 수도 있다.
HM74가 HM74 표적 분자에 결합하거나 상호작용하는 능력은 직접 결합을 측정하기 위한 상기 설명된 방법들 중 하나에 의해 실시할 수 있다. 바람직한 태양에서, HM74가 HM74 표적 분자에 결합하거나 상호작용하는 능력은 표적 분자의 활성을 측정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들면, 표적의 세포성 제2 메신저(예를 들면 세포내 Ca2+, 디아실글리세롤, IP3 등)의 유도를 감지하고, 적절한 기질상에 표적의 촉매적/효소적 활성을 감지하고, 리포터 유전자 유도(예를 들면 루시페라제와 같은 감지가능한 표지를 암호화하는 핵산에 작용가능하도록 연결된 HM74-반응성 조절 요소)를 감지하거나 세포 분화 또는 세포 증식과 같은 세포 반응을 감지함으로써 표적 분자의 활성을 측정할 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명의 검사는 무세포 검사법(cell-free assay)으로서, 이는 시험 화합물을 HM74에 접촉시키고, HM74에 결합하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 것을 포함한다. HM74에 시험 화합물이 결합되었는지는 상기에서 설명한 것과 같은 직접 또는 간접 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 바람직한 태양에서, 검사에는 시험 화합물 및 본 발명의 공지 화합물을 HM74에 접촉시키고, 여기에서 설명하는 공지 화합물의 HM74 활성에 영향을 주는 시험 화합물의 능력을 측정하는 것이 포함된다. HM74와 상호작용하는 시험 화합물의 능력은 여기에서 설명하고 있는 공지 화합물의 결합과 비교하였을 때 시험 화합물이 HM74에 우선적으로 결합하는 능력이 있는지를 측정하는 것을 포함한다.
또 다른 태양에서, 검사는 무세포 검사로써, 시험 화합물을 HM74와 접촉시키고, HM74의 활성을 조절(자극 또는 억제)하는 능력을 측정하는 것을 포함한다. HM74 활성을 조절하는 시험 화합물의 능력은, 예를 들어 직접 결합을 측정하기 위해 언급된 상기 방법 중 하나를 이용하여 HM74 표적 분자에 활성화된 HM74가 결합하는 능력을 측정하여 이루어질 수 있다. 대안적인 태양에서, HM74 활성을 조절하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 방법은 HM74 표적 분자를 추가 조절하는 HM74의 능력을 측정하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 적절한 기질상에서 표적 분자의 촉매/효소적 활성은 상기 설명한 것과 같이 측정될 수 있다.
또 다른 태양에서, 무세포 검사는 HM74에 결합하는 공지 화합물과 시험 화합물을 HM74에 접촉시키고, 시험 화합물이 HM74와 상호작용하는 능력을 측정하는데, 이때 HM74와 상호작용하는 시험 화합물의 능력을 측정하는 것은 HM74 표적 분자에 우선적으로 결합하여 이의 활성을 조절하는 능력이 있는지를 측정하는 것을 포함한다.
수용체는, 리간드 결합을 필수적으로 억제하지는 않지만 G 단백질 결합 또는 수용체 응집, 이량체화 또는 활성화시키는 클러스트링(clustering)이 가능하도록 수용체내의 구조 변화를 일으키는 비-리간드 분자에 의해 활성화될 수 있다.
본 발명의 무세포 검사는 HM74의 가용성 형태 및 막-결합된 형태에 이용될 수 있다. HM74의 막결합형을 포함하는 무세포 검사의 경우에 HM74의 막결합형이 용액에 유지되도록 하는 가용화제를 이용하는 것이 바람직할 수도 있다. 이와 같은 가용화제에는 비-이온성 계면활성제 예를 들면, n-옥틸글루코시드, n-도데실글루코시드, n-도데실말토시드, 옥타노일-N-메틸글루카미드, 데카노일-N-메틸글루카미드, 트리톤(Triton) X-100, 트리톤　X-114, 테시트(Thesit)
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, 이소트리데실폴리(에틸렌 글리콜 에테르)n, 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸아미노]-1-프로판 설포네이트(CHAPS), 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸아미노]-2-하이드록시-1-프로판 설포네이트(CHAPSO) 또는 N-도데실=N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판 설포네이트가 포함된다.
또 다른 태양에서, 숙주 세포에서 HM74가 발현될 때 항상 활성 상태가 되도록 변형된다. HM74를 변경시키면 리간드에 결합하지 않아도 수용체를 활성화시킬 수 있다. 활성화된 수용체를 얻는 한 가지 방법은 리간드 결합 없이 HM74가 G 단백질과 상호작용하도록 변경시키는 것이다. 이와 같은 변경은 세포내 G 단백질에 수용체가 결합할 수 있도록 리간드 결합시에 수용체의 형태학적 변화를 모방한다. 이와 같은 방법 중 한 가지가 WO 00/22129에 공지되어 있다.
WO　00/22129는 구성적 활성을 생성하는 TM6 및 IC3 부분에 있는 특정 아미노산에 대해 설명한다. HM74내에 특정 아미노산을 결합시키는 방법은 당분야에 공지되어 있는데, 부위-지시된 돌연변이 생성, 서브클로닝 등이 있다. 그 다음 변경된 HM74 분자는 숙주 세포에서 발현되어 구성적인 활성 HM74를 만든다.
그 다음 활성화된 세포는 HM74 효능제, 길항제, 역효능제 즉 HM74 활성을 변경시키는 분자인 것으로 의심가는 분자에 노출시킨다. G 단백질 활성을 변경시키는 이들 분자가 약물 개발에 공지된 방법을 이용하여 변경된 HM74 대사와 연관된 질환을 치료하는 표적 물질이 된다.
본 발명의 상기 검사 방법중 한 가지 이상의 태양에서, HM74 또는 이의 표적 분자를 고정시켜 단백질중 하나 또는 둘 모두의 비복합 형태로부터 복합된 형의 분리를 촉진시키고, 검사를 자동화시키는 것이 바람직하다. 후보물질 유무하에, 반응물을 담아두기에 적절한 임의 용기에서 HM74에 시험 화합물의 결합 또는 표적 분자와 HM74의 상호작용은 실행할 수 있다. 이와 같은 용기에는 예로 들면 미량적정 플레이트, 시험관 또는 미량원심분리관이 포함된다. 하나의 태양에서, 한 개의 단백질 또는 두 개의 모든 단백질이 매트릭스에 결합될 수 있는 도메인을 첨가하는 융합 단백질을 제공할 수도 있다. 예를 들면, 글루타티온-S-트란스퍼라제/HM74 융합 단백질 또는 글루타티온-S-트란스퍼라제/표적 융합 단백질들을 글루타티온 세파로즈 비드(Sigma Chemical, St. Louis, MO) 또는 글루타티온-유도된 미량적정 플레이트 상에 흡착시킬 수도 있다. 그 다음 이와 같은 복합체를 시험 화합물, 비-흡착된 표적 단백질 또는 HM74 단백질과 복합시키고, 혼합물은 복합체 형성이 유도되는 조건(예를 들면 염, pH 등 생리학적 조건에서)에서 배양시킨다. 배양후에, 비드 또는 미량적정 플레이트 웰을 세척하여 임의의 미결합된 성분를 제거하고, 상기에서 설명한 것과 같이 복합체 형성을 직접 또는 간접적으로 측정한다. 또는, 복합체를 매트릭스로부터 분리시키고, 표준 기술을 이용하여 HM74 결합 또는 활성 수준을 측정한다.
매트릭스 상에 단백질을 고정시키는 다른 기술을 본 발명의 스크리닝 검사에 이용할 수도 있다. 예를 들면, HM74 또는 이의 표적 분자는 바이오틴 및 스트렙트아비딘 결합을 이용하여 고정시킬 수 있다. 바이오티닐화된 HM74 또는 표적 분자는 당분야에 공지된 기술(바이오티닐화 키트, 피어스 케미칼 사, 록포드, IL)을 이용하여, 바이오틴-NHS(N-하이드록시-숙신이미드)로부터 준비하고, 스트렙트아비딘-피복된 96웰 플레이트(피어스 케미칼 사)의 웰에 고정시킨다. 또는, HM74와 반응성이 있는 항체 또는, HM74 단백질과 표적 분자와의 결합을 방해하지 않는 표적 분자들을 플레이트의 웰로 유도시키고, 항체 결합에 의해 웰내에 미결합 표적 또는 HM74는 갇히게 된다. 상기 GST-고정된 복합체에서 설명된 것에 추가하여 이와 같은 복합체를 감지하는 방법에는, HM74 또는 표적 분자와 반응성이 있는 항체를 이용하여 복합체의 면역감지 및 HM74 또는 표적 분자와 연관된 효소 활성을 감지하는 방법에 의존하는 효소-연결된 검사 방법이 포함된다.
또 다른 태양에서, HM74 발현 조절제를 확인하는데, 그 확인 방법은 세포를 후보 화합물과 접촉시키고, 세포에서 HM74 mRNA 또는 단백질이 발현되었는지를 측정하는 것이다. 후보 화합물 존재하에 HM74 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 후보 화합물이 없는 상태에서 HM74 mRNA 또는 단백질의 발현 수준과 비교한다. 그 다음 비교한 것에 근거하여 후보 화합물이 HM74 발현 조절제인지를 확인할 수 있다. 예를 들면, 후보 화합물이 없는 경우와 비교하였을 때, 존재하는 경우에 HM74 mRNA 또는 단백질 발현 정도가 더 큰(통계학적으로 유의하게 큰) 경우에, 후보 화합물을 HM74 mRNA 또는 단백질 발현의 자극물질 또는 효능제라고 할 수 있다. 또는, 후보 화합물이 없는 경우와 비교하였을 때, 존재하는 경우에 HM74 mRNA 또는 단백질 발현 정도가 더 적은(통계학적으로 유의적으로 적은) 경우에, 후보 화합물을 HM74 mRNA 또는 단백질 발현의 억제제 또는 길항제로 확인한다. HM74 활성이 리간드 또는 효능제 존재하에 감소되거나, 구성적 HM74 내에서 기준 미만인 경우에, 후보 화합물은 역효능제라 할 수 있다. 세포에서 HM74 mRNA 또는 단백질 발현 수준은 HM74 mRNA 또는 단백질을 감지하기 위해 여기에서 설명된 방법으로 측정할 수 있다.
순수한 HM74를 다량으로 제조하므로 합리적인 약물 설계를 위해 적절한 기능을 하는 부분의 양태의 물리적 특징을 확인할 수 있다. 예를 들면, 분자의 IC3 부분 및 EC 도메인이 특히 관심 대상이 되는 부분이다. 부분의 형태 및 이온적 배위가 인식되면, 이들 부분들과 상호작용하는 후보 약물을 계획하고, 온전한 세포, 동물 및 환자에서 시험한다. 이와 같은 구조적 정보를 유도할 수 있는 방법에는 X-선 결정화방법, NMR 스텍스럼분석, 분자 모델링 등이 포함된다. 3-D 구조로도 특정 부위에 작용하는 것으로 알려진 다른 공지 단백질에 있는 유사한 형태 부위를 확인할 수 있다. 이들 약물 또는 이의 유도체는 HM74와의 용도를 찾을 수 있을 것이다.
본 발명은 또한 상기 설명된 스크리닝 검사에 의해 확인된 신규한 제제 및 여기에서 설명하는 치료에 이들 제제를 이용하는 것이 포함된다.
본 발명은 비정상적인 HM74 발현 또는 활성과 연관된 질환을 가지거나 또는 질환에 걸릴 위험이 있는 (취약한) 개체를 치료하는 방법 또는 예방하는 방법을 제공한다. 이와 같은 질환에는 천식, 만성 폐색성 폐 질환, 및 류마티스 관절염과 같은 염증 질환을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.
한 측면에서, 본 발명은 비정상적인 HM74 발현 또는 활성과 연관된 질환 또는 상태를 개체에서 예방하기 위해 HM74 발현을 조절하거나 또는 적어도 한가지 HM74 활성을 조절하는 제제를 개체에 투여하는 예방 방법을 제공한다. 비정상적인 HM74 발현 또는 활성에 기인하거나 또는 이로인한 질환에 걸릴 위험이 있는 개체는 예를 들어 여기에서 설명하는 진단 또는 예후 검사를 복합 또는 임의적으로 사용하여 확인할 수 있다. HM74 이상으로 인한 증후가 명백하기 전에 예방 물질을 투여하면 질병 또는 질환을 예방하거나 또는 진행을 지연시킨다. HM74 이상 유형에 따라, 개체를 치료하는데 예를 들어 HM74 효능제 또는 HM74 길항제를 이용할 수 있다. 여기에서 설명하는 스크리닝 검사에 근거하여 적절한 물질을 결정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 치료 목적의 HM74 발현 또는 활성을 조절하는 방법을 포함한다. 본 발명의 조절 방법은 세포를 이 세포와 연합된 HM74의 하나 이상 활성을 조절하는 제제와 접촉시키는 것이다. HM74 활성을 조절하는 제제는 여기에서 설명하는 바와 같이, 퓨로세미드 또는 옥시데칼린, 핵산 또는 단백질, HM74 단백질의 자연적으로 발생되는 동족의 리간드, 펩티드, HM74 펩티드모방체 또는 다른 소분자와 같은 제제가 된다. 하나의 태양에서, 이 제제는 HM74의 하나 또는 그이상의 생물학적 활성을 자극한다. 또 다른 태양에서, 이 제제는 HM74 단백질의 하나 또는 그 이상의 생물학적 활성을 억제한다. 이와 같은 억제 제제의 예를 들면 항-HM74 항체가 포함된다. 조절 방법은 시험관 내(예를 들면 제제를 세포와 배양시키거나) 또는 생체 내(예를 들면 개체에 제제를 투여하거나)에서 실시할 수 있다. 이와 같이 함으로써, 본 발명은 HM74의 발현 또는 활성 이상으로 인한 질환 또는 질병으로 고통을 받은 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 태양에서, 본 발명의 방법은 (여기에서 설명하는 스크리닝 방법에 의해 확인된) 제제 또는 HM74 발현 또는 활성을 조절하는 제제(상향 또는 하향조절하는 물질)의 혼합물을 투여하는 것이다.
HM74를 비정상적으로 하향 조절하고/하거나 HM74 활성을 증가시키면 유익한 효과를 가져오는 상태에서는 HM74 활성을 촉진시키는 것이 바람직하다. 역으로, HM74를 비정상적으로 상향 조절하고/하거나 HM74 활성을 감소시키면 유익한 효과를 가져오는 상태에서는 HM74 활성을 억제시키는 것이 바람직하다.
본 발명은 다음의 실시예를 통하여 추가 설명하나 이에 한정시키고자 함은 아니다. 출원을 통하여 언급된 모든 참고문헌, 특허 및 공보의 내용은 참고문헌에 포함된다.
실시예 1-HM74를 발현하는 포유류 세포 생성
HM74를 암호화하는 cDNA를 발현 벡터내로 클로닝시키고, 이를 포유류 세포, 예를 들면, CHO 세포 또는 293 세포에 형질감염시킨다.
HM74를 과발현하는 포유류 세포를 만들기 위해, 포유류 세포를 6개 웰 35 mm 조직 배양 플레이트(웰당 3 x 105 포유류 세포(ATCC Catalog No.　CRL-1573))에서 10% 태아 송아지 혈청(Gibco/BRL Catalog No. 1600-044) 존재하에 2ml DMEM 배지(Gibco/BRL, Catalog No. 11765-054)에 도말시켰다.
그 다음 세포는 37℃에서 CO2 배양기를 이용하여 세포가 50-80% 합류될 때까지 배양시킨다. HM74의 클로닝된 cDNA 핵산 서열을 pcDNA 3.1 클로닝 벡터 (Invitrogen, Catalog No.　V790-20)내로 삽입시킨다. 2μg DNA를 100μl 무혈청(serum-free) F12 햄(Ham) 배지로 희석시킨다. 별도로, 25μl 리포펙타민(Lipofectamine) 시약(라이프 테크놀로지 사, Catalog No. 18324-020)을 100μl 무혈청 F12 햄 배지로 희석시킨다. 그 다음 DNA 용액 및 리포펙타민 용액을 부드럽게 혼합하고, 실온에서 45분간 배양시켜 DNA-지질 복합체가 형성되도록 한다.
세포는 2ml 무혈청 F12 햄 배지로 1회 세척한다. 각각의 형질감염을 위해(6개 웰 플레이트에서 6회 형질감염), 0.8ml 무혈청 F12 햄 배지를 DNA-지질 복합체 함유 용액 (총 용적은 0.2 ml)에 첨가하고 부드럽게 혼합한다. 생성된 혼합물(이하 "형질감염 혼합물")을 세척된 세포 위에 덮는다(0.8 ml + 0.2 ml). 항균제를 첨가하지 않는다. 그 다음 세포를 37℃, CO2 배양기에서 16시간 동안 지질-DNA 복합체와 배양하여 형질감염이 일어나도록 한다.
배양기간이 끝난 후에, 10% 태아 송아지 혈청을 포함하는 1ml Fl2 햄 배지를 형질감염된 혼합물을 먼저 제거하지 않은 상태에서 세포위에 덮는다. 형질감염 후 18시간 째에, 세포위에 덮은 배지를 빨아낸다. 그 다음 세포를 PBS, pH　2-4 (Gibco/BRL Catalog No. 10010-023)으로 세척하고, PBS 는 5% 혈청을 포함하는 F12 햄 배지("선택성 배지")로 대체한다. 형질감염 후 72시간에, 세포를 400 μg/ml의 농도로 항균제 제네테신(라이프 테크놀로지 사, Catalog No. 11811)을 함유하는 선택성 배지로 10배 희석한다.
실시예 2-효능제 검사
사람 HM74의 효능제를 스크리닝하기 위해, HM74를 Gq 기전에 인위적으로 결합시킬 수 있다. Gq 기전을 활성화시키면 세포내 근소포체(sarcoplasmic reticulum vesicles)로부터 Ca2+ 방출을 자극한다. Ca2+ 가 세포질로 방출되는데, 세포질에서 Ca2+ 킬레이트 염료를 이용하여 방출된 것을 감지할 수 있다. 플루오로메트릭 이미징 플레이트 리더(Fluorometric Imaging Plate Reader) 또는 FLIPR
Figure 112009064099731-pct00006
장치 (Molecular Devices)을 이용하여 형광에서 생성된 임의 변화를 모니터한다. 형광이 임의 증가된 것은 효능제가 활성이 있다는 것을 반영한다.
HM74를 발현하는 CHO-K1세포를 선조작하여, 무분별한 형태의 Gq 단백질 (Gα16)을 발현시킨다. 이와 같은 세포를 준비하기 위해, 시판되는 Gα16-결합된 CHO 세포를 구하고(Molecular Devices LIVEWARETM 세포, Catalog No.　RD-HGAl6) 이들 세포에서 HM74 발현을 실행시키기 위해 실시예 1의 프로토콜을 따른다.
37℃, 5% CO2, F12 햄 배지(Gibco/BRL, Catalog No. 11765-054)((10% 태아 송아지 혈청, 100 IU/ml 페니실린 (Gibco/BRL, Catalog No.　15140-148), 100 μg/ml 스트렙토마이신(Catalog No.　15140-148, Gibco/BRL), 400 μg/ml 제네티신(G418) (Gibco/BRL, Catalog No. 10131-035), 200 μg/ml 제오신 (Invitrogen, Catalog No.　R250-05) 포함됨)에서 세포의 생장은 로그상(log phase) 생장 상태를 유지한다. 검사 하루전에 CHO-K1 세포 12,500 세포/(웰)를 96/384 멀티드롭(Multidrop) 장치(Labsystems, Type 832)를 이용하여 384-웰의 깨끗한 바닥의 검사 플레이트(Greiner/Marsh, Catalog No.　N58102) 에 웰당 50 μl 용적으로 플레이팅한다. 37℃, 가습 5% CO2 배양기(Forma Scientific CO2 워터-재킷 배양기 모델 3110)에서 세포를 배양한다.
다음과 같은 원액을 제조한다: 1 M 원액의 헤페스(Hepes) (pH　7.5) (Gibco/BRL, Catalog No. 15630-080); 1N NaOH에서 만든 250mM 프로베니시드 원액(Sigma, Catalog No.　P8761); DMSO(Sigma D2650)에서 만든 1 mM Fluo　4-AM Dye 원액 (Molecular Probes, Catalog No.　Fl 4202). 반응 완충액은 1000 ml 행크(Hank) 균형 염 용액(Fisher/Mediatech, Catalog No.　MT21023), 20 ml 1 M 헤페스 원액, 10ml 250 mM 프로베니시드 원액으로 만든다. 로딩 완충액을 제조하기 위해, 1.6 ml 1 mM 플루오 4-AM 염료 원액을 0.32 ml 플루론산(Molecular Probes, Catalog No.　P6866)과 혼합하고, 그 다음 상기 반응 완충액 400ml, 태아 송아지 혈청 4ml와 혼합한다.
검사 한 시간 전에, 96/384 멀티드롭 장치를 이용하여 384-웰 플레이트의 각 웰에 새로 준비한 로딩 완충액 50μl를 첨가한다. 세포를 37℃, 가습 배양기에서 배양하여 염료 흡수를 최대화시킨다. 검사 직전에, 세포를 플레이트 바닥 위 최소 10mm위에 흡출 헤드가 있는 384 EMBLA 셀 워셔(Cell Washer) (Skatron; Model No. 12386) 를 이용하여, 90μl 반응 완충액으로 2회 세척하면, 웰당 45μl의 완충액이 남는다.
FLIPR
Figure 112006058979233-pct00007
II (Molecular Devices) 장치의 CCD 카메라(Princeton Instruments) 는 f-정지 2.0, 노출 0.4초로 설정해 둔다. 염료 로딩이 정확한지를 확인하기 위한 세포 플레이트를 모니터하는데 카메라를 이용한다.
잠재적 옥시데칼린형 화합물을 포함하는 화합물 라이브러리는 웰당 생리적 염 완충액에서 약 10 μM 농도로 시험받는다. 화합물을 첨가하기 전 10초 동안 형광의 변화를 측량한다. 화합물 첨가후에, 형광은 처음 1분간은 매초마다 측정하고, 총 3분간의 실험 분석에서 매 6초마다 노출시킨다. 100 μM 의 원액 화합물의 5 μl 분량을 10번째 스캔후에 첨가하여 최종 세포상의 농도는 10 μM이 된다. 처음 80회 스캔동안에 최대 형광 변화는 효능제 활성치로 기록되고, 이는 10 μM ATP(Sigma A9062)에 의해 유도된 최대 형광 변화와 비교한다.
다수의 옥시데칼린 화합물이 HM74를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다.
실시예 3-길항제 검사
사람 HM74 의 길항제를 스크린하기 위해, HM74를 Gq 기전에 인위적으로 결합시킬 수 있다. 실시예 2에서와 같이, FLIPR
Figure 112009064099731-pct00008
장치를 이용하여 형광의 임의 변화를 모니터한다. 형광이 임의 감소된 것은 길항제가 활성이 있다는 것을 반영한다.
HM74를 발현하는 CHO-K1세포를 실시예 2에서 설명된 것과 같이 선조작하여, 무분별한 형태의 Gq 단백질 (Gα16)을 발현시킨다. 37℃, 5% CO2, F12 햄 배지(Gibco/BRL, Catalog No. 11765-054)((10% 태아 송아지 혈청 함유, 100 IU/ml 페니실린 (Gibco/BRL, Catalog No.　15140-148), 100 μg/ml 스트렙토마이신(Catalog No.　15140-148, Gibco/BRL), 400 μg/ml 제네티신(G418) (Gibco/BRL, Catalog No. 10131-035), 200 μg/ml 제오신 (Invitrogen, Catalog No.　R250-05) 포함됨)에서 세포의 생장은 로그상(log phase) 생장 상태를 유지한다. 검사 하루전에 CHO-K1 세포 12,500 세포/(웰)를 96/384 멀티드롭 장치를 이용하여 384-웰의 검은색의 깨끗한 바닥의 검사 플레이트(Greiner/Marsh, Catalog No.　N58102) 에 웰당 50 μl 용적으로 플레이팅한다. 37℃, 가습 5% CO2 배양기에서 세포를 배양한다.
다음과 같은 원액을 제조한다: 1 M 원액의 헤페스 (pH　7.5) (Gibco/BRL, Catalog No. 15630-080); 1N NaOH에서 만든 250mM 프로베니시드 원액(Sigma, Catalog No.　P8761); DMSO(Sigma D2650)에서 만든 1 mM Fluo　4-AM 염료 원액 (Molecular Probes, Catalog No.　Fl 4202) 및 리간드 또는 길항제 원액. 반응 완충액은 1000 ml 행크 균형 염 용액(Fisher/Mediatech, Catalog No.　MT21023), 20 ml 1 M 헤페스 원액, 10ml 250 mM 프로베니시드 원액, 1mM CaCl2로 만든다. 로딩 완충액을 준비하기 위해, 80 μl 1 mM 플루오 4-AM 염료 원액을 16μl 플루론산(Molecular Probes, Catalog No.　P6866)과 혼합하고, 그 다음 상기 반응 완충액 20ml, 태아 송아지 혈청 0.2ml와 혼합한다.
검사 30분 전에, 96/384 멀티드롭 장치를 이용하여 384-웰 플레이트의 각 웰에 새로 제조한 로딩 완충액 30μl를 첨가한다. 세포를 37℃, 가습 CO2배양기에서 배양하여 염료 흡수를 최대화시킨다. 검사 직전에, 세포를 플레이트 바닥 위 최소 40mm위에 흡출 헤드가 있는 384 EMBLA 셀 워셔를 이용하여, 100μl 반응 완충액으로 3회 세척하면, 웰당 45μl의 완충액이 남는다.
5 μl의 100 μM 원액 길항제 화합물을 플레이트메이트-384 피페터(Platemate-384 pipetor) (Matrix)를 이용하여 세포에 첨가한다. 배양 중 화합물의 농도는 약 10μM이다. FLIPR
Figure 112009064099731-pct00009
II에 세포를 두고, 플레이트 형광을 처음 1분간은 매초마다 측정하고, 총 3분간의 실험 분석에서 매 6초마다 노출시킨다. 10번째 스캔후에 길항제 또는 리간드(10 μM)를 첨가한다. 각 첨가후에, 384 피페터 팁을 물 중의 20 μl 0.01% DMSO로 10회 씻는다.
HM74 세포는 길항제 후보 화합물로 시험하기 전에 확인된 효능제에 노출시키거나 노출시키지 않을 수도 있다.
실시예 4-수용체 결합 검사
HM74를 포함하는 막 분획물을 제조하기 위해, HM74를 발현하는 CHO 세포주를 1　mM EDTA을 포함하는 인산-완충염(10　ml)에서 배양하여 수득한다. 세포는 1 mM EDTA (10 ml)를 포함하는 인산-완충된 염으로 추가 3회 세척한 후에, 5　ml 완충액 A (50 mM Tris-HCl (pH　7.8) (Sigma T6791), 5 mM MgCl2 (Sigma M8266), 1 mM EGTA (Sigma 0396)으로 재현탁시킨다.
그 다음 세포를 1분간 조직 균질화기(Polytron, Kinemetica, Model PT 10/35)를 사용하여 파쇄한다. 생성된 균질물을 소르발 인스트루먼트 사(Sorvall Instruments) RC3B 냉동 원심분리기를 이용하여 49,000　X g, 4℃에서 20분간 원심분리시킨다. 생성된 펠렛을 25 ml의 완충액 A로 재현탁시키고, 원심분리 단계는 3회 반복한다. 최종 원심분리후에, 펠렛은 5 ml 완충액 A로 재현탁시키고, 나누어서 -70℃에 보관한다.
막 분획물과 추적물질로써 방사능표지된 중요한 효능제를 이용하여 수용체 결합 검사를 실시한다. 검사는 96-웰 플레이트(Beckman Instruments)에서 실시한다. 결합 반응은 0.1% 소 혈청 알부민(Sigma, Catalog No. 34287)을 포함하는 완충액 A의 최종 용적 0.2 ml내에 방사능활성 효능제(0.01 nM-25 nM)의 존재하에 18μg CHO 세포 조제물로 구성된다(참조: Im et　al., J. Biol. Chem. (2000) 275(19):14281-14286). 반응물은 실온에서 1시간동안 배양한다. 반응은 0.3% 폴리에틸렌이민(Sigma, Catalog No.　P3143) 및 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 1시간동안 선처리된 멀티채널 수확기(Brandell) 상에서 왓맨(Whatman) GF/C 필터를 통하여 여과시켜 종료한다. 혼합물을 필터에 적용하고, 1시간동안 배양시킨다. 필터는 1 ml의 얼음으로 냉각시킨 50 mM Tris-HCl, pH　7.6으로 6회 세척한다. 방사능활성을 측정하여, 각 추적물질의 농도에 대해 전체 결합 및 비-특이적 결합(배경)사이에 차이에 근거하여 특이적 결합을 계산한다. 효능제와 수용체 사이에 평형 상태(평형 결합 변수)에서 얻어진 수용체에 대한 효능제의 결합을 측정하기 위해 8개 내지 16개 농도 데이터 포인트를 얻는다. 경쟁 분석법에서 시험 화합물을 혼합물에 첨가하여, 수용체상에 방사능활성 효능제의 결합에 경쟁시킨다(경쟁결합치). 억제 곡선을 제작하여 결합의 50%를 억제하는데(IC50) 요구되는 농도를 측정한다.
실시예 5 - 소분자 효능제
일련의 옥시데칼린형 분자를 상기에서 설명하는 HM74를 발현하는 세포에 노출시켰다. 표적 분자들을 표지시켜, HM74에 결합이 발생되었는지를 결정한다. 결합은 세척후에 세포의 표지화 정도를 측정하여 감지하였다. 결합은 또한 2-D 겔 전기영동을 통하여 HM74를 분리시키고, 해당 단백질과 결합된 표지화 정도를 측정하여 확인하였다. 상기 결합 평가후에, 또는 결합 평가와 별도로, HM74를 활성화시키는 후보 효능제의 능력을 측정하였다. FLIPR 검사를 이용하여 HM74에 표적 분자 결합시에 세포내 칼슘 이동을 측정하였다. 따라서, 칼슘 이동의 원인이 되는 옥시데칼린 분자를 확인하였다.
본 발명을 지금까지 설명하였으나, 당업자는 본 발명에서 제시하는 범위 및 사상에서 벗어나지 않는 다양한 변화 및 수정이 가능하다는 것을 인지할 것이다.
여기에서 언급된 모든 참고문헌을 전문으로 본원에 인용한다.

Claims (6)

  1. 하기 화학식의 화합물을 포함하는, 염증 조절용 약제학적 조성물.
    Figure 112011089761670-pct00010
    상기 식에서,
    X는 O, NR2 또는 S이고;
    R1은 C1-C18 알킬(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C1-C18 알케닐(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C1-C18 알키닐(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C3-C18 아릴(이는 측쇄를 함유할 수 있거나 브릿지를 함유할 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C5-C18 사이클로알킬(이는 측쇄를 함유할 수 있거나 브릿지를 함유할 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); 또는 이들의 조합이고;
    R2는 R1 기 또는 (C1-C10) 알킬-(C3-C10) 사이클로알킬(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다)이거나; X와 R2는 환을 형성할 수 있고;
    R3은 H 또는 R1이며;
    Y는 카보닐, 시프 염기(Schiff base), 옥신, 케탈, 아세탈, 옥사졸리딘, 티아졸리딘 또는 에놀 에스테르이다.
  2. 다음의 화학식의 잠재적 효능제를 HM74를 발현하는 세포와 접촉시키고,
    상기 잠재적 효능제 부재하의 HM74의 신호화 활성에 비해 상기 잠재적 효능제 존재하의 HM74의 신호화 활성이 증가되는지의 여부를 측정함을 포함하는, HM74의 효능제를 확인하는 시험관내 방법.
    Figure 112011089761670-pct00011
    상기 식에서,
    X는 O, NR2 또는 S이고;
    R1은 C1-C18 알킬(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C1-C18 알케닐(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C1-C18 알키닐(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C3-C18 아릴(이는 측쇄를 함유할 수 있거나 브릿지를 함유할 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C5-C18 사이클로알킬(이는 측쇄를 함유할 수 있거나 브릿지를 함유할 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); 또는 이들의 조합이고;
    R2는 R1 기 또는 (C1-C10) 알킬-(C3-C10) 사이클로알킬(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다)이거나; X와 R2는 환을 형성할 수 있고;
    R3은 H 또는 R1이며;
    Y는 카보닐, 시프 염기, 옥신, 케탈, 아세탈, 옥사졸리딘, 티아졸리딘 또는 에놀 에스테르이다.
  3. 다음의 화학식의 잠재적 역효능제를 HM74를 발현하는 세포와 접촉시키고,
    상기 잠재적 역효능제 부재하의 HM74의 활성에 비해, 상기 잠재적 역효능제 존재하의 HM74의 활성이 감소되는지 및 효능제 존재하에 감소되는지의 여부를 측정함을 포함하는, HM74의 역효능제를 확인하는 시험관내 방법.
    Figure 112011089761670-pct00012
    상기 식에서,
    X는 O, NR2 또는 S이고;
    R1은 C1-C18 알킬(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C1-C18 알케닐(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C1-C18 알키닐(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C3-C18 아릴(이는 측쇄를 함유할 수 있거나 브릿지를 함유할 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C5-C18 사이클로알킬(이는 측쇄를 함유할 수 있거나 브릿지를 함유할 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); 또는 이들의 조합이고;
    R2는 R1 기 또는 (C1-C10) 알킬-(C3-C10) 사이클로알킬(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다)이거나; X와 R2는 환을 형성할 수 있고;
    R3은 H 또는 R1이며;
    Y는 카보닐, 시프 염기에 결합된 산소, 옥신, 케탈, 아세탈, 옥사졸리딘, 티아졸리딘 또는 에놀 에스테르이다.
  4. 다음의 화학식의 잠재적 길항제를 HM74를 발현하는 세포와 접촉시키고,
    효능제 존재하의 HM74의 신호화 활성에 비해, 상기 잠재적 길항제 존재하의 HM74의 신호화 활성이 감소되는지의 여부를 측정함을 포함하는, HM74의 길항제를 확인하는 시험관내 방법.
    Figure 112011089761670-pct00013
    상기 식에서,
    X는 O, NR2 또는 S이고;
    R1은 C1-C18 알킬(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C1-C18 알케닐(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C1-C18 알키닐(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C3-C18 아릴(이는 측쇄를 함유할 수 있거나 브릿지를 함유할 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C5-C18 사이클로알킬(이는 측쇄를 함유할 수 있거나 브릿지를 함유할 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); 또는 이들의 조합이고;
    R2는 R1 기 또는 (C1-C10) 알킬-(C3-C10) 사이클로알킬(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다)이거나; X와 R2는 환을 형성할 수 있고;
    R3은 H 또는 R1이며;
    Y는 카보닐, 시프 염기, 옥신, 케탈, 아세탈, 옥사졸리딘, 티아졸리딘 또는 에놀 에스테르이다.
  5. 삭제
  6. 다음 화학식의 화합물.
    상기 식에서,
    X는 O, NR2 또는 S이고;
    R1은 C1-C18 알킬(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C1-C18 알케닐(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C1-C18 알키닐(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C3-C18 아릴(이는 측쇄를 함유할 수 있거나 브릿지를 함유할 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); C5-C18 사이클로알킬(이는 측쇄를 함유할 수 있거나 브릿지를 함유할 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다); 또는 이들의 조합이고;
    R2는 R1 기 또는 (C1-C10) 알킬-(C3-C10) 사이클로알킬(이는 측쇄형일 수 있거나 헤테로원자를 함유할 수 있거나 또는 이들의 조합된 형태일 수 있다)이거나; X와 R2는 환을 형성할 수 있고;
    R3은 H 또는 R1이며;
    Y는 카보닐, 시프 염기, 옥신, 케탈, 아세탈, 옥사졸리딘, 티아졸리딘 또는 에놀 에스테르이고;
    단, R2가 메틸, 에틸 또는 사이클로헥실인 경우, R1은 n-알킬 또는 C1-C4 측쇄형 알킬이 아니거나; R2가 아세틸기로 치환될 수 있는 C1-C4 측쇄형 알킬 또는 C1-C4 알코올인 경우, R1은 n-(C1-C8) 알킬, (C1-C4) 측쇄형 알킬 또는 티오 치환된 페닐이 아니다.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1603585A2 (en) * 2003-03-14 2005-12-14 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotide encoding a novel human g-protein coupled receptor variant of hm74, hgprbmy74
NZ555320A (en) 2004-12-03 2010-11-26 Schering Corp Substituted piperazines as CB1 antagonists
JP2009528266A (ja) * 2006-01-18 2009-08-06 シェーリング コーポレイション カンナビノイド受容体修飾因子
US20100197564A1 (en) * 2007-04-19 2010-08-05 Schering Corporation Diaryl morpholines as cb1 modulators
EP2170846A2 (en) * 2007-06-28 2010-04-07 Intervet International BV Substituted piperazines as cb1 antagonists
EP2170847A2 (en) * 2007-06-28 2010-04-07 Intervet International BV Substituted piperazines as cb1 antagonists

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997048691A1 (de) 1996-06-18 1997-12-24 Hoechst Aktiengesellschaft Ringannelierte dihydropyrane, verfahren zur herstellung sowie deren verwendung

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4522811A (en) * 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US5674908A (en) * 1993-12-20 1997-10-07 Life Technologies, Inc. Highly packed polycationic ammonium, sulfonium and phosphonium lipids
US6555339B1 (en) 1997-04-14 2003-04-29 Arena Pharmaceuticals, Inc. Non-endogenous, constitutively activated human protein-coupled receptors
AU7966098A (en) * 1997-06-12 1998-12-30 Smithkline Beecham Corporation Hm74a receptor
GB0021484D0 (en) * 2000-09-01 2000-10-18 Boehringer Ingelheim Pharma Method for identifying substances which positively influence inflammatory conditions of chronic inflammatory airway diseases

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997048691A1 (de) 1996-06-18 1997-12-24 Hoechst Aktiengesellschaft Ringannelierte dihydropyrane, verfahren zur herstellung sowie deren verwendung

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